本申請要求于2014年9月10日提交的美國臨時申請第62/048,761號的優(yōu)先權(quán)，將其全部內(nèi)容通過引用并入本文以用于全部目的。

發(fā)明背景

胰腺癌是通常具有不良預后的癌癥，即使在其早期階段被檢測到。據(jù)估計，對于所有階段的胰腺癌組合，只有6％的患者在診斷后存活五年。已知胰腺癌的最常見形式(胰腺導管腺癌(PDAC))具有極差的預后。盡管對于接受手術(shù)切除的患者而言，存活時間有所改善，但是PDAC通常未在手術(shù)切除是可行時被診斷出。

癌基因K-Ras在諸如胰腺癌、肺癌和結(jié)腸直腸癌的癌癥中通常是突變的，在超過90％的PDAC中存在激活的K-Ras突變。然而，迄今為止，還沒有成功研發(fā)出直接封閉K-Ras功能并在臨床前模型中顯示功效的小分子抑制劑。

發(fā)明概述

在一個方面，提供治療對象中的癌癥的方法。在一些實施方案中，所述方法包括向所述對象施用治療量的prostratin或prostratin類似物或者以上的鹽或異構(gòu)體。

在一些實施方案中，所述癌癥為表達K-Ras的癌癥。在一些實施方案中，表達K-Ras的癌癥為表達野生型K-Ras的癌癥。在一些實施方案中，表達K-Ras的癌癥為表達突變型K-Ras的癌癥。

在一些實施方案中，所述癌癥為胰腺癌、結(jié)腸直腸癌或肺癌。在一些實施方案中，所述癌癥為胰腺癌(例如，胰腺導管腺癌)。

在一些實施方案中，向?qū)ο笫┯胮rostratin或者其鹽或異構(gòu)體。在一些實施方案中，向?qū)ο笫┯胮rostratin類似物或者其鹽或異構(gòu)體。在一些實施方案中，prostratin類似物具有下述結(jié)構(gòu)式：

其中R為乙基、甲酸酯、丙酸酯、丁酸酯、戊酸酯、己酸酯、苯甲酸酯、乙酸苯酯、乙酸環(huán)己酯、乙酸五氟苯酯、乙酸-1-萘酯、乙酸-2-萘酯、(5,6,7,8)四氫-1-萘基乙酸酯、乙酸聯(lián)苯酯、乙酸金剛烷酯或者對苯乙酸芐酯。

在一些實施方案中，經(jīng)口服、靜脈內(nèi)或者腹腔內(nèi)施用prostratin或prostratin類似物或者以上的鹽或異構(gòu)體。

在一些實施方案中，將prostratin或prostratin類似物或者以上的鹽或異構(gòu)體與化療劑組合施用。在一些實施方案中，所述化療劑是吉西他濱。在一些實施方案中，將prostratin或prostratin類似物或者以上的鹽或異構(gòu)體與化療劑同時施用。在一些實施方案中，將prostratin或prostratin類似物或者以上的鹽或異構(gòu)體與化療劑依次施用。

在另一方面，提供用于治療癌癥的組合物和試劑盒。在一些實施方案中，所述組合物或試劑盒包含：

Prostratin或prostratin類似物或者以上的鹽或異構(gòu)體；以及

化療劑。

在一些實施方案中，組合物和試劑盒用于治療表達K-Ras的癌癥。在一些實施方案中，表達K-Ras的癌癥是表達野生型K-Ras的癌癥。在一些實施方案中，表達K-Ras的癌癥是表達突變型K-Ras的癌癥。在一些實施方案中，組合物或試劑盒是用于治療癌癥的組合物或試劑盒，所述癌癥是胰腺癌、結(jié)腸直腸癌或肺癌。在一些實施方案中，組合物或試劑盒用于治療胰腺癌(例如，胰腺導管腺癌)。

在一些實施方案中，組合物或試劑盒包含prostratin或者其鹽或異構(gòu)體。在一些實施方案中，組合物或試劑盒包含如本文所述的prostratin類似物或者其鹽或異構(gòu)體。

在一些實施方案中，化療劑是吉西他濱。

在另一方面，提供包含prostratin或prostratin類似物或者以上的鹽或異構(gòu)體的組合物，其用于治療癌癥。在一些實施方案中，癌癥是胰腺癌(例如，胰腺導管腺癌)。在一些實施方案中，癌癥是表達K-Ras的癌癥。在一些實施方案中，表達K-Ras的癌癥是表達野生型K-Ras的癌癥。在一些實施方案中，表達K-Ras的癌癥是表達突變型K-Ras的癌癥。在一些實施方案中，將包含prostratin或prostratin類似物的組合物與化療劑組合使用。在一些實施方案中，包含prostratin或prostratin類似物的組合物還包含化療劑。在一些實施方案中，化療劑是吉西他濱。

而在另一方面，提供包含prostratin或prostratin類似物或者以上的鹽或異構(gòu)體的組合物在制備用于治療癌癥的藥物中的用途。在一些實施方案中，癌癥是胰腺癌(例如，胰腺導管腺癌)。在一些實施方案中，癌癥是表達K-Ras的癌癥。在一些實施方案中，表達K-Ras的癌癥是表達野生型K-Ras的癌癥。在一些實施方案中，表達K-Ras的癌癥是表達突變型K-Ras的癌癥。在一些實施方案中，包含prostratin或prostratin類似物的組合物還包含化療劑。在一些實施方案中，化療劑是吉西他濱。

附圖簡述

圖1.K-Ras^V12和H-Ras^V12具有不同的腫瘤起始特性，盡管具有相當?shù)慕?jīng)典信號轉(zhuǎn)導輸出。(A)如通過Raf-RBD或Ral-GDS-RBD pull-down分析所測量的相當水平的總Ras蛋白以及GTP結(jié)合的Ras。(B)H-Ras^V12或K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的細胞中相當水平的磷酸化Erk和Akt。(C)K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH3T3細胞呈現(xiàn)出增加的球體形成。左圖：形成的球體的大體形態(tài)。右圖：球形成效率(N＝6)。(D)當注射細胞的數(shù)目為1,000個(左上圖)或100個(右上圖)時，H-Ras^V12和K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞的腫瘤起始能力。當注射細胞的數(shù)目變得有限時，與H-Ras^V12轉(zhuǎn)化的細胞相比，K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的細胞呈現(xiàn)出增加的腫瘤起始能力(下表)。(E)通過EGF促進BxPC3球體的形成。上圖：形成的球體的形態(tài)。下圖：通過用接種細胞數(shù)標準化的球體的數(shù)目計算的球形成效率(N＝6)。(F)K-Ras而非H-Ras的敲低削弱了EGF對BxPC3球體形成的刺激(下圖)或者球形成效率的增加(上方圖)(N＝6)。(G)突變K-Ras的敲低阻抑了PANC1球形成效率。左上圖：蛋白質(zhì)印跡證實了敲低效率。左下圖和右圖：當與載體對照相比時，具有K-Ras shRNA表達的PANC1形成的球體具有更小的尺寸和數(shù)目(N＝6)。(H)突變K-Ras的敲低降低了PANC1腫瘤起始能力。左圖：無瘤生存率曲線。右圖：腫瘤形成頻率。N.S.無顯著性；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。

圖2.K-Ras而非H-Ras抑制Fzd8。(A)通過qPCR陣列所評估的H-Ras^V12和K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞中差異表達的干細胞因子的熱點圖(N＝3)。(B)在H-Ras^V12和K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞中差異表達的基因Bmpr1b、Fzd8和Gli2的散點圖(左)和鑒定。(C)當與載體對照或者H-Ras^V12轉(zhuǎn)化的細胞相比時，K-Ras轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞中降低的Fzd8表達和Wnt/Ca²⁺信號轉(zhuǎn)導(上方的8幅圖)，以及當與具有突變Raf的那些細胞相比時，具有致癌K-Ras突變的小鼠PDAC細胞中降低的Fzd8表達和Wnt/Ca²⁺信號轉(zhuǎn)導(下方的4幅圖)。(D)當分別與具有H-Ras^v12或B-Raf的那些細胞相比時，在K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞中(上方圖)以及在具有K-Ras突變的小鼠PDAC細胞(下方圖)中增加的TCF4和β-連環(huán)蛋白復合物。(E)與載體對照或H-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞相比，K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞中增加的TCF/β-連環(huán)蛋白活性(N＝4)。(F)K-Ras的敲低導致PANC2.13和PANC1細胞中Fzd8表達在mRNA水平上的增加(N＝3)。(G)具有包含Kras和HrasKI等位基因突變的wt H-Ras KO的皮膚腫瘤中，F(xiàn)zd8表達和CaMKii磷酸化水平的降低。(H)K-Ras的敲低增加了Fzd8蛋白水平、增強非經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導(p-CaMKii)，并增加了β-連環(huán)蛋白的磷酸化。(I)如通過TOPFlash分析(N＝4)所揭示的，PANC2.13細胞中K-Ras的敲低減弱經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導。

圖3.Fzd8介導的非經(jīng)典Wnt/Ca2⁺信號轉(zhuǎn)導抑制H-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞的腫瘤促進特性。(A)Fzd8在非經(jīng)典Wnt/Ca²⁺信號轉(zhuǎn)導通路中的示意圖及其與經(jīng)典的Wnt信號轉(zhuǎn)導的串擾的示意圖。使用小分子KN-93和針對Fzd8的shRNA來封阻CaMKii活性和Fzd8表達，以用于下述實驗。(B)通過KN-93抑制CaMKii降低了CaMKii的磷酸化，并降低了Fzd8的表達。(C)在H-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞中，KN-93的處理刺激了β-連環(huán)蛋白的轉(zhuǎn)錄活性(N＝4)。(D)通過KN-93抑制CaMKii增加了H-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞而非K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞的球體形成(N＝6)。(E-F)在H-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞中，F(xiàn)zd8的敲低降低了磷酸化CaMKii的水平(E)并刺激β-連環(huán)蛋白的轉(zhuǎn)錄活性(N＝4)(F)。(G)在H-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞中，F(xiàn)zd8的敲低促進了球體形成和重新鋪板率(N＝6)。(H)在H-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞中，F(xiàn)zd8的敲低增強了其腫瘤起始能力。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

圖4.Fzd8的下調(diào)是K-Ras增強腫瘤起始所需的。(A-B)在K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞中，F(xiàn)zd8表達的恢復增強了Wnt/Ca²⁺信號轉(zhuǎn)導(A)并降低了β-連環(huán)蛋白的轉(zhuǎn)錄活性(B)(N＝4)。(C)在K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞中，F(xiàn)zd8的恢復降低了球形成效率和重新鋪板率(N＝6)。(D)Fzd8的恢復降低了K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞的腫瘤起始能力。(E)在PANC1細胞中，F(xiàn)zd8的恢復增強了Wnt/Ca²⁺信號轉(zhuǎn)導(N＝4)，如通過NF-AT的轉(zhuǎn)錄活性所揭示的，并降低了β-連環(huán)蛋白活性(N＝4)。(F)Fzd8的恢復降低了PANC1細胞的腫瘤起始能力。(G)人胰腺腫瘤組織中Fzd8的下調(diào)。左圖：人胰腺正常組織和惡性組織中的針對Fzd8進行免疫染色的組織切片的顯微圖。(H)胰腺組織陣列中的Fzd8免疫反應性的H評分，所述胰腺組織包括正常的或者惡性的胰腺組織。(I)對癌鄰近的胰腺正常組織以及胰腺腺癌中的人Fzd8進行探查的RNAscope原位雜交。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

圖5.鈣調(diào)蛋白(CaM)-K-Ras相互作用是抑制K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞中鈣調(diào)蛋白激酶II(CaMKii)活性和Fzd8表達所必需的。(A)如在EDTA或Ca²⁺存在的情況下通過CaM pull-down分析所揭示的，鈣調(diào)蛋白與K-Ras^V12而非與H-Ras^V12相互作用。(B)當與K-Ras^V12或K-Ras^V12-S181A突變體相比時，CaM與K-Ras^V12-S181D突變體之間的相互作用的喪失。(C)當與K-Ras^V12或K-Ras^V12-S181A突變體相比時，K-Ras^V12-S181D突變體呈現(xiàn)減弱的抑制Fzd8啟動子活性的能力。(D)當與K-Ras^V12-或–S181A組相比時，在NIH/3T3-K-Ras^V12-S181D細胞中Fzd8的表達在RNA水平上增加(N＝3)。(E)當與NIH/3T3-K-Ras^V12或S181A細胞相比時，表達K-Ras^V12-S181D的NIH/3T3細胞顯示出增加的Fzd8表達水平和磷酸化CaMKii水平。在這三種細胞系中，K-Ras蛋白水平和磷酸化Erk水平無顯著差異。(F)當與K-Ras^V12-或–S181A組相比時，NIH/3T3-K-Ras^V12-S181D細胞呈現(xiàn)顯著增加的NF-AT轉(zhuǎn)錄活性(左圖)和顯著降低的Wnt/β-連環(huán)蛋白的活性(右圖)(N＝4)。(G)通過Wnt/β-連環(huán)蛋白信號轉(zhuǎn)導通路，在K-Ras介導的Fzd8表達的抑制和K-Ras促進的干細胞性中CaM-K-Ras相互作用的示意圖。提出Prostratin通過激活PKC使K-Ras磷酸化來干擾所述相互作用。(H)如通過CaM pull-down分析所揭示的，通過prostratin處理抑制鈣調(diào)蛋白與K-Ras^V12的相互作用。WCB：全細胞裂解物。IB：免疫印跡。(I)在K-Ras^V12而非K-Ras^V12-S181A突變體或H-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞中，通過prostratin處理升高的CaMKii活性。(J)在對prostratin處理的應答中，K-Ras^V12、K-Ras^V12-S181A突變體和H-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞的細胞形態(tài)。將DMSO用作介質(zhì)對照。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

圖6.Prostratin阻止了具有突變K-Ras的人胰腺癌中的腫瘤起始。(A)皮下注射的PANC1和PANC2.13在對介質(zhì)或prostratin處理的應答中的腫瘤起始率。上方圖：實驗設(shè)計的示意圖。在腫瘤移植之前一天，口服施用prostratin。將裸鼠用于皮下注射，以及將SCID小鼠用于原位移植。(B)在對藥物處理的應答中，來源于PANC2.13的皮下腫瘤的腫瘤生長曲線(N＝10)。(C)在對藥物處理的響應中，來源于PANC2.13的皮下腫瘤的生物發(fā)光成像(BLI)信號轉(zhuǎn)導變化(N＝10)。(D)在對藥物處理的應答中，來源于PANC2.13的皮下腫瘤的腫瘤增殖率和Ki67染色。腫瘤增殖率(D27-36)＝(D36天的腫瘤大小-D27天的腫瘤大小)/D36天的腫瘤大小*100。(E)在對藥物處理的應答中，來源于PANC2.13的原位腫瘤的腫瘤起始率和BLI信號轉(zhuǎn)導活性。(F)正常小鼠胰腺和來源于PANC2.13的原位腫瘤的H&E染色。(G)在對藥物處理的應答中，來源于PANC2.13的原位腫瘤的Ki67染色。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。對于(B)&(C)，數(shù)據(jù)是平均值±SEM。

圖7.Prostratin阻抑由致癌K-Ras驅(qū)使的體內(nèi)惡性腫瘤。(A)對于來源于PANC1或PANC2.13的0.5X10⁶個細胞的建立的皮下腫瘤，Prostratin顯示出抗腫瘤效果(N＝7；數(shù)據(jù)是平均值±SEM)。(B)Prostratin抑制通過cfDNA值所測量的原位腫瘤負荷(對于PANC2.13組，N＝5；對于PANC2.03組，N＝6)。(C)Prostratin降低了LRIG1cre/ER/LSL-Ras^G12V GEMM中乳頭狀瘤形成的發(fā)生率。左圖：LRIG1cre/ER/LSL-Ras^G12V小鼠中乳頭狀瘤產(chǎn)生的示意圖。右圖：用介質(zhì)或prostratin進行處理的攜帶K-Ras^G12V誘導的乳頭狀瘤的小鼠的圖片。(D)Prostratin差異性地影響LRIG1cre/ER/LSL-H-和K-Ras^G12V小鼠中的乳頭狀瘤的起始。(E)在用介質(zhì)(上方圖)或prostratin處理(下方圖)的K-Ras^G12V誘導的乳頭狀瘤中，H&E染色以及針對E-鈣粘蛋白和波形蛋白的IHC染色。

圖8.(A)被H-Ras^V12或K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞中類似水平的磷酸化Erk，無論培養(yǎng)基中的血清濃度如何。(B)如通過K-LISA所測量的H-Ras^V12或K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的細胞中類似的Akt活性(N＝4)。(C)由K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞形成的球體的增加的重新鋪板率。左圖：球體的形態(tài)及其隨后置于包含血清的培養(yǎng)基之后的變化。中間圖：活細胞的結(jié)晶紫染色。右圖：重新鋪板率(N＝8)。(D)如Erk的磷酸化所指示的在含有野生型Ras蛋白的BxPC3細胞中EGF的信號轉(zhuǎn)導效力。(E-F)通過shRNA選擇性敲低BxPC3細胞中的H-Ras或K-Ras。(G)K-Ras敲低之后，PANC2.13(左)和PANC1(右)細胞的形態(tài)。(H-I)在PANC2.13或PANC1細胞中，K-Ras的敲低降低了蛋白水平(H)或mRNA(I)水平的干細胞性特征。(J)突變的K-Ras的敲低減少了PANC2.13細胞中球體的形成和重新鋪板(N＝6)。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

圖9.(A)當與載體對照和H-Ras^V12相比時，用K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞中c-Myc和TCF1mRNA水平的表達增加(N＝3)。(B)在Rasless MEF-K-Ras^G12V細胞中，F(xiàn)zd8介導的非經(jīng)典信號轉(zhuǎn)導通路受抑。(左圖)在表達K-Ras^G12V的Rasless MEF中，蛋白質(zhì)印跡顯示降低的磷酸化CaMKii。(右圖)表達H-Ras^G12V和K-Ras^G12V的Rasless MEF中的小鼠Fzd8的qPCR陣列(N＝3)。(C)在相同數(shù)目的注射細胞下，Rasless MEF K-Ras^G12V細胞比Rasless MEF H-Ras^G12V細胞顯示出更高的腫瘤起始頻率。(D)來源于Rasless MEF K-Ras^G12V細胞的腫瘤顯示出顯著增加的增殖率。數(shù)據(jù)是平均值±SEM。(E)H-Ras^V12和K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3顯示出類似的Wnt3a和Wnt5a表達水平。(F)對在含有或不含Wnt3a或Wnt5a的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的NIH/3T3細胞中磷酸化CaMKii進行的蛋白質(zhì)印跡。(G)在含有或不含Wnt3a或Wnt5a的培養(yǎng)基中的NIH/3T3細胞的TOPFlash分析(N＝4)。(H)在對Wnt3a或Wnt5a的應答中，NIH/3T3細胞的球體形成分析。**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。

圖10.(A)在結(jié)腸癌細胞系中，突變K-Ras的敲低增加了Fzd8的表達以及CaMKii的磷酸化或者NFAT的轉(zhuǎn)錄活性(N＝3)。(B)在K-Ras已敲低的結(jié)腸癌細胞系中的TOPFlash(N＝3)。(C)在K-Ras已敲低的結(jié)腸癌細胞系中的類器官形成分析(N＝6)。(D)使用BrdU摻入分析來評估K-Ras已敲低的結(jié)腸癌細胞系中的細胞增殖率。將表達pLKO.1的細胞用作對照以用于標準化(N＝6)。(E)用不同的端錨聚合酶抑制劑處理12小時的NIH/3T3細胞中的相對TOPFlash活性。將DMSO處理的細胞用于標準化(對于各化合物，濃度：0.5μM)(N＝4)。(F)用不同的端錨聚合酶抑制劑處理12小時的NIH/3T3細胞中的球體形成分析。將DMSO處理的細胞用于標準化(N＝6)。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。

圖11.(A)在存在或不存在Fzd8過表達的NIH/3T3-K-Ras^V12細胞中，Wnt3a或Wnt5a的存在未影響磷酸化CaMKii的水平。(B)用Wnt3a或Wnt5a處理的過表達Fzd8的NIH/3T3-K-Ras^V12細胞中的TOPFlash分析。將表達GFP載體的細胞用作對照(N＝3)。(C-D)在PANC2.13細胞中，F(xiàn)zd8的恢復降低了干細胞特征，并增強了CaMKii的磷酸化(C)，同時降低了經(jīng)典Wnt通路中的靶基因的表達(D)(N＝3)。(E)在PANC1細胞中，F(xiàn)zd8的過表達降低了CD44和CD24mRNA水平的表達(N＝3)。(F)在PANC2.13或PANC1細胞中，F(xiàn)zd8的恢復模擬了K-Ras敲低的表型。(G)對人胰腺正常組織和惡性組織中以及不同階段的人胰腺腫瘤組織中的Fzd8進行免疫染色的組織切片的顯微圖。(H)不同的公開數(shù)據(jù)集中人Fzd8表達Oncomine分析。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

圖12.(A)用于NIH/3T3轉(zhuǎn)化的K-Ras^V12表達構(gòu)建體上的點突變的示意圖。(B)K-Ras蛋白在具有K-Ras^V12、-S181D和-S181A表達的NIH/3T3細胞中的膜定位。(C)在存在EDTA或Ca²⁺的情況下，鈣調(diào)蛋白與K-Ras^V12而非N-Ras^V12的相互作用，如通過CaM pull-down分析所揭示的。(D)過表達N-Ras^G12V的Rasless MEF比Rasless MEF-K-Ras^G12V顯示出更高的磷酸化CaMKii水平。(E)當與K-Ras^G12V相比時，N-Ras^G12V增強了Rasless MEF中Fzd8在mRNA水平上的表達(N＝3)。(F)過表達N-Ras^G12V或K-Ras^G12V的Rasless MEF中的TOPFlash分析(N＝4)。**P<0.01。

圖13.(A)在多種細胞系中，在對prostratin的應答中，通過DMSO處理組進行標準化的相對PKC活性(N＝3)。(B)以不同劑量prostratin處理的PANC1和PANC2.13中Fzd8和LEF1mRNA表達水平(N＝3)。(C)在過表達K-Ras^G12V而非H-Ras^G12V的Rasless MEF中，Prostratin增加了CaMKii的磷酸化水平，并降低了細胞活性率(對于細胞活性分析，N＝6)。(D)(左圖)在經(jīng)i.p.注射或者口服灌胃的裸鼠中，Prostratin降低了K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞而非H-Ras^V12轉(zhuǎn)化的細胞的腫瘤起始率。(右圖)體重變化指示，prostratin處理在動物中無全身毒性效應。(E)在來源于K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞的腫瘤中，Prostratin增加了CaMKii的磷酸化水平。(F)在prostratin處理后的不同時間點收獲的無胸腺NUDE小鼠的血清或胰腺中的PKC活性。*P<0.05；**P<0.01。

圖14.(A)(左圖)用prostratin處理的PANC1和PANC2.13的細胞形態(tài)。(右圖)用prostratin處理的PANC1和PANC2.13的相對細胞活力或增殖率(N＝6)。(B)(左圖)原位注射的PANC1的腫瘤起始率。(右圖)來源于PANC1的原位腫瘤的H&E和Ki67染色。(C)比較用介質(zhì)或者prostratin處理的接受原位注射PANC2.13的NOD SCID小鼠的腹膜的圖片。(D)在對每天的prostratin處理的應答中，來自PANC2.13的建立的腫瘤顯示切割的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3增加。(E)當與介質(zhì)處理的腫瘤相比時，來源于K-Ras^G12V的乳頭狀瘤顯示出顯著降低的腫瘤增殖率。

發(fā)明詳述

I.前言

本發(fā)明部分基于這樣的驚人發(fā)現(xiàn)：盡管K-Ras和H-Ras共有相同的效應物，并具有類似的特性，但是只有致癌的K-Ras而非H-Ras抑制非經(jīng)典的Wnt/Ca²⁺信號轉(zhuǎn)導(有力地導致K-Ras的致瘤特性的效應)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)K-Ras通過與鈣調(diào)蛋白結(jié)合來發(fā)揮其致瘤作用，所述結(jié)合降低了鈣調(diào)蛋白依賴性激酶II的活性并導致Fzd8表達的降低。進一步顯示，利用prostratin促進K-Ras與鈣調(diào)蛋白的解離恢復Fzd8介導的Wnt/Ca²⁺信號轉(zhuǎn)導抑制了腫瘤的形成和生長。因此，一方面，本發(fā)明提供通過施用治療量的prostratin或prostratin類似物治療對象中的癌癥的方法，所述癌癥如表達野生型K-Ras的癌癥或者表達突變型K-Ras的癌癥。

在另一方面，本發(fā)明還提供用于治療癌癥的組合物和試劑盒，所述癌癥如表達K-Ras的癌癥，所述組合物和試劑盒包含prostratin或prostratin類似物。

II.定義

本文使用的術(shù)語“K-Ras”指“Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同系物”。由K-Ras基因編碼的蛋白是在細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導中起作用的小GTPase。人K-Ras的基因和蛋白序列在例如Genbank登錄號M54968.1和AAB414942.1中示出。存在于人癌癥中的一些常見K-Ras的基因和蛋白含有位于12號密碼子、密碼子、61號密碼子、146號密碼子和/或其它并列位點處的突變。K-Ras突變的非限制性實例包括位于以下密碼子處的突變：5號密碼子(例如，K5E)、9號密碼子(例如，V9I)、12號密碼子(例如，G12A、G12C、G12D、G12F、G12R、G12S、G12V、G12Y)、13號密碼子(例如，G13C、G13D、G13V)、14號密碼子(例如，V14I、V14L)、18號密碼子(例如，A18D)、19號密碼子(例如，L19F)、22號密碼子(例如，Q22K)、23號密碼子(例如，L23R)、24號密碼子(例如，I24N)、26號密碼子(例如，N26K)、33號密碼子(例如，D33E)、36號密碼子(例如，I36L、I36M)、57號密碼子(例如，D57N)、59號密碼子(例如，A59E、A59G、A59T)、61號密碼子(例如，Q61H、Q61K、Q61L、Q61R)、62號密碼子(例如，E62G、E62K)、63號密碼子(例如，E63K)、64號密碼子(例如，Y64D、Y64H、Y64N)、68號密碼子(例如，R68S)、74號密碼子(例如，T74P)、92號密碼子(例如，D92Y)、97號密碼子(例如，R97I)、110號密碼子(例如，P110H、P110S)、117號密碼子(例如，K117N)、118號密碼子(例如，C118S)、119號密碼子(例如，D119N)、135號密碼子(例如，R135T)、138號密碼子(例如，G138V)、140號密碼子(例如，P140H)、146號密碼子(例如，A146T、A146V)、147號密碼子(例如，K147N)、153號密碼子(例如，D153N)、156號密碼子(例如，F(xiàn)156L)、160號密碼子(例如，V160A)、164號密碼子(例如，R164Q)、171號密碼子(例如，I171M)、176號密碼子(例如，K176Q)、185號密碼子(例如，C185R、C185S)和188號密碼子(例如，M188V)。

“表達K-Ras的癌癥”指具有可檢測的(野生型或其突變形式)K-Ras表達水平的癌癥。在一些實施方案中，當癌癥組織樣本中至少0.1％的細胞對于K-Ras激活(例如，野生型K-Ras或者位于12號密碼子、13號密碼子、61號密碼子和/或其它密碼子處的K-Ras激活突變)而言為陽性時，癌癥具有可檢測的表達水平。在一些實施方案中，癌癥具有可檢測的野生型K-Ras的表達水平。在一些實施方案中，癌癥具有可檢測的突變型K-Ras的表達水平。在一些實施方案中，表達K-Ras的癌癥中的K-Ras(例如，野生型K-Ras或突變型K-Ras)的表達水平比對照(例如，不表達K-Ras的非病變細胞或組織，如正常的人外周淋巴細胞)中的K-Ras表達水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、150％或200％。

術(shù)語“癌癥”指特征為異常細胞不受控制生長的疾病。該術(shù)語包括所有已知的癌癥和瘤病況(無論其特征為惡性、良性、軟組織還是實體的)，以及所有階段和等級的癌癥(包括轉(zhuǎn)移前和轉(zhuǎn)移后的癌癥)。不同類型的癌癥的實例包括但不限于，消化癌和胃腸癌，如胃部癌癥(例如，胃癌)、結(jié)腸直腸癌、胃腸間質(zhì)瘤、胃腸類癌瘤、結(jié)腸癌、直腸癌、肛門癌、膽管癌、小腸癌和食道癌；乳腺癌；肺癌；膽囊癌；肝癌；胰腺癌；闌尾癌；前列腺癌，卵巢癌；腎癌；中樞神經(jīng)系統(tǒng)的癌癥；皮膚癌(例如，黑素瘤)；淋巴瘤；神經(jīng)膠質(zhì)瘤；絨毛膜癌；頭頸癌；骨肉瘤；以及血癌。本文使用的“腫瘤”包含一個或多個癌性細胞。在一些實施方案中，所述癌癥為胰腺癌。

“生物樣本”包括血液和血液級分或產(chǎn)物(例如，血清、血漿、血小板、紅細胞等)；痰或唾液；腎、肺、肝、心臟、腦、神經(jīng)組織、甲狀腺、眼、骨骼肌、軟骨或骨組織；培養(yǎng)的細胞，例如，原代培養(yǎng)物、外植體和轉(zhuǎn)化的細胞，干細胞，糞便，尿等。此類生物樣本還包括組織切片，如活檢和尸檢樣本，以及用于組織學目的制備的冷凍切片。生物樣本通常獲自“對象”，即，真核生物，最優(yōu)選哺乳動物，如靈長類，例如，黑猩猩或人；奶牛；狗；貓；嚙齒類，例如，天竺鼠、大鼠或小鼠；兔；或鳥；爬行動物；或魚。

物質(zhì)(例如，prostratin或prostratin類似物或者以上的鹽或異構(gòu)體)的“治療量”或“治療有效量”是預防、減輕、減緩或降低對象中的癌癥(例如，表達K-Ras的癌癥)癥狀的嚴重性的量。

術(shù)語“prostratin”也被稱為12-脫氧佛波醇-13-乙酸酯，其指具有下述結(jié)構(gòu)的化合物：

術(shù)語“prostratin類似物”指為prostratin的結(jié)構(gòu)衍生物的化合物，其中一個或多個原子或官能團與prostratin不同。

本文使用的術(shù)語“鹽”指化合物例如prostratin或prostratin類似物的酸式鹽或堿式鹽。藥學可接受的鹽的示例性實例為陽離子鹽，如堿和堿土金屬(如鈉、鋰、鉀、鈣和鎂)鹽、銨(銨、三甲基銨、二乙基銨和三-(羥甲基)-甲基-銨)鹽、礦物酸(氫氯酸、氫溴酸、磷酸等)鹽、有機羧酸(乙酸、丙酸、谷氨酸、檸檬酸等)鹽、有機磺酸(甲磺酸)鹽以及季銨(甲基碘、乙基碘等)鹽。應當理解，藥學可接受的鹽是無毒的。關(guān)于合適的藥學可接受的鹽的其它信息可見于《雷明頓藥物科學》(Remington's,Pharmaceutical Sciences)(現(xiàn)行版),Mack Publishing Co.,Easton,PA，將其通過引用并入本文。

本文使用的術(shù)語“異構(gòu)體”指具有相同的化學式但在結(jié)構(gòu)上可區(qū)別的化合物。

術(shù)語“施用(administer)”、“施用(administered)”或“施用(administering)”指將物質(zhì)、化合物或組合物遞送至期望的生物作用位點的方法。這些方法包括但不限于，局部遞送、腸胃外遞送、靜脈內(nèi)遞送、真皮內(nèi)遞送、肌肉內(nèi)遞送、結(jié)腸遞送、直腸遞送或腹膜內(nèi)遞送。任選地與本文所描述的物質(zhì)和方法一起使用的施用技術(shù)包括例如，如Goodman和Gilman,《治療學的藥理學基礎(chǔ)》(The Pharmacological Basis of Therapeutics),現(xiàn)行版；Pergamon；和Remington的《藥物科學》(Pharmaceutical Sciences)(現(xiàn)行版),Mack Publishing Co.,Easton,PA中所討論的。

III.治療癌癥的方法

在一個方面，提供用于治療或預防對象中的癌癥的方法。在一些實施方案中，所述方法包括向所述對象施用治療量的prostratin或prostratin類似物或者以上的鹽或異構(gòu)體。在一些實施方案中，所述對象為人，例如，成年人或兒童。

在一些實施方案中，所述癌癥為表達K-Ras的癌癥，例如，表達或過表達野生型K-Ras的癌癥或者表達突變形式的K-Ras的癌癥。在一些實施方案中，表達K-Ras的癌癥為胰腺癌、結(jié)腸直腸癌或肺癌。在一些實施方案中，表達K-Ras的癌癥為胰腺癌，例如，胰腺導管腺癌。在一些實施方案中，所述方法還包括測量來自對象的樣本(例如，腫瘤組織樣本)中K-Ras表達的水平。在一些實施方案中，所述方法還包括測定在來自對象的樣本(例如，腫瘤組織樣本)中表達的K-Ras基因型。

在一些實施方案中，所述方法還包括：

檢測來自對象的樣本(例如，來自對象的腫瘤細胞或腫瘤組織樣本)中K-Ras表達的水平；

確定來自對象的樣本中K-Ras表達的水平是否大于對照(例如，不表達K-Ras的非病變細胞或組織，如正常的人外周淋巴細胞)中K-Ras表達的水平；以及

當來自對象的樣本中K-Ras表達的水平大于對照中K-Ras表達的水平時，向所述對象施用prostratin或prostratin類似物或者以上的鹽或異構(gòu)體。

在一些實施方案中，所述癌癥不為表達或過表達K-Ras的癌癥。作為非限制性實例，在一些實施方案中，所述癌癥為未表達或未過表達K-Ras的胰腺癌(例如，胰腺導管腺癌)。

表達K-Ras的癌癥

在一些實施方案中，所述癌癥為表達可檢測水平的K-Ras的癌癥。在一些實施方案中，當癌癥組織樣本中至少0.1％細胞對于K-Ras激活(例如，野生型K-Ras或者位于12號密碼子、13號密碼子、61號密碼子和/或其它密碼子處的K-Ras激活突變)而言為陽性時，癌癥具有可檢測的K-Ras表達水平。在一些實施方案中，癌癥具有可檢測的野生型K-Ras的表達水平。在一些實施方案中，癌癥具有可檢測的突變型K-Ras的表達水平。在一些實施方案中，K-Ras突變?yōu)槲挥谝韵碌囊粋€或多個密碼子處的激活突變：5號密碼子(例如，K5E)、9號密碼子(例如，V9I)、12號密碼子(例如，G12A、G12C、G12D、G12F、G12R、G12S、G12V、G12Y)、13號密碼子(例如，G13C、G13D、G13V)、14號密碼子(例如，V14I、V14L)、18號密碼子(例如，A18D)、19號密碼子(例如，L19F)、22號密碼子(例如，Q22K)、23號密碼子(例如，L23R)、24號密碼子(例如，I24N)、26號密碼子(例如，N26K)、33號密碼子(例如，D33E)、36號密碼子(例如，I36L、I36M)、57號密碼子(例如，D57N)、59號密碼子(例如，A59E、A59G、A59T)、61號密碼子(例如，Q61H、Q61K、Q61L、Q61R)、62號密碼子(例如，E62G、E62K)、63號密碼子(例如，E63K)、64號密碼子(例如，Y64D、Y64H、Y64N)、68號密碼子(例如，R68S)、74號密碼子(例如，T74P)、92號密碼子(例如，D92Y)、97號密碼子(例如，R97I)、110號密碼子(例如，P110H、P110S)、117號密碼子(例如，K117N)、118號密碼子(例如，C118S)、119號密碼子(例如，D119N)、135號密碼子(例如，R135T)、138號密碼子(例如，G138V)、140號密碼子(例如，P140H)、146號密碼子(例如，A146T、A146V)、147號密碼子(例如，K147N)、153號密碼子(例如，D153N)、156號密碼子(例如，F(xiàn)156L)、160號密碼子(例如，V160A)、164號密碼子(例如，R164Q)、171號密碼子(例如，I171M)、176號密碼子(例如，K176Q)、185號密碼子(例如，C185R、C185S)和188號密碼子(例如，M188V)。在一些實施方案中，K-Ras突變?yōu)榘被釟埢鵊12的突變(例如，G12C、G12V、G12D、G12A、G12S、G12R或G12F置換)。在一些實施方案中，K-Ras突變?yōu)榘被釟埢鵊13的突變(例如，G13C或G13D置換)。在一些實施方案中，K-Ras突變?yōu)榘被釟埢鵔61的突變(例如，Q61H或Q61K置換)。在一些實施方案中，K-Ras突變?yōu)榘被釟埢鵄146的突變(例如，A146T或A146V置換)。在一些實施方案中，表達可檢測水平的野生型或突變型K-Ras的癌癥為胰腺癌、肺癌或結(jié)腸直腸癌。

在一些實施方案中，所述癌癥為過表達K-Ras的癌癥。如本文所用，如果K-Ras(例如，野生型K-Ras或突變型K-Ras)的表達水平相對于閾值或?qū)φ諛颖?例如，不表達K-Ras的無病變細胞或組織，如正常的人外周淋巴細胞，或者已知K-Ras的表達為陰性的來自對象的癌癥樣本)有所增加，則癌癥“過表達”K-Ras。在一些實施方案中，如果K-Ras(例如，野生型K-Ras或突變型K-Ras)的表達水平比閾值或?qū)φ諛颖?例如，已知K-Ras的表達為陰性的癌癥)中的K-Ras表達水平高至少10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、150％或200％，則癌癥過表達K-Ras。在一些實施方案中，如果K-Ras(例如，野生型K-Ras或突變型K-Ras)的表達水平是相對于閾值或?qū)φ諛颖?例如，已知K-Ras的表達為陰性的癌癥)中K-Ras表達水平的至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或更多倍，則癌癥過表達K-Ras。在一些實施方案中，過表達野生型或突變型K-Ras的癌癥為胰腺癌、肺癌或結(jié)腸直腸癌。

可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法測量癌癥中的K-Ras的表達水平。在一些實施方案中，測量癌癥中的K-Ras基因表達的水平。在一些實施方案中，測量癌癥中的K-Ras蛋白表達的水平?？梢栽趤碜詫ο蟮纳飿颖局校瑴y量K-Ras基因或蛋白表達的水平或者檢測K-Ras基因型。在一些實施方案中，生物樣本包括癌細胞(例如，從腫瘤獲得或得到的細胞)。在一些實施方案中，生物樣本為腫瘤組織樣本。

可以使用本領(lǐng)域已知的多種免疫分析中的任一種測量K-Ras蛋白表達的水平。免疫分析的技術(shù)和方案通常描述于Price和Newman，《免疫分析的原理和實踐》(Principles and Practice of Immunoassay)，第2版，Grove詞典，1997；和Gosling，《免疫分析：實用方法》(Immunoassays:A Practical Approach)，Oxford University Press，2000?？梢允褂酶鞣N免疫分析技術(shù)，包括競爭性和非競爭性的免疫分析(參見，例如，Self等人,Curr.Opin.Biotechnol.,7:60-65(1996))。術(shù)語免疫分析包括這樣的技術(shù)：其包括不限于，酶免疫分析(EIA)，如酶放大免疫分析技術(shù)(EMIT)、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、IgM抗體捕獲ELISA(MAC ELISA)和微粒子酶免疫分析(MEIA)；毛細管電泳免疫分析(CEIA)；放射免疫分析(RIA)；免疫放射測定分析(IRMA)；免疫熒光(IF)；熒光偏振免疫分析(FPIA)；和化學發(fā)光分析(CL)。若需要，此類免疫分析可以是自動化的。免疫分析還可以與激光誘導熒光法聯(lián)合使用(參見，例如，Schmalzing等人,Electrophoresis,18:2184-93(1997)；Bao,J.Chromatogr.B.Biomed.Sci.,699:463-80(1997))。

可以直接或間接地檢測抗體與蛋白(例如，K-Ras)的特異性免疫學結(jié)合。直接標記包括熒光或冷光標簽、金屬、染料、放射性核素等，所述標記被連接至抗體。可以使用被碘-125(¹²⁵I)標記的抗體。使用對蛋白標志物具有特異性的化學發(fā)光抗體進行的化學發(fā)光分析適合于敏感、非放射性地檢測蛋白水平。被熒光染料標記的抗體也是合適的。熒光染料的實例包括不限于，DAPI、熒光素、Hoechst 33258、R-藻藍蛋白、B-藻紅蛋白、R-藻紅蛋白、羅丹明、德克薩斯紅和麗絲胺。間接標記包括本領(lǐng)域眾所周知的多種酶，如辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、脲酶等。辣根過氧化物酶檢測系統(tǒng)可以例如與顯色底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)一起使用，在過氧化氫的存在下其產(chǎn)生于450nm下可檢測的可溶產(chǎn)物。堿性磷酸酶檢測系統(tǒng)可以與顯色底物對硝基苯磷酸酯一起使用，例如，其產(chǎn)生于405nm下容易檢測的可溶產(chǎn)物。類似地，β-半乳糖苷酶檢測系統(tǒng)可以與顯色底物鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)一起使用，其產(chǎn)生于410nm下可檢測的可溶產(chǎn)物。脲酶檢測系統(tǒng)可以與底物如尿素-溴甲酚紫(Sigma Immunochemicals；St.Louis,MO)一起使用。

可以分析來自直接或間接標記的信號，例如，使用分光光度計檢測來自顯色底物的顏色；使用輻射計數(shù)器檢測輻射，如使用γ計數(shù)器檢測¹²⁵I；或者使用熒光計檢測某一波長光的存在下的熒光。為了檢測酶聯(lián)抗體，可以使用分光光度計如EMAX酶標儀(Molecular Devices；Menlo Park,CA)，根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，進行定量分析。若需要，本發(fā)明的分析可以是自動化的或機器進行的，并且可以同時檢測來自多個樣本的信號。在一些實施方案中，可以使用自動化的高含量成像系統(tǒng)，對信號量進行定量。高含量成像系統(tǒng)可以商購獲得(例如，ImageXpress,Molecular Devices Inc.,Sunnyvale,CA)。

抗體可以被固定在各種固體支持物上，如磁性或色譜基體顆粒、分析板的表面(例如，微量滴定孔)、固體基底材料片或膜(例如，塑料、尼龍、紙)等。可以通過將抗體或多種抗體以陣列形式包被在固體支持物上來制備分析條。然后可以將該條浸入測試樣本并通過洗滌和檢測步驟快速處理，以產(chǎn)生可測量的信號，如有色斑點。

可以使用常規(guī)技術(shù)來實現(xiàn)K-Ras核酸表達水平或K-Ras基因型的分析，所述常規(guī)技術(shù)如Southern分析、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)或基于與互補于目的編碼序列的一部分的核酸序列雜交的任何其它方法(例如，條形印跡雜交)，所述任何其它方法也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。可適用的PCR擴增技術(shù)描述于，例如，在前的Ausubel等人和Innis等人。通常的核酸雜交方法描述于Anderson,“Nucleic Acid hybridization,”BIOS Scientific Publishers,1999。由以微陣列排列的mRNA或cDNA序列也可以進行多個核酸序列(例如，基因組DNA、mRNA或cDNA)的擴增或雜交。微陣列方法通常描述于Hardiman,“Microarrays Methods and Applications:Nuts&Bolts,”DNA Press,2003；和Baldi等人,“DNA Microarrays and Gene Expression:From Experiments to Data Analysis and Modeling,”Cambridge University Press,2002。

也可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)進行核酸表達水平或基因型的分析，所述技術(shù)包括不限于微陣列、基于聚合酶鏈式反應(PCR)的分析、序列分析和電泳分析?；赑CR分析的非限制性實例包括可獲自Applied Biosystems的等位基因鑒別分析。序列分析的非限制性實例包括Maxam-Gilbert測序、Sanger測序、毛細管陣列DNA測序、熱循環(huán)測序(Sears等人,Biotechniques,13:626-633(1992))、固相測序(Zimmerman等人,Methods Mol.Cell Biol.,3:39-42(1992))、質(zhì)譜測序如基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF/MS；Fu等人,Nat.Biotechnol.,16:381-384(1998))、焦磷酸測序(Ronaghi等人,Science,281:363-365(1998))以及雜交測序(Chee等人,Science,274:610-614(1996)；Drmanac等人,Science,260:1649-1652(1993)；Drmanac等人,Nat.Biotechnol.,16:54-58(1998))。電泳分析的非限制性實例包括平板凝膠電泳(如瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳)、毛細管電泳和變性梯度凝膠電泳。在一些實施方案中，檢測核酸變體的方法包括，例如，來自Third Wave Technologies,Inc.的分析、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析、等位基因特異性寡核苷酸雜交、異源雙鏈遷移率分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析、單核苷酸引物延伸(SNUPE)和焦磷酸測序。

在本文所描述的分析中可以使用可檢測部分。可以使用各種可檢測部分，根據(jù)所需的敏感性、與抗體綴合的容易性、穩(wěn)定性需求、以及可用的使用儀器和處理條款，來選擇標記。合適的可檢測部分包括但不限于，放射性核素、熒光染料(例如，熒光素、異硫氰酸熒光素(FITC)、Oregon Green^TM、羅丹明、德克薩斯紅、四羅丹明異硫氰酸(TRITC)、Cy3、Cy5等)、熒光標志物(例如，綠色熒光蛋白(GFP)、藻紅蛋白等)、通過腫瘤相關(guān)的蛋白酶激活的自淬滅熒光化合物、酶(例如，熒光素酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等)、納米顆粒、生物素、地高辛配基等。

所述分析可以以多種物理形式進行。例如，微量滴定板或自動化的使用可以用來促進大量測試樣本的處理。

可選地，為了檢測蛋白或核酸表達的水平，可以將抗體或核酸探針應用于被固定在顯微鏡載片上的對象樣本上。所得抗體的染色或原位雜交模式可以使用本領(lǐng)域已知的多種光或熒光顯微方法中的任一種來顯現(xiàn)。

蛋白或核酸的分析也可以例如通過單獨或者與質(zhì)譜(例如，MALDI/MS、MALDI-TOF/MS、串聯(lián)MS等)聯(lián)合的高壓液相色譜(HPLC)來實現(xiàn)。

測定K-Ras基因型的方法在本領(lǐng)域有描述。參見，例如，Kramer等人,Cell Oncol.31:161-167(2009)；Chen等人,J.Chromatogr.A 1216:5147-5154(2009)；Lamy等人,Modern Pathology 24:1090-1100(2011)；Galbiati等人,PLoS ONE 8(3):359939(2013)；和WO 2010/048691。

Prostratin和Prostratin類似物

在一些實施方案中，向有需要的對象(例如，患有癌癥如表達或者過表達K-Ras的癌癥的對象)施用治療量的prostratin或者其鹽或異構(gòu)體。Prostratin(12-脫氧佛波醇-13-乙酸酯；CAS 60857-08-1)可商購自，例如Santa Cruz Biotechnology(Dallas,TX)和abcam Biochemicals(Cambridge,MA)。

在一些實施方案中，向有需要的對象(例如，患有癌癥如表達或者過表達K-Ras的癌癥的對象)施用治療量的prostratin類似物或者其鹽或異構(gòu)體。在一些實施方案中，prostratin類似物是與prostratin結(jié)構(gòu)上相關(guān)的化合物，其具有與prostratin相當?shù)牡鞍准っ窩(PKC)結(jié)合親和力。在一些實施方案中，prostratin類似物是與prostratin結(jié)構(gòu)上相關(guān)的化合物，其相對于prostratin具有改善的PKC結(jié)合親和力。

在一些實施方案中，prostratin類似物是于US 5,021,549、US 8,536,378、WO 2009/126949、US 2011/0014699或US 2011/0224297中公開的化合物，將其各自通過引用并入本文。

在一些實施方案中，prostratin的結(jié)構(gòu)類似物可以與母體prostratin化合物共有一種或多種結(jié)構(gòu)特征，但是可以在所選的酯基方面不同。在一些實施方案中，prostratin類似物是具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物：

其中：

R³選自O(shè)R、鹵素、SeR、SR、SOR、SO₂R、芳基、NHR、NR₂以及NHCOR，其中R是1-15個碳的低級烷基(C1至C15)；

R⁴選自氫、烷基(C1至C20)、環(huán)烷基(C3至C15)、芳基(C6至C10)、羥基、碳酸烷基酯、氨基甲酸酯、酯、醚、硫醇、胺、膦、磷酸酯、磷酰胺、亞磷酰胺、氨基磷酸酯、亞磷酸酯、膦酸酯、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰、砜、亞硫酸酯、酰胺、胍和脲；以及

R⁵選自氫、烷基(C1至C20)、環(huán)烷基(C3至C15)、芳基(C6至C10)、羥基、碳酸烷基酯、氨基甲酸酯、酯、醚、硫醇、胺、膦、磷酸酯、磷酰胺、亞磷酰胺、氨基磷酸酯、亞磷酸酯、膦酸酯、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰、砜、亞硫酸酯、酰胺、胍以及脲。

在一些實施方案中，prostratin類似物是具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物：

其中R是乙基、甲酸酯、丙酸酯、丁酸酯、戊酸酯、己酸酯、苯甲酸酯、乙酸苯酯、乙酸環(huán)己酯、乙酸五氟苯酯、乙酸-1-萘酯、乙酸-2-萘酯、(5,6,7,8)四氫-1-萘基乙酸酯、乙酸聯(lián)苯酯、乙酸金剛烷酯或?qū)Ρ揭宜崞S酯。

本領(lǐng)域中描述了合成prostratin和prostratin類似物的方法。參見，例如Wender等人，Science 320:649-652(2008)；以及Beans等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 110:11698-11703(2013)，將其各自通過引用并入。本領(lǐng)域中還描述了例如通過PKC結(jié)合親和力分析測試prostratin和prostratin類似物的活性的方法。參見，例如Beans等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 110:11698-11703(2013)。

施用以及組合療法

治療劑(例如prostratin或prostratin類似物或者以上的鹽或異構(gòu)體)的施用途徑可以是口服施用、腹腔內(nèi)施用、經(jīng)皮施用、皮下施用、通過靜脈內(nèi)或者肌肉內(nèi)注射施用、通過吸入施用、局部施用、病灶內(nèi)施用、輸注施用；脂質(zhì)體介導的遞送；局部施用、鞘內(nèi)施用、齦袋施用、直腸施用、支氣管內(nèi)施用、鼻施用、透粘膜施用、腸道施用、眼部或耳部遞送或者本領(lǐng)域已知的任何其它方法。在一些實施方案中，口服施用、靜脈內(nèi)施用或者腹腔內(nèi)施用prostratin或prostratin類似物或者以上的鹽或異構(gòu)體。

在一些實施方案中，以治療有效的量或劑量施用prostratin或prostratin類似物或者以上的鹽或異構(gòu)體?？梢允褂孟率雒咳談┝糠秶杭s0.01mg/kg至約500mg/kg，或者約0.1mg/kg至約200mg/kg，或者約1mg/kg至約100mg/kg，或者約10mg/kg至約50mg/kg。然而，劑量可以根據(jù)一些因素而改變，所述因素包括所選的施用途徑、組合物劑型、患者應答、病況的嚴重性、對象的體重以及處方醫(yī)師的判斷。根據(jù)個體患者的需要，劑量可以隨時間增加或減少。在某些情況下，最初給予患者低劑量，然后增加至患者可耐受的有效劑量。有效量的確定完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力內(nèi)。

在一些實施方案中，將prostratin或prostratin類似物或者以上的鹽或異構(gòu)體與第二治療劑組合施用。在一些實施方案中，第二治療劑是化療劑。在一些實施方案中，化療劑是烷化劑(例如，環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、白消安、美法侖、氮芥、烏拉莫司汀、塞替派、亞硝基脲或替莫唑胺)、蒽環(huán)類藥物(例如，多柔比星、阿霉素、道諾紅菌素、表柔比星或米托蒽醌)、細胞支架干擾物(例如，紫杉醇或多西紫杉醇)、組蛋白脫乙酰酶抑制劑(例如，伏立諾他或羅米地辛)、拓撲異構(gòu)酶的抑制劑(例如，伊立替康、拓撲替康、安吖啶、依托泊苷或替尼泊苷)、激酶抑制劑(例如，硼替佐米、埃羅替尼、吉非替尼、伊馬替尼、維羅非尼或維莫德吉)、核苷類似物或前體類似物(例如，阿扎胞苷、硫唑嘌呤、卡培他濱、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、巰嘌呤、甲氨蝶呤或硫鳥嘌呤)、肽抗生素(例如，放線菌素或博來霉素)、基于鉑的藥劑(例如，順鉑、奧沙利鉑(oxaloplatin)或卡鉑)或者植物生物堿(例如，長春新堿、長春花堿、長春瑞濱、長春地辛、鬼臼毒素、紫杉醇或多西紫杉醇)。在一些實施方案中，化療劑是吉西他濱。

可以一起施用或者分別施用、同時施用或者在不同的時間施用共施用的治療劑(例如，prostratin或prostratin類似物或者以上的鹽或異構(gòu)體，以及如本文所述的第二治療劑)。當施用時，視需要，可以每天一次、二次、三次、四次或者更多或更少次獨立地施用治療劑。在一些實施方案中，每天一次施用所施用的治療劑。在一些實施方案中，在同一時間或者同時施用所施用的治療劑，例如以混合物的形式。在一些實施方案中，治療劑中的一種或多種以緩釋制劑的形式施用。

在一些實施方案中，將prostratin或prostratin類似物或者以上的鹽或異構(gòu)體與第二治療劑同時施用。在一些實施方案中，首先施用prostratin或prostratin類似物，例如在施用第二治療劑(例如，化療劑)之前約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100天或者更多天。在一些實施方案中，首先施用第二治療劑(例如，化療劑)，例如在施用prostratin或prostratin類似物之前約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100天或者更多天。

在一些實施方案中，在延長的時段內(nèi)，向?qū)ο笫┯胮rostratin或prostratin類似物或者以上的鹽或異構(gòu)體(以及任選地第二治療劑，例如如本文所述的化療劑)，例如，持續(xù)至少30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350天或更久。

IV.組合物和試劑盒

另一方面，提供用于治療或預防對象中的癌癥(例如，表達或過表達K-Ras的癌癥)的組合物和試劑盒。

在一些實施方案中，提供包含prostratin或prostratin類似物或者以上的鹽或異構(gòu)體的藥物組合物，其用于向患有癌癥(例如，表達或過表達野生型K-Ras或突變型K-Ras的癌癥)的對象施用。在一些實施方案中，prostratin或prostratin類似物(或者其鹽或異構(gòu)體)如以上第III部分中所述。在一些實施方案中，通過用合適的藥學可接受的載體或稀釋劑配制而將prostratin或prostratin類似物或者以上的鹽或異構(gòu)體與第二治療劑(例如，如本文所述的化療劑)的組合共同或者分別配制為藥物組合物，并且其可被配制為固體、半固體、液體或氣體形式的制備物，如片劑、膠囊、丸劑、粉劑、粒劑、糖錠劑、膠體、藥漿、軟膏、溶液、栓劑、注射劑、吸入劑以及氣霧劑。

制備用于本發(fā)明的制劑的指導見于，例如，以上Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21^st Ed.,2006；Martindale:The Complete Drug Reference,Sweetman,2005,London:Pharmaceutical Press；Niazi,Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations,2004,CRC Press；以及Gibson,Pharmaceutical Preformulation and Formulation:A Practical Guide from Candidate Drug Selection to Commercial Dosage Form,2001,Interpharm Press，在此將其通過引用并入本文。可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式，即通過常規(guī)的混合、溶解、?；?、糖衣制備、磨細、乳化、包封、截留或凍干法來制備本文所述的藥物組合物。下述方法和賦形劑僅是示例性的，并且絕非限制性的。

在一些實施方案中，將prostratin或prostratin類似物或者以上的鹽或異構(gòu)體(以及任選地第二治療劑，例如如本文所述的化療劑)制備為以緩釋制劑、控釋制劑、延長釋放制劑、定時釋放制劑或延遲釋放制劑的形式遞送，例如，以含有治療劑的固體疏水聚合物的半滲透基質(zhì)的形式遞送。已建立了不同類型的緩釋材料，并且其為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。當前的延長釋放制劑包括薄膜包衣片、多微?；蛲鑴┫到y(tǒng)、使用親水或親脂材料的基質(zhì)技術(shù)以及含有造孔賦形劑的基于蠟的片劑(參見，例如，Huang等人，Drug Dev.Ind.Pharm.29:79(2003)；Pearnchob等人，Drug Dev.Ind.Pharm.29:925(2003)；Maggi等人，Eur.J.Pharm.Biopharm.55:99(2003)；Khanvilkar等人，Drug Dev.Ind.Pharm.228:601(2002)；以及Schmidt等人，Int.J.Pharm.216:9(2001))。基于緩釋遞送系統(tǒng)的設(shè)計，其可以在數(shù)小時或數(shù)天的進程內(nèi)，例如在4、6、8、10、12、16、20、24小時或更久的時間內(nèi)釋放化合物。通常，可以使用天然存在的或合成的聚合物來制備緩釋制劑，所述聚合物例如，聚合的乙烯基吡咯烷酮，如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；羧乙烯基親水聚合物；疏水性和/或親水性水狀膠體，如甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基纖維素和羥丙基甲基纖維素；以及羧聚亞甲基。

也可利用天然成分來制備緩釋或延長釋放的制劑，所述天然成分如礦物質(zhì)，包括二氧化鈦、二氧化硅、氧化鋅和粘土(參見，美國專利6,638,521，通過引用并入本文)。示例性的延長釋放制劑包括美國專利第6,635,680號；第6,624,200號；第6,613,361號；第6,613,358號；第6,596,308號；第6,589,563號；第6,562,375號；第6,548,084號；第6,541,020號；第6,537,579號；第6,528,080號以及第6,524,621號中所述的那些，在此將其各自通過引用并入本文。示例性的控釋制劑包括美國專利第6,607,751號；第6,599,529號；第6,569,463號；第6,565,883號；第6,482,440號；第6,403,597號；第6,319,919號；第6,150,354號；第6,080,736號；第5,672,356號；第5,472,704號；第5,445,829號；第5,312,817號以及第5,296,483號中所述的那些，在此將其各自通過引用并入本文。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地認識到其它可適用的緩釋制劑。

對于口服施用而言，可以通過與本領(lǐng)域熟知的藥學可接受的載體組合容易地配制prostratin或prostratin類似物或者以上的鹽或異構(gòu)體(以及任選地第二治療劑，例如如本文所述的化療劑)。此類載體使得化合物能夠被配制為片劑、丸劑、糖錠劑、膠囊、乳劑、親脂性和親水性懸液、液體、膠體、糖漿、藥漿、懸液等，用于被待治療的患者口服攝取?？梢酝ㄟ^下述獲得用于口服使用的藥物制備物：將化合物與固體賦形劑混合，任選地研磨得到的混合物，并且若需要，在添加合適的助劑之后處理顆?；旌衔铮垣@得片劑或糖錠劑核心(dragee core)。合適的賦形劑包括，例如，填充劑，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纖維素制備物，如例如，玉米淀粉、小麥淀粉、米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、黃蓍樹膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。若需要，可以添加崩解劑，如交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或者海藻酸或其鹽，如海藻酸鈉。

可將prostratin或prostratin類似物或者以上的鹽或異構(gòu)體(以及任選地第二治療劑，例如如本文所述的化療劑)配制為通過注射，例如通過彈丸注射或連續(xù)輸注腸胃外施用。對于注射而言，可以通過在水性或非水性溶劑中溶解、懸浮或乳化化合物而將其配制為制劑，所述水性或非水性溶劑如植物油或其它類似的油、合成的脂肪酸甘油酯、高級脂肪酸酯或丙二醇；以及若需要，含有常規(guī)添加劑，如增溶劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。在一些實施方案中，可在水溶液，優(yōu)選在生理兼容的緩沖液，如漢克斯液、林格氏液或生理鹽水緩沖液中配制化合物。用于注射的制劑可以以單位劑型存在，例如，存在于安瓿或者多劑量容器中，含有添加的防腐劑。組合物可以采取如下形式：油性或水性介質(zhì)中的懸液、溶液或乳狀液，并且可以包含配制劑(formulatory agent)，如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。

可以通過透粘膜或者經(jīng)皮方式全身施用prostratin或prostratin類似物或者以上的鹽或異構(gòu)體(以及任選地第二治療劑，例如如本文所述的化療劑)。對于透粘膜或者經(jīng)皮施用而言，在制劑中使用適于待滲入屏障的滲透劑。對于局部施用而言，將藥劑配制為膏劑、霜劑、藥膏、粉劑和膠體。在一個實施方案中，經(jīng)皮遞送劑可以是DMSO。經(jīng)皮遞送系統(tǒng)可以包括，例如貼劑。對于透粘膜施用而言，在制劑中使用適于待滲入屏障的滲透劑。此類滲透劑在本領(lǐng)域通常是已知的。示例性的經(jīng)皮遞送制劑包括美國專利第6,589,549號；第6,544,548號；第6,517,864號；第6,512,010號；第6,465,006號；第6,379,696號；第6,312,717號以及第6,310,177號中所述的那些，在此，將其各自通過引用并入本文。

在一些實施方案中，藥物組合物包含可接受的載體和/或賦形劑。藥學可接受的載體包括生理兼容的并且優(yōu)選不干擾或者以其它方式抑制治療劑的活性的任何溶劑、分散介質(zhì)或包衣。在一些實施方案中，載體適于靜脈內(nèi)施用、肌肉內(nèi)施用、口服施用、腹腔內(nèi)施用、經(jīng)皮施用、局部施用或者皮下施用。藥學可接受的載體可以包含一種或多種生理可接受的化合物，所述組合物用于例如穩(wěn)定組合物或者增加或降低活性劑的吸收。生理可接受的組合物可以包括，例如碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖；抗氧化劑，如抗壞血酸或谷胱甘肽；螯合劑；低分子量蛋白；減少活性劑的清除或水解的組合物；或者賦形劑或其它穩(wěn)定劑和/或緩沖劑。其它藥學可接受的載體及其制劑眾所周知，并且通常描述于，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版,Philadelphia,PA.Lippincott Williams&Wilkins,2005中。各種藥學可接受的賦形劑在本領(lǐng)域眾所周知，并且可見于，例如Handbook of Pharmaceutical Excipients(第5版,Rowe等人編著，Pharmaceutical Press,Washington,D.C.)。

在一些實施方案中，提供用于向患有癌癥(例如，表達或過表達野生型K-Ras或突變型K-Ras的癌癥)的對象施用的試劑盒。在一些實施方案中，試劑盒包含：

Prostratin或prostratin類似物或者以上的鹽或異構(gòu)體；以及

第二治療劑。

在一些實施方案中，prostratin或prostratin類似物(或者其鹽或異構(gòu)體)如以上第III部分所述。在一些實施方案中，第二治療劑是化療劑。在一些實施方案中，化療劑是烷化劑、蒽環(huán)類藥物、細胞支架干擾物、組蛋白脫乙酰酶抑制劑、拓撲異構(gòu)酶抑制劑、激酶抑制劑、核苷類似物或前體類似物、肽抗生素、基于鉑的藥劑或者植物生物堿。在一些實施方案中，化療劑是核苷類似物。在一些實施方案中，化療劑是吉西他濱。

在一些實施方案中，試劑盒還可以包含說明性材料，其含有實踐本發(fā)明的方法的用法(即，方案)(例如使用試劑盒治療癌癥的說明)。盡管說明性材料通過包括書面材料和打印材料，但是它們不限于此。本發(fā)明考慮了能夠存儲此類說明并將其傳達給最終用戶的任何媒介物。此類媒介物包括但不限于電子存儲媒介物(例如，磁盤、錄音帶、膠卷、芯片)、光學媒介物(例如，CD ROM)等。此類媒介物可以包含提供此類說明性材料的網(wǎng)站地址。

V.實施例

提供下述實施例以闡明而非限制所要求保護的發(fā)明。

實施例1：K-Ras通過阻抑非經(jīng)典的Wnt信號轉(zhuǎn)導促進致瘤性

前言

Ras超家族的小GTP酶是多個信號轉(zhuǎn)導通路的關(guān)鍵組分。Ras亞家族中的三個經(jīng)典成員H-Ras、N-Ras和K-Ras在人腫瘤中通常是突變的，并且干擾許多細胞過程，如基因表達、細胞周期進程和凋亡逃避(Giehl,Biol Chem 386:193-205,2005)。過去三十年的大量研究確定Ras蛋白作為惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤起始以及腫瘤進展和轉(zhuǎn)移的驅(qū)動子，表明致癌Ras是具有高吸引力的治療靶標(Stephen等人，Cancer Cell 25:272-281,2014)。未解決的問題是H-Ras、N-Ras和K-Ras蛋白是否在生理和病理過程中發(fā)揮獨特或多余的作用。由于它們高程度的序列同源性以及重疊的上游激活子或下游效應物，這三種Ras同種型長期以來被認為在功能上是冗余的。然而，越來越多的證據(jù)表明這些Ras同種型也可能具有不同的生物特性。首先，這三種Ras基因座各自的基因切除導致在轉(zhuǎn)基因動物中顯著不同的表型。K-Ras4B缺陷導致胚胎死亡，而N-Ras、H-Ras和K-Ras4A敲除的小鼠未顯示出明顯異常(Johnson等人，Genes Dev.11:2468-2481,1997；Koera等人，Oncogene 15:1151-1159,1997；Malumbres和Barbacid,Nat Rev Cancer 3:459-465,2003)。然而，K-Ras的該獨特生物學表型是由其基因產(chǎn)物的特定功能還是由其不同的表達模式引起的仍待確定(Esteban等人，Mol.Cell Biol 21:1444-1452,2001)。其次，已在20％至30％的全部人類腫瘤中發(fā)現(xiàn)H-Ras、N-Ras或K-Ras的激活突變，但顯示出驚人程度的組織特異性。N-Ras突變在急性白血病中常見，而H-Ras和K-Ras突變罕見(Sakamoto等人，Hum Pathol 32:1225-1231,2001)。相反地，致癌K-Ras突變高頻率發(fā)生于胰腺癌(90％)、結(jié)腸直腸癌(50％)和肺癌(35％)中，而N-Ras和H-Ras突變十分罕見(Prior等人，Cancer Res.72:2457-2467,2012)。

假定K-Ras4B而非N-Ras、H-Ras或K-Ras4A是胚胎發(fā)育必不可少的，則K-Ras4B在胚胎干細胞(ESC)中發(fā)揮重要且獨特的作用是可能的。事實上，已顯示一些胚胎基因和信號轉(zhuǎn)導通路，如Myc、Notch信號轉(zhuǎn)導和Wnt信號轉(zhuǎn)導，在正常ESC以及癌細胞的腫瘤起始中具有重疊的調(diào)控作用(Harris等人，Expert Opin Ther Targets 16:131-145,2012)。因此，吸引人的可能性是，致癌K-Ras在誘導腫瘤起始和干細胞樣特征中發(fā)揮重要(但先前未知)的作用，并且這些特征導致K-RAS突變腫瘤的侵略本性。

在Ras蛋白中，K-Ras是最頻繁突變的，并且因此是癌癥療法的有吸引力的靶標，特別是在不存在有效療法的胰腺癌中。然而，盡管K-Ras作為治療靶標具有極大興趣，但是在開發(fā)直接封閉K-Ras的功能并在臨床前模型中顯示出功效的小分子抑制劑方面還沒有成功(Downward,Nat Rev Cancer 3:11-22,2003；Karnoub和Weinberg,Nat Rev Mol Cell Biol9:517-531,2008；Stephen等人，2014)。在該研究中，我們提供了致癌K-Ras通過下調(diào)非經(jīng)典的Wnt/Ca²⁺信號轉(zhuǎn)導并阻抑Fzd8表達引發(fā)致瘤表型的證據(jù)。這在H-Ras轉(zhuǎn)化細胞中未觀察到，從而確立了真正同種型(bona fide isoform)-K-Ras的特異性作用。鈣調(diào)蛋白(CaM)與K-Ras(特別是4B同種型)的結(jié)合，而非與H-Ras的結(jié)合，似乎負責該主要差異：CaM與K-Ras的結(jié)合降低了CaM依賴性激酶II(CaMKii)的活性，并導致Fzd8表達的減少，所述CaM依賴性激酶II是Wnt/Ca²⁺信號轉(zhuǎn)導通路的主要下游效應物。通過增加的Fzd8表達或者通過阻止K-Ras與CaM的結(jié)合恢復Fzd8介導的Wnt/Ca²⁺信號轉(zhuǎn)導損壞了K-Ras介導的致瘤性，這提供了抑制該“無藥可靶向的(undruggable)”蛋白的潛在新途徑。確實，用prostratin處理小鼠阻抑了由K-Ras^G12V特異性驅(qū)動的胰腺癌和乳頭狀瘤模型中腫瘤的形成和生長，但未阻抑由H-Ras^G12V驅(qū)動的胰腺癌和乳頭狀瘤模型中腫瘤的形成和生長，所述prostratin是促進K-Ras與CaM解離的天然產(chǎn)物。

K-Ras^V12和H-Ras^V12在起始腫瘤形成方面不同，盡管參與相當?shù)慕?jīng)典MAPK和Akt信號轉(zhuǎn)導

為了闡明K-Ras和H-Ras的不同特性，我們在同基因NIH/3T3細胞中表達了受巨細胞病毒啟動子控制的致癌H-Ras和K-Ras，并尋找含有這兩種致癌基因的細胞之間的表型差異。H-Ras^V12和K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞均顯示出類似的形態(tài)學變化，指示轉(zhuǎn)化(數(shù)據(jù)未顯示)。GTP結(jié)合的Ras結(jié)合并激活許多下游效應物，并且可以通過Ras-GTP與C-Raf或RalGDS的Ras結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)的共免疫沉淀來測量Ras-GTP的水平(Santarpia等人，Expert Opin Ther Targets 16:103-119,2012)。H-Ras^V12和K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的細胞具有可比較的負載GTP的Ras水平，如C-Raf-RBD-和RalGDS-RBD-pull down分析所顯示的(圖1A)，并且顯示出類似的磷酸化的Erk1/2和Akt水平(圖1B)，不考慮培養(yǎng)條件中存在的血清(圖1B；圖8A)。此外，利用Akt的生物素化肽底物的基于ELISA的分析證實H-Ras^V12-和K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞具有類似的Akt激酶活性，當與載體對照細胞相比時，二者中的Akt激酶活性均升高(圖8B)?？偟貋碚f，這些數(shù)據(jù)表明Ras^V12-轉(zhuǎn)化的細胞含有類似水平的活性H-Ras和K-Ras，以及相當?shù)慕?jīng)典下游信號轉(zhuǎn)導通路的激活水平。

接下來，我們研究了Ras^V12轉(zhuǎn)化的細胞是否顯示出干細胞樣特質(zhì)以及在體外以單細胞水平自我更新的能力。干細胞特性(stem-ness)或體外自我更新的一個度量是球體的形成以及球體隨后在再現(xiàn)(recapitulate)2D培養(yǎng)中細胞指數(shù)生長的能力(Fang等人，Cancer Res 65:9328-9337,2005；Fujii等人，Int J Oncol 34:1381-1386,2009；Gou等人，Pancreas 34:429-435,2007；Ponti等人，Cancer Res.65:5506-5511,2005；Singh等人，Cancer Res.63:5821-5828,2003)。使用有限數(shù)目的接種細胞，當與H-Ras^V12轉(zhuǎn)化的細胞和載體對照相比時，K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞顯示出顯著增加的球形成效率(圖1C)。重新鋪板顯示，相對于來自H-Ras^V12轉(zhuǎn)化的細胞的球體的生活力和重新鋪板效率的降低，來自K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞的球體是有活力的，并且能夠重新起始2D培養(yǎng)中指數(shù)生長的細胞(圖8C)。K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞的球形成效率的增加不是由于較高的增殖率，因為當以低密度接種時，H-Ras^V12轉(zhuǎn)化的細胞實際上比K-Ras轉(zhuǎn)化的細胞具有更高的DNA合成率(數(shù)據(jù)未顯示)。

使用在體內(nèi)的有限且連續(xù)的移植，我們接下來評估了K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞的致瘤潛力(Clarke等人，Cancer Res.66:9339-9344,2006)。小鼠皮下注射H-Ras^V12或K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞，并測定無瘤生存率。當移植1,000個細胞時，H-Ras^V12和K-Ras^V12腫瘤以類似的速率產(chǎn)生。然而，當移植細胞的數(shù)目降低至100個時，與H-Ras^V12細胞相比，K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的細胞顯示出顯著增加的腫瘤起始率(圖1D，左圖)。為了進一步研究它們在體內(nèi)自我更新的能力，我們將分離自原發(fā)腫瘤(由1,000個移植的細胞起始的)的細胞重新移植進第二組群的受體小鼠內(nèi)。在注射500個NIH/3T3-K-Ras^V12細胞時，所有10只注射小鼠均產(chǎn)生腫瘤。相比之下，10只注射H-Ras^V12細胞的小鼠中僅2只成功起始了腫瘤(圖1D，右圖)。因此，當與H-Ras^V12轉(zhuǎn)化細胞相比時，K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞顯示出增加的腫瘤起始頻率和升高的在體內(nèi)再現(xiàn)腫瘤形成的能力。

不同Ras同種型的激活突變以高度組織特異性的方式發(fā)生于人癌癥中(Hezel等人，Genes Dev.20:1218-1249,2006)，但是這些差異是否反映各同種型的區(qū)別特征并不清楚。為了研究K-Ras和H-Ras在誘導致瘤性中是否發(fā)揮不同的作用，我們研究了BxPC3細胞(表達野生型H-Ras和K-Ras的胰腺癌細胞系)中的H-Ras和K-Ras在調(diào)控惡性腫瘤中的作用。用EGF刺激BxPC3細胞激活MAPK信號轉(zhuǎn)導通路，并顯著增加了球形成效率(圖1E和圖8D)。K-Ras的敲低(非H-Ras的敲低)顯著降低了EGF刺激的球形成效率，并降低了起始球體的大小，這支持了K-Ras具有可能導致人胰腺癌細胞中的惡性腫瘤的獨特特性的觀點(圖1F和圖8E-F)。

我們接下來確定致癌K-Ras是否是維持人胰腺腫瘤細胞中的致瘤特性所需的。PANC2.13和PANC1細胞系含有不同的突變，并顯示出對K-Ras的不同依賴性。當通過shRNA敲低K-Ras時，兩種細胞系顯示出分化形態(tài)(圖8G)。已顯示細胞表面抗原CD44和CD24的表達與胰腺癌患者中的不良臨床診斷高度相關(guān)(Ohara等人，Cancer Sci 104:1127-1134,2013)。PANC2.13和PANC1細胞中致癌K-Ras的耗竭顯著降低了CD44和CD24的表達(圖9H-I)。K-Ras耗竭的PANC2.13細胞顯示出顯著降低的在體外形成具有重新鋪板潛能的球體的能力(圖1G和圖9J)，再次表明K-Ras在維持與惡性腫瘤相關(guān)的表型中的重要作用。

先前將PANC1描述為K-Ras非依賴性細胞系(Scholl等人，Cell 137:821-834,2009；Singh等人，Cancer Cell 15:489-500,2009；Wei等人，Cancer Lett 322:58-69,2012)。與這些報道一致，K-Ras的敲低減緩了細胞增殖，但并未影響PANC1細胞在2D中生長的活力(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，使用有限數(shù)目的移植細胞，我們發(fā)現(xiàn)當與對照PANC1細胞相比時，K-Ras的敲低顯著降低了腫瘤起始率(圖1H)。這些數(shù)據(jù)表明致癌K-Ras介導了人胰腺癌細胞系中的致瘤表型，該功能看上去與其在維持2D培養(yǎng)中的細胞活力和增殖中的作用不同。

K-Ras阻抑Frizzled 8和CaMKii的活性

接下來，我們旨在研究K-Ras比H-Ras更有效地促進致瘤性的背后機制，盡管具有相當水平的經(jīng)典Ras信號轉(zhuǎn)導。K-Ras4B而非N-Ras、H-Ras或K-Ras4A是基因工程化的動物模型的胚胎發(fā)育必不可少的(Johnson等，Genes Dev.11:2468-2481,1997；Koera等人，Oncogene 15:1151-1159,1997；Malumbres和Barbacid,Nat Rev Cancer 3:459-465,2003)。此外，K-Ras(4B)^V12而非H-Ras^V12或N-Ras^V12阻止了小鼠胚胎癌干細胞中視黃酸誘導的分化，同時維持它們的增殖和干細胞特性(Quinlan等人，Mol Cell Biol 28:2659-2674,2008)。因此，K-Ras4B在胚胎干細胞(ESC)中發(fā)揮重要且獨特的作用是可能的。使用聚焦信號轉(zhuǎn)導的PCR陣列(SABioscience,PAMM047A)來定性由H-Ras或K-Ras介導的干細胞相關(guān)基因(圖2A；下文表1和表2)。鑒定了三種小鼠干細胞信號轉(zhuǎn)導相關(guān)基因，所述基因的表達在H-Ras^V12-和K-Ras^V12-轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞之間具有大于四倍的變化(圖2B；下文表3)。1B型骨髓蛋白受體(bmpr1b)在K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的細胞中上調(diào)，而Gli2和Frizzled 8(Fzd8)在NIH/3T3-K-Ras^V12細胞中顯著下調(diào)。由于bmpr1b的低內(nèi)源表達水平，我們決定不研究bmpr1b，或者不研究Gli2，因為與小鼠相比時，Gli2的N端阻遏物結(jié)構(gòu)域在人類中是縮短的，這表明在這兩個物種中的不同作用(Sasaki等人，Development 126:3915-3924,1999)。

表1.用于H-Ras轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞的qPCR陣列的質(zhì)量控制

表2.用于K-Ras轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞的qPCR陣列的質(zhì)量控制

七次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體Frizzled 8(Fzd8)是參與調(diào)控Wnt/β-連環(huán)蛋白信號轉(zhuǎn)導通路的frizzled基因家族的成員。在10個frizzled家族成員中，F(xiàn)zd1、Fzd4和Fzd10已經(jīng)被鑒定為Wnt/β-連環(huán)蛋白通路的激活劑(Lhomond等人，Development 139:816-825,2012；Nagayama等人，Cancer Sci 100:405-412,2009)。最近，F(xiàn)zd8被報道為維持造血干細胞的靜止的非經(jīng)典Wnt/Ca²⁺信號轉(zhuǎn)導的主要調(diào)節(jié)物(Sugimura等人，Cell 150:351-365,2012)。需要激活CaMKii和轉(zhuǎn)錄因子NF-AT的非經(jīng)典Wnt/Ca²⁺通路抑制β-連環(huán)蛋白/TCF信號轉(zhuǎn)導(Saneyoshi等人，Nature 417:295-299,2002；Semenov等人，Cell 131:1378,2007；Sugimura和Li.,Birth Defects Res C Embryo Today 90:243-256,2010)。因此，我們確定致癌K-Ras轉(zhuǎn)化細胞中Fzd8的下調(diào)是否導致非經(jīng)典Wnt/Ca²⁺信號轉(zhuǎn)導的阻抑以及隨后β-連環(huán)蛋白/TCF活性的激活。

蛋白質(zhì)印跡分析證實與H-Ras^V12轉(zhuǎn)化的細胞和載體對照相比，F(xiàn)zd8在K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞中下調(diào)(圖2C)。K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的細胞也具有大幅降低的激活CaMKii的水平，如通過Thr286位的自我磷酸化降低所指示的(圖2C)。活性NF-AT的基因產(chǎn)物抑制蓬亂蛋白(disheveled)介導的GSK3β阻抑，這導致β-連環(huán)蛋白的磷酸化、胞質(zhì)積聚和降解(Saneyoshi等人，Nature 417:295-299,2002)。細胞分級分離分析顯示,與載體對照和NIH/3T3-H-Ras^V12細胞相比，NF-AT的激活和核異位在NIH/3T3-K-Ras^V12細胞中降低(圖2C)。蛋白質(zhì)印跡分析進一步表明，β-連環(huán)蛋白的磷酸化形式在這些細胞中降低(圖2C)。有趣的是，當與分離自致癌B-Raf誘導的mPDAC的腫瘤細胞相比時，分離自致癌K-Ras驅(qū)使的小鼠PDAC(mPDAC)的腫瘤細胞也顯示出降低的Fzd8表達和阻抑水平的磷酸化CaMKii(圖2C)。

CaMKii通路的激活還通過阻斷β-連環(huán)蛋白與TCF的相互作用，從而抑制β-連環(huán)蛋白依賴性轉(zhuǎn)錄而阻抑經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導(Semenov等人，Cell 131:1378,2007；Sugimura和Li.,Birth Defects Res C Embryo Today 90:243-256,2010)。共免疫沉淀指示，當與CaMKii活性升高的H-Ras^V12轉(zhuǎn)化的細胞相比時，CaMKii很少磷酸化的K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH3T3細胞顯示β-連環(huán)蛋白與TCF4之間的相互作用增加(圖2D)。此外，NIH/3T3-K-Ras^V12細胞中CaMKii和NF-AT激活的降低導致β-連環(huán)蛋白的核定位的增加，而在CaMKii和NF-AT高度激活的載體對照和NIH/3T3-H-Ras^V12細胞中，核β-連環(huán)蛋白幾乎檢測不到(圖2C)。與B-Raf^mt誘導的小鼠mPDAC相比，含有突變K-Ras的腫瘤細胞顯示出增加的β-連環(huán)蛋白-TCF4相互作用(圖2D)。TOPFlash分析進一步證實，當與載體和NIH/3T3-H-Ras^V12細胞相比時，β-連環(huán)蛋白的轉(zhuǎn)錄活性在NIH/3T3-K-Ras^V12細胞中極大升高(圖2E)。必然地，與載體對照或H-Ras^V12轉(zhuǎn)化的細胞相比，β-連環(huán)蛋白靶基因c-Myc和TCF1的mRNA表達在K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的細胞中上調(diào)(圖9A)。

突變/致癌Ras-驅(qū)使的信號轉(zhuǎn)導活性和致瘤性長期以來被認為不依賴于野生型Ras同種型。然而，有越來越多的證據(jù)表明致癌K-Ras的生物輸出受野生型Ras蛋白依賴的調(diào)節(jié)的影響(Grabocka等人，Cancer Cell 25:243-256,2014；Young等人，Cancer Discov 3:112-123,2013)。為了確定野生型Ras等位基因的存在是否影響明顯由致癌K-Ras介導的Fzd8-CaMKii信號轉(zhuǎn)導通路，我們在缺乏Ras蛋白的小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)中表達了N-Ras^V12、H-Ras^V12或K-Ras^V12(H‐Ras^-/-；N‐Ras^-/-和K‐Ras^lox/lox)(Drosten等人，EMBO J 29:1091-1104,2010)。如圖9B中所示，僅表達K-Ras(4B)^V12的“Rasless”MEF比僅表達H-Ras^V12的細胞顯示出更低的Fzd8和磷酸化CaMKii表達。有趣的是，體內(nèi)有限的移植分析表明，與Ras^-/-MEF-H-Ras^V12相比，Ras^-/-MEF-K-Ras(4B)^V12以較高頻率起始腫瘤形成(圖9C)。此外，源自Ras^-/-MEF-K-Ras(4B)^V12的腫瘤比由Ras^-/-MEF-H-Ras^V12起始的腫瘤顯示出顯著更高的生長速率(圖9D)。合起來，我們關(guān)于NIH\3T3和被拯救的Rasless細胞的數(shù)據(jù)表明，不管野生型Ras蛋白是否存在，K-Ras和H-Ras在致瘤性以及在經(jīng)非經(jīng)典Wnt/Ca²⁺信號轉(zhuǎn)導通路的信號轉(zhuǎn)導方面明確不同。

接下來，我們詢問非經(jīng)典的Wnt/Ca²⁺信號轉(zhuǎn)導在由H-Ras或K-Ras驅(qū)使的腫瘤中是否不同。為此，我們將來自野生型小鼠的腫瘤與來自基因工程化小鼠模型的腫瘤進行了比較，所述基因工程化小鼠模型缺乏內(nèi)源H-Ras但表達敲進內(nèi)源K-Ras基因座的野生型H-Ras。然后通過用DMBA/TPA局部處理誘導腫瘤發(fā)生以及K-Ras或H-Ras突變。該模型允許在相同的細胞背景下，對受相同內(nèi)源調(diào)控元件控制的K-Ras和H-Ras致癌基因進行等同比較(Potenza等人，EMBO Rep 6:432-437,2005；To等人，Nat Genet 40:1240-1244,2008)。有趣的是，當與具有K-Ras突變的皮膚腫瘤相比時，在該模型中的突變H-Ras驅(qū)使的皮膚腫瘤具有升高水平的Fzd8蛋白和增加水平的磷酸化CaMKii(圖2G)。該數(shù)據(jù)進一步表明，該獨特的K-Ras介導的信號轉(zhuǎn)導不能由H-Ras再現(xiàn)，即使當其被敲入K-Ras基因座。

盡管它們具有不同的下游效應物，活性經(jīng)典和非經(jīng)典的Wnt信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)通常由frizzled受體與Wnt配體的結(jié)合來調(diào)控。與其它WNT家族成員如優(yōu)選激活Wnt/β-連環(huán)蛋白/TCF信號轉(zhuǎn)導的WNT3a不同，WNT5a是典型的非經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導通路激活劑(Weekes和Winn,Cancers3:3676-3686,2011)。為了評估不同的WNT配體是否參與調(diào)節(jié)可辨別的致癌H-Ras和K-Ras的Wnt/Ca²⁺信號轉(zhuǎn)導活性，我們對WNT-5a和WNT-3a在Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH\3T3細胞中的表達水平和功能進行了進一步評估。如圖9E中所示，致癌Ras^V12轉(zhuǎn)化的細胞比對照細胞表達更多的WNT-3a和-5a蛋白，但是在H-Ras^V12和K-Ras^V12之間的表達水平不存在明顯差異。此外，WNT配體的額外存在不改變H-Ras^V12或K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的細胞中的CaMKii活性、β-連環(huán)蛋白/TCF/LEF轉(zhuǎn)錄活性以及球形成效率(圖9F-H)。數(shù)據(jù)表明H-Ras和K-Ras在非經(jīng)典的Wnt/Ca²⁺信號轉(zhuǎn)導方面的顯著差異不依賴于WNT配體的存在。

由于致癌K-Ras導致NIH/3T3細胞中Fzd8表達的阻抑和CaMKii磷酸化的降低，我們接下來在癌來源細胞系中確定致癌K-Ras的敲低對Fzd8的影響。在人胰腺癌細胞中，K-Ras敲低增加了胰腺癌細胞系中Fzd8的表達并增加了CaMKii的磷酸化(圖2H)。如TOPFlash分析所評估的，當K-Ras表達被敲低時，PANC2.13細胞顯示出顯著降低的β-連環(huán)蛋白活性(圖2I)?；谝陨辖Y(jié)果，我們得出結(jié)論，在小鼠和人癌細胞中，致癌K-Ras而非H-Ras阻抑Fzd8的表達和CaMKii的活性，其為Wnt/Ca²⁺通路的主要效應物。

在此，我們報道了在K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的細胞以及在含有致癌K-Ras的胰腺癌細胞中，經(jīng)典Wnt/β-連環(huán)蛋白信號轉(zhuǎn)導通路的活性受Fzd8介導的非經(jīng)典Wnt/Ca²⁺通路調(diào)控。然而，參與經(jīng)典Wnt/β-連環(huán)蛋白活性的基因的突變發(fā)生于許多類型的癌癥中。在結(jié)腸直腸癌中，其中K-Ras突變發(fā)生于約50％的病例中，Wnt/β-連環(huán)蛋白信號轉(zhuǎn)導通路中的突變作為主要起始驅(qū)使子通常通過使APC(腺瘤性結(jié)腸息肉病)基因失活的突變發(fā)揮作用。因此，我們旨在研究APC損失/突變是否使得與K-Ras相關(guān)的惡性腫瘤特征與結(jié)腸直腸癌細胞中的Fzd8下調(diào)和干細胞特性無關(guān)。在多種結(jié)腸癌細胞系中，與野生型或突變的APC的狀態(tài)無關(guān)，K-Ras的敲低促進了Fzd8的表達和NF-AT或CaMKii的激活(圖10A)。如從我們的模型中所預期的，在表達野生型β-連環(huán)蛋白的SW480(突變的APC)中，K-Ras的敲低顯著阻抑了β-連環(huán)蛋白/TCF/LEF的轉(zhuǎn)錄活性，而在具有β-連環(huán)蛋白功能突變的HCT15(突變的APC)或HCT116(野生型APC)中沒有(圖10B)。盡管通過shRNA阻抑K-Ras的表達不影響HCT15和HCT116細胞中的β-連環(huán)蛋白/TCF/LEF轉(zhuǎn)錄活性，但是其仍然抑制3D培養(yǎng)中它們的球體形成能力(圖10C)。然而，在HCT15和HCT116中，當K-Ras敲低時，通過BrdU的摻入所指示的細胞增殖率未被抑制(圖10D)。該結(jié)果導致了有趣的問題：K-Ras介導的惡性腫瘤是否獨立于經(jīng)典Wnt/β-連環(huán)蛋白/TCF/LEF的轉(zhuǎn)錄活性？

為了解決該問題，我們用一系列端錨聚合酶抑制劑JW55、JW67和心肌原1(cardionogen 1)對致癌H-Ras^V12或K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞進行了處理。JW55和JW67的功能是通過直接降解β-連環(huán)蛋白作為經(jīng)典Wnt/β-連環(huán)蛋白信號轉(zhuǎn)導通路的強效抑制劑，以及心肌原1抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白/TCF/LEF的轉(zhuǎn)錄活性。TOPFlash分析顯示，在Ras^V12轉(zhuǎn)化的細胞中，端錨聚合酶抑制劑成功阻抑了β-連環(huán)蛋白/TCF/LEF的轉(zhuǎn)錄活性(圖10E)。然而，阻抑的β-連環(huán)蛋白的功能未相應地影響其在3D培養(yǎng)中的生長：在JW55、JW67或心肌原1存在的情況下，K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的細胞仍維持其球形成效率，而這些化合物抑制載體對照或H-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3的球體形成(圖10F)。數(shù)據(jù)指示，盡管我們將β-連環(huán)蛋白/TCF/LEF轉(zhuǎn)錄活性的變化用作含有野生型β-連環(huán)蛋白的細胞中的非經(jīng)典Wnt/Ca²⁺信號轉(zhuǎn)導活性的讀出的事實，但是K-Ras驅(qū)使的惡性腫瘤獨立于Wnt/β-連環(huán)蛋白信號轉(zhuǎn)導通路的功能。

CaMKii的抑制增強了H-Ras^V12細胞的球體形成

為了確定K-Ras轉(zhuǎn)化的細胞中觀察到的Wnt/Ca²⁺信號轉(zhuǎn)導通路的抑制是否是獲得干細胞樣特性的原因，我們用選擇性CaMKii抑制劑KN-93對NIH/3T3-H-Ras^V12和載體對照細胞進行了處理(圖3A)。該處理降低了CaMKii的磷酸化(圖3B)。明顯地，KN-93也降低了NIH/3T3-H-Ras^V12細胞中Fzd8的表達(圖3B)并增加了β-連環(huán)蛋白的轉(zhuǎn)錄活性，這證實了Wnt/Ca²⁺/CaMKii信號轉(zhuǎn)導對經(jīng)典Wnt通路的抑制作用(圖3C)。此外，KN-93的處理顯著提高了NIH/3T3-H-Ras^V12細胞的球形成效率和類球體集落的大小(圖3D)，這表明CaMKii活性的下調(diào)是誘導K-Ras轉(zhuǎn)化的細胞中觀察到的惡性腫瘤特征所必需的。

Fzd8的敲低誘導H-Ras^V12細胞中的致瘤性

為了進一步確定Fzd8在Wnt/Ca²⁺信號轉(zhuǎn)導中的作用，我們用shRNA敲低了NIH/3T3-H-Ras^V12細胞中的Fzd8(圖3A&E)。我們觀察到降低的磷酸化CaMKii水平以及增加的β-連環(huán)蛋白活性(圖3E-F)。當在NIH/3T3-H-Ras^V12細胞中敲低Fzd8時，具有重新鋪板能力的球體的體外形成也增強(圖3G)。重要的是，在有限的移植分析中，當與表達Fzd8的親本對照細胞相比時，皮下注射50個NIH/3T3-H-Ras^V12shFzd8細胞的小鼠顯示出顯著降低的無瘤生存率(圖3H)。因此，F(xiàn)zd8表達的抑制以及隨后Wnt/Ca²⁺通路的阻抑增強了H-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞中的腫瘤起始，表型模擬了致癌K-Ras的作用。

Fzd8在K-Ras驅(qū)使的癌癥中的作用

接下來，我們測試了Fzd8的下調(diào)是否是NIH/3T3-K-Ras^V12細胞起始腫瘤形成所需的。NIH/3T3-K-Ras^V12細胞中Fzd8表達的恢復提高了磷酸化CaMKii的水平，降低了細胞生長，并降低了β-連環(huán)蛋白的活性(圖4A-B)。此外，F(xiàn)zd8的恢復顯著降低了NIH/3T3-K-Ras^V12細胞在體外的球形成效率，以及其連續(xù)傳代之后的再現(xiàn)能力(圖4C)。在皮下注射了50個NIH3T3-K-Ras^V12細胞的裸鼠中，F(xiàn)zd8的過表達完全廢除了腫瘤形成，而對照細胞仍維持體內(nèi)的高腫瘤起始率(9/10)(圖4D)。

有趣的是，在NIH3T3-K-Ras^V12細胞中，外源添加的WNT3a或WNT5a配體未影響增加的磷酸化CaMKii，以及由Fzd8的過表達引起的β-連環(huán)蛋白的活性的抑制(圖11A-B)。這些數(shù)據(jù)表明，由Fzd8過表達導致的K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的細胞中改變的Wnt/Ca²⁺信號轉(zhuǎn)導通路和β-連環(huán)蛋白活性不能通過經(jīng)典或非經(jīng)典的Wnt通路配體來拯救。

當Fzd8在K-Ras依賴的人胰腺癌PANC2.13細胞中過表達時，我們觀察到磷酸化CaMKii水平的增加，伴隨著CD44和CD24表達的同時降低(圖11C)。當與對照細胞相比時，F(xiàn)zd8過表達的PANC2.13細胞顯示出多種β-連環(huán)蛋白靶向基因(包括CCND-1、LEF1和c-Myc)的顯著下調(diào)，這與阻抑的β-連環(huán)蛋白/TCF轉(zhuǎn)錄活性一致(圖11D)。PANC1細胞中Fzd8的過表達導致NF-AT轉(zhuǎn)錄活性升高、β-連環(huán)蛋白活性降低，如通過熒光素酶報告子分析所評估的，以及CD44和CD24的表達減少(圖4E和圖11E)。有趣的是，在這些胰腺癌系中Fzd8的過表達誘導了分化樣的形態(tài)學變化，表型模擬了K-Ras敲低時所觀察到的那些(圖11F)。此外，當與對照組相比時，皮下異種移植過表達Fzd8的PANC1的裸鼠在注射后至多90天具有增加的無瘤生存率(圖4F)。該結(jié)果確立，恢復Fzd8的表達(增強Wnt/Ca²⁺信號轉(zhuǎn)導并抑制經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導)降低了K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的細胞或者具有致癌K-Ras的胰腺腫瘤細胞的腫瘤形成。

人Fzd8通常在腦、心臟、腎臟、骨骼肌中以及在胰腺中表達(Saitoh等人，Int J Oncol 18:991-996,2001)。然而，尚未研究胰腺腫瘤起始和進展期間Fzd8的表達模型。四種不同的人胰腺組織陣列(BioMax、PAN241、PA242a、PA483b和T143)的免疫組織化學顯示，盡管Fzd8的表達在正常的胰腺腺泡和胰島細胞中是豐富的，但是其在惡性胰腺組織中的表達通常是損失的(圖4G和圖11G)。有趣的是，組織陣列T143、B1、B2、B5和B6顯示，F(xiàn)zd8在胰島細胞腫瘤中的表達無明顯降低，所述胰島細胞腫瘤大部分是良性的，并且其中K-Ras很少突變(圖11G)。此外，F(xiàn)zd8的表達在I期胰腺腺癌中被強烈阻抑(圖4G)，這表明Fzd8表達的抑制發(fā)生在胰腺癌變的早期階段，其中K-Ras的致癌激活很可能已經(jīng)發(fā)生。H評分進一步提供了指示當與正常組織相比時Fzd8在人惡性胰腺樣本中明顯被阻抑的半定量分析(圖4H)。

為了進一步證實在人胰腺組織中Fzd8的表達，我們使用了RNAscope，其為新型RNA原位雜交方法。通過使用新的探針設(shè)計策略和基于雜交的信號放大系統(tǒng)同時放大信號并抑制背景，實現(xiàn)了個體細胞中的單分子可視化(Wang等人，J.Mol Diagn 14:22-29,2012)。如圖4I中所示，正常胰腺組織和癌鄰近的正常組織與人Fzd8特異性探針雜交(Advanced Cell Diagnostics)，而惡性胰腺組織在RNAcope原位雜交分析中未顯示檢測到Fzd8的表達。此外，允許我們通過多個公開的微陣列數(shù)據(jù)集研究人Fzd8在RNA水平的表達水平的Oncomine在線軟件(Life Technologies)表明，F(xiàn)zd8不僅在人胰腺導管腺癌中顯著下調(diào)，而且在多種類型的人類癌癥(包括乳腺癌、膠質(zhì)母細胞瘤和結(jié)腸癌)中顯著下調(diào)(參見，例如圖11H)。

通過K-Ras-CaM相互作用調(diào)節(jié)的Wnt/Ca2+信號轉(zhuǎn)導

鈣調(diào)蛋白(CaM)是通過直接結(jié)合來激活CaMKii的鈣結(jié)合信使蛋白，其優(yōu)先與GTP結(jié)合的K-Ras4B結(jié)合，而不與H-Ras4A、N-Ras4A或K-Ras4A優(yōu)先結(jié)合(Klee和Vanaman,Adv Protein Chem 35:213-321,1982；Schulman,Curr Opin Cell Biol 5:247-253,1993；Villalonga等人，Mol Cell Biol 21:7345-7354,2001)。該結(jié)合可以改變CaM的亞細胞定位，并因此減少可用于激活CaMKii以及隨后激活非經(jīng)典的Wnt/Ca²⁺信號轉(zhuǎn)導通路的CaM庫。因此，我們旨在確定K-Ras與CaM之間的相互作用是否是通過K-Ras下調(diào)Wnt/Ca²⁺信號轉(zhuǎn)導的原因。

我們首先證實K-Ras^V12(而非H-Ras^V12)與CaM結(jié)合，并且以鈣依賴的方式結(jié)合(圖5A)。K-Ras的高變區(qū)是其與CaM的相互作用所需的，并且K-Ras 4B Ser181的磷酸化廢除了該相互作用(Lopez-Alcala等人，J Biol Chem 283:10621-10631,2008；Villalonga等人，Mol Cell Biol 21:7345-7354,2001)。我們構(gòu)建了編碼模擬磷酸化的突變體(S181D)或者不能經(jīng)受磷酸化的突變形式的K-Ras^V12(S181A)的逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體，然后將這些突變體引入NIH/3T3細胞內(nèi)(圖12A)。在NIH/3T3細胞中，K-Ras^V12-S181D不能與CaM免疫共沉淀，而在類似條件下，野生型和S181A突變體維持與CaM的相互作用(圖5B)。K-Ras^V12突變體S181D和S181A仍是法尼基化的，其被正確轉(zhuǎn)運至質(zhì)膜，并且當與K-Ras^V12相比時，不導致NIH/3T3細胞中的形態(tài)學差異(圖12B，并且數(shù)據(jù)未顯示)。與K-Ras^V12-轉(zhuǎn)化或K-Ras^V12-S181A轉(zhuǎn)化的細胞相比，K-Ras-CaM相互作用廢除且磷酸化CaMKii水平增加的表達K-Ras^V12-S181D的NIH/3T3細胞在Fzd8啟動子活性以及Fzd8的mRNA和蛋白水平的表達方面均顯著增加(圖5C-E)。有趣的是，盡管它們顯示出相當?shù)腒-Ras蛋白表達水平和磷酸化Erk水平，但是當與K-Ras^V12-轉(zhuǎn)化或K-Ras^V12-S181A轉(zhuǎn)化的細胞相比時，K-Ras^V12-S181D感染的NIH/3T3細胞顯示出升高水平的活性CaMKii(圖5E)。表達K-Ras^V12-S181D的細胞還顯示出增加的NF-AT轉(zhuǎn)錄活性和β-連環(huán)蛋白轉(zhuǎn)錄活性的阻抑，NF-AT是Wnt/Ca²⁺信號轉(zhuǎn)導通路的另一主要下游調(diào)節(jié)物(圖5F)。這些數(shù)據(jù)顯示，K-Ras通過與鈣調(diào)蛋白的特異性相互作用調(diào)控Fzd8介導的非經(jīng)典Wnt/Ca²⁺信號轉(zhuǎn)導以及隨后經(jīng)典的Wnt信號轉(zhuǎn)導(圖5G)。相比之下，致癌H-Ras轉(zhuǎn)化的腫瘤細胞含有足以激活CaMKii的CaM，導致Wnt/Ca²⁺信號轉(zhuǎn)導的激活和Wnt/β-連環(huán)蛋白信號轉(zhuǎn)導通路的抑制(圖5G)。與H-Ras一樣，N-Ras不能與CaM結(jié)合(圖12C)。因此，N-Ras轉(zhuǎn)化的細胞與H-Ras轉(zhuǎn)化的細胞類似，包括CaMKii的磷酸化、Fzd8的表達升高以及β-連環(huán)蛋白/TCF/LEF轉(zhuǎn)錄活性降低(圖12D-F)。

綜合考慮，這些數(shù)據(jù)表明通過刺激S181的磷酸化破壞K-Ras與CaM之間的相互作用可能是抑制致癌K-Ras驅(qū)使的惡性腫瘤的有吸引力的方法。

通過prostratin對K-Ras進行的磷酸化損害了(compromise)K-Ras與CaM的結(jié)合以及致瘤性

已知蛋白激酶C(PKC)通過多元區(qū)內(nèi)S181的磷酸化調(diào)控K-Ras(Bivona等人，Mol Cell 21:481-483,2006)。雖然作為PKC激活劑的典型的佛波酯(如佛波醇-12-十四酸酯-13-乙酸酯(PMA))顯示是腫瘤促進性的，但是非典型的PKC激活劑prostratin(12-脫氧佛波醇-13-乙酸酯)對腫瘤促進的效力小得多(Szallasi等人，Nat Genet 40:1240-1244,1993；Zayed等人，Planta Med 50:65-69,1984)。Prostratin最近被建議為治療AIDS的新型治療劑，因為其重新激活含有潛伏的原病毒的記憶型CD4+T細胞中的HIV-1，同時下調(diào)CD4受體，防止新的HIV感染。(Hezareh,Drug News Prespect 18:496-500,2005；Williams等人，J Biol Chem 279:42008-42017,2004；Witvrouw等人，Antivir Chem Chemother 14:321-328,2003)。在此，我們確定該非腫瘤促進性的PKC激活劑是否能夠被重定為減少K-Ras介導的惡性腫瘤的新型藥劑。

Prostratin以劑量依賴的形式激活PKC(圖13A)，其廢除了Ras^V12轉(zhuǎn)化的細胞以及多種人胰腺癌細胞系中K-Ras與CaM之間的內(nèi)源性相互作用(圖5H)。隨后，細胞在對prostratin的應答中顯示出顯著升高水平的磷酸化CaMKii(圖5H-I)。此外，在人胰腺癌細胞中，用prostratin進行的處理增加了Fzd8的表達并降低了β-連環(huán)蛋白靶基因LEF1的表達，這進一步表明通過prostratin激活PKC改變了由致癌性K-Ras介導的下游Wnt/Ca²⁺信號轉(zhuǎn)導的活性(圖13B)。值得注意的是，用prostratin進行的處理未改變被H-Ras^V12或K-Ras^V12-S181D轉(zhuǎn)化的細胞中CaMKii的活性，所述H-Ras^V12或K-Ras^V12-S181D無CaM結(jié)合能力(圖5I)。此外，K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞而非H-Ras^V12或K-Ras^V12-S181D轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞對于prostratin是敏感的，并且顯示顯著降低的細胞活力(圖5J)。此外，我們展示了，在拯救的“Rasless”MEF中，H-Ras^V12和K-Ras^V12有差異地介導Fzd8的表達以及隨后Wnt/Ca2+信號轉(zhuǎn)導。同樣地，當用prostratin處理時，用K-Ras(4B)^V12拯救的MEF顯示出增加的磷酸化CaMKii和降低的細胞活力，而用H-Ras^V12拯救的Rasless MEF顯示對prostratin的最小應答(圖13C)。這些顯著的體外應答導致詢問prostratin是否能夠作為治療K-Ras驅(qū)使的惡性腫瘤的新型藥劑？

有趣的是，口服或者腹腔內(nèi)施用的prostratin顯著抑制了K-Ras^V12轉(zhuǎn)化的細胞的致瘤性，其中無全身毒性的證據(jù)(圖13D)。當與用介質(zhì)對照處理的那些相比時，在prostratin存在的情況下，來源于K-RasV12-NIH/3T3細胞的單一皮下腫瘤小的多，并且磷酸化CaMKii大大增加(圖13D-E)。

Prostratin抑制人胰腺癌的腫瘤起始和生長

在針對prostratin處理的應答中，具有不同的突變K-Ras同種型的人胰腺癌細胞系顯示細胞形態(tài)的變化，其表型模擬了因K-Ras敲低或Fzd8過表達觀察到的那些(圖14A，左圖)。此外，prostratin的處理顯著降低了人胰腺癌細胞的細胞活力和增殖率(圖14A，右圖)。

為了測試prostratin對K-Ras驅(qū)使的人胰腺癌的體內(nèi)抗癌影響，我們首先研究了prostratin是否能夠阻止異種移植模型中的胰腺腫瘤形成。如圖6A所示，當與介質(zhì)處理組相比時，prostratin顯著降低了在皮下部位建立的異種移植胰腺腫瘤中腫瘤形成的頻率。此外，在prostratin存在的情況下建立的腫瘤的平均大小比對照組中的腫瘤小得多(圖6B)。用熒光素酶標記胰腺腫瘤細胞，以更準確地檢測腫瘤形成。生物發(fā)光成像(BLI)確認，用prostratin進行的處理大大抑制了腫瘤起始和腫瘤大小(圖6C)。此外，當與對照組中的腫瘤相比時，用prostratin處理的異種移植胰腺腫瘤在治療期間顯示顯著降低的腫瘤生長率，以及降低的Ki67表達(圖6D)。

除了測試對皮下腫瘤的預防效果，我們評估了prostratin在具有突變K-Ras的人胰腺癌細胞的原位模型中的抗癌效果?；贓LISA的PKC活性分析揭示，為了將prostratin有效遞送至胰腺，相對于腹腔內(nèi)途徑，優(yōu)選口服途徑(圖13F)。與對照處理的小鼠相比，每天接受口服prostratin處理的免疫妥協(xié)NOD-SCID小鼠在原位部位具有較低的腫瘤負荷：BLI分析揭示，當與對照相比時，prostratin顯著降低了動物中原位腫瘤的大小(圖6E和圖14B)。此外，用prostratin進行的處理降低了原位胰腺癌模型中至腹膜的轉(zhuǎn)移(圖6E和圖14C)。如圖6F和圖14B所示，H&E染色揭示，大部分prostratin處理的小鼠在胰腺中未顯示原發(fā)腫瘤的形成，而對照組的小鼠具有明顯的原位腫瘤，并且?guī)缀鯔z測不到正常的胰腺組織。此外，當與對照腫瘤相比時，prostratin處理組中的原位腫瘤表達少得多的Ki67(圖6G和圖14B)。綜合考慮，我們的數(shù)據(jù)表明，prostratin顯著降低了異種移植模型中人胰腺癌的腫瘤起始頻率。

接下來，我們測試了prostratin對建立的人胰腺異種移植腫瘤的抗腫瘤效果。將人胰腺癌細胞皮下或者原位植入免疫妥協(xié)小鼠中。在注射后約10至14天開始每天的口服prostratin處理，這取決于實驗細胞系和模型(圖7A)。有趣的是，當與介質(zhì)處理的腫瘤相比時，prostratin顯示對人胰腺皮下腫瘤的抗腫瘤活性，這由顯著降低的生長率確定(圖7A)。此外，prostratin處理的皮下腫瘤顯示出切割的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3的表達增強(圖14D)，這表明其對建立的腫瘤發(fā)揮細胞毒性作用。

在癌癥患者的血流中發(fā)現(xiàn)升高水平的無細胞DNA(cfDNA)，并且其濃度顯示與有效治療或者腫瘤復發(fā)之后的原發(fā)腫瘤大小的近乎完全的相關(guān)性(Anker等人，Cancer Metastasis Reviews 18:65-73,1999；Sozzi等人，J.Clin Oncol 21:3902-3908,2003)。因此，對血漿cfDNA的絕對水平的定量可能是診斷或監(jiān)測某些類型的癌癥的有效工具，所述癌癥包括胰腺惡性腫瘤(Sikora等人，The International Journal of Biological Markers 30,e136-141,2015)。在此，我們應用Taqman探針特異性檢測已原位植入人胰腺癌細胞的小鼠中的人cfDNA(Cheng等人，Cancer Sci 100:303-309,2009)(圖7B)。在腫瘤移植后第14天，人cfDNA的水平增加超過本底水平6倍以上，這時開始prostratin處理。在prostratin處理的動物中，人特異性cfDNA的濃度隨時間顯著降低，而在介質(zhì)處理組中，人特異性cfDNA的濃度顯示陽性動態(tài)變化(圖7B)。這些數(shù)據(jù)證明，prostratin顯著降低了原位異種移植模型中人胰腺癌的負荷。

綜合考慮，我們的數(shù)據(jù)表明，PKC的非典型激活劑prostratin能夠有效降低K-Ras與CaM的相互作用，從新接通Wnt/Ca2+信號轉(zhuǎn)導，并抑制胰腺癌中致癌K-Ras介導的惡性腫瘤。

Prostratin特異性抑制K-Ras^G12V誘導的乳頭狀瘤

我們進一步研究了prostratin對基因工程化小鼠模型(GEMM)中致癌Ras誘導的腫瘤的影響。我們首先使用由受皮膚干細胞啟動子Lrig1控制的H-Ras^G12V或K-Ras^G12V驅(qū)使的乳頭狀瘤模型(圖7C)(Jaks等人，Exp Cell Res 316:1422-1428,2010；Page等人，Cell Stem Cell 13,471-482,2013)。在該GEMM中，他莫昔芬誘導的Cre重組酶起始致癌H-Ras^G12V或K-Ras^G12V的表達，并且強制的致癌Ras的表達破壞了傷口愈合期間的皮膚穩(wěn)態(tài)，并進一步誘導了乳頭狀瘤的形成(圖7C)。

每天的prostratin處理顯著延遲/降低了由K-Ras^G12V驅(qū)使的乳頭狀瘤的形成，而其顯示對H-Ras^G12V誘導的腫瘤的起始無作用(圖7D)。應當注意，在相同的遺傳背景下，與致癌H-Ras相比，致癌K-Ras以高得多的頻率驅(qū)使皮膚腫瘤的起始，并且來自GEMM的結(jié)果與在植入Ras^V12轉(zhuǎn)化的MEF的異種移植模型中觀察到的結(jié)果一致。

上皮組織(如表皮)的眾所周知的特征是多種干細胞群的共存。Lrig1是與上部毛囊皮脂腺單元中的干細胞相關(guān)的多種標志物之一(Jaks等人，2010；Jensen等人，Nat Protoc 5:898-911,2010)。在表皮中，這些Lrig1⁺細胞能夠有助于皮膚重構(gòu)分析(skin-reconstitution assay)中的所有表皮譜系(Jensen等人，2010)。在此，我們顯示，在相同的Lrig1啟動子下，與H-Ras^G12V相比，K-Ras^G12V以高得多的速率起始皮膚腫瘤，這進一步支持了致癌K-Ras而非H-Ras對癌癥干細胞或者腫瘤起始細胞的功能性作用。此外，prostratin不僅降低腫瘤起始頻率，而且顯著減緩K-Ras^G12V誘導的乳頭狀瘤的生長率(圖14E)。有趣的是，對照組中的K-Ras^G12V驅(qū)使的皮膚腫瘤顯示出上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)型(EMT)特性，包括E-鈣粘蛋白的表達降低和波形蛋白的表達增加，而prostratin處理的腫瘤維持上皮標志物的強表達(圖7E)。這些數(shù)據(jù)表明，在該GEMM中，prostratin可以選擇性抑制由致癌K-Ras驅(qū)使的乳頭狀瘤的形成和發(fā)展。

總之，我們的結(jié)果指示，在免疫活性小鼠(immunocompetent mice)中，prostratin選擇性抑制由致瘤K-Ras導致的皮膚腫瘤的形成。綜合異種移植模型中的數(shù)據(jù)，我們表明prostratin可以是針對致癌K-Ras驅(qū)使的癌癥具有選擇性活性的新型有效藥物。

討論

歷史上，突變的H-Ras、N-Ras和K-Ras癌基因的高度序列同源性，結(jié)合其轉(zhuǎn)化培養(yǎng)中的細胞并激活常見的細胞信號轉(zhuǎn)導通路的類似能力，支持下述觀點：這三種Ras基因產(chǎn)物在功能上是冗余的。在本文，我們報道了H-Ras和K-Ras的不同在于其誘導腫瘤起始的能力，并且所述不同與K-Ras抑制Fzd8介導的非經(jīng)典Wnt/Ca²⁺信號轉(zhuǎn)導通路的能力直接相關(guān)。

由負調(diào)節(jié)因子APC的功能喪失突變和/或β-連環(huán)蛋白的功能獲得突變驅(qū)使的經(jīng)典Wnt/β-連環(huán)蛋白信號轉(zhuǎn)導通路的組成型激活與數(shù)種類型的腫瘤(最顯著的是結(jié)腸癌)的起始直接相關(guān)。然而，經(jīng)典的β-連環(huán)蛋白調(diào)控蛋白的此種遺傳損傷在人胰腺癌中極少發(fā)生(Abraham等人，Am J Pathol 160:1361-1369,2002；Gerdes等人，Digestion 60:544-548,1999；Seymour等人，Cancer Res 54:2761-2764,1994)，這表明用于激活PDAC中的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號轉(zhuǎn)導通路的替代路徑。在突變K-Ras的背景下，通過siRNA耗竭β-連環(huán)蛋白的表達降低了增殖，并促進小鼠胰腺癌的細胞凋亡(Pasca di Magliano等人，PLoS One 2:e1155,2007)。此外，β-連環(huán)蛋白的水平與PanIN分級和侵略性PDAC的發(fā)展正相關(guān)(Al-Aynati等人，Clin Cancer Res 10:1235-1240,2004；Pasca di Magliano等人，2007；Wang等人，Cancer Cell 15:207-219,2009)，指示W(wǎng)nt/β-連環(huán)蛋白信號轉(zhuǎn)導對PDAC維持的潛在貢獻。然而，在腺泡和內(nèi)分泌細胞中表達β-連環(huán)蛋白的激活突變的小鼠顯示增加的核β-連環(huán)蛋白的年齡依賴性積聚以及Wnt/β-連環(huán)蛋白-靶基因的表達，并最后未能發(fā)展為胰腺腫瘤(Strom等人，Development 134:2719-2725,2007)。綜合Cre誘導的β-連環(huán)蛋白的穩(wěn)定/激活不能與K-Ras協(xié)同驅(qū)使轉(zhuǎn)基因小鼠中的胰腺上皮內(nèi)損傷(PanIN)或者PDAC的證據(jù)(Heiser等人，Gastroenterology 135:1288-1300,2008)，看起來Wnt/β-連環(huán)蛋白信號轉(zhuǎn)導通路不足以起始PDAC。在此，我們報道了，在體外通過端錨聚合酶抑制劑抑制β-連環(huán)蛋白活性未顯示對K-Ras介導的惡性腫瘤的任何負效應(圖10)。此外，在結(jié)腸癌細胞系中通過shRNA阻抑致癌K-Ras的表達顯著抑制了其在“類器官”培養(yǎng)中的生長，與突變的或野生型APC的存在無關(guān)(圖10)。綜合考慮，我們推斷：致癌K-Ras強于H-Ras的腫瘤起始能力不僅僅是由于經(jīng)典Wnt/β-連環(huán)蛋白信號轉(zhuǎn)導的增強。盡管非經(jīng)典的Wnt/Ca²⁺信號轉(zhuǎn)導通路在致癌Ras介導的腫瘤起始中發(fā)揮重要作用，但是經(jīng)典的β-連環(huán)蛋白信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)不是通過其來調(diào)節(jié)致癌K-Ras驅(qū)使的腫瘤的惡性特征的唯一下游路徑。因此，需要鑒定Fzd8介導的非經(jīng)典Wnt/Ca²⁺信號轉(zhuǎn)導的其它潛在下游通路。

非經(jīng)典Wnt/Ca²⁺信號轉(zhuǎn)導通路的主要調(diào)節(jié)物是鈣調(diào)蛋白依賴性激酶II(CaMKii)。CaMKii由其與鈣調(diào)蛋白的結(jié)合來調(diào)控(Bachs等人，Cell Calcium 16:289-296,1994；Klee和Vanaman,Adv Protein Chem 35:213-321,1982；Stewart等人，F(xiàn)EBS Lett 137:80-84,1982)。有趣的是，發(fā)現(xiàn)鈣調(diào)蛋白排他性結(jié)合K-Ras4B，而不結(jié)合其它N-、H-或K-Ras4A，并且具有鈣調(diào)蛋白的CaMKii結(jié)合結(jié)構(gòu)域的序列的肽能夠封阻該特異性相互作用(Villalonga等人，Mol Cell Biol 21:7345-7354,2001)。我們的研究證實，K-Ras^V12而非H-Ras^V12能夠以Ca²⁺依賴性方式與鈣調(diào)蛋白結(jié)合。雖然致癌K-Ras與鈣調(diào)蛋白組成型結(jié)合，但是野生型K-Ras蛋白僅在當其被激活時才能與鈣調(diào)蛋白結(jié)合，例如在BxPC3細胞中通過EGF激活。此外，K-Ras與鈣調(diào)蛋白的結(jié)合通過高變區(qū)中Ser181的磷酸化而減弱，而模擬K-Ras的Ser181磷酸化形式的K-Ras^V12變體(S181D)不與鈣調(diào)蛋白結(jié)合。K-Ras^V12S181D變體喪失抑制CaMKii活性和Fzd8表達的能力，表明K-Ras與鈣調(diào)蛋白之間的相互作用是K-Ras抑制Fzd8介導的非經(jīng)典Wnt/Ca²⁺信號轉(zhuǎn)導的重要途徑，所述相互作用是同種型特異性的、GTP依賴性的且被高度調(diào)控。因此，封阻K-Ras與鈣調(diào)蛋白之間的該特異性相互作用可以提供選擇性地靶向K-Ras的新方法。

在本文中，我們報道了通過prostratin激活PKC導致K-Ras-CaM相互作用的解離，激活非經(jīng)典的Wnt/Ca²⁺信號轉(zhuǎn)導，并抑制致癌K-Ras介導的惡性腫瘤。我們的發(fā)現(xiàn)導致了下述未解決的問題：雖然PKC同功酶通過佛波酯的激活長期被認為促進腫瘤發(fā)生，但是是什么引起通過prostratin和其它典型的激活劑如PMA導致的PKC激活之間的差異？

蛋白激酶C(PKC)涉及腫瘤發(fā)生已超過30年，因為它首先被表征為促進腫瘤的佛波酯的受體(Castagna等人，J.Biol Chem 257:7847-7851,1982)。然而，近期的研究將PKC表征為相關(guān)的同種型家族，分為常規(guī)的(α、βI、βII和γ)、新型的(δ、ε、η和θ)以及非典型的(ζ、λ/τ)(Basu和Pal,Scientific World Journal 10:2272-2284,2010)，并且所述PKC同功酶可以顯示出重疊的以及相對的功能(Steinberg,Physiol Rev 88:1341-1378,2008)。例如，PKCδ被認為作為腫瘤抑制子發(fā)揮功能，因為PKCδ的下調(diào)而非激活與腫瘤促進相關(guān)(Lu等人，Mol Cell Biol 17:3418-3428,1997)。出人意料地，近期的研究揭示，PKC亞型中的大部分癌癥相關(guān)的突變是功能喪失的(LOF)(Antal等人，Cell 160:489-502,2015)。通過CRISPR介導的基因組編輯進行的PKCβ的LOF突變的修正抑制患者來源的結(jié)腸癌細胞的體外和體內(nèi)惡性腫瘤(Antal等人，2015)。更重要的是，存在于PKC同功酶中的數(shù)種突變是顯性陰性的，其功能為抑制整體的PKC信號轉(zhuǎn)導輸出(Antal等人，2015)。這建立了新的假說：PKC同功酶的功能通常是作為腫瘤抑制子，因此抗癌療法應當關(guān)注恢復PKC活性而非抑制PKC活性。該提議也已被Bivona及其同事證明(Bivona等人，Mol Cell 21:481-493,2006)，基于它們的下述觀察：PKC介導的K-Ras絲氨酸-181的磷酸化影響K-Ras的活性。有趣的是，已經(jīng)顯示PMA和prostratin在其對PKCα和PKCδ的生物活性(激活vs.亞細胞轉(zhuǎn)位)方面實質(zhì)性不同(Marquez等人，Biochem Pharmacol 75:1370-1380,2008)，這可能解釋了它們在腫瘤促進方面的不同特性。

總之，K-Ras通過與鈣調(diào)蛋白的直接結(jié)合，導致CaMKii活性降低并下調(diào)Fzd8表達，從而抑制Wnt/Ca²⁺信號轉(zhuǎn)導通路。Fzd8表達通過K-Ras的下調(diào)導致Wnt/Ca²⁺信號轉(zhuǎn)導的持續(xù)阻抑，這繼而引起經(jīng)典的Wnt信號轉(zhuǎn)導和致瘤性的增強?？蓪⑺龅腒-Ras同種型特異性活性用作替代靶標，以封阻K-Ras的致癌活性但不影響其它Ras同種型。

實驗程序

細胞系

NIH/3T3、BxPC3、PANC1和PANC2.03細胞來自ATCC。小鼠胰腺腺癌細胞由UCSF的Eric Collisson博士惠贈。表達H-、N-或K-Ras的Rasless MEF由UCSF的Cameron Pitt惠贈。小鼠細胞系在37℃，5％CO₂，于添加有10％FBS(或者對于NIH/3T3細胞而言，為CS)的達爾伯克改良伊戈爾培養(yǎng)基(DMEM)中生長。將人胰腺癌細胞系維持在添加有15％FBS和人重組胰島素(Gibco 12585-014)的ATCC改良RPMI-1640培養(yǎng)基中。

將K-Ras和H-Ras構(gòu)建體亞克隆至pBabe逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體，并使用標準誘變技術(shù)(Agilent QuikChange II XL定點誘變試劑盒)引入絲氨酸181位點突變。在293細胞中包裝各表達構(gòu)建體的病毒顆粒，并以大約1MOI轉(zhuǎn)導NIH/3T3細胞。然后在補充有2μg/ml嘌呤霉素的生長培養(yǎng)基中篩選轉(zhuǎn)導的細胞。

端錨聚合酶抑制劑JW55、Cardinogen1和JW67購自R&D Systems。將細胞用0.5μM抑制劑處理12小時，以用于TOPFlash分析。對于球體形成分析，在含有不同的端錨聚合酶抑制劑的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。

動物研究

所有實驗均被舊金山的加利福尼亞大學的IACUC批準。將Ras^V12轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細胞以每側(cè)50、100或1,000個細胞皮下注射進雌性裸鼠中(Nu/Nu)。一周兩次測量可觸知的腫瘤。將動物分成每組五只小鼠。來源于Braf^CA和Kras^LSL-G12D小鼠的胰腺腺癌細胞由Eric Collisson提供，并且如所述進行基因分型(Collison等人，Nat Med 17:500-503,2011；Dankort等人，Genes Dev 21:379-384,2007；Hingorani等人，Cancer Cell 4:37-450,2003)。使用28.5號針，將100個細胞以在20μL 50％Matrigel中的形式原位移植進6至8周齡的FVB/n小鼠。將小鼠監(jiān)測一個月，并且當其痛苦時使之安樂死。

如之前所述，通過兩階段化學致癌方案，使用7,12-二甲苯蒽(DMBA)和12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(TPA)誘導皮膚腫瘤(Balmain和Pragnell,Nature 303:72074,1983)。通過常規(guī)方法將組織學證實的皮膚癌處理為DNA、RNA和蛋白質(zhì)，以用于分子分析。如之前所述，通過直接測序鑒定Kras和HrasKI等位基因中的突變(To等人，Nat Genet 40:1240-1244,2008)。

用于動物處理的prostratin購自Santa Cruz Biotechnology(sc-203422A)。將藥物通過口服灌胃(OG)以1mg/kg或者通過腹腔內(nèi)(I.P)注射以0.5mg/kg每天施用于NOD-SCID或無胸腺的裸鼠。將10％DMSO、10％克列莫佛和80％鹽溶液用作溶劑和介質(zhì)對照。通過監(jiān)測至少30天的體重變化來評估介質(zhì)或prostratin的毒性效果。

使Lrig1Cre/ER/LSL Hras和Lrig1Cre/ER/LSL-Kras^G12D小鼠回交多代至FVB/N背景，以使遺傳異質(zhì)性對腫瘤發(fā)展的影響最小化。在兩組小鼠中，通過施用單一劑量的4oht(他莫昔芬)，激活Cre重組酶，所述施用在8周齡時局部應用。在其后第7天，通過切2cm的切口誘導其背部損傷，以發(fā)展乳頭狀瘤。

來自小鼠血漿樣本的DNA提取

將所有血液樣本收集于含有K₂EDTA的管中(BD Microtainer,Ref 365974)，并在1,500g下離心10min。然后從血漿的頂部小心收集上清液，以排除細胞污染物的可能性。將血漿在-80℃下儲存直至進一步使用。使用NucleoSpin Plasma XS試劑盒(Macherey-Nagel；740900)，從100μL血漿中提取cfDNA。

小鼠血漿中的人核酸的定量

根據(jù)制造商的方案，使用AB7900HT(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)和TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)，通過定量聚合酶鏈式反應(PCR)測量所有血漿樣本中的核酸濃度。為了定量小鼠血漿樣本中的人β-肌動蛋白基因組DNA，使用下述定制引物和探針組：正向引物，5’-ATCCTAAAAGCCACCCCACT-3’；

反向引物，5’-CTCAAGTTGGGGGACAAAAA-3’；以及

探針，5’-FAM-CACAGGGGAGGTGATAGCAT-TAMURA-3’。

RNA干擾

針對H-Ras、K-Ras和Fzd8的shRNA載體購自O(shè)pen Biosystems。使用標準方案，通過使用第3代慢病毒包裝系統(tǒng)將shRNA構(gòu)建體包裝為慢病毒。包裝質(zhì)粒來自Addgene。

RasGTP pull-down分析

將細胞在冰冷的PBS中洗滌兩次，并在補充有1mmol/L DTT以及蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑(Sigma-Aldrich)的1％TX100-TNM裂解緩沖液中裂解(20mmol/L Tris pH 7.5，5mmol/L MgCl₂，150mmol/L NaCl，1％Triton X-100)。向含10μL包裝GST-Raf-RBD或Ral-GDS-RBD珠子的300至500μL 1％TX100-TNM裂解緩沖液中添加來自各樣本的等量蛋白，并在4℃旋轉(zhuǎn)1至2小時。將珠子用1mL冷的裂解緩沖液洗滌3次，并在十二烷基硫酸鋰(LDS)樣本緩沖液(Invitrogen)中煮沸。

K-LISA Akt活性分析

K-LISA Akt活性試劑盒購自EMD Millipore(CBA019)。將細胞在冰冷的PBS中洗滌兩次，并在補充有1mmol/L DTT以及蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑(Sigma-Aldrich)的1％TX100-TNM裂解緩沖液(20mmol/L Tris pH 7.5，5mmol/L MgCl₂，150mmol/L NaCl，1％Triton X-100)中裂解。將含有等量蛋白的細胞裂解物與生物素化的肽底物孵育，所述肽底物可以被Akt1、Akt2和Akt3磷酸化。根據(jù)制造商的說明書，實施全部程序和板讀取。

蛋白質(zhì)印跡分析

將實驗細胞在冰冷的PBS中洗滌兩次，并在補充有蛋白酶抑制劑混合物(Roche)的1％Triton裂解緩沖液[25mmol/L Tris pH 7.5，150mmol/L NaCl，1％Triton X-100，1mmol/L EDTA，1mmol/L EGTA，20mmol/L NaF，1mmol/L Na₂VO₄和1mmol/L DTT]中裂解，以及通過離心清除。通過Bio-Rad蛋白分析(Bio-Rad)確定蛋白濃度。使用SDS-PAGE(NuPAGE；Invitrogen)溶解等量的蛋白提取物，將其轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，并用指定的初級抗體，隨后用被IRDye800(Rockland)或Alexa Fluor 680(Molecular Probes)標記的第二抗體進行免疫印跡，以及使用LI-COR Odyssey掃描儀使其可視化。初級抗體的完整列表提供于延伸的實驗程序中。

球體形成和重新鋪板分析

收獲細胞、計數(shù)并以每孔10個或100個細胞將其接種至Ultra Low Attachment Culture 96孔板內(nèi)(Corning Life Science,Catalog number 3261)。在含有0.1％FBS或CS的低血清培養(yǎng)基中維持接種的細胞和形成的球體。對起始的球體每周觀察兩次。接種后一個月對形成的球體的數(shù)目進行計數(shù)。收獲球體，并以每孔一個球體將其重新接種至含有完全生長培養(yǎng)基的12孔板或24孔板內(nèi)。對重新鋪板的集落進行染色，并通過0.05％結(jié)晶紫(在0.1％甲醇中)染色使其可視化。

藥物敏化分析

首先將細胞以每孔10,000個細胞接種至96孔板內(nèi)，并用prostratin(Santa Cruz Biotech,sc-203422A)處理72小時。移除死細胞，并且根據(jù)制造商的說明書，實施MTS分析(Promega,G5430)以確定活細胞的百分比。將DMSO用作介質(zhì)對照，并用于標準化。

定量PCR

使用QIAGEN RNAeasy試劑盒分離并純化總RNA。使用用于RT-PCR的SuperScript^TM第一鏈合成系統(tǒng)(Invitrogen)將每個樣本的1μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過DNase I處理排除基因組DNA的可能污染。使用SYBR Green(Applied Biosystem)實施定量實時PCR陣列分析。使用Windows的GraphPad Prism 4.00(GraphPad Software)計算倍數(shù)差異和統(tǒng)計學分析。96孔板上的小鼠干細胞信號轉(zhuǎn)導RT²Profiler PCR陣列(PAMM-047Z)購自SABiosciences。

TOPFlash和NFat熒光素酶分析

通過使用Fugene6(Roche)，用TOPFlash(Addgene#12456)、FOPFlash(Addgene#12457)或pGL3-NFAT(Addgene#17870)熒光素酶報告子構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細胞。在轉(zhuǎn)染后第48小時，使用Bright-Glo熒光素酶分析系統(tǒng)(Promega)，根據(jù)制造商的說明書，測量細胞裂解物中的熒光素酶活性。免疫組織化學

5μm厚的胰腺組織微陣列(PAN241、PA242a、PA483b和T143)購自Biomax,Inc。將脫蠟組織在電鍋中用Cell MarqueTM Trilogy試劑(ALS)暴露30分鐘。通過在室溫將切片置于H₂O₂/甲醇中10分鐘，而將其淬滅。使用 SP試劑盒(Invitrogen)對人和小鼠胰腺組織進行染色，并且根據(jù)制造商的說明書實施整個程序。根據(jù)產(chǎn)品應用注解使用初級抗體的稀釋液。

RNAscope原位雜交

為了通過放大靶標特異性的信號而非來自非特異性雜交的背景噪聲探索RNA ISH的信噪比，我們使用了新用戶設(shè)計的人Fzd8靶探針和RANSCOPE2.0High Definition-Brown染色試劑盒(Advanced Cell Diagnostics)。根據(jù)制造商的說明書實施整個程序。

盡管出于清楚理解的目的，已通過說明和實施例的方式在一定程度上詳細描述了前述發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解可在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)實踐的某些變化和修改。此外，將本文提供的各參考文獻通過引用整體并入，達到如同將各參考文獻通過引用單獨并入的程度。