相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求2014年10月6日提交的美國臨時專利申請us62/060,484和2015年8月18日提交的美國臨時專利申請us62/206,770，us62/206,771和us62/206,772的申請日的權(quán)益。上述美國臨時專利申請的全部內(nèi)容通過引用并入本文。

本文公開的內(nèi)容涉及抗體和載體蛋白的新型組合物及其制備和使用方法，具體而言，所述組合物作為癌癥治療劑。

背景技術(shù)：

化療對于多種類型的癌癥(包括黑色素瘤)而言仍然是主要的全身性療法。大多數(shù)化療劑對腫瘤細胞僅略有選擇性，并且對健康增殖的細胞的毒性非常高(allentm.(2002)cancer2:750-763)，因此，通常會要求降低劑量，甚至中斷治療。理論上，克服化療毒性問題以及改善藥物療效的一條途徑是使用對由腫瘤細胞選擇性表達(或過表達)的蛋白質(zhì)具有特異性的抗體將化療藥物靶向腫瘤以將靶向藥物吸引至腫瘤，從而改變化療的生物分配并且將更多的藥物引導(dǎo)至腫瘤而較低地影響健康組織。雖然進行了30年的研究，但是在治療劑方面，特異性靶向罕有成功。

傳統(tǒng)的抗體依賴性化療(adc)采用通過合成的蛋白酶-可裂解的連接體連接至靶向抗體的毒性藥劑來設(shè)計。這種adc療法的療效取決于目標(biāo)細胞結(jié)合至抗體的能力，待裂解的連接體和目標(biāo)細胞對毒性藥劑的攝取。schrama,d.等人(2006)naturereviews.drugdiscovery5:147-159。

抗體靶向的化療相對于傳統(tǒng)療法具有顯著優(yōu)勢，因為該抗體靶向的化療提供了靶向能力、多個細胞毒性藥劑以及改善的治療能力與潛在較低的毒性的組合。雖然已對抗體靶向的化療進行了廣泛的研究，但是臨床上有效的抗體靶向的化療仍然難以捉摸：主要的障礙包括抗體和化療藥物之間的連接體的不穩(wěn)定性，連接至抗體時化療劑的腫瘤毒性降低以及結(jié)合物無法結(jié)合并進入腫瘤細胞。此外，這些療法不能控制抗體-藥物結(jié)合物的尺寸。

本領(lǐng)域仍然需要基于抗體的癌癥治療劑，其保留靶向遞送的藥物的細胞毒性作用，從而相對于現(xiàn)有技術(shù)中的治療劑提供可靠的且改善的抗腫瘤療效。

此外，對于任何治療應(yīng)用而言，本領(lǐng)域仍然還需要物理、化學(xué)和生物性質(zhì)穩(wěn)定的組合物。

凍干法或冷凍干燥除去了組合物中的水。在處理過程中，待干燥的材料首先被冷凍，隨后冰或冷凍的溶劑在真空環(huán)境中通過升華而被除去。預(yù)凍干的制劑中可包括賦形劑以提高冷凍干燥處理過程中的穩(wěn)定性和/或改善儲存后凍干產(chǎn)品的穩(wěn)定性。pikal,m.biopharm.3(9)26-30(1990)andarakawa等人,pharm.res.8(3):285-291(1991)。

雖然蛋白質(zhì)可被凍干，但是凍干和復(fù)溶的過程可影響蛋白質(zhì)的性質(zhì)。因為蛋白質(zhì)比傳統(tǒng)的有機和無機藥物更大并且更加復(fù)雜(即，除了復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)之外還具有多種官能團)，這種蛋白質(zhì)的制劑帶來了特殊的問題。為了保留蛋白質(zhì)的生物活性，制劑必須完整保護蛋白質(zhì)的氨基酸的至少核心序列的構(gòu)象完整性，同時保護蛋白質(zhì)的多種官能團不被降解。蛋白質(zhì)的降解途徑可涉及化學(xué)不穩(wěn)定性(即，涉及通過鍵形成或產(chǎn)生新的化學(xué)實體的裂解進行蛋白質(zhì)修飾的任何過程)或物理不穩(wěn)定性(即，蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)的改變)?；瘜W(xué)不穩(wěn)定性可由脫酰胺基作用、外消旋作用、水解、氧化、β消除或二硫鍵交換(disulfideexchange)引起。物理不穩(wěn)定性可由變性作用(例如，聚集、沉淀或吸附)引起。三種最常見的蛋白質(zhì)降解途徑是蛋白質(zhì)聚集、脫酰胺基作用和氧化。cleland,等人,criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems10(4):307-377(1993)。

在本發(fā)明中，組合物包含含有(a)載體蛋白，(b)抗體和(c)任選地治療劑的納米顆粒。所述抗體被認為通過疏水相互作用與所述載體蛋白結(jié)合，所述疏水相互作用本質(zhì)上較弱。因此，這種組合物的凍干和復(fù)溶不僅僅必然保留了單個成分的活性，而且還保留了它們在納米顆粒中的相對關(guān)系。

因為將納米顆粒用于治療，因此，帶來了進一步的挑戰(zhàn)。

例如，納米顆粒中疏水成分的重新排列可能通過各個成分之間的共價鍵而被降低。然而，這些共價鍵給癌癥治療中納米顆粒的治療用途帶來了挑戰(zhàn)?？贵w、載體蛋白和額外的治療劑通常在腫瘤內(nèi)的不同位置發(fā)揮作用并且通過不同的機理發(fā)揮作用。非共價鍵允許納米顆粒的成分在腫瘤處解離。因此，雖然共價鍵對于凍干可能是有利的，但是，其對于治療應(yīng)用而言可能是不利的。

納米顆粒的尺寸和粒度分布也是非常重要的。本發(fā)明的納米顆?？筛鶕?jù)其尺寸產(chǎn)生不同的表現(xiàn)。在大尺寸條件下，納米顆?；蜻@些顆粒的團聚可阻塞血管，其可影響組合物的性能和安全性。

最后，冷凍保護劑和有助于凍干過程的試劑必須是安全的且耐受治療應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

一方面，本文提供含有納米顆粒的納米顆粒組合物，其中，每個納米顆粒包含載體蛋白，約100至約1000個抗體和任選地至少一種治療劑，其中，所述抗體從所述納米顆粒的表面向外排列，并且，其中，所述納米顆粒能夠在體內(nèi)結(jié)合至預(yù)定的表位。

當(dāng)靜脈內(nèi)給藥時，大的顆粒(例如，大于1μm)通常是不利的，因為它們可在肺的微血管中形成沉積。同時，較大的顆?？稍谀[瘤或特定器官中累積。參見，例如，用于注射進入供給肝臟腫瘤的肝動脈的20-60微米的玻璃顆粒，稱為“治療微球(therasphere)”(臨床上用于肝癌)。

因此，對于靜脈內(nèi)給藥而言，使用1μm以下的顆粒。更加通常而言，1μm以上的顆粒直接給藥于腫瘤(“直接注射”)或給藥于供給至腫瘤位點的動脈。

另一方面，本文提供包含納米顆粒的納米顆粒組合物，其中，每個納米顆粒包含載體蛋白，該載體蛋白不是白蛋白；約100至約100個抗體，優(yōu)選地約400至約800個抗體；以及任選地至少一種治療劑，其中，所述抗體被排布在所述納米顆粒的外表面，并且，其中，所述納米顆粒能夠在體內(nèi)結(jié)合至預(yù)定的表位。當(dāng)所述納米顆粒發(fā)生多聚化時，抗體的數(shù)量成比例地增加。例如，如果160nm的納米顆粒包含400個抗體，那么，直徑為320nm的二聚體包含約800個抗體。

另一方面，本文提供包含納米顆粒的納米顆粒組合物，其中，每個納米顆粒包含載體蛋白，約400至約800個抗體以及任選地至少一種治療劑，該治療劑不是紫杉醇，其中，所述抗體被排布在所述納米顆粒的表面，這樣，所述抗體的結(jié)合部分從該表面指向外部，并且，其中，所述納米顆粒能夠在體內(nèi)結(jié)合至預(yù)定的表位。

在其他實施方式中，所述納米顆粒發(fā)生多聚化，例如，二聚化。多聚化作用可被看做是單位分子的重量或尺寸加倍，例如，160nm的顆粒多聚化為約320nm，480nm，640nm，等等。在一些實施方式中，顆粒群中少于20％是多聚體。在一些實施方式中，顆粒群中多于80％是多聚體。

在一種實施方式中，載體結(jié)合的藥物與抗體(例如，白蛋白結(jié)合的紫杉醇與貝伐單抗)的重量比為約5:1至約1:1。在一種實施方式中，載體結(jié)合的藥物與抗體的重量比為約10:4。在一種實施方式中，抗體是在納米顆粒的全部表面或部分表面上的基本單層的抗體。在一種實施方式中，組合物中少于0.01％的納米顆粒的尺寸選自：大于200nm，大于300nm，大于400nm，大于500nm，大于600nm，大于700nm和大于800nm。較大的尺寸被認為是若干個納米顆粒多聚化的結(jié)果，每個納米顆粒包含核心和位于每個納米顆粒的全部表面或部分表面上的抗體涂層。

本發(fā)明還包括凍干的組合物，并且凍干的組合物實質(zhì)上不會與新鮮制備的納米顆粒的性質(zhì)不同或者和新鮮制備的納米顆粒的性質(zhì)相同。具體而言，重懸于水性溶液之后，凍干的組合物與新鮮的組合物在粒度、粒度分布、對癌細胞的毒性、抗體親和性和抗體特異性方面類似或等同。本發(fā)明涉及如下意想不到的發(fā)現(xiàn)：凍干的納米顆粒保持新鮮制備的納米顆粒的性質(zhì)，盡管在這些顆粒中存在兩種不同的蛋白質(zhì)成分。

一方面，本發(fā)明涉及包含納米顆粒的凍干的納米顆粒組合物，其中，每個納米顆粒包含載體結(jié)合的藥物核心和一定量的排布在所述核心的表面的抗體，從而使抗體的結(jié)合部分從所述表面指向外部，其中，所述抗體在復(fù)溶于水性溶液之后保持其與所述納米顆粒的外表面的結(jié)合。在一種實施方式中，凍干的組合物在室溫下穩(wěn)定至少3個月。在一種實施方式中，復(fù)溶的納米顆粒保持治療劑的活性并且能夠在體內(nèi)結(jié)合至靶點。

在一種實施方式中，復(fù)溶的納米顆粒的平均尺寸為約130nm至約1μm。在優(yōu)選的實施方式中，復(fù)溶的納米顆粒的平均尺寸為約130nm至約200nm，并且，更優(yōu)選地為約160nm。在一種實施方式中，復(fù)溶的納米顆粒的平均尺寸為大于800nm至約3.5μm，其包含較小的納米顆粒的多聚體，例如，100nm-200nm納米顆粒的多聚體。在一種實施方式中，核心與抗體的重量比為大于1:1至約1:3。

一方面，本文公開的內(nèi)容涉及包含納米顆粒的凍干的納米顆粒組合物，其中，每個納米顆粒包含：(a)白蛋白結(jié)合的紫杉醇核心和(b)排布在所述白蛋白結(jié)合的紫杉醇核心的表面上的約400個分子至約800個分子的貝伐單抗，這樣，抗體的結(jié)合蛋白從所述表面指向外部，其中，所述抗體在復(fù)溶于水性溶液之后保持其與所述納米顆粒的表面的結(jié)合，條件是所述凍干的組合物在約20℃至約25℃的條件下穩(wěn)定至少3個月并且復(fù)溶的納米顆粒能夠在體內(nèi)結(jié)合至vegf。

在其他方面，本文公開的內(nèi)容涉及包含納米顆粒的凍干的納米顆粒組合物，其中，每個納米顆粒包含：(a)白蛋白結(jié)合的紫杉醇核心和(b)排布在所述白蛋白結(jié)合的紫杉醇核心的表面的一定量的貝伐單抗，這樣，抗體的結(jié)合部分從所述表面指向外部，其中，所述抗體在復(fù)溶于水性溶液之后保持其與所述納米顆粒的表面的結(jié)合，條件是所述凍干的組合物在約20℃至約25℃的條件下穩(wěn)定至少3個月并且復(fù)溶的納米顆粒能夠在體內(nèi)結(jié)合至vegf，進一步地，其中，復(fù)溶的納米顆粒的平均粒度基本上不會與新鮮制備的納米顆粒的粒度不同。在一些實施方式中，粒度為200nm至800nm，包括200nm，300nm，400nm，500nm，600nm，700nm或800nm。在其他實施方式中，顆粒更大，例如，大于800nm至約3.5μm。在一些實施方式中，顆粒是納米顆粒的多聚體。

在一些實施方式中，白蛋白結(jié)合的紫杉醇與貝伐單抗的重量比為約5:1至約1:1。在其他實施方式中，白蛋白結(jié)合的紫杉醇與貝伐單抗的重量比為約10:4。在進一步的實施方式中，白蛋白結(jié)合的紫杉醇與貝伐單抗的重量比為大于1:1至約1:3。

在一些實施方式中，核心是白蛋白結(jié)合的紫杉醇，并且抗體選自：選擇性識別vegf的抗體(例如，貝伐單抗/阿瓦斯汀)，選擇性識別cd20的抗體(例如，利妥昔單抗/rituxin)和選擇性識別her2的抗體(曲妥單抗/赫賽汀)。

在一些實施方式中，所述至少一種治療劑位于納米顆粒內(nèi)部。在其他實施方式中，所述至少一種治療劑位于納米顆粒的外表面上。在其他實施方式中，所述至少一種治療劑位于納米顆粒內(nèi)部和納米顆粒的外表面上。

在一些實施方式中，所述納米顆粒包含多于一種類型的治療劑。例如，紫杉烷和鉑藥物，例如，紫杉醇和順鉑。

在一些實施方式中，所述抗體選自：ado-曲妥珠單抗emtansine，阿侖單抗(alemtuzumab)，貝伐單抗，西妥昔單抗(cetuximab)，地諾單抗(denosumab)，dinutuximab，伊匹單抗(ipilimumab)，納武單抗(nivolumab)，obinutuzumab，奧法木單抗(ofatumumab)，帕尼單抗(panitumumab)，派姆單抗(pembrolizumab)，帕妥珠單抗(pertuzumab)，利妥昔單抗和曲妥珠單抗。在一些實施方式中，所述抗體是所述納米顆粒的全部表面或部分表面上的基本單層的抗體。

在進一步的實施方式中，所述抗體的糖基化比在天然人抗體中通常發(fā)現(xiàn)的糖基化少。這種糖基化作用可受到例如表達系統(tǒng)或表達過程中糖基化作用抑制劑的存在的影響。在一些實施方式中，所述抗體的糖基化狀態(tài)可通過酶作用或化學(xué)作用發(fā)生改變。

在一些實施方式中，所述至少一種治療劑選自：阿比特龍(abiraterone),苯達莫司汀(bendamustine),硼替佐米(bortezomib),卡鉑(carboplatin),卡巴他賽(cabazitaxel),順鉑(cisplatin),苯丁酸氮芥(chlorambucil),達沙替尼(dasatinib),多西他賽(docetaxel),阿霉素(doxorubicin),表柔比星(epirubicin),厄洛替尼(erlotinib),依托泊苷(etoposide),依維莫司(everolimus),吉非替尼(gefitinib),柔紅霉素(idarubicin),伊馬替尼(imatinib),羥基脲(hydroxyurea),伊馬替尼(imatinib),拉帕替尼(lapatinib),亮丙瑞林(leuprorelin),美法侖(melphalan),氨甲蝶呤(methotrexate),二羥蒽酮(mitoxantrone),奈達鉑(nedaplatin),尼羅替尼(nilotinib),奧沙利鉑(oxaliplatin),紫杉醇(paclitaxel),帕唑帕尼(pazopanib),培美曲塞(pemetrexed),吡鉑(picoplatin),羅米地辛(romidepsin),沙鉑(satraplatin),索拉非尼(sorafenib),威羅菲尼(vemurafenib),舒尼替尼(sunitinib),替尼泊苷(teniposide),三鉑(triplatin),長春花堿(vinblastine),長春瑞濱(vinorelbine),長春新堿(vincristine)和環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)。

在一些實施方式中，所述納米顆粒還包含至少一種額外的治療劑，該額外的治療劑不是紫杉醇或貝伐單抗。

在一些實施方式中，所述抗體、載體蛋白以及治療劑(當(dāng)存在時)通過非共價鍵結(jié)合。

在一些實施方式中，所述載體蛋白選自：明膠、彈性蛋白、醇溶蛋白、豆球蛋白、玉米蛋白、大豆蛋白、乳蛋白和乳清蛋白。在其他實施方式中，所述載體蛋白是白蛋白，例如，人血清白蛋白。

在一些實施方式中，組合物被配制成用于靜脈內(nèi)遞送。在其他實施方式中，組合物被配制成用于直接注射或灌注至腫瘤內(nèi)。

在一些實施方式中，組合物中的納米顆粒的平均尺寸為大于800nm至約3.5μm。

在一些實施方式中，納米顆粒的解離常數(shù)為約1x10^-11m至約1x10^-9m。

另一方面，本文提供制備納米顆粒組合物的方法，其中，所述方法包括在各個成分的比例允許形成期望的納米顆粒的條件下，使載體蛋白和任選地至少一種治療劑在ph為5.0至7.5且溫度為5℃至60℃，23℃至60℃，或55℃至60℃的溶液中與抗體接觸。在一種實施方式中，納米顆粒在55℃至60℃，ph為7.0的條件下制備。另一方面，本文提供制備納米顆粒組合物的方法，其中，所述方法包括(a)使載體蛋白與任選地至少一種治療劑接觸以形成核心以及(b)在各個成分的比例允許形成期望的納米顆粒的條件下使所述核心在ph為約5.0至約7.5且溫度為約5℃至約60℃，約23℃至約60℃或約55℃至約60℃的溶液中與所述抗體接觸。

為了形成期望的納米顆粒，對各個成分(例如，載體蛋白、抗體、治療劑或其組合)的量進行控制。各個成分太稀的組合物無法形成本文所述的納米顆粒。在優(yōu)選的實施方式中，載體蛋白與抗體的重量比為10:4。在一些實施方式中，載體蛋白的量為約1mg/ml至約100mg/ml。在一些實施方式中，抗體的量為約1mg/ml至約30mg/ml。例如，在一些實施方式中，載體蛋白:抗體:溶液的比例為1ml溶液(例如，鹽水)中約9mg載體蛋白(例如，白蛋白)和4mg抗體(例如，bev)。治療劑(例如，紫杉醇)的量也可加至所述載體蛋白。

在進一步的實施方式中，所述納米顆粒如上所述制備并且隨后凍干。

另一方面，本文提供治療癌細胞的方法，所述方法包括使所述細胞與有效量的本文公開的納米顆粒組合物接觸，從而治療癌細胞。

另一方面，本文提供治療有此需求的患者體內(nèi)的腫瘤的方法，所述方法包括使細胞與有效量的本文公開的納米顆粒組合物接觸，從而治療腫瘤。在一些實施方式中，腫瘤尺寸減小。在其他實施方式中，所述納米顆粒組合物靜脈內(nèi)給藥。在其他實施方式中，所述納米顆粒組合物通過直接注射或灌注至腫瘤內(nèi)給藥。

在一些實施方式中，本文提供的方法包括如下步驟：a)每周一次給藥納米顆粒組合物持續(xù)三周；b)停止納米顆粒組合物的給藥持續(xù)一周；以及c)根據(jù)需要重復(fù)步驟a)和b)，從而治療腫瘤。

在相關(guān)的實施方式中，治療包括在給藥納米顆粒之前給藥靶向抗體。在一種實施方式中，靶向抗體在給藥納米顆粒之前約6至48小時或12至48小時給藥。在另一實施方式中，靶向抗體在給藥納米顆粒之前6小時至12小時給藥。在另一實施方式中，靶向抗體在給藥納米顆粒之前2小時至8小時給藥。在其他實施方式中，靶向抗體在給藥納米顆粒之前一周給藥。例如，在給藥ab160之前24小時給藥一劑bev。在另一實施例中，在給藥ar納米顆粒之前進行利妥昔單抗的在先給藥。在納米顆粒之前給藥的抗體可作為一劑給藥，該一劑是亞治療劑量的，例如，通常被認為的治療劑量的二分之一，十分之一或二十分之一。因此，在男性體內(nèi)，采用bev預(yù)先治療可包括給藥常規(guī)劑量的十分之一的1mg/kg的bev，隨后給藥ab160。

在一些實施方式中，治療有效量包括約75mg/m²至約175mg/m²的載體蛋白(即，毫克載體蛋白/m²患者)。在其他實施方式中，治療有效量包括約75mg/m²至約175mg/m²的治療劑(例如，紫杉醇)。在其他實施方式中，治療有效量包括約30mg/m²至約70mg/m²的抗體。在其他實施方式中，治療有效量包括約30mg/m²至約70mg/m²的貝伐單抗。

在一種特定的實施方式中，凍干的組合物包括約75mg/m²至約175mg/m²的載體蛋白，所述載體蛋白優(yōu)選為白蛋白；約30mg/m²至約70mg/m²的抗體，所述抗體優(yōu)選為貝伐單抗；以及約75mg/m²至約175mg/m²的紫杉醇。

附圖說明

下列附圖僅僅是本發(fā)明的代表性附圖并且無意作為限定。為了一致起見，使用和貝伐單抗的本發(fā)明的納米顆粒使用首字母縮略詞“ab”并且ab之后的數(shù)字(例如，ab160)是指這些納米顆粒的平均粒度(單位為納米)。同樣，當(dāng)抗體為利妥昔單抗時，首字母縮略詞為“ar”，同時其后的數(shù)字保持相同的含義。

圖1a顯示了流式細胞分選散點圖，其包括：僅采用二抗染色的(abx–獲自celgenecorporation,summit,nj07901)(左上圖)，采用山羊抗-小鼠igg1fab和二抗染色的abx(右上圖)，僅采用二抗染色的ab160(其是比例為約10:4且平均粒度為160nm的白蛋白結(jié)合的紫杉醇與貝伐單抗的納米顆粒)(左下圖)，或采用山羊抗-小鼠igg1fab和二抗染色的ab160(右下圖)。

圖1b顯示了用金顆粒標(biāo)記的抗-人iggfc孵育ab160之后的代表性的電子顯微照片。

圖1c顯示了表明ab160部分(顆粒，大于100kd的蛋白質(zhì)和小于100kd的蛋白質(zhì))中總紫杉醇的百分含量的餅圖(上圖)以及抗小鼠iggfab抗體(bev)和紫杉醇的western印跡，從而證明了共定位(下圖)。

圖1d表示與單獨的abx相比，在使用a375人黑色素瘤細胞的體外毒性檢測中紫杉醇的活性。結(jié)果由平均(+/-sem)增殖指數(shù)代表，該指數(shù)是未處理的細胞的總增殖百分數(shù)。該數(shù)據(jù)代表了三次實驗并且差異不顯著。

圖1e表示vegf與abx和ab160共孵育之后上清液的vegfelisa結(jié)果，以確定配體、vegf與抗體的結(jié)合。結(jié)果顯示為未與兩種復(fù)合物結(jié)合的vegf的平均百分比+/-sem。數(shù)據(jù)代表三次實驗**p<0.005。

圖2a顯示了在形成納米顆粒以及更大尺寸的顆粒的條件下通過將bev(貝伐單抗)加至abx形成的復(fù)合物的尺寸(通過光散射技術(shù)確定)。將增加的濃度的bev(0-25mg)加至10mgabx中并且確定所形成的復(fù)合物的尺寸。復(fù)合物的平均尺寸(146nm至2,166nm)隨著bev濃度的增加而增加。數(shù)據(jù)顯示為樣品的體積/尺寸并且圖顯示了顆粒的粒度分布。該數(shù)據(jù)代表了5個單獨的藥物制劑。作為對比，abx其自身的平均粒度為約130nm。

圖2b顯示了abx與bev的結(jié)合親和性(通過光吸收(blitz)技術(shù)確定)。數(shù)據(jù)顯示為解離常數(shù)(kd)。評估了在四個ph水平(3，5，7，9)和3個溫度(室溫，37℃和58℃)條件下制備的顆粒的結(jié)合親和性，并且數(shù)據(jù)代表5個實驗。

圖2c顯示了圖2b中的納米顆粒復(fù)合物在血清中的穩(wěn)定性，其由在nanosight300(ns300)上的納米顆粒追蹤分析(nta)確定。數(shù)據(jù)顯示為顆粒數(shù)/mgabx并且在每種條件下將在室溫和ph為7條件下制備的ab160(ab16007；粒度，ph)，58℃和ph為7條件下制備的ab160(ab1600758；粒度，ph，溫度)以及58℃和ph為5條件下制備的ab160(ab1600558，粒度，ph，溫度)與單獨的abx進行比較。一旦制備了顆粒，就將其加至人ab血清中持續(xù)15分鐘、30分鐘和60分鐘，以確定隨時間在血清中的穩(wěn)定性。

圖3a顯示了在右側(cè)肋腹注射有1x10⁶個a375人黑色素瘤細胞且用pbs，12mg/kgbev，30mg/kgabx，12mg/kgbev+30mg/kgabx或ab160治療(具有大約12mg/kgbev和大約30mg/kgabx)的無胸腺裸鼠中對ab納米顆粒的體內(nèi)測試，所述無胸腺裸鼠體內(nèi)的腫瘤尺寸為約600mm³至900mm³。數(shù)據(jù)被表示為治療后第七天腫瘤尺寸相對于基線(治療當(dāng)天的腫瘤尺寸)的變化百分比。student’st-測試用于確定顯著性。ab顆粒的p值相對于pbs、單獨給藥的單個藥物和按順序給藥的兩種藥物均具有顯著性差異。

圖3b顯示了圖3a中分析的小鼠的中值生存期所產(chǎn)生的kaplan-meier曲線。使用mantle-cox測試比較生存期曲線確定顯著性。

圖3c顯示了當(dāng)腫瘤小于或大于700mm³時所治療的小鼠相對于基線的變化百分比，以確定腫瘤尺寸是否影響腫瘤對單獨的abx和ab160組的響應(yīng)。student’st-測試用于確定顯著性，基于腫瘤尺寸，單獨的abx組顯示出沒有顯著性差異(p＝0.752)，而ab160組具有顯著性差異(p＝0.0057)。

圖3d顯示了在右側(cè)肋腹注射有1x10⁶個a375人黑色素瘤細胞且用pbs，30mg/kgabx或45mg/kgbev和ab160，ab580(白蛋白結(jié)合的紫杉醇和貝伐單抗的納米顆粒的平均粒度為580nm)或ab1130(白蛋白結(jié)合的紫杉醇和貝伐單抗的納米顆粒的平均粒度為1130nm)治療的無胸腺裸鼠中對ab納米顆粒體內(nèi)測試，所述無胸腺裸鼠體內(nèi)的腫瘤尺寸為約600mm³至900mm³。數(shù)據(jù)被表示為治療后第七天腫瘤尺寸相對于基線(治療當(dāng)天的腫瘤尺寸)的變化百分比。student’st-測試用于確定顯著性。ab顆粒的p值相對于pbs、單獨給藥的單個藥物和按順序給藥的兩種藥物均具有顯著性差異。不同尺寸的ab顆粒之間沒有顯著性差異。

圖3e顯示了圖3d中分析的小鼠的中值生存期所產(chǎn)生的kaplan-meier曲線。使用mantle-cox測試比較生存期曲線確定顯著性。

圖4a顯示了在abx或ab160的環(huán)境下在iv注射有30mg/kg紫杉醇之后0-24小時從不帶有腫瘤和帶有腫瘤的小鼠中采集的且通過lc-ms測量的血液和腫瘤樣本的基礎(chǔ)上，采用對數(shù)標(biāo)度的y軸以線性圖顯示的血液紫杉醇濃度。在0時間對小鼠進行iv注射，在0、4、8、12和24小時的時間點采集血液樣本并且宰殺小鼠。每個時間點至少有三個小鼠。student’st-測試用于確定abx和ab160之間的濃度是否具有任何顯著性差異。

圖4b顯示了來自圖4a的血液紫杉醇濃度，顯示為數(shù)字標(biāo)度的y軸線圖。

圖4c顯示了來自圖4a和圖4b中提供的血液濃度數(shù)據(jù)計算的cmax，半衰期和auc值。

圖4d顯示了采用對數(shù)標(biāo)度的y軸在線性圖中顯示的血液紫杉醇濃度，該血液紫杉醇濃度來自使用較早的時間點(2至8小時)的第二藥代動力學(xué)實驗。

圖4e顯示了來自圖4d的血液紫杉醇濃度，其顯示在采用數(shù)字標(biāo)度的y軸的線圖中。

圖4f顯示了小鼠中的血液紫杉醇濃度，在所述小鼠中，腫瘤被允許生長至較大尺寸，隨后注射abx和ab160。

圖4g顯示了通過圖4f的數(shù)據(jù)計算的cmax和auc。

圖4h顯示了通過lc-ms確定的來自第二小鼠實驗的腫瘤中的紫杉醇濃度。數(shù)據(jù)顯示為μg紫杉醇/mg腫瘤組織。student’st-測試用于確定是否具有顯著性差異。

圖4i顯示了相對于用單獨的abx治療的小鼠，用ab160治療的小鼠體內(nèi)的i-125輻射水平。

圖4j顯示了圖4i所示的i-125輻射水平的圖形表示。

圖5a顯示了采用利妥昔單抗制備的納米顆粒的粒度測量值和親和性。10mg/ml的abx采用0-10mg/ml的利妥昔單抗(rit)孵育并且將光散射技術(shù)(mastersizer2000)用于測定得到的粒度。數(shù)據(jù)顯示為每種尺寸的顆粒的體積百分比并且曲線代表粒度分布(上圖)。表格(下圖)顯示了在每種抗體濃度條件下得到的顆粒的尺寸。

圖5b顯示了采用曲妥珠單抗制備的納米顆粒的粒度測量值和親和性。10mg/ml的abx用0-22mg/ml的曲妥珠單抗(her)孵育并且將光散射技術(shù)(mastersizer2000)用于確定得到的顆粒的尺寸。數(shù)據(jù)顯示為每種尺寸的顆粒的體積百分比并且曲線代表粒度分布(上圖)。表格(下圖)顯示了在每種抗體濃度條件下得到的顆粒的尺寸。

圖5c顯示了在ph為3、5、7和9的條件下與abx相比利妥昔單抗和曲妥珠單抗的結(jié)合親和性，其由生物膜干涉(blitz)技術(shù)確定。顯示每種相互作用的解離常數(shù)。

圖6a顯示了采用cd20陽性daudi人淋巴瘤細胞系測試的ar160的體外毒性。數(shù)據(jù)顯示在增殖指數(shù)的圖中，所述增殖指數(shù)是處理的孔中的fitc陽性細胞相對于未處理的孔中的fitc陽性細胞的百分比(最高水平的增殖)。

圖6b顯示了在右側(cè)肋腹中注射有5x10⁶個daudi人淋巴瘤細胞的無胸腺裸鼠體內(nèi)腫瘤療效。腫瘤被允許生長至600mm³至900mm³并且用pbs，30mg/kgabx，12mg/kg利妥昔單抗，12mg/kg利妥昔單抗+30mg/kgabx或ar160治療小鼠。在治療后第7天通過從治療第一天開始的腫瘤尺寸的變化百分比來確定腫瘤反應(yīng)。通過student’st-測試確定顯著性；ar160治療的小鼠與所有其他組之間的相對于基線的變化百分比具有顯著性差異(p<0.0001)。

圖6c顯示了圖6b中所示的實驗產(chǎn)生的kaplan-meier生存期曲線。顯示了每個治療組的中值生存期。mantle-cox測試用于確定生存期曲線是否具有顯著性差異。

圖7a顯示了將另一化療藥物(順鉑)順鉑加至ab160。在室溫條件下采用順鉑(0.5mg/ml)孵育abx(5mg/ml)持續(xù)30分鐘并且在除去abx顆粒之后通過hplc測量上清液中的游離順鉑。從起始濃度中減去游離順鉑的量以確定結(jié)合至abx的順鉑的量。數(shù)據(jù)顯示在柱狀圖中，其中帶有起始濃度(順鉑)。

圖7b顯示了a375人黑色素瘤細胞的增殖檢測中順鉑結(jié)合的abx(ac)的毒性。在藥物暴露以及edu摻入24小時后，用fitc結(jié)合的抗-edu抗體對細胞進行固定，透化和標(biāo)記。數(shù)據(jù)顯示在增殖指數(shù)的圖中，所述增殖指數(shù)是處理的孔中的fitc陽性細胞相對于未處理的孔中的fitc陽性細胞(最高水平增殖)的百分比。

圖7c顯示了右側(cè)肋腹中注射有1x10⁶個a375人黑色素瘤細胞的無胸腺裸鼠中的ac(abc復(fù)合物，順鉑結(jié)合的abx)的體內(nèi)腫瘤療效。腫瘤被允許生長至600mm³至900mm³，并且用pbs，30mg/kgabx，2mg/kg順鉑，ab160，2mg/kg順鉑+ab160或abc160治療小鼠。在治療后第七天通過從治療開始當(dāng)天腫瘤尺寸的變化百分比確定腫瘤反應(yīng)。通過student’st-測試確定顯著性；相對于基線，用abc160治療的小鼠與pbs-治療的小鼠、順鉑治療的小鼠或abx治療小鼠的變化百分比具有顯著性差異(p<0.0001)。相對于基線，ab160治療組、ab160+順鉑治療組合及abc160治療組在治療后第七天的變化百分比沒有顯著性差異。

圖7d顯示了基于圖7c所示的實驗產(chǎn)生的kaplan-meier生存期曲線并且顯示了每個治療組的中值生存期。mantle-cox測試用于確定生存期曲線是否具有顯著性差異。

圖8a顯示了與新鮮的ab160或單獨的abx相比，被凍干、在室溫下儲存一個月并復(fù)溶的ab160納米顆粒的粒度分布。

圖8b顯示了與新鮮的ab160或單獨的abx相比，被凍干、在室溫下儲存一個月并復(fù)溶的ab160納米顆粒的配體(vegf)結(jié)合能力。

圖8c顯示了與新鮮的ab160或單獨的abx相比，被凍干、在室溫下儲存一個月并復(fù)溶的ab160納米顆粒的體外癌細胞毒性。

圖8d顯示了與新鮮的ab160或單獨的abx相比，被凍干、在室溫下儲存十個月并復(fù)溶的ab160納米顆粒的粒度分布。

圖8e顯示了與新鮮的ab160或單獨的abx相比，被凍干、在室溫下儲存十個月并復(fù)溶的ab160納米顆粒的配體(vegf)結(jié)合能力。

圖8f顯示了與新鮮的ab160或單獨的abx相比，被凍干、在室溫下儲存十個月并復(fù)溶的ab160納米顆粒的體外癌細胞毒性。

圖9a至c顯示了在鹽水中室溫條件下孵育了長達24小時的abx-bev復(fù)合物在i.v.輸注條件(abx最終濃度為5mg/ml)下的粒度分布(圖a和b)。經(jīng)過在室溫下4個小時，由elisa得到復(fù)合物分解的一些證據(jù)(20％，圖c)。

圖10顯示了在相對體積比例為9:1或1:1的條件下鹽水或肝素化的人血漿中的abx(上圖)或ab160(下圖)的30秒體外孵育。

圖11a至e顯示了右側(cè)肋腹注射有1x10⁶個a375人黑色素瘤細胞的并用pbs(圖11a)、12mg/kgbev(圖11b)、30mg/kgabx(圖11c)，ab160(圖11d)治療的或用0.12mg/kgbev預(yù)治療且24小時后用ab160治療(圖11e)的無胸腺裸鼠的體內(nèi)測試。數(shù)據(jù)表示為治療后第7天和治療后第10天的腫瘤體積(mm³)。

圖11f總結(jié)了圖11a至e的治療后7天的數(shù)據(jù)。

圖11g總結(jié)了圖11a至e的治療后10天的數(shù)據(jù)。

具體實施方式

在閱讀了具體實施方式這部分的內(nèi)容之后，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，如何在各種可選的實施方式和可選的應(yīng)用中實施本發(fā)明將變得明顯。然而，本發(fā)明的所有各種不同的實施方式不會在本文中描述。應(yīng)當(dāng)理解的是，本文提供的實施方式僅以舉例的方式呈現(xiàn)，并不產(chǎn)生限定。這樣，各種不同的可選的實施方式的詳細描述不應(yīng)當(dāng)被解釋為對下文所列舉的本發(fā)明的范圍或廣度的限定。

在公開并描述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)理解的是，下文描述的各個方面不限定于特定的組合物、該組合物的制備方法或其用途，當(dāng)然，下文描述的各個方面可發(fā)生改變。還應(yīng)當(dāng)理解的是，本文使用的術(shù)語僅僅是為了描述各個具體的方面而無意進行限定。

為了方便讀者，本發(fā)明的具體實施方式部分分為多個部分，并且在任何部分中發(fā)現(xiàn)的公開內(nèi)容可與另一部分結(jié)合。為了方便讀者，將標(biāo)題或副標(biāo)題可用于說明書中，而標(biāo)題或副標(biāo)題無意影響本發(fā)明的范圍。

釋義

除非另有說明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義。在說明書和后附的權(quán)利要求書中，參考定義為具有如下含義的多個術(shù)語。

本文使用的術(shù)語僅僅是為了描述特定實施方式，無意限定本發(fā)明。本文使用的單數(shù)形式冠詞(“a”，“an”和“the”)也意在包括復(fù)數(shù)形式，除非另有明確說明。

“任選的”或“任選地”是指接下來描述的事件或情況可能發(fā)生或可能不發(fā)生，并且描述的內(nèi)容包括事件或情況發(fā)生的實例和不發(fā)生的實例。

在數(shù)字名稱(例如，溫度、時間、量、濃度，等等，包括范圍)之前使用的術(shù)語“約”表示近似值，其可以在正(+)負(-)10％，正(+)負(-)5％，正(+)負(-)1％或其之間的任何子范圍或子值的范圍內(nèi)變化。優(yōu)選地，與劑量相關(guān)使用的術(shù)語“約”是指劑量可發(fā)生正負(+/-)10％的改變。例如，“約400個至約800個抗體”是指納米顆粒的外表面包含的抗體的量為約360個至880個顆粒。

“包含(comprising或comprises)”是指組合物和方法包括所記載的成分，但不排除其他成分。限定組合物和方法時使用的“基本由……構(gòu)成”是指排除任何對用于指定目的的組合而言本質(zhì)上顯著的其他成分。因此，基本由本文所限定的組分構(gòu)成的組合物可不排除對要求保護的發(fā)明的基本且新穎的特點本質(zhì)上無影響的其他材料或步驟?！坝伞瓨?gòu)成”是指排除其他高于痕量的成分和基本方法步驟。由這些過渡術(shù)語中的每一個界定的實施方式在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

本文使用的術(shù)語“納米顆?！笔侵钢辽僖粋€維度小于5微米的顆粒。在優(yōu)選的實施方式中，例如，用于靜脈內(nèi)給藥而言，納米顆粒小于1微米。對于直接給藥而言，納米顆粒較大。本發(fā)明明確考慮甚至更大的顆粒。

在顆粒群中，單個顆粒的尺寸圍繞平均值分布。因此，顆粒群的粒度可由平均值表示并且也可由百分率來表示。d50是如下粒度：50％的顆粒的粒度低于該粒度。10％的顆粒小于d10值并且90％的顆粒小于d90。在不清楚的情況下，“平均”尺寸等同于d50。因此，例如，ab160是指平均尺寸為160nm的納米顆粒。

術(shù)語“納米顆?！币部砂ǜ卧募{米顆粒的離散多聚體。例如，320nm顆粒包括單元160nm納米顆粒的二聚體。因此，對于160nm的納米顆粒而言，多聚體為約320nm，480nm，640nm，800nm，960nm，1120nm，等等。

本文使用的術(shù)語“載體蛋白”是指起到運輸抗體和/或治療劑的作用的蛋白質(zhì)。本文公開的抗體可可逆地結(jié)合至載體蛋白。示例性的載體蛋白在下文更加詳細地討論。

本文使用的術(shù)語“核心”是指可由載體蛋白、載體蛋白和治療劑或其他藥劑或藥劑的組合構(gòu)成的納米顆粒的中心或內(nèi)部部分。在一些實施方式中，抗體的疏水部分可并入所述核心。

本文使用的術(shù)語“治療劑”是指治療上有用的藥劑，例如，用于治療、緩解或弱化疾病狀態(tài)、生理學(xué)狀況、癥狀或致病因素，或者用于對疾病狀態(tài)、生理學(xué)狀況、癥狀或致病因素進行評估和診斷的藥劑。治療劑可以是化療劑，例如，有絲分裂抑制劑，拓撲異構(gòu)酶抑制劑，類固醇，抗腫瘤抗生素，抗代謝劑，烷基化劑，酶，蛋白酶體抑制劑或它們的任何組合。

本文使用的術(shù)語“抗體(antibody或antidies)”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分(即，含有免疫特異性結(jié)合抗原的抗原結(jié)合位點的分子)。該術(shù)語還指由兩個免疫球蛋白重鏈和兩個免疫球蛋白輕鏈構(gòu)成的抗體以及包括全長抗體及其部分的多種形式；包括，例如，免疫球蛋白分子，單克隆抗體，嵌合抗體，cdr接枝的抗體，人源化抗體，fab，fab’，f(ab’)2，fv，二硫化物連接的fv，scfv，單結(jié)構(gòu)域抗體(dab)，雙價抗體，多特異性抗體，雙特異性抗體，抗獨特型抗體，雙特異性抗體，它們的功能活性表位結(jié)合片段，雙功能雜交抗體(例如，lanzavecchia等人,eur.j.immunol.17,105(1987))和單鏈(例如，huston等人,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,85,5879-5883(1988)和bird等人,science242,423-426(1988)，其通過引用并入本文)(參見，總體上，hood等人,immunology,benjamin,n.y.,第二版(1984)；harlowandlane,antibodies.alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory(1988)；hunkapillerandhood,nature,323,15-16(1986)，其通過引用并入本文)?？贵w可以是任何類型(例如，igg，iga，igm，ige或igd)。優(yōu)選地，抗體是igg。抗體可以是非人抗體(例如，來自小鼠、山羊或任何其他動物)，全部人抗體，人源化抗體或嵌合抗體。

術(shù)語“解離常數(shù)”(也稱為“kd”)是指表達特定物質(zhì)分離成單個成分(例如，蛋白載體，抗體和任選的治療劑)的程度的量。

本文使用的術(shù)語“凍干(lyophilized，lyophilization，等等)”是指如下過程：通過該過程，待干燥的材料(例如，納米顆粒)首先被冷凍，隨后冰或冷凍的溶劑在真空環(huán)境中通過升華而被除去。任選地，賦形劑被包括在預(yù)凍干的制劑中以提高凍干的產(chǎn)品存儲后的穩(wěn)定性。在一些實施方式中，納米顆?？捎蓛龈傻某煞?載體蛋白，抗體和任選的治療劑)形成，隨后用作治療劑。在其他實施方式中，載體蛋白，抗體和任選的治療劑首先被合并至納米顆粒中，隨后被凍干。凍干的樣品還可包含其他賦形劑。

術(shù)語“填充劑”包括提供冷凍干燥的產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)的試劑。用于填充劑的常見實例包括甘露醇、甘氨酸、乳糖和蔗糖。除了提供藥學(xué)上美觀的餅狀物之外，填充劑還可在改良塌陷溫度、提供冷凍-融化保護和提高蛋白質(zhì)的長期儲存穩(wěn)定性方面賦予有用的性質(zhì)。這些試劑還可作為張力調(diào)整劑。

術(shù)語“緩沖劑”包括凍干之前將溶液ph維持在可接受的范圍內(nèi)的那些試劑并且可包括琥珀酸鹽(琥珀酸鈉或琥珀酸鉀)，組氨酸，磷酸鹽(磷酸鈉或磷酸鉀)，tris(三(羥甲基)氨基甲烷)，二乙醇胺，檸檬酸鹽(檸檬酸鈉)，等等。本發(fā)明的緩沖劑的ph在約5.5至約6.5的范圍內(nèi)，并且ph優(yōu)選地為6.0。將ph控制在該范圍內(nèi)的緩沖劑的實例包括琥珀酸鹽(例如，琥珀酸鈉)，葡糖酸鹽，組氨酸，檸檬酸鹽和其他有機酸緩沖劑。

術(shù)語“冷凍保護劑”通常包括為蛋白質(zhì)提供對抗冷凍誘導(dǎo)的應(yīng)力的穩(wěn)定性的試劑，假定通過優(yōu)先從蛋白質(zhì)表面排除應(yīng)力而為蛋白質(zhì)提供穩(wěn)定性。它們還可在初次干燥和二次干燥過程中以及在長期儲存產(chǎn)品的過程中提供保護。實例是諸如葡聚糖和聚乙二醇之類的聚合物，諸如蔗糖、葡萄糖、海藻糖和乳糖之類的糖類，諸如聚山梨醇酯之類的表面活性劑和諸如甘氨酸、精氨酸和絲氨酸之類的氨基酸。

術(shù)語“凍干保護劑”包括在干燥或‘脫水’處理過程(初次和二次干燥循環(huán))中為蛋白質(zhì)提供穩(wěn)定性的試劑，假定通過提供無定型玻璃態(tài)基質(zhì)并通過氫鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合，代替在干燥處理過程中除去的水分子為蛋白質(zhì)提供穩(wěn)定性。這有助于維持蛋白質(zhì)的構(gòu)象，最小化凍干循環(huán)過程中蛋白質(zhì)的降解并且改善長期儲存的產(chǎn)品。實例包括多元醇或諸如蔗糖和海藻糖之類的糖類。

術(shù)語“藥物制劑”是指如下形式的制劑，在該形式中使活性成分有效并且所述制劑不包含對被給藥所述制劑的受治者有毒性的額外的成分。

“藥學(xué)上可接受的”賦形劑(載體，添加劑)是可合理地給藥于目標(biāo)哺乳動物以提供所使用的活性成分的有效劑量的那些賦形劑。

“復(fù)溶時間”是采用溶液使凍干的制劑再次水合成不含顆粒的澄清溶液所需的時間。

“穩(wěn)定的”制劑是儲存之后其中的蛋白質(zhì)基本上保持其物理穩(wěn)定性和/或化學(xué)穩(wěn)定性和/或生物學(xué)活性的制劑。

本文使用的術(shù)語“表位”是指被抗體識別的抗原的一部分。表位包括但不限于：能夠與蛋白質(zhì)(例如，抗體)或配體發(fā)生特異性相互作用的短氨基酸序列或肽(任選地，糖基化的或其他方式修飾的)。例如，表位可以是與抗體的抗原結(jié)合位點結(jié)合的分子的一部分。

術(shù)語“治療(treating或treatment)”涵蓋了對受治者(例如，人)體內(nèi)的疾病或失調(diào)(例如，癌癥)的治療，并且包括：(i)抑制疾病或失調(diào)，即，阻止其發(fā)展；(ii)緩解疾病或失調(diào)，即，使失調(diào)復(fù)原；(iii)減慢失調(diào)的進展；和/或(iv)抑制、緩解或減慢疾病或失調(diào)的一種或多種癥狀的進展。在一些實施方式中，治療(treating或treatment)是指殺死癌細胞。

與癌癥治療相關(guān)的術(shù)語“殺死”意在包括任何類型的調(diào)控，所述調(diào)控導(dǎo)致癌細胞死亡或癌細胞群的至少一部分死亡。

此外，本說明書中使用的一些術(shù)語在下文中更加具體地界定。

概述

本發(fā)明被認為部分基于如下意想不到的發(fā)現(xiàn)：包含載體蛋白，抗體和治療劑的任選地凍干的納米顆粒提供對腫瘤的靶向治療同時最小化對患者的毒性。因此，本文描述的納米顆粒相對于傳統(tǒng)adc產(chǎn)生顯著的改善。

對于有效的傳統(tǒng)adc而言，連接體足夠穩(wěn)定不會在全身循環(huán)中解離但是允許足量的藥物釋放在腫瘤位點是至關(guān)重要的。alley,s.c.,等人(2008)bioconjugchem19:759-765。這已被證明是研發(fā)有效藥物結(jié)合物的主要障礙(julien,d.c.,等人(2011)mabs3:467-478；alley,s.c.,等人(2008)bioconjugchem19:759-765)；因此，納米-免疫結(jié)合物的引人注目的特點在于不需要生物化學(xué)連接體。

目前的adc的另一缺陷在于在人腫瘤中實質(zhì)上并未證明較多的藥物滲透進入腫瘤。小鼠模型中的早期adc測試表明抗體靶定腫瘤會在腫瘤中產(chǎn)生較高濃度的活性劑(deguchi,t.等人(1986)cancerres46:3751-3755)；然而，這未與人疾病的治療產(chǎn)生關(guān)聯(lián)，這可能是因為人腫瘤在滲透性方面相對于小鼠腫瘤有高得多的異質(zhì)性。jain,r.k.等人(2010)natrevclinoncol7:653-664。而且，納米顆粒的尺寸對于從血管進入腫瘤過程中的外滲而言至關(guān)重要。在使用人結(jié)腸惡性腺瘤異種移植模型的小鼠研究中，血管的孔可滲透高達400nm的脂質(zhì)體。yuan,f.,等人(1995)cancerres55:3752-3756。腫瘤孔尺寸和滲透性的另一研究表明這兩個特點依賴于腫瘤位置和生長情況，退化的腫瘤和顱腫瘤可滲透小于200nm的顆粒。hobbs,s.k.,等人(1998)procnatlacadsciusa95:4607-4612。本文描述的納米-免疫結(jié)合物通過如下事實克服了該問題：整體小于200nm的大復(fù)合物在體內(nèi)循環(huán)中部分解離成較小的功能單元，該功能單元能夠易于滲透腫瘤組織。而且，一旦結(jié)合物到達腫瘤位點，較小的毒性有效載荷可被釋放并且只有毒性部分需要被腫瘤細胞攝取，而非整個結(jié)合物。

包含治療劑(即，)的抗體(即，)包被的白蛋白納米顆粒的出現(xiàn)已產(chǎn)生了將兩種或多種治療劑體內(nèi)定向遞送至預(yù)定位點的新的范例。參見pct申請公開wo2012/154861和wo2014/055415，這兩者的全部內(nèi)容均通過引用并入本文。

當(dāng)白蛋白和抗體的組合物以特定濃度和比例在水性溶液中混合在一起時，抗體自發(fā)地自組裝至白蛋白內(nèi)和白蛋白上以形成具有多個抗體拷貝(高達500個或更高)的納米顆粒。不受任何理論的限制，考慮將抗體的抗原受體部分定位于朝向納米顆粒外部，而通過疏水-疏水相互作用將疏水尾端并入白蛋白內(nèi)。

雖然包含單獨的源蛋白的蛋白質(zhì)組合物通常以凍干形式儲存，在該凍干形式中，蛋白質(zhì)組合物表現(xiàn)出明顯的保質(zhì)期，但是凍干的組合物不包含通過疏水-疏水相互作用形成為整體的兩種不同蛋白質(zhì)的自組裝的納米顆粒。而且，大部分抗體結(jié)合部分暴露于納米顆粒的表面的納米顆粒結(jié)構(gòu)使其自身易受到移動或重組結(jié)構(gòu)的影響，所述移動或重組結(jié)構(gòu)通過其他被認為是良性的條件進行。例如，在凍干過程中，蛋白質(zhì)上的離子電荷脫水，從而暴露其下面的電荷。所暴露的電荷在兩個蛋白質(zhì)之間產(chǎn)生電荷-電荷相互作用，該相互作用可改變每個蛋白質(zhì)對另一蛋白質(zhì)的結(jié)合親和性。此外，納米顆粒的濃度隨著溶劑(例如，水)的除去而顯著提高。納米顆粒的這種濃度的提高可導(dǎo)致不可逆的寡聚。寡聚是蛋白質(zhì)的已知性質(zhì)，其使得寡聚物的生物性質(zhì)相比于單體形式降低并且有時使顆粒的尺寸超過1微米。

另一方面，對于臨床和/或商業(yè)使用而言，需要納米顆粒組合物的穩(wěn)定形式，在所述臨床和/或商業(yè)使用中，需要至少三個月的保質(zhì)期并且高于6個月或9個月的保質(zhì)期是優(yōu)選的。這種穩(wěn)定的組合物必須容易地用于靜脈內(nèi)注射，必須在靜脈內(nèi)注射之后保持其自組裝形式，從而在體內(nèi)將納米顆粒指向預(yù)定位點，必須具有小于1微米的最大尺寸，從而避免在遞送進入血流時的任何缺血性事件，并且最后，必須與用于注射的水性組合物相容。

化合物

如在閱讀了本公開的內(nèi)容之后對于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，本文公開的內(nèi)容涉及包含載體蛋白、抗體和任選地至少一種治療劑的納米顆粒的組合物，其中，所述組合物任選地為凍干的。

在一些實施方式中，載體蛋白可以是白蛋白，明膠，彈性蛋白(包括彈性蛋白原)或彈性蛋白衍生的多肽(例如，α-彈性蛋白和彈性蛋白樣多肽(elp))，醇溶蛋白，豆球蛋白，玉米蛋白，大豆蛋白(例如，大豆蛋白分離物(spi))，乳蛋白(例如，β-乳球蛋白(blg)和酪蛋白)或乳清蛋白(例如，乳清蛋白濃縮物(wpc)和乳清蛋白分離物(wpi))。在優(yōu)選的實施方式中，載體蛋白是白蛋白。在優(yōu)選的實施方式中，白蛋白是蛋白(卵白蛋白)，牛血清白蛋白(bsa)，等等。在甚至更優(yōu)選的實施方式中，載體蛋白是人血清白蛋白(hsa)。在一些實施方式中，載體蛋白是美國食品藥品管理局(fda)批準的一般認為安全的(gras)賦形劑。

在一些實施方式中，抗體選自：ado-曲妥珠單抗emtansine，阿侖單抗(alemtuzumab)，貝伐單抗，西妥昔單抗(cetuximab)，地諾單抗(denosumab)，dinutuximab，伊匹單抗(ipilimumab)，納武單抗(nivolumab)，obinutuzumab，奧法木單抗(ofatumumab)，帕尼單抗(panitumumab)，派姆單抗(pembrolizumab)，帕妥珠單抗(pertuzumab)，利妥昔單抗和曲妥珠單抗。在一些實施方式中，所述抗體是所述納米顆粒全部表面或部分表面上的基本單層的抗體。

表1描述了抗體的非限定性列表

表1：抗體

在一些實施方式中，所述至少一種治療劑選自：阿比特龍(abiraterone),苯達莫司汀(bendamustine),硼替佐米(bortezomib),卡鉑(carboplatin),卡巴他賽(cabazitaxel),順鉑(cisplatin),苯丁酸氮芥(chlorambucil),達沙替尼(dasatinib),多西他賽(docetaxel),阿霉素(doxorubicin),表柔比星(epirubicin),厄洛替尼(erlotinib),依托泊苷(etoposide),依維莫司(everolimus),吉非替尼(gefitinib),柔紅霉素(idarubicin),伊馬替尼(imatinib),羥基脲(hydroxyurea),伊馬替尼(imatinib),拉帕替尼(lapatinib),亮丙瑞林(leuprorelin),美法侖(melphalan),氨甲蝶呤(methotrexate),二羥蒽酮(mitoxantrone),奈達鉑(nedaplatin),尼羅替尼(nilotinib),奧沙利鉑(oxaliplatin),紫杉醇(paclitaxel),帕唑帕尼(pazopanib),培美曲塞(pemetrexed),吡鉑(picoplatin),羅米地辛(romidepsin),沙鉑(satraplatin),索拉非尼(sorafenib),威羅菲尼(vemurafenib),舒尼替尼(sunitinib),替尼泊苷(teniposide),三鉑(triplatin),長春花堿(vinblastine),長春瑞濱(vinorelbine),長春新堿(vincristine)和環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)。

表2描述了癌癥治療劑的非限定性的列表

表2：癌癥治療劑

應(yīng)當(dāng)理解的是，治療劑可位于納米顆粒的內(nèi)部，位于納米顆粒的外表面或這兩者。納米顆粒可包含多于一種治療劑，例如，包含兩種治療劑，三種治療劑，四種治療劑，五種治療劑或更多。而且，納米顆?？稍诩{米顆粒的內(nèi)部和外部包含相同的治療劑或不同的治療劑。

在一些實施方式中，任何載體蛋白，抗體，治療劑或它們的任何組合可被明確排除。例如，在一些實施方式中，組合物可包含除了之外的任何載體蛋白和化療劑和/或除了貝伐單抗之外的任何靶向抗體。

一方面，納米顆粒包含至少100個非共價結(jié)合至納米顆粒表面的抗體。一方面，納米顆粒包含至少200個非共價結(jié)合至納米顆粒表面的抗體。一方面，納米顆粒包含至少300個非共價結(jié)合至納米顆粒表面的抗體。一方面，納米顆粒包含至少400個非共價結(jié)合至納米顆粒表面的抗體。一方面，納米顆粒包含至少500個非共價結(jié)合至納米顆粒表面的抗體。一方面，納米顆粒包含至少600個非共價結(jié)合至納米顆粒表面的抗體。

一方面，納米顆粒包含約100至約1000個非共價結(jié)合至納米顆粒表面的抗體。一方面，納米顆粒包含約200至約1000個非共價結(jié)合至納米顆粒表面的抗體。一方面，納米顆粒包含約300至約1000個非共價結(jié)合至納米顆粒表面的抗體。一方面，納米顆粒包含約400至約1000個非共價結(jié)合至納米顆粒表面的抗體。一方面，納米顆粒包含約500至約1000個非共價結(jié)合至納米顆粒表面的抗體。一方面，納米顆粒包含約600至約1000個非共價結(jié)合至納米顆粒表面的抗體。一方面，納米顆粒包含約200至約800個非共價結(jié)合至納米顆粒表面的抗體。一方面，納米顆粒包含約300至約800個非共價結(jié)合至納米顆粒表面的抗體。在優(yōu)選的實施方式中，納米顆粒包含約400至約800個非共價結(jié)合至納米顆粒表面的抗體。所涉及的值包括在所記載的范圍內(nèi)的任何值或子范圍，包括端點值。

一方面，納米顆粒組合物的平均粒度為小于約1μm。一方面，納米顆粒組合物的平均粒度為約130nm至約1μm。一方面，納米顆粒組合物的平均粒度為約130nm至約900nm。一方面，納米顆粒組合物的平均粒度為約130nm至約800nm。一方面，納米顆粒組合物的平均粒度為約130nm至約700nm。一方面，納米顆粒組合物的平均粒度為約130nm至約600nm。一方面，納米顆粒組合物的平均粒度為約130nm至約500nm。一方面，納米顆粒組合物的平均粒度為約130nm至約400nm。一方面，納米顆粒組合物的平均粒度為約130nm至約300nm。一方面，納米顆粒組合物的平均粒度為約130nm至約200nm。在優(yōu)選的實施方式中，納米顆粒組合物的平均粒度為約150nm至約180nm。在特別優(yōu)選的實施方式中，納米顆粒組合物的平均粒度為約160nm。所涉及的值包括在所記載的范圍內(nèi)的任何值或子范圍，包括端點值。

一方面，納米顆粒組合物被配制成用于靜脈內(nèi)注射。為了避免缺血事件，配制成用于靜脈內(nèi)注射的納米顆粒組合物應(yīng)當(dāng)包含平均粒度小于約1μm的納米顆粒。

一方面，納米顆粒組合物的平均粒度為大于約1μm。一方面，納米顆粒組合物的平均粒度為約1μm至約5μm。一方面，納米顆粒組合物的平均粒度為約1μm至約4μm。一方面，納米顆粒組合物的平均粒度為約1μm至約3μm。一方面，納米顆粒組合物的平均粒度為約1μm至約2μm。一方面，納米顆粒組合物的平均粒度為約1μm至約1.5μm。所涉及的值包括在所記載的范圍內(nèi)的任何值或子范圍，包括端點值。

一方面，納米顆粒組合物被配制成用于直接注射至腫瘤內(nèi)。直接注射包括注射至腫瘤位點或注射至靠近腫瘤位點，灌注至腫瘤內(nèi)，等等。當(dāng)配制成用于直接注射至腫瘤內(nèi)時，納米顆粒可包括任何平均粒度。不受理論的限制，越大的顆粒(例如，大于500nm，大于1μm，等等)被認為越有可能被固定在腫瘤內(nèi)部，從而提高有益效果。較大的顆?？稍谀[瘤或特定器官內(nèi)累積。參見，例如，用于注射至供給肝臟腫瘤的肝動脈的20微米至60微米的玻璃顆粒，其稱為(臨床用于肝癌)。因此，對于靜脈內(nèi)給藥而言，通常使用1μm以下的顆粒。1μm以上的顆粒更加通常直接給藥于腫瘤(“直接注射”)或給藥于供給至腫瘤位點的動脈。

一方面，組合物中小于約0.01％的納米顆粒的粒度大于200nm，大于300nm，大于400nm，大于500nm，大于600nm，大于700nm，大于800nm。一方面，組合物中小于約0.001的納米顆粒的粒度大于200nm，大于300nm，大于400nm，大于500nm，大于600nm，大于700nm，大于800nm。在優(yōu)選的實施方式中，組合物中小于約0.01％的納米顆粒的粒度大于800nm。在更加優(yōu)選的實施方式中，組合物中小于約0.001％的納米顆粒的粒度大于800nm。

在優(yōu)選的實施方式中，本文記載的尺寸及尺寸范圍涉及復(fù)溶凍干的納米顆粒組合物的粒度。也就是說，在凍干的納米顆粒重懸于水性溶液(例如，水，其他藥學(xué)上可接受的賦形劑，緩沖劑，等)中之后，粒度或平均粒度在本文記載的范圍內(nèi)。

一方面，至少約50％,60％,70％,80％,90％,95％,96％,97％,98％,99％,99.5％,或99.9％的納米顆粒作為單個納米顆粒存在于復(fù)溶的組合物中。也就是說，少于約50％，40％，30％等的納米顆粒被二聚化或多聚化(寡聚化)。

在一些實施方式中，納米顆粒的尺寸可通過調(diào)節(jié)載體蛋白相對于抗體的量(例如，比例)控制。納米顆粒的尺寸和粒度分布也非常重要。本發(fā)明的納米顆?？筛鶕?jù)其尺寸而起到不同的作用。在大尺寸條件下，團聚可阻斷血管。因此，納米顆粒的團聚可影響組合物的性能和安全性。另一方面，較大的顆粒可在某些情況(例如，當(dāng)不是靜脈給藥的情況)下更加具有治療作用。

一方面，納米顆粒組合物包含至少一種額外的治療劑。在一種實施方式中，所述至少一種額外的治療劑非共價結(jié)合至納米顆粒的外表面。在一種實施方式中，所述至少一種額外的治療劑排布在納米顆粒的外表面。在一種實施方式中，所述至少一種額外的治療劑排布在選自：阿比特龍(abiraterone),苯達莫司汀(bendamustine),硼替佐米(bortezomib),卡鉑(carboplatin),卡巴他賽(cabazitaxel),順鉑(cisplatin),苯丁酸氮芥(chlorambucil),達沙替尼(dasatinib),多西他賽(docetaxel),阿霉素(doxorubicin),表柔比星(epirubicin),厄洛替尼(erlotinib),依托泊苷(etoposide),依維莫司(everolimus),吉非替尼(gefitinib),柔紅霉素(idarubicin),伊馬替尼(imatinib),羥基脲(hydroxyurea),伊馬替尼(imatinib),拉帕替尼(lapatinib),亮丙瑞林(leuprorelin),美法侖(melphalan),氨甲蝶呤(methotrexate),二羥蒽酮(mitoxantrone),奈達鉑(nedaplatin),尼羅替尼(nilotinib),奧沙利鉑(oxaliplatin),紫杉醇(paclitaxel),帕唑帕尼(pazopanib),培美曲塞(pemetrexed),吡鉑(picoplatin),羅米地辛(romidepsin),沙鉑(satraplatin),索拉非尼(sorafenib),威羅菲尼(vemurafenib),舒尼替尼(sunitinib),替尼泊苷(teniposide),三鉑(triplatin),長春花堿(vinblastine),長春瑞濱(vinorelbine),長春新堿(vincristine)和環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)。在一種實施方式中，所述至少一種額外的治療劑是抗癌抗體。

制備納米顆粒的方法

一方面，本發(fā)明涉及制備本文所述的納米顆粒組合物的方法。

一方面，納米顆粒組合物的納米顆粒通過使載體蛋白或載體蛋白-治療劑顆粒與抗體以載體蛋白顆?；蚧蜉d體蛋白-治療劑顆粒與抗體的比例為約10:1至約10:30接觸而形成。在一種實施方式中，所述比例為約10:2至約10:25。在一種實施方式中，所述比例為約10:2至約1:1。在優(yōu)選的實施方式中，所述比例為約10:2至約10:6。在特別優(yōu)選的實施方式中，所述比例為約10:4。所涉及的值包括在所記載的范圍內(nèi)的任何值或子范圍，包括端點值。

在一種實施方式中，用于形成納米顆粒的溶液或其他液體介質(zhì)的量特別重要。在載體蛋白(或載體蛋白-治療劑)和抗體過于稀的溶液中無法形成納米顆粒。過于濃的溶液會產(chǎn)生無結(jié)構(gòu)的聚集體。在一些實施方式中，所使用的溶液(例如，無菌水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水)的量為約0.5ml溶液至約20ml溶液。在一些實施方式中，載體蛋白的量為約1mg/ml至約100mg/ml。在一些實施方式中，抗體的量為約1mg/ml至約30mg/ml。例如，在一些實施方式中，載體蛋白：抗體：溶液的比例為1ml溶液(鹽水)中約9mg載體蛋白(例如，白蛋白)和4mg抗體(例如，bev)。治療劑(例如，紫杉醇)的量還可加至載體蛋白中。例如，1mg紫杉醇可加至1ml溶液中的9mg載體蛋白(10mg載體蛋白-治療劑)和4mg抗體。當(dāng)使用常規(guī)i.v.袋時，例如，該i.v.袋中帶有約1升溶液，本領(lǐng)域技術(shù)人員需要使用相對于1ml中使用的量的1000倍的量的載體蛋白/載體蛋白-治療劑和抗體。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員無法在標(biāo)準i.v.袋中形成本發(fā)明的納米顆粒。而且，當(dāng)將各個成分以本發(fā)明的治療量加至標(biāo)準i.v.袋中時，各個成分不會自組裝形成納米顆粒。

在一種實施方式中，載體蛋白或載體蛋白-治療劑顆粒在ph為約4至約8的溶液中與抗體接觸。在一種實施方式中，載體蛋白或載體蛋白-治療劑顆粒在ph為約4的溶液中與抗體接觸。在一種實施方式中，載體蛋白或載體蛋白-治療劑顆粒在ph為約5的溶液中與抗體接觸。在一種實施方式中，載體蛋白或載體蛋白-治療劑顆粒在ph為約6的溶液中與抗體接觸。在一種實施方式中，載體蛋白或載體蛋白-治療劑顆粒在ph為約7的溶液中與抗體接觸。在一種實施方式中，載體蛋白或載體蛋白-治療劑顆粒在ph為約8的溶液中與抗體接觸。在優(yōu)選的實施方式中，載體蛋白或載體蛋白-治療劑顆粒在ph為約5至約7的溶液中與抗體接觸。

在一種實施方式中，載體蛋白顆?；蜉d體蛋白-治療劑顆粒在溫度為約5℃至約60℃(或該范圍內(nèi)的任何范圍、子范圍或值，包括端點值)的條件下與抗體一同孵育。在優(yōu)選的實施方式中，載體蛋白顆?；蜉d體蛋白-治療劑顆粒在溫度為約23℃至約60℃的條件下與抗體一同孵育。

不受理論的限制，納米顆粒組合物中的納米顆粒的穩(wěn)定性被認為至少部分取決于形成納米顆粒的溫度和/或ph，以及溶液中各個成分(即，載體蛋白，抗體和任選地治療劑)的濃度。在一種實施方式中，納米顆粒的kd為約1x10^-11m至約2x10^-5m。在一種實施方式中，納米顆粒的kd為約1x10^-11m至約2x10^-8m。在一種實施方式中，納米顆粒的kd為約1x10^-11m至約7x10^-9m。在優(yōu)選的實施方式中，納米顆粒的kd為約1x10^-11m至約3x10^-8m。所涉及的值包括在所記載的范圍內(nèi)的任何值或子范圍，包括端點值。

凍干法

本發(fā)明的凍干的組合物通過標(biāo)準凍干技術(shù)在存在穩(wěn)定劑、緩沖劑等或不存在穩(wěn)定劑、緩沖劑等的條件下制備。意想不到的是，這些條件不會改變納米顆粒的相對脆的結(jié)構(gòu)。而且，最好的是，這些納米顆粒在凍干后保持其粒度分布，并且更加重要的是，這些納米顆?？杀粡?fù)溶以與新鮮制備的納米顆粒基本相同的形式和比例用于體內(nèi)給藥(例如，靜脈內(nèi)遞送)。

制劑

一方面，納米顆粒組合物被配制成用于直接注射至腫瘤內(nèi)。直接注射包括注射至腫瘤位點或注射至腫瘤位點附近，灌注至腫瘤內(nèi)，等等。因為，納米顆粒組合物無法全身給藥，因此，納米顆粒組合物被配制成用于直接注射至腫瘤內(nèi)并且納米顆粒組合物可包含任何平均粒度。不受理論限制，較大的顆粒(例如，大于500nm，大于1μm等等)被認為更有可能被固定在腫瘤內(nèi)部，從而被認為提供更好的有益效果。

另一方面，本文提供包含本文提供的化合物以及至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的組合物。

總體而言，本文提供的化合物可配制成用于通過任何可接受的給藥模式給藥于患者。各種不同的劑型和藥物遞送系統(tǒng)是本領(lǐng)域可獲得的。參見，例如，gennaro,a.r.,編輯(1995)remington’spharmaceuticalsciences,第18版,mackpublishingco.。

總體而言，本文提供的化合物可作為藥物組合物通過下述途徑中的任何一種給藥：口服給藥、全身給藥(例如，透皮給藥，鼻內(nèi)給藥或通過栓劑給藥)，或腸胃外給藥(例如，肌肉內(nèi)給藥，靜脈內(nèi)給藥或皮下給藥)。

總體而言，組合物由本發(fā)明的化合物結(jié)合至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑構(gòu)成。可接受的賦形劑是無毒的，有助于給藥并且不會對本發(fā)明的化合物的治療益處產(chǎn)生不利的影響。這些賦形劑可以是任何固體、液體、半固體或在氣溶膠組合物的情況下，這些賦形劑可以是氣態(tài)賦形劑，該氣態(tài)賦形劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員通?？色@得的。

固體藥物賦形劑包括淀粉，纖維素，滑石，葡萄糖，乳糖，蔗糖，明膠，麥芽，米，面粉，滑石粉，硅膠，硬脂酸鎂，硬脂酸鈉，硬脂酸甘油酯，氯化鈉，干燥的脫脂牛奶，等等。液體和半固體賦形劑可選自：甘油，丙二醇，水，乙醇和各種不同的油類(包括石油，動物油，植物油或合成來源的油，例如，花生油，大豆油，礦物油，芝麻油，等等)。優(yōu)選的液體載體，尤其是可注射溶液，包括水，鹽水，水性葡萄糖和乙二醇。其他合適的藥物賦形劑及其劑型在remington'spharmaceuticalsciences,e.w.martin編輯(mackpublishingcompany,第18版,1990)中描述。

如果需要的話，本發(fā)明的組合物可以存在于包裝或分配器設(shè)備中，所述包裝或分配器設(shè)備包含含有活性成分的一個或多個單位劑型。例如，這種包裝或設(shè)備可包含金屬箔或塑料箔，例如，泡罩包裝，或玻璃和橡膠塞，例如，在小瓶中。還可制備在相容性藥學(xué)載體中配制的包含本發(fā)明的化合物的組合物，其可放置于合適的容器中，并且標(biāo)記治療的適應(yīng)癥。

治療方法

本文描述的納米顆粒組合物在治療哺乳動物體內(nèi)的癌細胞和/或腫瘤方面有用。在優(yōu)選的實施方式中，所述哺乳動物是人類(即，人類患者)。優(yōu)選地，凍干的納米顆粒組合物在給藥之前復(fù)溶(懸浮于水性賦形劑中)。

一方面，本發(fā)明提供用于治療癌細胞的方法，所述方法包括使所述細胞與有效量的本文描述的納米顆粒組合物接觸，從而治療癌細胞。癌細胞的治療包括但不限于：降低增殖，殺死細胞，預(yù)防細胞轉(zhuǎn)移，等等。

一方面，本發(fā)明提供用于治療有此需求的患者體內(nèi)的腫瘤的方法，所述方法包括將治療有效量的本文所述的納米顆粒組合物給藥于患者，從而治療腫瘤。在一種實施方式中，腫瘤的尺寸減小。在一種實施方式中，腫瘤的尺寸不增加持續(xù)至少一段時間和/或在治療之后腫瘤的尺寸不增加。

在一種實施方式中，納米顆粒組合物靜脈內(nèi)給藥。在一種實施方式中，納米顆粒組合物直接給藥至腫瘤。在一種實施方式中，納米顆粒組合物通過直接注射或灌注給藥至腫瘤內(nèi)。

在一種實施方式中，所述方法包括：

a)每周一次給藥納米顆粒組合物持續(xù)三周；

b)停止給藥納米顆粒組合物持續(xù)一周；以及

c)可選地，根據(jù)需要，重復(fù)步驟a)和b)以治療腫瘤。

在一種實施方式中，本文所述的納米顆粒的治療有效量包括約50mg/m²至約200mg/m²的載體蛋白或載體蛋白和治療劑。在優(yōu)選的實施方式中，治療有效量包括約75mg/m²至約175mg/m²的載體蛋白或載體蛋白和治療劑。所涉及的值包括在所記載的范圍內(nèi)的任何值、子范圍或范圍，包括端點值。

在一種實施方式中，治療有效量包括約20mg/m²至約90mg/m²抗體。在優(yōu)選的實施方式中，治療有效量包括30mg/m²至約70mg/m²的抗體。所涉及的值包括在所記載的范圍內(nèi)的任何值、子范圍或范圍，包括端點值。

可由本文所述的組合物和方法治療的癌癥或腫瘤包括但不限于：膽道癌，腦癌(包括膠質(zhì)母細胞瘤和髓母細胞瘤)，乳腺癌，子宮頸癌，絨毛膜癌，結(jié)腸癌，子宮內(nèi)膜癌，食道癌，胃癌，血液腫瘤(包括急性淋巴細胞白血病和髓細胞性白血病)，多發(fā)性骨髓瘤，aids相關(guān)白血病和成人t-細胞白血病淋巴瘤，上皮內(nèi)瘤(包括鮑溫病(bowen'sdisease)和柏哲德氏病(paget'sdisease))，肝癌(肝細胞癌)，肺癌，淋巴瘤(包括霍奇金氏疾病和淋巴細胞性淋巴瘤)，神經(jīng)母細胞瘤，口腔癌(包括鱗狀細胞癌)；卵巢癌(包括那些由上皮細胞、基質(zhì)細胞、生殖細胞和間充質(zhì)細胞引起的卵巢癌)，胰腺癌，前列腺癌，直腸癌，肉瘤(包括平滑肌肉瘤，橫紋肌肉瘤，脂肪肉瘤，纖維肉瘤和骨肉瘤)，皮膚癌(包括黑色素瘤，卡波西氏肉瘤，基底細胞癌(basocellularcancer)和鱗狀細胞癌)，睪丸癌(包括生殖腫瘤(精原細胞瘤，非精原細胞瘤[畸胎瘤，絨毛膜瘤(choriocarcinomas)])，基質(zhì)細胞腫瘤和生殖細胞腫瘤)，甲狀腺癌(包括甲狀腺腺癌和甲狀腺髓樣癌)以及腎癌(包括腺癌和腎母細胞瘤)。在重要的實施方式中，癌癥或腫瘤包括乳腺癌，淋巴瘤，多發(fā)性骨髓瘤和黑色素瘤。

總體而言，本發(fā)明的化合物可以治療有效量通過用于起類似作用的藥劑的任何可接受的給藥模式給藥。本發(fā)明的化合物的實際量(即，納米顆粒)將取決于多種因素，例如，待治療的疾病的嚴重性，受治者的年齡和相對健康情況，所使用的化合物的效力，給藥的途徑和形式以及本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他因素。

這些藥劑的有效量可通過常規(guī)實驗容易地確定，最有效和方便的給藥途徑以及最合適的劑型也可確定。各種不同的劑型以及藥物遞送系統(tǒng)是本領(lǐng)域可獲得的。例如，參見，gennaro,a.r.,編輯(1995)remington’spharmaceuticalsciences,第18版,mackpublishingco.。

藥劑(例如，本發(fā)明的化合物)的有效量或治療有效量或劑量是指使癥狀得到改善或延長受治者的生存期的藥劑或化合物的量。這些分子的毒性和治療療效可通過例如測定ld50(50％的群體的致死劑量)和ed50(50％的群體的治療有效劑量)由細胞培養(yǎng)物或?qū)嶒瀯游镏械臉?biāo)準藥物步驟確定。毒性和治療療效的劑量比例是治療指數(shù)，其可表達為ld50/ed50的比值。表現(xiàn)出高治療指數(shù)的藥劑是優(yōu)選的。

有效量或治療有效量是引起組織、系統(tǒng)、動物或人類的生物或醫(yī)學(xué)反應(yīng)的化合物的量或藥物組合物的量，該量是研究者、獸醫(yī)、醫(yī)師或其他臨床醫(yī)生正在尋找的。劑量可在取決于所使用的劑型和/或所使用的給藥途徑的這個范圍內(nèi)發(fā)生改變。確切的劑型、給藥途徑、劑量和劑量間隔應(yīng)當(dāng)根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，考慮受治者的病癥的特性進行選擇。

劑量和劑量間隔可單獨進行調(diào)節(jié)以提供足以實現(xiàn)期望的效果的活性部分的血藥水平，即，最小有效濃度(mec)。每個化合物的mec是不同的，但是可從例如體外數(shù)據(jù)和動物實驗來估計mec。實現(xiàn)mec所需的劑量可取決于個體特點和給藥途徑。在局部給藥或選擇性攝取的情況下，藥物的有效局部濃度可不與血藥濃度相關(guān)。

實施例

本文公開的內(nèi)容使用由作為核心的白蛋白結(jié)合的紫杉醇(即，)或順鉑和作為抗體的貝伐單抗(即，)或利妥昔單抗(即，)構(gòu)成的納米顆粒進行舉例說明。

本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的是，實施例中納米顆粒的制備和使用僅僅是為了舉例說明，并且本發(fā)明公開的內(nèi)容不受這種舉例說明的限制。

除非另有說明，本文使用的任何縮寫具有常見的科學(xué)含義。所有的溫度為℃。在此，除非另有說明，下列術(shù)語具有如下含義。

abx＝/(白蛋白結(jié)合的紫杉醇)

ac＝順鉑結(jié)合的abx

acn＝乙腈

adc＝抗體依賴性化療

bev＝貝伐單抗

bsa＝牛血清白蛋白

dh2o＝蒸餾水

dmem＝dulbecco改良的eagle培養(yǎng)基

nm＝納摩爾

edu＝5-乙炔基-2'-脫氧尿苷

em＝電子顯微鏡

fcb＝流式細胞儀緩沖劑

fitc＝熒光素

kd＝千道爾頓

kd＝解離常數(shù)

kg＝千克

kv＝千伏

l/hr＝升/小時

lc-ms＝液相色譜-質(zhì)譜

m＝摩爾

mci＝毫居里

mg＝毫克

mlorml＝毫升

m²＝平方米

mm³＝立方毫米

μg＝微克

μl＝微升

μm＝微米

pbs＝磷酸鹽緩沖鹽水

pk＝藥代動力學(xué)

rt＝室溫

rpm＝每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)

v＝伏特

xg＝時間重力

實施例1：納米顆粒的制備

將abraxane(abx)(10mg)懸浮于貝伐單抗(bev)(4mg[160μl]除非另有說明)中,并加入840μl0.9％的鹽水以提供abx和bev的最終濃度分別為10mg/ml和2mg/ml。在室溫(或在指定溫度)下孵育混合物30分鐘以形成顆粒。對于測量abx:bev復(fù)合物的粒度的mastersizer實驗而言，將10mgabx懸浮于濃度為0至25mg/ml的bev中。采用利妥昔單抗(0-10mg/ml)或曲妥珠單抗(0-22mg/ml)在類似條件下形成abx的復(fù)合物。

對于應(yīng)用于人體而言，通過獲得25mg/mlbev的合適劑量的4ml小瓶以及根據(jù)下述指導(dǎo)將每個小瓶稀釋至4mg/ml制備abx:bev復(fù)合物。abx的合適劑量的100mg小瓶可通過復(fù)溶至最終濃度為包含10mg/mlabx納米顆粒來制備。使用無菌3ml注射器，可抽取1.6ml(40mg)貝伐單抗(25mg/ml)并且在最少1分鐘內(nèi)將其緩慢注射至每個含有100mgabx的小瓶的內(nèi)壁上。貝伐單抗溶液不應(yīng)當(dāng)直接注射在凍干的餅上，因為這樣會引起起泡。隨后，使用無菌12ml無菌注射器，可抽取8.4ml0.9％的氯化鈉注射液(usp)，并且在最少1分鐘內(nèi)將這8.4ml緩慢注射至每個含有100mgabx和40mgbev的小瓶的內(nèi)壁上。一旦完成添加1.6mlbev和8.4ml0.9％的氯化鈉注射液(usp)，可輕輕旋轉(zhuǎn)每個小瓶和/或緩慢倒轉(zhuǎn)每個小瓶持續(xù)至少2分鐘，直至任何餅/粉末完全溶解。應(yīng)當(dāng)避免起泡。這時，每個小瓶的濃度應(yīng)當(dāng)為100mg/10mlabx和40mg/10mlbev。包含abx和bev的小瓶應(yīng)當(dāng)靜置60分鐘。每十分鐘應(yīng)當(dāng)輕輕地旋轉(zhuǎn)小瓶和/或緩慢地倒轉(zhuǎn)小瓶，以繼續(xù)混合復(fù)合物。60分鐘過去之后，應(yīng)當(dāng)從每個小瓶中抽取計算的劑量體積的abx和bev并且將其緩慢加至空的viaflex袋中。隨后加入等體積的0.9％氯化鈉注射液(usp)以使最終濃度為abx5mg/ml且bev2mg/ml。隨后，應(yīng)當(dāng)輕輕地旋轉(zhuǎn)所述袋和/或緩慢地倒轉(zhuǎn)所述袋持續(xù)1分鐘，以進行混合。abx:bev納米顆?？稍谑覝叵聝Υ骈L達4小時，隨后進行最終稀釋。

實施例2：abx和bev的體外結(jié)合

為了確定abx和bev是否發(fā)生相互作用，通過流式細胞儀和電子顯微鏡分析實施例1形成的納米顆粒。

方法

流式細胞術(shù)：如上實施例1所述的那樣生成ab160。為了確定bev與abx的結(jié)合，在accuric6流式細胞儀(bdfranklinlakes,nj)上進行ab160的可視化并且使用accuric6軟件進行數(shù)據(jù)分析。采用5μg鏈霉親和素pe(abcam,cambridge,ma)標(biāo)記生物素化的(5μg)山羊抗-小鼠igg(abcam,cambridge,ma)。選擇該山羊抗-小鼠igg標(biāo)記ab160，因為bev的fab部分是小鼠衍生的。在室溫下采用pe-標(biāo)記的山羊抗-小鼠igg孵育abx和ab160持續(xù)30分鐘，洗滌并通過流式細胞儀進行可視化。

電子顯微鏡：將溶解于pbs中濃度為6mg/ml的5μlabx加至300目火棉膠片(parlodian)-碳包被的銅網(wǎng)上并靜置1分鐘。使濾紙的尖頭接觸液滴以除去多余的液體，在網(wǎng)上留下薄膜。使網(wǎng)干燥。為了溶解留在干燥的網(wǎng)上的緩沖劑結(jié)晶，在dh2o中洗滌樣品三次。將ph7.2，1％磷鎢酸(pta)的小滴加至網(wǎng)上。隨后使濾紙的尖頭再次接觸該網(wǎng)，以除去多余的液體，在網(wǎng)上留下薄膜并干燥。以1:10的比例用pbs稀釋0.9％氯化鈉溶液中的濃度為25mg/ml的bev(genentech)。將5μlbev加載至鎳formvar包被的網(wǎng)上并風(fēng)干30分鐘至1小時。對于ab160而言，將溶解于pbs中的10mg/ml的abx與溶解于0.9％氯化鈉溶液中的4mg/ml的bev以2.5:1的比例混合。進一步用pbs以1:5的比例稀釋復(fù)合物。將5μl的復(fù)合物加載至鎳formvar-包被的網(wǎng)上并風(fēng)干30分鐘至1小時。兩種樣品均在山羊抗-小鼠igg中用6nm金-結(jié)合的顆粒(electronmicroscopysciences)孵育1小時,用10％fcb/pbs以1:30的比例稀釋,用pbs洗滌6次(每次2分鐘),用dh2o洗滌6次,隨后用2％甲基纖維素和4％ua(9:1)的混合物染色持續(xù)5分鐘。濾紙用于吸干染色劑并風(fēng)干所述網(wǎng)1小時。兩種樣品在驢抗-小鼠igg中用6nm金-結(jié)合的顆粒(jacksonimmunoresearch)孵育過夜，用10％fcb/pbs以1:25稀釋，用pbs洗滌6次(每次2分鐘),用dh2o水洗滌6次，用1％pta染色持續(xù)5分鐘，風(fēng)干，用2％甲基纖維素覆蓋，并風(fēng)干1小時。在jeol1400上以80kv進行操作獲取顯微照片。

結(jié)果

abx(10mg/ml)在體外與4mg/mlbev共孵育，并且發(fā)現(xiàn)他們形成160nm的納米顆粒(本文稱為ab160)。因為igg1(bev)的fab部分是小鼠來源的，因此，含有bev的顆粒被純化的山羊抗-小鼠igg選擇性標(biāo)記，隨后以抗-山羊pe作為二抗。作為陰性對照，僅采用抗-山羊pe對樣品染色。通過流式細胞儀使顆?？梢暬⑶蚁鄬τ趩为毜腶bx(6.7％陽性)，結(jié)合至ab160的抗-小鼠igg1顯示出明亮的信號(41.2％陽性)(圖1a)。為了使bev與abx的結(jié)合生效，采用金-標(biāo)記的小鼠抗-人igg標(biāo)記bev并且采用電子顯微鏡使顆?？梢暬?圖1b)。意想不到的是，em圖片表明單層bev圍繞abx納米顆粒。

為了確定當(dāng)復(fù)合物分解時，紫杉醇仍然結(jié)合至何種蛋白質(zhì)(白蛋白或bev)，制備ab160并收集如下碎片：顆粒(納米ab160)，高于100kd的蛋白質(zhì)和低于100kd的蛋白質(zhì)。通過液相色譜-質(zhì)譜(lc-ms)測量每個碎片中的紫杉醇。大約75％的紫杉醇仍然留在顆粒中，大部分剩余的紫杉醇與包含100kd或更高的蛋白質(zhì)的碎片結(jié)合(圖1c，上圖)，這表明當(dāng)顆粒解離時，紫杉醇結(jié)合至單獨的bev或bev與白蛋白的異二聚體。這說明解離的復(fù)合物包含帶有抗體的化療藥物，該復(fù)合物仍然可進入高vegf腫瘤微環(huán)境中。這些發(fā)現(xiàn)由ab160的上清液的western印跡分析來證實，western印跡分析顯示出bev和紫杉醇共定位于大約200kd，尺寸與紫杉醇-bev-白蛋白復(fù)合物的尺寸一致(圖1c，下圖)。

實施例3：ab160的體外功能

證明了復(fù)合物中的兩個關(guān)鍵成分(抗體和紫杉醇)在存在于復(fù)合物中時保持其功能。

方法

體外毒性：在帶有1％psg和10％fbs的dmem中培養(yǎng)a375人黑色素瘤細胞系(atccmanassa,va)和daudib-細胞淋巴瘤細胞系(atccmanassa,va)。收獲細胞并將其以0.75x10⁶個細胞/孔的濃度接種于24孔板。在37℃和5％co2的條件下，細胞暴露于紫杉醇濃度為0至200μg/ml的abx或ab160過夜。為了測量增殖，使用click-itedu(molecularprobes,eugene,or)試劑盒。簡言之，將10mmedu加至孔中并用細胞和abx或ab160孵育過夜。用1％皂素對細胞進行透性化處理并且插入的edu用fitc結(jié)合的抗體標(biāo)記。增殖指數(shù)通過每次處理的fitc陽性細胞除以由未處理的edu標(biāo)記的細胞的最大增殖來確定。

vegfelisa：為了確定bev是否可仍然結(jié)合其配體vegf，當(dāng)結(jié)合至abx時，使用標(biāo)準vegfelisa(randdsystems,minneapolis,mn)。如所述的那樣制備ab160并將2000pg/mlvegf加至ab160復(fù)合物中或單獨的abx中。室溫下用納米顆粒孵育vegf持續(xù)2小時。懸浮液以6000rpm的速度旋轉(zhuǎn)15分鐘，收集上清液并通過elisa測量游離vegf。簡言之，在4℃下用捕獲抗體包被elisa板過夜。對所述板進行洗滌、封閉和標(biāo)準化，并添加樣品。洗滌之后，添加檢測抗體并用底物對板進行顯色(randdsystems,minneapolis,mn)。使用versamaxelisa酶標(biāo)儀(moleculardevices,sunnyvale,ca)測量450nm的吸光度。采用0至2000pg/ml的標(biāo)準曲線確定未結(jié)合的vegf的濃度。

結(jié)果

在使用人黑色素瘤細胞系a375的體外毒性測試中，ab160具有與單獨的abx類似的毒性，這表明在任一種制劑中紫杉醇發(fā)揮同樣的作用(圖1d)。

為了測試vegf與ab160復(fù)合物中的bev的結(jié)合，將ab160或abx與vegf共孵育，除去顆粒，并測試上清液中vegf內(nèi)含物。測量的ab160的上清液中缺乏vegf(<10％vegf未結(jié)合)表明vegf被ab160復(fù)合物中的bev結(jié)合，而當(dāng)用單獨的abx孵育時vegf仍然是游離的(>80％vegf未結(jié)合)(圖1e)。

重要的是，這些測試表明ab160中的紫杉醇保持其對腫瘤細胞的毒性并且結(jié)合的bev保持與其配體vegf的結(jié)合能力。

實施例4：粒度和蛋白質(zhì)親和性

為了理解在bev與abx結(jié)合時形成的納米顆粒的特性，測定abx:bev復(fù)合物相對于abx的尺寸。

方法

mastersizer和nanosight：通過mastersizer2000(malverninstruments,westborough,ma)上的動態(tài)光散射測量abx和抗體-abx藥物復(fù)合物的粒度。為了測量粒度，將2ml(5mg/ml)的abraxane或復(fù)合物加至樣品室。采用malvern軟件進行數(shù)據(jù)分析并且通過柱狀圖顯示粒度分布。隨后使用nanosight系統(tǒng)(malverninstruments,westborough,ma)驗證粒度和穩(wěn)定性。abx或復(fù)合物顆粒被稀釋至合適的范圍以精確測量粒度。由粒度分布來顯示數(shù)據(jù)，然而納米顆粒跟蹤分析使用布朗運動以確定粒度。

結(jié)合測試：使100μg/ml的生物素化的bev、利妥昔單抗或曲妥珠單抗結(jié)合至鏈霉親和素探針(fortebiocorp.menlopark,ca)。abx的結(jié)合通過blitx系統(tǒng)(fortebiocorp.menlopark,ca)上1000mg/ml，500mg/ml和100mg/ml條件下的吸光度來測量。結(jié)合和解離常數(shù)使用blitx軟件計算。

生物膜層干涉(blitx)技術(shù)用于評價bev與abx的結(jié)合親和性。生物素化的bev結(jié)合至鏈霉親和素探針并且暴露于abx(1000,500,and100μg/ml)。bev和abx在室溫、ph為7的條件下的解離常數(shù)(kd)為2.2x10^-8m，與強的非共價相互作用一致。bev和abx的結(jié)合親和性在白蛋白和一些細菌蛋白的天然或工程白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間觀察到的解離常數(shù)的范圍內(nèi)。nilvebrant,j.等人(2013)computstructbiotechnolj6:e201303009。

結(jié)果

abx:bev納米顆粒一直大于(大約160nm)單獨的130nm的abx(圖2a)。納米顆粒的尺寸與所使用的bev的濃度直接相關(guān)，中值尺寸為0.157至2.166μm(圖2a)。考慮到這些研究的目的在于臨床i期實驗，因此關(guān)注最小的abx:bev顆粒(ab160)，這是因為其與130nmabx最類似。ab160顆粒的尺寸與abx加圍繞其的單層bev一致，并且與顆粒的em圖像一致(參見圖1b)。

為了確定靜脈內(nèi)給藥條件是否影響納米顆粒粒度分布，評估了在室溫、鹽水中孵育長達24小時的ab160(或abx)的粒度分布。ab160粒度分布在長達24小時的時間內(nèi)沒有發(fā)生顯著改變(圖9a和圖9b)然而，在室溫、4小時時，通過elisa給出了ab160分解的一些證據(jù)(圖9c)。

為了確定ab160在血漿中的穩(wěn)定性，abx或ab160在鹽水或肝素化的人血漿中以相對體積比例為9:1或1:1孵育。值得注意的是，當(dāng)abx(圖10，上圖)或ab160(圖10，下圖)在等體積血漿中孵育時，沒有檢測到顆粒(0.01μm至1μm)。

western印跡(數(shù)據(jù)未顯示)表明，在鹽水或肝素化的人血漿中，ab160解離成更小的蛋白結(jié)合物，該蛋白結(jié)合物仍然包含腫瘤靶向抗體、白蛋白和細胞毒性劑(紫杉醇)。這些蛋白結(jié)合物保持其靶向腫瘤的能力，一旦位于腫瘤位點，就可快速溶解并釋放細胞毒性有效載荷以有效引起腫瘤退化，而不會由腫瘤細胞內(nèi)在化整個納米顆粒。

接下來，為了測試結(jié)合親和性是否為ph依賴的和/或溫度依賴的，將abx懸浮于bev并且用鹽水在ph為3、5、7或9的條件下稀釋混合物，隨后在不同的溫度(rt，37℃和58℃)條件下進行孵育，以形成顆粒。abx和bev的結(jié)合親和性是ph依賴且溫度依賴的，觀察到在ph為5、溫度為58℃條件下形成的顆粒具有最高的結(jié)合親和性(圖2b)。

為了確定58℃、ph為5的條件下的bev和abx的較高的結(jié)合親和性是否轉(zhuǎn)化為復(fù)合物的穩(wěn)定性，通過納米顆粒跟蹤分析(nanosight)比較了各種不同的制劑。在58℃且ph為5的條件下制備的ab160(ab1600558)、在室溫且ph為7的條件下制備的ab160(ab16007)，或在58℃且ph為7條件下制備的ab160(ab1600758)在人ab血清中孵育0分鐘、15分鐘、30分鐘或60分鐘后，將它們的穩(wěn)定性與暴露于相同條件的abx(分別為abx0558,abx07和abx0758)進行比較。

如在暴露于人ab血清之后每mgabx中存在的顆粒數(shù)所表示的，在較高親和性條件(ph7且溫度為58℃)下制備的顆粒也更加穩(wěn)定。在人血清中ab160顆粒表現(xiàn)出穩(wěn)定性增加，這與它們的結(jié)合親和性相關(guān)聯(lián)。具體而言，如通過每mgabx測量的顆粒尺寸和顆粒數(shù)所確定的(圖2c和表3)，ab16007和ab1600558相比于單獨的abx在鹽水和人血清中均更加穩(wěn)定。這說明ab160顆粒的穩(wěn)定性可通過改變形成ab160顆粒的條件進行調(diào)控。

表3：人ab血清中ab160和abx的穩(wěn)定性

顆粒/mgabxx10⁸

這些數(shù)據(jù)表明bev以皮摩爾范圍內(nèi)的親和性結(jié)合至abx，這證明了強的非共價鍵并且表明粒度分布與被單層抗體分子圍繞的abx一致，所產(chǎn)生的顆粒的尺寸依賴于抗體濃度。

實施例5：ab160在小鼠體內(nèi)的療效

植入無胸腺裸鼠體內(nèi)的a375人黑色素瘤細胞的異種移植模型用于測試ab160的體內(nèi)療效。

方法

體內(nèi)實驗進行至少兩次。那些實驗所需的小鼠數(shù)量通過功效分析確定。每周測量2-3次小鼠腫瘤并且當(dāng)腫瘤為10重量％時宰殺小鼠。治療后監(jiān)測已完成腫瘤反應(yīng)的小鼠持續(xù)60天至80天。小鼠研究的終點是中值生存期。生成kaplan-meier曲線并進行mantle-cox測試以確定治療組之間的中值生存期的顯著性。所提供的體外結(jié)果代表至少5次重復(fù)試驗。相對于基線的體外和體內(nèi)變化百分比的統(tǒng)計學(xué)分析使用student’s-t測試完成。

小鼠模型：為了測試腫瘤療效，將1x10⁶個a375人黑色素瘤細胞接種于無胸腺裸鼠(harlanspraguedawley,indianapolis,in)的右側(cè)肋腹。當(dāng)腫瘤尺寸已達到約700mm³時，隨機分配小鼠并用pbs，abx(30mg/kg)，bev(12mg/kg)，bev隨后abx或上述濃度的ab160進行治療。對于測試更大的ab顆粒的小鼠實驗而言，產(chǎn)生較大顆粒所需的最高劑量的bev(45mg/kg)用于僅bev治療組。每周3次監(jiān)測腫瘤尺寸并且使用如下方程計算腫瘤體積：(長度*寬度²)/2。當(dāng)腫瘤尺寸等于小鼠體重的10％或約2500mm³時，宰殺小鼠。相對于基線第7天的變化百分比如下計算：[(治療當(dāng)天的腫瘤尺寸-第7天的腫瘤尺寸)/治療當(dāng)天的腫瘤尺寸]*100。ar160的體內(nèi)測試類似，除了將5x10⁶個daudi細胞注射至無胸腺裸鼠的右側(cè)肋腹。

結(jié)果

測試了ab160相對于pbs，單獨的單個藥物以及順序給藥的藥物。與所有其他治療組相比，用ab160治療的小鼠在治療后第7天腫瘤尺寸相對于基線顯著減小(圖3a)。用ab160治療的所有小鼠中的腫瘤在第7天衰退并且這種腫瘤反應(yīng)轉(zhuǎn)化為ab160組相對于所有其他組顯著增加的中值生存期(圖3b)，pbs組(p<0.0001)，bev組(p＝0.003)，abx組(p＝0.0003)，bev+abx組(p＝0.0006)和ab160組的生存期分別為7天、14天、14天、18天和33天。

較大的腫瘤有可能具有較高的局部vegf濃度。當(dāng)基于治療當(dāng)天的腫瘤尺寸(<700mm³和>700mm³)分析數(shù)據(jù)時，較大的腫瘤顯示出對ab160具有較高的反應(yīng)，這說明較高的腫瘤vegf濃度吸引更多的bev靶向的abx至腫瘤。ab160組相對于基線的變化百分比具有顯著性差異(p＝0.0057)。該觀察結(jié)果在僅abx組(p＝0.752)中沒有看到，其中，abx沒有靶向能力(圖3c)。

如圖2a所示，使用增加的bev:abx比例制備尺寸增加的顆粒。腫瘤衰退和中值生存期與增加的粒度正相關(guān)，這說明較大的顆粒的生物分布相對于較小的顆?？砂l(fā)生改變(圖3d和3e)。在小鼠上進行了全部毒性研究并且沒有出現(xiàn)毒性。

實施例6：小鼠體內(nèi)的紫杉醇藥代動力學(xué)

為了比較ab160和abx的藥代動力學(xué)(pk)，測量在給藥ab160和abx0小時、4小時、8小時、12小時和24小時的小鼠體內(nèi)的紫杉醇血藥濃度。

方法

紫杉醇藥代動力學(xué)：使用與agilentporoshell120ec-c18分析柱(2.1x100mm,2.7μmchromtech,applevalley,mn)連接的agilentporoshell120ec-c18預(yù)柱(2.1x5mm,2.7μm,chromtech,applevalley,mn)，在40℃下，完成紫杉醇和d5紫杉醇的液相色譜分離，采用由含0.1％甲酸的水(a)和含0.1％甲酸的acn(b)構(gòu)成的梯度流動相以0.5ml/分鐘的恒定流速進行洗脫。以60％a和40％b開始洗脫持續(xù)0.5分鐘，隨后將b從40％線性增加至85％持續(xù)4.5分鐘，保持85％b持續(xù)0.2分鐘，回到起始條件持續(xù)1.3分鐘。自動進樣器溫度為10℃并且樣品注射體積為2μl。使用esi正離子模式的質(zhì)譜儀，在毛細管電壓為1.75kv，源溫度為150℃，脫溶劑溫度500℃，錐孔氣流150l/小時，脫溶劑氣流為1000l/小時的條件下，采用停留時間為0.075秒的多反應(yīng)監(jiān)測(mrm)掃描模式，完成紫杉醇和內(nèi)標(biāo)d5-紫杉醇的檢測。通過masslynx-intellistart,v4.1軟件確定錐孔電壓和碰撞能量，其分別為6至16v和12至60ev。對于紫杉醇而言，在m/z854.3>105.2條件下監(jiān)測mrm前體和產(chǎn)品離子，對于d5紫杉醇而言，在m/z859.3>291.2條件下監(jiān)測mrm前體和產(chǎn)品離子。紫杉醇的初始母液(etoh中1mg/ml)和d5紫杉醇的初始母液(etoh中1mg/ml)在4ml琥珀色硅烷化的玻璃小瓶中制備并且儲存在-20℃。通過用acn在2ml琥珀色硅烷化的玻璃小瓶中稀釋母液制備工作標(biāo)準并且儲存在-20℃。血漿樣品如下提?。簩?00μl血漿樣品加至含有d5紫杉醇(116.4nm或100ng/ml)和300μlacn的1.7ml微離心管中，震蕩，室溫下孵育10分鐘以沉淀蛋白質(zhì)，并離心(14,000rpm)3分鐘。在agilentcaptivand^lipids板(chromtech,applevalley,mn)上過濾上清液，將其收集在深96孔板中，并且使用氮氣干燥。使用100μlacn復(fù)溶樣品并且在板振蕩器上(高速)震蕩5分鐘。每天制作包含紫杉醇(0.59-5855nm或0.5-5000ng/ml)和d5紫杉醇(116.4nm)的血漿標(biāo)準曲線，用于紫杉醇定量。小鼠腫瘤在冰上解凍、稱重并在1xpbs中稀釋成2部分(重量至體積)。隨后采用使用鋸齒探針(5mmx75mm)的pro200組織勻漿器使腫瘤均質(zhì)化。隨后以與人血漿樣品相同的方式處理腫瘤勻漿。

小鼠成像：制備阿瓦斯汀和igg對照溶液并且根據(jù)規(guī)程(imanislifesciences)用i-125標(biāo)記。簡言之，將tris緩沖液(0.125mtris-hcl,ph6.8,0.15mnacl)和5mcina¹²⁵i直接加至碘化管中(thermofischerscientific,waltham,ma)。使碘化物活化并且在室溫下旋轉(zhuǎn)?；罨牡饣锱c蛋白質(zhì)溶液混合。加入50μlscavenging緩沖液(pbs中10mg酪氨酸/ml,ph7.4)并孵育5分鐘。在加入tris/bsa緩沖液并混合之后，將樣品施加于10kmwco透析盒中，在4℃下，由預(yù)先冷卻的pbs透析30分鐘、1小時、2小時和過夜。由伽馬計數(shù)器確定輻射活性，隨后計算每分鐘衰變數(shù)(dpm)和具體活性。在小鼠尾靜脈注射阿瓦斯汀i-125，abraxane-阿瓦斯汀i-125，abraxane-人iggi-125或僅僅abraxane。在給藥后3小時、10小時、24小時和72小時通過spect-ct成像使用u-spect-ii/ct掃描儀(milabs,utrecht,thenetherlands)對動物進行成像。使用posem(像素化有序子集期望最大值法(pixelatedorderedsubsetsbyexpectationmaximization))算法進行spect重構(gòu)。在feldkamp算法過程中進行ct數(shù)據(jù)重構(gòu)。相互配準的圖像使用pmod軟件(pmodtechnologies,zurich,switzerland)進一步著色和可視化。注射后72小時宰殺動物并解剖。所選擇的感興趣的組織和器官使用放射性核素活度計(capinteccrc-127r,capintecinc.)測量。

結(jié)果

第一pk實驗的結(jié)果在圖4a和圖4b中提供。計算了帶有a375腫瘤和不帶有腫瘤的小鼠體內(nèi)的曲線下面積(auc)和最大血清濃度(cmax)。在第一pk實驗中，在不帶有腫瘤的小鼠體內(nèi)，ab160和abx的cmax和auc非常類似(分別為63.3+/-39.4和65.5+/-14.4以及129和133μg/m)。然而，在帶有腫瘤的小鼠體內(nèi)，各治療組的cmax和auc是有差異的(分別為55.7+/-21.2和63.3+/-17.3以及112和128μg/ml)(圖4c)。雖然該差異不是統(tǒng)計學(xué)上顯著的，但是這與ab160相對于abx的更好的靶向作用一致。

第二pk實驗采用另外較早的時間點和大腫瘤尺寸以及小腫瘤尺寸進行(圖4d至圖4f)。該實驗的結(jié)果表明相對于不帶有腫瘤的小鼠的auc，帶有腫瘤的小鼠的auc較小，相對于小腫瘤小鼠，大腫瘤小鼠具有最低的紫杉醇血藥值(abx治療的不帶有腫瘤的小鼠，帶有小腫瘤的小鼠和帶有大腫瘤的小鼠分別為80.4+/-2.7,48.4+/-12.3,和30.7+/-5.2；ab160治療的不帶有腫瘤的小鼠，帶有小腫瘤的小鼠和帶有大腫瘤的小鼠分別為66.1+/-19.8,44.4+/-12.1和22.8+/-6.9)。類似地，帶有較大腫瘤的小鼠的兩個治療組的cmax下降(abx治療組為47.2,28.9和19.7μg/ml以及ab160治療組為40.1,26.9和15.3μg/ml)。ab160治療的小鼠的血液中紫杉醇的auc和cmax比abx治療的小鼠的血液中紫杉醇的auc和cmax低。雖然沒有統(tǒng)計學(xué)上的顯著性，但是該數(shù)據(jù)也和用ab160治療的腫瘤中較多的紫杉醇沉積一致。

為了直接測試這種假設(shè)，通過lc-ms測量腫瘤紫杉醇濃度。在4小時(3473μg/mg組織+/-340相對于2127μg/mg組織+/-3.5；p＝0.02)和8小時(3005μg/mg組織+/-146相對于1688μg/mg組織+/-146；p＝0.01)時間點，用ab160治療的腫瘤中的腫瘤紫杉醇濃度顯著高于用abx治療的腫瘤中的腫瘤紫杉醇濃度，這表明當(dāng)被抗體靶定時，紫杉醇在腫瘤中停留較長時間(圖4h)。這解釋了血液pk并且與藥物重新分布至組織(包括腫瘤)一致。

i-125標(biāo)記的ab160(abx-avti125)和結(jié)合abx的igg同種型(abx-iggi125)的體內(nèi)活細胞成像證實了lc-ms的結(jié)果，注射后3小時(32.2uci/g+/-9.1相對于18.5uci/g+/-1.65；p＝0.06)和10小時(41.5uci/g+/-6.4相對于28.7uci/g+/-2.66；p＝0.03)，用ab160治療的小鼠的腫瘤中的i-125水平高于igg-abx(圖4i和圖4j)。綜上，這些數(shù)據(jù)說明bev和abx的結(jié)合改變了血液pk，并且這種改變是由于藥物向腫瘤組織的重新分布引起的，如通過紫杉醇的lc-ms和bev的i-125標(biāo)記相對于同種型匹配的igg1所顯示的。

不受理論的限制，認為通過靶向腫瘤的抗體結(jié)合至abx，pk比單獨的abx發(fā)生更加顯著的改變，血液中cmax和auc降低是由于ab160重新分布至腫瘤組織。這些來自小鼠血液紫杉醇pk，紫杉醇的腫瘤組織水平和用ab160治療的小鼠體內(nèi)的i-125輻射活性水平相對于單獨用abx治療的小鼠體內(nèi)的i-125輻射活性水平的結(jié)果表明abx的抗體靶向改變了紫杉醇的生物分布，這樣更高水平的紫杉醇到達腫瘤并且停留在腫瘤位點持續(xù)更長的時間段，從而加強腫瘤衰退。

實施例7：其他治療性抗體的結(jié)合

測試了抗-人cd20抗體(利妥昔單抗)和抗-her2/neu受體抗體(曲妥珠單抗)和abx的結(jié)合以確定其他igg治療性抗體是否也在體外結(jié)合時表現(xiàn)出結(jié)合至abx。

方法

制備包含利妥昔單抗或曲妥珠單抗的納米顆粒并且如上述實施例那樣進行測試。

結(jié)果

含有bev的復(fù)合物的粒度與含有曲妥珠單抗的復(fù)合物的粒度非常類似，平均粒度分別為約0.157至2.166μm(圖2a)和0.148至2.868μm(圖5b)。相反，采用利妥昔單抗形成的顆粒在較低的抗體:abx比例條件下變得大得多，粒度為0.159至8.286μm(圖5a)。

在不同的ph條件下通過blitz測定利妥昔單抗和曲妥珠單抗與abx的結(jié)合親和性。這兩種抗體均以在皮摩爾范圍內(nèi)的相對高的親和性發(fā)生結(jié)合(圖5c)。隨著ph升高，利妥昔單抗與abx的親和性降低，但是曲妥珠單抗與abx的親和性不受ph的影響(圖5c)。

在體外和體內(nèi)測試了由利妥昔單抗制備的160nm顆粒(ar160)的療效。在體外，在紫杉醇濃度增加(0-200μg/ml)的條件下，用ar160，abx或單獨的利妥昔單抗治療b-細胞淋巴瘤細胞系daudi。與abx(ic50>200μg/ml)或單獨的利妥昔單抗(ic50>200μg/ml)相比，ar160(ic50＝10μg/ml)治療24小時(p＝0.024)顯著抑制daudi細胞的增殖(圖6a)。

在體內(nèi)，在無胸腺裸鼠體內(nèi)建立daudi細胞的異種移植模型。一旦產(chǎn)生腫瘤，就采用pbs，abx，利妥昔單抗，順序給藥的abx和利妥昔單抗或ar160治療小鼠。在治療后第7天，測量腫瘤并且計算相對于基線的腫瘤尺寸的變化百分比。ar160治療的腫瘤衰退或保持穩(wěn)定，而所有其他治療組的腫瘤惡化(圖6b)。ar160組中相對于基線腫瘤尺寸的變化百分比與所有其他組相比具有顯著性(p<0.0001)。與分別用pbs(p<0.0001)，abx(p<0.0001)或利妥昔單抗(p＝0.0002)治療的小鼠的12天、16天和12天的中值生存期相比，用ar160治療的小鼠具有大于60天的顯著更長的中值生存期(圖6c)。然而，ar160的中值生存期與順序治療組的中值生存期沒有顯著性差異(p＝0.36)。這可能是因為利妥昔單抗結(jié)合至腫瘤細胞并且保留在細胞表面，當(dāng)其進入腫瘤位點時允許后續(xù)給藥的abx結(jié)合至抗體，不像bev，其結(jié)合可溶的靶點并且不是細胞表面標(biāo)志物。

實施例8：其他化療藥物與ab160的結(jié)合

評估了其他化療藥物形成的功能納米顆粒的療效。

方法

制備包含順鉑的納米顆粒并且如上述實施例所描述的那樣進行測試。

結(jié)果

為了測試另一化療藥物是否與ab160顆粒結(jié)合，將順鉑與abx共孵育并且通過hplc測量上清液中殘留的游離順鉑的量。大約60％的順鉑(即，僅40％留在上清液中)結(jié)合至abx(圖7a)。

接下來，使用a375細胞測試ac相對于abx和單獨的順鉑的腫瘤毒性。對復(fù)合物進行離心以除去較高毒性的未結(jié)合的順鉑并且復(fù)溶于介質(zhì)中以確保ac相對于abx的任何額外的毒性是僅由abx結(jié)合的順鉑引起的。類似地，僅abx以類似的方式進行離心。ac(ic50＝90μg/ml)比單獨的abx(ic50>1000μg/ml)在更大程度上抑制a375的增殖(圖7b)。相對于其他毒性實驗，該實驗中降低的毒性是由于離心步驟中藥物的一些損失引起的，但是abx和ac的比較仍然有意義。

為了確定含有順鉑的ab160復(fù)合物的腫瘤毒性，將ab160與順鉑共孵育以形成含有順鉑的顆粒(abc復(fù)合物)。在a375黑色素瘤異種移植模型中相對于每個單獨的藥物和ab160測試abc復(fù)合物。使用ab160，順序給藥的ab160+順鉑以及abc復(fù)合物治療的腫瘤在治療之后7天均顯示出腫瘤尺寸減小(圖7c)，但是abc復(fù)合物產(chǎn)生最長的中值生存期(35天，相對于ab160和ab160+順鉑分別為24天和26天)。雖然沒有統(tǒng)計學(xué)上的顯著性差異(p＝0.82和0.79)(圖7d)，但是數(shù)據(jù)與abc復(fù)合物的長期生存率益處一致。

這些數(shù)據(jù)表明abx的白蛋白部分為結(jié)合其他治療性抗體(例如利妥昔單抗和曲妥珠單抗)以及結(jié)合其他化療劑(例如，順鉑)提供了平臺，這均與ab160在體外和體內(nèi)具有類似的療效。

綜合這些數(shù)據(jù)證明了構(gòu)建通用的納米-免疫結(jié)合物的簡單方式，其使得多種蛋白質(zhì)或細胞毒性藥劑結(jié)合至單個白蛋白骨架。在小鼠模型中證明了相對于單個藥劑靶向藥物的療效得到改善，這至少部分由抗體靶向的藥物的pk改變引起。而且，不受理論限制，本文公開的無需連接體或靶細胞內(nèi)在化的納米-免疫結(jié)合物的通用性可克服其他納米藥物在將結(jié)果從小鼠轉(zhuǎn)化至人類時所面臨的障礙。

實施例9：ab160的凍干

ab160通過將8mg(320μl)貝伐單抗加至20mgabraxane來合成。隨后加入1.66ml0.9％的鹽水，使最終體積為2ml，貝伐單抗的最終濃度為4mg/ml且abraxane的最終濃度為10mg/ml，并且使混合物在室溫下在15ml聚丙烯圓錐管中孵育30分鐘。

30分鐘的室溫孵育之后，以1:2的比例在0.9％的鹽水中稀釋混合物至貝伐單抗和abraxane分別為2mg/ml和5mg/ml。這些是由給藥于患者的藥方制備的兩種藥物的濃度。

ab160分成20個1.5ml聚丙烯eppendorf中200μl的等份并在-80℃下冷凍。

一旦冷凍，采用virtis3lbenchtop凍干器(spscientific,warmister,pa)打開制冷將各個等份過夜凍干。生成凍干的制劑。

在相同的1.5ml聚丙烯eppendorf中，將干燥的等份儲存在室溫下。這些樣品易于在室溫在鹽水中復(fù)溶30分鐘，隨后在2000xg條件下離心7分鐘。隨后，根據(jù)需要，將得到的樣品重懸于合適的緩沖劑中。

通過比較，通過加熱和快速真空干燥的樣品不能復(fù)溶。

實施例10：凍干的制劑的測試

在凍干后的不同時間點復(fù)溶樣品并且測試它們相對于abx和新鮮制備的ab160的物理性質(zhì)。

如上所述的那樣評估粒度分布。

通過樣品與vegf在室溫下孵育2小時，在2000xg條件下離心7分鐘對vegf結(jié)合進行評估。結(jié)合至小粒(對應(yīng)于納米顆粒)的vegf的量或保留在上清液中的vegf的量由elisa測量。

通過細胞毒性在體外評價紫杉醇針對a375細胞的活性。

意想不到的是，如通過抑制癌細胞增殖的能力所顯示的，凍干并未顯著影響粒度、vegf結(jié)合或紫杉醇的活性。儲存1個月(圖8a至8c)或10個月(圖8d至8f)的凍干樣品保持該結(jié)果。

更意想不到的是，這些結(jié)果在未使用冷凍保護劑或其他可不利地影響人的治療應(yīng)用的試劑的凍干的納米顆粒中觀察到。

實施例11：ab160在人體中的療效

在1期首次人體臨床試驗中測試ab160，測試ab160給藥于患有轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤的先前治療已失敗的患者的安全性。研究使用典型3+3，1期臨床試驗設(shè)計，測試下列模式中ab160的3個不同劑量：

表4

*劑量水平1是指起始劑量

選擇與目前用于臨床實踐中的abraxane的劑量相關(guān)的劑量。在每個治療劑量之前制備ab160。治療作為在28天治療循環(huán)的第1天、第8天和第15天30分鐘的靜脈內(nèi)輸注來施用。繼續(xù)治療直至不耐受毒性，腫瘤惡化或患者拒絕。在每個治療循環(huán)之前，評估對患者的毒性，每隔一個循環(huán)進行腫瘤評估(recist)。

研究通過與治療循環(huán)1和治療循環(huán)2的劑量1相關(guān)的正式(患者體內(nèi))藥代動力學(xué)研究來完成。

5位患者已被給藥ab160，100mg/m²的abx和40mg/m²的bev，對5位患者中的4位進行分析。

表5：i期研究中的疾病過程

pfs是指無惡化中值生存期，即，癌癥復(fù)發(fā)之前的治療天數(shù)。不良事件列于下表。沒有劑量限制性毒性(dlt)，即，不良事件與ab160的劑量不相關(guān)。更加詳細的細節(jié)列于表6。

表6：i期研究中的不良事件

平均pfs為7.6個月并且中值為7.0個月。

與其他臨床試驗的比較

下表顯示了其他公開的用于轉(zhuǎn)移的黑色素瘤的紫杉烷療法臨床研究。

在目前的試驗中，ab160顆粒的給藥相當(dāng)于100mg/m²的abraxane和40mg/m²貝伐單抗的劑量。只有spitler的研究使用單獨的bev和abx。然而，spitler使用更高劑量的abx。如果劑量調(diào)節(jié)至平均患者的話(假設(shè)表面積為1.9m²且質(zhì)量為90kg)，本研究還使用了低于先前研究中所報道的bev劑量的10％的劑量。

spilter還檢測了先前尚未進行治療的患者，而本研究檢測了先前治療失敗的患者。先前的無效治療不僅僅花費了預(yù)期的pfs的時間，而且還選擇了對治療更加具有耐受性的癌細胞，并且通常留下了身體條件不太好的患者。因此，“挽救”療法(如本文的采用ab160)中的患者群的pfs預(yù)期比初始群的pfs更低。這可在2期臨床試驗中看到(hersh等人,cancer,january2010,116:155)，其測試了使用單獨的abraxane的挽救患者和初始患者。對于先前采用單獨的abraxane治療的患者而言，pfs為3.5個月，hersh等人,ann.oncol2015,(epubseptember26,2015)，采用單獨的abx治療的初始患者的pfs報道為4.8個月。

表9：在針對公布的數(shù)據(jù)的有限的研究中ab160的性能

因此，使用ab160的i期臨床試驗的早期結(jié)果顯示先前治療的患者中的晚期轉(zhuǎn)移的惡性黑色素瘤的pfs增加。這種增加特別意想不到，pfs高于spitler中那些患者，他們是初始化療并且給藥更高劑量的abraxane以及幾乎12倍的貝伐單抗的劑量。ab160中使用的bev的劑量遠遠低于任何其他研究，因此，最佳比較不是spitler，而是hersh。

因此，abx/bev復(fù)合物(ab160)優(yōu)于順序給藥的abx和bev或單獨的abx，并且以非常低的bev有效劑量實現(xiàn)了這種優(yōu)良的結(jié)果。因此，數(shù)據(jù)與ab160使化療藥劑靶向腫瘤得到改善一致，并且這種靶向由bev介導(dǎo)。因為白蛋白被腫瘤選擇性攝取，所以abx納米顆?？赡苡兄谑筨ev靶向腫瘤。bev/abx復(fù)合物的存在也有可能在體內(nèi)顯示出比abraxane更好的穩(wěn)定性。

實施例12：研究采用bev預(yù)治療是否改善靶向的跟蹤研究

根據(jù)上述總體規(guī)程，向無胸腺裸鼠的右側(cè)肋腹注射1x10⁶個a375人黑色素瘤細胞并隨后采用pbs，12mg/kgbev，30mg/kgabx，ab160或用1.2mg/kgbev預(yù)治療并在24小時后使用ab160治療。數(shù)據(jù)表示治療后第7天和第10天的腫瘤體積(mm³)。圖11a至e跟蹤10天的腫瘤體積。只有用ab160治療的小鼠(采用bev預(yù)先治療或不采用bev預(yù)先治療)表現(xiàn)出平均腫瘤體積減小。參見圖11f和圖11g。

如圖11f所總結(jié)的，治療后第7天的數(shù)據(jù)顯示采用bev預(yù)先治療與腫瘤體積相對于對照或單獨的bev(p≤0.0001)或單獨的abx(p≤0.0001)發(fā)生統(tǒng)計學(xué)上的顯著減小有關(guān)。

如圖11g所總結(jié)的，治療后第10天的數(shù)據(jù)再次顯示采用bev預(yù)先治療與腫瘤體積相對于對照或單獨的bev(p≤0.0001)或單獨的abx(p≤0.0001)發(fā)生統(tǒng)計學(xué)上的顯著減小有關(guān)。在ab160之前采用bev預(yù)先治療還與腫瘤體積相對于單獨的ab160(p＝0.02)減小有關(guān)，在兩只小鼠體內(nèi)產(chǎn)生完全反應(yīng)。

在該實驗中，12mg/kgbev的劑量不是治療的。加至預(yù)先治療組中的bev的量僅為1.2mg/kg，這是小鼠中的常規(guī)劑量的十分之一。然而，采用亞治療劑量的預(yù)先治療看起來顯示出ab160納米顆粒的療效得到改善。該數(shù)據(jù)支持如下想法：采用亞治療量的bev進行預(yù)先治療可清除vegf的全身水平，留下腫瘤中相對較高的濃度，這樣由ab160納米顆粒靶向腫瘤相關(guān)的vegf更加有效。

實施例13：遞送納米顆粒的可選方式

本發(fā)明的納米顆粒被認為可直接遞送至腫瘤。例如，納米顆?？赏ㄟ^動脈內(nèi)置管遞送或通過直接注射至腫瘤內(nèi)部。在這些實施方式中，較大的納米顆粒(例如，580nm或1130nm)被認為可通過直接注射至腫瘤內(nèi)部或腫瘤附近來遞送。