關(guān)于聯(lián)邦贊助研究的聲明

本發(fā)明是在由國家衛(wèi)生研究院授予的批準(zhǔn)文號5dp5od017898的政府支持下進(jìn)行的。政府對本發(fā)明具有一定權(quán)利。

相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求于2014年7月2日提交的申請?zhí)枮?2/020,249的美國臨時專利申請、以及2014年7月2日提交的申請?zhí)枮?2/020,233的美國臨時專利申請的優(yōu)先權(quán)，其公開內(nèi)容通過引用并入本文中。

背景技術(shù)：

用于在生物系統(tǒng)內(nèi)運(yùn)輸?shù)氖杷苑肿拥陌饣蝌弦殉蔀閺V泛關(guān)注和研究的主題。疏水性藥物包含相當(dāng)大比例的目前使用的所有藥物化合物。這些藥物在水中的溶解度有限。對于需要精確給藥的應(yīng)用，口服遞送可導(dǎo)致可變的生物利用度。在一些情況下，腸胃外給藥是優(yōu)選的途徑。在一些情況下，通過改變?nèi)芤簆h或通過添加適當(dāng)?shù)柠}類來可以將疏水性藥物弄成水溶液。在其它情況下，少量的增溶賦形劑如糊精或脂質(zhì)是足夠的。然而，對于仍更難溶解的許多化合物，需要其它賦形劑策略。這些通常涉及由表面活性劑和非水溶劑形成的制劑。非離子表面活性劑如聚氧乙烯蓖麻油(cremophorel)和聚山梨酯-80，通常用于母方(parentalformulation)，但可能誘導(dǎo)包括過敏性超敏反應(yīng)和神經(jīng)毒性的不利副作用。非水溶劑具有引起溶血的可能性，并且在油的情況下具有引起肺微栓塞的可能性。對于可注射制劑，優(yōu)選中性ph、等滲的水溶液。繞過這些問題的新藥物遞送系統(tǒng)有產(chǎn)生下一代制劑的可能，并且已經(jīng)逐漸向臨床開放。然而，迄今為止，描述的許多藥物遞送系統(tǒng)本身由相對大量的賦形劑形成，其本身可能攜帶副作用以及未知的長期安全性特點(diǎn)。因此，與表面活性劑溶液相比，當(dāng)前納米顆粒遞送系統(tǒng)的藥物與賦形劑的質(zhì)量比或摩爾比可能不會明顯更佳，并且通常為接近1:10的質(zhì)量比(藥物:賦形劑)。由于制劑復(fù)雜性和低藥物負(fù)載能力，替代藥物遞送系統(tǒng)的臨床應(yīng)用受到限制。

疏水性分子也常用作成像劑。胃腸道的成像用于診斷中。然而，基于x射線輻射、磁共振和超聲的用藥程式受到了在安全性、可達(dá)性或缺乏足夠的對比度方面的限制。例如，使用現(xiàn)有方法，動態(tài)腸道過程的功能性腸成像是不切實(shí)際的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本公開基于我們的觀察，當(dāng)疏水劑與表面活性劑(如嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆，例如可以由商品名獲得的那些))接觸時，疏水劑自組裝成膠束，并且低溫處理能夠除去大部分或全部的泊洛沙姆，從而得到其中所有或基本上所有剩余的泊洛沙姆分子存在于剝離了表面活性劑的負(fù)載疏水劑的膠束中的組合物。這允許膠束組合物具有高疏水劑濃度和高疏水劑-表面活性劑摩爾比。

基于我們的研究，本公開提供了與已經(jīng)剝離了表面活性劑的膠束制劑相關(guān)的組合物和方法，所述表面活性劑不是負(fù)載疏水劑的膠束的一部分。疏水劑在本文中也稱為疏水性負(fù)載物。在所述組合物中，基本上所有的表面活性劑(例如泊洛沙姆)存在于膠束中，并且存在很少或不存在游離的表面活性劑。本公開還提供了制備所述組合物的方法和使用所述組合物的方法。

疏水劑可以是期望在生物系統(tǒng)中運(yùn)輸?shù)娜我馐杷苑肿?。例如，疏水劑可以被遞送到期望的位點(diǎn)(用于在位點(diǎn)釋放)，也可以在沒有釋放的情況下(例如當(dāng)用于成像目的時)被運(yùn)輸通過位點(diǎn)。在一個實(shí)施方案中，疏水劑是藥物。在一個實(shí)施方案中，疏水劑是光學(xué)成像造影劑。在各種實(shí)施方案中，組合物包含負(fù)載疏水藥物的膠束和/或負(fù)載疏水光學(xué)造影染料的膠束，基本上由負(fù)載疏水藥物的膠束和/或負(fù)載疏水光學(xué)造影染料的膠束組成，或由負(fù)載疏水藥物的膠束和/或負(fù)載疏水光學(xué)造影染料的膠束組成。

低溫處理導(dǎo)致去除了基本上所有未締合的泊洛沙姆(當(dāng)溫度降低時泊洛沙姆與負(fù)載疏水劑的膠束不締合)。例如，去除85％以上、90％以上、99％以上或99.9％以上的起始表面活性劑。剩余的泊洛沙姆存在于膠束中。

這些組合物表現(xiàn)出高穩(wěn)定性和高負(fù)載。最終組合物中的疏水劑:泊洛沙姆摩爾比為3:1以上。例如，在疏水劑是藥物的情況下，我們觀察到疏水劑:泊洛沙姆摩爾比高達(dá)55:1，比使用其它增溶賦形劑的現(xiàn)有臨床制劑的數(shù)量級高，其通常在1:10。在一個實(shí)例中，其中疏水劑是藥物，我們觀察到藥物:泊洛沙姆摩爾比為7:1。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物的疏水劑:泊洛沙姆比為60:1。

適于制備本發(fā)明膠束組合物的表面活性劑包括嵌段共聚物(例如泊洛沙姆)。在一個實(shí)施方案中，膠束由泊洛沙姆作為唯一的表面活性劑分子形成，并且所述膠束含有疏水劑。在一個實(shí)施方案中，表面活性劑是嵌段共聚物，所述嵌段共聚物至少包含親水嵌段和疏水嵌段。在一個實(shí)施方案中，所述嵌段共聚物是三嵌段共聚物，如泊洛沙姆。所述組合物基本上不含未締合的表面活性劑分子。術(shù)語“未締合的表面活性劑分子”或描述特定的表面活性劑(例如“未締合的泊洛沙姆分子”或“未締合的泊洛沙姆127分子”)的相應(yīng)術(shù)語意在表示一旦溫度降低(如低于室溫，例如至10℃至-20℃)，不屬于膠束的一部分的表面活性劑分子。未締合的表面活性劑分子可以是非嵌合形式的表面活性劑分子，彼此松散地締合(統(tǒng)稱為“游離”表面活性劑)，或形成空膠束，即其中沒有疏水劑分子摻入的膠束。通過諸如膜過濾或透析的方法將膠束與小得多的非嵌合表面活性劑分離，并通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)分析方法(如用于泊洛沙姆檢測的比色硫氰酸鈷方法)可以檢測未締合的表面活性劑。

這些膠束可以在用于腸胃外施用的溶液中制備而沒有其它賦形劑?？蛇x地，這些膠束可以存在于含有ph緩沖劑(例如檸檬酸鹽或磷酸鹽)和用于控制張力的成分(如鹽水或蔗糖)的溶液中。膠束可以儲存在水或含有高達(dá)4mnacl的高滲鹽水溶液中。高滲鹽水可在給藥前稀釋。膠束組合物可以與另外的藥學(xué)上可接受的載體一起配制，所述藥學(xué)上可接受的載體包括糖類、淀粉類、鯨蠟醇、纖維素、粉末狀黃蓍膠、麥芽、明膠、滑石、油類、二醇類、單油酸甘油酯、多元醇類、聚乙二醇、乙醇、另外的乳化劑等。

本公開還提供了制備剝離了非締合表面活性劑的組合物的方法。該方法包括將溶解在有機(jī)溶劑如氯仿或二氯甲烷或其它有機(jī)溶劑(包括例如乙醇，甲醇，四氫呋喃等)中的疏水劑分子與表面活性劑分子(如泊洛沙姆分子)接觸以形成膠束，其中至少一些具有摻入其中的疏水劑分子。隨后是有機(jī)溶劑的蒸發(fā)或部分蒸發(fā)(主動或被動)，并且隨后去除不包含于負(fù)載疏水劑的膠束中的表面活性劑分子。在一個實(shí)施方案中，通過降低溫度來除去未締合的表面活性劑分子，使得所有或基本上所有的未締合的表面活性劑分子成為未嵌合的，隨后除去未嵌合的表面活性劑分子(例如通過過濾方法如膜過濾方法)?？梢愿鶕?jù)需要重復(fù)或繼續(xù)低溫處理，直到除去所有可檢測到的非締合表面活性劑。由于沒有更多的表面活性劑可以從膠束中去除，因此膠束基本上缺少未締合的表面活性劑分子。所得組合物包含在本文中稱為剝離表面活性劑誘導(dǎo)的“冷凍”膠束(“ss-infroms”)的膠束。組合物可以原樣使用或可以濃縮。例如，負(fù)載疏水劑的膠束可以濃縮至高達(dá)150mg/ml的試劑。

在一些情況下，利用用高滲鹽溶液、維生素e或輔酶q10共負(fù)載，或利用目的藥物的脂肪酯化以使其具有足夠的疏水性可以形成負(fù)載疏水劑的膠束。維生素e或輔酶q10共負(fù)載涉及將這些試劑摻入膠束中以改善穩(wěn)定性或另一負(fù)載的疏水劑。高滲鹽水的作用是使膠束外的溶液更具離子性，這具有將疏水性分子驅(qū)動到膠束中的作用。

術(shù)語剝離表面活性劑誘導(dǎo)的冷凍膠束“ss-infroms”、納米顆?；蚰z束可以互換使用。在一個實(shí)施方案中，其中膠束負(fù)載有疏水光學(xué)造影劑染料，所述ss-infroms也稱為納米粒子(nanonaps)。

在一個實(shí)施方案中，本公開的組合物包含多個膠束，其具有15至250nm(以及其間的所有整數(shù)納米值)的尺寸(指膠束的直徑)。在一個實(shí)施方案中，所述尺寸為20-120nm。在一個實(shí)施方案中，膠束中至少80-90％(以及其間的所有整數(shù)百分比值)在20-100nm或20-120nm(以及其間的所有整數(shù)納米值)的范圍內(nèi)。

根據(jù)疏水性負(fù)載物選擇，這些組合物可用于各種應(yīng)用，包括例如藥物遞送和成像。在施用給小鼠后，本公開的膠束組合物在體內(nèi)表現(xiàn)出安全性和功效。

在一個實(shí)施方案中，本公開提供了一種包含膠束的水性組合物，所述膠束包含泊洛沙姆并在其中摻入疏水劑，由此形成負(fù)載疏水劑的泊洛沙姆膠束，其中組合物中疏水劑:泊洛沙姆的摩爾比為至少2:1或3:1，并且其中組合物中至少90％或95％的泊洛沙姆形成負(fù)載疏水劑的膠束。在一個實(shí)施方案中，構(gòu)成膠束的唯一表面活性劑是一種以上類型的泊洛沙姆(例如407、338或188；也分別稱為普朗尼克(pluronic)f127、f108或f68)，并且在這里分別稱為f127、f108或f68)，并且膠束中摻入了疏水劑作為負(fù)載物。泊洛沙姆可以是單一類型的泊洛沙姆，也可以是多種類型的泊洛沙姆。在一個實(shí)施方案中，制劑中至少96％、97％、98％或99％的泊洛沙姆分子作為膠束存在，其中摻入了作為負(fù)載物的疏水劑。泊洛沙姆在膠束中的摻入可以通過將溫度降低至-20至10℃來量化，其導(dǎo)致未締合的泊洛沙姆成為未締合的，通過膜分離技術(shù)分離負(fù)載疏水劑的膠束，并對未締合的泊洛沙姆進(jìn)行定量。當(dāng)疏水劑是藥物(例如治療藥物)時，藥物:泊洛沙姆摩爾比可以為7:1至55:1或7:1至60:1。當(dāng)疏水劑負(fù)載物為成像造影染料時，染料:泊洛沙姆的摩爾比可以為3:1至10:1。在一個實(shí)施方案中，疏水劑以具有至少3、或3至11的辛醇-水分配系數(shù)(logp值)為特征。

本公開提供了制備本發(fā)明組合物的方法，其包括：將溶解在有機(jī)溶劑中的疏水劑(如x摩爾)與泊洛沙姆(如y摩爾)的水溶液接觸，由此形成負(fù)載疏水劑的泊洛沙姆膠束；使沒有形成負(fù)載疏水劑的膠束的泊洛沙姆分子成為單一泊洛沙姆單位。x和y可以根據(jù)需要選擇。在一個實(shí)施方案中，x:y的比例為0.1:1至2:1。單位泊洛沙姆分子的形成可通過使組合物處于或低于泊洛沙姆的cmt的溫度誘導(dǎo)。在各種實(shí)施方案中，降低的溫度為0℃至25℃、0℃至20℃、0℃至15℃、0℃至10℃、或?qū)τ诟邼B鹽水溶液為-20℃至0℃，并去除單位泊洛沙姆單位以得到負(fù)載剝離了泊洛沙姆的疏水劑的膠束組合物，其中泊洛沙姆分子起始量的至少85％被除去，疏水劑:泊洛沙姆摩爾比為3:1至55:1，以及組合物中90％以上的(例如95、86、97、98或99％或99.5、99.9或100％)泊洛沙姆存在于負(fù)載疏水劑的膠束中。組合物可以新鮮使用或儲存?zhèn)溆谩＝M合物可以以粉末或冷凍干燥形式儲存，并且隨后可以用水介質(zhì)復(fù)原。

本公開還提供了藥物遞送的方法，其包括：制備如本文所述的負(fù)載疏水性的藥物的膠束組合物，其基本上不含未締合的泊洛沙姆(即，至少90％的泊洛沙姆作為負(fù)載疏水性負(fù)載物的膠束存在)，并將該組合物施用于個體，使其被輸送到期望的位置。在一個實(shí)施方案中，本公開提供了成像方法(例如胃腸道)，包括：制備如本文所述的負(fù)載疏水性造影染料的膠束組合物，其基本上不含未締合的泊洛沙姆(即，至少90％的泊洛沙姆作為負(fù)載疏水性染料的膠束存在)，將組合物施用于個體，使得其被運(yùn)輸至并通過胃腸道，并且當(dāng)組合物通過胃腸道運(yùn)輸時對胃腸道進(jìn)行成像。成像可以在給藥后立即進(jìn)行，并且可以持續(xù)所需的時間段，或者可以在給藥后一定時間后開始。對于藥物遞送目的，例如，組合物可以通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、局部、皮下或粘膜遞送施用。為了成像目的如胃腸道的成像，組合物可以通過口服途徑施用，并且為了其它成像目的，組合物可以通過靜脈內(nèi)、瘤內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)或肌內(nèi)遞送施用。

附圖說明

圖1：離心過濾洗滌后表面活性劑保留。在指定溫度下旋轉(zhuǎn)10％(w/v)的表面活性劑溶液，并使用1,6-二苯基-1,3,5-己三烯熒光法和標(biāo)準(zhǔn)曲線評估保留物中的表面活性劑。

圖2：低溫離心過濾后保留和溶解的八丁氧基-萘酞菁的染料吸光度。使用10％(w/v)的表面活性劑溶液溶解染料，然后進(jìn)行3次離心過濾洗滌。在860nm處測量可溶性保留物的吸光度。

圖3：維生素kss-infroms的產(chǎn)生。a)將維生素k溶解于二氯甲烷中并加入到10％(w/v)的f127溶液中。在有機(jī)溶劑蒸發(fā)后，對溶液進(jìn)行低溫離心過濾洗滌，并測定保留物中藥物和pluronic的量。b)維生素kinforms的吸收光譜和照片(插圖)。c)維生素kinfroms的粒徑分布。d)與f68、f127形成的純化維生素kinforms以及市場上混合膠束臨床制劑的摩爾比的比較。

圖4：鹽輔助的環(huán)孢霉素ass-infroms的生成。a)將環(huán)孢霉素a溶解于二氯甲烷中，并加入到含有所示量的鹽類的10％(w/v)f127溶液中。在有機(jī)溶劑蒸發(fā)后，將溶液進(jìn)行低溫離心過濾洗滌，并測定藥物產(chǎn)量。b)在洗滌步驟期間(在1mnacl中)環(huán)孢霉素和pluronic保留。c)環(huán)孢霉素informs的粒徑分布。d)環(huán)孢霉素informs的吸收光譜。

圖5：氟維司群ss-infroms的產(chǎn)生。a)將氟維司群溶解于二氯甲烷中并加入到10％(w/v)f127溶液中。在有機(jī)溶劑蒸發(fā)后，將溶液進(jìn)行低溫離心過濾洗滌，并測定每個洗滌步驟的藥物和pluronic的量。b)氟維司群informs的吸收光譜。

圖6：胺碘酮ss-infroms的產(chǎn)生。a)將胺碘酮溶解在二氯甲烷中，并加入到含有所示量nacl的10％(w/v)f127溶液中。在有機(jī)溶劑蒸發(fā)后，將溶液進(jìn)行低溫離心過濾洗滌，并測定藥物產(chǎn)量。b)在洗滌步驟期間(在1mnacl中)胺碘酮和pluronic的保留。c)胺碘酮infroms的吸收光譜。d)胺碘酮infroms的粒徑分布。

圖7：伊維菌素ss-infroms的產(chǎn)生。a)將伊維菌素溶解于二氯甲烷中并加入10％(w/v)的溶液中。在有機(jī)溶劑蒸發(fā)后，將溶液進(jìn)行低溫離心過濾洗滌，并測定藥物產(chǎn)量。b)伊維菌素informs的吸收光譜。b)伊維菌素informs的粒徑分布。

圖8：十一酸睪酮ss-infroms的產(chǎn)生。a)將十一酸睪酮溶解于二氯甲烷中并加入到10％(w/v)f127溶液中。在有機(jī)溶劑蒸發(fā)后，將溶液進(jìn)行低溫離心過濾洗滌，并測定滯留物中藥物和f127的量。b)十一酸睪酮ss-infroms的吸收光譜。

圖9：膽鈣化醇ss-infroms的產(chǎn)生。a)將膽鈣化醇溶解于二氯甲烷中并加入到10％(w/v)f127溶液中。在有機(jī)溶劑蒸發(fā)后，將溶液進(jìn)行低溫離心過濾洗滌，并測定滯留物中藥物和f127的量。b)膽鈣化醇ss-infroms的吸收光譜。

圖10：視黃醇棕櫚酸酯ss-infroms的產(chǎn)生。a)將視黃醇棕櫚酸酯溶解于二氯甲烷中并加入到10％(w/v)f127溶液中。在有機(jī)溶劑蒸發(fā)后，將溶液進(jìn)行低溫離心過濾洗滌，并測定滯留物中藥物和f127的量。b)視黃醇棕櫚酸酯informs的吸收光譜。將100mg視黃醇棕櫚酸酯溶解在1ml二氯甲烷(dcm)中，并加入到含有2mnacl的10ml10％(w/v)f127中，并攪拌直至有機(jī)溶劑蒸發(fā)。通過用裝配有蠕動泵(masterflexl/s)和管道(masterflex6434-16)的膜過濾(sartoriusvivaflow，1501008vs)進(jìn)行未摻入的f127去除過程。在-7℃下進(jìn)行去除過程，并將2mnacl溶液用于透析過濾溶液。為了使f127去除百分比最大化，將膜組件、管道和用于洗滌的溶液浸入乙二醇和乙醇(v/v＝9:1)的混合物中，并使用干冰作為冷卻劑。

圖11：西羅莫司脂化物ss-infroms的產(chǎn)生。a)將西羅莫司脂化物溶解于二氯甲烷中并加入到10％(w/v)f127溶液中。在有機(jī)溶劑蒸發(fā)后，將溶液進(jìn)行低溫離心過濾洗滌，并測定滯留物中藥物和f127的量。b)西羅莫司脂化物informs的吸收光譜。

圖12：米非司酮ss-infroms的產(chǎn)生。

a)將十一酸睪酮溶解于二氯甲烷中并加入到10％(w/v)f127溶液中。在有機(jī)溶劑蒸發(fā)后，將溶液進(jìn)行低溫離心過濾洗滌，并測定滯留物中藥物和f127的量。

b)十一酸睪酮ss-informs的吸收光譜。

圖13：視黃醇ss-infroms的產(chǎn)生。a)將視黃醇溶解于二氯甲烷中并加入到10％(w/v)f127溶液中。在有機(jī)溶劑蒸發(fā)后，將溶液進(jìn)行低溫離心過濾洗滌，并測定滯留物中藥物和f127的量。b)視黃醇ss-informs的吸收光譜。

圖14：輔酶q10ss-infroms的產(chǎn)生。a)將輔酶q10溶解于二氯甲烷中并加入到10％(w/v)f127溶液中。在有機(jī)溶劑蒸發(fā)后，將溶液進(jìn)行低溫離心過濾洗滌，并測定滯留物中藥物和f127的量。b)輔酶q10ss-informs的吸收光譜。

圖15：與維生素e共負(fù)載的紫杉烷inform形成的增強(qiáng)。將多西他賽或紫杉醇與所示量的維生素e(α-生育酚)一起溶解于二氯甲烷中，并加入到10％(w/v)f127溶液中。在有機(jī)溶劑蒸發(fā)后，對溶液進(jìn)行離心以測定溶解的紫杉烷的吸光度。

圖16：與輔酶q共負(fù)載的紫杉烷inform形成的增強(qiáng)。將多西他賽或紫杉醇與所示量的輔酶q一起溶解于二氯甲烷中，并加入到10％(w/v)f127溶液中。在有機(jī)溶劑蒸發(fā)后，對溶液進(jìn)行離心以測定溶解的紫杉烷的吸光度。

圖17：pluronic家族的表面活性劑適用于onc疏水染料的低溫(4℃)洗滌，導(dǎo)致表面活性劑剝離以產(chǎn)生高度濃縮的oncss-infroms。

圖18：a)在低溫滲濾期間，游離的f127被去除，而維生素k1被完全保留。b)維生素k1ss-infroms的透射電子顯微照片。c)差示掃描量熱法測量顯示表面活性劑剝離過程除去了所有由膠束化過程中傳遞的熱指示的游離f127。d)基于少量與維生素k1膠束共負(fù)載的疏水性熒光團(tuán)的forster共振能量轉(zhuǎn)移(fret)測定揭示，負(fù)載物被鎖定在動力學(xué)冷凍膠束中，而沒有表面活性劑剝離前后的膠束間交換。e)維生素k1ss-infroms與臨床制劑相比表現(xiàn)出高的藥物與增溶劑摩爾比。f)基于凝血時間，維生素k1ss-infroms有效地作用抵抗口服華法林對小鼠的影響。

圖19：在維生素k1洗滌過程中，基于在濾液中不存在任何可檢測到的表面活性劑，從保留物中除去所有游離f127。

圖20：a)高滲鹽水增強(qiáng)了負(fù)載環(huán)孢菌素a的膠束的產(chǎn)率，b)f127可以在較低溫度下有效剝離，c)剝離了表面活性劑的環(huán)孢菌素a膠束與臨床制劑相比表現(xiàn)出高摩爾比，d)剝離了負(fù)載環(huán)孢菌素a的表面活性的膠束有效地用作免疫抑制劑。

圖21：a)高滲鹽水通過鹽提高了負(fù)載十一酸睪酮膠束的產(chǎn)率，b)十一酸睪酮ss-infroms與臨床制劑相比表現(xiàn)出更高的摩爾比。

圖22：a)鹽增強(qiáng)卡巴他賽informs的產(chǎn)量，b)輔酶q10改善ctxinfroms在稀釋時的穩(wěn)定性，c)ctxss-infroms與臨床制劑相比表現(xiàn)出高摩爾比，d)剝離了負(fù)載ctx的表面活性劑的膠束有效地治愈了裸鼠皮下miapaca-2腫瘤，其中在第0天和第4天兩次靜脈內(nèi)注射30mg/kg(由箭頭標(biāo)記)。

圖23：不可交換的f127-萘酞菁冷凍膠束的形成。a)具有不同疏水性的染料加入到10％(w/v)f127的水溶液中，然后對20mm膽酸鹽透析24小時后染料的保留。mb＝亞甲基藍(lán)，qr＝喹哪啶紅，6g＝羅丹明6g，ir780＝ir780碘化物。b)所用的萘酞菁的化學(xué)結(jié)構(gòu)。bnc：x1＝2h；x2＝t-bu；x3，x4＝h。vbnc：x1＝v＝o；x2＝t-bu；x3，x4＝h。znbnc：x1＝zn；x2＝t-bu；x3，x4＝h；onc：x1＝2h；x2＝h；x3，x4＝o-(ch2)3ch3。酞菁不含外苯：bpc：x1＝2h；x2＝t-bu；x3，x4＝h。vbpc：x1＝v＝o；x2＝t-bu；x3＝n(ch3)2，x4＝h。

圖24：溫度介導(dǎo)的cmc轉(zhuǎn)換產(chǎn)生不含表面活性劑的納米粒子(nanonaps)。a)純化的納米粒子的產(chǎn)生。f127peo嵌段和ppo嵌段顯示為鏈，并且nc染料顯示為填充的封閉結(jié)構(gòu)。b)f127保留作為在4℃(黑色)和25℃(紅色)下的離心過濾洗滌的函數(shù)。對于n＝3，得到平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。c)f127-溶解的染料保留作為在4℃下對于nc(黑色)和亞甲基藍(lán)(紅色)的離心過濾洗滌的函數(shù)。對于n＝3，得到平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。d)通過水中動態(tài)光散射的納米粒子粒徑分布。e)干燥納米粒子的負(fù)染透射電子顯微照片。比例尺，50nm。f)將由2mgonc形成的納米顆粒凍干后，來自濃縮的重構(gòu)的納米粒子(黑色)或脂質(zhì)體(紅色，1:19摩爾比nc：脂質(zhì))的等效吸光度。插圖顯示放大的脂質(zhì)體吸光度。

圖25：在超高光密度下多光譜納米粒子沒有峰值波長漂移。a)將由bpc(藍(lán)色)、znbnc(深綠色)、bnc(淺綠色)或onc(青銅色)形成的納米粒子的吸光度標(biāo)準(zhǔn)化。b)納米粒子在水中的照片。從左到右：bpc、znbnc、bnc和onc。c)在高光密度下的吸收峰值波長漂移。在10μm路徑長度比色皿中測量濃縮溶液，并與在水中1000倍稀釋液相比較。將指示的納米粒子與吲哚菁綠(icg)和亞甲基藍(lán)(mb)進(jìn)行比較。對于n＝3，得到平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

圖26：納米粒子口服后安全通過腸道。a)在37℃下在模擬胃液(紅色)或模擬腸液(黑色)中透析的onc納米粒子的保留。對于n＝3，得到平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。b)在糞便(黑色)和尿液(紅色)中排出100光密度的onc納米粒子(“od”-一個od定義為用標(biāo)準(zhǔn)1cm路徑長度測量在1ml溶液中產(chǎn)生1個吸光度所需的納米顆粒的量)。對于n＝3只小鼠，得到平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。c)在糞便(黑色)和尿液(紅色)中排出100od的亞甲基藍(lán)(mb)。對于n＝3只小鼠，得到平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。d)對照小鼠(左)或灌胃100od的onc納米粒子24小時后的小鼠(右)，用蘇木精和曙紅染色的腸部分。絨毛和隱窩是完整的，沒有炎癥細(xì)胞的流入。比例尺，100μm。

圖27：使用納米粒子對腸道進(jìn)行無創(chuàng)解剖性和功能性pa成像。a)利用單個換能器pa系統(tǒng)灌胃100od的znbnc納米粒子后，納米粒子的pa最大強(qiáng)度投影(mip)。紅色箭頭顯示納米顆粒運(yùn)輸。b)深度編碼的pamip的腸可視化znbnc納米粒子。c)在灌胃100od的onc納米粒子后，具有pa信號(顏色)以及同時的us(灰色)采集的實(shí)時多模式小鼠腸橫斷面。d)腸中納米粒子運(yùn)動。黑色箭頭顯示流入，并且白色箭頭顯示流出。e)目的腸道區(qū)域分析。一階導(dǎo)數(shù)零交叉提供最大納米粒子流入(黑色三角形)和流出點(diǎn)(灰色三角形)的時間。f)隨時間繪制從該區(qū)域收縮運(yùn)動的速率。g)共注冊us用于納米粒子的解剖繪圖。膀胱(b)和腎臟(k)位于us(灰色)，而納米粒子pa信號以顏色顯示。h)us(灰色)/pa(彩色)橫切片的mip顯示onc納米粒子隨時間通過腸。mip用于在目的單個切片(左下)內(nèi)定向pa信號。參考兩個其它的在“b”(藍(lán)色)和“c”(灰色)中保持穩(wěn)定的納米粒子內(nèi)容物，示出了區(qū)域“a”(紅色)中的納米粒子的隨時間的流出定量。“a”的波動是由于納米粒子的收縮性流入和流出。i)us/pa檢測腸梗阻。將小鼠進(jìn)行十二指腸結(jié)扎或假手術(shù)。給予3.4mg(對應(yīng)于100od860)onc納米粒子，并且1小時后對小鼠成像。頂部顯示膀胱上方2.4cm的橫切片，顯示梗阻的小鼠中腫脹的胃。底部顯示us/pamip。在假手術(shù)組中，納米粒子的無阻塞流動是清楚的。虛線表示近似的手術(shù)切口部位，圖像寬度對應(yīng)于2.4cm。每組n＝3的代表圖像。實(shí)心標(biāo)尺，指示5mm。

圖28：用⁶⁴cu標(biāo)記的無縫納米粒子對gi腸道的全身pet成像。a)使用⁶⁴cu標(biāo)記納米粒子。f127peo塊顯示為藍(lán)色，ppo塊顯示為黑色，nc染料顯示為紅色并且⁶⁴cu顯示為放射性黃色圓圈。b)在37℃孵育的模擬胃液(紅色)、模擬腸液(藍(lán)色)和水(黑色)中放射性標(biāo)記的納米粒子中⁶⁴cu螯合的保留穩(wěn)定性。對于n＝3，得到平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。c)在灌胃100od的onc納米點(diǎn)后24小時后，小鼠中onc納米粒子和螯合的⁶⁴cu的糞便清除。利用γ計(jì)數(shù)評估⁶⁴cu并利用吸收評估納米粒子。對于n＝3到4只小鼠，得到平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。d)灌胃后24小時⁶⁴cu和納米粒子的生物分布。對于一些器官，由于沒有測量而沒有獲得數(shù)據(jù)(“n.d.”)。對于n＝3到4只小鼠，得到平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。e)納米粒子的代表性pet成像。灌胃100od的⁶⁴cu標(biāo)記的onc納米粒子，并在指定的時間點(diǎn)對小鼠成像。比例尺，1厘米。f)在灌胃后3小時，貫穿小鼠的代表性的0.8mm厚的冠狀切片。

圖29：作為初始f127濃度的函數(shù)的納米粒子的產(chǎn)量。在不同pluronicf127濃度的溶液中納米粒子形成后的納米粒子產(chǎn)量。由于溶液粘度增加超過該濃度，選擇10％(w/v)pluronicf127用于納米粒子制劑。對于n＝3，得到平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

圖30：用于在離心清洗期間測定游離f127濃度的校準(zhǔn)曲線。pluronicf127和硫氰酸鈷形成深藍(lán)色復(fù)合物(在623nm處的吸光度)。所呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)說明稀釋因子。對于n＝3，得到平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

圖31：洗滌循環(huán)的接觸角分析。基于接觸角分析確定除去游離f127所需的洗滌次數(shù)(角度如圖所示)。納米粒子在10％(w/v)的f127(“洗滌前”)樣品的溶液中形成，并且在采用離心洗滌步驟的cmc轉(zhuǎn)換后除去游離f127。

圖32：nc染料在二氯甲烷和水性納米粒子形式中的標(biāo)準(zhǔn)化吸收光譜。bpc、znbnc、bnc、vbpc、vbnc、onc、nionc分別用藍(lán)色、深綠色、黃綠色、紫色、粉紅色、琥珀色和黃色表示。成功形成的納米粒子相比于二氯甲烷光譜的偏移吸收光譜表明nc染料在納米粒子中的密集排列改變了一些電子性質(zhì)。

圖33：znbnc納米粒子的自淬滅熒光發(fā)射。在水中的吸收匹配的znbnc納米粒子和在二氯甲烷(dcm)中游離znbnc的熒光。

圖34：凍干znbnc納米粒子和純znbnc的x射線衍射光譜。盡管與pluronicf127相比，znbnc(灰色線)表現(xiàn)出弱的結(jié)晶性質(zhì)，但小的峰指示一些結(jié)晶取向(7°)。然而，這些在納米粒子形成后消失(黑線)。在納米粒子中觀察到的兩個大峰是由于基于peo結(jié)晶度的特征性pluronicf127晶體圖案。

圖35：znbnc、bnc和onc納米粒子的光聲光譜。將所示納米粒子的最大吸光度調(diào)節(jié)至10，并在vevolazr上的pe20管中進(jìn)行pa光譜掃描。

圖36：納米粒子在寬ph范圍內(nèi)保持接近中性ζ電位。將納米粒子稀釋到ph經(jīng)調(diào)節(jié)的磷酸鹽緩沖液中，并記錄ζ電位。對于n＝3，得到平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

圖37：濃度匹配納米粒子和金納米棒的光聲光譜。將onc納米粒子和金標(biāo)準(zhǔn)化為1.2mg/ml濃度，并且在vevolazr上記錄光聲光譜。納米棒質(zhì)量僅基于金。三個獨(dú)立試驗(yàn)的代表性試驗(yàn)。

圖38：與納米粒子或亞甲基藍(lán)孵育后的caco-2細(xì)胞活力。將濃縮的onc納米粒子和亞甲基藍(lán)溶液稀釋到caco-2細(xì)胞培養(yǎng)基中，最終的nir吸光度作為指示。將細(xì)胞與染料在含有20％血清的dmem培養(yǎng)基中在37℃下孵育24小時，然后采用xtt測定法評估存活率。對于n＝6，得到平均值±標(biāo)準(zhǔn)差?；趩我蛩胤讲罘治?one-wayanova)，在對照組和任何納米粒子治療組之間發(fā)現(xiàn)無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。對于亞甲基藍(lán)，基于單因素anova和圖基事后分析(tukey’sposthocanalysis)，星號標(biāo)記區(qū)別于未經(jīng)處理的對照的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的組(p<0.001)。

圖39：50,000od860/kg納米粒子是安全的口服納米粒子劑量。a)在灌胃1000od劑量后的小鼠體重。在2周的時間內(nèi)，小鼠沒有表現(xiàn)出痛苦或異常行為的跡象。對于每個雄性(+/-納米點(diǎn))和雌性(+/-納米點(diǎn))組，n＝5只小鼠，得到平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。在研究完成后(基于雙尾學(xué)生t檢驗(yàn)，p>0.05)，在治療和對照小鼠的質(zhì)量之間沒有觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。b)來自治療或?qū)φ招∈蟮膆&e染色的肝、脾、腎、肺和心。沒有觀察到系統(tǒng)毒性的跡象。c)基于h&e染色，包括食道、胃、小腸和大腸的胃腸道器官的組織學(xué)，顯示沒有明顯損傷。所有比例尺表示200μm。

圖40：雞胸模型中znbnc和onc納米粒子的信噪比。將吸光度匹配(～400的吸光度)的znbnc和onc納米粒子置于雞體模型中，并通過逐步添加雞乳腺組織監(jiān)測光聲信號。能量脈沖密度在710nm和860nm下分別為2mj/cm²和1.5mj/cm²。

圖41：銅標(biāo)記不影響納米粒子ζ電位或大小。將onc納米粒子(100od)在0、0.01、0.1、1、10mm冷cucl2中在37℃下溫育30分鐘，同時持續(xù)搖動。將標(biāo)記的納米粒子以離心過濾洗滌4次以除去過量的銅，并測量ζ電位。對于n＝3，得到平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。示出了對于10mm標(biāo)記條件的尺寸。

圖42：表示用示例性疏水劑形成的ss-infroms的性質(zhì)的表。logp是指通過alogps算法預(yù)測的試劑的疏水性的性質(zhì)。用動態(tài)光散射法評價最終制劑的尺寸和pdi(多分散指數(shù))。

圖43：示出納米粒子光學(xué)參數(shù)的表。

圖44：示出用⁶⁴cu標(biāo)記的納米粒子的表：使用每mci⁶⁴cu不同量的納米點(diǎn)的放射性標(biāo)記產(chǎn)率。除了作為單次實(shí)驗(yàn)的最大劑量，對于三次重復(fù)試驗(yàn)，數(shù)據(jù)表示平均值±sd。

發(fā)明內(nèi)容

本公開提供了用于在生物系統(tǒng)中運(yùn)輸疏水劑分子的組合物和方法。所述組合物包含負(fù)載疏水劑的膠束(本文中也稱為納米顆粒)。納米顆粒由表面活性劑分子(如泊洛沙姆)組成并且其中摻入了疏水劑。納米顆?？梢源嬖谟谳d體中，例如水性載體。本文所用的術(shù)語“摻入”是指疏水劑存在于膠束的疏水域中。

在一個實(shí)施方案中，本公開提供了遞送疏水性藥物的組合物和方法。本文所用的術(shù)語“藥物”是指為了治療、診斷或監(jiān)測生理功能的目的而遞送的任何試劑。在一個實(shí)施方案中，本公開提供了用于運(yùn)輸疏水性造影劑的組合物和方法。

在一個實(shí)施方案中，本公開提供了粉末形式的包含多個負(fù)載疏水劑的膠束的組合物。膠束可以是冷凍干燥的。所述組合物基本上或完全不含未締合的表面活性劑。例如，所述組合物基本上或完全不含未締合的泊洛沙姆。

在一個實(shí)施方案中，從組合物中除去構(gòu)成膠束的表面活性劑(例如，泊洛沙姆)的起始量的85％以上。剩余的泊洛沙姆形成膠束，其負(fù)載有疏水劑。在各種實(shí)施方案中，從組合物中除去高達(dá)90％、95％、99％或99.9％的起始量的泊洛沙姆。

在一個實(shí)施方案中，本公開提供了包含一種以上泊洛沙姆和一種以上類型的疏水劑(例如藥物或造影染料)分子的膠束。膠束可以是凍干形式。冷凍干燥的組合物基本上不含任何未締合的表面活性劑(即，為未嵌合形式或可以在低溫處理后呈現(xiàn)未嵌合形式的表面活性劑，例如空膠束、或任何非嵌合形式的泊洛沙姆、或其中單體彼此松散地締合，但是沒有將藥物分子并入其中)。

膠束含有可能密集填充但不結(jié)晶的疏水劑。由于低表面活性劑含量，膠束可以容易地通過例如過濾(如膜過濾)被進(jìn)一步濃縮。負(fù)載疏水劑的膠束組合物的剩余表面活性劑不是分散劑，而是形成膠束。

在一個實(shí)施方案中，所述組合物在合適的緩沖液中(如含有或不含有ph緩沖劑的糖溶液或鹽水溶液中，如檸檬酸鹽、磷酸鹽、組氨酸或谷氨酸鹽)含有膠束，并且基本上不含未締合的泊洛沙姆分子。

本公開的表面活性劑分子能夠溶解疏水性藥物，并且藥物表面活性劑復(fù)合物能夠形成膠束。在一個實(shí)施方案中，用于本公開的表面活性劑是包含至少疏水性和親水性嵌段的嵌段共聚物。在一個實(shí)施方案中，表面活性劑是三嵌段共聚物，例如泊洛沙姆。泊洛沙姆是具有不同分子量的聚氧化乙烯(peo)-聚氧化丙烯(ppo)-聚氧化乙烯三嵌段共聚物。例如，泊洛沙姆由中間疏水鏈聚丙烯(聚(氧化丙烯))組成，其側(cè)面是兩個親水鏈聚氧乙烯(聚(氧化乙烯))。泊洛沙姆是可商購的，例如商品名為許多泊洛沙姆在本領(lǐng)域中是已知的，包括泊洛沙姆氏f87、f88、f98、f108、f127等。

在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物包含膠束，其包含選自泊洛沙姆氏f127、f68、f108及其組合的表面活性劑，以及一種以上疏水劑。在一個實(shí)施方案中，存在于膠束中的唯一表面活性劑是泊洛沙姆。在一個實(shí)施方案中，膠束中唯一的表面活性劑是f127、f68和/或f108。在一個實(shí)施方案中，沒有其它表面活性劑存在于包含膠束的組合物中，所述膠束包含、基本上由或由泊洛沙姆表面活性劑組成并且具有摻入其中的疏水性負(fù)載物分子。

本公開的藥物可以是為了診斷或監(jiān)測生理功能或改善、治療、預(yù)防、診斷或監(jiān)測病理狀況的目的施用于個體所需的任何疏水性分子。因此，治療性和非治療性疏水劑可以通過該方法遞送。

用于本公開的藥物或造影染料通常是疏水性的。在一個實(shí)施方案中，辛醇-水分配系數(shù)(例如logp值，用alogps算法預(yù)測)為至少2。在一個實(shí)施方案中，辛醇-水分配系數(shù)為2至11。在一個實(shí)施方案中，辛醇-水分配系數(shù)為3至11。在各種實(shí)施方案中，其為3、4、5、6、7、8、9、10和11。

在一些實(shí)施方案中，所述疏水性藥物為α-生育酚、阿巴芬凈、胺碘酮、阿奇霉素二水合物、芐普地爾、β-胡蘿卜素、布地奈德、卡巴他賽、卡馬西平、鈣化醇、卡維地洛、氯喹、氯丙嗪、膽鈣化醇、克霉唑、輔酶q10、可替寧、賽克利嗪、環(huán)孢霉素a、地西泮、多西他賽、益康唑、維生素d2、依托泊苷、芬太尼、非諾貝特、非那雄胺、氟維司群、氟哌啶醇、安度利可、伊曲康唑、伊維菌素、拉貝洛爾、拉坦前列素、美洛昔康、咪康唑、米非司酮、霉酚酸酯、尼莫地平、紫杉醇、苯妥英、吡羅昔康、孕烯醇酮、孕烯醇酮醋酸酯、孕酮、異丙酚、利血平、視黃醇、視黃醇棕櫚酸酯、舍他康唑、西布曲明、辛伐他汀、西羅莫司、角鯊烯、他克莫司、他莫昔芬、西羅莫司脂化物、睪酮、環(huán)戊丙酸睪酮、丙酸睪酮、十一酸睪酮、替拉那韋、曲伏前列素、去炎松、維生素k1及其組合。

在一些實(shí)施方案中，疏水劑是造影染料，例如發(fā)色團(tuán)。用于本公開的發(fā)色團(tuán)可以是適于成像的任何疏水性造影劑。合適的發(fā)色團(tuán)的實(shí)例包括四吡咯類及其類似物和衍生物，包括卟啉及其衍生物、二氫卟吩及其衍生物(包括葉綠素a、脫鎂葉綠素a和相關(guān)化合物)、酞菁及其衍生物、萘酞菁及其衍生物、菌綠素及其衍生物、細(xì)菌葉綠素及其衍生物。合適的發(fā)色團(tuán)的特征是：在適于生物體內(nèi)成像的光譜區(qū)域中高光吸收。這通常包括在600-1000nm范圍內(nèi)的近紅外吸收。在一個實(shí)施方案中，染料是酞菁或萘酞菁衍生物。合適的染料包括但不限于2,11,20,29-四-叔-丁基-2,3-萘酞菁(bnc)、2,11,20,29-四-叔-丁基-2,3-萘酞菁鋅(znbnc)、5,9,14,18,23,27,32,36-八丁氧基-2,3-萘酞菁(onc)、5,9,14,18,23,27,32,36-八丁氧基-2,3-萘酞菁鎳(nionc)、2,11,20,29-四-叔-丁基-2,3-萘酞菁氧釩(vbnc)、2,9,16,23-四-叔-丁基-29h,31h-酞菁(bpc)、3,10,17,24-四-叔-丁基-1,8,15,22-四(二甲氨基)-29h,31h-酞菁氧釩(vbpc)。也包括這樣的染料的衍生物和類似物，其以四吡咯結(jié)構(gòu)和疏水性為特征，使得辛醇-水分配系數(shù)(通過測量或通過alogps算法預(yù)測確定)為至少2。

疏水劑與泊洛沙姆的起始摩爾比可以在0.02:1至3:1的范圍內(nèi)，并且在制備如本文所述的膠束組合物的方法之后，疏水劑:泊洛沙姆比可以高達(dá)55:1。在一個實(shí)施方案中，疏水劑是藥物，并且起始藥物:泊洛沙姆的摩爾比為0.1:1至3:1，而最終摩爾比為7:1至55:1。在一個實(shí)施方案中，疏水劑是光學(xué)造影染料，并且起始染料:泊洛沙姆的摩爾比為0.02:1至1:1，而最終摩爾比為3:1至10:1。

在一個實(shí)施方案中，所述組合物包含含有藥物和表面活性劑分子的膠束，并且基本上不含未締合的表面活性劑分子。在一個實(shí)施方案中，所有(或基本上所有)疏水劑分子以摻入到泊洛沙姆膠束中的形式存在，并且不存在未摻入膠束中的疏水劑分子(或小于1％)。在各種實(shí)施方案中，存在少于0.5％或0.1％(以及其間至小數(shù)第十位的所有百分比值)的未摻入膠束中的疏水劑分子。因此，組合物具有疏水劑分子摻入其中的膠束，但基本上缺乏空的膠束，即不具有摻入其中的疏水劑分子或未嵌合的或松散締合的表面活性劑分子的膠束。在一個實(shí)施方案中，本公開的組合物包含至少90％的所有存在于其中摻入了疏水劑分子的膠束中的表面活性劑分子。在各種實(shí)施方案中，所述組合物包含至少91、92、93、94、95、96、97、98、99％的存在于其中摻入了疏水劑分子的膠束中的表面活性劑分子。在一個實(shí)施方案中，所述組合物包含100％的存在于其中摻入了疏水劑分子的膠束中的表面活性劑分子，使得不存在可檢測到的未締合的表面活性劑分子。因此，各種實(shí)施方案提供了這樣的組合物，所述組合物中存在的10％以下的總表面活性劑分子不與負(fù)載疏水劑的膠束締合。在各種實(shí)施方案中，組合物具有9％以下、8％以下、7％以下、6％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、1％以下或小于1％的總表面活性劑分子不與負(fù)載疏水劑的膠束締合。

本發(fā)明的組合物還可以含有合適量的其它組分，例如鹽(nacl、kcl或其它鹽類)、糖、ph緩沖劑等，包括用于施用于個體的制劑中使用的任何其它組分。例如，鹽濃度可以高達(dá)4m。

本發(fā)明的膠束組合物很好地分散，并且沒有明顯的膠束聚集。在一個實(shí)施方案中，通過亞微米過濾技術(shù)和/或動態(tài)光散射技術(shù)和/或通過目視檢查(表現(xiàn)為渾濁的外觀)，沒有檢測到可檢測到的聚集。在一個實(shí)施方案中，組合物包含高度均勻并且是單分散的(基于動態(tài)光散射的動態(tài)光散射多分散指數(shù)小于0.5)的納米顆粒。在一個實(shí)施方案中，多分散指數(shù)為0.05至0.5。在各種實(shí)施方案中，納米顆粒具有0.4以下、0.35以下、0.3以下、0.2以下、0.1以下或0.05以下的多分散指數(shù)。在各種實(shí)施方案中，納米顆粒具有0.4至0.05、0.35至0.05、0.3至0.05、0.2至0.05或0.1至0.05的多分散指數(shù)。

本公開的組合物具有高疏水劑:表面活性劑摩爾比。在一個實(shí)施方案中，該比例為0.5:1至50:1(以及它們之間的所有比例和范圍)。在一個實(shí)施方案中，所述比例為1:1至55:1。例如，所述比例為1:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1或55:1。在實(shí)施方案中，所述比例為3:1至10:1、10:1至50:1、10:1至55:1、10:1至60:1(以及它們之間的所有比例)。在一個實(shí)施方案中，疏水劑是藥物，并且組合物中藥物:泊洛沙姆摩爾比為至少10:1，可以高達(dá)50:1，高達(dá)55:1或高達(dá)60:1(以及它們之間的所有比例)。例如，在實(shí)施方案中，藥物:泊沙沙姆比為10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1或60:1。在一個實(shí)施方案中，疏水劑是造影劑(染料)，并且組合物中的染料:泊洛沙姆摩爾比為至少3:1，并且可以高達(dá)10:1(以及它們之間的所有比例)。例如，染料:泊洛沙姆比為3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、6.5:1、7:1、7.5:1，8:1、8.5:1、9:1、9.5:1或10:1。

膠束具有10至250nm之間的尺寸(直徑)。在一個實(shí)施方案中，膠束具有15至250nm(以及其間的所有整數(shù)納米值)的尺寸。在一個實(shí)施方案中，至少90％的膠束在15-250或15-100nm范圍內(nèi)。在一個實(shí)施方案中，平均尺寸為20-100nm直徑。在一個實(shí)施方案中，平均尺寸為20-120nm。在各種實(shí)施方案中，其為20、30、40和50、60、70、80、90、100、110或120nm。在一個實(shí)施方案中，膠束中至少80-90％(以及其間的所有整數(shù)百分比值)在20-100nm(以及其間的所有整數(shù)納米值)的范圍內(nèi)。在一個實(shí)施方案中，至少80-90％(以及其間的所有整數(shù)百分比值)的膠束在20-120nm(以及其間的所有整數(shù)納米值)的范圍內(nèi)。在一個實(shí)施方案中，超過90％的膠束在20-100nm范圍內(nèi)或在20-120nm范圍內(nèi)。在一個實(shí)施方案中，91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的膠束在20-100nm范圍內(nèi)或在20-120nm范圍內(nèi)。

在一個實(shí)施方案中，本公開的組合物用于成像應(yīng)用，并包含多個平均尺寸為15至40nm(以及其間所有整數(shù)納米值)的冷凍膠束。在一個實(shí)施方案中，平均尺寸為20-30nm(直徑)。在各種實(shí)施方案中，其為20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30nm。在一個實(shí)施方案中，至少80-90％(以及其間的所有整數(shù)百分比值)的膠束在20-30nm(以及其間所有整數(shù)納米值)的范圍內(nèi)。在一個實(shí)施方案中，超過90％的膠束在20-30nm范圍內(nèi)。在一個實(shí)施方案中，91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的膠束在20-30nm范圍內(nèi)。在另一個實(shí)施方案中，至少90％的膠束在15-40nm范圍內(nèi)。

組合物可以根據(jù)如下制備。將疏水劑溶解在有機(jī)溶劑中，例如以10mg/ml至200mg/l的試劑濃度，并加入到泊洛沙姆水溶液中，例如5、10或15％w/v的泊洛沙姆，并使有機(jī)溶劑蒸發(fā)(主動或被動方式)。通過過濾或離心除去較大的聚集體(如果有的話)。去除未摻入的泊洛沙姆(即，與疏水劑分子未締合的泊洛沙姆)。在一個實(shí)施方案中，去除是通過改變條件而促進(jìn)的，使得形成空膠束的表面活性劑、或與膠束松散地或外周締合的表面活性劑改變?yōu)閱误w(未嵌合的形式)。當(dāng)這樣完成時，空膠束或松散締合的表面活性劑成為未嵌合的，然后變得更容易除去。在一個實(shí)施方案中，這是通過臨界膠束濃度(cmc)切換實(shí)現(xiàn)的，即通過將溫度降低到或低于cmt的溫度，從而使得膠束變成未嵌合形式。在一個實(shí)施方案中，形成未嵌合形式的溫度可以是從30℃至0℃(以及其間至小數(shù)第十位的所有溫度值)的任何溫度。在一個實(shí)施方案中，降溫溫度為從室溫(25℃)至0℃。在一個實(shí)施方案中，降溫溫度為從25℃至1℃或從22℃至1℃。在一個實(shí)施方案中，降溫溫度為從20℃至1℃(以及其間至小數(shù)第十位的所有溫度值)。在一個實(shí)施方案中，降溫溫度為從10℃至-20℃(以及其間至小數(shù)第十位的所有溫度值)。在一個實(shí)施方案中，不需要降低溫度，并且可以通過使用其它溶劑或鹽條件通過其它方式實(shí)現(xiàn)從空膠束到單體的轉(zhuǎn)化。在一個實(shí)施方案中，降溫溫度為從0℃至-20℃(以及其間至小數(shù)第十位的所有溫度值)。

在一個實(shí)施方案中，例如，將澄清溶液(將疏水劑(在溶劑中)加入到泊洛沙姆水溶液中并使溶劑蒸發(fā)后得到)在冰上冷卻，并使用在4℃下以500至5000g持續(xù)通常10至100分鐘的時間進(jìn)行離心過濾，直到保留顯著體積的溶液(例如100至1000ul)。用于過濾的離心力可以為2,000g以上。例如，離心力可以為2,000g至4,000g。離心可以在1℃至室溫、或1℃至10℃、或4℃至10℃下進(jìn)行。在一個實(shí)施方案中，在1至10℃下以3,500g持續(xù)25分鐘來進(jìn)行離心?？梢詫⑺踊氐綕饪s物中。將保留物進(jìn)行一次或多次洗滌和離心過濾。因此，可以根據(jù)需要重復(fù)洗滌和過濾。在一個實(shí)施方案中，洗滌和過濾程序重復(fù)2至8次(以及其間的所有整數(shù))。在一個實(shí)施方案中，重復(fù)3次。在另一個實(shí)施方案中，采用滲濾以連續(xù)方式進(jìn)行洗滌，而不是離散步驟。在一個實(shí)施方案中，洗滌和過濾程序使得通過洗滌除去最初用于制備制劑的表面活性劑的至少60％。在各種實(shí)施方案中，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％和所有所述未締合的表面活性劑被除去。可以通過確定洗滌液中出現(xiàn)的表面活性劑來檢查表面活性劑的所需量是否被除去。在一個實(shí)施方案中，將組合物進(jìn)行洗滌，直到在洗滌液(或?yàn)V液)中沒有發(fā)現(xiàn)可檢測到的表面活性劑。例如，我們觀察到通常在三次或四次洗滌后，在進(jìn)一步洗滌中沒有可檢測到的表面活性劑。表面活性劑可以用標(biāo)準(zhǔn)方法如比色硫氰酸鈷方法檢測。

組合物的物理和光學(xué)性質(zhì)可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測定。粒度測量和均勻性也可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如透射電子顯微鏡等來確定。穩(wěn)定性可以通過相對于相關(guān)流體的透析來評估。

在一個實(shí)施方案中，一種以上共負(fù)載劑(例如疏水性分子，如維生素e和/或輔酶q)與藥物一起使用以制備膠束。觀察到使用維生素e共負(fù)載藥物導(dǎo)致膠束中藥物負(fù)載的協(xié)同增加。在一個實(shí)施方案中，紫杉醇與維生素e或輔酶q一起使用以形成膠束。在一個實(shí)施方案中，多西他賽與維生素e一起使用以形成膠束。共負(fù)載劑相對于目的藥物的摩爾比可以在0.1:1至10:1的范圍內(nèi)。

本發(fā)明的組合物可以新鮮使用，或者可以儲存為冷凍水溶液或儲存在室溫或其間任何溫度(如25℃至0℃)下。組合物也可以冷凍干燥并干燥儲存。因此，組合物可以儲存，然后以比可獲得的先前組合物更濃縮的形式重構(gòu)。

如果疏水性酞菁或萘酞菁用作疏水劑，則可將所得溶液濃縮至具有至少高達(dá)500個吸光度單位的近紅外吸光度。在一個實(shí)施方案中，納米顆?？梢员豢蓹z測地標(biāo)記。例如，通過與疏水劑形成金屬絡(luò)合物，如在染料的大環(huán)內(nèi)，對納米粒子進(jìn)行放射性標(biāo)記或磁性標(biāo)記。在一個實(shí)施方案中，納米顆粒用⁶⁴cu標(biāo)記。它們可以用mn標(biāo)記用于mri檢測。

對于使用本發(fā)明的組合物，可以通過任何合適的給藥途徑進(jìn)行給藥。例如，組合物可以口服、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、肌內(nèi)、粘膜、瘤內(nèi)、局部或任何其它給藥方式給藥。

所述組合物可用于成像技術(shù)，如光學(xué)成像(包括光聲成像和熒光成像)，以及全身技術(shù)，如正電子發(fā)射斷層攝影(pet)成像，磁共振成像(mri)等。我們觀察到，當(dāng)負(fù)載染料的膠束用于成像時，膠束可以承受胃和腸環(huán)境的惡劣條件，避免全身吸收，并為光聲成像產(chǎn)生良好的光學(xué)對比度。用于成像應(yīng)用的負(fù)載染料的膠束在本文中稱為納米粒子。

在一個實(shí)施方案中，膠束具有可調(diào)并且大的近紅外吸收值(>1000)。例如，吸光度是用相同染料制備的傳統(tǒng)脂質(zhì)體制劑的吸光度的500至1000倍大。在一些實(shí)施方案中，納米顆粒具有約650至約1000nm的峰值發(fā)射。

與常規(guī)發(fā)色團(tuán)不同，納米粒子在超高光密度下顯示出非移動光譜，并且在小鼠口服給藥后安全通過胃腸道。在一個實(shí)施方案中，非侵入性、非電離光聲技術(shù)可用于顯示納米粒子腸分布，具有低背景和0.5厘米深度的分辨率?？梢酝ㄟ^改進(jìn)的pat技術(shù)進(jìn)行更深的成像。這允許實(shí)時腸功能成像以及超聲影像融合。在一個實(shí)施方案中，可以使用其它成像技術(shù)，例如正電子發(fā)射斷層顯像。本公開提供了使用放射性標(biāo)記的納米粒子的pet的數(shù)據(jù)，允許補(bǔ)充全身成像。

為了用于成像，將本發(fā)明組合物口服給予個體或以其它方式遞送至胃腸道。個體可以是人或非人動物。在臨床前研究中，我們給出了100od的劑量，并且這導(dǎo)致通過光聲成像的強(qiáng)信號檢測?？梢詧?zhí)行高分辨率掃描以及實(shí)時成像。例如，在灌胃100od的組合物后，可以監(jiān)測消化系統(tǒng)中納米粒子的移動。術(shù)語od代表“光密度”并且是不依賴于體積的吸光度測量量(“od”-一個od被定義為在用標(biāo)準(zhǔn)1cm路徑長度測量的1ml溶液中產(chǎn)生1個吸光度所需的納米顆粒的量)。這允許評價目的區(qū)域并且還分析蠕動、腸梗阻等。另外，可以通過使用放射性標(biāo)記的納米粒子(例如用⁶⁴cu標(biāo)記的納米粒子)進(jìn)行成像技術(shù)，如pet掃描。然后可以執(zhí)行圖像重建。

光聲(pa)成像是比其它光學(xué)方法具有更深的穿透的非電離模式。儀器成本低，并且系統(tǒng)小且模塊化，可以廣泛地用于常規(guī)臨床探查慢性和急性gi癥狀。pa成像是數(shù)據(jù)豐富、固有的實(shí)時模態(tài)，適合于成像動態(tài)腸道過程，如蠕動和分割，無需空間分辨率犧牲。此外，pa成像是安全的，非侵入性和非電離模式，其匹配gi成像的優(yōu)選特征，特別是在兒科患者的情況下。pa技術(shù)對成像外源近紅外(nir，650-1000nm)造影劑特別有用。由于它們對身體示出可忽略的全身吸收，本發(fā)明的組合物可用于這種模式。由于隨后造影劑從腸的損失將導(dǎo)致信號減少，干擾定量測量并引入毒性問題，這是重要的。本發(fā)明組合物的納米顆粒在胃和腸的苛刻的化學(xué)和消化環(huán)境中也不降解。

本發(fā)明的組合物可以通過其它途徑施用，包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)或任何其它途徑以到達(dá)感興趣的區(qū)域。本發(fā)明的組合物還可以用于其它器官和系統(tǒng)的成像。例如，所述組合物可在局部區(qū)域或更普遍的用于淋巴系統(tǒng)的成像，以及用于靜脈內(nèi)給藥后的血液血管成像。為了使淋巴結(jié)成像，可以將其注射到淋巴系統(tǒng)中。這些系統(tǒng)的成像可以以與用于對胃腸道成像的描述類似的方式進(jìn)行。

提供以下實(shí)施例以說明本發(fā)明。它們不旨在以任何方式限制。

實(shí)施例1

該實(shí)施例描述了膠束的制備及其特征。除非另有說明，材料得自sigma公司。

材料和方法

pluronicf127(sigma公司，p2443)、pluronicf68(sigma公司，412325)、cremophorel(sigma公司，c5135)、cremophorrh40(sigma公司，07076)、二氯甲烷(fisher公司)、葉綠醌(維生素k1，vwr公司，aaal10575-03)、環(huán)孢霉素a(vwr公司，89156-334)、2,6-二異丙基苯酚(異丙酚，vwr公司，aaal06841-14)、氟維司群(biorbyt公司，orb62178)、胺碘酮鹽酸鹽(vwr公司，aaj60456-03)、伊維菌素(vwr公司，aaj62777-03)、十一酸睪酮(matrix公司，099258)、膽鈣化醇(vwr公司，tcc0314)、視黃醇棕櫚酸酯(vwr公司，ic15652125)、西羅莫司脂化物(lclabs公司，t-8040)、米非司酮(vwr公司，tcm1732)、視黃醇(kracker公司，45-t3634)、輔酶q10(kracker公司，45-c9538)、多西他賽(lclabs公司，d-1000)、紫杉醇(lclabs公司，p-9600)、卡巴他賽(proactivemolecularresearch公司)、角鯊烯(sigma公司)以及5,9,14,18,23,27,32,36-八丁氧基-2,3-萘酞菁(onc，得自sigma公司)、2,11,20,29-四叔丁基-2,3-萘酞菁(得自sigma的bnc)、2,9,16,23-四-叔-丁基-29h,31h-酞菁、鋅2,11,20,29-四-叔-丁基-2,3-萘酞菁(得自sigma的zn-bnc)。

通過旋轉(zhuǎn)4ml10％(w/v)普朗尼克(pluronic)或克列莫佛(cremophor)水溶液，然后將溶液置于離心過濾管(fisher公司，#ufc810024)中并在4℃或25℃下用3500g旋轉(zhuǎn)25分鐘進(jìn)行表面活性劑保留實(shí)驗(yàn)(圖1)。在將水加回到保留物至4ml之后，將溶液在3500g下進(jìn)行第二次離心10分鐘。將蒸餾水加入到最終保留物中至4ml，并且通過比色法和1,6二苯基-1,3,5-己三烯(dph)探針法測定pluronic和cremophor濃度。具體地，通過首先通過將0.3g硝酸鈷六水合物和1.2g硫氰酸銨溶解在3ml水中制備的硫氰酸鈷試劑來測定普朗尼克濃度。然后將100μl硫氰酸鈷溶液、40μl濃度范圍在0-7.5wt％的f127溶液(更濃縮的f127溶液稀釋至適合的范圍)、200μl乙酸乙酯和80μl乙醇合并。將混合物輕輕渦旋并在14000×g離心1分鐘。除去藍(lán)色上清液，用乙醚洗滌藍(lán)色沉淀幾次(～5)次，直到上清液變?yōu)闊o色。然后將沉淀溶解在1ml丙酮中以測量在623nm處的吸光度。對于dph探針法，將50μl0.4mmdph的甲醇儲備溶液加入1ml濃度為0-1％(wt)的cremophor溶液中。在黑暗中平衡至少3小時后，記錄356nm處的uv-vis吸收強(qiáng)度。

藥物吸收保留實(shí)驗(yàn)(圖2)開始于溶解onc藥物的表面活性劑溶液形成。簡言之，將2ml的溶解onc的dcm溶液(濃度：0.4mgonc/mldcm)滴加到6ml的10％pluronic或cremophor水溶液中。攪拌至少4小時以使dcm蒸發(fā)后，將所得溶液以3500g離心10分鐘，然后將1ml上清液在3500g下低溫離心15分鐘，重復(fù)三次；在每次離心之前，將蒸餾水加入到起始溶液或濃縮物中，體積為4ml。在約863nm測量uv-vis吸收。

藥物infroms形成開始于疏水性藥物溶解到f127溶液中。將100ul儲備溶液(50mg藥物/mldcm)(對于紫杉烷藥物共負(fù)載實(shí)驗(yàn)，將指定量的維生素e或coq10與紫杉烷藥物一起溶解在儲備溶液中)滴加入將1ml10％(w/v)f127溶液(對于環(huán)孢霉素a為具有0.5、1、2、3mnacl或kcl的10％f127溶液；對于丙酚和胺碘酮為水或具有0.15、0.5、1mnacl的10％f127)，同時攪拌3小時。然后將所得溶液進(jìn)行幾次低溫離心洗滌。對于大規(guī)模infroms形成，將30mg藥物溶解于150mldcm中，將所得溶液逐滴加入750ml10％(w/v)f127/f68溶液中。相反，通過使用單模塊vivaflow200(sartorius)的透濾法除去過量的f127/f68。在perkinelmerxls上使用具有1cm路徑長度的石英比色杯測量吸光度。在nanobrook90pluspals機(jī)器上測量尺寸。對于保留在共負(fù)載實(shí)驗(yàn)中od的定量，平行進(jìn)行維生素e和coq10單獨(dú)(無藥物)infroms對照，并減去藥物特征峰處的吸光度。對于摩爾比測定，將濃縮的infroms凍干。然后測定infroms粉末的質(zhì)量，將粉末溶解在二氯甲烷中以確定藥物質(zhì)量?；诳們龈少|(zhì)量的差異確定f127或f68的質(zhì)量。

首先，我們在4℃和25℃的離心過濾期間檢查了幾種普朗尼克表面活性劑以及cremophorel和rh40的10％(w/v)溶液的保留。當(dāng)處于膠束形式時，表面活性劑不容易通過過濾膜中的孔。如圖1所示，由于其溫度敏感的臨界膠束濃度(cmc)，pluronicf127保持在較高溫度，但在低溫(4℃)下除去。然而，都具有較高cmc的f68和f108可以在25℃和4℃下利用離心過濾除去。我們檢查的cremophors不能通過離心過濾去除。我們接下來檢查表面活性劑是否可以與疏水萘酞菁形成冷凍膠束，其將具有更大的尺寸并因此在離心過濾期間保留。從二氯甲烷溶液中加入萘酞菁并滴入表面活性劑的攪拌溶液中。使有機(jī)溶劑蒸發(fā)，然后將藥物在4℃下進(jìn)行離心過濾。在除去所有普朗尼克的條件下，大量的萘酞菁藥物通過冷凍膠束保持溶解。(圖2)。在另一個實(shí)施例中，使用在水中包含10％w/w的表面活性劑的擴(kuò)展組來重復(fù)該洗滌過程，包括pluronicf127、pluronicf108、pluronicf68；聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯80；cremophorel、cremophorrh40；tergitolnp9、tergitolnp10、tergitolnp40；聚氧乙烯脂肪醇醚(brij)97、brij35、brijl23、brijo20；并且4℃洗滌重復(fù)三次。如圖17所示，只有普朗尼克類可以在洗滌過程中產(chǎn)生高吸光度。

實(shí)施例2

評估維生素k1是否適合形成誘導(dǎo)的冷凍膠束。維生素k1是涉及血液凝固的疏水性分子，有時靜脈內(nèi)給予。如圖3a所示，在pluronicf127中溶解后，維生素k1誘導(dǎo)的冷凍膠束形成，離心過濾可以除去大多數(shù)表面活性劑，留下純化的維生素k1informs，其具有特征吸收光譜(圖3b)。這些ss-infroms的大小為100nm(圖3c)。重要的是，當(dāng)與f68形成時，發(fā)現(xiàn)其具有高達(dá)20:1的藥物:表面活性劑，其是臨床制劑超過兩個數(shù)量級高(圖3d)。在目前只能利用甘氨膽酸表面活性劑的混合膠束形式之前，維生素k1之前是與cremophor表面活性劑臨床配制的。這種添加劑可以取代膽紅素，并不總是建議患有晚期肝病的患者使用。

實(shí)施例3

在維生素k1的另一個實(shí)施例中，使用透濾法。將150mg維生素k1溶解于1.5ml二氯甲烷(dcm)中，并加入15ml10％(w/v)f127并攪拌直至有機(jī)溶劑蒸發(fā)。將溶液用水稀釋至75ml體積，在4℃進(jìn)行膜過濾(sartoriusvivaflow公司，1501008vs)，以除去未摻入的f127，并收集5份濾液級分(每次200ml)。維生素k1的保留通過吸光度測量定量，而f127通過硫氰酸鈷方法定量。如圖18a所示，維生素k1在洗滌過程中保留，而f127被除去。如圖18b所示，基于透射電子顯微照片，這產(chǎn)生尺寸小于100nm的納米顆粒。如圖42所示，藥物:f127的摩爾比為39.5:1；典型的濃縮溶液可達(dá)到150mg/ml的維生素k1，尺寸為74nm，多分散指數(shù)為0.25。當(dāng)使用差示掃描量熱法探測起始f127溶液時，觀察到超過2j/g的膠束化焓，峰值在20℃附近(圖18c)。在維生素k1添加后，焓峰變小約50％，顯示大部分游離f127保留在溶液中。然而，在洗滌過程后，在ss-infroms中沒有觀察到可檢測的膠束化焓。如圖18d所示，維生素kinfroms摻雜有1％的2,9,16,23-四-叔-丁基-29h,31h,酞菁(bpc)、用于znbpc(鋅,2,22,20,20-四-叔-丁基-2,3-萘酞菁)的fret供體。通過將0.5mgbpc、49.5mg維生素k1溶解在500μl二氯甲烷中制備供體dcm溶液。受體二氯甲烷溶液通過將5mgznbnc和45mg維生素k1溶解在500μl二氯甲烷中制備。由0.5mgbpc、5mgznbnc和44.5mg維生素k1在500μl二氯甲烷中制備預(yù)混合供體和受體二氯甲烷溶液。將上述三種二氯甲烷溶液分別加入3個分別的5ml10％(w/v)f127中，然后攪拌至有機(jī)溶劑蒸發(fā)。通過在攪拌后將供體溶液和受體溶液(1:1，v/v)組合制備后混合供體和受體。然后在熒光計(jì)上測量熒光。當(dāng)分別由fret供體和受體形成infroms，然后隨后組合時，即使在洗滌過程后也沒有發(fā)生明顯的能量轉(zhuǎn)移。當(dāng)將fret供體和受體在有機(jī)溶劑中混合以產(chǎn)生infroms時，觀察到大量的fret。這些觀察結(jié)果證實(shí)了ss-infroms的動力學(xué)冷凍性質(zhì)。使用滲濾方法，基于nmr分析，觀察到超過40:1的標(biāo)準(zhǔn)維生素k1ss-infroms的高表面活性劑-藥物摩爾比，是現(xiàn)有制劑的幾階數(shù)量級大(圖18e)。如圖18f所示，當(dāng)對小鼠靜脈內(nèi)給藥時，維生素k1ss-infroms可有效地抵抗華法林給藥的作用。在維生素k1informs靜脈內(nèi)注射之前，將6周齡雌性icr小鼠(harlan)喂飼華法林鈉溶液24小時。小鼠(n＝6)靜脈注射維生素kss-informs劑量0、1、2、5mg/kg。其余組用作對照，不服用華法林或任何注射。24小時后，取小鼠血液，通過coagucheckxs系統(tǒng)(roche)測定小鼠血液的inr值。

當(dāng)在維生素k1infroms的洗滌濾液中測量未締合和剝離的f127的量時，在充分洗滌后，不能檢測到進(jìn)一步的f127(圖19)。這表明ss-infroms已經(jīng)去除了未締合普朗尼克。

實(shí)施例4

評估環(huán)孢霉素a是否適合形成誘導(dǎo)的冷凍膠束。環(huán)孢霉素a是一種免疫抑制藥物，有時在cremophor溶液中靜脈內(nèi)給予。通過將鹽添加到普朗尼克溶液中可以增強(qiáng)環(huán)孢霉素inform形成(圖4a)。我們假設(shè)的原因是鹽使溶液更離子化和親水，導(dǎo)致更加穩(wěn)定的疏水性負(fù)載物分配到冷凍的膠束核心?？梢詮膇nforms中洗去多余的普朗尼克(圖4b)。尺寸接近100nm，并且溶液具有特征吸收峰(圖4c、d)。

實(shí)施例5

在環(huán)孢霉素a的另一個實(shí)施例中，將10mg環(huán)孢霉素a溶解在1ml二氯甲烷中，并加入含有0、1、2、3mnacl的10ml10％(w/v)f127溶液。攪拌3小時后，將溶液在0℃(對于0m和1m)或-10℃(對于2m和3m)下進(jìn)行離心過濾，直至保持～200μl的溶液或保留物體積保持不變，將相應(yīng)的鹽溶液加回到濃縮物中，洗滌步驟進(jìn)行三次。將保留物通過0.45μm過濾器，然后使用高效液相色譜(hplc)定量環(huán)孢霉素a的濃度。為了將pluronicf127的去除百分比定量為不同溫度下鹽濃度的函數(shù)，保存濾液，并使用硫氰酸鈷方法。如圖42所示，藥物:f127的摩爾比為15:1；典型的濃縮溶液可以達(dá)到7mg/ml的環(huán)孢霉素a，尺寸為165nm，多分散指數(shù)為0.34。鹽對在ss-infroms中的環(huán)孢霉素a的產(chǎn)量的影響如圖20a所示。高滲鹽水增加產(chǎn)量。圖20b顯示通過低溫洗滌(-10℃)可以在高滲鹽水中有效地除去游離的普朗尼克。如圖20c所示，在ss-infroms中環(huán)孢霉素a的摩爾比是現(xiàn)有的臨床制劑的幾個數(shù)量級高。當(dāng)環(huán)孢霉素a的ss-infroms在注射羊紅細(xì)胞之前施用于小鼠時，其有效抑制免疫系統(tǒng)反應(yīng)，如對免疫抑制藥物所預(yù)期的那樣(圖20d)。

實(shí)施例6

通過將100mg藥物溶解在1ml二氯甲烷(dcm)中并將其添加到10ml10％(w/v)f127溶液(含或不含nacl)中并攪拌直到有機(jī)溶劑蒸發(fā)而產(chǎn)生許多其它疏水藥物的ss-infroms。然后去除未摻入的f127，包括：1)離心過濾f127剝離方法：在低溫(0℃，4℃或-10℃)下對溶液進(jìn)行離心過濾(fisher#ucf9-100-24)直到保留約200μl的溶液(或保留物的體積不變)。將水(或nacl溶液)加回到濃縮物中，并將洗滌過程重復(fù)三次。2)滲濾過濾方法：對于大規(guī)模(>15ml)或高鹽(>2或3m)溶液，通過用裝配有蠕動泵(masterflexl/s)和管道(masterflex6434-16在低溫(對于2m為-7℃，對于3m為-12℃和對于4m為-16℃)下)的膜過濾(sartoriusvivaflow，1501008vs)進(jìn)行去除過程。為了達(dá)到更低的溫度并使f127去除百分比最大化，將膜組件、管道和待洗滌的溶液浸入乙二醇和乙醇(v/v＝9:1)的混合物中，并使用干冰作為冷卻劑。評估氟維司群是否適合形成誘導(dǎo)的冷凍膠束。氟維司群是一種可注射激素化療藥物。如圖5a所示，加入pluronic后形成氟維司群膠束，然后可以洗掉過量的pluronic，而氟維司群保留在氟維司群informs中。溶液具有特征吸收光譜(圖5b)。

實(shí)施例7

評估胺碘酮是否適合形成誘導(dǎo)的冷凍膠束。胺碘酮是一種可注射的心臟藥。如圖6a所示，氯化鈉大大增強(qiáng)了胺碘酮inform的形成?？梢韵吹暨^量的pluronic，而保留胺碘酮(圖6b)。informs具有特征吸收光譜和接近30nm的窄粒徑分布(圖6c和d)。

實(shí)施例8

評估伊維菌素是否適合形成誘導(dǎo)的冷凍膠束。伊維菌素是一種抗寄生蟲藥物，其注射形式的主要應(yīng)用是治療牲畜，但也用于人類。如圖7a所示，可以形成伊維菌素informs，這允許洗去過量的pluronic而保留伊維菌素。伊維菌素informs在240nm具有接近40nm的特征吸收峰(圖7b、c)。將100mg伊維菌素溶解在1ml二氯甲烷中并加入10ml10％(w/v)，然后攪拌直至有機(jī)溶劑蒸發(fā)。為了除去未摻入的f127，在0℃下對溶液進(jìn)行離心過濾(fisher#ucf9-100-24)，直至保留約200μl的溶液。將水加回到濃縮物中，洗滌過程重復(fù)三次。如圖42所示，藥物:f127的摩爾比為45:1；典型的濃縮溶液可以達(dá)到79mg/ml的伊維菌素，尺寸為39nm，并且多分散指數(shù)為0.03。

實(shí)施例9

評估十一酸睪酮是否適合形成誘導(dǎo)的冷凍膠束。十一酸睪酮是睪酮的酯化形式，其為主要的雄激素，已被用于激素替代以及探索男性避孕。它通常在植物油中以肌內(nèi)注射施用。如圖8a所示，可以形成十一酸睪酮informs，這允許洗去過量的pluronic而保留十一酸睪酮。十一酸睪酮informs在235nm處具有特征吸收峰(圖8b)。十一酸睪酮informs具有40:1的藥物:普朗尼克比。在另一個實(shí)施例中，以小規(guī)模攪拌十一酸睪酮，并將10mg藥物溶解在100μl的dcm中，并加入到含有0、1、2、3、4mnacl的1ml10％(w/v)f127水溶液中，然后攪拌3小時，直到dcm完全蒸發(fā)。然后溶液以5,000×g離心10分鐘。棄去上清液，將沉析物溶于1ml乙醇中，測量240nm(對于十一酸睪酮)和230nm(對于卡巴他賽)的吸光度以定量未摻入的藥物。將100mg十一酸睪酮溶解在1ml二氯甲烷(dcm)中，并加入到含有4mnacl的10ml10％(w/v)f127中，攪拌直至有機(jī)溶劑蒸發(fā)。通過用裝配有蠕動泵(masterflexl/s)和管道(masterflex6434-16)的膜過濾(sartoriusvivaflow，1501008vs)進(jìn)行未摻入的f127去除過程。在-16℃下進(jìn)行去除過程，并將4mnacl溶液用于透析過濾溶液。為了使f127去除百分比最大化，將膜組件、管道和待洗滌的溶液浸入乙二醇和乙醇(v/v＝9:1)的混合物中，并使用干冰作為冷卻劑。如圖42所示，藥物:f127的摩爾比為9:1；典型的濃縮溶液可以達(dá)到16mg/ml的十一酸睪酮，尺寸為112nm，并且多分散指數(shù)為0.19。如圖21a所示，高滲鹽水至4m可以極大地防止十一酸睪酮的聚集。與溶解在油中的現(xiàn)有制劑相比，ss-infroms具有高得多的藥物與增溶劑摩爾比(圖21b)。

實(shí)施例10

評估膽鈣化醇是否適合形成誘導(dǎo)的冷凍膠束。膽鈣化醇是維生素d的一種形式。如圖9a所示，可以形成膽鈣化醇informs，這允許這允許洗去過量的pluronic而保留膽鈣化醇。膽鈣化醇informs在270nm具有特征吸收峰(圖9b)。將100mg鈣鈣石溶解在1ml二氯甲烷(dcm)中，并加入到含有2mnacl的10ml10％(w/v)f127中，攪拌直至有機(jī)溶劑蒸發(fā)。通過用裝配有蠕動泵(masterflexl/s)和管道(masterflex6434-16)的膜過濾(sartoriusvivaflow，1501008vs)進(jìn)行未摻入的f127去除過程。在-7℃下進(jìn)行去除過程，并將2mnacl溶液用于透析過濾溶液。為了使f127去除百分比最大化，將膜組件、管道和待洗滌的溶液浸入乙二醇和乙醇(v/v＝9:1)的混合物中，并使用干冰作為冷卻劑。如圖42所示，使用高滲鹽水用于形成，并進(jìn)行洗滌，藥物:f127的摩爾比為9:1；典型的濃縮溶液可以達(dá)到75mg/ml的膽鈣化醇，尺寸為44nm，并且多分散指數(shù)為0.16。

實(shí)施例11

評估視黃醇棕櫚酸酯是否適合形成誘導(dǎo)的冷凍膠束。視黃醇棕櫚酸酯是酯化的維生素a前體。如圖10a所示，可以形成視黃醇棕櫚酸酯informs，這允許洗去過量的pluronic而保留視黃醇棕櫚酸酯。視黃醇棕櫚酸酯informs在320nm具有特征吸收峰(圖10b)。將100mg視黃醇棕櫚酸酯溶解在1ml二氯甲烷(dcm)中，并加入到含有2mnacl的10ml10％(w/v)f127中，并攪拌直至有機(jī)溶劑蒸發(fā)。通過用裝配有蠕動泵(masterflexl/s)和管道(masterflex6434-16)的膜過濾(sartoriusvivaflow，1501008vs)進(jìn)行未摻入的f127去除過程。在-7℃下進(jìn)行去除過程，并將2mnacl溶液用于透析過濾溶液。為了使f127去除百分比最大化，將膜組件、管道和待洗滌的溶液浸入乙二醇和乙醇(v/v＝9:1)的混合物中，并使用干冰作為冷卻劑。如圖42所示，使用高滲鹽水用于形成，并進(jìn)行洗滌，藥物:f127的摩爾比為54:1；典型的濃縮溶液可以達(dá)到38mg/ml的視黃醇棕櫚酸酯，尺寸為114nm，并且多分散指數(shù)為0.1625。

實(shí)施例12

評估西羅莫司脂化物是否適合形成誘導(dǎo)的冷凍膠束。西羅莫司脂化物是一種免疫抑制藥物，在某些情況下靜脈內(nèi)給予。如圖11a所示，可以形成西羅莫司脂化物informs，這允許洗去過量的pluronic而保留西羅莫司脂化物。西羅莫司脂化物informs在275nm具有特征吸收峰(圖112b)。

實(shí)施例13

評估米非司酮是否適合形成誘導(dǎo)的冷凍膠束。米非司酮是一種通常用作墮胎劑的類固醇化合物。它不經(jīng)常通過注射給予。如圖12a所示，可以形成米非司酮informs，這允許完全洗去過量的pluronic而保留米非司酮。米非司酮informs在310nm具有特征吸收峰(圖12b)。

實(shí)施例14

評估視黃醇是否適合形成誘導(dǎo)的冷凍膠束。視黃醇是維生素a的一種形式。如圖13a所示，可以形成視黃醇informs，這允許完全洗去過量的pluronic而保留視黃醇。視黃醇informs在接近300nm具有特征吸收峰(圖13b)。

實(shí)施例15

接著評估輔酶q10是否適合形成誘導(dǎo)的冷凍膠束。輔酶q10是一種必需的維生素。如圖14a所示，可以形成輔酶q10informs，這允許完全洗去過量的pluronic而保留輔酶q10。輔酶qinforms在290nm附近具有特征吸收峰(圖14b)。將100mg輔酶q10溶解在1ml二氯甲烷(dcm)中，并加入到含有4mnacl的10ml10％(w/v)f127中，并攪拌直至有機(jī)溶劑蒸發(fā)。通過用裝配有蠕動泵(masterflexl/s)和管道(masterflex6434-16)的膜過濾(sartoriusvivaflow，1501008vs)進(jìn)行未摻入的f127去除過程。在-16℃下進(jìn)行去除過程，并將4mnacl溶液用于透析過濾溶液。為了使f127去除百分比最大化，將膜組件、管道和待洗滌的溶液浸入乙二醇和乙醇(v/v＝9:1)的混合物中，并使用干冰作為冷卻劑。如圖42所示，藥物:f127的摩爾比為30:1；典型的濃縮溶液可以達(dá)到42mg/ml的輔酶q，尺寸為115nm，并且多分散指數(shù)為0.28。

實(shí)施例16

接下來，我們研究了紫杉烷inform制劑。紫杉烷是作用于癌細(xì)胞中微管的常用化療劑。多西他賽和紫杉醇是兩種最常見的紫杉烷。即使在3mnacl中，inform形成也是無效的(圖15)。然而，以等摩爾比添加維生素e，多西他賽和紫杉醇inform的形成被大大增強(qiáng)。同樣，添加輔酶q具有顯著提高多西他賽和紫杉醇inform形成功效的相同效果(圖16)。高滲鹽水對提高卡巴他賽(ctx)形成f127ss-infroms的溶解度的影響示于新圖6a中，并且使用3或4mnacl以基本上防止聚集。

實(shí)施例17

在另一個實(shí)施例中，將10mg卡巴他賽(ctx)與不同質(zhì)量比的輔酶q10(ctx:coq＝10:0；10:0.5；10:1；10:2)溶解在100μldcm中，并加入到含有3.5mnacl的1ml10％(w/v)f127水溶液中，然后攪拌5小時(直到溶劑蒸發(fā)，溶液變得澄清)。發(fā)現(xiàn)高滲鹽水在膠束形成期間防止聚集(圖22a)。然后，將1份溶液稀釋在15份水中，置于室溫。在不同的時間點(diǎn)(1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時)，溶液以5,000×g離心5分鐘；數(shù)據(jù)在圖22b中示出)，并在6小時聚集。棄去澄清和黃色的上清液，加入1ml水以沖洗白色沉淀，并重復(fù)旋轉(zhuǎn)過程。棄去上清液后，將ctx沉淀溶解在1ml乙醇中，測量吸光度以對藥物的量定量。這些結(jié)果在圖22b中示出，并且添加質(zhì)量比為10:1或10:2的ctx:coq以防止在稀釋到水中后的聚集。如圖22c所示，相對于當(dāng)前臨床制劑，ctxss-infroms具有高得多的藥物與增溶劑摩爾比。如圖42所示，藥物:f127的摩爾比接近8:1；典型的濃縮溶液可以達(dá)到41mg/ml的ctx，尺寸為62nm，并且多分散指數(shù)為0.1。如圖22d所示，當(dāng)向具有4-5mm直徑的皮下miapaca-2腫瘤的無胸腺裸小鼠以30mg/kg卡巴他賽劑量在第0天和第4天靜脈內(nèi)施用時，ss-infroms可以根除腫瘤。

實(shí)施例18

將100mgα-生育酚溶解在1ml二氯甲烷(dcm)中，并加入到含有2mnacl的10ml10％(w/v)f127中，并攪拌直至有機(jī)溶劑蒸發(fā)。通過用裝配有蠕動泵(masterflexl/s)和管道(masterflex6434-16)的膜過濾(sartoriusvivaflow，1501008vs)進(jìn)行未摻入的f127去除過程。在-7℃下進(jìn)行去除過程，并將2mnacl溶液用于透析過濾溶液。為了使f127去除百分比最大化，將膜組件、管道和待洗滌的溶液浸入乙二醇和乙醇(v/v＝9:1)的混合物中，并使用干冰作為冷卻劑。如圖42所示，藥物:f127的摩爾比為21:1；典型的濃縮溶液可以達(dá)到58mg/ml的α-生育酚，尺寸為86nm，并且多分散指數(shù)為0.26。

實(shí)施例19

將100mg維生素d2(ergocalciferol)溶解在1ml二氯甲烷(dcm)中，并加入到含有2mnacl的10ml10％(w/v)f127中，并攪拌直至有機(jī)溶劑蒸發(fā)。通過用裝配有蠕動泵(masterflexl/s)和管道(masterflex6434-16)的膜過濾(sartoriusvivaflow，1501008vs)進(jìn)行未摻入的f127去除過程。在-7℃下進(jìn)行去除過程，并將2mnacl溶液用于透析過濾溶液。為了使f127去除百分比最大化，將膜組件、管道和待洗滌的溶液浸入乙二醇和乙醇(v/v＝9:1)的混合物中，并使用干冰作為冷卻劑。如圖42所示，藥物:f127的摩爾比為9:1；典型的濃縮溶液可以達(dá)到64mg/ml的維生素d2，尺寸為112nm，并且多分散指數(shù)為0.31。

實(shí)施例20

將100mg角鯊烯溶解在1ml二氯甲烷(dcm)中，并加入到含有3mnacl的10ml10％(w/v)f127中，并攪拌直至有機(jī)溶劑蒸發(fā)。通過用裝配有蠕動泵(masterflexl/s)和管道(masterflex6434-16)的膜過濾(sartoriusvivaflow，1501008vs)進(jìn)行未摻入的f127去除過程。在-12℃下進(jìn)行去除過程，并將3mnacl溶液用于透析過濾溶液。為了使f127去除百分比最大化，將膜組件、管道和待洗滌的溶液浸入乙二醇和乙醇(v/v＝9:1)的混合物中，并使用干冰作為冷卻劑。如圖42所示，藥物:f127的摩爾比為43:1；典型的濃縮溶液可以達(dá)到80mg/ml的角鯊烯，尺寸為81nm，并且多分散指數(shù)為0.28。

實(shí)施例21

將2mg2,9,16,23-四-叔-丁基-29h,31h-酞菁溶解在1ml二氯甲烷中，并加入到10ml10％(w/v)中，并攪拌直至有機(jī)溶劑蒸發(fā)。為了除去未摻入的f127，在4℃下對溶液進(jìn)行離心過濾(fisher#ucf9-100-24)，直至保留約200μl的溶液。將水加回到濃縮物中，洗滌過程重復(fù)三次。如圖42所示，藥物:f127的摩爾比為5:1；典型的濃縮溶液可以達(dá)到19mg/ml，尺寸為18nm，并且多分散指數(shù)為0.15。

實(shí)施例22

將2mg鋅2,11,20,29-四-叔-丁基-2,3-萘酞菁溶解在1ml二氯甲烷中，并加入到10ml10％(w/v)中，并攪拌直至有機(jī)溶劑蒸發(fā)。為了除去未摻入的f127，在4℃下對溶液進(jìn)行離心過濾(fisher#ucf9-100-24)，直至保留約200μl的溶液。將水加回到濃縮物中，洗滌過程重復(fù)三次。如圖42所示，藥物:f127的摩爾比為4:1；典型的濃縮溶液可以達(dá)到30mg/ml，尺寸為20nm，并且多分散指數(shù)為0.16。

實(shí)施例23

將2mg5,9,14,18,23,27,32,36-八丁氧基-2,3-萘酞菁溶解在1ml二氯甲烷中，并加入到10ml10％(w/v)中，并攪拌直至有機(jī)溶劑蒸發(fā)。為了除去未摻入的f127，在4℃下對溶液進(jìn)行離心過濾(fisher#ucf9-100-24)，直至保留約200μl的溶液。如圖42所示，藥物:f127的摩爾比為3:1；典型的濃縮溶液可以達(dá)到13mg/ml，尺寸為20nm，并且多分散指數(shù)為0.16。

實(shí)施例24

這個實(shí)施例，包括方法和結(jié)果部分，描述了納米粒子的準(zhǔn)備和用于gi成像的納米粒子的使用。除非另有說明，材料獲自sigma公司。

方法

具有不同疏水性的染料的溶解和保留：使用在vcclab.org托管的alogps2.1程序評價logp值。將2mg亞甲基藍(lán)、喹鈉啶紅、羅丹明6g、ir780、2,11,20,29-四-叔-丁基-2,3-萘酞菁(bnc)、2,11,20,29-四-叔-丁基-2,3-萘酞菁鋅(znbnc)、5,9,14,18,23,27,32,36-八丁氧基-2,3-萘酞菁(onc)、5,9,14,18,23,27,32,36-八丁氧基-2,3-萘酞菁鎳(nionc)、2,11,20,29-四-叔-丁基-2,3-萘酞菁氧釩(vbnc)、2,9,16,23-四-叔-丁基-29h,31h-酞菁(bpc)、3,10,17,24-四-叔-丁基-1,8,15,22-四(二甲氨基)-29h,31h-酞菁氧釩(vbpc)溶解在1ml二氯甲烷或甲醇中用于mb，然后滴加到10％w/v的pluronicf127(sigma#p2443)。將溶液在通風(fēng)櫥中在室溫下(或?qū)τ趍b為80℃)攪拌4小時以蒸發(fā)有機(jī)溶劑。在4000×g離心5分鐘以除去任何大的聚集體后，將100μl上清液稀釋在3ml的20mm膽酸鈉溶液中。記錄吸光度后，將溶液置于透析管(fisher，#21-152-16；標(biāo)稱分子量截止值為12,000-14,000道爾頓中，并在室溫下相對于500ml20mm膽酸鈉緩沖液透析。4小時后更換緩沖液。24小時后，再次測量透析管中溶液的吸光度，以確定染料保留百分比。

按如下制備膠束。簡言之，將2mgnc或pc染料溶解在1ml二氯甲烷中，滴加到10mlf127(10％，w/v)的水溶液中。選擇二氯甲烷，因?yàn)樗腥玖隙及l(fā)現(xiàn)是可溶的(>10mg/ml)，而甲醇的溶解度小于0.1mg/ml。將懸浮液在通風(fēng)櫥中在室溫下攪拌4小時以蒸發(fā)二氯甲烷。在4000×g離心5分鐘以除去聚集體后，將上清液用于cmc轉(zhuǎn)換純化。為了除去未摻入的f127，將上清液在冰上冷卻，然后在4℃下在具有100,000mwco(fisher#ufc9-100-24)的amiconultra-15離心過濾裝置中離心，直到200μl溶液保留在過濾裝置中。儲存濾液用于測定f127和染料濃度。將水加回到過濾裝置中，并且重復(fù)洗滌過程至少三次。

為了定量摻入的f127，收集收集的濾液，并通過先前報道的比色測定方法(稍作修改)測定f127濃度。簡言之，首先通過將0.3g六水合硝酸鈷和1.2g硫氰酸銨溶解在3ml水中制備硫氰酸鈷試劑。然后將100μl硫氰酸鈷溶液、40μl濃度范圍為0-7.5wt％的f127溶液(將更濃縮的f127溶液稀釋至適合的范圍)、200μl乙酸乙酯和80μl乙醇合并。將混合物輕輕渦旋并在14000×g離心1分鐘。除去藍(lán)色上清液，用乙醚洗滌藍(lán)色沉淀幾次(約5次)，直到上清液變?yōu)闊o色。然后將沉淀溶解在1ml丙酮中以測量623nm處的吸光度(圖30示出了硫氰酸鈷-f127復(fù)合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線和f127的濃度)。通過稱重質(zhì)量并通過比色測定法測定質(zhì)量百分比來計(jì)算每次洗滌后的f127保留百分比。染料的濃度通過測量吸光度來確定。

對于重構(gòu)研究，通過相同的方案使用2mgonc染料制備納米粒子。通過將2mgonc和19.9mgdmpc(對應(yīng)于95摩爾％dmpc)溶解在小體積氯仿中制備dmpc脂質(zhì)體。在通過氮?dú)獯祾哒舭l(fā)溶劑后，將薄膜置于真空下1小時，然后用1.5ml蒸餾水再水合并超聲處理30分鐘。然后將onc納米粒子和脂質(zhì)體冷凍干燥過夜(labconcofreezone)。然后將粉末再懸浮在最小體積的水(50μl)中，并記錄吸光度。將樣品簡單離心以除去干擾吸收基線的大的不溶性聚集體。

納米粒子的物理和光學(xué)性質(zhì)的表征：使用動態(tài)光散射用nanozs90zetasizer(malverninstruments)進(jìn)行尺寸和ζ電位測量。使用jem-2010電子顯微鏡進(jìn)行透射電鏡術(shù)以確定用1％醋酸鈾陰性染色的納米粒子的水分散體的形態(tài)。除了使用10μm路徑長度比色皿的高濃度光譜移動分析外，使用lambda35uv/vis分光光度計(jì)(perkinelmer)在室溫下使用具有1cm光程長度的比色皿測量吸光度。

在rigakuultimaiv上，用40kv、44ma和1.76kw的操作條件，用冷凍干燥的樣品進(jìn)行x射線衍射粉末圖。使用的衍射儀的源是具有單色儀濾波器的波長的cukα輻射，并且在室溫下以θ/2θ模式分析。以0.030間隔收集2θ掃描數(shù)據(jù)，掃描速度為0.5度/分鐘。用于測量強(qiáng)度的技術(shù)是聚焦束法。

使用熒光計(jì)(photontechnologyinternational)評估散射和熒光性質(zhì)。為了檢查納米粒子(峰值吸收在707nm處的znbnc納米粒子)和具有700nm峰值吸收的金納米棒(nanopartz#a12-10-700)的散射性質(zhì)，并且在水中700nm下將消光標(biāo)準(zhǔn)化為0.05。在具有2nm狹縫寬度的在600nm和800nm之間同時激發(fā)和發(fā)射掃描的熒光計(jì)上記錄共振散射。記錄緩沖液散射背景空白并從納米顆粒測量量中減去。通過用納米粒子形式或直接溶解于具有4nm激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度的二氯甲烷中的吸光度匹配的稀釋znbnc的300nm激發(fā)測量發(fā)射光譜來進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化熒光測量。

為了確定光學(xué)參數(shù)，將具有已知吸光度的濃縮納米粒子凍干。測定納米粒子粉末的質(zhì)量，然后將一部分粉末溶解在二氯甲烷中以確定染料的濃度和質(zhì)量。然后基于總凍干質(zhì)量的差異確定f127的質(zhì)量。為了計(jì)算納米顆粒光學(xué)性質(zhì)，由于疏水性染料可以漂浮/懸浮在水中并且f127的密度為1.05g/cm³，假定染料的密度為1g/cm³。使用動態(tài)光散射測量均勻球形的納米粒子的直徑，并且對于bpc、znbnc、bnc和onc分別發(fā)現(xiàn)為17nm、20nm、26nm和20nm。納米粒子體積假定從其內(nèi)部排除水?；诩{米粒子的平均密度和體積，可以估計(jì)每個顆粒的質(zhì)量和隨后的每個顆粒的染料數(shù)。

為了評估納米粒子在模擬胃液(sgf)和模擬腸液(sif)中的穩(wěn)定性，將納米粒子相對于200mlsgf(ricca，#7108-32)透析，加入胃蛋白酶和含胰蛋白酶的sif(ricca#7109-32)。濃縮納米粒子用sgf和sif稀釋，使吸光度接近1，然后在37℃下透析。

納米粒子清除研究：根據(jù)布法羅大學(xué)動物護(hù)理和使用委員會的規(guī)定進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)。將6-8周齡雌性balb/c小鼠(harlan實(shí)驗(yàn)室)饑餓過夜，自由飲水。灌胃后引入食物。灌胃100odonc納米粒子(3.42mg)或亞甲基藍(lán)后，將小鼠轉(zhuǎn)移到代謝籠中，分別收集糞便和尿。在0、2、4、8和24小時收集糞便和尿液，稱重并在分析前保持在4℃。為了測定回收百分比，直接測量尿液和血清樣品的吸光度。將組織或糞便(約50mg)溶解于2ml氯仿(用于回收亞甲基藍(lán)的甲醇)中，并使用tissuetearor勻漿器(型號985-370)破碎30秒或直至染料完全溶解。將溶液在3000×g離心3分鐘以除去碎片，測量含氯仿的染料的吸光度以測定回收率。為了校準(zhǔn)納米粒子形式和氯仿中染料的吸光度差異，將納米粒子冷凍干燥過夜，并溶解在相同體積的氯仿中并測量吸光度。

納米粒子毒性：對于體外研究，將2×10⁴個caco-2細(xì)胞(atcc)接種在96孔板中的含有20％胎牛血清的dulbecco改良的eagle培養(yǎng)基中(dmem)。第二天，在指定濃度下用onc納米粒子或亞甲基藍(lán)處理細(xì)胞。24小時后，除去培養(yǎng)基并加入xtt以確定在450nm處測量吸光度的存活率。對于體內(nèi)研究，通過灌胃給予小鼠(harlanlabs，6周齡balb/c小鼠)每20gonc納米粒子1000od860(在24小時內(nèi)給予3次給藥)或保持作為對照(n＝5/每組雄性灌胃、雌性灌胃、雄性對照和雌性對照組)。每隔一天監(jiān)測行為，每周測量質(zhì)量。2周后，處死小鼠并收獲器官。pbs用于沖洗血液和碎片。將器官浸入10％中性緩沖福爾馬林(vwr#16004-114)中并固定24小時。固定的器官通過增加等級的醇處理、在二甲苯中澄清并用石蠟(tbs)滲透。隨后將它們包埋、切割并用蘇木精和曙紅染色。最后，用單個載玻片掃描儀(aperio)掃描載玻片。

光聲實(shí)驗(yàn)。利用使用單個元件超聲換能器的定制的體積反射模式pat系統(tǒng)。簡而言之，由泵激光器(slii-10；continuum；q-switchednd:yag；532nm)激發(fā)的opo激光器(sureliteopoplus；continuum；波長調(diào)諧范圍，680至2500nm；脈沖寬度，5ns；以及脈沖重復(fù)頻率，10hz)合成可調(diào)激光脈沖。將與znbnc或onc納米粒子的相應(yīng)吸收峰匹配的710nm或860nm的光學(xué)波長用于pa成像實(shí)驗(yàn)。產(chǎn)生的光通過自制的球面錐形透鏡和光學(xué)聚光器，脈沖能量約為約5mj/cm²，遠(yuǎn)小于安全極限。在用于體積成像的光柵掃描期間，利用定制的水盤改進(jìn)了聲耦合。小鼠(6-8周齡雌性balb/c小鼠)位于水盤下方。誘導(dǎo)的pa信號由聚焦超聲換能器(v308；olympusndt；5-mhz中心頻率)捕獲。vevolazrus/pa成像系統(tǒng)用于具有21mhz換能器頻率的實(shí)時成像。在雌性balb/c小鼠中灌胃100od的納米粒子后，對消化系統(tǒng)中納米粒子的移動進(jìn)行光聲監(jiān)測。這對應(yīng)于3.4mg的onc納米粒子和13.2mg的znbnc納米粒子。用系統(tǒng)軟件進(jìn)行目的區(qū)域分析。通過獲取目的區(qū)域強(qiáng)度的一階導(dǎo)數(shù)(具有0.2秒分辨率)和在平均10秒窗口中量化數(shù)字零交叉(對應(yīng)于收縮)來確定每分鐘蠕動計(jì)算的速率。使用vevolazr(visualsonics)記錄光聲光譜響應(yīng)，并且在納米粒子的情況下將樣品置于浸沒在水中的pe20管中，并且將樣品置于具有在860nm峰值吸收的濃度匹配的金納米棒。納米棒濃度僅基于金并由制造商提供(納米棒llc)。使用家用光聲系統(tǒng)，通過將含有znbnc和onc納米粒子吸收匹配至400的管頂部上的雞肉組織層疊來確定雞組織中的深度反應(yīng)。在710nm和860nm波長處記錄2和1.5mj/cm²脈沖能量，分別用于激發(fā)znbnc和onc納米粒子。對于腸阻塞研究，將12-14g雌性cd-1小鼠(harlan)在可以獲得水的情況下禁食過夜。然后用在胃附近的1cm橫向切口打開腹部，并且用尼龍縫合線(vwr#89219-096)結(jié)扎十二指腸。假手術(shù)處理的小鼠沒有進(jìn)行十二指腸結(jié)扎，但否則是相同的程序。再次縫合腹部皮膚，并在幾小時內(nèi)，通過灌胃給小鼠施用100od860劑量的onc納米粒子。1小時后，麻醉小鼠并用vevolazr系統(tǒng)成像。

納米粒子放射性標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。使用威斯康星-麥迪遜大學(xué)的ctirds112回旋加速器，通過⁶⁴ni(p，n)⁶⁴cu反應(yīng)生產(chǎn)⁶⁴cu。使用增加量的納米粒子的初步研究顯示，對每37mbq的⁶⁴cu用少至1μg的納米粒子即可以實(shí)現(xiàn)良好的放射性標(biāo)記產(chǎn)率(>65％，圖44)。盡管對于體內(nèi)檢測，pet比pat更敏感，每只小鼠使用相似量的納米粒子以確保兩個研究之間的相當(dāng)?shù)纳锓植寄Ｊ健?/p>

為了標(biāo)記，將37mbq的⁶⁴cucl2稀釋在300μl的0.1m乙酸鈉緩沖液(ph5.5)中，并加入400od納米粒子。將反應(yīng)混合物在37℃下在恒定搖動下溫育30分鐘。通過amiconultra-4離心過濾單元(millipore)用磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)作為流動相來純化⁶⁴cu納米粒子。將最終純化的⁶⁴cu納米粒子重懸于500μl的pbs中并用于體外穩(wěn)定性、口服灌胃、pet成像和生物分布研究。

對于體外螯合穩(wěn)定性研究，將37mbq的⁶⁴cucl2與1od的納米粒子溫育30分鐘，并使用100kda的截止amicon濾器(millipore，billerica，ma)分離未偶聯(lián)的⁶⁴cu。之后，將一個od的⁶⁴cu納米粒子重懸于1ml的sgf或sif中，并在37℃下攪拌溫育。在不同的時間點(diǎn)(孵育后0.5、1、2、4、8和24小時)對部分混合物(50μl)進(jìn)行取樣，并通過100kda截止濾器過濾。收集濾液，并通過wizard2自動γ計(jì)數(shù)器(perkin-elmer，waltham，ma)測量放射性。使用以下公式計(jì)算納米粒子上保留的⁶⁴cu的百分比：(總放射性-濾液中的放射性)/總放射性。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次進(jìn)行。

使用inveonmicropet/microct嚙齒動物模型掃描儀(siemensmedicalsolutionsusa，inc.)進(jìn)行pet掃描。禁食過夜后，通過口服灌胃給每只balb/c小鼠施用月7.4mbq的⁶⁴cu-納米點(diǎn)(在125μlpbs中100od)。在注射后的不同時間點(diǎn)進(jìn)行5至10分鐘的靜態(tài)pet掃描。使用最大后驗(yàn)(map)算法重建圖像，沒有散射校正。使用供應(yīng)商軟件(inveonresearchworkplace)對衰變校正的全身圖像進(jìn)行每個pet掃描的目的區(qū)域分析，以計(jì)算腸的每克組織的注射劑量百分比(％id/g)值。

在注射后24小時的最后pet掃描之后，對所有小鼠實(shí)施安樂死并進(jìn)行生物分布研究以確認(rèn)基于pet成像的定量示蹤劑攝取值真實(shí)地表示小鼠中的放射性分布。收集血液和主要器官/組織并稱濕重。使用γ-計(jì)數(shù)器(perkinelmer)測量組織中的放射性，并以％id/g表示。

結(jié)果：

冷凍萘酞菁膠束的形成

檢查不同疏水性的發(fā)色團(tuán)以確定它們在稀釋成生物相容性表面活性劑后是否自發(fā)組裝成穩(wěn)定的納米顆粒。選擇pluronic(聚(氧乙烯)-聚(氧丙烯)-聚(氧乙烯)；peo-ppo-peo)f127，因?yàn)槠浔幻绹称泛退幬锕芾砭?fda)批準(zhǔn)用于口服。為了檢查生色團(tuán)-f127復(fù)合物穩(wěn)定性，然后將溶液相對于膽汁表面活性劑膽酸鈉透析，由于其的小膠束尺寸，其可以通過透析管。如圖23a所示，基于辛醇-水分配系數(shù)(logp值，用alogps算法預(yù)測(tetko,i.v.&tanchuk,v.y.,j.chem.inf.comput.sci.42,1136–1145(2002))的非常疏水的染料在透析后顯示出高保留，因此不容易與大量過量的膽酸鹽膠束交換。在所評價的染料中，酞菁(pc)和萘酞菁(nc)衍生物(圖23b)(其以它們的四吡咯結(jié)構(gòu)和極端疏水性為特征)，幾乎完全保留。離心除去任何聚集體后色彩濃郁的上清液的存在，意味著形成可溶性納米配方的萘酞菁(納米粒子)的形成。納米粒子的產(chǎn)率隨著f127濃度的增加而升高(圖29)。在f127的臨界膠束濃度(cmc)(在室溫下約1％)之前觀察到納米粒子產(chǎn)率沒有急劇增加，這意味著與未聚合物-微團(tuán)平衡無關(guān)的納米粒子形成機(jī)制。

因?yàn)閒127具有溫度敏感的cmc，我們檢查了降低溶液溫度以將膠束轉(zhuǎn)化為f127單體的效果。將溫度降低至4℃不會導(dǎo)致任何nc聚集，這可以通過形成冷凍膠束來解釋。這使得能夠去除所有過量的f127的新策略(圖24a)。如圖24b所示，離心過濾除去在4℃所有游離的f127，但是如使用先前報道的比色測定法(圖30)所檢測的那樣，該方法在25℃下無效。cmc切換不影響納米粒子的自組裝，其在4℃洗滌過程中定量保留(圖24c)。用3個低溫洗滌循環(huán)從納米粒子除去所有游離表面活性劑，并且在額外洗滌下觀察不到接觸角的進(jìn)一步變化(圖31)。與納米粒子不同，用于pa應(yīng)用的染料亞甲基藍(lán)(mb)在3次離心過濾洗滌后完全從保留物中除去。

納米顆粒形成20nm球體(圖24d、24e)。由于cmc轉(zhuǎn)換過程除去了所有過量的f127，良好分散的納米粒子可以濃縮成高染料與f127摩爾比(>3:1的染料:f127，參見圖43)。我們使用二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(dmpc)以19:1的脂質(zhì):染料摩爾比在納米粒子或脂質(zhì)體制劑中制備2mg的nc染料。初始溶解后，將溶液冷凍干燥并在最小體積的水(50μl)中重構(gòu)。如圖24f所示，濃縮的納米點(diǎn)溶解在水中，這通過大約1000的極端ncnir吸收證實(shí)。然而，在冷凍干燥的脂質(zhì)體重構(gòu)后，觀察到一些nc再溶解，但是其數(shù)量級低于納米點(diǎn)制劑。由于cmc轉(zhuǎn)換顯著降低了存在的f127表面活性劑的總含量，納米粒子可以以高得多的濃度重構(gòu)。nc溶解所需的磷脂量不能通過cmc轉(zhuǎn)換類似地降低，并且在冷凍干燥和重構(gòu)期間進(jìn)一步濃縮時，磷脂濃度高于溶解度極限。在溶劑去除期間，nc的無定形沉淀可能進(jìn)一步影響封裝的難度。

由于納米粒子可以由一系列疏水的pc和nc發(fā)色團(tuán)產(chǎn)生(圖23a)，我們開始識別具有跨越nir窗口的光譜性質(zhì)的子集。使用cmc切換方法篩選不同的市售可得的pc和nc染料以產(chǎn)生純納米粒子(補(bǔ)充圖4)。在有機(jī)溶劑中染料消光系數(shù)范圍為1.0-2.2×10⁵m^-1cm^-1，而在納米粒子形式，這些降低到0.4-1.5×10⁵m^-1cm^-1(圖43)。這表明納米粒子中nc的密集排列導(dǎo)致改變的電子性質(zhì)和分子間相互作用，這進(jìn)一步由水性納米粒子的完全熒光自淬滅(圖33)所支持。冷凍干燥的樣品的粉末衍射分析沒有顯示納米粒子內(nèi)的任何結(jié)晶nc的存在，顯示染料可能嵌入f127而沒有組織堆積(圖34)。假定納米粒子內(nèi)部是染料和疏水f127ppo嵌段的無定形共混物。然而，由于結(jié)構(gòu)研究已經(jīng)顯示f127ppo嵌段的回轉(zhuǎn)半徑僅為1.6nm，并且由于peo-ppo-peo嵌段的連續(xù)性質(zhì)，納米粒子的內(nèi)部也可能含有一小部分親水peo，其與更加疏水的nc和ppo分離。納米粒子的面向水的殼被推測為僅由peo組成。

鑒定產(chǎn)生在600、707、793和863nm處具有峰的納米粒子的1pc和3nc染料(圖25a、b)。納米粒子產(chǎn)生跨越nir光譜同時保持相當(dāng)窄的全寬度半最大值(50-100nm)的吸收。由于pa成像可以分辨多個吸收波長，所以納米顆粒的多波長類別是期望的。將納米粒子的pa光譜響應(yīng)與它們的吸收光譜比對(圖35)?？梢詫⒓{米顆粒濃縮成具有大于1000的吸收的完全溶解的溶液。納米粒子與游離染料相比的一個優(yōu)點(diǎn)是在濃縮時，吸收峰位置顯示可忽略的偏移(圖25c)。這通過測量10μm路徑長度中濃縮溶液的吸收(～1000光密度(od)/ml)，然后測量在1cm路徑長度中的相同溶液的1000倍稀釋來評估。通常使用的pa染料mb和吲哚菁綠在濃縮溶液中表現(xiàn)出大的吸收偏移，這是由于在高濃度下遇到的自相互作用誘導(dǎo)的調(diào)制的電子性質(zhì)的結(jié)果。另一方面，nc與納米粒子矩陣中的f127共組裝沒有表現(xiàn)出改變的峰值吸收位移，表明納米粒子防止?jié)舛纫蕾囆匀玖舷嗷プ饔?，否則會影響較高濃度的吸收。盡管濃度依賴性吸收偏移在pa成像中是有用的，但是與濃度無關(guān)的光學(xué)參數(shù)導(dǎo)致對比度運(yùn)動的簡化分析，如gi光聲層析成像(pat)的情況。基于ζ電位測量，納米粒子在寬的ph值范圍內(nèi)保持接近中性的表面電荷(圖36)。

在分光光度計(jì)上測量的吸光度包括吸收和散射兩者的效應(yīng)。然而，僅吸收有助于光聲效應(yīng)。使用共振光散射來估計(jì)散射。與消光匹配的金納米棒相比，納米粒子顯示出可忽略的散射。納米粒子被認(rèn)為沒有散射分量?；诩兓{米粒子中nc與f127的摩爾比和幾何計(jì)算，我們估計(jì)每個5,9,14,18,23,27,32,36-八丁氧基-2,3-萘酞菁(onc)納米粒子含有501個分子的nc和155個分子的f127，光學(xué)截面為2.9×10^-17m²。附加的光學(xué)參數(shù)在圖43中報道。雖然這個橫截面是納米棒的橫截面的兩個數(shù)量級分之一，但是納米粒子的獨(dú)特的可分散性使它們能夠在保持溶解度的同時被濃縮到更高數(shù)量級的顆粒密度。因此，可以獲得穩(wěn)定的納米顆粒溶液，其總吸收大于1000。

光聲腸成像

為了評估納米粒子用作口服給藥的pa劑的適宜性，我們確定納米粒子是否能夠承受胃和腸的惡劣條件，這通常對納米顆粒造成障礙。當(dāng)在37℃下在模擬胃液(sgf)或模擬腸液(sif)中透析納米粒子時，沒有觀察到明顯的吸收損失，表明在苛刻的透析條件下的穩(wěn)定性(圖26a)。在水中，1.2mg/mlonc納米粒子產(chǎn)生的光聲信號是濃度匹配和波長匹配的金納米棒超出一百倍高(圖37)。

使用caco-2細(xì)胞評估onc納米粒子的細(xì)胞毒性。然而當(dāng)在具有大于1的吸光度的細(xì)胞培養(yǎng)基中孵育時測試mb誘導(dǎo)的毒性，直至測試的最高值吸光度100時，納米粒子沒有表現(xiàn)出任何毒性(圖38)。受這些結(jié)果的鼓勵，我們通過灌胃給小鼠施用100od的onc納米粒子。納米粒子完全排泄在糞便中(圖26b)。腸吸收的缺乏可能源自20nm尺寸的納米粒子，其防止通過膜的被動擴(kuò)散，以及f127的peo特征，其防止生物吸附。為了比較，以相同的方式施用100od的mb。mb被全身吸收，并且可在尿中檢測到，而大部分mb保留在體內(nèi)或被代謝(圖26c)。

使用組織學(xué)檢查納米粒子對腸組織的影響(圖26d)。沒有引起明顯的炎癥反應(yīng)或損傷作用，并且腸絨毛和隱窩似乎是健康的?？紤]到通過其定量排泄預(yù)測的納米粒子的安全性和全身吸收的缺乏，我們接下來使用口服劑量50,000od860/kg評估納米粒子的急性毒性。這表示10倍過量的用于成像應(yīng)用的功能納米粒子劑量。在兩周的研究中，雄性或雌性小鼠沒有不利的行為或體重變化(圖39a)。組織學(xué)顯示沒有全身性(圖39b)或胃腸道(圖39c)毒性。

我們接下來檢查了納米粒子對在體內(nèi)腸內(nèi)非侵入性pat的效用。如圖27a所示，使用定制的單元素掃描系統(tǒng)的pa成像顯示納米粒子在胃腸道中的生物分布，其具有100μm軸向分辨率。清楚地觀察到2,11,20,29-四-叔-丁基-2,3-萘酞菁鋅(znbnc)納米粒子的進(jìn)展。檢測到可忽略的背景，使腸特征分辨率清晰并且個體小腸憩室是可區(qū)分的。深度編碼分析揭示了具有深度映射到5mm的腸分布的進(jìn)一步空間細(xì)節(jié)(圖27b)。

對于動態(tài)成像，使用vevolazr換能器陣列系統(tǒng)。通過灌胃給予100od的onc納米粒子。如圖27c中的橫切片所示，pa(彩色)完美地與us(灰色)重疊以顯示具有最小背景的胃表面下方的腸中的納米粒子分布。每秒5幀掃描速度使得能夠詳細(xì)跟蹤納米粒子在腸道運(yùn)動。納米粒子流的快速變化是顯而易見的(圖27d)，并且詳細(xì)的蠕動運(yùn)動是清楚的。通過選擇顯示波動納米粒子內(nèi)容物的目的區(qū)域，定量分割或蠕動流。納米粒子進(jìn)入目的代表性區(qū)域的流動周期性地出現(xiàn)，具有不同的流入和流出運(yùn)動(圖27e)。圖27f所示的蠕動腸液流速的計(jì)算表明收縮率接近每分鐘30次。

通過檢查us共注冊，將腸納米粒子的分布映射到解剖特征。如圖27g所示，膀胱和腎臟用us鑒定，并且相鄰腸內(nèi)納米粒子的相對位置隨時間變化。從一疊掃描中產(chǎn)生兩個us/pa最大強(qiáng)度投影(mip)，所述掃描在30分鐘內(nèi)跟蹤納米粒子通過腸的運(yùn)動(圖27h)。mip可用于在任何給定的單個橫切片中提供腸定向。所指示的目的區(qū)域?qū)崟r顯示納米粒子的平面外通過腸的橫切片。與含有相對恒定的納米粒子體積的對照區(qū)“b”和“c”相比，納米粒子在1分鐘內(nèi)定量地從區(qū)域“a”離開并在該過程中表現(xiàn)出蠕動收縮。

在美國，小腸梗阻每年導(dǎo)致30萬次手術(shù)。為了確定us/pa成像是否可用于檢測腸梗阻，我們使用外科誘導(dǎo)的十二指腸結(jié)扎小鼠模型。在十二指腸結(jié)扎或假手術(shù)(打開腹部，但省略結(jié)扎)后，將腹部縫合閉合。然后給小鼠施用100od860劑量的onc納米粒子，并在灌胃后1小時成像。具有阻塞的小鼠的胃可見地腫脹至大體積。us橫切片在結(jié)扎的小鼠中顯示出顯著的空隙胃體積，但不顯示假處理的小鼠(圖27i，上圖)。雖然us可以區(qū)分阻塞的小鼠的胃膨脹，pa信號幾乎檢測不到。阻塞的小鼠的增大的胃包含可能引起pa衰減的大袋空氣，并且需要進(jìn)一步調(diào)查這種現(xiàn)象。在阻塞的小鼠中，在整個腸區(qū)域幾乎檢測不到任何pa信號(圖27i，底部)。然而，假處理的小鼠顯示強(qiáng)pa信號，表明納米粒子不受抑制地進(jìn)展通過腸道。因此，納米點(diǎn)可用作檢測小腸梗阻的診斷工具。

基于它們的高吸收，znbnc(707nm)和onc納米粒子(860nm)都適合于低背景gipa成像。最佳納米粒子波長的選擇取決于不同病例。例如，當(dāng)前在光聲儀器中使用的許多可調(diào)諧激光器在707nm產(chǎn)生較高的激光輸出，而860nm可具有較低的固有生物背景和散射。在雞胸組織中，吸光度匹配的onc和znbnc納米粒子都可以容易地被檢測到高達(dá)2.5cm的深度，具有相似的光聲信噪比(圖40)。使用的脈沖能量僅為2和1.5mj/cm²，分別對應(yīng)于znbnc和onc納米粒子波長的激光安全限度的僅約1/10和約1/30。

正電子發(fā)射斷層掃描

雖然pa技術(shù)正在迅速改善，深部組織(>5厘米)pa成像尚未在人類報道。由于正電子發(fā)射斷層掃描(pet)臨床上用于非侵入性全身成像，我們檢查了基于納米粒子的pet成像作為一種互補(bǔ)的技術(shù)。nc大環(huán)內(nèi)的4個吡咯氮可以與銅配位以用作螯合劑，并且已經(jīng)顯示正電子發(fā)射體⁶⁴cu可以用于方便地標(biāo)記完整的基于四吡咯的納米顆粒。因?yàn)榧{米粒子由nc本身形成，所以不需要額外的螯合劑綴合步驟。

當(dāng)納米粒子與⁶⁴cu的水溶液孵育時，在30分鐘內(nèi)用超過65％的放射性標(biāo)記產(chǎn)率進(jìn)行標(biāo)記(圖28a和圖44)。尺寸和ζ電位不受影響(圖41)。在除去游離銅后，當(dāng)⁶⁴cu-納米點(diǎn)在37℃下在sif和sgf中孵育時，在體外螯合是穩(wěn)定的(圖28b)。然后灌胃100od860劑量的放射性標(biāo)記的onc納米粒子(每只小鼠7.4mbq)。99％的納米粒子在糞便中排泄，而85％的⁶⁴cu放射性標(biāo)記在糞便中排泄(圖28c)。這種差異可能是由于在苛刻的gi環(huán)境中一些銅從nc螯合物的置換。最小放射性保留在小鼠的任何部分，所有器官保持小于1.5％id/g的⁶⁴cu(圖28d)。由于它們在糞便中清除，納米粒子本身在任何器官中都沒有檢測到，除了在小腸中保留少量痕量。

使用pet跟蹤納米粒子通過胃腸道的運(yùn)動。在口服灌胃后，放射性存在于胃和上腸中，如在0.5小時時從pet圖像可以看到的(圖28e)。在給藥后3小時觀察到腸內(nèi)⁶⁴cu納米粒子的清晰分布模式。由于pet是沒有組織穿透極限的層析成像，可以獲得小鼠的連續(xù)全身連續(xù)冠狀切片(圖28f)。斷層分析在三維中顯示無背景的腸可視化。

由于高nc疏水性，可以形成在腸中穩(wěn)定的動力學(xué)冷凍納米粒子，避免全身吸收，并在nir中產(chǎn)生極端和可調(diào)的光學(xué)吸收。它們是有機(jī)的，由fda批準(zhǔn)的表面活性劑組裝，并且完全排泄在糞便中而沒有觀察到毒性。使用納米粒子的實(shí)時us/pa腸成像提供高分辨率、低背景、實(shí)時原理圖的腸道解剖、病理和功能的映射。此外，直接使用納米粒子的pet可以實(shí)現(xiàn)定量、靈敏、用于全身成像的具有完全組織穿透的臨床建立的成像方法。pet的空間分辨率限制(幾毫米)可用使用單一試劑的局部pat技術(shù)來補(bǔ)償。超越gi成像，基于其多峰性質(zhì)，穩(wěn)定性和高于腎清除閾值的小尺寸，納米粒子也具有用作靜脈內(nèi)施用造影劑的潛力。未來的研究方向可能包括修改納米粒子表面性質(zhì)以用于目標(biāo)檢測，并檢查多色pa成像以診斷腸道疾病。

雖然通過具體實(shí)施例描述了本公開，但是常規(guī)修改對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的，并且這樣的修改旨在處于本公開的范圍內(nèi)。