本發(fā)明涉及一種具有降低的免疫抑制活性但維持神經(jīng)再生活性的FK506衍生物、其制備方法、以及包含其的用于預(yù)防或治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物。

背景技術(shù)：

FK506，也稱為他克莫司或藤霉素，是一種23元大環(huán)內(nèi)酰胺，并且可以從鏈霉菌屬(Streptomyces tsukubaensis)中分離。已知FK506及其類似的藥物與細(xì)胞質(zhì)的抑免蛋白(通常稱為FK506結(jié)合蛋白(FKBP))相互作用以修飾若干生物化學(xué)反應(yīng)(Kang,C.B.等,Neurosignals 2008)。

特別地，F(xiàn)K506在臨床上防止同種異體移植排斥(Kino,H.等,J.Antibiot.1987；Kino,H.等,J.Antibiot.1987；Fung,J.J.等,Transplantation 2004)并作為用于治療自身免疫疾病(例如特應(yīng)性)的免疫抑制劑使用(Parsons,W.H.等,Ann.N.Y.Acad.Sci.1993)。FK506是T細(xì)胞受體信號傳導(dǎo)中的重要成分并抑制能抑制T淋巴細(xì)胞活性的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的活性。

在FK506的免疫抑制活性機(jī)制的特定研究中，F(xiàn)K506的化學(xué)結(jié)構(gòu)可以分為兩個區(qū)域：結(jié)合至鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的效應(yīng)區(qū)(Goulet,M.T.等,Perspect.Drug Discov.1994；Parsons,W.H.等,Ann.N.Y.Acad.Sci.1993；Griffith,J.P.等,Cell 1995)和與FKBP形成復(fù)合物的結(jié)合位點(diǎn)。FKBP結(jié)合位點(diǎn)包含哌啶酸酯部分、三羰基和環(huán)己烷環(huán)，并且在與FKBP12蛋白的復(fù)合物形成中起重要作用。這允許剩余的效應(yīng)區(qū)自由地結(jié)合鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶從而形成三重復(fù)合物。

為了發(fā)揮上述免疫抑制作用，重要的是FK506首先結(jié)合FKBP12蛋白。一旦形成兩部分復(fù)合物，則該復(fù)合物可以與鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶相互作用(Goulet,M.T.等,Perspect.Drug Discov.1994；Parsons,W.H.等,Ann.N.Y.Acad.Sci.1993)。FK506-FKBP復(fù)合物與鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的相互作用抑制由T細(xì)胞增殖介導(dǎo)的白細(xì)胞介素-2，導(dǎo)致免疫抑制作用。

FK506由雜合PKS/NRPS(聚酮合酶/非核糖體肽合成酶)系統(tǒng)合成。使用從分支酸鹽衍生的DHCHC(4,5-二羥基環(huán)己-1-烯羧酸)作為起始材料進(jìn)行生物合成過程，其中DHCHC通過使用兩分子丙二酰輔酶A、兩分子甲氧基丙二?；??；d體蛋白(ACP)、五分子甲基丙二酰輔酶A和一分子烯丙基丙二酰輔酶A的10步縮合延伸(Andexer,J.N.等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2011；Mo,S.J.等,J.Am.Chem.Soc.2011)。通過FkbL作用從賴氨酸衍生的哌啶酸酯通過NRPS KfbL與線性聚酮化物鏈縮合并環(huán)化以產(chǎn)生大環(huán)內(nèi)酯環(huán)。該環(huán)通過后PKS修飾過程進(jìn)一步修飾，例如由FkbM(S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶)導(dǎo)致的C-31上的氧甲基化或由FkbD(P450羥化酶)在C-9上的氧化反應(yīng)(Motamedi,H.等,J.Bacteriol.1996；Shafiee,A.等,J.Antibiot.1997)。

最近，本發(fā)明人已經(jīng)確定，后PKS修飾途徑包括通過表征所有FK506生物合成中間體的兩個獨(dú)立的平行途徑(Ban,Y.H.等,J.Nat.Prod.2013)。

除了上述免疫抑制活性之外，已報(bào)道FK506或其衍生物具有抗真菌(Nakagawa,H.等,Clin.Drug Invest.1996)、抗炎癥(Migita,K.等,Curr.Med.Chem.2003)、以及神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)再生作用(Gold,B.G.Expert Opin.Invest.Drugs 2000；Gold,B.G.等,J.Pharmacol.Exp.Ther.1999)。然而，盡管具有上述藥理活性，但FK506或其衍生物具有免疫抑制活性，從而導(dǎo)致問題，例如難以用于需要免疫反應(yīng)的一般患者。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

[技術(shù)問題]

在這種情況下，本發(fā)明人的深入研究努力旨在確定PKS變形后參與途徑的FK506的幾個特征，導(dǎo)致證實(shí)了一種通過FK506生物合成基因的失活制備9-脫氧-脯氨酰-FK506(9-脫氧-脯氨酰-FK506)、一種新型FK506衍生物的方法，并發(fā)現(xiàn)作為9-脫氧-脯氨酰-FK506、31-O-脫甲基-FK506(31-O-脫甲基-FK506)或9-脫氧-31-O-脫甲基FK506(9-脫氧-31-O-脫甲基-FK506)的FK506衍生物具有降低的免疫抑制活性并具有神經(jīng)再生和保護(hù)作用，因此可用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

[技術(shù)方案]

本發(fā)明的主要目的是提供一種用于預(yù)防或治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物，其包含選自31-O-脫甲基-FK506、9-脫氧-31-O-脫甲基-FK506或9-脫氧-脯氨酰-FK506中的一種或多種FK506衍生物，具有降低的免疫抑制活性。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備9-脫氧-脯氨酰-FK506的方法，包括培養(yǎng)其中fkbD基因失活的鏈霉菌菌株的步驟。

本發(fā)明的另一個目的是提供9-脫氧-脯氨酰-FK506、其異構(gòu)體或其藥學(xué)上可接受的鹽。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于促進(jìn)神經(jīng)再生的組合物，其具有降低的免疫抑制活性，包含選自31-O-脫甲基-FK506、9-脫氧-31-O-脫甲基-FK506或9-脫氧-脯氨酰-FK506中的一種或多種FK506衍生物。

[本發(fā)明的有利效果]

根據(jù)本發(fā)明的包含9-脫氧-脯氨酰-FK506、31-O-脫甲基-FK506或9-脫氧-31-O-脫甲基-FK506的組合物具有降低的免疫抑制活性，可以促進(jìn)神經(jīng)再生并減少治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的副作用。

附圖說明

圖1是顯示從通過fkbD基因的框內(nèi)缺失而失活的菌株(ΔfkbD_框內(nèi))獲得的9-脫氧-脯氨酰-FK506的HPLC ESI-MS分析結(jié)果的圖。

圖2是9-脫氧-脯氨酰-FK506的ESI-MS/MS分析的結(jié)果，其中(A)顯示ESI-MS/MS片段的圖譜，(B)顯示MS/MS光譜。

圖3a和3b是溶于CDCl₃中的9-脫氧-脯氨酰-FK506的NMR波譜，圖3a是¹H NMR波譜，圖3b是¹³C NMR波譜。

圖4是溶于CDCl₃中的9-脫氧-脯氨酰-FK506的HSQC波譜。

圖5a至5c是9-脫氧-脯氨酰-FK506的COSY和HMBC分析的結(jié)果，其中圖5a顯示上述化合物的COSY和主要HMBC相關(guān)性，圖5b顯示溶于CDCl₃中的9-脫氧-脯氨酰-FK506的COSY波譜，圖5c顯示溶于CDCl₃中的9-脫氧-脯氨酰-FK506的HMBC波譜。

圖6顯示9-脫氧-脯氨酰-FK506與FK506相比的免疫抑制活性。

圖7a顯示9-脫氧-脯氨酰-FK506與FK506相比的神經(jīng)再生活性，圖7b顯示在用9-脫氧-脯氨酰-FK506處理的PC12細(xì)胞上生長的神經(jīng)突。

圖8顯示31-O-脫甲基-FK506與FK506相比的免疫抑制活性。

圖9a顯示31-O-脫甲基-FK506與FK506相比的神經(jīng)再生活性，圖9b顯示在用31-O-脫甲基-FK506處理的PC12細(xì)胞上生長的神經(jīng)突。

圖10顯示9-脫氧-31-O-脫甲基-FK506與FK506相比的免疫抑制活性。

圖11a顯示9-脫氧-31-O-脫甲基-FK506與FK506相比的神經(jīng)再生活性，圖11b顯示在用9-脫氧-31-O-脫甲基-FK506處理的PC12細(xì)胞上生長的神經(jīng)突。

具體實(shí)施方式

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供由式2表示的9-脫氧-脯氨?；?FK506(其是由式1表示的FK506的新型衍生物)、其異構(gòu)體、或其藥學(xué)上可接受的鹽。

[式1]

[式2]

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，另一方面，本發(fā)明提供一種制備9-脫氧-脯氨酰-FK506的方法。

作為一個實(shí)施方式，上述制備方法可以包括培養(yǎng)其中缺失fkbD(P450羥化酶)基因的鏈霉菌菌株的步驟。已知在后PKS修飾中起作用的FkbD酶在C-9處導(dǎo)致氧化反應(yīng)，但是從未報(bào)道過FkbD酶與脯氨酰基的相關(guān)性。

作為另一個實(shí)施方式，上述制備方法可以還包括將通過使用乙酸乙酯離心分離fkbD基因缺失菌株的培養(yǎng)液而獲得的上清液進(jìn)行分配并通過使用60％甲醇水溶液的制備型反相HPLC進(jìn)行分段的步驟。作為另一個實(shí)施方式，在分段步驟后可以還包括使用50％乙腈的半制備型反相HPLC的步驟。

此外，用于制備9-脫氧-脯氨酰-FK506的菌株可以是能夠在生物體內(nèi)部產(chǎn)生FK506的鏈霉菌的菌株。例如，菌株可以選自鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)KCTC11604BP、鏈霉菌屬(Streptomyces kanamyceticus)KCTC9225、鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)ATCC55098、鏈霉菌屬(Streptomyces tsukubaensis)No.9993、鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)ATCC53770、鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)6260、鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)49A、鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)94128、鏈霉菌屬(Streptomyces glaucescens)MTCC5115和鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)BICC7522，但不限于此，只要可以制備FK506即可。

菌株可以在含有微生物可利用的營養(yǎng)源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。作為菌株的營養(yǎng)源，可以使用但不限于本領(lǐng)域的常規(guī)營養(yǎng)源，例如含有丙二酸、乙醇、甲硫氨酸和碳氮源的培養(yǎng)基。

本發(fā)明人使用化學(xué)物理分析鑒定了制備的物質(zhì)為9-脫氧-脯氨酰-FK506(FK506的新型衍生物)，其通過雙交換同源重組產(chǎn)生的框內(nèi)缺失使鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)KCTC11604BP的fkbD基因失活。

分析的9-脫氧-脯氨酰-FK506的化學(xué)物理特性如下：(a)無定形白色粉末；(b)旋光率：[α]²³_D＝1.64(c＝0.1，甲醇)；(c)UV吸收光譜(甲醇)：λ_max為(log e)227nm(2.0)；(d)IR吸收光譜(膜)：ν_max 3450，2960，1750，1640，1170，1050cm^-1；(e)¹H和¹³C-NMR，參見表1；(f)(+)-ESI-MS：m/z 793.1[M+NH₄]⁺；(+)-MS/MS：m/z 776.1，758.1，740.1，547.9；(+)-HR-ESI-MS：m/z 776.4940[M+H]⁺；和(g)分子式和分子量：C₄₃H₇₀NO₁₁，776.4949。

作為具體的實(shí)施方式，本發(fā)明的化合物可以包含異構(gòu)體或其藥學(xué)上可接受的鹽。

異構(gòu)體是指具有相同化學(xué)式的不同化合物，并且作為實(shí)例可以包括9-脫氧-脯氨酰-FK506的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體、光學(xué)異構(gòu)體(對映異構(gòu)體)、立體異構(gòu)體或非對映異構(gòu)體。

藥學(xué)上可接受的鹽可以是具有對患者相對無毒的濃度、無害的有效作用和不降低9-脫氧-脯氨酰-FK506的有益作用的副作用的任何有機(jī)或無機(jī)酸加成鹽。例如，該鹽可以是由藥學(xué)上可接受的游離酸形成的酸加成鹽。酸加成鹽可以通過常規(guī)方法制備，即將化合物溶于過量的酸水溶液中，并使用水混溶有機(jī)溶劑例如甲醇、乙醇、丙酮或乙腈沉淀該鹽。該鹽也可以通過加熱酸或醇(例如，乙二醇單甲醚)的水溶液和等摩爾化合物，然后通過蒸發(fā)或抽濾沉淀的鹽以干燥該化合物來制備。有機(jī)或無機(jī)酸可用作游離酸。藥學(xué)上可接受的鹽可以是使用堿制備的藥學(xué)上可接受的金屬鹽。

作為另一個具體實(shí)施方式，本發(fā)明的化合物可以是處于本發(fā)明范圍內(nèi)的溶劑合物或前藥的形式。溶劑合物可優(yōu)選地包括水合物或乙醇溶劑合物。

本發(fā)明的化合物可以根據(jù)本領(lǐng)域中的常規(guī)方法合成。例如，可以使用本發(fā)明的制備方法由變體制備化合物。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，另一方面，本發(fā)明提供用于預(yù)防或治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物，其包含選自9-脫氧-脯氨酰-FK506、由下式3表示的31-O-脫甲基-FK506和由下式4表示的9-脫氧-31-O-脫甲基-FK506中的一種FK506衍生物。

[式3]

[式4]

由于FK506是T細(xì)胞受體信號傳導(dǎo)中的重要酶，并抑制能抑制T淋巴細(xì)胞活性的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的活性，因此其用作臨床預(yù)防同種異體移植排斥和治療自身免疫疾病(例如特應(yīng)性)的免疫抑制劑。除了免疫抑制活性之外，已經(jīng)報(bào)道FK506具有抗真菌、抗炎、神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)再生作用。然而，盡管具有藥理活性，但由于免疫抑制活性，因此存在著難以用于需要免疫反應(yīng)的一般患者的問題。

用9-脫氧-脯氨酰-FK506、31-O-脫甲基-FK506或9-脫氧-31-O-脫甲基-FK506處理CD3/CD28激活的人T細(xì)胞的結(jié)果，本發(fā)明人證實(shí)了白細(xì)胞介素-2的分泌顯著增加以達(dá)到正常水平。還證實(shí)了FK506衍生物顯示出優(yōu)異的神經(jīng)再生活性。因此，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以顯示對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療效果，而沒有免疫抑制活性。

作為一個實(shí)施方式，神經(jīng)系統(tǒng)疾病可以是神經(jīng)變性疾病。神經(jīng)變性疾病是指以中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的退化變化為特征的疾病，引起幾種癥狀，例如癡呆、阿爾茨海默氏病、帕金森病、進(jìn)行性核上性麻痹、多系統(tǒng)萎縮、橄欖體腦橋小腦萎縮(OPCA)、Shy-Drager綜合征：紋狀體黑質(zhì)變性、亨廷頓病、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、特發(fā)性震顫、皮質(zhì)基底神經(jīng)節(jié)變性、彌漫性路易體病、關(guān)島的帕金森-ALS-癡呆復(fù)合體或皮克氏病。

作為另一個實(shí)施方式，神經(jīng)系統(tǒng)疾病可以包括癲癇、麻痹、中風(fēng)、缺血性腦疾病、脊髓損傷疾病、周圍神經(jīng)疾病、行為障礙、發(fā)育障礙、智力遲鈍、唐氏綜合征或精神分裂癥，但不限于此。

作為另一個實(shí)施方式，神經(jīng)系統(tǒng)疾病可以是由神經(jīng)元損傷或細(xì)胞死亡引起的疾病。

本發(fā)明人證實(shí)了9-脫氧-脯氨酰-FK506、31-O-脫甲基-FK506或9-脫氧-31-O-脫甲基-FK506促進(jìn)PC12細(xì)胞中的神經(jīng)突生長并誘導(dǎo)神經(jīng)再生，因此可用于促進(jìn)神經(jīng)再生或用于預(yù)防或治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

如本文所用，術(shù)語“預(yù)防”可以指通過將根據(jù)本發(fā)明的用于預(yù)防或治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的組合物施用于受試者來抑制或延緩神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)作的所有作用。

如本文所用，術(shù)語“治療”可以指通過將本發(fā)明的組合物施用于疑似發(fā)生神經(jīng)系統(tǒng)疾病的受試者來改善或緩解神經(jīng)系統(tǒng)疾病的癥狀的所有作用。

本發(fā)明的藥物組合物可以作為單一制劑或通過另外含有使用藥學(xué)上可接受的載體或者賦形劑配制的單位劑型的已公知對神經(jīng)元疾病具有治療效果的藥物而制備的組合制劑，或包封在多劑量容器中。

如本文所用，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”可以指不抑制待引入受試者的化合物的生物活性和性質(zhì)而不刺激受試者的載體或稀釋劑?？捎糜诒景l(fā)明的載體的類型沒有特別限制，可以使用任何載體，只要其是本領(lǐng)域通常使用的藥學(xué)上可接受的載體即可。載體的非限制性實(shí)例可以包括生理鹽水、無菌水、林格氏溶液、緩沖鹽水、白蛋白注射溶液、葡萄糖溶液、麥芽糖糊精溶液、甘油和乙醇。載體可以單獨(dú)使用或以兩種或更多種的組合使用，并且可以包括非天然存在的載體。

此外，如果需要，可以加入其它常規(guī)添加劑，例如抗氧化劑、緩沖劑和/或抑菌劑，并且還可以加入稀釋劑、分散劑、表面活性劑、粘合劑或潤滑劑以用于可注射制劑，例如，水溶液、懸浮液和乳液；丸劑；膠囊劑；顆粒劑；或片劑。

此外，本發(fā)明的藥物組合物可以含有藥學(xué)有效量的9-脫氧-脯氨酰-FK506、31-O-脫甲基-FK506或9-脫氧-31-O-脫甲基-FK506。如本文所用，術(shù)語“藥學(xué)有效量”是指足以以適用于醫(yī)學(xué)治療的合理的利益/風(fēng)險(xiǎn)比治療疾病的量，并且化合物通?？梢砸?.001至1000mg/kg、優(yōu)選地0.05至200mg/kg、更優(yōu)選地0.1至100mg/kg的量每天單劑量或多劑量施用。然而，對于本發(fā)明的目的，優(yōu)選根據(jù)所需反應(yīng)的類型和程度、是否在一些情況下使用其它制劑、具體組合物、年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、給藥時間和途徑、組合物的分泌速率、治療周期、以及同時或與特定組合物組合使用的藥物、以及其它在制藥領(lǐng)域中公知的各種因素和類似因素來給予特定患者特定治療有效量。

本發(fā)明的藥物組合物可以作為獨(dú)立的治療劑或與其它治療劑組合施用，并且與常規(guī)治療劑相繼或同時施用。本發(fā)明的藥物組合物可以作為單劑量或多劑量施用。重要的是根據(jù)所有上述因素進(jìn)行施用，使得可以以最小量獲得最大效果而沒有任何副作用，并且組合物可以容易地由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定。

如本文所用，術(shù)語“施用”是指以適當(dāng)?shù)姆绞綄⒈景l(fā)明的藥物組合物引入患者。本發(fā)明的組合物可以通過能夠?qū)⒔M合物遞送至靶組織的口服或各種腸胃外途徑施用。

對施用根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的方法沒有特別限制，并且可以遵循本領(lǐng)域中常規(guī)使用的方法。作為給藥方法的非限制性實(shí)例，組合物可以以口服或腸胃外途徑給藥。根據(jù)預(yù)期的給藥方法，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以配制成各種劑型。

本發(fā)明的藥物組合物可以例如以1至20mg/kg、優(yōu)選地1至10mg/kg的量施用于包括人的哺乳動物。對組合物的給藥頻率沒有特別限制，并可以是每天一次或數(shù)次。

作為實(shí)現(xiàn)上述目的的另一方面，本發(fā)明提供用于促進(jìn)神經(jīng)再生的具有降低的免疫抑制活性的組合物，其包含選自31-O-脫甲基-FK506、9-脫氧-31-O-脫甲基-FK506和9-脫氧-脯氨酰-FK506中的一種或多種FK506衍生物。

作為實(shí)例，組合物可以用作促進(jìn)體外神經(jīng)突生長的組合物。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，另一方面，本發(fā)明提供用于預(yù)防或治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，包括向受試者施用用于加速神經(jīng)再生的組合物的步驟。

如本文所用，術(shù)語“受試者”可以指所有動物，包括其中已經(jīng)開展或可能發(fā)展神經(jīng)系統(tǒng)疾病的人。動物不僅可以是人，還可以是需要治療相似癥狀的牛、馬、羊、豬、山羊、駱駝、羚羊、狗、貓和其它哺乳動物，但不限于此。

本發(fā)明的預(yù)防或治療方法可以具體包括以藥學(xué)有效量將組合物施用于已經(jīng)發(fā)展或正在發(fā)展神經(jīng)系統(tǒng)疾病的風(fēng)險(xiǎn)的受試者的步驟。

如本文所用，術(shù)語“施用”是指以任何適當(dāng)?shù)姆绞綄⒈景l(fā)明的藥物組合物引入患者，并且只要該組合物可以遞送至靶組織，該組合物可以通過口服或各種胃腸外途徑施用。

實(shí)施例

在下文中，將參考以下實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而，這些實(shí)施例僅用于說明的目的，并且本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限制。

實(shí)施例1.材料制備方法和條件

(1)變體和培養(yǎng)條件的構(gòu)建

根據(jù)Ban,Y.H.等人公開的制備方法(J.Nat.Prod.2013,76,1091-1098)，通過雙交換同源重組產(chǎn)生的框內(nèi)缺失來滅活鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)KCTC11604BP的fkbD基因，以制備ΔfkbD_框內(nèi)菌株。

將KCTC11604BP菌株的孢子和fkbD基因缺失的ΔfkbD_框內(nèi)在ISP4-瓊脂板上傳代培養(yǎng)，并在R2YE培養(yǎng)基中制備種子培養(yǎng)物。將在種子培養(yǎng)物中生長6天的50mg營養(yǎng)細(xì)胞接種到包含在250mL帶擋板燒瓶中的50mL R2YE培養(yǎng)基中，然后在定軌搖床(固定在180rpm)中在28℃下溫育6天。

(2)提取和分離

將4L的ΔfkbD_框內(nèi)菌株的培養(yǎng)肉湯離心分離，并將上清液用乙酸乙酯進(jìn)行溶劑-溶劑分配兩次。分離溶于乙酸乙酯中的層并在減壓下蒸發(fā)以得到深紅色提取物。通過制備型反相HPLC使用60％甲醇水溶液作為流動相以2mL/min的流速對提取物進(jìn)行分級，然后進(jìn)行HPLC-ESI-MS分析。

在Waters/Micromass Quattro micro MS界面上記錄使用ACQUITY UPLC BEH C18柱(50×2.1mm，1.7μm；Waters)的HPLC-ESI-MS/MS光譜，其由直接連接到Micromass Quattro微型MS的Waters 2695分離模塊組成。

通過在多反應(yīng)監(jiān)測模式下操作的MS/MS進(jìn)行追蹤，其中選擇對于所選分析物特異性的質(zhì)量對，以檢測從母離子例如銨加合物到產(chǎn)物離子的轉(zhuǎn)變。

為了將級分分離成兩個亞級分，還以2mL/min的流速和50％乙腈水溶液作為流動相進(jìn)行半制備型反相HPLC。在相同柱和HPLC條件下純化亞級分的結(jié)果是獲得無定形白色粉末(7.4mg，t_R 90分鐘)。

(3)數(shù)據(jù)測量方法

使用Jasco P-1010旋光計(jì)，使用具有0.1dm路徑長度的池測量旋光度。

用Scinco S-3100分光光度計(jì)記錄UV光譜，并在Varian FTS-800FTIR光譜儀上獲得IR光譜。

使用在500MHz操作的Varian INOVA 500譜儀(¹³C，125MHz)記錄NMR波譜1小時。使用四甲基硅烷(TMS)作為內(nèi)標(biāo)，以ppm表示化學(xué)位移。將Mnova軟件(Mestrelab Research S.L.)用于處理所有NMR數(shù)據(jù)。通過將純化合物溶解在250μL的CDCl₃(Sigma)中，然后將溶液置于對應(yīng)于溶劑的5mm Shigemi Advanced NMR微管(Sigma)中，從而制備用于NMR分析的樣品。

使用與UPLC聯(lián)接的Waters SYNAPT G2質(zhì)譜儀收集HR-ESI-MS數(shù)據(jù)。在Acme 9000HPLC系統(tǒng)(YL Instrument Co.Ltd.，韓國)上使用半分離Watchers 120ODS-BP(250×10mm，5μm)進(jìn)行HPLC純化，所述HPLC系統(tǒng)由與UV 730D UV檢測器組(205nm)連接的SP930D梯度泵和CTS 30柱溫箱組(50℃)組成。用于實(shí)驗(yàn)的HPLC級溶劑購自J.T.Baker。

實(shí)施例2：觀察實(shí)施例1的結(jié)果

無定形白色固體分析的結(jié)果如下。

(1)HPLC-ESI-MS

圖1是ΔfkbD_框內(nèi)菌株的培養(yǎng)物提取物的HPLC-ESI-MS分析的結(jié)果，其中銨加合物離子峰于13分鐘在m/z 793.1處和于28分鐘在m/z 807.1處洗脫。因此，基于776.1、758.1、740.1和547.9處的碎片離子，預(yù)測于13分鐘在m/z 793.1洗脫的峰為9-脫氧-脯氨酰-FK506，如圖2中所示。9-脫氧-脯氨酰-FK506的斷裂模式類似于9-脫氧-FK506的斷裂模式在于每個碎片離子之間的距離為14Da。特征C-1-C-24碎片離子出現(xiàn)在9-脫氧-FK506中的m/z 561.9處，而本發(fā)明的9-脫氧-脯氨酰-FK506的離子峰用m/z 547.9處的離子峰表示。這意味著9-脫氧-脯氨酰-FK506在特征C-1-C-24碎片中比9-脫氧-FK506和其它9-脫氧-FK506衍生物少一個亞甲基。

因此，假定無定形白色固體(即9-脫氧-脯氨酰-FK506)含有脯氨酸。

(2)1D-和2D-NMR

[表1]

1D和2D-NMR數(shù)據(jù)

如上表1和圖3a中所示，¹H NMR波譜分析的結(jié)果是觀察到FK506骨架的特征信號：對應(yīng)于甲基的三個雙峰(δ_H 0.95/H₃-38、0.90/H₃-41和0.75/H₃-39)；兩個甲基單峰(δ_H1.67/H3-40和1.66/H3-42)；三個甲氧基單峰(δ_H 3.40/H3-45、3.37/H3-43和3.36/H3-44)；和烯烴質(zhì)子的多重峰(δ_H 5.70/H-36)。

此外，如圖3b中所示，¹³C NMR波譜分析的結(jié)果是考慮到來自¹³C NMR波譜的42個碳信號和來自HMBC波譜的一個羰基碳，預(yù)期化合物總共具有43個碳。然而，仔細(xì)比較化合物(9-脫氧-脯氨酰-FK506)的NMR數(shù)據(jù)與9-脫氧-FK506的NMR數(shù)據(jù)表明，對應(yīng)于9-脫氧-FK506的哌啶酸酯部分(C-2-C-6)的化合物的信號轉(zhuǎn)移。

此外，圖4中對所得化合物的上述¹H和¹³C波譜和HSQC波譜的分析示出了在δ_C58.9/C-2(δ_H 4.35/H-2)、47.4/C-6(δ_H 3.63/H-6a，3.54/H-6b)、29.2/C-3(δ_H 2.19/H-3a，1.98/H-3b)和24.7/C-4(δ_H 1.96/H2-4)處的四個碳信號，證實(shí)了化合物中脯氨酸部分的存在，而不是哌啶酸酯。

通過COZY和HMBC分析證實(shí)了化合物的脯氨酸部分的存在，如圖5a至5c中所示。在δ_H 4.35至δ_H 3.54的范圍內(nèi)的COSY交叉峰提供H-2/H-3/H-4/H-6連通性。此外，觀察到δ_H4.35/H-2、2.19/H-3a和1.98/H-3b處的質(zhì)子信號與δ_C 169.9/C-1處的羰基酯碳信號之間以及δ_H 3.63/H-6a和3.54/H-6b處的質(zhì)子信號與δ_C 58.9/C-2和29.2/C-3處的碳信號之間的關(guān)鍵HMBC相關(guān)性。

圖4中的HSQC光譜顯示δ_H 2.64(d，J＝15Hz)和2.56(d，J＝15Hz)處的質(zhì)子信號與δ_C39.2處的碳信號相關(guān)。這些質(zhì)子信號顯示了與C-8(δ_C 171.8)和C-10(δ_C 98.6)的HMBC相關(guān)性(圖5a和5c)，表明該化合物是類似于9-脫氧-FK506的9-脫氧-FK506衍生物。

同時，化合物的COSY波譜顯示剩余的4個自旋系統(tǒng)，其基于HMBC相關(guān)性連接(圖5a至5c)?；谙鄬MBC相關(guān)性確定甲基和甲氧基的位置，如圖5a中所示。

因此，確定該化合物為9-脫氧-脯氨酰-FK506，本發(fā)明人首次揭示了含有脯氨酸部分而不是普通哌啶酸酯環(huán)的9-脫氧-FK506衍生物。此外，該化合物的立體化學(xué)與母體化合物FK506的立體化學(xué)相同。

(3)HR-ESI-MS

無定形白色固體的HR-ESI-MS分析的結(jié)果是：在m/z 776.4940處獲得[M+H]⁺離子，其與分子式C₄₃H₇₀NO₁₁(計(jì)算的m/z 776.4949)一致。

(+)-ESI-MS

m/z 793.1[M+NH₄]⁺；(+)-MS/MS：m/z 776.1，758.1，740.1，547.9

(+)-HR-ESI-MS

m/z 776.4940[M+H]⁺(對C₄₃H₇₀NO₁₁的計(jì)算值：776.4949)。

基于上述結(jié)果，在通過鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)KCTC11604BP的fkbD基因的框內(nèi)缺失而失活的菌株的培養(yǎng)肉湯中分離的無定形白色粉末具有如下的化學(xué)物理特性，并因此已經(jīng)鑒定為9-脫氧-脯氨酰-FK506。

(a)無定形白色粉末；

(b)旋光率：[α]²³_D＝1.64(c＝0.1，甲醇)；

(c)UV吸收光譜(甲醇)：λ_max(log e)227nm(2.0)；

(d)IR吸收光譜(膜)：ν_max 3450，2960，1750，1640，1170，1050cm^-1；

(e)¹H和¹³C-NMR波譜(參見表1)；

(f)(+)-ESI-MS：m/z 793.1[M+NH₄]⁺；

(+)-MS/MS：m/z 776.1，758.1，740.1，547.9；

(+)-HR-ESI-MS：m/z 776.4940[M+H]⁺；

(g)分子式和分子量：C₄₃H₇₀NO₁₁，776.4949。

實(shí)施例3. 9-脫氧-脯氨酰-FK506活性的分析

(1)體外T細(xì)胞活性的分析

如Mo,S.J.等人(J.Am.Chem.Soc.2011,133,976-985)中描述那樣，使用T淋巴細(xì)胞測定化合物與真實(shí)FK506相比的相對免疫抑制性質(zhì)。簡單地，在用CD3/CD28激活的人T細(xì)胞處理該化合物(0.1nM)后，用該化合物定量白細(xì)胞介素-2分泌物16-20小時。

結(jié)果如圖6中所示，當(dāng)用FK506處理CD3/CD28激活的人T細(xì)胞時，白介素-2分泌減少與CD3/CD28失活的人T細(xì)胞一樣多的數(shù)目，從而增加免疫抑制活性。相反地，當(dāng)用根據(jù)本發(fā)明的9-脫氧-脯氨酰-FK506(標(biāo)記為1)處理CD3/CD28激活的人T細(xì)胞時，白細(xì)胞介素-2分泌顯著增加以到達(dá)正常組的分泌，表現(xiàn)出與母離子FK506及其衍生物的免疫抑制活性相反的結(jié)果。

(2)神經(jīng)再生活性的分析

通過Mo,S.J.等人描述的方法(J.Am.Chem.Soc.2011,133,976-985)，使用大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12)測定化合物與真正的FK506相比的相對神經(jīng)再生活性。PC12細(xì)胞用誘導(dǎo)神經(jīng)突增生的神經(jīng)生長因子(NGF；KOMA Biotech；10ng/mL)處理96小時。將10nM的FK506或9-脫氧-脯氨酰-FK506一起處理或排除。通過Revill,W.P.等人描述的方法(J.Pharmacol.Exp.Ther.2002,302,1278-1285)在照片上測量神經(jīng)突長度。

結(jié)果如圖7a和7b中所示，根據(jù)本發(fā)明的9-脫氧-脯氨酰-FK506(標(biāo)記為1)顯示出對神經(jīng)突增生促進(jìn)的優(yōu)異效果。在圖7b中，A是指未處理的細(xì)胞，B是指僅用神經(jīng)生長因子處理的細(xì)胞，C是指在FK506存在下用神經(jīng)生長因子處理的細(xì)胞，并且D是指在9-脫氧脯氨酰-FK506存在下用神經(jīng)生長因子處理的細(xì)胞。

免疫抑制和神經(jīng)再生活性通過不同的機(jī)制產(chǎn)生，即通過FKBP12或FKBP52的復(fù)合物(Gold,B.G.Expert Opin.Invest.Drugs 2000,9,2331-42)。因此，由于與FKBP12形成二元復(fù)合物的能力降低而引起的免疫抑制活性的喪失不抑制FKBP52復(fù)合物的形成，因此可以維持神經(jīng)再生活性。這同樣適用于下面的31-O-脫甲基-FK506和9-脫氧-31-O-脫甲基-FK506。

實(shí)施例4. 31-O-脫甲基-FK506活性的分析

(1)T細(xì)胞的體外活性分析

使用與實(shí)施例3.(1)相同的方法測定31-O-脫甲基-FK506與真實(shí)FK506相比的相對免疫抑制性質(zhì)。

結(jié)果如圖8中所示，當(dāng)用FK506處理CD3/CD28激活的人T細(xì)胞時，白細(xì)胞介素-2分泌減少與CD3/CD28失活的人T細(xì)胞一樣多的數(shù)目，從而增加免疫抑制活性。相反地，當(dāng)用根據(jù)本發(fā)明的31-O-脫甲基-FK506(標(biāo)記為2)處理CD3/CD28激活的人T細(xì)胞時，白細(xì)胞介素-2分泌的水平顯著增加以達(dá)到正常組的分泌，表現(xiàn)出與母體分子FK506及其衍生物的免疫抑制活性相反的結(jié)果。

(2)神經(jīng)再生活性的分析

使用與實(shí)施例3.(2)相同的方法測定31-O-脫甲基-FK506與真實(shí)FK506相比的相對神經(jīng)再生性質(zhì)。

結(jié)果如圖9a和9b中所示，根據(jù)本發(fā)明的31-O-脫甲基-FK506(標(biāo)記為2)顯示出對神經(jīng)突增生促進(jìn)的優(yōu)異效果。圖9b中，A是指未處理的細(xì)胞，B是指僅用神經(jīng)生長因子處理的細(xì)胞，C是指在FK506存在下用神經(jīng)生長因子處理的細(xì)胞，并且D是指在31-O-脫甲基-FK506存在下用神經(jīng)生長因子處理的細(xì)胞。

實(shí)施例5. 9-脫氧-31-O-脫甲基-FK506活性的分析

(1)T細(xì)胞的體外活性分析

使用與實(shí)施例3.(1)相同的方法測定31-O-脫甲基-FK506與真實(shí)FK506相比的相對免疫抑制性質(zhì)。

結(jié)果如圖10中所示，當(dāng)用FK506處理CD3/CD28激活的人T細(xì)胞時，白細(xì)胞介素-2分泌減少與CD3/CD28失活的人T細(xì)胞一樣多的數(shù)目，從而增加免疫抑制活性。相反地，當(dāng)用根據(jù)本發(fā)明的9-脫氧-31-O-脫甲基-FK506(標(biāo)記為3)處理CD3/CD28激活的人T細(xì)胞時，白細(xì)胞介素-2分泌的水平顯著增加以到達(dá)正常組的分泌，表現(xiàn)出與母體分子FK506及其衍生物的免疫抑制活性相反的結(jié)果。

(2)神經(jīng)再生活性的分析

使用與實(shí)施例3.(2)相同的方法測定9-脫氧-31-O-脫甲基-FK506與真實(shí)FK506相比的相對神經(jīng)再生性質(zhì)。

結(jié)果如圖11a和11b中所示，根據(jù)本發(fā)明的9-脫氧-31-O-脫甲基-FK506顯示出對神經(jīng)突增生促進(jìn)的優(yōu)異效果。在圖11中，A是指未處理的細(xì)胞，B是指僅用神經(jīng)生長因子處理的細(xì)胞，C是指在FK506存在下用神經(jīng)生長因子處理的細(xì)胞，并且D是指在9-脫氧-31-O-脫甲基-FK506存在下用神經(jīng)生長因子處理的細(xì)胞。

因此，根據(jù)本發(fā)明的包含9-脫氧-脯氨酰-FK506、31-O-脫甲基-FK506或9-脫氧-31-O-脫甲基-FK506的組合物具有降低的免疫抑制活性，可以促進(jìn)神經(jīng)再生并減少治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的副作用。

根據(jù)前述內(nèi)容，本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠理解，在不改變本發(fā)明的技術(shù)概念或本質(zhì)特征的情況下，本發(fā)明可以以其它具體形式實(shí)施。在這點(diǎn)上，本文中公開的示例性實(shí)施方式僅用于說明性目的，而不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明的范圍。相反地，本發(fā)明旨在不僅涵蓋示例性實(shí)施方式，而且涵蓋由所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)可以包括的各種替代、修改、等同物和其它實(shí)施方式。

[工業(yè)實(shí)用性]

根據(jù)本發(fā)明的組合物具有降低的免疫抑制活性，可以促進(jìn)神經(jīng)再生并且可以用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。