本發(fā)明涉及包含GLP-1激動(dòng)劑的液體組合物，所述激動(dòng)劑包括阿必魯肽(albiglutide)。發(fā)明背景降血糖藥可用于治療1型和2型糖尿病以降低血液中的葡萄糖濃度。促胰島素肽如毒蜥外泌肽-4(exendin-4)和GLP-1衍生物目前作為治療劑用于治療糖尿病。產(chǎn)品包括和(毒蜥外泌肽-4或艾塞那肽(exenatide))；(利拉魯肽；與棕櫚酰基融合的GLP-1片段)；TRULICITYTM(度拉糖肽；與IgG4Fc區(qū)融合的GLP-1類似物)和TANZEUMTM/EPERZANTM。促胰島素肽包括但不限于腸降血糖素激素，例如抑胃肽(GIP)和胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)，以及其片段、變體和/或綴合物。促胰島素肽還包括例如毒蜥外泌肽-3和毒蜥外泌肽-4。GLP-1是腸中L-細(xì)胞在應(yīng)對(duì)食物攝入時(shí)所分泌的36個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的腸降血糖素激素。已顯示GLP-1以生理學(xué)和葡萄糖依賴性方式刺激胰島素分泌、降低胰高血糖素分泌、抑制胃排空、減少食欲和刺激β細(xì)胞增殖。在非臨床實(shí)驗(yàn)中，GLP-1通過(guò)刺激對(duì)葡萄糖依賴性胰島素分泌來(lái)說(shuō)重要的基因的轉(zhuǎn)錄和通過(guò)促進(jìn)β細(xì)胞新生來(lái)促進(jìn)持續(xù)的β細(xì)胞能力(Meier等人，Biodrugs.2003；17(2)：93-102)。在健康的個(gè)體中，GLP-1通過(guò)刺激胰腺的葡萄糖依賴性胰島素分泌而在調(diào)節(jié)餐后血糖水平中起到重要作用，使得外周葡萄糖吸收增加。GLP-1也抑制胰高血糖素分泌，導(dǎo)致肝葡萄糖排出量減少。此外，GLP-1延遲胃排空并減緩小腸蠕動(dòng)，從而延遲食物吸收。在患有2型糖尿病(T2DM)的人中，GLP-1的正常餐后升高不存在或升高量降低(VilsbollT等人，Diabetes.2001.50；609-613)。因此，施用外源GLP-1、腸降血糖素激素或腸降血糖素模擬物的一個(gè)原因是為了增強(qiáng)、替代或補(bǔ)充內(nèi)源性GLP-1，以增加膳食相關(guān)的胰島素分泌，減少胰高血糖素分泌和/或減慢胃腸道蠕動(dòng)。天然GLP-1具有非常短的血清半衰期(<5分鐘)。阿必魯肽在美國(guó)以TANZEUMTM銷售，在歐洲以EPERZANTM銷售。TANZEUMTM/EPERZANTM的有效成分是阿必魯肽。阿必魯肽是由2個(gè)拷貝組成的重組融合蛋白，所述拷貝為30個(gè)氨基酸序列的經(jīng)修飾的人胰高血糖素樣肽1(GLP-1，片段7-36(A8G))，其與重組人血清白蛋白連續(xù)地基因融合。每個(gè)GLP-1序列已被修飾，其中用甘氨酸取代第8位的天然存在的丙氨酸，以賦予對(duì)二肽基肽酶IV(DPP-IV)介導(dǎo)的蛋白水解的抗性。TANZEUMTM/EPERZANTM被提供為用于皮下注射的30mg阿必魯肽筆，并且包含40.3mg凍干阿必魯肽和0.65mL注射用稀釋水，用于在重構(gòu)后以0.5mL的體積遞送30mg的劑量。TANZEUMTM/EPERZANTM還提供為50mg的筆，其含有67mg凍干阿必魯肽和0.65mL注射用稀釋劑水，用于在重構(gòu)后以0.5mL的體積遞送50mg的劑量。非活性成分包括153mM甘露醇、0.01％(w/w)聚山梨醇酯80、10mM磷酸鈉、117mM海藻糖二水合物。TANZEUMTM/EPERZANTM不含防腐劑。凍干或冷凍干燥的治療性蛋白(如阿必魯肽)的制劑具有需要復(fù)雜包裝的缺點(diǎn)，因?yàn)樾枰獑为?dú)供應(yīng)無(wú)菌注射用水。此外，凍干制劑通常使用雙室注射筒來(lái)施用。雙室藥筒是昂貴的，并且將注射用水與凍干藥物混合后，可經(jīng)長(zhǎng)達(dá)30分鐘至1小時(shí)之后，凍干的活性藥物才被重構(gòu)并準(zhǔn)備好被注射。因此，對(duì)于用于降血糖劑，特別是阿必魯肽或其變體的液體組合物，仍存在未滿足的需求。附圖說(shuō)明圖1.研究1.0的制劑F07至F12在t0時(shí)的非還原SDS-PAGE凝膠。圖2.研究1.0的制劑F07至F12在t0時(shí)的還原SDS-PAGE凝膠。圖3.來(lái)自研究1.0的t2樣品的非還原和還原SDS-PAGE凝膠。圖4.來(lái)自研究1.1的制劑F01-F07在t0時(shí)的非還原SDS-PAGE凝膠。圖5.來(lái)自研究1.1的制劑F08-F14在t0時(shí)的非還原SDS-PAGE凝膠。圖6.來(lái)自研究1.1的制劑F01-F07在t1時(shí)的非還原SDS-PAGE凝膠。圖7.來(lái)自研究1.1的制劑F08-F14在t1時(shí)的非還原SDS-PAGE凝膠。圖8.來(lái)自研究1.1的制劑F01-F07在t2時(shí)的非還原SDS-PAGE凝膠。圖9.來(lái)自研究1.1的制劑F01-F07在t2時(shí)的非還原SDS-PAGE凝膠。圖10.來(lái)自研究1.2的制劑F01至F08在t0時(shí)的非還原SDS-PAGE凝膠。圖11.來(lái)自研究1.2的制劑F09至F16在t0時(shí)的非還原SDS-PAGE凝膠。圖12.來(lái)自研究1.2的制劑F01至F18在t1時(shí)的非還原SDS-PAGE凝膠。圖13.來(lái)自研究1.2的制劑F09至F16在t1時(shí)的非還原SDS-PAGE凝膠。圖14.來(lái)自研究1.2的制劑F09至F16在t2時(shí)的非還原SDS-PAGE凝膠。圖15.來(lái)自研究1.2的制劑F09至F16在t2時(shí)的非還原SDS-PAGE凝膠。圖16.根據(jù)PLS1模型的pH和檸檬酸鹽的影響，使用RPHPLC在t22在25℃的純度作為終點(diǎn)。蛋白質(zhì)濃度固定為50mg/mL，精氨酸為100mM，海藻糖為117mM。圖17.根據(jù)PLS1模型的PS80和蛋白質(zhì)濃度的影響，使用RPHPLC在t22在25℃的純度作為終點(diǎn)。檸檬酸鹽固定在10mM，pH為6.0，精氨酸為100mM，海藻糖為117mM。圖18.根據(jù)PLS1模型的精氨酸和海藻糖的影響，使用RPHPLC在t22在25℃的純度作為終點(diǎn)。檸檬酸鹽固定在10mM，pH為6.0，蛋白質(zhì)濃度為50mg/mL。圖19.根據(jù)PLS2模型的pH和檸檬酸鹽的影響，使用在t22處在5°和25℃的二聚體含量作為終點(diǎn)。蛋白質(zhì)濃度固定為50mg/mL，精氨酸為100mM，海藻糖為117mM。圖20.根據(jù)PLS2模型的PS80和蛋白質(zhì)濃度的影響，使用在t22處在5°和25℃的二聚體含量作為終點(diǎn)。檸檬酸鹽固定在10mM，pH為6.0，精氨酸為100mM，海藻糖為117mM。圖21.根據(jù)PLS2模型的精氨酸和海藻糖的影響，使用在t22處在5°和25℃的二聚體含量作為終點(diǎn)。檸檬酸鹽固定在10mM，pH為6.0，蛋白質(zhì)濃度為50mg/mL。圖22.根據(jù)PLS1模型的pH和檸檬酸鹽的影響，使用通過(guò)cIEF在t22在5°的主峰純度作為終點(diǎn)。蛋白質(zhì)濃度固定為50mg/mL，精氨酸為100mM，海藻糖為117mM。圖23.根據(jù)PLS1模型的PS80和蛋白質(zhì)濃度的影響，使用cIEF在t22處在5°的主峰純度作為終點(diǎn)。檸檬酸鹽固定在10mM，pH為6.0，精氨酸為100mM，海藻糖為117mM。圖24.根據(jù)PLS1模型的精氨酸和海藻糖的影響，使用cIEF在t22處在5°的主峰純度作為終點(diǎn)。檸檬酸鹽固定在10mM，pH為6.0，蛋白質(zhì)濃度為50mg/mL。發(fā)明概述在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含阿必魯肽、緩沖劑、至少一種糖和/或至少一種多元醇、至少一種穩(wěn)定劑和任選的表面活性劑的液體組合物，其中所述阿必魯肽在所述液體組合物中保持穩(wěn)定。如果在避光時(shí)，在至少一周的時(shí)間內(nèi)，至少≥96％的所述阿必魯肽在液體組合物中保持為單體，則可認(rèn)為阿必魯肽在液體中保持穩(wěn)定。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了液體組合物，其包含多肽、至少一種緩沖劑、至少一種糖和/或至少一種多元醇和至少一種穩(wěn)定劑，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:1所示的多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或者所述多肽與在C端和/或N端被截短的SEQIDNO:1所示的多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，其中所述多肽保持穩(wěn)定并且在所述液體組合物中具有至少一種GLP-1活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，液體組合物還包含表面活性劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含GLP-1激動(dòng)劑的液體組合物，其中在至少一年期間，所述GLP-1激動(dòng)劑在所述液體組合物中保持穩(wěn)定并且具有至少一種GLP-1活性。合適地，GLP-1激動(dòng)劑是阿必魯肽。本發(fā)明提供了治療代謝性疾病，包括2型糖尿病的方法，包括給予人本發(fā)明的任何一種液體組合物。發(fā)明詳述定義本文所用的“GLP-1激動(dòng)劑組合物”是指能夠刺激胰島素分泌或提高胰島素水平的任何組合物，包括但不限于腸降血糖素激素和腸降血糖素模擬物。本文所用的“GLP-1激動(dòng)劑”和“GLP-1受體激動(dòng)劑”和“GLP-1R激動(dòng)劑”可互換使用，是指能夠結(jié)合GLP-1受體和/或具有至少一種GLP-1活性的任何化合物。適宜地，阿必魯肽可被稱為GLP-1激動(dòng)劑或GLP-1R激動(dòng)劑。本文所用的“腸降血糖素激素”是指增強(qiáng)胰島素分泌或以其它方式提高哺乳動(dòng)物中胰島素水平的任何激素。腸降血糖素激素的一個(gè)實(shí)例是GLP-1。GLP-1是腸L細(xì)胞在應(yīng)對(duì)食物攝取時(shí)而分泌的腸降血糖素激素。在健康的個(gè)體中，GLP-1通過(guò)刺激胰腺的葡萄糖依賴性胰島素分泌而在調(diào)節(jié)餐后血糖水平中起重要作用，從而導(dǎo)致外周葡萄糖吸收增加。GLP-1也抑制胰高血糖素分泌，導(dǎo)致肝葡萄糖排出量減少。此外，GLP-1延遲胃排空時(shí)間，并減緩小腸蠕動(dòng)，延遲食物吸收。GLP-1通過(guò)刺激參與葡萄糖依賴性胰島素分泌的基因的轉(zhuǎn)錄并通過(guò)促進(jìn)β細(xì)胞新生來(lái)促進(jìn)持續(xù)的β細(xì)胞能力(Meier等人，Biodrugs2003；17(2):93-102)。本文所用的“GLP-1活性”是指天然存在的人GLP-1的一種或多種活性，包括但不限于：當(dāng)施用于哺乳動(dòng)物(包括人)時(shí)，降低血液和/或血漿葡萄糖，刺激葡萄糖依賴性胰島素分泌或以其他方式提高胰島素水平，抑制胰高血糖素分泌，降低果糖胺，增加葡萄糖向腦的遞送和代謝，延遲胃排空和促進(jìn)β細(xì)胞能力和/或新生。任何這些活性和與GLP-1活性相關(guān)的其它活性可以由具有GLP-1活性的組合物或GLP-1激動(dòng)劑直接或間接引起。舉例來(lái)說(shuō)，具有GLP-1活性的組合物可直接或間接刺激胰島素產(chǎn)生，其導(dǎo)致哺乳動(dòng)物血漿葡萄糖水平的降低。如本領(lǐng)域所理解的，GLP-1活性可以通過(guò)各種標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)量?？梢栽隗w內(nèi)和/或體外測(cè)量GLP-1活性。作為實(shí)例，具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的多肽或與SEQIDNO:1具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)量，從而測(cè)量施用給哺乳動(dòng)物之前和之后的血液或血漿葡萄糖水平。作為另一個(gè)實(shí)例，可在體外測(cè)量具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的多肽或與SEQIDNO:1具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的GLP-1活性。GLP1介導(dǎo)其已知的細(xì)胞效應(yīng)(包括誘導(dǎo)胰島素分泌)的能力取決于其與GLP1受體的結(jié)合和隨后GLP1受體的活化。這種活化導(dǎo)致通過(guò)腺苷酸環(huán)化酶產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)3,5-環(huán)磷腺苷(cAMP)增加，其可以通過(guò)ELISA測(cè)量。阿必魯肽對(duì)敏感細(xì)胞產(chǎn)生類似的作用，包括誘導(dǎo)cAMP的產(chǎn)生。使用了改造成穩(wěn)定表達(dá)人GLP1受體的HEK293F細(xì)胞系的生物測(cè)定可用于測(cè)定GLP-1激動(dòng)劑的體外生物活性。該測(cè)定基于如下原理：阿必魯肽與在HEK293F細(xì)胞上表達(dá)的GLP1受體的結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的增加，其可以通過(guò)ELISA檢測(cè)和定量。通過(guò)比較阿必魯肽參考標(biāo)準(zhǔn)比測(cè)試樣品的50％有效濃度(EC50)可以確定那些測(cè)試樣品的相對(duì)功效。包括阿必魯肽的GLP-1激動(dòng)劑相對(duì)于由凍干顆粒重新形成的天然GLP-1或阿必魯肽保留GLP-1受體結(jié)合活性。例如，本發(fā)明的液體組合物中的阿必魯肽可以保留的活性為由凍干顆粒重構(gòu)的天然GLP-1或阿必魯肽的活性的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(計(jì)算為阿必魯肽液體組合物相比于重構(gòu)的阿必魯肽的EC50的反比，例如，通過(guò)cAMP的產(chǎn)量測(cè)量)。在一個(gè)實(shí)施方案中，與重構(gòu)的阿必魯肽相比，液體組合物中的阿必魯肽具有相同的、100％、99％、98％、97％、96％、95％或90％的活性(與本文術(shù)語(yǔ)“效力”同義)。合適地，本發(fā)明的液體組合物中的阿必魯肽可以保留的活性為從凍干顆粒重構(gòu)的天然GLP-1或阿必魯肽的活性的約90％至100％。本文所用的GLP-1激動(dòng)劑(包括但不限于阿必魯肽)的“效力”是指，在基于細(xì)胞的測(cè)定中，GLP-1激動(dòng)劑在體內(nèi)和/或體外表現(xiàn)出至少一種GLP-1活性以活化GLP-1受體的能力。如本文所述并且如本領(lǐng)域所理解的，可以通過(guò)幾種體內(nèi)和體外方法測(cè)量GLP-1激動(dòng)劑(包括阿必魯肽)及其變體的效力。在本發(fā)明的一些方面，任何液體組合物中的GLP-1激動(dòng)劑可具有約80％至約130％的阿必魯肽效力。在一些方面，GLP-1激動(dòng)劑可具有超過(guò)130％的阿必魯肽效力。在一些方面，本發(fā)明的液體制劑中GLP-1激動(dòng)劑的效力可以相對(duì)于其自身測(cè)量，其為時(shí)間0(T0)和T1之間的差異。另外或備選地，可以在相同條件和相同時(shí)間點(diǎn)下，相對(duì)于相同制劑中的阿必魯肽的效力，測(cè)量本發(fā)明的液體制劑中GLP-1激動(dòng)劑的效力。如本文所用的“腸降血糖素模擬物”是能夠增強(qiáng)胰島素分泌或以其它方式提高胰島素水平的化合物。腸降血糖素模擬物在哺乳動(dòng)物中能夠刺激的胰島素分泌，增加β細(xì)胞新生，抑制β細(xì)胞凋亡，抑制胰高血糖素分泌，延遲胃排空并誘導(dǎo)飽腹感。腸降血糖素模擬物可包括但不限于具有GLP-1活性的任何多肽，包括但不限于毒蜥外泌肽3和毒蜥外泌肽4，包括其任何片段和/或變體和/或綴合物。本文所用的“降血糖藥”是指能夠降低血糖的任何化合物或包含能夠降低血糖的化合物的組合物。降血糖藥可以包括但不限于任何GLP-1激動(dòng)劑，包括腸降血糖素激素或腸降血糖素模擬物、GLP-1和/或其片段、變體和/或綴合物。其它降血糖藥包括但不限于增加胰島素分泌的藥物(例如磺酰脲類(SU)和氯茴苯酸類)，抑制GLP-1分解的藥物(例如DPP-IV抑制劑)，增加葡萄糖利用的藥物(例如格列酮類，噻唑烷二酮類(TZD)和/或pPAR激動(dòng)劑)、減少肝臟葡萄糖產(chǎn)生的藥物(例如二甲雙胍)和延遲葡萄糖吸收的藥物(例如，α-葡萄糖苷酶抑制劑)?；酋ｋ孱惖膶?shí)例包括但不限于醋磺已脲、氯磺丙脲、妥拉磺脲、格列吡嗪、格列齊特、格列本脲(優(yōu)降糖)、格列喹酮和格列美脲。格列酮的實(shí)例包括但不限于羅格列酮和吡格列酮?！岸嗪塑账帷蓖ǔＪ侵缚梢允俏葱揎椀腞NA或DNA或修飾的RNA或DNA的任何多聚核糖核苷酸或多聚脫氧核糖核苷酸?！岸嗪塑账帷卑ǖ幌抻趩捂満碗p鏈DNA、單鏈和雙鏈區(qū)的混合物的DNA或單鏈、雙鏈和三鏈區(qū)的混合物的DNA、單鏈和雙鏈RNA和單鏈和雙鏈區(qū)域的混合物的RNA、包含DNA和RNA的雜交分子(該DNA和RNA可以是單鏈或更通常是雙鏈或三鏈區(qū)域，或?yàn)閱捂満碗p鏈區(qū)域的混合物)。此外，本文所用的“多核苷酸”是指包含RNA或DNA、或RNA和DNA二者的三鏈區(qū)。該區(qū)域中的鏈可以來(lái)自相同的分子或來(lái)自不同的分子。這些區(qū)域可以包括所有的一個(gè)或多個(gè)分子，但是更典型地僅涉及分子的一些區(qū)域中的一個(gè)。三螺旋區(qū)域分子中的一種通常是寡核苷酸。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”還包括如上所述的包含一個(gè)或多個(gè)修飾堿基的DNA或RNA。因此，為了穩(wěn)定性或其他原因主鏈被修飾的DNA或RNA屬于本文所述的術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”。此外，包含稀有堿基(例如肌苷)或修飾堿基(例如三苯甲基堿基)的DNA或RNA(僅舉兩個(gè)實(shí)例)屬于本文所用的術(shù)語(yǔ)多核苷酸。應(yīng)當(dāng)理解，已經(jīng)對(duì)DNA和RNA進(jìn)行了各種各樣的修飾，其用于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多有用目的。本文使用的術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”包括多核苷酸的這種化學(xué)修飾、酶修飾或代謝修飾形式，以及病毒和細(xì)胞的DNA和RNA特征的化學(xué)形式，包括例如簡(jiǎn)單和復(fù)雜細(xì)胞?！岸嗪塑账帷币舶ㄍǔ７Q為寡核苷酸的短多核苷酸?！岸嚯摹笔侵溉魏坞幕虻鞍踪|(zhì)，其包含通過(guò)肽鍵或修飾的肽鍵彼此連接的兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸的，即肽電子等排體?！岸嚯摹笔侵付替?通常稱為肽、寡肽或寡聚體)以及較長(zhǎng)的鏈(通常稱為蛋白質(zhì))。多肽可以包含除了20個(gè)基因編碼的氨基酸之外的氨基酸?！岸嚯摹卑ㄍㄟ^(guò)天然過(guò)程(例如翻譯后加工)或通過(guò)本領(lǐng)域熟知的化學(xué)修飾技術(shù)修飾的氨基酸序列。這樣的修飾在基礎(chǔ)教科書和更詳細(xì)的專題論文中以及在大量研究文獻(xiàn)中有詳細(xì)描述。修飾可發(fā)生在多肽中的任何地方，包括肽主鏈、氨基酸側(cè)鏈和氨基或羧基末端。應(yīng)當(dāng)理解，相同類型的修飾可以相同或不同程度存在于給定多肽中的幾個(gè)位點(diǎn)處。另外，給定的多肽可以含有多種類型的修飾。多肽可以因泛素化而分支，并且它們可以是環(huán)狀的(帶有或不帶有分支)。環(huán)狀、支鏈和支鏈環(huán)狀的多肽可以由翻譯后天然過(guò)程產(chǎn)生，或可以通過(guò)合成方法制備。修飾包括乙?；?、?；?、ADP-核糖基化、酰胺化、黃素的共價(jià)連接、血紅素部分的共價(jià)連接、核苷酸或核苷酸衍生物的共價(jià)連接、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價(jià)連接、磷脂酰肌醇的共價(jià)連接、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、脫甲基化、形成共價(jià)交聯(lián)、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲?；ⅵ?羧化、糖基化、形成GPI錨、羥基化、碘化、甲基化、豆蔻?；?、氧化、蛋白酶解加工、磷酸化、異戊二烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、通過(guò)轉(zhuǎn)移-RNA介導(dǎo)將氨基酸添加到蛋白質(zhì)中(例如精氨?；?和泛素化。例如參見(jiàn)，PROTEINS-STRUCTUREANDMOLECULARPROPERTIES,第2版，T.E.Creighton,W.H.FreemanandCompany,NewYork,1993和Wold,F.,PosttranslationalProteinModifications:PerspectivesandProspects,第1-12頁(yè)，在POSTTRANSLATIONALCOVALENTMODIFICATIONOFPROTEINS中,B.C.Johnson,Ed.,AcademicPress,NewYork,1983；Seifter等人,“Analysisforproteinmodificationsandnonproteincofactors”,Meth.Enzymol.(1990)182:626-646和Rattan等人,“ProteinSynthesis:PosttranslationalModificationsandAging”,AnnNYAcadSci(1992)663:48-62。本文使用的術(shù)語(yǔ)“變體”是分別不同于參考多核苷酸或參考多肽、但保留基本性質(zhì)(如保留參考多核苷酸或多肽的生物學(xué)活性)的多核苷酸或多肽。多核苷酸的典型變體在核苷酸序列上不同于另一個(gè)參考多核苷酸。變體的核苷酸序列的變化可以改變或不改變參考多核苷酸所編碼的多肽的氨基酸序列。核苷酸變化可導(dǎo)致由參考序列編碼的多肽中的氨基酸取代、添加、缺失、融合和截短，如下所述。多肽的典型變體在氨基酸序列上與另一個(gè)參考多肽不同。通常，差異是有限的，這使得參考多肽和變體的序列在整體上非常類似，并且在許多區(qū)域中是相同的。變體和參考多肽在氨基酸序列中的不同可在于氨基酸的取代、添加、缺失中的一個(gè)或多個(gè)或任何組合。取代或插入的氨基酸殘基可以是或可以不是由遺傳密碼編碼的殘基。多核苷酸或多肽的變體可以是天然存在的，例如等位基因變體，或其可以是非已知天然存在的變體。多核苷酸和多肽的非天然存在的變體可以通過(guò)誘變技術(shù)或通過(guò)直接合成制備。變體還可以包括但不限于多肽或其片段，其具有一個(gè)或多個(gè)其氨基酸側(cè)基的化學(xué)修飾?；瘜W(xué)修飾包括但不限于：添加化學(xué)部分、產(chǎn)生新的鍵和去除化學(xué)部分。氨基酸側(cè)基的修飾包括但不限于：賴氨酸-ε-氨基的?；?；精氨酸、組氨酸或賴氨酸的N-烷基化；谷氨酸或天冬氨酸羧酸基團(tuán)的烷基化；以及谷氨酰胺或天冬酰胺的脫酰胺化。末端氨基的修飾包括但不限于：去氨基、N-低級(jí)烷基、N-二-低級(jí)烷基和N-?；揎?。末端羧基的修飾包括但不限于：酰胺、低級(jí)烷基酰胺、二烷基酰胺和低級(jí)烷基酯修飾。此外，一個(gè)或多個(gè)側(cè)基或末端基團(tuán)可以被蛋白質(zhì)化學(xué)的普通技術(shù)人員已知的保護(hù)基團(tuán)保護(hù)。如本文所用，當(dāng)用于指多肽時(shí)，“片段”是具有與整個(gè)天然存在多肽的氨基酸序列部分相同(但不是全部相同)的氨基酸序列的多肽。片段可以是“獨(dú)立的”，或被包含在較大的多肽內(nèi)，其中它們作為單個(gè)連續(xù)區(qū)域在單個(gè)較大多肽中形成部分或區(qū)域。因此，GLP-1的片段可以是“獨(dú)立的”，或可以是遺傳融合的，并且是較大氨基酸序列的一部分。舉例來(lái)說(shuō)，天然存在的GLP-1的片段將包括天然存在的氨基酸1至36中的氨基酸7至36。此外，多肽的片段也可以是天然存在的部分序列的變體。例如，包含天然存在的GLP-1的氨基酸7-36的GLP-1的片段也可以是在其部分序列內(nèi)具有氨基酸取代的變體，例如在位置8的Ala變?yōu)镚ly。如本文所用的“綴合物”或“綴合的”是指彼此結(jié)合的兩個(gè)分子。例如，第一多肽可以共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合至第二多肽。第一多肽可以通過(guò)化學(xué)連接物共價(jià)結(jié)合第二多肽或者可以與第二多肽基因融合，其中第一和第二多肽共享共同的多肽主鏈。本文所述的任何GLP-1多肽可以通過(guò)連接物與另一種穩(wěn)定多肽(如白蛋白和/或其片段或人Fc區(qū)(例如修飾的IgG4或修飾的IgG1))結(jié)合。如本文所用，“串聯(lián)取向”是指作為相同分子的部分的彼此相鄰的兩個(gè)或更多個(gè)多肽。它們可以共價(jià)或非共價(jià)地連接。兩個(gè)或多個(gè)串聯(lián)取向的多肽可以形成相同多肽主鏈的一部分。串聯(lián)取向的多肽可以具有直接或反向的取向，和/或可以被其他氨基酸序列分開。本文所用的“阿必魯肽”或“ALB”是指由連續(xù)與重組人血清白蛋白基因融合的修飾的人胰高血糖素樣肽1的30個(gè)氨基酸序列(GLP-1，片段7-36(A8G))的2個(gè)拷貝組成的重組融合蛋白。阿必魯肽的氨基酸序列為如下所示的SEQIDNO:1。如本文所用，“減少”或“降低”血液或血漿葡萄糖是指在施用降血糖藥之后在患者的血液或血漿中觀察到的血糖量的減少。血液或血漿葡萄糖的降低可以根據(jù)每個(gè)個(gè)體測(cè)量和評(píng)估，或作為一組受試者的平均變化。另外，可以測(cè)量和評(píng)估一組被治療的受試者的血液或血漿葡萄糖的平均降低，其為相對(duì)于基線的平均變化和/或作為與被施用安慰劑的受試者中的血液或血漿葡萄糖的平均變化相比的平均變化。如本文所用，“增強(qiáng)GLP-1活性”是指增加了與天然存在的GLP-1相關(guān)的任何和所有活性。作為實(shí)例，可以在向受試者施用至少一種具有GLP-1活性的多肽之后測(cè)量增強(qiáng)的GLP-1活性，并且將其與施用該具有GLP-1的多肽之前的相同受試者中的GLP-1活性進(jìn)行比較，或與被施用安慰劑的第二受試者進(jìn)行比較。本文使用的“與升高的血糖相關(guān)的疾病”包括但不限于1型和2型糖尿病、葡萄糖不耐受和高血糖癥。本文所用的“共同施用”或“共施用”是指向同一患者施用兩種或更多種化合物或相同化合物的兩種或更多種劑量。這些化合物的共同施用可以是同時(shí)或在大約相同的時(shí)間(例如，在一小時(shí)內(nèi))，或者可以彼此在數(shù)小時(shí)或數(shù)天內(nèi)。例如，第一化合物可每周施用一次，而第二化合物被每天共施用。如本文所用，“最大血漿濃度”或“Cmax”是指在將物質(zhì)(例如，具有GLP-1活性的多肽或GLP-1激動(dòng)劑)施用于哺乳動(dòng)物后，在哺乳動(dòng)物血漿中該物質(zhì)的最高觀察濃度。如本文所使用的，“曲線下面積”或“AUC”是物質(zhì)在血漿中的濃度相對(duì)于時(shí)間作圖的曲線下面積。AUC可以是在一時(shí)間間隔內(nèi)，瞬時(shí)濃度的積分的測(cè)量值，并且具有質(zhì)量×?xí)r間/體積的單位，其也可以表示為摩爾濃度×?xí)r間，例如nM×天。AUC通常通過(guò)梯形法計(jì)算(例如，線性、線性-對(duì)數(shù))。AUC通常針對(duì)零到無(wú)窮大的時(shí)間間隔給出，并且指示其他時(shí)間間隔(例如AUC(t1，t2)，其中t1和t2是時(shí)間間隔的開始和結(jié)束時(shí)間)。因此，如本文所用，“AUC024h”是指在24小時(shí)期間的AUC，“AUC04h”是指4小時(shí)期間的AUC。如本文所使用的，“加權(quán)平均AUC”是AUC除以計(jì)算AUC的時(shí)間間隔。例如，加權(quán)平均AUC024h將代表AUC0-24小時(shí)除以24小時(shí)。如本文所使用的，“置信區(qū)間”或“CI”是測(cè)量或試驗(yàn)所落入的對(duì)應(yīng)于給定概率p的區(qū)間，其中p指90％或95％CI，并且圍繞算術(shù)平均值、幾何平均值、或最小二乘法平均值計(jì)算。如本文所使用，幾何平均值是通過(guò)求冪反向轉(zhuǎn)換的自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換值的平均值，并且最小二乘均值也可以是或可以不是幾何平均值，但是是使用固定效果從方差分析(ANOVA)模型得出的。如本文所使用的，“變異系數(shù)(CV)”是離散的量度，并且其被定義為標(biāo)準(zhǔn)偏差與平均值的比。通過(guò)將上述計(jì)算乘以100(％CV)以百分比(％)報(bào)告變異系數(shù)。如本文所用，“劑量”是指可以施用于哺乳動(dòng)物(包括人)的治療化合物的任何量。有效劑量是化合物的劑量，其為足以誘導(dǎo)治療性化合物的至少一種預(yù)期作用的量。例如，當(dāng)施用于人時(shí)，GLP-1激動(dòng)劑的有效劑量將在人中誘導(dǎo)至少一種類型的GLP-1活性，例如但不限于增加所述人的胰島素產(chǎn)生。如本領(lǐng)域所理解的，治療性化合物的有效劑量可以通過(guò)替代終點(diǎn)測(cè)量。因此，作為另一個(gè)實(shí)例，GLP-1激動(dòng)劑的有效劑量可以通過(guò)其降低人類血清葡萄糖的能力來(lái)測(cè)量。如本文所用，“緩沖試劑”或“緩沖劑”及其語(yǔ)法變體是指可以起到維持液體組合物的pH的溶液的任何組分。合適地，緩沖試劑或緩沖劑可以是任何藥學(xué)上可接受的注射用緩沖劑。緩沖劑的實(shí)例包括但不限于，檸檬酸鹽緩沖劑(例如檸檬酸一鈉-檸檬酸二鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸一鈉混合物等)、琥珀酸鹽緩沖劑(例如琥珀酸-琥珀酸一鈉混合物、琥珀酸-氫氧化鈉混合物、琥珀酸-琥珀酸二鈉混合物等)、酒石酸鹽緩沖劑(例如酒石酸-酒石酸鈉混合物、酒石酸-酒石酸鉀混合物、酒石酸-氫氧化鈉混合物等)、富馬酸鹽緩沖劑(例如富馬酸-富馬酸一鈉混合物、富馬酸-富馬酸二鈉混合物、富馬酸一鈉-富馬酸二鈉混合物等)、葡萄糖酸鹽緩沖劑(例如葡萄糖酸-葡萄糖酸鈉混合物、葡萄糖酸-氫氧化鈉混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸鉀混合物等)、草酸鹽緩沖劑(例如草酸-草酸鈉混合物、草酸-氫氧化鈉混合物、草酸-草酸鉀混合物等)、乳酸鹽緩沖劑(例如乳酸-乳酸鈉混合物、乳酸-氫氧化鈉混合物、乳酸-乳酸鉀混合物等)、磷酸鹽緩沖劑(磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉)和乙酸鹽緩沖劑(例如乙酸-乙酸鈉混合物、乙酸-鈉氫氧化物混合物等)。另外，組氨酸或組氨酸HCl和甘油可用作緩沖劑。適當(dāng)?shù)兀彌_液將使液體組合物的pH保持在約5.7至約6.2、或約5.8至約6.1、或約5.9至約6.0的所需范圍內(nèi)。合適地，緩沖液將本發(fā)明的含水液體組合物的pH保持為約5.9。需要調(diào)節(jié)緩沖劑的濃度以維持本發(fā)明的液體組合物的pH。適當(dāng)?shù)?，緩沖劑選自磷酸鈉、檸檬酸鈉、琥珀酸鈉、碳酸鈉和乙酸鈉。如本文所用，“糖”是指藥學(xué)上可接受用于注射的穩(wěn)定糖。合適地，二糖包括蔗糖、乳果糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、棉子糖或纖維二糖、和/或其混合物。其它考慮的二糖包括曲二糖、黑曲霉糖、異麥芽糖、ββ-海藻糖、αβ-海藻糖、槐糖、昆布二糖、龍膽二糖、松二糖、麥芽酮糖、帕拉金糖(palatinose)、gentiobiulose、甘露二糖、蜜二糖、車前二糖、蘆丁糖、rutinulose和木二糖。糖包括但不限于二糖、單糖或多糖。術(shù)語(yǔ)“糖”可以用于指所有糖。二糖可以是例如蔗糖或海藻糖，或其混合物。合適地，糖或蔗糖也可以用作本發(fā)明的液體組合物中的穩(wěn)定劑。在本發(fā)明的一些方面，海藻糖是海藻糖二水合物。在其它方面，海藻糖是海藻糖一水合物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“多元醇”是指任何糖醇。多元醇的實(shí)例包括但不限于甘露醇、麥芽糖醇、山梨醇、木糖醇、赤蘚糖醇和異麥芽酮糖醇。糖醇可以在溫和的還原條件下由它們的類似物糖形成。合適地，多元醇也可以用作本發(fā)明的液體組合物中的穩(wěn)定劑。術(shù)語(yǔ)“賦形劑”是指在加工和/或儲(chǔ)存期間，為了改變堆積性質(zhì)、改善穩(wěn)定性和/或調(diào)整滲透壓濃度，而向液體組合物中添加的任何化合物。術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定試劑”或“穩(wěn)定劑”是指改善或增強(qiáng)活性成分(例如但不限于阿必魯肽)的穩(wěn)定性的賦形劑。本文所用的“穩(wěn)定試劑”或“穩(wěn)定劑”是指能夠防止GLP-1多肽(例如阿必魯肽)在本發(fā)明的液體組合物中的聚集的任何試劑，穩(wěn)定劑包括但不限于精氨酸鹽酸鹽和組氨酸鹽酸鹽。合適地，辛酸納可作為穩(wěn)定劑。術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定劑”旨在包括能夠在包含該多肽的組合物的儲(chǔ)存或生產(chǎn)期間穩(wěn)定多肽的物質(zhì)或該物質(zhì)的混合物。另外，以下物質(zhì)可以用作穩(wěn)定劑：一般意義上的糖和蔗糖，一般意義上的多元醇、海藻糖、甘露醇、辛酸鈉、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽和表面活性劑，包括但不限于聚山梨醇酯80。例如，精氨酸和海藻糖均可在相同的液體組合物中用作穩(wěn)定劑(也稱為協(xié)調(diào)穩(wěn)定劑)。術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定性”或“穩(wěn)定的”及其語(yǔ)法變體是指阿必魯肽或其變體的至少一種GLP-1活性相對(duì)時(shí)間的恒定性。術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定化”旨在包括在組合物的儲(chǔ)存或生產(chǎn)期間使多肽的聚集物(不溶性和/或可溶性)的形成和/或化學(xué)降解和/或蛋白質(zhì)解折疊最小化，從而基本保持生物活性并維持多肽穩(wěn)定性。術(shù)語(yǔ)GLP-1多肽的“物理穩(wěn)定性”涉及形成不溶性和/或可溶性聚集物，其為GLP-1多肽的二聚體、寡聚體形式和聚合形式以及該分子的任何結(jié)構(gòu)變形和變性的形式。術(shù)語(yǔ)“化學(xué)穩(wěn)定性”旨在涉及在加速條件下，以溶解或固體狀態(tài)儲(chǔ)存時(shí)，GLP-1多肽中任何化學(xué)變化的形成。其實(shí)例為水解、脫酰胺和氧化。特別地，含硫氨基酸易于被氧化，形成相應(yīng)的亞砜。術(shù)語(yǔ)“化學(xué)穩(wěn)定性”還包括對(duì)多肽主鏈的化學(xué)降解的抗性，例如通過(guò)蛋白水解。用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的賦形劑通常描述于以下中：Manning等人，"Stabilityofproteinpharmaceuticals,"PharmaceuticalResearch,6:903-918(1989)；Wang等人，"ReviewofexcipientsandpH'sforparenteralproductsusedintheUnitedStates,"JournalofParenteralDrugAssociation,34:452-462(1980)；Wang等人，"Parenteralformulationsofproteinsandpeptides:stabilityandstabilizers,"JournalofParenteralScience&Technology,42:S4-S26(1988)；Cleland等人，"TheDevelopmentofStableProteinFormulations:ACloseLookatProteinAggregation,Deamidation,andOxidation",CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,vol.10(4),pp.307-377(1993)。如本文所用，“表面活性劑”是指降低液體組合物的表面張力的任何組分。表面活性劑可以是離子型或非離子型的。用于注射的合適的表面活性劑包括但不限于，聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20和PluronicF68。合適地，表面活性劑也可以用作本發(fā)明的液體組合物中的穩(wěn)定劑。本發(fā)明提供了液體組合物，其包含阿必魯肽、緩沖劑、至少一種糖和/或至少一種多元醇、至少一種穩(wěn)定劑和任選的表面活性劑，其中所述阿必魯肽在所述液體組合物中保持穩(wěn)定。在一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖劑包括本發(fā)明的任何液體組合物中的檸檬酸鈉。在一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖劑由檸檬酸鈉組成。檸檬酸鈉適宜地在本發(fā)明的任何液體組合物中的濃度為約5mM至約15mM檸檬酸鹽。在本發(fā)明的任何液體組合物中，檸檬酸鈉為濃度約10mM的檸檬酸鹽。在一個(gè)方面，如果檸檬酸鹽濃度高于10mM，則液體組合物的pH在約5.5至約5.7之間。在另一方面，在本發(fā)明的任何液體組合物中，如果檸檬酸鹽濃度為10mM檸檬酸鹽，則pH為約5.9。在一個(gè)方面，緩沖劑包含本發(fā)明的任何液體組合物中的琥珀酸鹽檸檬酸鹽。在一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖劑由琥珀酸鹽組成。在本發(fā)明的任何液體組合物中，琥珀酸鹽的濃度可以為約5mM至約10mM。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的液體組合物包含糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，糖包括海藻糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，糖由海藻糖組成。在本發(fā)明的任何液體組合物中，海藻糖的濃度可以為約72mM至約207mM。在一些方面，海藻糖可以是約75mM、80mM、85mM、90mM、95mM、100mM、105mM、110mM、115mM、120mM或125mM的濃度。合適地，海藻糖在液體組合物中的濃度范圍可以為約100mM至約140mM或約100mM至約120mM。在一個(gè)方面，所述液體組合物中海藻糖的濃度為約117mM。在一個(gè)實(shí)施方案中，液體組合物包含糖類但不包含多元醇。在一個(gè)實(shí)施方案中，液體組合物包含多元醇并且不包含糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，液體組合物包含糖和多元醇。在一個(gè)實(shí)施方案中，穩(wěn)定劑包括在本發(fā)明的任何液體組合物中的精氨酸。在一個(gè)方面，穩(wěn)定劑是精氨酸。適當(dāng)?shù)?，精氨酸在任何本發(fā)明的液體組合物濃度為約50mM至約125mM。在一個(gè)方面中，精氨酸的濃度可以是約45mM、50mM、55mM、60mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM、100mM、105mM、110mM、115mM、120mM、125mM或130mM。適當(dāng)?shù)?，精氨酸在液態(tài)組合物中濃度范圍可以是約90mM至約110mM。合適地，精氨酸在液體組合物中的濃度范圍可以為約80mM至120mM。在本發(fā)明的任何液體組合物中，精氨酸的濃度可以為約100mM。在另一方面，穩(wěn)定劑包括組氨酸。在一個(gè)方面，組氨酸在本發(fā)明的任何液體組合物中的濃度為約50mM至約125mM。合適地，組氨酸在液體組合物中的濃度可以在約90mM至約110mM的范圍內(nèi)。合適地，在本發(fā)明的任何液體組合物中組氨酸濃度可以在約80mM至120mM的范圍內(nèi)。在一個(gè)方面，組氨酸在本發(fā)明的任何液體組合物中的濃度為約100mM。在一個(gè)實(shí)施方案中，液體組合物包含表面活性劑。表面活性劑是聚山梨醇酯80。聚山梨醇酯80在本發(fā)明的任何液體組合物中為約0.005％w/w至約0.02％w/w。聚山梨醇酯80在本發(fā)明的任何液體組合物中的濃度為0.01％w/w。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的液體組合物還包含蛋氨酸和/或EDTA。合適地，本發(fā)明的液體組合物包含注射用水。在一個(gè)實(shí)施方案中，液體組合物包含多元醇。在一個(gè)實(shí)施方案中，多元醇包括甘露醇。在一個(gè)實(shí)施方案中，多元醇由甘露醇組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，液體組合物包含多元醇但不包含糖。適宜地，阿必魯肽以約30mg/mL至約100mg/mL的濃度存在于本發(fā)明的任何液體組合物中。阿必魯肽以約60mg/mL的濃度存在于本發(fā)明的任何液體組合物中。阿必魯肽以約50mg/mL的濃度存在于本發(fā)明的任何液體組合物中。適宜地，阿必魯肽可為約30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、55mg/mL、60mg/mL或65mg/mL。適宜地，阿必魯肽可以約40mg/mL至約80mg/mL或約50mg/mL至約70mg/mL存在。在某些方面，在純化后和配制之前對(duì)阿必魯肽進(jìn)行熱處理。在一個(gè)方面，本發(fā)明的液體組合物具有在約5.0和6.5之間的pH。合適地，液體組合物的pH可以在約5.5至約6.2的范圍內(nèi)。適當(dāng)?shù)?，液體組合物的pH為約5.5至約5.9。在一個(gè)方面，pH為約5.5至約5.7。在一個(gè)方面，液體組合物具有約5.9的pH。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的液體組合物中，至少≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、適宜地≥98％、適宜地≥99％、適宜地為100％的阿必魯肽在本發(fā)明的任何液體組合物保持為單體。阿必魯肽作為單體的穩(wěn)定性可以通過(guò)本領(lǐng)域各種已知的技術(shù)測(cè)量，并且在本文提供的實(shí)施例中描述。如本文所述，當(dāng)在室溫下儲(chǔ)存時(shí)，阿必魯肽在本發(fā)明的液體組合物中在長(zhǎng)達(dá)一周的時(shí)間內(nèi)保持為單體，并且當(dāng)在約2℃至約8℃下避光儲(chǔ)存時(shí)，在長(zhǎng)達(dá)12個(gè)月、18個(gè)月和24個(gè)月的時(shí)間內(nèi)保持為單體。在另一方面，所述液體組合物中的阿必魯肽具有至少一種GLP-1活性，并且將所述至少一種GLP-1活性維持為至少90％效力至少12個(gè)月。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的液體制劑避光保護(hù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了液體組合物，其包含多肽、至少一種緩沖劑、至少一種糖和/或至少一種多元醇、至少一種穩(wěn)定化試劑和任選的至少一種表面活性劑，所述多肽與SEQIDNO:1所示的多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或與在C端和/或N端截短的SEQIDNO:1中所示的多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，其中所述多肽在所述液體組合物中保持穩(wěn)定。在一個(gè)方面，與SEQIDNO:1相比，或與在整個(gè)序列上與SEQIDNO:1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽相比，所述多肽在N-末端截短了1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸。在一個(gè)方面，與SEQIDNO:1相比，或與在整個(gè)序列上與SEQIDNO:1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽相比，多肽在C-末端被截短了1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸。在一個(gè)方面，所述多肽與SEQIDNO:1所示的多肽具有100％的序列同一性。在一個(gè)方面，液體組合物包含表面活性劑。在一個(gè)方面，液體組合物包含檸檬酸鈉、海藻糖、精氨酸、聚山梨醇酯80和水，其中所述組合物的pH為約5.9。在一個(gè)方面，所述多肽在所述液體組合物中的濃度為約30mg/mL至約100mg/mL，合適地，所述多肽的濃度為約60mg/mL，合適地，所述多肽的濃度為約50mg/mL。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含約30mg/mL至約100mg/mL的多肽、約110mM至約140mM海藻糖、90mM至約110mM精氨酸、5mM至約15mM檸檬酸鈉和0.01％w/w聚山梨醇酯80，所述多肽與SEQIDNO:1中所示的多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％or100％的序列同一性，或與在C端和/或N端截短的SEQIDNO:1中所示的多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，其中所述組合物具有約5.5至約6.0的pH。在一個(gè)實(shí)施方案中，液體組合物包含約50mg/mL的具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，液體組合物由50mg/mL具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的多肽、117mM海藻糖、100mM精氨酸、10mM檸檬酸鈉、0.01％w/w聚山梨醇酯80和注射用水，其中所述組合物的pH為約5.9。本發(fā)明還提供液體組合物，其中所述液體組合物包含與SEQIDNO:1具有至少90％序列同一性的多肽，并且其中所述多肽具有至少一種GLP-1活性并在所述液體組合物中維持所述GLP-1活性至少一周。在一個(gè)方面，至少96％的所述多肽在本發(fā)明的任何液體組合物中保持為單體至少一周。在一個(gè)方面，所述多肽在任何本發(fā)明的液體組合物中維持至少一種GLP-1活性在至少90％效力，保持至少12個(gè)月。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)本發(fā)明的任何液體組合物維持在約2℃至約8℃避光條件下時(shí)，多肽在所述組合物中保持穩(wěn)定至少12個(gè)月。本發(fā)明還提供了包含GLP-1激動(dòng)劑的液體組合物，其中所述GLP-1激動(dòng)劑保持穩(wěn)定并且在本發(fā)明的任何液體組合物中具有至少一種GLP-1活性至少一年。液體組合物還可包含檸檬酸鈉、海藻糖、精氨酸、聚山梨醇酯80和水。還提供了液體組合物，其包含約30mg/mL至約100mg/mL的多肽、117mM海藻糖、100mM精氨酸、10mM檸檬酸鈉和0.01％w/w聚山梨醇酯80，其中所述多肽具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列，其中所述組合物的pH為約5.9。合適地，所述液體組合物包含約60mg/mL的多肽，所述多肽具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。合適地，本發(fā)明的液體組合物包含約50mg/mL的多肽，所述多肽具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了由50mg/mL的多肽、117mM海藻糖、100mM精氨酸、10mM檸檬酸鈉、0.01％w/w聚山梨醇酯80和注射用水組成的液體組合物，所述多肽具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列，其中所述組合物的pH為約5.9。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種液體組合物，其由50-70mg/mL的多肽、100-140mM海藻糖、90-110mM精氨酸、9-11mM檸檬酸鈉、0.01％w/w的聚山梨醇酯80和注射用水，所述多肽具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列，其中所述組合物的pH為約5.5至約6.0。在一個(gè)實(shí)施方案中，液體組合物包含糖但不包含多元醇。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，液體組合物的糖被多元醇代替。合適的實(shí)例包括但不限于甘露醇、麥芽糖醇、山梨醇、木糖醇、赤蘚糖醇和異麥芽酮糖醇。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述液體組合物包含甘露醇。在某些實(shí)施方案中，提供了用于治療人的代謝紊亂的方法，包括向人施用本發(fā)明的液體組合物。代謝紊亂是2型糖尿病(T2DM)。在一些方面，液體組合物經(jīng)由筆式注射裝置被皮下施用于人。在一個(gè)實(shí)施方案中，液體組合物被包含在預(yù)填充注射器中，液體組合物可使用自動(dòng)注射器裝置施用。在一些方面，自動(dòng)注射器裝置具有28、29、30或更大的規(guī)格，表明其具有更小的針孔。在另一個(gè)實(shí)施例中，該裝置是自動(dòng)注射器。在一個(gè)方面，該裝置具有29號(hào)(G)針。在一個(gè)方面，液體組合物用于在有此需要的人中提供血糖控制。適當(dāng)?shù)?，提供了用于在患有T2DM的人中提供血糖控制的方法，包括向所述人施用任一種本發(fā)明的液體組合物。本發(fā)明還提供液體組合物，其用于治療代謝紊亂，例如與升高的血糖相關(guān)的疾病，包括但不限于1型和2型糖尿病、葡萄糖不耐受和高血糖癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的液體組合物，其用于制備用于治療代謝紊亂的藥物，例如與升高的血糖相關(guān)的疾病，包括1型和2型糖尿病、葡萄糖耐受不良和高血糖癥。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括可以是但不限于GLP-1或其片段、變體和/或綴合物的多肽。本發(fā)明的GLP-1片段和/或變體和/或綴合物通常具有至少一種GLP-1活性。GLP-1或其片段、變體和/或綴合物可以包含人血清白蛋白。人血清白蛋白可以與GLP-1或其片段和/或變體綴合。人血清白蛋白可以在注射前通過(guò)化學(xué)連接物與腸降血糖素激素(例如GLP-1)及其變體綴合，或者可以在體內(nèi)與天然存在的人血清白蛋白化學(xué)連接(參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)6,593,295和美國(guó)專利號(hào)6,329,336，其整體并入本文以用于參考)。或者，人血清白蛋白可以與GLP-1和/或其片段和/或變體、或其它GLP-1激動(dòng)劑(如毒蜥外泌肽-3或毒蜥外泌肽-4)和/或其片段和/或變體基因融合。與人血清白蛋白融合的GLP-1及其片段和/或其變體的實(shí)例提供在以下中：WO2003/060071、WO2003/59934、WO2005/003296、WO2005/077042和美國(guó)專利號(hào)7,141,547(其整體并入以用于參考)。具有GLP-1活性的多肽可以包含人GLP-1的至少一個(gè)片段和/或變體。人GLP-1的兩個(gè)天然存在的片段在SEQIDNO:2中表示。其中：37位的Xaa為Gly(以下稱為“GLP-1(7-37)”)或-NH2(以下稱為“GLP-1(7-36)。GLP-1片段可以包括但不限于包含人GLP-1的氨基酸7至36(GLP-1(7-36))或者由人GLP-1的氨基酸7至36(GLP-1(7-36))組成的GLP-1分子。GLP-1或其片段的變體可以包括但不限于，在野生型GLP-1中，或在SEQIDNO:2中所示的天然存在的GLP-1片段中，一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或更多的氨基酸取代。變體GLP-1或GLP-1的片段可以包括但不限于類似于野生型GLP-1的丙氨酸8的丙氨酸殘基的取代，所述丙氨酸被突變?yōu)楦拾彼?下文稱為“A8G”)(參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)5,545,618中公開的突變體，其全部?jī)?nèi)容并入本文以用于參考)。在一些方面，GLP-1的至少一個(gè)片段和變體包含GLP-1(7-36(A8G))，并且與人血清白蛋白基因融合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽包含一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或更多個(gè)串聯(lián)取向的GLP-1分子和/或其片段和/或變體，其融合到人血清白蛋白或其變體的N-或C-末端。其它實(shí)施方案具有與白蛋白或其變體的N或C末端融合的這樣的A8G多肽。與人血清白蛋白的N末端融合的兩個(gè)串聯(lián)取向的GLP-1(7-36)(A8G)片段和/或變體的實(shí)例包括SEQIDNO:1，如圖1所示。在另一方面，GLP-1的至少一個(gè)片段和變體包含與人血清白蛋白串聯(lián)且基因融合的至少兩個(gè)GLP-1(7-36(A8G))。至少兩個(gè)GLP-1(7-36(A8G))可以在人血清白蛋白的N末端基因融合。至少一種具有GLP-1活性的多肽可以包含SEQIDNO:1。GLP-1(7-37)的變體可以表示為例如Glu22-GLP-1(7-37)OH，其表示這樣的GLP-1變體，其中通常在GLP-1(7-37)37)OH的22位處發(fā)現(xiàn)的甘氨酸被谷氨酸替代；Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH表示GLP-1化合物，其中通常在GLP-1(7-37)OH的8位上發(fā)現(xiàn)的丙氨酸和通常在22位上發(fā)現(xiàn)的甘氨酸分別被纈氨酸和谷氨酸替代。GLP-1的變體的實(shí)例包括但不限于，GLP-1的變體還可以包括但不限于GLP-1或GLP-1片段，其中一個(gè)或多個(gè)其氨基酸側(cè)基具有化學(xué)修飾?；瘜W(xué)修飾包括但不限于：添加化學(xué)部分、產(chǎn)生新的鍵和去除化學(xué)部分。氨基酸側(cè)基的修飾包括但不限于：賴氨酸-ε-氨基的?；痪彼?、組氨酸或賴氨酸的N-烷基化；谷氨酸或天冬氨酸羧酸基團(tuán)的烷基化；以及谷氨酰胺或天冬酰胺的脫酰胺。末端氨基的修飾包括但不限于：去氨基、N-低級(jí)烷基、N-二-低級(jí)烷基和N-?；揎?。末端羧基的修飾包括但不限于酰胺、低級(jí)烷基酰胺、二烷基酰胺和低級(jí)烷基酯修飾。此外，一個(gè)或多個(gè)側(cè)基或末端基團(tuán)可以被具有普通技術(shù)的蛋白質(zhì)化學(xué)家所已知的保護(hù)基團(tuán)保護(hù)。GLP-1片段或變體還可以包括這樣的多肽，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被添加到所述片段或變體的GLP-1(7-37)OH的N-末端和/或C-末端。GLP-1中的氨基酸(其中已向N末端或C末端添加了氨基酸)由與GLP-1(7-37)OH中的相應(yīng)氨基酸相同的數(shù)字表示。例如，通過(guò)在GLP-1(7-37)OH的N末端添加2個(gè)氨基酸而得到的GLP-1化合物中，N末端氨基酸在5位，并且通過(guò)向GLP-1(7-37)OH的C末端添加一個(gè)氨基酸而獲得的GLP-1化合物中，C末端氨基酸在38位。因此，在這兩種GLP-1化合物中，12位被苯丙氨酸占據(jù)，22位被甘氨酸占據(jù)，如在GLP-1(7-37)OH中的那樣。具有添加到N-末端的氨基酸的GLP-1的氨基酸1-6可以與GLP-1(1-37)OH的相應(yīng)位置處的氨基酸相同，或者是其保守取代。具有添加到C-末端的氨基酸的GLP-1的氨基酸38-45可以與胰高血糖素或毒蜥外泌肽-4的相應(yīng)位置處的氨基酸相同，或者是其保守取代。阿必魯肽使用用于重構(gòu)和注射的雙筒裝置以凍干形式商業(yè)提供。本發(fā)明提供了在液體形式中穩(wěn)定的阿必魯肽液體制劑。下表比較了凍干形式與穩(wěn)定的液體制劑。實(shí)施例以下實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明的各種非限制性方面。對(duì)于下列實(shí)施例，除非另有說(shuō)明，否則阿必魯肽(ALB)可以稱為SEQIDNO:1和/或阿必魯肽。實(shí)施例1在本文的實(shí)施例1中給出四個(gè)研究(研究1.0；研究1.1；研究1.2；和研究1.3)的結(jié)果。在每個(gè)研究中呈現(xiàn)的制劑由制劑編號(hào)指定。相同的制劑編號(hào)可用于多于一個(gè)研究中，但不總是代表相同的制劑。表示每個(gè)研究結(jié)果的表包括表標(biāo)題中的研究編號(hào)。在包括60種獨(dú)特制劑的四個(gè)研究中，在各種溫度下評(píng)價(jià)阿必魯肽(ALB)的穩(wěn)定性。檢查了緩沖液、多元醇、糖、聚山梨醇酯80和辛酸鈉對(duì)阿必魯肽穩(wěn)定性的影響。此外，改變pH和蛋白質(zhì)濃度。發(fā)現(xiàn)含有檸檬酸鹽、精氨酸、海藻糖和聚山梨醇酯80的制劑賦予阿必魯肽在水溶液中足夠的穩(wěn)定性，從而證明進(jìn)一步開發(fā)是合理的。相關(guān)目標(biāo)規(guī)格為，在2-8℃下儲(chǔ)存18個(gè)月后，通過(guò)SEC測(cè)量的單體>96％。其他可接受的相關(guān)目標(biāo)規(guī)格包括但不限于，18個(gè)月后通過(guò)SEC測(cè)量的單體100％，≥99％，≥98％，≥97％，≥96％，≥95％，≥94％，≥93％，≥92％，≥91％，≥90％。另外，其它可接受的目標(biāo)規(guī)格包括在12個(gè)月后通過(guò)SEC測(cè)量的相同單體百分比。材料和方法材料本研究中使用的化學(xué)品總結(jié)在表1中。本項(xiàng)目中使用的材料和設(shè)備分別總結(jié)在表2和表3中。表1.研究1中使用的化學(xué)品化學(xué)品供應(yīng)商純度檸檬酸鈉二水合物MallinckrodtUSP精氨酸鹽酸鹽SpectrumUSP海藻糖二水合物Spectrum未知聚山梨醇酯80SpectrumNF辛酸鈉AlfaAesar96％磷酸二氫鈉一水合物FisherACS海藻糖二水合物Spectrum未知甘露醇BDHUSP組氨酸SpectrumUSP琥珀酸鈉Spectrum未知表2研究1中使用的材料表3.研究中使用的裝置和設(shè)備制造商裝置模型DenverInstrumentpH計(jì)Model250CaryUV-VIS光度計(jì)Bio100DionexHPLCUltimate3000DionexHPLCUltimate3000DionexHPLCUltimate3000Eppendorf離心機(jī)MiniSpinPlusBioRad電源PowerPac300Binder烘箱BinderBinder烘箱BinderSartorius天平CPA124SVWR加熱模塊12621-104Labnet振蕩器OrbitP4HPCE3D-CE方法以下部分描述了進(jìn)行這些研究時(shí)使用的方法和技術(shù)。樣品制備制備在適當(dāng)pH下的制劑緩沖液，其為兩份用于滲析的1L儲(chǔ)備體積。對(duì)于每種制劑，將等于所需質(zhì)量的130％的儲(chǔ)備體積置于Slide-A-Lyzer盒(10kDa截留值)中。將樣品在2-8℃下在緩沖液(2×1L)中過(guò)夜?jié)B析兩次。接下來(lái)，取出樣品，通過(guò)A280測(cè)定濃度。用滲析緩沖液將樣品稀釋至適當(dāng)濃度，并將任何其它賦形劑(聚山梨酸酯、二糖、氨基酸、辛酸酯等)作為固體加入溶液中。然后通過(guò)A280測(cè)量最終濃度。將樣品在生物安全柜中無(wú)菌過(guò)濾，并置于標(biāo)記的高壓滅菌小瓶中并塞緊。然后將小瓶置于指定溫度下的穩(wěn)定室中。UV光譜除非另有說(shuō)明，本實(shí)施例的所有UV光譜使用VarianCary100Bio光譜儀進(jìn)行。對(duì)所有讀數(shù)使用校準(zhǔn)的0.1mm試池(0.0096cm)。分析之前，在280nm將儀器相對(duì)于緩沖液調(diào)零。用緩沖液、水和乙醇沖洗可拆卸的池，然后干燥，之后分析每個(gè)樣品。使用指定濃度的阿必魯肽確定消光系數(shù)為0.755mL/mgcm。尺寸排阻色譜(SEC)方法.簡(jiǎn)而言之，將TosohTSKGelG3000SWx17.8mm×30cm柱用于所有分離。流動(dòng)相由pH7.5的15mM磷酸鈉組成。使用1mL/min的流速，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為214nm。將樣品在水中稀釋至1.7mg/mL，每次分離注入5μL溶液(8.5μg)。每次運(yùn)行20分鐘，并且在該時(shí)間量?jī)?nèi)分離所有樣品組分。分析后，將柱用去離子水沖洗并儲(chǔ)存在20％甲醇中。反相色譜(RPHPLC)方法.所有分離使用AcquityUPLCBEH300C41.7μm2.1×150mm柱進(jìn)行。將柱保持在25℃，并且對(duì)于每次運(yùn)行，從被稀釋至1mg/mL的樣品將2μg蛋白質(zhì)注入柱中(20μL注射)。使用0.1mL/min的恒定流速。溶劑A由含0.15％TFA的去離子水組成，溶劑B由含0.15％TFA的乙腈溶液組成。在214nm進(jìn)行檢測(cè)。積分前從樣品色譜圖中減去緩沖液色譜圖。梯度時(shí)間表如下：毛細(xì)管等電聚焦(cIEF)方法.毛細(xì)管等電聚焦使用BeckmanCoulter出版的PA800plus應(yīng)用指南和作為內(nèi)部指導(dǎo)的文件“cIEF.PDF”的教導(dǎo)進(jìn)行。制備樣品以包含以下組分：100μL的10M尿素50mMDTT6μLPharmalytepH5-86uL500mM精氨酸0.5μLpI5.12標(biāo)記物(ProteinSimple)0.5μLpI6.60標(biāo)記物(AmericanPeptide,5mg/mL)0.5μL100mg/mL阿必魯肽樣品(或相同質(zhì)量)中性涂覆的毛細(xì)血管如Gao等人所述制備(Gao，L.；Liu，S.R.，Cross-linkedpolyacrylamidecoatingforcapillaryisoelectricfocusing.AnalChem2004,76(24)，7179-7186。)。將涂覆的毛細(xì)管切成32cm的長(zhǎng)度，并在22cm處產(chǎn)生用于檢測(cè)的窗口。在每次運(yùn)行前用4M尿素(3分鐘)和去離子水(2分鐘)沖洗毛細(xì)管。進(jìn)行樣品的全毛細(xì)管注射(在25psi下進(jìn)行100秒)。將樣品在25kV的恒定電壓(正常極性)下在入口處的陽(yáng)極電解質(zhì)(0.5％甲基纖維素中的100mM磷酸)和出口處的陰極電解質(zhì)(0.5％甲基纖維素中的100mM氫氧化鈉)之間聚焦15分鐘。在陽(yáng)極電解液和移動(dòng)劑溶液(350mM乙酸)之間在30kV的恒定電壓下進(jìn)行化學(xué)移動(dòng)40分鐘。在280nm進(jìn)行檢測(cè)。每次運(yùn)行結(jié)束時(shí)用去離子水沖洗2分鐘。研究1.3省略了cIEF。使用Chromeleon軟件分析數(shù)據(jù)。記錄樣品中所有積分峰的相對(duì)面積和第一峰值時(shí)刻。使用兩個(gè)cIEF標(biāo)記物的第一峰值時(shí)刻確定等電點(diǎn)。SDS-PAGE方法.如下所述，在研究1的不同階段采用不同版本的方法。研究1.0、1.1:使用0.5μL樣品、2.5μLNuPAGELDS樣品緩沖液和7μL水制備用于SDS-PAGE的樣品。將每個(gè)制備的樣品在70℃溫育10分鐘，然后進(jìn)行電泳。將NuPAGE12％Bis-Tris凝膠和NuPAGEMES緩沖液用于每種凝膠。將樣品加載到每個(gè)孔(10μL)中并在200V下分離40分鐘。然后用去離子水清洗凝膠并在去離子水中浸泡15分鐘。然后用SimplyBlueSafeStain(Invitrogen)覆蓋凝膠1小時(shí)，然后再次在去離子水中溫育至少2小時(shí)。研究1.2：如上所述，但是每個(gè)10μL樣品用0.25μg蛋白質(zhì)制備，而不管樣品蛋白質(zhì)濃度如何。每個(gè)凝膠孔僅裝入8μL材料。研究1.3：本研究未進(jìn)行SDS-PAGE。潛結(jié)構(gòu)投影(PLS)方法.已經(jīng)公開了對(duì)PLS建模的詳細(xì)描述[Stahle,L.；Wold,K.Multivariatedataanalysisandexperimentaldesigninbiomedicalresearch.Prog.Med.Chem.1988,25:291-338；WoldS.PLS-regression:abasictoolofchemometrics.Chemom.Intell.Lab.Syst.2001,58:109-130]。它是用于大型和復(fù)雜數(shù)據(jù)集的多變量分析的最常用的化學(xué)計(jì)量方法。對(duì)于任何大的數(shù)值矩陣(其中存在合理數(shù)量的樣本(一起形成所謂的X矩陣))，可以構(gòu)建數(shù)學(xué)模型，其解釋感興趣的因變量中的最大方差量(Y矩陣)。在X矩陣和終點(diǎn)(Y矩陣)之間的變化之間的關(guān)系的最佳單一描述被稱為第一主分量PC1。下一個(gè)重要的(就描述Y矩陣中的方差而言)被稱為第二主分量PC2，等等。通常，只需要一個(gè)或兩個(gè)PC來(lái)解釋Y矩陣中的大部分方差。這些PC中的每一個(gè)包含來(lái)自X矩陣中的每個(gè)變量的一些貢獻(xiàn)。如果X矩陣內(nèi)的變量對(duì)構(gòu)建給定PC貢獻(xiàn)很大，則它被評(píng)級(jí)為顯著的。事實(shí)上，對(duì)于給定模型，可以為X矩陣中的每個(gè)變量計(jì)算回歸系數(shù)，其中模型是一定數(shù)量的PC的復(fù)合，以便提供對(duì)Y矩陣的充分描述[Katz,M.H.MultivariateAnalysis:APracticeGuideforClinicians.CambridgeUniversityPress，NewYork，pp.158-162(1999)]?？傊琍LS從X矩陣獲取信息，計(jì)算所需的PC數(shù)量，并構(gòu)建合適的模型。PLS模型在適當(dāng)時(shí)可以包括交互術(shù)語(yǔ)以及二次項(xiàng)，其允許表征非線性效應(yīng)。包括所有樣品的模型被稱為校準(zhǔn)模型[WoldS.PLS-regression:abasictoolofchemometrics.Chemom.Intell.Lab.Syst.2001,58:109-130]?？偟臏y(cè)定系數(shù)(r2)表示模型的質(zhì)量。所有PLS計(jì)算使用軟件(CAMO，Corvallis，OR)進(jìn)行。用Y矩陣中的單個(gè)變量進(jìn)行的PLS分析稱為PLS1分析。構(gòu)建適合Y矩陣中多個(gè)變量的模型稱為PLS2分析。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)所有校準(zhǔn)模型進(jìn)行全交叉驗(yàn)證[Martens,H.；Martens,M.MultivariateAnalysisofQuality:AnIntroduction,WileyandSons,Chichester,UK(2001)]。簡(jiǎn)而言之，一次移除一個(gè)樣品，重新校準(zhǔn)數(shù)據(jù)集，并構(gòu)建新的模型。重復(fù)該過(guò)程，直到所有校準(zhǔn)樣品被一次移除并且被量化為驗(yàn)證模型。因此，包含所有樣本的第一集合被稱為校準(zhǔn)集合，并且交叉驗(yàn)證之后的集合被稱為驗(yàn)證集合。千斤頂算法[Martens,H.；Martens,M.MultivariateAnalysisofQuality:AnIntroduction,WileyandSons,Chichester,UK(2001)]被用于確定用于構(gòu)建上述PLS模型的任何因子的統(tǒng)計(jì)顯著性。結(jié)果與討論該項(xiàng)目進(jìn)行了四輪制劑篩選。來(lái)自每輪的結(jié)果用于優(yōu)化下一輪中的制劑。研究1.0.設(shè)計(jì)第一輪篩選以研究緩沖液物質(zhì)和pH。使用12種制劑，在pH值5.7-6.8之間檢查三種不同的緩沖液(檸檬酸鹽，磷酸鹽，組氨酸)。此外，含有10mM辛酸鈉的兩種制劑在GSK進(jìn)行的預(yù)配制工作中被鑒定為潛在的穩(wěn)定劑。本研究中的制劑之一含有甘露醇、海藻糖、精氨酸和聚山梨醇酯80。將玻璃小瓶中的樣品在40℃下儲(chǔ)存一周和兩周以用于本研究。所有樣品含有濃度為60mg/mL的阿必魯肽。表4研究1.0的制劑的組成制劑號(hào)pH檸檬酸鹽磷酸鹽組氨酸甘露醇海藻糖PS80辛酸鹽mMmMmMmMmM％mMF017.001001531170.010F025.710000000F035.701000000F045.700100000F056.301000000F066.300100000F075.310000000F085.300100000F095.7010000010F105.7100000010F116.801000000F126.800100000表5.研究1.0的視覺(jué)觀察最初，所有樣品都是澄清的，在制備時(shí)具有淺棕色。在指定的孵育時(shí)間，幾個(gè)樣品變得渾濁或完全凝膠化(表5)。沒(méi)有進(jìn)一步分析顯示出較差視覺(jué)外觀的樣品。表6.來(lái)自研究1.0的制劑的RPHPLC純度表7.來(lái)自研究1.0的制劑的通過(guò)SEC測(cè)量的單體含量通過(guò)RPHPLC測(cè)量的研究1.0樣品的純度顯示兩種制劑(F09和F10)比其他制劑好的多(表6)，如所述表格中所示。這些是兩種含有10mM辛酸鹽的制劑。還顯示，提高pH至～6.8降低穩(wěn)定性。通過(guò)SFC觀察到相似的趨勢(shì)，其中在儲(chǔ)存時(shí)，這兩種制劑的單體含量是最高的(表7)。除了對(duì)照制劑F01(參見(jiàn)凍干制劑和表4中的F01)，這些制劑僅含有緩沖劑并且在制劑F09和F10中除辛酸鹽外不含有其他穩(wěn)定劑。就沒(méi)有顯示差得視覺(jué)外觀的制劑而言，大多數(shù)是基于檸檬酸鹽。表8.通過(guò)RPHPLC測(cè)量的來(lái)自研究1.0的樣品在進(jìn)行冷凍-解凍循環(huán)后的純度這些制劑也進(jìn)行了重復(fù)的冷凍-解凍(F/T)循環(huán)。再次，使用RPHPLC(表8)和SEC(表9)測(cè)定穩(wěn)定性。在測(cè)定誤差內(nèi)，在冷凍-解凍循環(huán)時(shí)沒(méi)有純度損失。通過(guò)SEC(表9)，單體含量有輕微的表觀下降，但是這些值足夠小，使得它們不夠顯著。表9.來(lái)自研究1.0的樣品經(jīng)受冷凍-解凍循環(huán)后通過(guò)SEC測(cè)量的單體含量最后，使用SDS-PAGE評(píng)估研究1.0樣品。該測(cè)定可以在還原或非還原條件下進(jìn)行。為了監(jiān)測(cè)較高分子量(MW)帶，有意使凝膠過(guò)載(圖1和圖2)。還原凝膠(圖2)顯示在非還原凝膠中觀察到的最高M(jìn)W帶的損失(圖1)，這表明這是由于一些類型的二硫鍵交聯(lián)，其即使在t0時(shí)也存在。在40℃下兩周后，存在幾乎不能進(jìn)入非還原凝膠的非常高M(jìn)W的物質(zhì)(圖3)。通過(guò)加入還原劑有效地除去這種物質(zhì)。此外，在非還原凝膠中看到的聚集體的量存在一些差異，因此僅這些被用于隨后的研究。研究1.1.第二輪研究集中在略微不同的pH范圍和具體的緩沖液組成上，大多數(shù)情況下不存在其他穩(wěn)定劑(表10)。降低了pH范圍，從5.3至6.0，因?yàn)橹暗墓ぷ鞅砻?，較低的pH有利于穩(wěn)定性。將在研究1.0中導(dǎo)致差的溶解穩(wěn)定性(凝膠化、混濁)的組氨酸排除在外不做進(jìn)一步研究。在該pH范圍內(nèi)，羧酸鹽緩沖劑如檸檬酸鹽表現(xiàn)良好。由于檸檬酸鹽賦予一定的穩(wěn)定性，因此琥珀酸鹽由于其結(jié)構(gòu)相似性也被引入作為緩沖劑來(lái)評(píng)價(jià)。海藻糖、甘露醇和辛酸鈉各自作為穩(wěn)定劑加以研究。如研究1.0中所示，第一制劑為凍干的對(duì)照制劑(參見(jiàn)表4的F01)。此外，制劑F13和F14分別包括甘露醇和海藻糖，從而確定它們各自的貢獻(xiàn)是什么。在40℃1周和在25℃2周后評(píng)價(jià)樣品。表10.研究1.1制劑的組成制劑號(hào)pH檸檬酸鹽磷酸鹽琥珀酸鹽甘露醇海藻糖PS80辛酸鹽F017.001001531170.010F025.71000000.010F035.72000000.010F045.71000000.0110F056.01000000.0110F065.31000000.010F075.30010000.010F085.70100000.010F095.70010000.010F105.70020000.0110F116.00010000.0110F126.00010000.010F135.7100015300.010F145.7100001170.010表11.通過(guò)RPHPLC測(cè)量的研究1.1的樣品的純度表12.通過(guò)SEC測(cè)量的研究1.1的樣品的單體含量對(duì)于這些制劑，通過(guò)RP測(cè)量的阿必魯肽的純度最初接近85-87％，對(duì)照制劑在t0時(shí)略低(表11)。當(dāng)樣品在升高的溫度下儲(chǔ)存時(shí)，通過(guò)RPHPLC測(cè)量的純度降低，其中最穩(wěn)定的制劑含有檸檬酸鹽(表11)。單體含量值在儲(chǔ)存時(shí)也降低，其中低pH樣品(pH5.3)制劑F07和F08在40℃一周后(t1)顯示最大降低(表12)。在25℃兩周后(t2)，除了制劑F01和F11之外，單體含量均為97％或更高。F11的結(jié)果似乎與其他值不一致，有可能不正確。一些制劑在儲(chǔ)存時(shí)確實(shí)顯示出一些混濁，并且這些在表11和12中以灰色陰影顯示。也使用非還原性SDS-PAGE凝膠對(duì)這些制劑進(jìn)行測(cè)定。t0數(shù)據(jù)凝膠顯示在圖4和5中。在單體之上存在強(qiáng)帶，其跑膠就如同它是二聚體一樣，并且還存在更高M(jìn)W的微弱帶，其存在于所有制劑中。該條帶在制劑F14中是相當(dāng)明顯的(圖5)。在t1，在制劑F06和F07中的高M(jìn)W物質(zhì)比從F01至F07的任何其它制劑都有更大的增加(圖6)。這些是低pH制劑。類似地，在制劑F08、F09和F12中存在增加量的高M(jìn)W物質(zhì)。后兩種制劑含有琥珀酸鹽緩沖液。此外，這些物質(zhì)的最低量存在于辛酸鹽制劑中(圖6和7)。在t2(兩周，25℃，通過(guò)SDS-PAGE觀察到非常少的降解(圖8和9)，與在這些條件下通過(guò)RPHPLC和SEC觀察到的少量降解相稱。SDS-PAGE和SEC都指示主要的降解途徑是聚集，而不是片段化。總體而言，研究1.1表明檸檬酸鹽是最好的緩沖液，琥珀酸鹽可以作為替代品。雖然pH響應(yīng)相對(duì)平坦，但最佳值接近pH5.7。研究1.2.本輪的第三個(gè)研究主要是為了優(yōu)化在前兩輪中被發(fā)現(xiàn)為穩(wěn)定劑的制劑組分的水平。具體來(lái)說(shuō)，本研究檢測(cè)了檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、辛酸鹽、海藻糖和甘露醇的水平。此外，評(píng)估了高達(dá)100mg/mL的蛋白質(zhì)濃度。注意，每種制劑現(xiàn)在含有100mM精氨酸HCl，其被設(shè)計(jì)為匹配在用于關(guān)于阿必魯肽的其它研究中(被稱為研究2)使用的水平。最后，兩種制劑由不含聚山梨酯-80(PS-80)的材料制備(所有先前的儲(chǔ)備溶液均含有0.01％的PS-80，其在加工過(guò)程中添加)。在40℃孵育1周(t1)、在25℃孵育2周(t2)和在25℃孵育4周(t4)后檢查樣品。表13.研究1.2制劑的組成表14.通過(guò)UV檢測(cè)的研究1.2的制劑的pH值和蛋白質(zhì)濃度在研究1.2中評(píng)價(jià)的任何制劑的pH或蛋白質(zhì)濃度幾乎沒(méi)有變化(表14)。對(duì)于這些制劑，通過(guò)SEC測(cè)量的初始單體含量為98％至99％(表15)。剩余是低聚物，可能是二聚體，其在0.89的相對(duì)保留時(shí)間(RRT)洗脫。表15.研究1.2中的制劑在t0時(shí)的SEC峰面積百分比在40℃下儲(chǔ)存一周后，大多數(shù)制劑的單體含量降低至約97％或更多(表16)。觀察到兩種新物質(zhì)，RRT為0.78和0.85，推測(cè)是較高分子量(MW)的聚集體。一些制劑似乎比其它制劑保留更多的單體。這些包括F13、F14、F10和F07。全部含有檸檬酸鹽作為緩沖液，這四種中有三種使用甘露醇代替海藻糖作為多元醇穩(wěn)定劑。雖然單體含量范圍在t1(表16)相對(duì)較小，但這些差異可能是有意義的，特別是當(dāng)考慮什么制劑似乎不含HMW3物質(zhì)(RRT0.78)時(shí)。表16.通過(guò)SEC測(cè)量的研究1.2中的制劑在t1(在40℃一周)的峰面積百分比表17.通過(guò)SEC測(cè)量的研究1.2中的制劑在t2(在25℃兩周)的峰面積百分比在t2時(shí)最穩(wěn)定的制劑(制劑F01、F05、F11、F13和F14)中，都含有檸檬酸鹽作為緩沖劑以及甘露醇作為穩(wěn)定劑(表17)。通過(guò)SEC檢測(cè)的唯一降解產(chǎn)物是RRT為0.85的較高M(jìn)W物質(zhì)，表明在25℃下，不會(huì)被迫聚集為更高M(jìn)W的物質(zhì)。在25℃(t4)四周后，單體含量仍然相當(dāng)高，許多制劑保持98％或更多(表18)。引入了新的柱，導(dǎo)致了表18中稍高的單體水平，包括在RRT0.85處的聚集峰的量的微小變化。單體含量的最低值是對(duì)于pH5.5的含有琥珀酸鹽的制劑，表明最佳pH大于5.5。表18.通過(guò)SEC測(cè)量的研究1.2中的制劑在t4(25℃四周)的峰面積百分比表19.通過(guò)RPHPLC測(cè)量的研究1.2制劑在t0時(shí)的純度通過(guò)RPHPLC測(cè)量的t0時(shí)的純度見(jiàn)于表19中。顯示所有制劑的純度在87-89％范圍內(nèi)。在40℃儲(chǔ)存一周后，許多制劑的純度降低，一些降至小于80％(表20)。少數(shù)(制劑F05、F14、F15和F16)繼續(xù)表現(xiàn)出接近85％的純度?？傮w趨勢(shì)為，在較低的蛋白質(zhì)濃度和較高量的甘露醇下具有更好的穩(wěn)定性。表20.通過(guò)RPHPLC測(cè)量的研究1.2制劑在t1(在40℃一周)的純度表21.通過(guò)RPHPLC測(cè)量的研究1.2制劑在t2(在25℃兩周)的純度在t2，對(duì)于大多數(shù)制劑，純度變化非常小，甚至當(dāng)考慮到在該方法中給定的誤差時(shí)，有可能無(wú)變化(表21)。在25℃(t4)四周后，觀察到一些更寬的純度范圍(表22)。最不穩(wěn)定的制劑為具有較低的pH(5.5)或具有最高的檸檬酸鹽濃度。最穩(wěn)定的制劑含有甘露醇作為穩(wěn)定劑或使用最高濃度的琥珀酸鹽。一般來(lái)說(shuō)，主要趨勢(shì)是在較低的蛋白質(zhì)濃度下具有更大的穩(wěn)定性。表22.通過(guò)RPHPLC測(cè)量的研究1.2中的制劑在t4(在25℃4周)時(shí)的純度表23.研究1.2中制劑F01-F04的cIEF峰的相對(duì)強(qiáng)度表23(續(xù)).在研究1.2中制劑F05-F08的cIEF峰的相對(duì)強(qiáng)度表23(續(xù)).研究1.2中制劑F09-F12的cIEF峰的相對(duì)強(qiáng)度表23(續(xù)).研究1.2中的制劑F13-F16的cIEF峰的相對(duì)強(qiáng)度PLS模型可以為最有效的賦形劑提供一些指導(dǎo)。該模型提供了對(duì)有限數(shù)目的數(shù)據(jù)點(diǎn)的全局?jǐn)M合；然而，它可以在識(shí)別可能被數(shù)據(jù)中的噪聲模糊的趨勢(shì)方面提供有用的指導(dǎo)，尤其是當(dāng)數(shù)據(jù)集被視為整體考慮時(shí)。使用t1時(shí)單體含量的差異作為終點(diǎn)構(gòu)建研究1.2的PLS1模型。PLS是一個(gè)二次模型，還包括pH緩沖相互作用項(xiàng)。該模型使用8個(gè)主成分(PC)，校準(zhǔn)集的相關(guān)系數(shù)為0.998，驗(yàn)證集的相關(guān)系數(shù)為0.946，表明它是一個(gè)非常準(zhǔn)確和穩(wěn)健的模型。各種因素的相關(guān)系數(shù)匯總在表24中。由于人們?cè)噲D使差異最小化，因此穩(wěn)定劑將具有負(fù)相關(guān)系數(shù)。表24.在構(gòu)建PLS1模型1中使用的因素的相關(guān)系數(shù)，使用t1時(shí)單體含量的差異作為終點(diǎn)。確定為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p<0.05)的因素以粗體顯示。因素r-值pH-0.704蛋白質(zhì)+0.160檸檬酸鹽-0.602琥珀酸鹽+0.296辛酸鹽-0.095甘露醇+0.037海藻糖+0.004表明pH和檸檬酸鹽的影響的響應(yīng)面顯示最佳pH為～6。雖然發(fā)現(xiàn)檸檬酸鹽是有益的，但最佳濃度接近10mM，盡管這是非常淺的最小值(shallowminimum)。pH和琥珀酸鹽的影響的響應(yīng)面更復(fù)雜。在pH6，至少20mM的琥珀酸鹽是穩(wěn)定劑，但是效果與沒(méi)有琥珀酸鹽存在時(shí)的效果相同。所呈現(xiàn)的最后一個(gè)表面顯示，辛酸鹽在pH6下似乎是弱穩(wěn)定劑，淺最小值接近10mM。注意，未確定辛酸鹽對(duì)穩(wěn)定性具有顯著影響，并且響應(yīng)面顯示相對(duì)淺的輪廓。使用兩個(gè)不同的終點(diǎn)，即t2和t4處的單體含量構(gòu)建PLS2模型。該模型僅使用1個(gè)PC，并且校準(zhǔn)集的相關(guān)系數(shù)為0.861，驗(yàn)證集的相關(guān)系數(shù)為0.698，表明它不如以前的模型精確。各種因素的相關(guān)系數(shù)列于表25中。檸檬酸鹽顯示為弱穩(wěn)定劑，而琥珀酸鹽列為失穩(wěn)劑(destabilizer)。表25中的值不反映二次項(xiàng)或交互項(xiàng)，因此檢查實(shí)際響應(yīng)面是有幫助的。表25.構(gòu)建PLS2模型中使用的因素的相關(guān)系數(shù)，其中使用t2和t4(25℃下兩周和四周)處的單體含量作為終點(diǎn)。確定為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p<0.05)的因素以粗體顯示。對(duì)于pH和檸檬酸鹽的影響的響應(yīng)面表明，最佳pH為5.5至5.7。根據(jù)該模型，最佳檸檬酸鹽濃度接近10mM，但是在整個(gè)表面上的范圍相當(dāng)小(<0.2％)，因此任何變化都會(huì)是不顯著的。根據(jù)該模型，辛酸鹽是一種去穩(wěn)定劑，特別是在高于10mM的濃度時(shí)。類似地，根據(jù)該模型，PS80降低了阿必魯肽在25℃的穩(wěn)定性。此外，兩個(gè)模型發(fā)現(xiàn)，增加的蛋白質(zhì)濃度導(dǎo)致較低的穩(wěn)定性，但影響不大。注意該模型質(zhì)量較低，并且與研究1中進(jìn)行其他工作的結(jié)果不一致。構(gòu)建了僅使用t4時(shí)的單體含量作為終點(diǎn)的PLS1模型。該模型使用8個(gè)PC，并且具有0.999的校準(zhǔn)集相關(guān)系數(shù)和0.856的驗(yàn)證集相關(guān)系數(shù)，使其成為與上述第一PLS1模型相當(dāng)?shù)母哔|(zhì)量模型。對(duì)于許多因素而言，相關(guān)系數(shù)是相當(dāng)大的，但是其中只有三個(gè)，即pH、蛋白質(zhì)和琥珀酸鹽被認(rèn)為是顯著的(表26)。表26.構(gòu)建PLS1模型中使用的因素的相關(guān)系數(shù)，其中使用在t4(25℃4周)時(shí)的單體含量作為終點(diǎn)。確定為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p<0.05)的因素以粗體顯示。因素r-值pH+0.585蛋白質(zhì)-0.137檸檬酸鹽+0.295琥珀酸鹽-0.497辛酸鹽-0.261甘露醇-0.025海藻糖-0.154PS80-0.007對(duì)于pH和檸檬酸鹽的影響的響應(yīng)面顯示最佳pH接近pH6.0，表明t2數(shù)據(jù)影響任何表明較低pH優(yōu)越的指示。該模型表明最佳檸檬酸鹽濃度為10mM。蛋白質(zhì)濃度的影響是令人感興趣的，因?yàn)槿绻嬖陲@著的濃度影響，人們可以有效地延長(zhǎng)產(chǎn)品的保質(zhì)期。該模型表明穩(wěn)定性隨著蛋白質(zhì)濃度的增加而降低，特別是一旦濃度增加到60mg/mL以上時(shí)。該模型表明蛋白質(zhì)濃度在t4時(shí)確實(shí)對(duì)單體含量具有顯著影響。琥珀酸鹽被預(yù)測(cè)在pH6具有非線性效應(yīng)，但在該pH時(shí)影響非常小。同時(shí)，其在pH5.5下明顯不穩(wěn)定。鑒于琥珀酸鹽的小影響，根據(jù)研究1.2的所有數(shù)據(jù)，最好考慮將檸檬酸鹽作為緩沖液的最佳選擇。最后，辛酸鹽也是不穩(wěn)定的，但是相比于琥珀酸鹽，其采用的是更不依賴于pH的方式。預(yù)測(cè)最佳pH接近6.0。使用通過(guò)RPHPLC測(cè)量的在t1的純度差異作為終點(diǎn)構(gòu)建第四個(gè)PLS(PLS1)模型。該模型使用3個(gè)PC，并且校準(zhǔn)集的相關(guān)系數(shù)為0.949，驗(yàn)證集的相關(guān)系數(shù)為0.748。該模型中的因素的相關(guān)系數(shù)總結(jié)在表27中。經(jīng)計(jì)算，三個(gè)因素是顯著的：pH、檸檬酸鹽和辛酸鹽。表27.構(gòu)建PLS1模型中使用的因素的相關(guān)系數(shù)，其中使用通過(guò)RPHPLC測(cè)量的在t1(40℃一周)時(shí)的純度差異作為終點(diǎn)。確定為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p<0.05)的因素以粗體顯示。因素r-值pH+0.252蛋白質(zhì)-0.052檸檬酸鹽+0.217琥珀酸鹽-0.080辛酸鹽+0.372甘露醇+0.029海藻糖+0.071PS80-0.059該P(yáng)LS模型表明，如果檸檬酸鹽濃度高于10mM，則最佳pH接近5.5至5.7。如前所述，pH和琥珀酸鹽的響應(yīng)面相當(dāng)復(fù)雜。它表明，不存在琥珀酸鹽時(shí)，最佳pH為5.5。然而，當(dāng)存在琥珀酸鹽時(shí)，趨勢(shì)逆轉(zhuǎn)，pH6更有利，且琥珀酸鹽在20mM時(shí)提供一些增加的穩(wěn)定性。根據(jù)該模型，辛酸鹽在所有pH值下都不穩(wěn)定。該模型還顯示PS80有利于保持純度，其中最佳pH接近5.5至5.7。總體而言，研究1.2提供了關(guān)于阿必魯肽穩(wěn)定化的一些重要信息。最佳pH接近6.0，但略低的pH值不會(huì)明顯改變穩(wěn)定性曲線。關(guān)于緩沖劑影響的數(shù)據(jù)是變化的，但是常識(shí)是，適量的約10至15mM的檸檬酸鹽是有益的。琥珀酸鹽的影響更難解釋，但沒(méi)有數(shù)據(jù)表明它是與檸檬酸鹽一樣好的穩(wěn)定劑。隨著蛋白質(zhì)濃度增加，穩(wěn)定性降低，特別是在通過(guò)SEC測(cè)量的物理穩(wěn)定性方面。高于70mg/mL的濃度在一定程度上降低了穩(wěn)定性。雖然辛酸鹽顯示對(duì)穩(wěn)定性有害，但一些PS80似乎提供了一些益處，但這很少不足以在任何數(shù)學(xué)模型中被認(rèn)為是顯著的。在研究1.2中考慮的兩種結(jié)構(gòu)穩(wěn)定劑中，甘露醇和海藻糖兩者之間沒(méi)有任何顯著差異。一些數(shù)據(jù)表明甘露醇會(huì)是更好的穩(wěn)定劑，但差異是如此輕微，因此這不能說(shuō)是結(jié)論性的。pH、緩沖液和蛋白質(zhì)濃度的影響更重要。最后，使用非還原SDS-PAGE檢查這些樣品。在t0處，存在50kD附近的主單體帶和110kD附近的第二較弱帶，據(jù)推測(cè)其為二聚體(圖10和11)。在t1，在一些制劑中出現(xiàn)接近200kD的微弱帶(圖12和13)。此條帶不出現(xiàn)在t2樣品中(圖14和15)。這些結(jié)果反映了SEC的發(fā)現(xiàn)，其中在25℃不產(chǎn)生RRT為0.78的物質(zhì)，其在40℃產(chǎn)生。研究1.3.最終研究旨在研究海藻糖和精氨酸HCl的濃度效應(yīng)(表28)。檸檬酸鹽是研究的唯一緩沖體系，并且在5和15mM之間變化。蛋白質(zhì)濃度低至30mg/mL，因?yàn)橄惹暗臄?shù)據(jù)表明使用較低濃度可延長(zhǎng)保質(zhì)期。對(duì)于除兩個(gè)樣品外的所有樣品，pH固定為6.0?；谙惹暗臄?shù)據(jù)(研究1.2和研究2.0)停止作為潛在穩(wěn)定劑的辛酸鹽。將樣品保持五個(gè)月的時(shí)間。表28.研究1.3制劑的組成在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)和儲(chǔ)存溫度下測(cè)定樣品。在40℃的一周和兩周后，在30℃的一周、兩周或三周后、在25℃的四周、十三周和22周(約1個(gè)月、3個(gè)月和5個(gè)月)后和在5℃的三個(gè)月和五個(gè)月后收集穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。使用SEC和RPHPLC進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)試，如下所概述。相反，此時(shí)停止SDS-PAGE和cIEF，因?yàn)樗鼈兯坪醪皇欠€(wěn)定性指示方法。此外，樣品在GSK也使用SEC和RP測(cè)試，但添加通過(guò)cIEF和Caliper分析完成的測(cè)試。表29.來(lái)自研究1.3的樣品的pH表30.通過(guò)UV測(cè)量來(lái)自研究1.3的樣品的濃度在研究1.3的整個(gè)過(guò)程中，pH值(表29)和蛋白質(zhì)濃度(表30)都相當(dāng)穩(wěn)定。在t0時(shí)，通過(guò)SEC測(cè)量的單體含量范圍為約98％至98.5％，僅觀察到二聚體(RRT0.89)和低聚物(RRT0.85)(表31)。在這些研究中，沒(méi)有通過(guò)SEC觀察到任何片段。表31.通過(guò)SEC測(cè)量的研究1.3中的制劑在t0時(shí)的峰面積百分比表32.通過(guò)SEC測(cè)量的在30℃儲(chǔ)存一周的研究1.3中的制劑的峰面積百分比在30℃，沒(méi)有觀察到更高M(jìn)W的物質(zhì)，并且單體的損失輕微(表32)。對(duì)于100mg/mL的制劑(制劑F16和F17)，觀察到最低的單體含量。另一方面，在40℃，甚至在僅一周后，觀察到了更高的MW物質(zhì)(表33)。雖然與t0時(shí)的差異小，但顯示更高的海藻糖水平和更低的精氨酸濃度可有益于穩(wěn)定性。在一周樣品中在30℃兩個(gè)星期看到單體含量的進(jìn)一步少量減少(表34)。同樣，沒(méi)有觀察到更高的MW物質(zhì)(RRT0.79)。類似地，即使在40℃儲(chǔ)存兩周后仍幾乎沒(méi)有損失(表35)，其中對(duì)于許多制劑，單體含量仍為97％或更高。對(duì)于沒(méi)有PS80或具有高蛋白濃度的制劑，觀察到最大的降低。表33.通過(guò)SEC測(cè)量的在40℃儲(chǔ)存一周的研究1.3中的制劑的峰面積百分比表34.通過(guò)SEC測(cè)量的在30℃儲(chǔ)存兩周的研究1.3中的制劑的峰面積百分比表35.通過(guò)SEC測(cè)量的在40℃儲(chǔ)存兩周的研究1.3中的制劑的峰面積百分比表36通過(guò)SEC測(cè)量的在30℃儲(chǔ)存三周的研究1.3中的制劑的峰面積百分比即使在30℃三周后，對(duì)于大多數(shù)制劑單體含量幾乎沒(méi)有損失(表36)，這表明這些在穩(wěn)定性方面幾乎是最佳的。對(duì)于在25℃保持四周的樣品，單體含量仍然保持在98％附近，其接近t0的水平(表37)。這些短期研究都表明，這里考慮的制劑幾乎是最佳的。換句話說(shuō)，在檸檬酸鹽緩沖液中，在pH6.0附近，通過(guò)SEC測(cè)量的物理穩(wěn)定性最大，其中精氨酸和海藻糖作為穩(wěn)定劑一起作用。PS80可以不是必需的，或甚至不利于長(zhǎng)期穩(wěn)定性。與研究1.2一樣，較高的蛋白濃度降低了阿必魯肽的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。表37.通過(guò)SEC測(cè)量的在25℃儲(chǔ)存4周的研究1.3中的制劑的峰面積百分比表38.通過(guò)SEC測(cè)量的在5℃儲(chǔ)存13周(三個(gè)月)的研究1.3中的制劑的峰面積百分比進(jìn)行長(zhǎng)期儲(chǔ)存研究，將樣品在5℃和25℃保持三個(gè)月和五個(gè)月(分別為t13和t22)。在5℃三個(gè)月后，對(duì)于許多(如果不是全部)制劑，通過(guò)SEC測(cè)量的單體含量保持在98％附近(表38)。通過(guò)比較，在25℃保持相同時(shí)長(zhǎng)的那些包含約97％的單體(表39)，表明這些制劑都相當(dāng)穩(wěn)定。表39.通過(guò)SEC測(cè)量的在25℃儲(chǔ)存13周(3個(gè)月)的研究1.3中的制劑的峰面積百分比表40.通過(guò)SEC測(cè)量的在5℃儲(chǔ)存22周(5個(gè)月)的研究1.3中的制劑的峰面積百分比當(dāng)檢查5℃下保持5個(gè)月的樣品時(shí)，通過(guò)SEC測(cè)量的單體含量平均剛好在98％之上(表40)。這說(shuō)明，對(duì)于每個(gè)月的儲(chǔ)存，單體損失約為0.1％(或更少)。這樣的降解速率將預(yù)測(cè)在24個(gè)月的過(guò)程中損失2％至3％，單體含量在期限結(jié)束時(shí)接近96％。同時(shí)，在25℃儲(chǔ)存制劑5個(gè)月后顯示大多數(shù)仍保留～97％的單體(表41)，表明其可以于室溫保持?jǐn)?shù)周。表41通過(guò)SEC測(cè)量的在25℃儲(chǔ)存22周(5個(gè)月)的研究1.3中的制劑的峰面積百分比還通過(guò)RPHPLC測(cè)量純度來(lái)監(jiān)測(cè)穩(wěn)定性，其提供了這些阿必魯肽制劑的化學(xué)穩(wěn)定性的一些證據(jù)。對(duì)于所有制劑，初始純度接近89％(表42)。當(dāng)樣品保持在30℃(表43)或25℃(表44)時(shí)，純度變化非常小，如果有的話(見(jiàn)下文)。在40℃，純度有一些降低，這似乎是真實(shí)的，但是純度僅降低到接近86％的水平(表42)。對(duì)于蛋白質(zhì)濃度為80mg/mL至100mg/mL的樣品，觀察到最低的純度。應(yīng)當(dāng)注意，通過(guò)RPHPLC顯示，含有100mg/mL的PS80(F17)在40℃下確實(shí)顯示比沒(méi)有表面活性劑的相應(yīng)制劑(F16)更大的穩(wěn)定性。在較低的儲(chǔ)存溫度下，這些差異變小或不顯著。表42.通過(guò)RPHPLC測(cè)量的研究1.3中的制劑的純度，其在40℃儲(chǔ)存零周、一周和兩周樣品t0t1t2F0188.15±0.5088.90±0.4187.04±1.07F0288.64±0.1888.85±0.7587.12±0.36F0388.43±0.4588.55±0.7088.30±0.06F0486.94±0.1088.42±0.2886.64±0.35F0588.56±0.2089.57±0.2188.54±0.12F0687.67±0.4189.70±0.5587.73±0.04F0788.55±0.3088.71±0.1088.23±0.48F0887.90±0.3587.85±0.2187.57±0.55F0984.97±0.3288.09±1.0686.15±0.20F1088.76±0.0488.67±0.5387.93±0.25F1188.76±0.2189.53±0.2387.22±0.33F1286.25±0.5489.60±0.2886.69±0.38F1388.02±0.2790.04±0.2587.69±0.22F1487.42±0.3689.70±0.3288.10±0.21F1586.45±0.0689.44±0.2187.20±0.51F1686.48±0.1889.82±0.4586.45±0.41F1787.29±0.2489.19±0.3289.46±0.38F1887.75±0.3090.47±0.0686.84±0.24表43.通過(guò)RPHPLC測(cè)量的研究1.3中的制劑的純度，其在30℃儲(chǔ)存零周、一周、兩周和三周樣品t0t130t230t330F0188.15±0.5089.46±0.1089.24±0.1690.47±0.37F0288.64±0.1889.65±0.4389.51±0.2790.08±0.41F0388.43±0.4589.67±0.2989.07±0.1690.66±0.27F0486.94±0.1088.09±0.6388.27±0.0790.40±0.60F0588.56±0.2089.39±0.1489.36±0.4089.40±0.19F0687.67±0.4190.07±0.1088.70±0.3089.18±0.09F0788.55±0.3089.96±0.3088.49±0.3489.05±0.19F0887.90±0.3589.14±0.6587.69±0.3788.75±0.31F0984.97±0.3288.77±0.2388.18±0.3188.38±0.66F1088.76±0.0489.35±0.3489.37±0.7188.46±0.46F1188.76±0.2188.97±0.1589.17±0.1789.11±0.49F1286.25±0.5488.96±0.5488.83±0.3289.21±0.40F1388.02±0.2788.80±0.4488.90±0.3489.68±0.55F1487.42±0.3689.32±0.3289.35±0.1389.32±0.70F1586.45±0.0689.30±0.3289.68±0.3489.11±0.40F1686.48±0.1888.12±0.5586.78±0.1488.50±0.80F1787.29±0.2488.40±0.6887.50±0.4188.42±0.64F1887.75±0.3089.45±0.2888.72±0.0287.74±0.41表44.通過(guò)RPHPLC測(cè)量的研究1.3中的制劑的純度，其在25℃儲(chǔ)存樣品t0t4t13t22F0188.15±0.5088.08±0.3085.83±1.4187.96±0.44F0288.64±0.1887.07±0.7786.16±0.5587.78±0.51F0388.43±0.4586.57±0.6985.43±0.9186.80±1.61F0486.94±0.1086.50±0.3486.63±0.8687.08±0.83F0588.56±0.2086.34±0.6086.45±1.0686.78±0.63F0687.67±0.4186.41±0.7585.66±0.8887.74±1.06F0788.55±0.3086.90±0.4586.10±0.5885.94±0.17F0887.90±0.3586.79±0.1786.43±0.1185.17±0.22F0984.97±0.3287.06±0.4984.61±0.4284.64±0.42F1088.76±0.0487.33±0.5185.60±0.4985.27±0.39F1188.76±0.2186.88±0.4186.76±0.5184.95±0.12F1286.25±0.5486.76±0.4685.25±0.3884.40±0.40F1388.02±0.2787.35±0.3584.89±0.9783.95±0.50F1487.42±0.3687.62±1.3284.33±0.9183.98±0.42F1586.45±0.0687.11±0.0888.02±0.1584.18±0.65F1686.48±0.1887.60±0.2587.63±0.4483.96±0.37F1787.29±0.2488.09±0.1987.18±1.3084.14±0.78F1887.75±0.3088.19±0.6487.84±0.4885.27±0.45表45.通過(guò)RPHPLC測(cè)量的在5℃儲(chǔ)存的研究1.3中的制劑的純度樣品t0t13t22F0188.15±0.5088.94±0.5688.72±0.27F0288.64±0.1887.30±0.4988.89±0.57F0388.43±0.4589.43±0.5889.44±0.38F0486.94±0.1085.64±0.6489.51±0.10F0588.56±0.2086.82±0.3489.03±0.42F0687.67±0.4187.54±0.7789.36±0.26F0788.55±0.3085.98±0.6889.26±0.21F0887.90±0.3588.40±0.7488.20±0.77F0984.97±0.3286.69±0.2588.43±0.73F1088.76±0.0488.29±0.6389.83±0.37F1188.76±0.2186.87±0.6189.68±0.41F1286.25±0.5487.52±0.3489.29±0.28F1388.02±0.2788.70±0.1089.99±0.30F1487.42±0.3687.63±0.6490.22±0.51F1586.45±0.0686.60±0.2890.37±0.40F1686.48±0.1885.24±0.1489.95±0.56F1787.29±0.2486.30±0.6790.09±0.29F1887.75±0.3087.78±0.2490.07±0.44對(duì)于在5℃儲(chǔ)存的樣品，沒(méi)有可測(cè)量的純度損失(表45)，其中所有值在方法的誤差內(nèi)與初始值基本上沒(méi)有變化。對(duì)于在25℃儲(chǔ)存的樣品，在t13和t22通過(guò)RPHPLC發(fā)現(xiàn)存在一些小的損失(表44)。盡管如此，RP方法中的錯(cuò)誤使得很難確定這些損失究竟有多大。一般來(lái)說(shuō)，5個(gè)月內(nèi)損失范圍為2％至4％，表明阿必魯肽的化學(xué)穩(wěn)定性在這些制劑中是相當(dāng)好的。SEC和RP數(shù)據(jù)的PLS模型使用這些數(shù)據(jù)作為終點(diǎn)構(gòu)建了多個(gè)PLS模型。它們按照所使用的時(shí)間點(diǎn)的順序列出，其中列有本節(jié)結(jié)尾處的三個(gè)月和五個(gè)月時(shí)間點(diǎn)的模型。使用在t2/40℃時(shí)的單體含量差作為終點(diǎn)構(gòu)建PLS1模型。該模型使用一個(gè)PC，并且校準(zhǔn)集的相關(guān)系數(shù)為0.865且驗(yàn)證集為0.751。這表明該模型不如研究1.2數(shù)據(jù)的一些PLS模型那么穩(wěn)健。經(jīng)計(jì)算，五種因素是顯著的：檸檬酸鹽、蛋白質(zhì)、精氨酸、海藻糖和PS80。pH和檸檬酸鹽的響應(yīng)面顯示單體含量的損失在pH6時(shí)最低，并且具有最高的檸檬酸鹽濃度。就蛋白質(zhì)濃度效應(yīng)而言，對(duì)于高達(dá)～70mg/mL的濃度，響應(yīng)面相對(duì)平坦，其中在閾值之上損失略高。對(duì)于較低濃度樣品，兩周后，預(yù)測(cè)100mg/mL的增加的損失為約0.4％(參見(jiàn)下文的討論)。一種制劑含有100mM精氨酸和117mM海藻糖。研究1.3的一個(gè)主要目標(biāo)是研究改變這些量的效果。精氨酸和海藻糖的響應(yīng)面顯示圓頂形狀，其中總的趨勢(shì)是精氨酸是不穩(wěn)定的，而海藻糖在pH6下穩(wěn)定。當(dāng)樣品在較低溫度下儲(chǔ)存時(shí)，存在較不明顯的差異，這是由于疏水效應(yīng)傾向于在升高溫下放大。最后，顯示PS80是該P(yáng)LS模型中的穩(wěn)定劑。使用在25℃(t4/25℃)四周后的單體含量作為終點(diǎn)構(gòu)建研究1.3數(shù)據(jù)的第二PLS1模型。該模型使用一個(gè)PC，并且校準(zhǔn)集的相關(guān)系數(shù)為0.811且驗(yàn)證集為0.636。該模型反映了在較低儲(chǔ)存溫度下的數(shù)據(jù)，因此在長(zhǎng)期儲(chǔ)存穩(wěn)定性方面會(huì)更相關(guān)。pH和檸檬酸鹽的響應(yīng)面表明最佳pH接近5.7至5.8，其中檸檬酸鹽是良好的穩(wěn)定劑。為了判斷蛋白質(zhì)濃度的影響的大小，使用PS80預(yù)測(cè)的單體含量百分比被列在表面上。通過(guò)從30mg/mL移動(dòng)至100mg/mL，顯示單體含量降低約0.15％。這種趨勢(shì)與迄今為止所進(jìn)行的所有其他分析完全一致。較高的蛋白質(zhì)濃度確實(shí)導(dǎo)致穩(wěn)定性降低。同時(shí)，PS80，如其在這個(gè)模型中一樣，提供了少量的穩(wěn)定性。使用在t2/30℃，t3/30℃和t4/25℃的二聚體含量差異構(gòu)建第三個(gè)PLS模型。盡管所有這些溫度反映加速的應(yīng)激條件，但它們提供了關(guān)于阿必魯肽耐受溫度變化的信息。此外，通過(guò)考慮多個(gè)時(shí)間點(diǎn)和溫度，可以獲得關(guān)于穩(wěn)定性分布的更平衡的觀點(diǎn)。在本報(bào)告中描述的所有PLS模型中，數(shù)據(jù)被集中且歸一化為標(biāo)準(zhǔn)偏差的倒數(shù)。因此，任何響應(yīng)都可以用作具有與任何其他的相等權(quán)重的終點(diǎn)。因此，來(lái)自兩個(gè)不同溫度的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)可以彼此結(jié)合使用，每個(gè)溫度給出相等的權(quán)重。使用三個(gè)PC，該P(yáng)LS2模型具有兩個(gè)極端值(制劑14和15)，但是產(chǎn)生了具有0.958驗(yàn)證集r-值和0.905校準(zhǔn)集r-值的高質(zhì)量模型。除了它們確實(shí)代表海藻糖和精氨酸濃度的極端值以外，不清楚為什么它們顯示與其他數(shù)據(jù)不一致的數(shù)據(jù)。根據(jù)該模型，最佳pH為5.9至6.0，其中檸檬酸鹽在15mM下輕微不穩(wěn)定。這些結(jié)果與早期的結(jié)論一致，即pH6.0幾乎是理想的，并且需要存在適量的檸檬酸鹽(10至15mM)。根據(jù)該模型，蛋白質(zhì)濃度影響穩(wěn)定性，但僅在高于70至80mg/mL或更高的濃度下。同樣，這一發(fā)現(xiàn)與研究1.2和研究1.3收集的數(shù)據(jù)一致。每個(gè)數(shù)據(jù)集指向這樣的事實(shí)，即約60mg/mL的濃度可降低阿必魯肽的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。數(shù)據(jù)和這些模型表明，通過(guò)SEC測(cè)量，對(duì)于精氨酸或海藻糖，20mM的變化對(duì)穩(wěn)定性具有最小的影響。換句話說(shuō)，精氨酸濃度可以為80至120mM，海藻糖可以為100至140mM。再一次，至少根據(jù)這個(gè)模型，響應(yīng)面表明PS80是一種適度的穩(wěn)定劑，但這似乎是總的趨勢(shì)。收集儲(chǔ)存至五個(gè)月(22周)的樣品的數(shù)據(jù)，使用在25℃存儲(chǔ)的樣品的在t13和t22的單體含量作為終點(diǎn)構(gòu)建PLS2模型。該模型具有0.856的校準(zhǔn)集相關(guān)系數(shù)和0.775的驗(yàn)證集r值。三個(gè)因素被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的，即蛋白質(zhì)濃度、檸檬酸鹽和PS80。pH和檸檬酸鹽的響應(yīng)面顯示，單體含量在最高檸檬酸鹽水平時(shí)是最大的，略微偏好pH5.7優(yōu)于較高pH值。在該模型中，蛋白質(zhì)濃度對(duì)該模型的穩(wěn)定性具有顯著影響，至～60mg/mL時(shí)，單體含量仍為恒定的。高于該值時(shí)，根據(jù)該模型，穩(wěn)定性降低。相比之下，精氨酸在所評(píng)估的濃度范圍內(nèi)對(duì)穩(wěn)定性具有相對(duì)較小的影響。在pH和檸檬酸鹽水平固定后(注意整個(gè)響應(yīng)面上的范圍)，海藻糖和精氨酸影響不大。最后，發(fā)現(xiàn)PS80的作用對(duì)于在25℃下保持單體含量是有益的。使用在5℃存儲(chǔ)的樣品的在t13和t22的單體含量作為終點(diǎn)構(gòu)建PLS2模型。該模型具有0.938的校準(zhǔn)集相關(guān)系數(shù)和0.604的驗(yàn)證集r值。兩個(gè)因素被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)上顯著的，即蛋白質(zhì)濃度和檸檬酸鹽。對(duì)于在較低溫度下儲(chǔ)存的樣品的這種模型，如以前的模型一樣，發(fā)現(xiàn)檸檬酸鹽是一種穩(wěn)定劑，并且優(yōu)選pH5.7而不是較高pH值。下一個(gè)響應(yīng)面顯示在較低的蛋白質(zhì)濃度(<60mg/mL)時(shí)，維持單體含量，但其隨著濃度升至100mg/mL而減少。此外，PS80可有利于保持單體含量。這個(gè)模型表明，在這些范圍內(nèi)，精氨酸和海藻糖對(duì)穩(wěn)定性幾乎沒(méi)有影響，這很像以前的模型。適宜地，本發(fā)明的液體組合物可以含有100mM濃度的精氨酸和117mM濃度的海藻糖。使用通過(guò)RPHPLC測(cè)量的在25℃存儲(chǔ)的樣品在t22的純度作為終點(diǎn)構(gòu)建PLS1模型。在5℃的損失太小，不能建立一個(gè)可比的模型。該P(yáng)LS模型的校準(zhǔn)集的相關(guān)系數(shù)為0.859，驗(yàn)證集的r值為0.700。發(fā)現(xiàn)兩個(gè)因素是顯著的，即pH和蛋白質(zhì)濃度。pH和檸檬酸鹽的影響顯示與SEC終點(diǎn)所觀察到的相同的模式，其中較高的檸檬酸鹽是有利的，并且優(yōu)選pH5.7以在25℃維持蛋白質(zhì)的純度(圖16)。此外，根據(jù)該模型，較高的蛋白質(zhì)濃度導(dǎo)致在超過(guò)接近60mg/mL的閾值時(shí)純度損失(圖17)。添加PS80導(dǎo)致在儲(chǔ)存時(shí)保留更大的純度。第三響應(yīng)面顯示精氨酸和海藻糖的影響。左上角的深灰色區(qū)域表示最大穩(wěn)定性區(qū)域。100mM精氨酸和117mM海藻糖的當(dāng)前組成直接落在該區(qū)域的中間(圖18)。該數(shù)據(jù)還表明，穩(wěn)定劑水平有20％或更高的變化對(duì)穩(wěn)定性不會(huì)有明顯的影響。補(bǔ)充數(shù)據(jù)來(lái)自該研究1.3的樣品用于產(chǎn)生補(bǔ)充數(shù)據(jù)。除了SEC和RP之外，還使用Caliper和cIEF收集數(shù)據(jù)。報(bào)告的這一部分提供了數(shù)據(jù)的簡(jiǎn)要摘要，特別是由于它們涉及存儲(chǔ)三個(gè)月和五個(gè)月(t13和t22)的樣品。表46.來(lái)自研究1.3的存儲(chǔ)22周(5個(gè)月)的阿必魯肽樣品的Caliper數(shù)據(jù)，還原的樣品以粗體文本呈現(xiàn)，未還原的樣品為非粗體黑字列出未使用Caliper方法分析含有PS80的樣品，而其余16種制劑的結(jié)果列于表46中。對(duì)于以粗體字列出的還原樣品，在5個(gè)月后在任何制劑中幾乎沒(méi)有損失。非還原法看上去更能指示穩(wěn)定，其中在制劑的值中發(fā)現(xiàn)一些變化。但是，損失如此之小，以至于不能從該技術(shù)推導(dǎo)出進(jìn)一步的穩(wěn)定性分析。表47.通過(guò)SEC測(cè)量的在5℃和25℃儲(chǔ)存22周(5個(gè)月)的研究1.3中的制劑的單體含量百分比制劑號(hào)t0t225Ct2225C198.398.096.8298.498.196.8398.398.097.2498.297.997.0598.398.097.2698.498.097.1798.397.996.9898.297.896.8998.197.796.71098.398.097.11198.397.996.91298.297.996.91398.398.097.01498.297.996.71598.297.997.01698.297.896.61798.197.796.51898.197.896.7通過(guò)SEC測(cè)量的在t22處的單體含量總結(jié)在表47中。初始值接近98.3％。在5℃5個(gè)月后，這些值仍然大多接近98％，意味著每月?lián)p失小于0.1％。相比之下，在25℃的水平接近97％，這仍然僅達(dá)到每月約0.2％量的單體損失?？紤]到目前規(guī)格為>96％的單體，所有這些樣品仍然通過(guò)該測(cè)試。使用在5℃存儲(chǔ)5個(gè)月的樣品的這些數(shù)據(jù)作為終點(diǎn)構(gòu)建PLS1模型。該模型的校準(zhǔn)集的相關(guān)系數(shù)為0.929，驗(yàn)證集的r值為0.700。確定三個(gè)因素具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，即pH、檸檬酸鹽和蛋白質(zhì)濃度。該模型表明檸檬酸鹽是一種穩(wěn)定劑，并且通過(guò)達(dá)到pH5.7而不是更高的pH值使單體含量最大化。同時(shí)，單體含量在低于50mg/mL的蛋白質(zhì)濃度時(shí)保持最高。預(yù)測(cè)PS80的添加提供了一定適度量的穩(wěn)定性。精氨酸和海藻糖的作用在100mM精氨酸和117mM海藻糖的當(dāng)前目標(biāo)附近是最大的。該模型表明在這些濃度中存在一些顯著的緯度，其中在每個(gè)方向可容易地進(jìn)行超過(guò)20mM的變化而不影響穩(wěn)定性。表48.通過(guò)SEC測(cè)量的在5℃和25℃下儲(chǔ)存22周(5個(gè)月)的研究1.3中的制劑的二聚體含量百分比制劑號(hào)t0t225Ct2225C11.72.03.221.61.93.231.72.02.841.82.13.051.72.02.861.62.02.971.72.13.181.82.23.291.92.33.3101.72.02.9111.72.13.1121.82.13.1131.72.03.0141.82.13.3151.82.13.0161.82.23.4171.92.33.5181.92.23.3儲(chǔ)存22周(t22，5個(gè)月)的樣品的二聚體含量總結(jié)在表48中。在5℃，水平在1.9％和2.3％之間，僅比1.7％附近的初始值稍高。在25℃，二聚體含量已增加至3％或更多，但仍低于目前<4％的規(guī)格。使用在5℃和25℃存儲(chǔ)五個(gè)月的樣品的二聚體水平作為終點(diǎn)構(gòu)建PLS2模型。該模型的校準(zhǔn)集的相關(guān)系數(shù)為0.961，驗(yàn)證集的r值為0.778。確定三個(gè)因素具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，即pH、檸檬酸鹽和蛋白質(zhì)濃度。PLS2模型表明檸檬酸鹽是穩(wěn)定劑，最小二聚體水平發(fā)生在pH5.7(圖19)。這些發(fā)現(xiàn)與上述許多PLS模型一致，特別是對(duì)于關(guān)注儲(chǔ)存至少三個(gè)月的樣品的數(shù)據(jù)的那些。預(yù)測(cè)PS80是穩(wěn)定劑，而顯示增加的蛋白質(zhì)濃度導(dǎo)致更高的二聚體水平(圖20)。該模型顯示高于90mM的精氨酸濃度和80mM與140mM之間的海藻糖水平將使二聚體形成最小化(圖21)。表49.在GSK，通過(guò)RPHPLC進(jìn)行對(duì)在5℃和25℃下儲(chǔ)存22周的研究1.3樣品的純度測(cè)量。提供t0的數(shù)據(jù)用于比較。使用RPHPLC測(cè)量樣品在t22的純度(表49)。初始純度接近96.5％。在5℃5個(gè)月后，這些值基本上沒(méi)有變化。甚至在25℃22周后，該水平僅降低約3％(表49)。在GSK對(duì)這18種制劑進(jìn)行的最終分析測(cè)試是使用cIEF測(cè)量電荷分布。每種制劑的純度(通過(guò)主峰強(qiáng)度判斷)總結(jié)于表50中。對(duì)于在5℃的樣品，在t22觀察到有小的降低，和對(duì)于在25℃儲(chǔ)存的樣品，損失范圍為7-11％。表50.在GSK進(jìn)行的通過(guò)cIEF測(cè)量的在5℃和25℃儲(chǔ)存22周的研究1.3樣品的主峰純度制劑號(hào)t0t225Ct2225C176.874.467.7277.073.866.6375.973.668.7475.572.467.2576.374.268.3675.674.867.9775.173.769.5874.974.166.5975.073.168.21076.472.066.91175.373.067.31275.473.267.11375.573.366.01476.473.866.21575.974.367.11673.072.164.71775.873.666.21873.771.763.8使用在5℃存儲(chǔ)五個(gè)月的樣品的cIEF的主峰純度作為終點(diǎn)構(gòu)建PLS1模型。該模型的校準(zhǔn)集的相關(guān)系數(shù)為0.891，驗(yàn)證集的r值為0.663。確定三個(gè)因素具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，即pH、檸檬酸鹽和PS80。PLS模型表明檸檬酸鹽對(duì)于維持這些t22樣品的主峰純度是有效的，而pH5.7與更高pH值相比也是有益的(圖22)。同時(shí)，預(yù)測(cè)PS80的添加是有益的(圖23)。蛋白質(zhì)濃度依賴性與以前的模型略有不同，其中預(yù)計(jì)稍高的濃度是有幫助的，但是該區(qū)域的響應(yīng)面相當(dāng)淺。最后，精氨酸和海藻糖的影響如圖24所示。響應(yīng)面積的整個(gè)范圍僅為約0.4％，表明目前使用的量接近理想。根據(jù)這個(gè)模型，預(yù)測(cè)即使較大的變化對(duì)穩(wěn)定性也僅具有最小的影響?？偨Y(jié)進(jìn)行了四組實(shí)驗(yàn)以研究阿必魯肽在水溶液中的穩(wěn)定性。指示穩(wěn)定性的主要測(cè)定是SEC和RPHPLC。雖然cIEF和SDS-PAGE也可以提供信息，但是至少對(duì)于相對(duì)穩(wěn)定的制劑來(lái)說(shuō)，它們?nèi)狈PLC所具有的評(píng)估穩(wěn)定性的靈敏度。僅發(fā)現(xiàn)cIEF提供了關(guān)于穩(wěn)定性的有用信息，并且僅在樣品儲(chǔ)存五個(gè)月后。最初的研究，即研究1.0，表明組氨酸(His)制劑不太穩(wěn)定，在較小程度上類似磷酸鹽制劑。此外，較高的pH(>6.3)也導(dǎo)致一些不穩(wěn)定性。同時(shí)，這些制劑都非常耐冷凍-解凍破壞的。研究1.1更詳細(xì)地探討了緩沖劑作用，其中添加琥珀酸鹽代替組氨酸。其被證明是檸檬酸鹽的可能替代物，但是當(dāng)考慮所有因素時(shí)，檸檬酸鹽不斷被證明是阿必魯肽的最佳緩沖劑。研究1.2考察了其他成分，如甘露醇、海藻糖和PS80的影響。數(shù)據(jù)再次表明，琥珀酸鹽幾乎不如檸檬酸鹽穩(wěn)定，并且pH最佳值為5.5至6.0。與研究1.3的信息一起，發(fā)現(xiàn)在選擇緩沖劑濃度時(shí)必須謹(jǐn)慎。再一次，數(shù)據(jù)指向適度水平的檸檬酸鹽(約10至15mM)作為最佳范圍。與其他蛋白質(zhì)一樣，過(guò)量的檸檬酸鹽使阿必魯肽不穩(wěn)定，這可能是由于降低的膠體穩(wěn)定性。辛酸鹽被發(fā)現(xiàn)是去穩(wěn)定的，而甘露醇和海藻糖的作用是相似的，并且在大多數(shù)情況下相對(duì)較弱。繼續(xù)在研究1.3中優(yōu)化制劑，再次研究海藻糖和甘露醇，以及改變精氨酸和PS80水平。從研究1.3(至今)看來(lái)，PS80是一種穩(wěn)定劑。即使認(rèn)為效果趨于適度，但是觀察是一致的，即存在PS80是有益的。用研究1.3完成pH和緩沖液的選擇。最佳pH為5.7，特別是當(dāng)考慮來(lái)自三個(gè)和五個(gè)月時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)時(shí)。然而，一般來(lái)說(shuō)，這些研究的整體過(guò)程已經(jīng)表明，在5.7到6.2這一有限pH范圍內(nèi)，對(duì)pH的響應(yīng)相對(duì)平坦。盡管如此，最新數(shù)據(jù)對(duì)于選擇pH5.7提供了令人信服的論據(jù)，因?yàn)闊o(wú)論是通過(guò)SEC、RPHPLC或cIEF確定穩(wěn)定性，其都穩(wěn)定了蛋白質(zhì)。如上文對(duì)早期研究所述，適量的檸檬酸鹽(10至15mM)是理想的。研究1.3的結(jié)果表明，使用100mM精氨酸和117mM海藻糖的制劑是好的選擇。對(duì)于任一種化合物，約20mM(或更多)的變化似乎對(duì)穩(wěn)定性具有最小的影響，如通過(guò)SEC、RP和甚至cIEF測(cè)量的。換句話說(shuō)，精氨酸濃度可以為80至120mM，海藻糖可以為100至140mM?；谘芯?.2的發(fā)現(xiàn)，研究1.3中更詳細(xì)地探討了蛋白質(zhì)濃度的影響。發(fā)現(xiàn)低于約60mg/mL時(shí)，穩(wěn)定性分布相對(duì)平坦，但是更高的蛋白質(zhì)濃度確實(shí)導(dǎo)致單體損失。通過(guò)RPHPLC還觀察到較高蛋白濃度時(shí)一些降低的穩(wěn)定性。因此，當(dāng)考慮長(zhǎng)期儲(chǔ)存時(shí)，50mg/mL至60mg/mL的濃度將是可以使用的不損害穩(wěn)定性并且仍然允許更容易的給藥最高濃度，。盡管通過(guò)各種研究觀察到一些差異，但是已經(jīng)出現(xiàn)了最佳液體組合物的組成。制劑pH應(yīng)該為約5.7，其中0.3單位的pH變化可以被相當(dāng)好地耐受。10至15mM的檸檬酸鹽濃度是最好的，含有100mM精氨酸和117mM海藻糖的制劑也是如此?？偟膩?lái)說(shuō)，數(shù)據(jù)表明這些水平接近最佳。在大多數(shù)情況下，0.01％左右的PS80對(duì)在高溫下儲(chǔ)存的樣品有益。在40℃儲(chǔ)存確實(shí)產(chǎn)生較高M(jìn)W的聚集體，而在25℃或甚至30℃儲(chǔ)存時(shí)未觀察到。盡管如此，通過(guò)SEC測(cè)量的單體損失在不同儲(chǔ)存溫度之間大致相關(guān)。在任何情況下都沒(méi)有看到任何碎片，僅形成二聚體、低聚物和較高M(jìn)W的聚集體。當(dāng)通過(guò)RPHPLC檢查這些制劑的純度時(shí)，在5℃看到非常少的(如果有的話)純度降低。即使在25℃5個(gè)月后的純度變化也小于5％。同樣，cIEF數(shù)據(jù)表明在在25℃5個(gè)月后主峰純度損失小于10％(至多)，在5℃儲(chǔ)存時(shí)損失小于5％。這些研究結(jié)果表明，阿必魯肽在存儲(chǔ)時(shí)發(fā)生非常少的化學(xué)降解，主要降解途徑是形成可溶性聚集體。甚至，可以通過(guò)適當(dāng)?shù)呐浞胶驮?-8℃下儲(chǔ)存而使化學(xué)降解大部分停止。實(shí)施例2阿必魯肽散裝藥物物質(zhì)(BDS)通過(guò)來(lái)自合成路線B3的方法3(P3)制備。已經(jīng)探索了熱處理作為P3中的可能步驟，并且已經(jīng)由下游加工開發(fā)(DPD)證明，熱處理降低了蛋白酶活性并進(jìn)一步降低了阿必魯肽的酶降解，導(dǎo)致產(chǎn)生高效肽，其通過(guò)生物測(cè)定和RPHPLC測(cè)定。降低阿必魯肽的蛋白水解降解可能使溶液制劑成為可行。除了蛋白水解降解，聚集和氧化也是阿必魯肽在溶液中的兩種主要的降解機(jī)制。研究表明，酸性變體，主要是cIEF中的峰97，是N-末端和賴氨酸的氨基甲?；?、半胱氨酸和色氨酸的氧化。研究表明，阿必魯肽在包含5mM檸檬酸鹽、100mM精氨酸鹽酸鹽和117mM海藻糖的pH5.7的制劑中對(duì)抗溶液聚集更穩(wěn)定。在該實(shí)施例中，該制劑被稱為“優(yōu)化的”制劑。先前的研究還顯示，向當(dāng)前的凍干制劑(pH7.2,10mM磷酸鹽，153mM甘露醇，117mM海藻糖和0.01％(w/w)PS80)中添加辛酸鈉可以自替代制造方法(方法2(P2))穩(wěn)定阿必魯肽，防止其聚集。在該研究中，研究了P3和熱處理的P3材料在不同制劑中的溶液穩(wěn)定性。另外，研究了接近阿必魯肽pI的滲濾緩沖液pH對(duì)聚集的影響。本研究的目的為：1.比較P3材料和熱處理的P3材料的穩(wěn)定性。2.比較現(xiàn)有的凍干制劑和優(yōu)化的溶液制劑。3.對(duì)于非熱處理的阿必魯肽，比較P2和P3。4.評(píng)價(jià)pH(5.7和6.5)對(duì)優(yōu)化的溶液制劑的影響。5.確定蛋氨酸是否有助于防止阿必魯肽的氧化。6.確定辛酸鹽是否對(duì)P3材料具有與其對(duì)溶液中P2材料相同的穩(wěn)定作用。7.確定在pH6.5的優(yōu)化溶液制劑中，辛酸鹽是否能穩(wěn)定阿必魯肽。8.評(píng)估在滲濾過(guò)程中pH對(duì)阿必魯肽聚集的影響實(shí)驗(yàn)設(shè)定和測(cè)定材料:阿必魯肽：優(yōu)化的溶液制劑和當(dāng)前的凍干制劑中的P3和P3熱處理的材料從DPD獲得。通過(guò)DPD進(jìn)一步純化來(lái)自PD3大規(guī)模運(yùn)行的15LBlueSAHL池。另外15L(3×5L循環(huán))被熱處理和純化。由于這種材料由DPD以小規(guī)模加工，所以它不會(huì)代表足規(guī)模制造的材料。通過(guò)UFDF步驟制備阿必魯肽滲濾樣品，將緩沖劑改變?yōu)?mM檸檬酸鹽、100mM精氨酸鹽酸鹽、117mM海藻糖，pH5.0、5.7和6.5。在第一次滲濾中制備pH5.0、5.7和6.5的樣品，然而，在開始時(shí)將pH5.7的樣品在水中滲濾，然后使用pH5.7的緩沖液，并且在滲濾樣品中觀察到高度聚集體(約0.8％)。重復(fù)在pH5.7中的滲濾。小瓶：3mL玻璃小瓶，玻璃型I，未處理，GSKCometFlurotec血清塞：13mm，注射器1358，West4023/50，灰色，GSKComet制劑:關(guān)于制劑信息，參見(jiàn)表51。表51:制劑信息樣品制備和靜置將樣品在目標(biāo)制劑中在2-8℃下滲析3次。滲析后，將樣品在目標(biāo)制劑中稀釋至80mg/mL，以匹配來(lái)自DPD的優(yōu)化制劑(在優(yōu)化制劑中熱處理的P3)中的樣品濃度。準(zhǔn)備樣品并在如表52所示的以下溫度靜置。表52穩(wěn)定性測(cè)試時(shí)間表溫度時(shí)間01個(gè)月2個(gè)月3個(gè)月6個(gè)月12個(gè)月2-8℃√√√√√25℃/60％RH√√√√40℃/75％RH√√SEC,cIEF填充體積：0.5mL測(cè)定方法和驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)在時(shí)間0的樣品通過(guò)毛細(xì)管DSC分析。將樣品稀釋至1mg/mL，每個(gè)樣品的制劑緩沖液都相同。掃描速率為1℃/min。掃描開始溫度為25℃，結(jié)束溫度為95℃。對(duì)于生物測(cè)定，在時(shí)間0處一式三份分析制劑1和制劑2。對(duì)于所有其它時(shí)間點(diǎn)，進(jìn)行單次測(cè)量。表53測(cè)試方法和驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果不同制劑中的阿必魯肽穩(wěn)定性表54顯示了通過(guò)毛細(xì)管DSC測(cè)量的在時(shí)間0的不同制劑中阿必魯肽的轉(zhuǎn)變溫度、ΔH和熱解折疊曲線。表55-57顯示了在2-8℃儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)12個(gè)月、25℃儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月和40℃儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)8周后不同制劑中阿必魯肽的結(jié)果。通過(guò)pH測(cè)量的在2-8℃、25℃和40℃下不同制劑中的阿必魯肽的穩(wěn)定性、通過(guò)RP-HPLC、SEC、RP-HPLC、cIEF、CGE和滲透壓測(cè)量的蛋白質(zhì)濃度顯示在表55中。對(duì)于40℃樣品，用3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)繪制圖(SEC-HPLC和cIEF)；對(duì)2個(gè)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)不繪制圖形。通過(guò)SEC-HPLC、RP-HPLC、cIEF和非還原(NR)和還原(R)的CGE測(cè)量在2-8℃和25℃下在不同制劑中的阿必魯肽，所得結(jié)果使用SigmaPlot版本10獲得線性趨勢(shì)，以確定是否發(fā)生統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的降解。其他測(cè)定不包括在統(tǒng)計(jì)分析中，因?yàn)樵诔跏己妥罱K時(shí)間點(diǎn)之間沒(méi)有觀察到顯著差異。在2-8℃和25℃每個(gè)測(cè)定的p值和斜率示于表58中。線性回歸的斜率對(duì)應(yīng)于降解速率。如果p值≤0.1，則認(rèn)為斜率是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。如果p值≤0.1，則報(bào)告測(cè)定的降解速率。如果p值>0.1，則降解率報(bào)告為0。附錄3中包含具有統(tǒng)計(jì)顯著斜率的測(cè)定的原始數(shù)據(jù)對(duì)時(shí)間的圖。表54通過(guò)毛細(xì)管DSC測(cè)定的不同制劑中阿必魯肽在時(shí)間0時(shí)的轉(zhuǎn)變溫度表552-8℃時(shí)的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)表552-8℃時(shí)的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)(續(xù))表5625℃的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)表5625℃的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)(續(xù))表5740℃的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)在透濾過(guò)程中pH對(duì)阿必魯肽聚集的影響還研究了在透濾期間pH對(duì)阿必魯肽聚集的影響。在DPD通過(guò)UFDF在pH5.0、5.7和6.5下制備樣品。在UFDF之后，通過(guò)pH和SEC-HPLC測(cè)試樣品。結(jié)果示于表59。表59阿必魯肽在不同pH下透濾的SEC-HPLC和pH結(jié)果討論阿不魯肽P3材料在不同制劑中的穩(wěn)定性最初從DPD獲得四個(gè)樣品。它們是在10mM磷酸鹽、153mM甘露醇、117mM海藻糖、0.01％PS80(pH7.2)(現(xiàn)有凍干制劑)和在5mM檸檬酸鹽、100mM精氨酸、117mM海藻糖、0.01％PS80(優(yōu)化制劑)中的P3和熱處理的P3材料。P3和熱處理的P3材料在優(yōu)化的配方中具有較高量的聚集體和較低的滲透壓(123mOsm/kg和74mOsm/kg)，并且沒(méi)有看到SEC-HPLC中的檸檬酸鹽、精氨酸峰。本節(jié)討論了P3和熱處理的P3材料在不同制劑(F1至F7)中的穩(wěn)定性。表54的DSC結(jié)果表明，熱處理的阿必魯肽的熱穩(wěn)定性比未熱處理的材料稍微更穩(wěn)定，如Tm1所示，而不是通過(guò)T起始所示(F1相比于F2)。F3(其為5.7的pH值，5mM檸檬酸鹽、100mM精氨酸鹽酸鹽和117mM海藻糖(優(yōu)化的溶液制劑))的T起始和Tm1比制劑F1、F2、F4和F5高得多，表明阿必魯肽在優(yōu)化的溶液制劑中更為熱穩(wěn)定。F3的ΔH1比制劑F1、F2、F4和F5的更高，也指示F3更穩(wěn)定。在pH6.5、10mM磷酸鹽、100mM精氨酸鹽酸鹽和117mM海藻糖中，具有Met(F5)和不具有Met(F4)的阿必魯肽的Tm1和Tm2相似，表明Met不影響阿必魯肽的熱穩(wěn)定性。向阿必魯肽的溶液制劑(F6和F7)中添加辛酸鈉使得T起始、Tm1和Tm2更高，并且第一轉(zhuǎn)變峰非常接近第二轉(zhuǎn)變峰，表明辛酸鹽可以在溶液中熱穩(wěn)定化阿必魯肽。轉(zhuǎn)變峰的位移是由于辛酸鹽與rHSA的結(jié)合。F6和F7的增加的ΔH1也表明添加辛酸鹽增加了阿必魯肽的熱穩(wěn)定性。F1至F7在2-8℃的穩(wěn)定性F1和F2在2-8℃的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)(表55)表明，如通過(guò)所有測(cè)定法所測(cè)量的那樣，熱處理和非熱處理的阿必魯肽之間沒(méi)有差異。阿必魯肽在現(xiàn)有凍干制劑(F1和F2)的溶液中沒(méi)有比在優(yōu)化的溶液制劑和含有辛酸鈉的制劑中穩(wěn)定。對(duì)于F1和F2，在2-8℃，從0至6或12個(gè)月，SEC-HPLC的％單體下降低約0.9％，但對(duì)于其它制劑僅為約0.2-0.3％。％單體的減少對(duì)應(yīng)于峰91的增加，峰91是二聚體峰。在2-8℃下儲(chǔ)存12個(gè)月后，通過(guò)一般外觀、pH、濃度、RP-HPLC、cIEF、CGE(未還原和還原)、滲透壓和生物測(cè)定測(cè)量的所有制劑之間沒(méi)有差異，但制劑4在2-8℃6個(gè)月的CGE結(jié)果(R和NR)較低，并且制劑4在2-8℃6個(gè)月的生物測(cè)定值較高。在2-8℃6個(gè)月的制劑4樣品被污染。在樣品在2-8℃儲(chǔ)存7天后觀察到一些微生物。污染最有可能導(dǎo)致阿必魯肽的剪切，并導(dǎo)致CGE％主成分的減少、片段峰(EE560621)的存在和生物測(cè)定的增加。除了通過(guò)SEC-HPLC測(cè)量的F1和F2(現(xiàn)有凍干制劑)和通過(guò)cIEF測(cè)量的F7(使用辛酸鈉，pH6.5)測(cè)量外，所有制劑在2-8℃的降解速率沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(參見(jiàn)表54)。阿必魯肽在優(yōu)化溶液制劑中、在pH6.5、10mM磷酸鹽、100mM精氨酸鹽酸鹽和117mM海藻糖的制劑中(含有和不含蛋氨酸)和在具有10mM辛酸鈉的現(xiàn)有凍干制劑中，在2-8℃保持穩(wěn)定達(dá)至少12個(gè)月。F1至F7在25℃/60％RH的穩(wěn)定性阿必魯肽在25℃的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)(表56)表明，如所有測(cè)定所測(cè)量的那樣(F1對(duì)F2)，熱處理和非熱處理的阿必魯肽沒(méi)有差異。所有制劑的結(jié)果類似于通過(guò)一般外觀、pH、濃度和滲透壓所測(cè)量的那樣。如表56所示的SEC-HPLC結(jié)果表明，在優(yōu)化的溶液制劑(F3)中的阿必魯肽是最穩(wěn)定的。F3在6個(gè)月后具有最高的％單體峰和最低的％聚集體。具有辛酸鈉的制劑(F6和F7)比具有和不具有Met的pH6.5、10mM磷酸鹽中的制劑(F5和F4)稍微更穩(wěn)定。阿必魯肽在現(xiàn)有凍干制劑(F1和F2)溶液中顯示出最高的聚集。如表56所示的未還原的CGE結(jié)果表明，除了具有較低％主成分的F1和F2外，所有制劑都具有類似的穩(wěn)定性。還原CGE的結(jié)果如表56所示，顯示F3最穩(wěn)定。F5、F6和F7(含Met(F5)、辛酸鈉(F6和F7))比F1、F2和F4稍微穩(wěn)定一些。如表56所示的RP-HPLC和cIEF結(jié)果也表明，阿必魯肽在優(yōu)化的溶液制劑中更穩(wěn)定。具有辛酸鈉的制劑具有最低量的％主成分且沒(méi)有其它制劑穩(wěn)定。具有辛酸鹽的制劑(F6和F7)的cIEF結(jié)果顯示峰91的出現(xiàn)和峰97的增加(對(duì)于制劑6為23.1％，對(duì)于制劑7為26.3％，而對(duì)于制劑3為14.2％)。這個(gè)結(jié)果是由于蛋氨酸、半胱氨酸和色氨酸的氧化。該結(jié)果也得到了阿必魯肽產(chǎn)物相關(guān)變體表征報(bào)告的支持，其表明峰97的增加是由于N-末端和賴氨酸的氨基甲?；?、半胱氨酸和色氨酸的氧化。在現(xiàn)有凍干制劑的溶液中的阿必魯肽類似于在pH6.5、10mM磷酸鹽制劑中的阿必魯肽。具有和不具有Met的制劑具有類似的RP-HPLC和cIEF結(jié)果，表明蛋氨酸在25℃6個(gè)月沒(méi)有抑制阿必魯肽的化學(xué)降解。所有樣品在25℃3個(gè)月通過(guò)了生物測(cè)定的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)；然而，所有樣品在25℃6個(gè)月不符合生物測(cè)定驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)。25℃穩(wěn)定性數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析(表58)顯示，在所測(cè)試的所有制劑中，通過(guò)SEC，CGENR和cIEF測(cè)量，阿必魯肽具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的降解。通過(guò)SEC-HPLC測(cè)量，在25℃的優(yōu)化溶液制劑(F3)中的阿必魯肽具有最低降解速率。通過(guò)CGENR測(cè)量，制劑F3、F4、F5、F6和F7都具有相當(dāng)?shù)慕到馑俾省０⒈佤旊脑贔3和F4中具有最低的cIEF％主成分的降解率(分別為0.26％/周和0.24％/周)。F6和F7(含辛酸鹽)具有最高的cIEF％主成分的降解率(分別為0.65和1.17％/周)。通過(guò)RP-HPLC顯示，僅F6和F7(含辛酸鈉)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著降解的制劑。F4(無(wú)Met)和F5(具有Met)的降解速率的比較顯示，在25℃，向pH6.5制劑中加入蛋氨酸使降解速率增加，通過(guò)cIEF％主成分測(cè)量為從0.24％/周增加至0.26％/周，但不影響任何其他測(cè)定的降解速率?？傮w來(lái)說(shuō)，25℃的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)表明F3(優(yōu)化的制劑)是阿必魯肽的最穩(wěn)定的制劑。F1至F7在40℃/75％RH的穩(wěn)定性表57中所示的40℃的結(jié)果表明未經(jīng)熱處理的材料的穩(wěn)定性類似于熱處理材料的穩(wěn)定性(F1對(duì)F2)。表57中顯示的SEC-HPLC的結(jié)果表明F6中的阿必魯肽(具有辛酸鈉，pH7.2)是最穩(wěn)定的，具有最高百分比的單體和最低聚集百分比。在F3(優(yōu)化溶液制劑)中的阿必魯肽是第二穩(wěn)定的并且類似于F7(具有辛酸鈉，于pH6.5、10mM磷酸鹽、100mM精氨酸鹽酸鹽和117mM海藻糖中)。添加蛋氨酸不影響聚集(F4對(duì)F5)。阿必魯肽在現(xiàn)有凍干制劑(F1和F2)中具有最高的聚集速率。未還原的CGE結(jié)果與SEC-HPLC的結(jié)果相似。在F6中的阿必魯肽最穩(wěn)定，在40℃1個(gè)月后％主成分為95.8％。F2，F(xiàn)3，F(xiàn)4和F7在40℃1個(gè)月后具有類似的％主成分，其范圍為94.5％至95.1％。阿必魯肽在現(xiàn)有凍干制劑中的溶解度最不穩(wěn)定，在40℃一個(gè)月后，F(xiàn)1和F2的％主成分分別為78.2％和78.1％。表57中所示的RP-HPLC的結(jié)果表明，F(xiàn)3(優(yōu)化的溶液制劑)類似于F5(具有Met)，其是最穩(wěn)定的制劑，具有最高的％主成分和從0至6個(gè)月最小的變化。含有辛酸鈉的F7具有最低的％主成分。當(dāng)比較F4(具有Met)和F5(不具有Met)時(shí)，阿必魯肽在Met存在下更穩(wěn)定，證據(jù)為，F(xiàn)4的％主成分從0至1個(gè)月減少2.6％，而F5僅減少1.6％。表57中顯示的cIEF結(jié)果表明F5(具有Met)是最穩(wěn)定的制劑。F3類似于F4和F1，并且是第二穩(wěn)定的制劑。與RP-HPLC結(jié)果一致，F(xiàn)7(辛酸鹽，pH6.5)是最不穩(wěn)定的制劑。cIEF的結(jié)果還表明，阿必魯肽在含有Met的制劑中更穩(wěn)定。對(duì)于F4(無(wú)Met)，cIEF的％主成分從0至6個(gè)月的減少為13.8％，對(duì)于F5(具有Met)僅為9.6％。方法3和方法2的材料比較的穩(wěn)定性(F10對(duì)F11)方法3的材料(F10)比方法2的材料(F11)更穩(wěn)定，如在2-8℃儲(chǔ)存3個(gè)月后的cIEF和CGENR結(jié)果所示(表55)。F10的cIEF％主成分從74.1降至73.2，F(xiàn)11的cIEF％主成分從73.2降至68.0。未還原的CGE的％主成分對(duì)于F10沒(méi)有降低，對(duì)于F11降低1.5％。在25℃儲(chǔ)存3個(gè)月后，如RP-HPLC、cIEF和CGE(還原和未還原的)結(jié)果所示，方法3材料(F10)比方法2材料(F11)更穩(wěn)定(表56)。RP-HPLC的％主成分對(duì)于F10沒(méi)有降低，對(duì)于F11降低10.5％。F10的cIEF％主成分從74.1降至68.1，F(xiàn)11的從73.2降至56.1。對(duì)于F10，未還原的CGE的％主成分降低2.8％，F(xiàn)11減少7％。對(duì)于F10，還原CGE的％主成分從99.1降低到98.5，F(xiàn)11從99.3降低到95.9。在40℃儲(chǔ)存1個(gè)月后，如SEC-HPLC、RP-HPLC、cIEF和CGE(還原的)結(jié)果(表57)所示，方法3材料(F10)比方法2材料(F11)更穩(wěn)定。對(duì)于F10，SEC-HPLC的％單體降低17.7％，對(duì)于F11降低21.0％。％單體的減少對(duì)應(yīng)于更高階聚集體的增加(峰大于pK87)。對(duì)于F11，還觀察到了片段。對(duì)于F10，RP-HPLC的％主成分降低了6.2％，F(xiàn)11降低了11.3％。cIEF的％主成分分別對(duì)F10降低12.6％，對(duì)F11降低18.4％。對(duì)于F10，還原的CGE的％主成分降低1.4％，對(duì)F11降低3.5％。在透濾過(guò)程中pH對(duì)阿必魯肽的聚集的影響在DPD，在優(yōu)化的溶液制劑中，在pH5.0、5.7和6.5對(duì)阿必魯肽進(jìn)行透濾。所有樣品的％單體相似(表59)。在優(yōu)化的溶液制劑中，在不同pH下的樣品透濾沒(méi)有差異。結(jié)論總的來(lái)說(shuō)，結(jié)果表明熱處理和非熱處理材料之間沒(méi)有差別。除了現(xiàn)有制劑(F1和F2)外，所有測(cè)試的制劑在2-8℃持續(xù)12個(gè)月期間具有同等的穩(wěn)定性。因此，在pH5.7的優(yōu)化溶液制劑中的阿必魯肽、在具有和不具有10mM蛋氨酸和10mM辛酸鈉的pH6.5優(yōu)化制劑中的阿必魯肽、和在具有10mM辛酸鈉的現(xiàn)有制劑中的阿必魯肽，在2-8℃穩(wěn)定至少12個(gè)月。在25℃和40℃的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)表明，阿必魯肽在優(yōu)化的制劑(pH5.7，5mM檸檬酸鹽、100mM精氨酸鹽酸鹽和117mM海藻糖)中最穩(wěn)定。加入Met可以在40℃穩(wěn)定阿必魯肽；然而，在2-8℃和25℃沒(méi)有顯著的影響。類似于方法II的材料，向阿必魯肽方法III的材料添加辛酸鈉減少了聚集；然而，其增加了降解，特別是在pH6.5時(shí)，這通過(guò)RP-HPLC和cIEF測(cè)量。方法3的材料比方法2的材料更穩(wěn)定，如cIEF、RP-HPLC、SEC-HPLC和CGE結(jié)果所示。在pH5.0、5.7和6.5的優(yōu)化溶液制劑中的阿必魯肽的透濾不引起聚集。實(shí)施例3鑒定了在2℃至8℃穩(wěn)定12個(gè)月的先導(dǎo)制劑，其含有5mM檸檬酸鹽、117mM海藻糖、100mM精氨酸、～0.01％聚山梨醇酯80(pH5.9)。進(jìn)行兩個(gè)其它的制劑開發(fā)研究，以尋求當(dāng)在2-8℃儲(chǔ)存于預(yù)填充注射器(PFS)中時(shí)，相比于先導(dǎo)制劑提供改進(jìn)的阿必魯肽穩(wěn)定性的液體制劑。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)預(yù)填充注射器(PFS)的研究在PFS研究中測(cè)試的制劑列于表60中。所有制劑含有117mM海藻糖、100mM精氨酸、～0.01％(w/w)PS80，pH6.0下。在所有制劑中，阿必魯肽濃度為約100mg/mL。表60：制劑(全部含有117mM海藻糖，100mM精氨酸，0.01％(w/w)PS80，pH6.0)將所有制劑填充到體積為0.75ml的高硅酮預(yù)填充注射器(PFS)中。將制劑1另外裝入小瓶(對(duì)照)中。每種制劑和容器組合作為變體(variation)列于表61中。每個(gè)變體評(píng)估的應(yīng)激(熱、光、剪切)也提供在表61中。表61評(píng)估的變體和應(yīng)激變體制劑容器熱穩(wěn)定性研究光應(yīng)激研究剪切應(yīng)激研究A1小瓶xxB1PFS高硅酮xxxE2PFS高硅酮xxF3PFS高硅酮xxG4PFS高硅酮xxxH5PFS高硅酮xxJ7PFS高硅酮xxK8PFS高硅酮xx聚集研究基于動(dòng)態(tài)光散射(DLS)、光循環(huán)器(外部熒光)和DSC實(shí)驗(yàn)的結(jié)果設(shè)計(jì)聚集研究的制劑。DSC、DLS熱解折疊和外因熒光的結(jié)果表明，阿必魯肽的熱穩(wěn)定性隨著NaCl的增加、海藻糖的增加、精氨酸濃度的降低和半胱氨酸的添加而升高。辛酸鈉在以前的研究中表現(xiàn)出抗聚集的保護(hù)作用。然而，在以前的研究中觀察到含辛酸鹽的制劑具有較高的化學(xué)降解速率。評(píng)價(jià)具有不同pH值的含辛酸鈉的制劑以確定含辛酸鹽制劑中化學(xué)降解速率的增加和聚集速率的降低是否是pH依賴性的。還評(píng)價(jià)了具有蛋氨酸和辛酸鹽的制劑以觀察蛋氨酸是否能夠防止由辛酸鹽誘導(dǎo)的化學(xué)降解。在本研究中測(cè)試的制劑列于表62中。表62制劑(所有都為約100mg/mL，含0.01％(w/w)PS80)制劑緩沖劑辛酸鹽MetArgCysNaCl海藻糖pH高海藻糖，具有NaCl10mM檸檬酸鹽50mM200mM6.0高NaCl10mM檸檬酸鹽140mM6.0精氨酸，具有NaCl10mM檸檬酸鹽100mM140mM6.0海藻糖，具有NaCl10mM檸檬酸鹽140mM100mM6.0辛酸鹽、Met和NaCl10mM檸檬酸鹽10mM20mM140mM6.0NaCl和辛酸鹽10mM檸檬酸鹽10mM140mM6.0NaCl和辛酸鹽10mM磷酸鹽10mM140mM7.0NaCl+半胱氨酸10mM檸檬酸鹽1.36mM140mM6.0NaCl、辛酸鹽和半胱氨酸10mM磷酸鹽10mM1.36mM140mM7.0樣品制備：PFS研究將400mL的在10mM磷酸鈉鹽、117mM海藻糖、153mM甘露醇、～0.01％PS80、pH7.0中的103mg/mL的阿必魯肽濃縮至約140mg/mL，并滲析得到PFS制劑1(表1)。在2-8℃下避光滲析，120mL的阿必魯氏肽針對(duì)2L緩沖液，改變4次緩沖液，總共8L。通過(guò)添加賦形劑原料從制劑1制備制劑2-8。使用1MHCl將每種制劑調(diào)節(jié)至pH6.0，并通過(guò)0.22微米PES過(guò)濾器過(guò)濾。通過(guò)RPHPLC濃度測(cè)量所得制劑的蛋白質(zhì)濃度。通過(guò)加入相配的稀釋劑將所有制劑稀釋至100mg/mL。制劑1的濃度為～105mg/mL，對(duì)于其它制劑為97.6-99.1。這種～7％的蛋白質(zhì)濃度差異不會(huì)影響本研究的結(jié)果。注射器裝有0.75mL原料藥產(chǎn)品溶液并塞緊。對(duì)于光應(yīng)激的樣品，將注射器水平放置在1000勒克斯、25℃/65％RH的可變強(qiáng)度光穩(wěn)定室中達(dá)1周。僅測(cè)試高硅酮注射器中的光應(yīng)激的變化，以比較制劑的避光能力(變體BEFGHJK)。通過(guò)用鋁箔包裹對(duì)無(wú)光對(duì)照品進(jìn)行避光保護(hù)。通過(guò)在25℃將注射器水平放置在避光的300rpm的軌道搖床上48小時(shí)，以誘導(dǎo)剪切應(yīng)激。通過(guò)震搖僅評(píng)價(jià)對(duì)照和辛酸鈉制劑(變體A、B和G)，以評(píng)估硅酮含量和辛酸鈉對(duì)剪切誘導(dǎo)降解的影響。聚集研究將5mM檸檬酸鹽、117mM海藻糖、100mM精氨酸和～0.01％PS80、pH6.0中的阿必魯肽在10mM檸檬酸鹽、pH6.0緩沖液中滲析(以制備聚集制劑1至6和8)，且在10mM磷酸鈉、140mMNaCl、pH7.0緩沖液中滲析(以制備制劑7和9)。在2-8℃避光保護(hù)下進(jìn)行滲析，90mL的阿必魯肽使用約3.5L的緩沖液，其中更換3次緩沖液，總共10L。通過(guò)SoloVPE測(cè)量樣品的蛋白質(zhì)濃度和測(cè)量滲透壓，以確認(rèn)滲析完成。然后通過(guò)在pH6.0的10mM檸檬酸鹽，0.01％PS80中加入NaCl、海藻糖、精氨酸或半胱氨酸的儲(chǔ)液，或在pH7.0的10mM磷酸鈉鹽、140mMNaCl、0.01MNaCl、0.01％PS80中加入NaCl、海藻糖、精氨酸或半胱氨酸的儲(chǔ)液，制備表3中的目標(biāo)制劑。檢查每種制劑的pH，使用1MNaOH將制劑1至4和pH調(diào)節(jié)至6.0，對(duì)于制劑7和9調(diào)節(jié)至7.0。每個(gè)樣品通過(guò)0.2μm過(guò)濾器過(guò)濾。將每種制劑填充至注射器，其中對(duì)于除生物測(cè)定之外的所有測(cè)定，每個(gè)注射器填充0.75mL，而生物測(cè)定填充0.25mL。注射器的頂部空間為2-3mm。將樣品儲(chǔ)存在2-8℃或30℃(表64)。測(cè)試表63PFS研究的熱應(yīng)激的測(cè)試時(shí)間表溫度時(shí)間02W1M2M3M6M2-8℃√√√30℃/65％RH√√√√40℃/75％RH√√√√表64聚集研究的測(cè)試時(shí)間表討論P(yáng)FS研究由于通過(guò)RP-HPLC測(cè)量到明顯形成了峰93，因此在1個(gè)月后停止了變體K。下面的討論將集中在變體A至J的穩(wěn)定性。變體G和J在1個(gè)月后經(jīng)歷還原測(cè)試(reducedtesting)，因?yàn)橥ㄟ^(guò)RPHPLC和cIEF發(fā)現(xiàn)變體G在40℃化學(xué)降解加速，并且變體J(色氨酸/蛋氨酸)與變體H(僅蛋氨酸)相比沒(méi)有顯示益處。盡管研究在6個(gè)月結(jié)束，但是在12個(gè)月時(shí)測(cè)試變體E以獲得關(guān)于選擇為III期/商業(yè)阿必魯肽液體制劑的制劑的12個(gè)月數(shù)據(jù)點(diǎn)。2-8℃的穩(wěn)定性穩(wěn)定性數(shù)據(jù)表明，在2-8℃儲(chǔ)存至6個(gè)月后，變體A、B和F至J沒(méi)有變化，并且變體E在儲(chǔ)存12個(gè)月后沒(méi)有變化，這通過(guò)GA(一般外觀)、pH、濃度、RP-HPLC、cIEF、還原和未還原的CGE、滲透壓和生物測(cè)定測(cè)量。對(duì)于所有制劑，cIEF峰102在6個(gè)月分裂成2個(gè)峰，然而，分裂峰小于DL。SEC-HPLC的結(jié)果表明，在2-8℃儲(chǔ)存至6和12個(gè)月后，變體A至J的主峰從99.0％略微降低至98.2％，相應(yīng)地，二聚體峰從1.0％增加至～1.6％。在6個(gè)月時(shí)，所有制劑中單體的變化在0.1％內(nèi)。峰87從時(shí)間0至3個(gè)月從0.1％略微增加至0.2％然而，在3至6個(gè)月之間沒(méi)有進(jìn)一步增加。在不同制劑和容器中，在2-8℃下，阿必魯肽的穩(wěn)定性在其他測(cè)定中沒(méi)有顯著差異，除了與時(shí)間0數(shù)據(jù)(97.0％)相比變體G具有稍低的％主成分(6個(gè)月時(shí)96.3％)，其通過(guò)RP-HPLC測(cè)量。MFI數(shù)據(jù)表明玻璃小瓶中的顆粒數(shù)量低于注射器中的顆粒數(shù)量，據(jù)信這是由于不存在硅顆粒。所有顆粒中的大多數(shù)是小于10μm的顆粒，約30,000個(gè)。僅存在約300個(gè)大于10μm的顆粒。在2-8℃，總顆粒數(shù)不隨存儲(chǔ)時(shí)間增加。對(duì)于變體G，總顆粒數(shù)隨儲(chǔ)存時(shí)間稍微增加。30℃的穩(wěn)定性穩(wěn)定性數(shù)據(jù)表明，通過(guò)GA、pH、濃度、還原CGE和滲透壓測(cè)量，在30℃儲(chǔ)存至3個(gè)月后，變體A至J沒(méi)有顯著變化。在30℃儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月后，通過(guò)SEC-HPLC測(cè)量，所有制劑中阿必魯肽的純度隨時(shí)間降低，相應(yīng)地，二聚體和峰87增加。在30℃儲(chǔ)存3個(gè)月后，主峰從～99.0％降至～97.0％，二聚體峰從～1.0％增加至2.4-2.6％，峰87從0.1％增至0.3-0.4％。變體H(Met)的主峰比其他變體高0.1-0.3％。數(shù)據(jù)表明，所有變體的RP-HPLC的主峰在30℃儲(chǔ)存3個(gè)月后從～97％降低至～94％。代表6AA雜質(zhì)加上與6AA雜質(zhì)共洗脫的蛋白水解片段的峰96從2.2％-2.3％增加到3.1-3.6％，并且代表糖基化/糖化阿必魯肽的峰93從0.6-0.7％增加到1.0-1.3％。峰90也代表糖基化/糖化阿必魯肽，從<DL增加到0.4-0.6％(<QL)。在不同變體之間沒(méi)有顯著差異。cIEF結(jié)果表明，在30℃儲(chǔ)存3個(gè)月后，變體A至F和H的主峰百分比下降～10％，酸性峰從～21％增加至～27％，堿性峰從4.0-4.9％略微增加至5.7-6.4％。與其他變體(74-76％)相比，變體G(辛酸鹽)具有顯著較低的主峰(69.0％)，并停止對(duì)其的分析。變體J也被停止分析，因?yàn)槠渑c變體H相比沒(méi)有益處，且色氨酸的溶解度較低，這將使制造復(fù)雜化。未還原的CGE結(jié)果表明，所有制劑在30℃儲(chǔ)存3個(gè)月后，阿必魯肽的主峰減少約相同量(～3％)。生物測(cè)定結(jié)果顯示，由于有效肽的釋放，在30℃儲(chǔ)存3個(gè)月后，效力從～100％增加至～130％。所有變體之間沒(méi)有顯著差異?？傮w上，結(jié)果表明，通過(guò)SEC-HPLC、RP-HPLC、cIEF、未還原CGE和MFI測(cè)量，在30℃儲(chǔ)存至3個(gè)月后，阿必魯肽的穩(wěn)定性降低并且總顆粒數(shù)增加。除了含有辛酸鈉的變體G外(其通過(guò)cIEF測(cè)量具有較低的穩(wěn)定性)，所有變體表現(xiàn)出類似的穩(wěn)定性。40℃的穩(wěn)定性通過(guò)GA、pH、濃度、還原的CGE和滲透壓測(cè)量，在40℃儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)2個(gè)月后，變體A至J的穩(wěn)定性沒(méi)有顯著變化。SEC-HPLC結(jié)果顯示單體峰從～99％降低至94-95％，相應(yīng)地，二聚體從1％增加至～3.5％，峰87從0.1％增至0.4-0.7％，峰79增至1.9％。在凍干制劑中沒(méi)有觀察到代表高級(jí)聚集體的峰79，并且不在凍干藥物產(chǎn)品的說(shuō)明書中。在40℃2個(gè)月，變體F(NaCl)和E(10mM檸檬酸鹽)具有更高的單體百分比，F(xiàn)為95.1％，且E為94.9％，表明變體F和E比其他變體更穩(wěn)定。變體H(Met)具有比變體A和B略高的單體峰百分比(94.5％)，表明變體H比變體A和B更穩(wěn)定，但不如變體E和F穩(wěn)定。RP-HPLC結(jié)果表明，除了具有較高主峰(88.3％)的變體H之外，所有變體的主峰從～97％降至～86％。除變體H外，所有次要峰都以類似水平增加，代表6AA雜質(zhì)加上與6AA雜質(zhì)共洗脫的蛋白水解片段的峰96從約2.2％增加至5.8％。峰93代表糖基化/糖化阿必魯肽，從0.6％增加到～1.4％。峰90也是糖基化/糖化阿必魯肽，且峰87代表N-末端斷裂的阿必魯肽蛋白水解片段，其從<DL分別變?yōu)椤?.4％和0.4％(<QL)，變體H(Met)對(duì)于所有次要峰都具有較低水平的增加。RP-HPLC結(jié)果表明變體H更穩(wěn)定。與其他變體相比，變體G在0.5個(gè)月(94.0％)和1.0個(gè)月(90.4％)具有顯著較低的主峰，并且在1個(gè)月后停止分析。變體J也被停止分析，因?yàn)榕c變體H相比沒(méi)有益處。cIEF結(jié)果表明，主峰從74-76％降至57-58％，酸性峰從～20％增加至33-34％，堿性峰從4-5％增加至7-9％。變體G具有較低的穩(wěn)定性，并在1個(gè)月后被停止分析。結(jié)果表明，通過(guò)非還原的CGE測(cè)量，在40℃儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)2個(gè)月后，所有制劑的主峰的百分比降低～2-3％。生物測(cè)定數(shù)據(jù)顯示，在40℃儲(chǔ)存1個(gè)月后，由于釋放有效肽，變體A和B的效力從～100％增加至～180％。MFI數(shù)據(jù)表明，在40℃儲(chǔ)存2個(gè)月后總顆粒數(shù)略有增加約1-2倍。對(duì)于變體G，在40℃儲(chǔ)存1個(gè)月后，大于10μm的顆粒的數(shù)目增加?？傮w而言，結(jié)果表明，通過(guò)SEC-HPLC、RP-HPLC、cIEF、未還原CGE和MFI測(cè)量，在40℃儲(chǔ)存2個(gè)月后阿必魯肽的穩(wěn)定性降低，并且總顆粒數(shù)增加。通過(guò)SEC-HPLC測(cè)量，變體E(10mM檸檬酸鹽)和F(NaCl)更穩(wěn)定。通過(guò)RP-HPLC測(cè)量，變體H(Met)更穩(wěn)定，但是通過(guò)SEC-HPLC測(cè)量不如E和F穩(wěn)定。通過(guò)RP-HPLC和cIEF測(cè)量，變體G(辛酸鹽)具有較低的穩(wěn)定性。光的影響在25℃/65％RH，在暴露于1000勒克斯光7天后，變體A至K的外觀、pH和生物測(cè)定沒(méi)有顯著變化。通過(guò)SEC-HPLC、RP-HPLC、cIEF、CGE(NR和R)測(cè)量，變體A至K的穩(wěn)定性在暴露于光后降低。對(duì)于RP-HPLC，在暴露于光的樣品中出現(xiàn)新的峰108和峰112。通過(guò)SEC-HPLC、RP-HPLC、cIEF和CGE(NR和R)測(cè)量，含有半胱氨酸的變體K在暴露于光后具有最高穩(wěn)定性。通過(guò)SEC-HPLC和未還原的CGE測(cè)量，分別包含Met和Met/Try的變體H和J比變體B(5mM檸檬酸鹽)稍微更穩(wěn)定，并且比變體E(10mM檸檬酸鹽)和F(50mMNaCl)更穩(wěn)定，這通過(guò)SEC-HPLC、cIEF和CGE(NR和R)測(cè)量。變體B比變體E和F稍微更穩(wěn)定。變體G，其是含有辛酸鹽的制劑，在光應(yīng)激下最不穩(wěn)定，如通過(guò)SEC-HPLC和RP-HPLC所測(cè)量。SEC-HPLC數(shù)據(jù)顯示變體K的單體峰減少4.5％，變體H和J減少～6％，變體B減少7.4％，變體E和F減少8.5％，變體G減少8.9％。RP-HPLC結(jié)果顯示變體K的主峰下降～0.6％，變體H和J下降～6％，變體B下降4.9％，變體E和F下降5.7％，變體G下降11.4％。cIEF數(shù)據(jù)顯示變體K的主峰減少17.3％，變體B、H和J減少～30％，變體E和F和G減少36-38％。未還原的CGE數(shù)據(jù)顯示變體K的主峰減少1.0％，變體H和J降低～7％，變體B降低8.4％，變體E、F和G降低9.3-9.9％。還原的CGE數(shù)據(jù)顯示，變體K的主峰下降0.2％，變體H和J下降～2.3％，變體B減少2.8％，變體E、F和G減少3.2％-3.4％。震搖應(yīng)激的影響通過(guò)GA、pH、SEC-HPLC、RP-HPLC、cIEF、CGE(NR和R)和生物測(cè)定測(cè)量，在室溫下在300rpm震搖48小時(shí)后，變體B和G的穩(wěn)定性沒(méi)有明顯變化。通過(guò)SEC-HPLC測(cè)量，在震搖后，作為玻璃小瓶中的先導(dǎo)制劑的變體A具有略低的主成分百分比和更高百分比的二聚體峰，并且通過(guò)CGENR測(cè)量具有較低的主峰。這是由于玻璃瓶中的頂部空間(約2cm)高于注射器中的頂部空間(約2-3mm)。顆粒數(shù)表明，對(duì)于所有變體，顆粒數(shù)在震搖后沒(méi)有顯著變化。聚集研究該研究針對(duì)在2-8℃長(zhǎng)達(dá)2個(gè)月的樣品進(jìn)行，和針對(duì)在30℃達(dá)3個(gè)月的制劑1-6進(jìn)行。由于沒(méi)有制劑顯示比先導(dǎo)制劑(對(duì)照)具有增加的穩(wěn)定性，3個(gè)月后停止研究。在2-8℃的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)表明，對(duì)于所有制劑，沒(méi)有顯著的穩(wěn)定性變化，并且通過(guò)GA(一般外觀)、pH、濃度、未還原的和還原的CGE、滲透壓和生物測(cè)定測(cè)量，在2-8℃達(dá)2個(gè)月的所有制劑之間沒(méi)有顯著差異。通過(guò)SEC-HPLC測(cè)量的結(jié)果表明，對(duì)于所有制劑，在2-8℃儲(chǔ)存2個(gè)月后，阿必魯肽的穩(wěn)定性略有降低。制劑1和先導(dǎo)制劑(對(duì)照)是最穩(wěn)定的制劑，制劑2(高NaCl)、6(NaCl和辛酸鹽，pH6.0)和7(NaCl和辛酸鹽，pH7.0)制劑不如其它制劑穩(wěn)定。對(duì)于制劑1和先導(dǎo)制劑，SEC-HPLC單體峰降低0.2％，對(duì)于制劑2、6和7降低0.4-0.5％，對(duì)于其它制劑降低約0.3-0.4％。通過(guò)RP-HPLC測(cè)量的結(jié)果表明，先導(dǎo)制劑比所有其它制劑更穩(wěn)定，其主峰沒(méi)有減少，次要峰沒(méi)有增加。含有半胱氨酸的制劑8和9在2-8℃下不穩(wěn)定。主峰在時(shí)間0和2-8℃儲(chǔ)存1個(gè)月后顯著降低(制劑9在時(shí)間0降低35％，制劑8在1個(gè)月降低14％)，相應(yīng)地，峰96顯著增加(制劑9在時(shí)間0增加35％，制劑8在1個(gè)月時(shí)增加14％)。根據(jù)表征報(bào)告7，峰96是6AA雜質(zhì)加上與6AA雜質(zhì)共洗脫的蛋白水解片段。對(duì)于制劑1至7，主峰從～97.2％降低至～96.7％。cIEF的結(jié)果表明，先導(dǎo)制劑和制劑4比所有其它制劑稍微更穩(wěn)定，主峰沒(méi)有減少。pH6.0的含有辛酸鈉的制劑7和9和制劑8(Cys)沒(méi)有其它制劑穩(wěn)定。制劑7的主峰減少3.0％，制劑9減少1.9％，制劑8減少1.1％，對(duì)于其它制劑僅降低0.1-0.8％。對(duì)于所有樣品沒(méi)有觀察到峰102的分裂。FcRn結(jié)合的結(jié)果表明含半胱氨酸的制劑影響阿必魯肽與Fc受體的結(jié)合，并影響阿必魯肽的半衰期。對(duì)于制劑8，F(xiàn)cRn結(jié)合降低6％，對(duì)于制劑9降低16％，對(duì)于先導(dǎo)制劑沒(méi)有變化。熒光數(shù)據(jù)表明，樣品在2-8℃儲(chǔ)存2個(gè)月后，與先導(dǎo)制劑相比，制劑8(Cys)的熒光強(qiáng)度降低，制劑9(Cys和辛酸鹽)的熒光強(qiáng)度降低并且具有藍(lán)移。在樣品2-8℃儲(chǔ)存2個(gè)月后，制劑6(辛酸鹽)與先導(dǎo)制劑相比也具有較低的熒光強(qiáng)度和藍(lán)移，所有其它制劑沒(méi)有變化。MFI數(shù)據(jù)表明在2-8℃下儲(chǔ)存2個(gè)月后，制劑7和9的總顆粒數(shù)加倍。所有其他制劑無(wú)變化?？傮w上，2-8℃的數(shù)據(jù)結(jié)果表明，通過(guò)RP-HPLC和cIEF測(cè)量，先導(dǎo)制劑比其它制劑更穩(wěn)定。通過(guò)SEC-HPLC測(cè)量，先導(dǎo)制劑和制劑1(高海藻糖)更穩(wěn)定。30℃的穩(wěn)定性在30℃3個(gè)月，所有制劑沒(méi)有顯著的穩(wěn)定性變化，并且所有制劑之間沒(méi)有顯著差異，其通過(guò)GA(一般外觀)、pH、濃度、還原的CGE和滲透壓測(cè)量。SEC-HPLC結(jié)果表明，對(duì)于所有制劑，在30℃儲(chǔ)存后主峰都隨時(shí)間降低。含有辛酸鹽的制劑6、7和9是最不穩(wěn)定的制劑，單體峰從99％降低到96.2-96.7％，二聚體峰從1.0％增加到3.0-3.5％。對(duì)于其他制劑，在30℃儲(chǔ)存2個(gè)月后，單體峰從99％降低至97.0-97.6％，二聚體峰從1.0％增加至2.1-2.7％。在2個(gè)月后停止制劑7、8和9的分析，這是由于由Cys和辛酸鹽引起的化學(xué)降解(由RP-HPLC和cIEF測(cè)量)。30℃3個(gè)月的數(shù)據(jù)表明，制劑3(NaCl+Arg)和先導(dǎo)制劑比制劑1、2、4和5更穩(wěn)定。對(duì)于制劑3和先導(dǎo)制劑，單體峰從98.9％降至97.3％，二聚體峰從1.0％增加到2.2％，對(duì)于制劑1、2、4和5，單體峰從98.9％降低到96.5-96.9％，二聚體峰從1.0％增加到2.4-2.7％。RP-HPLC顯示在30℃時(shí)主峰隨時(shí)間下降，而所有次要峰隨時(shí)間增加。RP-HPLC主峰從～97％降至89.9-94.0％。峰61是6AA雜質(zhì)加上與6AA雜質(zhì)共洗脫的蛋白水解片段，其從～2％增加到3.8-7.5％。峰93是糖基化/糖化阿必魯肽，其從0.6-0.8％增加到1.2-1.5％。峰90也是糖基化/糖化阿必魯肽，其在30℃下儲(chǔ)存3個(gè)月后，從<DL增加到0.6-0.9％，峰87是N-末端斷裂的阿必魯肽蛋白水解片段，其在30℃下儲(chǔ)存3個(gè)月后，從<DL增加到0.4-0.6％(<QL)。含有半胱氨酸的制劑8和9不穩(wěn)定。在30℃儲(chǔ)存0.5個(gè)月后，主峰分別下降至59.7％和20.3％，并且峰96(代表6AA雜質(zhì)加上與6AA雜質(zhì)共洗脫的蛋白水解片段)分別增加至39.0％和77.4％。2個(gè)月后停止制劑7、8和9的分析。30℃3個(gè)月的數(shù)據(jù)表明，先導(dǎo)制劑、制劑2(高NaCl)和4(NaCl+海藻糖)比制劑1、3、5和6更穩(wěn)定。對(duì)于先導(dǎo)制劑、制劑2和4，主峰下降2.9-3.1％且峰96增加了1.1-1.6％，而對(duì)于制劑1、3、5和6，主峰減少了3.5-7.5％，峰96增加了1.9-5.5％。其它次要峰沒(méi)有顯示明顯的差異。通過(guò)cIEF測(cè)量的降解類似于所評(píng)估的制劑的RP-HPLC結(jié)果。所有制劑的主峰都下降。cIEF主峰從75.3-78.9％下降到59.4-68.9％，總酸性峰從16.9-19.9％增加到25.5-34.9％，總堿性峰從3.9-4.5％增加到4.8-6.5％。在30℃2個(gè)月的數(shù)據(jù)表明，具有辛酸鹽的制劑5、6和7以及具有Cys的制劑8和9不如其它制劑穩(wěn)定。制劑7的cIEF主峰下降～21％，制劑5、6和9主峰下降～12％至～14％，制劑8主峰下降9.3％，而制劑1-4主峰下降～8.5％。制劑7、8和9在2個(gè)月后停止分析。30℃3個(gè)月的數(shù)據(jù)表明先導(dǎo)制劑最穩(wěn)定，制劑1至4比制劑5(辛酸鹽+Met)和6(辛酸鹽)更穩(wěn)定。cIEF主峰對(duì)于先導(dǎo)制劑降低3.4％，對(duì)于制劑1-4降低7.0-8.0％，對(duì)于制劑5和6降低12.5％和13.6％。CGENR數(shù)據(jù)表明阿必魯肽的穩(wěn)定性隨時(shí)間降低，但3個(gè)月時(shí)主峰增加。這是由于不同批次的芯片和試劑的原因(不同批次的芯片用于不同的時(shí)間點(diǎn))。結(jié)果再次表明，制劑5、6、7、8和9沒(méi)有制劑1-4和先導(dǎo)制劑穩(wěn)定。在30℃儲(chǔ)存2個(gè)月后，先導(dǎo)制劑是最穩(wěn)定的。在30℃3個(gè)月的先導(dǎo)制劑的主峰下降，但所有其他制劑的主峰增加。在不同時(shí)間和用不同CGE芯片測(cè)量先導(dǎo)制劑和所有其它樣品。主峰的百分比在30℃儲(chǔ)存3個(gè)月后不應(yīng)增加，因此不可能將先導(dǎo)制劑的30℃3個(gè)月數(shù)據(jù)與其他制劑進(jìn)行比較。生物測(cè)定數(shù)據(jù)顯示在30℃儲(chǔ)存2個(gè)月后所有制劑的效力從～100％增加至～130-160％，并且在不同制劑之間沒(méi)有顯著差異。在30℃儲(chǔ)存2個(gè)月后，制劑8和制劑9的FcRn結(jié)合降低23％，并且先導(dǎo)制劑沒(méi)有變化。MFI表明在30℃儲(chǔ)存2個(gè)月后，含有辛酸鹽的制劑6和7的總顆粒數(shù)增加。所有其他制劑沒(méi)有變化?？傮w上，結(jié)果表明，通過(guò)RP-HPLC測(cè)量，含有Cys的制劑8和9具有一些新物質(zhì)。通過(guò)RP-HPLC、CIEF和未還原的CGE測(cè)量，如圖9所示，含有辛酸鹽、半胱氨酸或兩者的制劑5-9是不太穩(wěn)定的。通過(guò)SEC-HPLC測(cè)量，先導(dǎo)制劑和制劑3比其它制劑更穩(wěn)定。通過(guò)RP-HPLC測(cè)量，先導(dǎo)制劑、制劑2和4比其它制劑更穩(wěn)定。通過(guò)cIEF測(cè)量，先導(dǎo)制劑是最穩(wěn)定的制劑。結(jié)論總體上，結(jié)果表明，在PFS研究和聚集研究中指出，在PFS研究中含有辛酸鹽的制劑(變體G)降低聚集速率，但在化學(xué)降解方面不如其它制劑穩(wěn)定。通過(guò)RP-HPLC測(cè)量，即使半胱氨酸顯著保護(hù)阿必魯肽免于產(chǎn)生光誘導(dǎo)的降解，但含有半胱氨酸的制劑(在PFS研究中的變體K，在聚集研究中的制劑8和9)也非?？赡墚a(chǎn)生了新物質(zhì)。在2-8℃和30℃儲(chǔ)存2個(gè)月后，制劑8(Cys)和制劑9(Cys和辛酸鹽)具有較低的FcRn結(jié)合。HSA與FcRn的結(jié)合是pH依賴性的。三個(gè)保守的組氨酸殘基：HSA亞結(jié)構(gòu)域DIIIa中的His-464、DIIIb中的His-535和連接兩者的環(huán)中的His-510對(duì)于HSA與FcRn的pH依賴性結(jié)合是至關(guān)重要的。在評(píng)估阿必魯肽強(qiáng)制的FcRn結(jié)合的降解影響的報(bào)告中發(fā)現(xiàn)，游離Cys94氧化影響了FcRn結(jié)合。在該研究中，通過(guò)熒光測(cè)量，發(fā)現(xiàn)制劑8(Cys)和制劑9(Cys和辛酸鹽)中產(chǎn)生了三級(jí)結(jié)構(gòu)變化。Cys和辛酸鹽與HSA的結(jié)合可導(dǎo)致三級(jí)結(jié)構(gòu)改變并降低阿必魯肽與FcRn的結(jié)合。通過(guò)RP-HPLC測(cè)量，在40℃，與10mM檸檬酸鹽制劑相比，Met和Trp具有光誘導(dǎo)降解的部分降低和輕微益處，但在兩項(xiàng)研究中，在2-8℃的推薦儲(chǔ)存條件下對(duì)穩(wěn)定性沒(méi)有影響。先導(dǎo)制劑(其為5mM檸檬酸鹽、117mM海藻糖、100mM精氨酸和0.01％PS80，pH6.0)顯示出比包含NaCl或包含NaCl、海藻糖和精氨酸組合的其它制劑更好的穩(wěn)定性。推薦含有5-10mM檸檬酸鹽、117mM海藻糖、100mM精氨酸、～0.01％PS80且pH5.9-6.0的制劑。序列表<110>葛蘭素史密斯克萊有限責(zé)任公司(GlaxoSmithKline,LLC)<120>藥物組合物<130>PU65720<140>NotYetAssigned<141>2015-06-25<150>62/016,806<151>2014-06-25<160>2<170>FastSEQforWindowsVersion4.0<210>1<211>645<212>PRT<213>人類<400>1HisGlyGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGly151015GlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyArgHisGly202530GluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGlyGlnAla354045AlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyArgAspAlaHisLys505560SerGluValAlaHisArgPheLysAspLeuGlyGluGluAsnPheLys65707580AlaLeuValLeuIleAlaPheAlaGlnTyrLeuGlnGlnCysProPhe859095GluAspHisValLysLeuValAsnGluValThrGluPheAlaLysThr100105110CysValAlaAspGluSerAlaGluAsnCysAspLysSerLeuHisThr115120125LeuPheGlyAspLysLeuCysThrValAlaThrLeuArgGluThrTyr130135140GlyGluMetAlaAspCysCysAlaLysGlnGluProGluArgAsnGlu145150155160CysPheLeuGlnHisLysAspAspAsnProAsnLeuProArgLeuVal165170175ArgProGluValAspValMetCysThrAlaPheHisAspAsnGluGlu180185190ThrPheLeuLysLysTyrLeuTyrGluIleAlaArgArgHisProTyr195200205PheTyrAlaProGluLeuLeuPhePheAlaLysArgTyrLysAlaAla210215220PheThrGluCysCysGlnAlaAlaAspLysAlaAlaCysLeuLeuPro225230235240LysLeuAspGluLeuArgAspGluGlyLysAlaSerSerAlaLysGln245250255ArgLeuLysCysAlaSerLeuGlnLysPheGlyGluArgAlaPheLys260265270AlaTrpAlaValAlaArgLeuSerGlnArgPheProLysAlaGluPhe275280285AlaGluValSerLysLeuValThrAspLeuThrLysValHisThrGlu290295300CysCysHisGlyAspLeuLeuGluCysAlaAspAspArgAlaAspLeu305310315320AlaLysTyrIleCysGluAsnGlnAspSerIleSerSerLysLeuLys325330335GluCysCysGluLysProLeuLeuGluLysSerHisCysIleAlaGlu340345350ValGluAsnAspGluMetProAlaAspLeuProSerLeuAlaAlaAsp355360365PheValGluSerLysAspValCysLysAsnTyrAlaGluAlaLysAsp370375380ValPheLeuGlyMetPheLeuTyrGluTyrAlaArgArgHisProAsp385390395400TyrSerValValLeuLeuLeuArgLeuAlaLysThrTyrGluThrThr405410415LeuGluLysCysCysAlaAlaAlaAspProHisGluCysTyrAlaLys420425430ValPheAspGluPheLysProLeuValGluGluProGlnAsnLeuIle435440445LysGlnAsnCysGluLeuPheGluGlnLeuGlyGluTyrLysPheGln450455460AsnAlaLeuLeuValArgTyrThrLysLysValProGlnValSerThr465470475480ProThrLeuValGluValSerArgAsnLeuGlyLysValGlySerLys485490495CysCysLysHisProGluAlaLysArgMetProCysAlaGluAspTyr500505510LeuSerValValLeuAsnGlnLeuCysValLeuHisGluLysThrPro515520525ValSerAspArgValThrLysCysCysThrGluSerLeuValAsnArg530535540ArgProCysPheSerAlaLeuGluValAspGluThrTyrValProLys545550555560GluPheAsnAlaGluThrPheThrPheHisAlaAspIleCysThrLeu565570575SerGluLysGluArgGlnIleLysLysGlnThrAlaLeuValGluLeu580585590ValLysHisLysProLysAlaThrLysGluGlnLeuLysAlaValMet595600605AspAspPheAlaAlaPheValGluLysCysCysLysAlaAspAspLys610615620GluThrCysPheAlaGluGluGlyLysLysLeuValAlaAlaSerGln625630635640AlaAlaLeuGlyLeu645<210>2<211>31<212>PRT<213>人類<220><221>變體<222>31<223>Xaa=任意氨基酸(AnyAminoAcid)<400>2HisAlaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGly151015GlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyArgXaa202530當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3