發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及美容和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是皮膚病學(xué)領(lǐng)域。它提供了新的肽，其減少黑素細胞中黑色素的合成，因此可用作增白劑。發(fā)明背景色素沉著是由在皮膚、毛發(fā)和虹膜的色素上皮中最顯著的黑色素的合成和分布引起的。因此，皮膚、毛發(fā)和眼睛的顏色主要取決于存在的色素的類型及其濃度。黑色素是通過加成或縮合由酪氨酸形成的單體(真黑素)或酪氨酸和半胱氨酸(褐黑素)而在黑素體(即黑素細胞中包含的專門化的細胞內(nèi)細胞器)中產(chǎn)生的大分子。合成黑色素或黑色素生成的機制特別復(fù)雜，并涉及各種酶，主要是酪氨酸酶和酪氨酸相關(guān)蛋白(酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1或tyrp-1)。根據(jù)形態(tài)學(xué)標準，黑素體成熟可以分為四個階段。階段i對應(yīng)于由膜界定的具有可變量的腔內(nèi)膜的隔室。階段ii是具有特征性蛋白質(zhì)樣條紋的橢圓形結(jié)構(gòu)。從階段iii，通過沿著條紋的電子致密沉積物檢出黑色素。階段iv是內(nèi)部條紋不再可見的電子致密結(jié)構(gòu)，對應(yīng)于準備轉(zhuǎn)移到角質(zhì)形成細胞的成熟黑素體(vandenbossche等人，2006，traffic，7,769-778;raposo和marks，natrevmolcellbiol.oct2007;8(10)：786-797)。在生物發(fā)生過程中，通過轉(zhuǎn)移在前黑素體中黑色素合成的關(guān)鍵酶獲得階段iii和iv的黑素體(raposo等人，2001，j.cellbiol.152,809-824)。這種轉(zhuǎn)移特別需要稱為ap-1至ap-3的三種銜接蛋白(ap)復(fù)合物的參與，所述復(fù)合物是具有在運輸小泡中募集酶的作用的異源四聚體。雖然皮膚中的黑色素代表對uv輻射的適當保護，但是較深或過度著色的皮膚，例如色素沉著過度(例如黃褐斑或黑斑病)、雀斑(freckles，ephelides)、老年斑(著色斑)、太陽斑或脂溢性角化病，可導(dǎo)致嚴重的美容問題。這些色素斑可能由黑素細胞功能障礙誘導(dǎo)，或可能是由于事故，例如由于光敏化或損傷后瘢痕形成。太陽非常頻繁地起重要作用，并且可以實現(xiàn)預(yù)防，特別是通過具有高光保護因素的常規(guī)防曬。為了除去討厭的色素斑，可使用各種可能性，例如激光、磨皮或其它電外科手術(shù)方法和包含脫色或增白物質(zhì)的漂白霜劑。后一種選擇具有的優(yōu)點是，其顯著更便宜并且對于患者更舒適。增白分子作用于皮膚黑素細胞并干擾黑素生成的一個或多個階段。已知的脫色物質(zhì)特別是有氫醌及其衍生物、抗壞血酸及其衍生物、胎盤提取物、曲酸、煙酰胺、維生素c、嚕忻喏(rucinol)、熊果苷、植物提取物(例如來自桑樹(morusalba)或余甘子(phyllanthusemblica))、亞氨基酚類(wo99/22707)、肉堿和醌的組合(de19806947)、氨基酚酰胺衍生物(fr2772607)或苯并噻唑衍生物(wo99/24035)。然而，這些物質(zhì)存在各種缺點，例如低效率、制劑不穩(wěn)定性、短保存期限、非特異性作用或毒性、刺激性或變應(yīng)原性性質(zhì)。在過去幾年中，出現(xiàn)了使用反義寡核苷酸或肽抑制劑以使皮膚增白的新方法。例如，設(shè)想了用調(diào)節(jié)酪氨酸酶表達的反義寡核苷酸(fr2804960)、抑制ap-2或ap-3復(fù)合物與酪氨酸酶之間相互作用的肽(wo2009/010356)或直接抑制酪氨酸酶的肽(wo2009/003034)來治療色素沉著過度。已知名為kif13a的驅(qū)動蛋白能夠與ap-1的亞基相互作用(nakagawa等，cell，2000，第103卷，569-581)，并且本發(fā)明人以前表明，可以利用抑制與驅(qū)動蛋白kif13a相互作用的ap-1銜接子復(fù)合物的亞基表達的核酸來有效降低黑色素的合成(wo2009/141541)。該核酸不僅能夠破壞內(nèi)體的黑素生成酶向前黑素體的轉(zhuǎn)運，因此阻斷這些細胞器的成熟，而且能夠降低黑素生成酶的表達。因此，其構(gòu)成有效的脫色劑。然而，當使用核酸作為皮膚病劑或美容劑時，穩(wěn)定性、配制和施用途徑仍然棘手。因此，仍然需要新型皮膚增白劑，其能夠破壞前黑素體中黑素生成酶的轉(zhuǎn)運，因此具有高效力，而且具有良好的制劑性質(zhì)。發(fā)明簡述本發(fā)明的目的是提供新的皮膚增白肽劑，其是無毒的并且通過抑制ap-1銜接子復(fù)合物的亞基與驅(qū)動蛋白kif13a之間的相互作用而對黑素生成具有特異性作用。在第一方面，本發(fā)明涉及皮膚增白肽、其功能衍生物或生理學(xué)上可接受的鹽，所述肽長度為3至15個氨基酸，并且包含seqidno:1的氨基酸序列的至少三個連續(xù)氨基酸的序列。所述肽可以包含選自氨基酸序列epl、pln、lnn、nnl、nlq、lqv、qva、vav、avk和seqidno:1至16的氨基酸序列。優(yōu)選地，肽具有3至11個氨基酸的長度，更優(yōu)選3至7個氨基酸的長度。所述肽可以由選自以下氨基酸序列的氨基酸序列組成：(i)氨基酸序列epl、pln、lnn、nnl、nlq、lqv、qva、vav、avk和seqidno:1至16，和(ii)包含seqidno:1的氨基酸序列的6、7、8、9或10個連續(xù)氨基酸的任何序列。特別地，所述肽可包含選自氨基酸序列avk、vavk(seqidno:9)和qvavk(seqidno:16)的氨基酸序列，或由其組成。優(yōu)選地，所述肽包含氨基酸序列qvavk(seqidno:16)，或由其組成。在另一方面，本發(fā)明涉及編碼根據(jù)本發(fā)明的肽的核酸、包含所述核酸的表達盒、包含所述核酸或所述表達盒的表達載體和包含所述核酸、表達盒或表達載體的宿主細胞。在另一方面，本發(fā)明涉及美容或藥物組合物，其包含：根據(jù)本發(fā)明的肽、其功能衍生物或生理學(xué)上可接受的鹽，以及生理學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑。在所述組合物中，肽可以包含在脂質(zhì)體中。組合物可以進一步包含一種或幾種其它活性物質(zhì)。優(yōu)選地，所述組合物適于通過局部途徑施用。在另一方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的肽，其作為藥物。本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的肽、其功能衍生物或生理學(xué)上可接受的鹽，其用于預(yù)防或治療色素沉著過度。其還涉及治療色素沉著過度的方法，其包括向有需要的受試者施用治療有效劑量的根據(jù)本發(fā)明的肽。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的肽在制備用于治療或預(yù)防色素沉著過度的藥物中的用途。特別地，色素沉著過度可以選自：黑斑病，例如特發(fā)性黑斑病(即與妊娠或口服避孕藥的攝入均無關(guān)的黑斑病)或黃褐斑(也稱為妊娠面斑)；光化性雀斑；來自痤瘡的色素性后效應(yīng)；由于光敏化引起的色素沉著；由于擦傷、燒傷、瘢痕、皮膚病和/或接觸性變態(tài)反應(yīng)引起的炎癥后色素沉著；草地皮炎；由于毒藤(poisonivy)引起的色素沉著；雀斑；和痣，例如先天性巨痣、貝克痣(beckernevus)或斯皮茨痣(spitznevus)。在另一方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的肽、其功能衍生物或生理學(xué)上可接受的鹽作為美容劑、特別是作為皮膚增白劑、脫色劑或增亮美容劑的用途。本發(fā)明還涉及用于使人皮膚增白、脫色或增亮的美容方法，包括將本發(fā)明的美容組合物局部施用于人皮膚上。附圖說明圖1：在存在或不存在1μg所示的11種氨基酸肽(肽ai、qt、gn、ek、el、wq、ny、qf、lm、ff、lk和ri：分別為seqidno:17、28、20、1、25、27、22、21、24、23、19和26)的情況下，在4℃、旋轉(zhuǎn)條件下從hela細胞裂解物中免疫沉淀人ap-1復(fù)合物的γ-銜接蛋白亞基2小時。將免疫沉淀物加載在凝膠上用于蛋白質(zhì)印跡分析，使用特異性抗人kif13a揭示其配偶體。分子量單位為kda。圖2：在存在或不存在1μg所示肽(肽ss-5、ek-11和qk-5：分別為seqidno:28、1和16)的情況下，在4℃下、旋轉(zhuǎn)條件下從黑素細胞(mnt1)的細胞裂解物中免疫沉淀人ap-1復(fù)合物的γ-銜接蛋白亞基2小時。將免疫沉淀物加載在凝膠上用于蛋白質(zhì)印跡分析，使用特異性抗人kif13a揭示其配偶體。ek-11和ss-5肽分別用作陽性和陰性對照。分子量單位為kda。圖3：使用imagej對圖2所示的免疫沉淀的kif13a和ap-1條帶的強度進行定量。將kif13a強度除以其相應(yīng)的ap-1強度并相對于對照(無肽孵育的裂解物，第一泳道)標準化。圖4：將mnt1黑素細胞與10μmqk-5肽(seqidno:16)或作為對照的h2o一起培養(yǎng)3天。如先前所述(delevoye等人，jcellbiol.2009oct19;187(2)：247-64)進行黑色素估計，并相對于對照標準化。qk-5肽孵育減少細胞內(nèi)黑色素含量約40±0.02%。數(shù)據(jù)表示為平均值±標準偏差。*;p值(雙尾)<0.05。圖5：將mnt1黑素細胞接種在玻璃蓋玻片上，并與10μmqk-5肽(seqidno:16)或作為對照的h2o一起培養(yǎng)3天。將細胞固定在冷甲醇中，并使用兔抗人kif13a和小鼠抗人γ-銜接蛋白作為一抗以及偶聯(lián)alexa-488或546的山羊抗兔或小鼠(molecularprobes)進行共染色。將蓋玻片安裝在dabco(invitrogen)培養(yǎng)基中，并在eclipse80iupright顯微鏡(nikon)上獲得圖像并解卷積。圖像是使用imagej軟件獲得的多達15個3d圖像堆棧的最大強度z投影。通過定量重疊的kif13a和ap-1像素的強度并通過將它們相對于對照標準化來進行分析。在黑素細胞上的qk-5肽孵育減少大約84±7%的kif13a與ap-1的共定位。數(shù)據(jù)表示為平均值±標準偏差。***;p值(雙尾)<0.001。圖6：將mnt1黑素細胞接種在玻璃蓋玻片上，并與10μmqk-5肽(seqidno:16;底部圖)或作為對照的h2o(上部圖)一起培養(yǎng)3天。然后在室溫下在dmem中快速洗滌細胞，并在4℃下用2.5%戊二醛在0.1m二甲胂酸鹽緩沖液中的混合物固定90分鐘，在4℃下用1%oso4/1.5%亞鐵氰化鉀后固定45分鐘，在乙醇中脫水并包埋在epon樹脂中。在配備有keenview相機(softimagingsystem;sis，germany)的cm120電子顯微鏡(fei公司，eindoven)下觀察超薄(60-70nm)切片。與對照(上圖)相比，與qk-5肽一起孵育的黑素細胞(下圖)含有較少的黑色著色顆粒(黑素體)。比例尺：2μm。圖7：基于其在如圖6中處理的mnt1黑素細胞上的形態(tài)來定量黑素體階段。階段i和ii對應(yīng)于早期非著色黑素體，黑色素色素沉著在階段iii中開始，而階段iv是完全成熟的和著色的黑素體。計數(shù)階段并繪制為它們的總數(shù)的百分比。與對照相比，與qk-5肽一起孵育的黑素細胞減少了階段iv黑素體的數(shù)目，并伴隨地增加了較不成熟和著色的階段iii的數(shù)目。圖8：將mnt1黑素細胞與10μm的el-3或ln-3或作為對照的h2o一起培養(yǎng)3天。如先前所述(delevoye等人，jcellbiol.2009oct19;187(2)：247-64)進行黑色素估計，并相對于對照標準化。與對照相比，el-3或ln-3肽孵育使細胞內(nèi)黑色素含量降低約12%。圖9：將mnt1黑素細胞與10μmqa-3肽或ak-3肽或作為對照的h2o一起培養(yǎng)3天。如先前所述(delevoye等人，jcellbiol.2009oct19;187(2)：247-64)進行黑色素估計，并相對于對照標準化。qa-3和ak-3肽孵育減少細胞內(nèi)黑色素含量分別約22.8±7%和21.3±8%。數(shù)據(jù)表示為平均值±標準偏差。*;p值(雙尾)<0.05。圖10：與30μm的qa-3肽或ak-3肽一起孵育10天的3d人重建的著色表皮的黑色素定量。從其插入物中取出合成的表皮，并在100℃下在400μl的solvable(perkinelmer)中溶解1小時。通過測量492nm處的光密度，對200μl進行黑色素定量。將黑色素定量相對于對照標準化。qa-3和ak-3肽減少約22.5±13%或21±10%的通過合成皮膚表皮產(chǎn)生的黑色素。數(shù)據(jù)表示為平均值±標準偏差。*;p值(雙尾)<0.1。發(fā)明詳述本發(fā)明人先前顯示，ap-1銜接子復(fù)合物和驅(qū)動蛋白kif13a對于合成皮膚黑素細胞中的黑色素是必需的(wo2009/141541)。兩種蛋白質(zhì)相互作用，并且這種相互作用對于維持著色表型是關(guān)鍵的。如實驗部分所示，他們設(shè)計并測試了ap-1復(fù)合物的β1-銜接蛋白亞基的小肽(3至11個氨基酸)干擾ap-1/kif13a相互作用的能力。他們開發(fā)了一種生化測定，其中將細胞裂解物與肽一起孵育。從細胞裂解物中免疫沉淀ap-1，將免疫沉淀物加載到凝膠上用于蛋白質(zhì)印跡分析，其是通過揭示其配偶體kif13a。使用該測定，他們觀察到11個氨基酸的ek肽(seqidno:1)及其片段、特別是5個氨基酸的肽qvavk(seqidno:16)有效地降低了在皮膚黑素細胞中的ap-1/kif13a相互作用。這些結(jié)果通過以下來證實：(i)在活的皮膚黑素細胞上孵育這些肽和在孵育3天后測量色素的產(chǎn)生，(ii)免疫熒光，其顯示在細胞上孵育肽后，ap-1與kif13a的共定位減少，(iii)電子顯微術(shù)，其顯示完全成熟的著色黑素體的數(shù)目顯著減少，和(iv)將這些肽在合成的3d人重建的著色表皮上孵育，其顯示黑色素含量的顯著降低和在超微結(jié)構(gòu)水平?jīng)]有觀察到肽的細胞毒性效應(yīng)。因此，本發(fā)明人在此證實，所鑒定的肽能夠阻斷ap-1銜接子復(fù)合物和kif13a之間的相互作用，以減少黑素細胞中黑色素的產(chǎn)生，并延遲表皮黑素細胞中完全成熟的著色黑素體的形成。令人驚訝的是，小至3個氨基酸的肽導(dǎo)致合成人皮膚表皮中細胞內(nèi)黑色素含量減少約20%。這種小肽的主要優(yōu)點之一是它們可以跨細胞膜自由擴散，因此可以容易地用作用于皮膚病學(xué)和/或美容學(xué)目的的增白劑。定義如本文所用，術(shù)語“肽”、“寡肽”和“多肽”可互換使用，并且是指通過肽鍵連接的氨基酸鏈，而不管形成所述鏈的氨基酸的數(shù)目。肽可以包含來自任何天然存在的氨基酸和/或任何非天然存在的氨基酸的殘基。在本文所述的肽序列中，氨基酸由根據(jù)以下命名法的單字母代碼表示：c：半胱氨酸;d：天冬氨酸;e：谷氨酸;f：苯丙氨酸;g：甘氨酸;h：組氨酸;i：異亮氨酸;k：賴氨酸;l：亮氨酸;m：甲硫氨酸;n：天冬酰胺;p：脯氨酸;q：谷氨酰胺;r：精氨酸;s：絲氨酸;t：蘇氨酸;v：纈氨酸;w：色氨酸；和y：酪氨酸。構(gòu)成本發(fā)明的肽的氨基酸可以是l或d構(gòu)型，優(yōu)選l構(gòu)型。根據(jù)本發(fā)明的肽可以包含一個或多個氨基酸，其是非常見的、合成的或化學(xué)修飾的氨基酸，特別是乙?；被?例如n-乙?；?l-丙氨酸)、酰胺化氨基酸(例如l-丙氨酸酰胺)、甲?；被?例如n-甲酰基-l-甲硫氨酸)、羥基化氨基酸(例如羥基脯氨酸、羥基賴氨酸、別羥基賴氨酸)、脂質(zhì)綴合的氨基酸(例如n6-肉豆蔻酰-l-賴氨酸)、乙基化或甲基化的氨基酸(例如n-甲基-l-丙氨酸、6-n-甲基賴氨酸、n-乙基甘氨酸、n-甲基甘氨酸、n-乙基天冬酰胺、別異亮氨酸、n-甲基異亮氨酸、n-甲基纈氨酸)、磷酸化氨基酸(例如n6-磷酸-l-賴氨酸)或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它非常見的、合成的或化學(xué)修飾的氨基酸，例如鳥氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、β-丙氨酸、苯基甘氨酸、高精氨酸和環(huán)己基丙氨酸。根據(jù)本發(fā)明的肽分子還可以包含促進分子穿透進入細胞的元件。特別地，該元件是促進分子的細胞穿透的肽(cpp：細胞穿透肽元件)。這些肽是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(例如，vivès等，biochimic＆biophysicaacta，2008,1786,126-138)。例如但不限于，促進細胞穿透的肽可以選自tat肽、觸足肽或穿膜蛋白(penetratin)肽和富含精氨酸和/或賴氨酸的肽，特別是聚精氨酸。本文中使用的術(shù)語“ap-1”是指在反式高爾基體和內(nèi)吞網(wǎng)絡(luò)中起作用的ap-1銜接子復(fù)合物。它不應(yīng)該與同一名稱的轉(zhuǎn)錄因子混淆，該轉(zhuǎn)錄因子由通過jun和fos家族成員的基因編碼的蛋白質(zhì)組成。ap-1銜接子復(fù)合物由4個亞基γ、β1、σ1和μ1組成。ap-1的γ、β1、σ1和μ1亞基的geneid登錄號分別為geneid164、geneid162、geneid1174和geneid8907。術(shù)語“kif13a”、“驅(qū)動蛋白樣蛋白kif13a”或“驅(qū)動蛋白kif13a”是指一種正端定向的微管依賴性動力蛋白，其參與細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運和調(diào)節(jié)各種過程，例如甘露糖-6-磷酸受體(m6pr)轉(zhuǎn)運到質(zhì)膜、黑素體生物發(fā)生期間的內(nèi)體分選、內(nèi)體生物發(fā)生和胞質(zhì)分裂再循環(huán)。人驅(qū)動蛋白kif13a的geneid登錄號是geneid63971。uniprot登錄號為q9h1h9。術(shù)語“黑色素(melanin/melanins/melanicpigments)”和“色素”在本文中可互換使用。它們包括可能在黑素體中合成的各種色素，包括真黑素或褐黑素。如本文所用，術(shù)語“約”是指指定值的值±10%的范圍。例如，“約20”包括20的±10%，或18至22。優(yōu)選地，術(shù)語“約”是指指定值的值±5%的范圍。在第一方面，本發(fā)明涉及一種分離的皮膚增白肽、其功能衍生物或生理學(xué)上可接受的鹽，所述皮膚增白肽具有3至15個氨基酸的長度并且包含eplnnlqvavk(seqidno:1)肽的至少三個連續(xù)氨基酸的序列。在實驗部分中，本發(fā)明人顯示，跨越eplnnlqvavk序列的幾種3個氨基酸的肽能夠有效地減少皮膚黑素細胞以及合成表皮的色素沉著。因此，在一個實施方案中，所述肽包含以下序列，由其組成或基本上由其組成：-eplnnlqvavk序列的三個連續(xù)氨基酸的序列，即選自氨基酸序列epl、pln、lnn、nnl、nlq、lqv、qva、vav和avk的氨基酸序列；-eplnnlqvavk序列的四個連續(xù)氨基酸的序列，即選自氨基酸序列epln(seqidno:2)、plnn(seqidno:3)、lnnl(seqidno:4)、nnlq(seqidno:5)、nlqv(seqidno:6)、lqva(seqidno:7)、qvav(seqidno:8)和vavk(seqidno:9)的氨基酸序列；或-eplnnlqvavk序列的五個連續(xù)氨基酸的序列，即選自氨基酸序列eplnn(seqidno:10)、plnnl(seqidno:11)、lnnlq(seqidno:12)、nnlqv(seqidno:13)、nlqva(seqidno:14)、lqvav(seqidno:15)和qvavk(seqidno:16)的氨基酸序列。在另一個實施方案中，所述肽包含含有seqidno:1的氨基酸序列的6、7、8、9或10個連續(xù)氨基酸的任何序列，由其組成或基本上由其組成。在另一個實施方案中，肽包含seqidno:1的氨基酸序列、由其組成或基本上由其組成。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的肽包含選自氨基酸序列epl、pln、lnn、qva、vav、avk、lqva(seqidno:7)、qvav(seqidno:8)、vavk(seqidno:9)和qvavk(seqidno:16)的氨基酸序列，由其組成或基本上由其組成。優(yōu)選地，所述肽包含選自氨基酸序列epl、lnn、qva、avk、vavk(seqidno:9)和qvavk(seqidno:16)的氨基酸序列，由其組成或基本上由其組成。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的肽包含選自氨基酸序列avk、vavk(seqidno:9)和qvavk(seqidno:16)的氨基酸序列，由其組成或基本上由其組成。優(yōu)選地，所述肽包含選自氨基酸序列avk和qvavk(seqidno:16)的氨基酸序列，由其組成或基本上由其組成。更優(yōu)選地，所述肽包含氨基酸序列qvavk(seqidno:16)、由其組成或基本上由其組成。如本文所用，術(shù)語“基本上由...組成”是指允許至多兩個置換或一個缺失或添加，即肽的氨基酸序列可以與特定序列具有一個或兩個氨基酸差異。優(yōu)選地，該術(shù)語是指肽具有與特定序列具有至少90%、更優(yōu)選至少95%同一性的氨基酸序列。在優(yōu)選的實施方案中，該術(shù)語是指肽的氨基酸序列與指定序列具有一個氨基酸差異(置換、缺失或插入)。在一個優(yōu)選的實施方案中，如上公開的本發(fā)明的肽表現(xiàn)出皮膚增白活性和/或干擾或抑制ap-1和kif13a之間的相互作用。當本發(fā)明的肽還包含額外的氨基酸殘基時，這些殘基可以添加到c-和/或n-末端。本發(fā)明的肽具有3至15個氨基酸的長度。因此，肽可以具有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個氨基酸的長度。優(yōu)選地，肽具有3至11個氨基酸的長度，更優(yōu)選3至7個氨基酸的長度。在一個具體的實施方案中，肽具有3至5個氨基酸的長度，優(yōu)選具有5個氨基酸的長度。為了通過提高肽對肽酶的抗性來增強肽的穩(wěn)定性，可以將保護基添加到c-和/或n-末端而不改變肽的活性。例如，n末端的保護基可以是?；蛞阴；?，c末端的保護基可以是酰胺化或酯化。蛋白酶的作用也可以通過使用d構(gòu)型的氨基酸，通過在c-和n-末端之間形成二硫橋、內(nèi)酰胺環(huán)或鍵而環(huán)化肽來阻斷。本發(fā)明的肽還可以包含替換“經(jīng)典”conh肽鍵并賦予對肽酶增強的抗性的假肽鍵，例如choh-ch2、nhco、ch2-o、ch2ch2、co-ch2、n-n、ch=ch、ch2nh和ch2-s。本發(fā)明還包括如上所述的本發(fā)明的肽的功能衍生物。本文所用的術(shù)語“功能衍生物”是指模擬本發(fā)明的肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)并保留所述肽的功能性質(zhì)的分子。例如，所述功能衍生物可以是逆肽(retropeptide)、逆反肽(retro-inversopeptide)、肽模擬物(如類肽或β-肽)或具有甲基化酰胺鍵的肽。設(shè)計肽類似物的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。本發(fā)明還包括根據(jù)本發(fā)明的肽的生理學(xué)上可接受的鹽。生理學(xué)上可接受的鹽可以是例如：生理學(xué)上可接受的無機酸的鹽，例如鹽酸、氫溴酸、硫酸和磷酸的鹽；生理學(xué)上可接受的有機酸的鹽，例如乙酸、檸檬酸、馬來酸、蘋果酸、琥珀酸、抗壞血酸和酒石酸的鹽；生理上可接受的無機堿的鹽，例如鈉、鉀、鈣、鎂或銨的鹽；或通常用于制藥技術(shù)的含有可成鹽氮的有機堿的鹽。制備所述鹽的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。根據(jù)本發(fā)明的肽可以通過熟知的方法例如經(jīng)典化學(xué)合成(在固相或均相液相中)或通過酶促合成(kullmannw，1987，enzymaticpeptidesynthesis，crcpress，florida)獲得。它還可以通過包括下述步驟的方法獲得：培養(yǎng)例如下文所述的宿主細胞，其包含編碼所述肽的轉(zhuǎn)基因并表達所述肽；并從所述宿主細胞或從分泌有所述肽的培養(yǎng)基中提取所述肽。本發(fā)明的肽還可以從天然蛋白質(zhì)獲得；即通過動物、植物或微生物來源的蛋白質(zhì)的受控水解。水解可以對粗提取物或分離或純化的蛋白質(zhì)進行。因此，本發(fā)明的肽可以是天然或合成來源的。優(yōu)選地，肽通過化學(xué)合成獲得。如本文所用，術(shù)語“皮膚增白”、“皮膚增亮”、“皮膚脫色”或“皮膚漂白”劑是指能夠抑制或減少黑素細胞中黑色素合成并因此使皮膚增白的活性劑，即本發(fā)明的肽。該活性優(yōu)選是由于ap-1和kif13a之間的相互作用的干擾或抑制。本發(fā)明的肽的皮膚增白活性可以通過評估肽對ap-1銜接子復(fù)合物和kif13a之間的相互作用的影響而容易地確定。具體地，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以進行如實驗部分中公開的生化測定，即生化測定包括將細胞裂解物與本發(fā)明的肽或者其功能衍生物或生理學(xué)上可接受的鹽一起孵育，從細胞裂解物免疫沉淀ap-1，并通過此免疫沉淀物的蛋白質(zhì)印跡分析揭示其配偶體kif13a?？缮藤彨@得針對ap-1(特別是γ-銜接蛋白亞基)和kif13a的單克隆或多克隆抗體(小鼠單克隆抗γ-銜接蛋白，sigmaaldrich；兔多克隆抗kif13a，bethyllaboratories，inc.)。當本發(fā)明的肽能夠破壞ap-1銜接子復(fù)合物和kif13a之間的相互作用時，即當與無肽孵育的細胞裂解物相比，ap-1和kif13a的共免疫沉淀顯著降低時，本發(fā)明的肽顯示出皮膚增白活性?；蛘?，可以通過免疫熒光觀察在與或不與本發(fā)明的肽一起孵育的細胞中ap-1和kif13a的細胞定位，來測定肽的皮膚增白活性。使用該測定，當與肽一起孵育的細胞中ap-1和kif13a的細胞共定位與無肽孵育的細胞相比顯著降低時，肽顯示出皮膚增白活性。肽的皮膚增白活性也可以通過電子顯微鏡檢查觀察在與或不與本發(fā)明的肽一起孵育的細胞中成熟的著色黑素體的數(shù)量來測定。使用該測定，當與肽一起孵育的細胞中成熟的著色黑素體的數(shù)量與無肽孵育的細胞相比顯著減少時，肽顯示出皮膚增白活性。肽的皮膚增白活性可以進一步通過測量與肽一起孵育的黑素細胞(例如mnt-1細胞)的黑色素含量來確定。例如，該測定可以如下進行：在第1天，將105個mnt-1細胞接種在6孔板中;從第2天至第4天，在包含10μm肽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞;在第5天，通過在50mmtris-hcl，ph7.4，2mmedta，150mmnacl，1mm二硫蘇糖醇和蛋白酶抑制劑中超聲處理破碎細胞。在4℃下以20,000g沉淀色素15分鐘，在乙醇/乙醚(1:1)中漂洗一次，并在60℃下溶于2mnaoh/20%二甲基亞砜中;黑色素含量測量為492nm處的光密度。使用該測定，當與本發(fā)明的肽一起孵育的細胞中的黑色素的量與無肽孵育的細胞的黑色素含量相比顯著減少時，所述肽顯示出皮膚增白活性。如本文所用，術(shù)語“顯著降低”是指用不與本發(fā)明的肽一起孵育的細胞獲得的值(即用其中本發(fā)明的肽僅用稀釋劑例如h2o代替的對照樣品獲得的值)的至少10%、15%、20%、25%、30%、35%或40%降低。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的肽誘導(dǎo)與所述肽一起孵育的黑素細胞(例如mnt-1細胞)的黑色素含量減少至少20%，優(yōu)選至少40%。本發(fā)明還涉及編碼根據(jù)本發(fā)明的肽的核酸。在本發(fā)明的精神中，“核酸”應(yīng)理解為是指基于dna或rna的任何分子。這些可以是合成的或半合成的重組分子，可能擴增或克隆到載體中，化學(xué)修飾的，包含非天然堿基或修飾的核苷酸(包含例如修飾的鍵、修飾的嘌呤或嘧啶堿基或修飾的糖)。根據(jù)本發(fā)明的核酸可以是單鏈或雙鏈的dna和/或rna的形式。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，核酸是通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的重組技術(shù)合成的分離的dna分子。根據(jù)本發(fā)明的核酸可以從根據(jù)本發(fā)明的肽的序列推導(dǎo)，并且可以根據(jù)其中核酸將被轉(zhuǎn)錄的宿主細胞來改變密碼子使用。這些步驟可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進行，其中一些描述在參考手冊sambrook等人，(sambrookj，russelld(2001)molecularcloning：alaboratorymanual，第三版，coldspringharbor)。本發(fā)明還涉及包含與其表達所需的序列可操作地連接的根據(jù)本發(fā)明的核酸的表達盒。特別地，核酸可以處在允許其在宿主細胞中表達的啟動子的控制下。通常，表達盒由允許啟始轉(zhuǎn)錄的啟動子、根據(jù)本發(fā)明的核酸和轉(zhuǎn)錄終止子構(gòu)成，或包含允許啟始轉(zhuǎn)錄的啟動子、根據(jù)本發(fā)明的核酸和轉(zhuǎn)錄終止子。術(shù)語“表達盒”表示包含可操作地連接的編碼區(qū)和調(diào)節(jié)區(qū)的核酸構(gòu)建體。表述“可操作地連接”表示元件以這樣的方式組合，其使得編碼序列(目的基因)的表達和/或編碼的肽的靶向處在轉(zhuǎn)錄啟動子和/或信號肽的控制下。本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明的核酸或表達盒的表達載體。所述表達載體可以用于轉(zhuǎn)化宿主細胞并使得能夠在所述細胞中表達本發(fā)明的核酸。載體可以是dna或rna，環(huán)狀或非環(huán)狀，單鏈或雙鏈的。有利地，其選自質(zhì)粒、噬菌體、噬菌粒、病毒、粘粒和人工染色體。有利地，表達載體包含允許表達根據(jù)本發(fā)明的核酸的調(diào)節(jié)元件。這些元件可以含有例如轉(zhuǎn)錄啟動子、轉(zhuǎn)錄激活子、終止子序列、起始密碼子和終止密碼子。根據(jù)期望在其中表達的宿主細胞選擇所述元件的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。載體還可以含有使其能夠在宿主細胞中選擇的元件，例如抗生素抗性基因或提供與宿主細胞基因組缺失的相應(yīng)基因的互補物的選擇性基因。這樣的元件是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并且在文獻中廣泛描述。本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的核酸、表達盒或表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細胞的用途。宿主細胞可以以瞬時或穩(wěn)定的方式轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染，并且核酸、盒或載體可以以附加體形式或染色體形式包含在細胞中。本發(fā)明涉及包含根據(jù)本發(fā)明的核酸、盒或表達載體的宿主細胞。根據(jù)一個實施方案，宿主細胞是微生物，優(yōu)選細菌或酵母。根據(jù)另一個實施方案，宿主細胞是動物細胞，例如哺乳動物細胞，例如cos或cho細胞。在一個具體的實施方案中，所述細胞是非人的和非胚胎的。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的皮膚增白肽的方法，包括用根據(jù)本發(fā)明的核酸、表達盒或表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細胞；培養(yǎng)轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化的細胞；并回收由所述細胞產(chǎn)生的肽。用于產(chǎn)生重組肽的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的肽的方法，包括將根據(jù)本發(fā)明的核酸、盒或表達載體插入體外表達系統(tǒng)(也稱為無細胞的)，并回收由所述系統(tǒng)產(chǎn)生的肽。許多體外或無細胞表達系統(tǒng)是可商購的，并且所述系統(tǒng)的使用是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。另一方面，本發(fā)明涉及美容或藥物組合物，其包含：本發(fā)明的皮膚增白肽或者其功能衍生物或生理學(xué)上可接受的鹽，和生理學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑。優(yōu)選地，組合物的制劑適于局部施用，即組合物是局部組合物。本文使用的術(shù)語“生理學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑”是指優(yōu)選適于局部施用到皮膚上，與本發(fā)明的肽和包含在組合物中的任何其它活性物質(zhì)相容，并不會造成任何不良的安全或毒性問題的載體或賦形劑。載體或賦形劑可以是美容上或藥學(xué)上可接受的，這取決于所需的性質(zhì)概況。本發(fā)明的組合物可以包含約50%至約99.99%的載體和/或賦形劑，優(yōu)選約80%至約99.9%，更優(yōu)選約90%至約95%。根據(jù)本發(fā)明的組合物可以以通常用于局部施用的任何蓋侖制劑形式存在。特別地，組合物可以是固體、半固體或液體。其可以是例如白色或有色粉末、軟膏、糊劑、乳膏、流體、乳液、化妝水、洗劑、漿液、水性或油性凝膠、水性水醇溶液或油性溶液、水包油或油包水或多重乳液、泡沫、面膜、水性貼或無水貼、油在聚合物相(例如納米球和納米膠囊)中的分散體的形式。任選地，組合物可以以氣霧劑的形式施用于皮膚。它還可以作為貼劑、筆、刷子和施用器提供，用于在面部或手部的斑點上局部施用。它可以用作護膚產(chǎn)品和/或化妝產(chǎn)品。優(yōu)選地，組合物包括水。更優(yōu)選地，組合物為水包油、油包水或硅包水乳液的形式。當本發(fā)明的組合物是乳液時，與組合物的總重量相比，油相的比例范圍可以為5重量%至80重量%，優(yōu)選5重量%至50重量%。以乳液形式用于組合物中的油、乳化劑和共乳化劑選自在相關(guān)領(lǐng)域中常規(guī)使用的那些。乳化劑和共乳化劑以相對于組合物的總重量為0.3重量%至30重量%、優(yōu)選0.5重量%至20重量%范圍的比例存在于組合物中。合適的油的實例包括但不限于：礦物油，例如礦脂或石蠟油；植物來源的油，例如鱷梨、大豆或霍霍巴油；動物來源的油，如羊毛脂；合成油如苯甲酸烷基酯，和支鏈烴如聚丁烯、全氫化角鯊烯；硅油，例如環(huán)甲硅油、二甲硅油和苯基二甲硅油；和氟化油，例如全氟聚醚。也用作脂肪物質(zhì)的有：脂肪醇，如鯨蠟醇；脂肪酸；或蠟，如巴西棕櫚蠟、蜂蠟、聚乙烯蠟或地蠟。合適的乳化劑和共乳化劑的實例包括但不限于脂肪酸和聚乙二醇的酯(例如peg-20硬脂酸酯)和脂肪酸和甘油的酯(例如硬脂酸甘油酯)。或者，在組合物中含有的本發(fā)明的肽可以包封在脂質(zhì)體中。如本文所用，“脂質(zhì)體”是指人工制造的且由磷脂層組成的小囊泡，其通過水性隔室彼此分離。它們具有非常接近細胞膜的結(jié)構(gòu)，這使得它們能夠與它們?nèi)诤希瑫r釋放它們含有的活性成分。合適的脂質(zhì)體的實例包括但不限于多層脂質(zhì)體或mlv(多層囊泡)、小單層脂質(zhì)體或suv(小單層囊泡)或大單層脂質(zhì)體或luv(大單層囊泡)或secosomes(表面活性劑-乙醇-膽固醇-體)，如geusens等人，2010(advancedfunctionalmaterials.2010.pp.4077-4090)中所述。脂質(zhì)體也可以是其壁不由磷脂組成而是由非離子脂質(zhì)組成的非離子脂質(zhì)體。組合物還可以包含其它添加劑，包括但不限于硅酮彈性體、表面活性劑、增稠劑、膠凝劑、保濕劑、促進經(jīng)皮吸收的試劑、著色劑、防腐劑、光學(xué)改性劑、螯合劑(例如edta的鹽)和/或香味劑。這樣的添加劑和其它添加劑的實例見述于由personalcareproductscouncil出版的internationalcosmeticingredientdictionary＆handbook，第15版，2014。這些各種添加劑的量是在相關(guān)領(lǐng)域中常規(guī)使用的量。根據(jù)其性質(zhì)，這些添加劑可以引入油相、水相、脂質(zhì)囊泡和/或納米顆粒中?；蛘?，本發(fā)明的組合物也可適于腸胃外給藥，即組合物可以是可注射的組合物。本文所用的術(shù)語“可注射組合物”是指適合注射入人和/或動物的組合物，其中所述注射優(yōu)選為皮內(nèi)或皮下注射。這些組合物必須是無菌的、無熱原的且在生理學(xué)上可接受的ph。合適的可注射制劑可以含有防腐劑，例如苯甲酸鈉，對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯等，并且在25攝氏度下可具有6.8-8.0的ph。優(yōu)選通過緩沖液維持ph。合適的緩沖劑包括乙酸鹽緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇、甘氨酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、tris緩沖液等。組合物可包含一種或幾種(例如2、3、4或5種)本發(fā)明的肽或者其功能衍生物或生理學(xué)上可接受的鹽。在一個優(yōu)選的實施方案中，組合物包含至少一種包含氨基酸序列qvavk(seqidno:16)或由其組成的肽。該組合物包含有效量的本發(fā)明的肽。本申請中使用的術(shù)語“有效量”是本發(fā)明的皮膚增白肽的量，其能夠顯著降低黑色素的合成。這種降低尤其可導(dǎo)致皮膚顏色的可見變化。該降低可以例如是未處理細胞中存在的黑色素量的5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%或40%。例如，相對于組合物的總重量，有效量可以為0.001至20重量%，優(yōu)選0.01至10重量%，更優(yōu)選0.1至5重量%。本發(fā)明的組合物可以進一步包含一種或幾種另外的活性物質(zhì)。在一個實施方案中，本發(fā)明的肽與一種或幾種其它皮膚增白劑混合。這樣的增白劑的實例包括但不限于鞣花酸(kamide等人，nishinihonjdermatol.1995;57：136-142)、熊果苷(sugai等人，skinres(hifu)1992;34：522-529)、間苯二酚、嚕忻喏(4-正丁基間苯二酚)(katagiri等人jcosmetchemjpn.2001;35：42-49)、曲酸(mishima等人，skinres(hifu)1994;36：134-150)、胎盤提取物(itoh.fragrancej.1990：6,67-71)、植物提取物(包括水仙(narcissustazetta)、桑樹(morusalba)、余甘子(phyllanthusemblica)、長春花(catharanthusroseus)、fomesjaponicus、靈芝(ganoderma)、春黃菊(chamomilla)(kawashima等人，nishinihonjdermatol.1999;61：682-685)和光果甘草(glycyrrhizaglabra)提取物)、光甘草定、抗壞血酸及其衍生物(如l-抗壞血酸-2-磷酸、l-抗壞血酸-2-磷酸鈉、l-抗壞血酸2-葡萄糖苷和l-抗壞血酸乙酯(maeda等人jjpncosmetscisoc.2003;27：257-268;kumano等人j.nutr.sci.vitaminol.1998;44：345-359;kameyama等人j.am.acad.dermatol.1996;34：29-33;miyai等人nishinihonjdermatol.1996;58：439-443))、亞油酸(shigeta等人，biol.pharm.bull.2004;27：591-594)、氨甲環(huán)酸(mafune等人，farumashia.2008;44：437-442)、氨甲環(huán)酸十六烷基酯鹽酸鹽、4-甲氧基水楊酸鉀、腺苷單磷酸二鈉鹽(kawashima等人jpnjclindermatol.2008;62：250-257)、5,5'-二丙基-聯(lián)苯-2,2'-二醇)(magnolian?)(takeda等人nishinihonjdermatol.2006;68：293-298)、4-(4-羥基苯基)-2-丁醇、半胱氨酸、4-硫代間苯二酚(ep0623341)、5-羥基-2-羥甲基-γ-吡啶酮、煙酰胺、亞氨基酚類(wo99/22707)、肉堿和/或醌(de19806947)、氨基苯酚酰胺衍生物(fr2772607)、苯并噻唑衍生物(wo99/24035)、泛酸鹽、甘草酸、氫醌β-葡萄糖苷和inulavosin(pigmentcellmelanomares.2004may;27(3)：376-86)。組合物還可以包含旨在增強所需效果的另外的活性物質(zhì)，例如：有機或無機防曬劑；角質(zhì)軟化劑和/或剝脫劑，例如水楊酸、乙醇酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸；保濕劑；潤膚劑；收斂劑；防腐劑；抗糖化和/或抗氧化劑，例如生育酚、硫代?；撬?、次?；撬?、氨基胍、焦磷酸硫胺、吡哆胺、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、吡哆醇、腺苷三磷酸；多元醇，如甘油、乙二醇或丙二醇；維生素，如維生素a、e、k；視黃酸、視黃醛、視黃醇；棕櫚酸鹽、丙酸鹽或乙酸鹽；透明質(zhì)酸；抗炎劑；舒緩劑；和/或脫氧核糖核酸或核糖核酸。本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的肽、其功能衍生物或生理學(xué)上可接受的鹽作為美容劑、特別是作為皮膚增白美容劑的用途。本發(fā)明還涉及用于增白人皮膚的美容方法，包括將本發(fā)明的美容組合物局部施用于人皮膚上。優(yōu)選地，每天施用本發(fā)明的美容組合物，更優(yōu)選每天施用兩次。本發(fā)明還涉及用于增白人皮膚的美容方法，包括腸胃外給予本發(fā)明的美容組合物。優(yōu)選地，所述組合物是皮內(nèi)或皮下施用的。在另一方面，本發(fā)明涉及作為藥物的本發(fā)明的皮膚增白肽。本發(fā)明還涉及用于預(yù)防或治療色素沉著過度的本發(fā)明的肽或組合物。本發(fā)明還涉及治療色素沉著過度的方法，包括向有需要的受試者施用有效劑量的本發(fā)明的肽或組合物。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的肽或組合物在制備用于治療或預(yù)防色素沉著過度的藥物中的用途。優(yōu)選地，待治療的受試者是哺乳動物，更優(yōu)選人。色素沉著過度的特征在于黑色素的累積，并且常常導(dǎo)致不規(guī)則的色素沉著模式。特別地，本發(fā)明的肽或組合物可用于增白著色斑的皮膚，并因此使受試者的皮膚色素沉著均勻化。色素沉著過度可以選自：黑斑病，例如特發(fā)性黑斑病(即與妊娠或口服避孕藥的攝入均無關(guān)的黑斑病)或黃褐斑(也稱為妊娠面斑)；光化性雀斑(也稱為衰老性著色斑、老年斑、太陽斑、老化斑或雀斑)；來自痤瘡的色素性后效應(yīng)；由于擦傷、燒傷、瘢痕引起的炎癥后色素沉著；由于光敏化、皮膚病和/或接觸性變態(tài)反應(yīng)引起的色素沉著；草地皮炎；由于毒藤引起的色素沉著；雀斑；和痣，例如先天性巨痣、貝克痣或斯皮茨痣。本發(fā)明的其它方面和優(yōu)點將在以下實施例中描述，這些實施例應(yīng)當被認為是說明性的而不是限制性的。實施例材料和方法肽設(shè)計和制備本發(fā)明人設(shè)計了跨越位于人ap-1的β1-銜接蛋白亞基的第813和890個氨基酸之間的區(qū)域的11、5或3個氨基酸的肽。所有的肽由proteogenix(oberhausbergen，france)合成。凍干的肽根據(jù)制造商的建議在h2o或二甲基亞砜(dmso)/h2o(1v/3v)中稀釋。下表列出了肽序列。肽名稱肽序列ai-11aplspnqtvei(seqidno:17)qt-11qtveislplst(seqidno:18)lk-11lplstvgsvmk(seqidno:19)gn-11gsvmkmeplnn(seqidno:20)ek-11eplnnlqvavk(seqidno:1)qf-11qvavknnidvf(seqidno:21)ny-11nidvfyfstly(seqidno:22)ff-11fstlyplhilf(seqidno:23)lm-11lhilfvedgkm(seqidno:24)el-11edgkmdrqmfl(seqidno:25)ri-11rqmflatwkdi(seqidno:26)wq-11wkdipneneaq(seqidno:27)en-5eplnn(seqidno:10)nv-5nnlqv(seqidno:13)ss-5stvgs(seqidno:28)qk-5qvavk(seqidno:16)el-3eplln-3lnnqa-3qvaak-3avk細胞培養(yǎng)將hela細胞維持在補充有10%fbs和抗生素的dmem(invitrogen)中。將mnt-1細胞維持在補充有10%aim-v培養(yǎng)基、20%fcs、非必需氨基酸、丙酮酸鈉和抗生素的dmem(invitrogen)中。蛋白質(zhì)提取、免疫沉淀和蛋白質(zhì)印跡分析在冷pbs中洗滌80%匯合的細胞，并在冰上在裂解緩沖液(50mmtris，150mmnacl，0.1%tritonx-100,10mmedta，ph7.2，和蛋白酶抑制劑混合物，roche)中裂解。將裂解物與1μg肽一起孵育過夜。首先使用蛋白g瓊脂糖珠在4℃、旋轉(zhuǎn)條件下預(yù)澄清裂解物1小時。收集上清液，并與具有1μg小鼠單克隆igg2b抗cd9的蛋白g瓊脂糖珠在4℃、旋轉(zhuǎn)條件下一起孵育1小時。將預(yù)澄清的上清液與先前用1μg小鼠單克隆igg2b抗γ-銜接蛋白包被的珠一起在4℃、旋轉(zhuǎn)條件下孵育2小時。作為陰性對照，使用1μg小鼠單克隆igg2b抗cd9免疫沉淀裂解物。在冷裂解緩沖液中洗滌五次并在pbs中洗滌三次后，將與珠結(jié)合的免疫沉淀的蛋白質(zhì)在具有還原劑的樣品緩沖液中孵育，在95℃下煮沸10分鐘，并通過sds-page使用nupage(3-8%)tris-乙酸鹽凝膠(invitrogen)分級分離。在硝酸纖維素膜(millipore)上實現(xiàn)轉(zhuǎn)移。用小鼠單克隆抗γ-銜接蛋白(sigma-aldrich)和兔多克隆抗kif13a(bethyllaboratory，inc.)探測膜。免疫熒光將在蓋玻片上生長的mnt-1細胞在含有10μg肽的培養(yǎng)基中孵育3天。在pbs中漂洗蓋玻片，在100%冷甲醇中固定30秒，隨后在pbs和1mg/mlbsa中孵育。將固定的細胞在pbs中洗滌，在pbs和50mm甘氨酸中在rt淬滅10分鐘，在封閉緩沖液中飽和，并在pbs，0.05%皂苷和1mg/mlbsa(孵育緩沖液，1b)中透化。將細胞與在ib中稀釋的小鼠單克隆抗γ-銜接蛋白(sigma-aldrich)和兔多克隆抗kif13a(bethyllaboratory，inc.)一起孵育1小時，在ib中洗滌三次，并與相應(yīng)的二抗(alexafluor，invitrogen)一起孵育30分鐘。將細胞在1b中洗滌兩次，在封閉緩沖液中洗滌一次。最后，將蓋玻片安裝在dabco培養(yǎng)基中并在3d尼康顯微鏡下檢查。使用imagej軟件進行共定位分析。首先，使用colocalizationplugin生成合并圖像。只有像素的覆蓋強度超過單個通道的強度被認為是共定位像素。然后定義細胞內(nèi)相同的區(qū)域并分析定量。常規(guī)電子顯微術(shù)將在蓋玻片上生長3天的對照和肽處理的mnt-1細胞用在ph7.2的0.1m二甲砷酸鹽緩沖液中的2.5%戊二醛固定，用補充有1.5%的亞鐵氰化鉀的1%oso4后固定，在乙醇中脫水，并嵌入在epon中。用ulltracutuct超薄切片機(leica)制備超薄切片，并在用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛復(fù)染色之后在cm120電子顯微鏡(fei公司，eindoven)下觀察。兩個作者獨立完成了基于形態(tài)和黑色素含量的黑色素體從i階段到iv階段的分級。下表列出了分析的標準。階段標準i球形，無黑色素ii橢圓形，平行絲iii橢圓形，黑色素中等沉積iv橢圓形，黑色素強烈沉積黑色素測定對mnt-1細胞在第1天，將105個細胞接種在6孔板中。從第2天到第4天，在含有1或10μg肽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。每天更換培養(yǎng)基。在第5天，通過在50mmtris-hcl，ph7.4，2mmedta，150mmnacl，1mm二硫蘇糖醇和蛋白酶抑制劑中超聲處理破碎細胞。在4℃下以20,000g沉淀色素15分鐘，在乙醇/乙醚(1:1)中漂洗一次，并在60℃下溶解于2mnaoh/20%二甲基亞砜中。黑色素含量作為在492nm的光密度測量。對重建的表皮在第10天接受光型vi的重建人表皮(sterlab)，并從第11天至第21天用30μg肽補充的制造商的生長培養(yǎng)基孵育。按照推薦，每天更換培養(yǎng)基。在第21天，將表皮與插入物分離，通過在400μl的solvable(perkinelmer)中在98℃下孵育1小時來消化。黑色素含量作為在492nm的光密度測量。結(jié)果本發(fā)明人設(shè)計了旨在阻斷ap-1復(fù)合物與驅(qū)動蛋白kif13a的相互作用的小肽。已經(jīng)表明，這種相互作用對于將黑素生成酶轉(zhuǎn)運到黑素體是關(guān)鍵的，并且然后對于人皮膚黑素細胞的色素沉著是必需的(delevoye等人，jcellbiol.2009oct19;187(2)：247-64)。本發(fā)明人在此顯示，小至5或3個氨基酸(aa)的肽能夠防止ap-1復(fù)合物與kif13a之間的相互作用以及它們的細胞內(nèi)共定位，導(dǎo)致皮膚黑素細胞的色素顆粒數(shù)目減少，和皮膚黑素細胞以及合成的人著色皮膚表皮的細胞內(nèi)黑色素含量的減少。ek-11肽減少kif13a與ap-1復(fù)合物的相互作用基于來自(nakagawa等人，cell，2000，vol.103,569-581)的之前的工作，預(yù)測小鼠ap-1復(fù)合物的β1-銜接蛋白亞基與小鼠kif13a的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)于位于第783和860個aa之間的77aa區(qū)域。本發(fā)明人鑒定了對應(yīng)于77aa區(qū)域(第813-890)的人β1-銜接蛋白亞基的同源序列。使用這77aa人序列，本發(fā)明人設(shè)計了與相鄰肽共享5個氨基酸的11個氨基酸的12種肽。本發(fā)明人測試了這些序列阻斷人ap-1與人kif13a的相互作用的能力。這些蛋白質(zhì)被廣泛表達，因此本發(fā)明人通過獨立地將1μg的各12種肽與hela細胞裂解物(非著色細胞)一起孵育來進行第一次相互作用篩選。從裂解物中免疫沉淀ap-1復(fù)合物的γ亞基，并測試免疫沉淀物的kif13a含量。本發(fā)明人顯示，與對照或其他設(shè)計的肽相比，僅ek-11肽(seqidno:1)與hela細胞裂解物的孵育能夠顯著減少ap-1與kif13a的相互作用約52.6±7%(圖1)。此外，本發(fā)明人還證實，ek-11肽減少皮膚黑素細胞mnt-1細胞裂解物中的ap-1/kif13a相互作用(57.5±8%)，與hela細胞中一樣多(圖2)。qk-5肽減少kif13a與ap-1復(fù)合物的相互作用為了找到可用于工業(yè)目的的分子，本發(fā)明人設(shè)計了覆蓋和包圍ek-11肽的五肽，以找到能夠防止ap-1/kif13a相互作用的更短的肽。本發(fā)明人顯示，與對照或其它5aa肽例如ss-5肽(seqidno:28)(圖2)相比，對應(yīng)于ek-11肽(seqidno:1)的最后5個氨基酸的qk-5肽(seqidno:16)降低了在黑素細胞細胞裂解物中ap-1與kif13a(圖2)相互作用的能力(56.1±6%;圖3)。引人注意的是，倍數(shù)減少等同于通過ek-11肽孵育(參見上文)產(chǎn)生的倍數(shù)減少?？傊?，本發(fā)明人顯示qk-5肽防止黑素細胞中ap-1與kif13a的相互作用。qk-5肽減少ap-1與kif13a在皮膚黑素細胞中的共定位本發(fā)明人測試了ap-1與kif13a的相互作用的減少(圖3)是否可以通過其在皮膚黑素細胞中的共定位的減少來反映。如上所述地將qk-5肽與皮膚黑素細胞一起孵育，并進行免疫熒光實驗以定量ap-1與kif13a在皮膚mnt-1黑素細胞中的共定位。本發(fā)明人顯示，與對照相比，qk-5肽的孵育減少兩種蛋白質(zhì)之間的共定位約84±7%(圖5;p<0.001)，這顯示它們相互作用的物理破壞(圖2)之后是它們的細胞內(nèi)分布的空間隔離。qk-5肽減少皮膚黑素細胞的黑色素產(chǎn)生本發(fā)明人先前顯示，ap-1/kif13a對是皮膚黑素細胞在細胞內(nèi)產(chǎn)生黑色素所需要的(delevoye等人，jcellbiol.2009oct19;187(2)：247-64)。因此，本發(fā)明人測試了qk-5肽的孵育是否可以影響皮膚mnt-1黑素細胞的細胞內(nèi)黑色素含量。將mnt1黑素細胞在含有10μmqk-5肽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天(每天更新孵育)，然后純化細胞內(nèi)黑色素和通過讀取其在492nm的光密度來測量。與對照相比，qk-5肽的孵育使皮膚mnt-1黑素細胞的細胞內(nèi)黑色素含量降低約40%(圖4;p<0.05)。該結(jié)果表明qk-5肽自由擴散到細胞中，并且顯示通過阻斷kif13a與ap-1的相互作用，qk-5因此減少了經(jīng)處理的黑素細胞的黑色素產(chǎn)生。qk-5肽減少完全成熟的色素顆粒的形成在皮膚黑素細胞中，黑色素合成發(fā)生在膜結(jié)合的稱為黑素體的細胞器中(raposo和marks，natrevmolcellbiol.opt2007;8(10)：786-797)。本發(fā)明人先前顯示，ap-1/kif13a對是形成完全著色的黑素體所必需的(delevoye等人，jcellbiol.2009oct19;187(2)：247-64)。然后本發(fā)明人測試了廢除ap-1與kif13a的相互作用和共定位(圖2、3和5)的qk-5肽的孵育是否可能影響黑素體的成熟，并且因此減少色素沉著(圖4)。如上所述地將qk-5肽與皮膚黑素細胞一起孵育，并進行電子顯微鏡處理(參見材料和方法)?；谒鼈兊男螒B(tài)，黑素體以4個不同階段存在，從早期非著色黑素體(階段i和ii)到早期成熟黑素體(階段iii，其中黑色素開始沉積到它們的腔中)，然后到完全成熟的黑素體(階段iv，其中黑色素完全填充黑素體的腔)。與對照(圖6，上圖)相比，與qk-5肽一起孵育3天的mnt-1細胞(圖6，下圖)攜帶更少的黑色著色的顆粒(階段iv黑素體)，顯示完全著色的黑素體的成熟在qk-5處理的細胞中受到影響。本發(fā)明人定量了在h2o或qk-5處理的mnt1細胞中黑素體階段的數(shù)目(表示為總數(shù)的%)。與對照相比，qk-5處理的黑素細胞增加其階段iii的數(shù)量，并且減少其階段iv黑素體的數(shù)目，而不影響早期階段(i和ii)(圖7)。該數(shù)據(jù)表明，當用qk-5肽處理細胞時，完全著色的階段iv黑素體的成熟速率減慢，并解釋了圖4所示的色素沉著的減少。三個氨基酸的qk衍生肽減少皮膚黑素細胞的色素沉著為了找到較小的活性分子，本發(fā)明人設(shè)計了幾種衍生自ek-11肽并因此來自兩種五肽en-5和qk-5的三肽，即el-3(epl)、ln-3(lnn)、qa-3(qva)和ak-3(avk)肽，以測試其減少色素沉著的能力。本發(fā)明人顯示，el-3或ln-3的孵育適度地減少皮膚黑素細胞的黑色素產(chǎn)生(約12%)(圖8)。此外，本發(fā)明人將衍生自qk-5肽的三肽(qa-3和ak-3)與皮膚mnt-1黑素細胞一起孵育。本發(fā)明人顯示，qa-3和ak-3肽都使細胞內(nèi)黑色素含量降低約20%(圖9；分別為23%±7%和22%±8%；*，p<0.05)。此外，本發(fā)明人在30μm的各自三肽存在下保持人重建的著色表皮的培養(yǎng)。本發(fā)明人顯示，與對照相比，qa-3和ak-3肽都減少了3d-人重建的著色表皮的色素沉著約20%(圖10；分別為22.5±13%和21±10%;*，p<0.1)。該結(jié)果顯示，衍生自qk-5和小至三個氨基酸的肽能夠減少皮膚黑素細胞以及合成表皮的色素沉著。結(jié)論本文的發(fā)明人證明了衍生自ek-11肽的小至5或3個氨基酸(aa)的肽能夠阻斷ap-1復(fù)合物與驅(qū)動蛋白kif13a的相互作用。這些肽不僅影響這些蛋白質(zhì)的物理締合，而且影響它們的空間細胞內(nèi)共定位。因為ap-1和kif13a對于維持黑素體的成熟和皮膚黑素細胞的色素沉著是關(guān)鍵的，所以本發(fā)明人顯示這樣的肽通過控制完全著色的黑素體的成熟速率而影響皮膚黑素細胞的色素沉著。本發(fā)明人還顯示這些肽減少皮膚黑素細胞的色素沉著，并且重要的是，減少人重建的著色表皮的色素沉著。總之，本發(fā)明人顯示，抑制ap-1與kif13a的相互作用的小肽是調(diào)節(jié)人皮膚色素沉著的相關(guān)新工具，并且可用作新的增白活性分子。當前第1頁12