交叉引用相關(guān)申請

本發(fā)明系主張美國臨時專利申請案之優(yōu)先權(quán)，該美國臨時專利申請案之申請?zhí)枮?2/052,083，申請日為公元2014年9月18日，全文以參考文獻之方式并入本案。

本發(fā)明系關(guān)于提升及抑制免疫調(diào)節(jié)細胞表達之方法。尤其是，本發(fā)明系關(guān)于經(jīng)由il-25提升及抑制免疫調(diào)節(jié)細胞表達之方法。

先前技術(shù)

多能人類間葉干細胞(multipotenthmscs)為體細胞祖細胞，可分離自骨髓(bm)(friedenstein,1976friedenstein,a.j.,int.rev.cytol.1976,47,327-359.；pittenger,m.f.etal.,science1999,284,143-147)及許多其它位置，如脂肪組織、臍帶血、及胎盤(ericesetal.,2000erices,a.etal.,br.j.haematol2000,109,235-242；yen,b.l.etal.,stemcells2005,23,3-9；zuk,p.a.etal.,tissueeng.2000,7,211-228)。先前研究已暗示，藉由給予正確的環(huán)境引導，hmscs可分化成成骨細胞、軟骨細胞及脂肪細胞之軸旁中胚層系及非中胚層系(dominici,m.etal.,cytotherapy2006,8,315-317；engler,a.j.etal.,cell2006,126,677-689)。因此，人類間葉干細胞已被廣泛應用于許多再生醫(yī)學之臨床試驗中(giordano,a.etal.,j.cell.physiol.2007,211,27-35；hare,j.m.etal.,jama2012,308,2369-2379)。又，已發(fā)現(xiàn)人類間葉干細胞具有很強的免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)，具有驚人的治療潛能，如同利用該等多功能之祖細胞對免疫相關(guān)疾病之眾多臨床試驗所證明(gebler,a.etal.,trendsmol.med.2012,18,128-134；leblanc,k.etal.,lancet2008,371,1579-1586；tan,j.etal.,jama2012,307,1169-1177)。人類間葉干細胞調(diào)控白血球之不同族群，研究最多者為針對t淋巴球，可抑制t淋巴球之效應功能(bartholomew,a.etal.,exp.hematol.2002,30,42-48；dinicola,m.etal.,blood2002,99,3838-3843；uccelli,a.etal.,nat.rev.immunol.2008,8,726-736)。該分子作用機制顯示同時涉及旁分泌因子(paracrinefactors)—特別是在人類系統(tǒng)中—包含腫瘤生長因子-β(tgf-β)、吲哚胺2,3-二加氧酶(ido)及前列腺素e2(pge2)，以及，與白血球表面受體接合之細胞表面分子(uccelli,a.etal.,nat.rev.immunol.2008,8,726-736；chen,p.m.etal.,j.biomed.sci.2011,18,49-59)。人類間葉干細胞亦影響輔助型cd4t細胞(th)次群表型之多樣性，強力地使th1細胞反應轉(zhuǎn)向th2細胞反應(aggarwal,s.etal.,blood2005,105,1815-1822；aksu,a.e.etal.,clin.immunol.2008,127,348-358)；及，可能誘導調(diào)節(jié)性t細胞(tregs)，即一種具有免疫調(diào)節(jié)功能之t細胞族群之產(chǎn)生(chang,c.j.etal.,stemcells2006,24,2466-2477；maccario,r.etal.,haematologica2005,90,516-525；selmani,z.etal.,stemcells2008,26,212-222)。

于t淋巴球中，一群可分泌白介素(il)-17a之t細胞逐漸受關(guān)注(dong,2008)，其亦稱為th17細胞，此種輔助型t細胞次族群系調(diào)控宿主反應以應對微生物感染，以及，參與許多長久以來被認為是由th1細胞所引起之自體免疫疾病及慢性發(fā)炎性疾病之致病性(miossec,p.etal.,nat.rev.drugdiscov.2012,11,763-776)。一些研究顯示，人類間葉干細胞會弱化th17所調(diào)控之免疫力(ghannam,s.etal.,j.immunol.2010,185,302-312；gonzalez,m.a.etal.,arthritisrheum.2009,60,1006-1019；xu,j.etal.,blood2012,120,3142-3151)；另外一些研究則發(fā)現(xiàn)，人類間葉干細胞實際上增強th17反應(darlington,p.j.etal.,ann.neurol.2010,68,540-545；tso,g.h.etal.,stemcells2010,28,939-954)。這些互相矛盾的報告似肇因于不完全了解人類間葉干細胞(hmsc)與th17淋巴球交互作用之相關(guān)機制，由于th17細胞在人類疾病中具有角色，此交互作用對于人類間葉干細胞的臨床應用具有重要關(guān)聯(lián)(korn,t.etal.,annu.rev.immunol.2009,27,485-517)。因此，本發(fā)明系檢測hmsc-th17交互作用之本質(zhì)，并闡明相關(guān)機制。本發(fā)明并發(fā)現(xiàn)，人類間葉干細胞對th17的抑制反應系同時經(jīng)由旁分泌作用及細胞-細胞接觸機制，并涉及il-25(亦稱為il17e)及pd-l1(pd-1家族之配體)。此數(shù)據(jù)證實，人類間葉干細胞持續(xù)地分泌il-25，經(jīng)由jnk及stat3，以提升pd-l1之細胞表面表達，其中stat3系與pd-l1之轉(zhuǎn)錄控制有關(guān)。人類間葉干細胞亦已被描述可增加具免疫調(diào)控性功能之骨髓衍生性抑制細胞(mdscs)白血球族群(yen,b.l.etal,stemcellrep.2013,1,139-51)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明系提供一種于體外(invitro)提升免疫調(diào)節(jié)細胞之表達之方法，系包括以il-25處理該免疫調(diào)節(jié)細胞以增加pd-l1之表達。于一實施例中，該免疫調(diào)節(jié)細胞為人類單核細胞或人類間葉干細胞(hmsc)。該方法進一步包括以jnk及/或stat3活化劑(activator)處理該免疫調(diào)節(jié)細胞。

本發(fā)明亦提供一種藉由前述方法治療免疫異常之方法，該免疫異常系包括，但不限于，自體免疫疾病、移植、及炎癥。

本發(fā)明系提供一種抑制免疫調(diào)節(jié)細胞表達之方法，系包括抑制pd-l1之表達。該免疫調(diào)節(jié)細胞為人類單核細胞或人類間葉干細胞。該方法可進一步包括抑制il-25之表達，及/或以stat3抑制劑及/或jnk抑制劑處理。

本發(fā)明進一步提供一種治療免疫逃避疾病(immune-evasivediseases)之方法，系包括藉由前述方法抑制免疫調(diào)節(jié)細胞之表達。該免疫逃避疾病包括，但不限于，癌癥。

附圖簡單說明

圖1系表示于體外擴增之外周血白血球(pbl)及cd4細胞中，人類間葉干細胞抑制il-17a之表達，并于人類t細胞中增強foxp3表達。來自3位提供者之人類外周血白血球(a：代表數(shù)據(jù)；b：合并數(shù)據(jù))或cd4t細胞(c：代表數(shù)據(jù)；d：合并數(shù)據(jù))系單獨(左列)或與人類間葉干細胞(提供者a&b)(右列)于抗-cd3/cd28珠粒刺激下體外共培養(yǎng)3天。于佛波醇12-肉豆蔻酸鹽13-乙酸鹽(pma)/離子霉素刺激6小時后，以胞內(nèi)染色評估經(jīng)活化之cd3+t細胞之il-17a之產(chǎn)生。右上象限之數(shù)字表示il-17a+細胞百分比。*,p<0.05。以胞內(nèi)染色評估新鮮分離之外周血白血球(e)或cd4t細胞(f)系單獨(左列)或與人類間葉干細胞(右列)于cd3+t細胞中之foxp3之表達。代表性點狀圖系顯示使用3位提供者之外周血白血球/t細胞及2位提供者之人類間葉干細胞之實驗；foxp3+cd3+t細胞之百分比系顯示于右上象限。

圖2系表示多能人類間葉干細胞抑制th17反應。人類外周血cd3⁺白血球(a：代表數(shù)據(jù)；b：合并數(shù)據(jù))或cd3⁺cd4t細胞(c：代表數(shù)據(jù)；d：合并數(shù)據(jù))系單獨(左列)或與人類間葉干細胞(右列)于離體(exvivo)共培養(yǎng)3天，接著以pma/離子霉素刺激6小時。以胞內(nèi)染色評估離體培養(yǎng)之cd3⁺t細胞之il-17a之產(chǎn)生。來自外周血白血球(n＝17)或cd4t細胞(n＝11)與全部3個hmsc提供者共培養(yǎng)之合并數(shù)據(jù)系分別顯示于(b)及(d)。以流式細胞儀分析與或不與人類間葉干細胞共培養(yǎng)之cd3⁺外周血白血球(e：代表數(shù)據(jù)；f,合并數(shù)據(jù))或cd3⁺cd4t細胞(g：代表數(shù)據(jù)；h,合并數(shù)據(jù))中之il-17a及ifn-γ產(chǎn)生。代表性胞內(nèi)染色之顯示為：il-17a⁺ifn-γ^--cd3⁺t細胞(r3區(qū)域)及il-17a⁺ifn-γ⁺(r5區(qū)域)cd3⁺t細胞，及來自外周血白血球(n＝4)或cd4t細胞(n＝4)與2位提供者之hmsc(提供者a&b)共培養(yǎng)之合并數(shù)據(jù)系分別顯示于(f)及(h)。柱狀圖之灰色表示il-17a⁺ifn-γ^--cd3⁺t細胞之百分比，而白色表示il-17a⁺ifn-γ⁺t細胞之百分比。以胞內(nèi)染色分析與或不與2位提供者之人類間葉干細胞(提供者a&b)共培養(yǎng)之4位提供者之cd3⁺cd4t細胞(i：代表數(shù)據(jù)；j,合并數(shù)據(jù))之il-22產(chǎn)生。細胞百分比系標注于點狀圖關(guān)注處之象限。數(shù)據(jù)以平均值±sd顯示；*,p<0.05；**,p<0.01。

圖3系表示人類間葉干細胞持續(xù)性表達il-25。以rt-pcr檢測il-25基因表達：胎盤衍生性人類間葉干細胞及纖維母細胞株(mrc-5及ws-1)(a)，及胎盤(左列)及骨髓(bm；右列)人類間葉干細胞各3位提供者(b)。il-25蛋白質(zhì)表達之檢測：(c)蛋白質(zhì)印記(k562細胞株及如標示劑量之重組人類il-25(rhil-25)為陽性對照組；微管蛋白為內(nèi)部對照組)及(d)針對流式細胞分析之胞內(nèi)染色(左列：胎盤人類間葉干細胞提供者a；右列，bm人類間葉干細胞提供者a)。充填之柱狀圖表示同型對照組；未充填之柱狀圖表示il-25抗體染色，及合并數(shù)據(jù)(各3位提供者之胎盤及bm人類間葉干細胞)系顯示于(e)。ctrl：同型對照；mfi：平均熒光強度；a.u.：任意單位。(f)胎盤人類間葉干細胞(提供者c，黑色柱狀圖)、bm人類間葉干細胞(提供者b，灰色柱狀圖)、mrc-5(條紋柱狀圖)、或ws-1(白色柱狀圖)所分泌之il-25系收集各類型細胞之條件培養(yǎng)基并以elisa分析。數(shù)據(jù)均以三重復之平均值±sd。

圖4系表示siil-25于人類間葉干細胞中成功地沉默il-25之表達。以小段干擾rna：非專一性片段(sictrl)或針對il-25(siil-25)對間葉干細胞中il-25之表達系以(a)rt-pcr：代表性凝膠并以光密度分析定量(全部3個提供者)；及(b)胞內(nèi)染色分析。充填之柱狀圖表示同型對照；未充填之柱狀圖表示il-25抗體染色。a.u.：任意單位；mfi：平均熒光強度；*,p<0.05。

圖5系表示于體外或體內(nèi)沉默人類間葉干細胞中的l-25會逆轉(zhuǎn)th17反應。新鮮分離之人類外周血白血球(a)或cd4t細胞(c)系單獨(左列)或與sictrl-hmsc(中列)或siil-25-hmsc(右列)其一共培養(yǎng)3天，接著以pma/離子霉素刺激6小時。以胞內(nèi)染色分析cd3⁺細胞之il-17a產(chǎn)生。右上象限之數(shù)字表示il-17a產(chǎn)生之cd3⁺t細胞之百分比。來自外周血白血球(n＝3)或cd4t細胞(n＝3)及2位人類間葉干細胞提供者(提供者a&b)之合并數(shù)據(jù)系分別顯示于(b)及(d)。數(shù)據(jù)以平均值±sd表示。*,p<0.05；**,p<0.01。(e)建立野生型c57bl/6j小鼠之體內(nèi)發(fā)炎條件與th17細胞擴增及人類間葉干細胞之過繼轉(zhuǎn)移之實驗策略。(f)lps(100μg/小鼠)處理后第三天，將對照組小鼠、pbs處理之小鼠、sictrl-hmsc處理之小鼠、或siil-25-hmsc處理之小鼠，以胞內(nèi)染色分析il-17a產(chǎn)生狀況。于對照組小鼠、pbs處理之小鼠、sictrl-hmsc處理之小鼠、或siil-25-hmsc處理之小鼠(n＝6)中，經(jīng)計算之(g)及相對之(h)il-17a表達之cd4t細胞平均百分比。數(shù)據(jù)以平均值±sd表示。*,p<0.05.**,p<0.01；***,p<0.005。

圖6系表示單獨使用外生性il-25不足以對th17反應產(chǎn)生顯著抑制作用，且，人類間葉干細胞所調(diào)控對th17反應之抑制作用需要細胞接觸。(a)人類cd4t細胞以指示劑量之重組人類il-25(rhil-25)處理18小時，接著以pma/離子霉素刺激6小時。以胞內(nèi)染色分析cd3⁺細胞之il-17a產(chǎn)生。右上象限之數(shù)字表示il-17a產(chǎn)生之cd3⁺t細胞之百分比；(b)5位外周血白血球提供者之合并數(shù)據(jù)。(c)人類cd4t細胞(n＝4)單獨或與人類間葉干細胞(2提供者：b&c)于transwell屏障存在或不存在下共培養(yǎng)。來自健康提供者之合并數(shù)據(jù)系顯示于(d)。數(shù)據(jù)以平均值±sd表示。**,p<0.01；n.s.,不顯著。

圖7系表示il-25于人類間葉干細胞及人類單核細胞上誘導pd-l1表面表達。(a)以表面染色分析sictrlmscs(左列)及sipd-l1mscs(右列)之pd-l1。(b)新鮮分離之人類外周血白血球系單獨(左列)或與sictrlmscs(中列)或與sipd-l1mscs(右列)共培養(yǎng)3天，接著以pma/離子霉素刺激6小時。以胞內(nèi)染色分析cd3+細胞之il-17a產(chǎn)生。右上象限之數(shù)字所示之代表性數(shù)據(jù)系表示il-17a產(chǎn)生之cd3⁺t細胞之百分比。(c)顯示來自外周血白血球(n＝4)及2位人類間葉干細胞提供者(提供者a&b)之合并數(shù)據(jù)。(d)系顯示siil-25及sipd-l1之經(jīng)逆轉(zhuǎn)之表型之倍數(shù)。(e)以細胞表面染色分析sictrl-hmscs(左列)及siil-25-hmscs(右列)之pd-l1表達。充填之長條圖表示同型對照；未充填之長條圖表示pd-l1抗體染色。(f)系顯示siil-25-hmscs及sipd-l1-hmscs(共3位提供者)之pd-l1表達之合并數(shù)據(jù)，系以平均熒光強度mfi之倍數(shù)變化表示。比較以針對標的基因(il-25或pd-l1)或以sictrl沉默之人類間葉干細胞之間之pd-l1表達量。(g)以指示劑量之rhil-25處理人類間葉干細胞達18小時，并以細胞表面染色分析細胞表面pd-l1表達。圖表中所示之合并數(shù)據(jù)(共3位提供者)，右側(cè)柱狀圖系以mfi表示(任意單位；a.u.)。(h)以指示劑量之rhil-25處理人類外周血白血球達18小時，并以流式細胞儀，采用fsc及ssc過閘，分析單核細胞表面pd-l1之表達。(i)顯示合并數(shù)據(jù)(10位pbl提供者)，以柱狀圖表達mfi。*,p<0.05；**,p<0.01；n.s.,不顯著。

圖8系表示人類間葉干細胞沉默il-25r系弱化t細胞il17a產(chǎn)生之抑制效果。(a)以免疫印記法檢測人類間葉干細胞上il-25r之表達。(b)以表面染色分析sictrlmscs(左列)與siil-25rmscs(右列)上之il-25r。充填之長條圖表示同型對照；未充填之長條圖表示il-25r抗體染色。(c)新鮮分離之人類外周血白血球系單獨(左列)或與sictrlmscs(中列)或siil-25rmscs(右列；提供者a&b)共培養(yǎng)3天，接著以pma/離子霉素刺激6小時。以胞內(nèi)染色檢測cd3+t細胞(3位提供者)中il-17a之產(chǎn)生。右上象限之數(shù)字表示il-17a產(chǎn)生之cd3+t細胞之百分比。(d)系顯示來自外周血白血球(n＝3)之合并數(shù)據(jù)。

圖9系表示于人類單核細胞及人類間葉干細胞中，il-25系經(jīng)由jnk及stat3而調(diào)控pd-l1之表達，且stat3涉及pd-l1之轉(zhuǎn)錄控制。(a)人類外周血白血球于100ng/mlrhil-25處理前，以抑制劑stat3(wp1066；2.5μm)、jnk(sp600125；25μm)或mek1(pd98059；20μm)預處理18小時，接著以流式細胞儀以fsc及ssc過閘，分析單核細胞上之pd-l1表面表達。充填之長條圖表示同型對照；未充填之長條圖表示pd-l1抗體染色。(b)顯示合并數(shù)據(jù)(3提供者)及表示mfi之柱狀圖。人類間葉干細胞以下列抑制劑：(c)stat3(wp1066；2.5μm)及(d)jnk(sp600125；25μm)處理6小時，接著以流式細胞儀分析pd-l1表面表達。系提供個別抑制劑(左表)之合并數(shù)據(jù)(共3位提供者)及表示mfi之柱狀圖。(e)以tfsearch網(wǎng)頁基礎(chǔ)之軟件測定之于人類pd-l1基因之近側(cè)啟動子區(qū)域之假設(shè)gas單元(stat鍵結(jié)位置)，系轉(zhuǎn)錄起始位置之上游700bp。(f)以染色質(zhì)免疫沉淀(chip)及對區(qū)域1及區(qū)域2之啟動子專一性引物分析人類間葉干細胞中stat3或igg(陰性對照組)之鍵結(jié)。輸入樣本(陽性對照組)代表1％起始染色質(zhì)。(g)hmsc所調(diào)控之th17反應之抑制作用之模塊示意圖，系涉及il-25/stat3/pd-l1序列軸。

圖10系表示il-25誘導之pd-l1表達于人類外周血單核細胞中參與之訊號途徑。(a)mek抑制后之pd-l1表達之合并數(shù)據(jù)(3提供者)(以mfi顯示)。(b)以抑制劑pi3k(ly294002；10μm)或akt(aktinhibitoriii；10μm)預處理人類外周血單核細胞，接著以100ng/mlil-25刺激。于il-25處理18小時后，藉由細胞表面染色檢測pd-l1表達。(c)顯示pd-l1表達之合并數(shù)據(jù)(3提供者)，以mfi顯示。a.u.：自行設(shè)定單位。

圖11系顯示il-25可擴增外周血白血球中的cd33-/cd11b+/cd33+骨髓衍生性抑制細胞(mdsc)。藉由重組人類il-25自人類外周血白血球擴增cd14^-cd11b⁺cd33⁺細胞。同種異體之外周血白血球(2提供者)系單獨培養(yǎng)或如指示添加不同劑量之il-25。首先，以前向散射(fsc)/側(cè)向散射(ssc)(r1)過閘，接著針對cd14^-及cd11b⁺(r2)分析，并進一步針對cd33⁺分析(r3，表示細胞百分比)。

實施方式

于本發(fā)明中，一種于體外提升免疫調(diào)節(jié)細胞之表達之方法系包括以il-25處理該免疫調(diào)節(jié)細胞以增加pd-l1之表達。于一實施方案中，該免疫調(diào)節(jié)細胞為人類單核細胞或人類間葉干細胞(hmsc)。

于一些實施方案中，該人類間葉干細胞系分離自骨髓、脂肪組織、臍帶血、或胎盤。于另一實施方案中，該人類單核細胞可分離自外周血白血球。于一實施方案中，于體外提升免疫調(diào)節(jié)細胞之表達之方法可進一步包括以jnk及/或stat3活化劑處理該免疫調(diào)節(jié)細胞。

于本發(fā)明中，一種治療免疫異常之方法，系藉由使用前述于體外提升免疫調(diào)節(jié)細胞之表達之方法。于一些實施方案中，該免疫異常可為自體免疫疾病、移植、及炎癥。

于本發(fā)明中，一種抑制免疫調(diào)節(jié)細胞表達之方法，系包括抑制pd-l1之表達。于一實施方案中，該免疫調(diào)節(jié)細胞為人類單核細胞或人類間葉干細胞。又，該人類間葉干細胞可為骨髓、脂肪組織、臍帶血、或胎盤之間葉干細胞。

于一實施方案中，該抑制免疫調(diào)節(jié)細胞表達之方法可進一步包括抑制il-25之表達。于一些實施方案中，該il-25之表達系藉由抑制il-25與il-25r之間的交互作用、或以抗-il25或抗-il-25r抗體處理而抑制。于一些實施方案中，抑制該il-25之表達，系藉由指向(targeting)il-25及il-25r之sirna處理而抑制il-25與il-25r之表達。

于另一實施方案中，該抑制免疫調(diào)節(jié)細胞表達之方法可進一步包括以stat3抑制劑及/或jnk抑制劑處理。于一些實施方案中，該stat3抑制劑為wp1066，而該jnk抑制劑為sp600125。

本發(fā)明進一步提供一種治療免疫逃避疾病之方法，系藉由前述方法抑制免疫調(diào)節(jié)細胞之表達。該免疫免疫逃避疾病包括，但不限于，癌癥。

實施例

實驗流程

細胞培養(yǎng)

依據(jù)先前已發(fā)表之流程(pittenger,m.f.etal.,science1999,284,143-147；yen,b.l.etal.,stemcells2005,23,3-9)，由bm及胎盤將人類間葉干細胞分離及擴增。簡言之，胎盤間葉干細胞系分離自人類足月胎盤(38至40周妊娠；3位提供者分別標示為a、b及c)，向機構(gòu)審查委員會呈報及經(jīng)同意后進行。將胎盤組織經(jīng)機械性及酶促消化(0.25％胰蛋白酶-edta；購自gibco-invitrogen)，并培養(yǎng)于杜氏改良之伊格氏培養(yǎng)基(dmem)-低葡萄糖(gibco-invitrogen)、10％胎牛血清(fbs；hyclone)、2mml-谷氨酰胺(gibco-invitrogen)、及100u/ml青霉素-鏈霉素(gibco-invitrogen)中。骨髓間葉干細胞(bmmsc)可自商業(yè)上購得(cambrex，2位提供者標示為a及b；及promocell，1位提供者標示為c)。除非另有指示，所使用的人類間葉干細胞均為胎盤衍生性。人類外周血白血球(pbl)系分離自健康供給者血液樣本(臺灣血液基金會臺北捐血中心，位于臺灣臺北)之白色血球?qū)?buffycoat)，向機構(gòu)審查委員會呈報及經(jīng)同意后進行；以及如先前報導之方式(chang,c.j.etal.,stemcells2006,24,2466-2477；yen,b.l.etal.,stemcellreports2013,1,139-151)培養(yǎng)。依據(jù)制造商之流程，利用人類cd4微粒(microbeads)(購自miltenyibiotec)自pbl純化cd4t細胞。以流式細胞儀分析純度(>98％為cd4陽性)。人類纖維母細胞株mrc-5及ws-1系得自美國菌種保存中心(atcc)，并依所建議之流程培養(yǎng)。

人類間葉干細胞-白血球共培養(yǎng)試驗

在與人類外周血白血球或cd4細胞共培養(yǎng)之前，于6孔平盤中以每孔3.5x10⁴細胞涂布人類間葉干細胞，并于37℃培養(yǎng)24小時。針對共培養(yǎng)，將1x10⁵人類外周血白血球或cd4細胞添加至包含人類間葉干細胞之孔洞中，并以磁性抗cd3/cd28涂覆之dynabeads(gibco-invitrogen)依據(jù)制造商之說明書進行刺激或否。3天后，將細胞以佛波醇12-肉豆蔻酸鹽13-乙酸鹽(pma)(50ng/ml；sigma-aldrich)加上離子霉素(1μg/ml；sigma-aldrich)于莫能菌素(ebioscience)存在下刺激6小時，接著以胞內(nèi)染色評估t細胞之il-17a之表達。針對transwell培養(yǎng)，將人類外周血白血球或cd4細胞涂布于穿孔細胞培養(yǎng)平盤之上方分隔(0.4μm孔洞尺寸；bdfalcon^tm)，而人類間葉干細胞涂布于下方分隔。于建立對單核細胞及人類間葉干細胞之毒性概況后，將人類重組il-25(rhil-25；peprotech)及不同抑制劑(wp1066/insolution^tmstat3抑制劑iii及akt抑制劑iii，購自millipore；sp600125jnk抑制劑及l(fā)y294002pi3激酶抑制劑，購自cellsignalingtechnology；以及pd98059/mek1/2抑制劑，購自cellsignalingtechnology)依據(jù)所指示之劑量添加于不同實驗組別中。

流式細胞儀

以下列抗體(括號內(nèi)為購買來源)對細胞染色：抗人類il-25-pe(r&dsystems)、小鼠igg1同型對照-pe(r&dsystems)、抗人類cd3-pe/cy5(biolegend)、抗人類cd4-pe(biolegend)、抗人類il-17a-pe(ebioscience)、抗人類ifn-γ-fitc(biolegend)、抗人類il-22-pe(ebioscience)、抗人類foxp3-alexafluor488(bdpharmingen)、抗人類cd274(b1-h1)-pe(ebioscience)、小鼠igg1同型對照-pe(ebioscience)、抗人類il-25r-pe(r&dsystems)、及小鼠igg2b同型對照-pe(r&dsystems)、抗小鼠cd4-apc(ebioscience)、抗小鼠cd3e-pe/cy5(ebioscience)、及抗小鼠/大鼠il-17a-pe(ebioscience)。以bdfacscalibur^tm(bdbiosciences)儀器收集數(shù)據(jù)，并以軟件cellquestprosoftwear(bdbiosciences)分析。

質(zhì)譜法

依據(jù)先前報導(chang,w.c.etal.,int.jproteomics2010,726968)進行串聯(lián)式質(zhì)譜(ms/ms)實驗。簡言之，系以ltq-fticrms(購自thermoelectron)配備奈電灑離子源(購自newobjective)、agilent1100系列二元hplc泵(購自agilenttechnologies)及famos自動注射器(購自lcpackings)進行ms/ms。以計數(shù)1,000之最小閾值作為ms/ms連續(xù)分離之臨界值，系藉由ltq以個別帶電離子排斥達到ms/ms定序。

rt-pcr

依據(jù)制造商之說明書，利用trizol試劑(購自gibco-invitrogen)由細胞制備全rna。以improm-ii反轉(zhuǎn)錄酶(購自promega)由該rna合成第一股cdna。針對pcr，以下列引物組對cdna進行pcr。il-25，正向

5’-ttcctacaggtggttgcattc-3’、反向

5’-cgcctgtagaagacagtctgg-3’(furuta,s.etal.,sci.transl.med.2011,3,78ra31)；β-肌動蛋白，正向5’-tggcaccacaccttctacaatgagc-3’、反向5’-gcacagcttctccttaatgtcacgc-3’。

elisa

人類il-25elisa試劑盒系購自peprotech，并依據(jù)制造商之說明書進行。其檢測范圍為0～2000pg/ml。

rna干擾

以隱形(stealth)rna干擾(rnai)雙鏈體寡核苷酸(gibco-invitrogen)依據(jù)制造商之說明書，沉默(silencing)人類il-25、il-25r或pd-l1于人類間葉干細胞中的表達，并以無目標sirna(中度gc雙鏈體)作為對照組。依據(jù)制造商之說明書，以lipofectaminernaimax(gibco-invitrogen)進行rnai之轉(zhuǎn)染。以流式細胞儀確認敲減(knockdown)效果。

人類間葉干細胞過繼轉(zhuǎn)移(adoptivetransfer)

所有動物試驗均依據(jù)已經(jīng)機構(gòu)內(nèi)動物照護及使用委員會核準之實驗流程進行。野生型c57bl/6j小鼠系購自動物實驗中心(位于臺灣臺北)。以類似于先前報導之方式(shi,g.etal.,j.immunol.2013,191,415-423)，進行th17細胞之體內(nèi)誘導。簡言之，取8至12周之小鼠，以腹腔注射入lps(100μg；escherichiacoli00041:b4；sigma-aldrich)，接著于2小時后，以無目標rnai或il-25rnai轉(zhuǎn)染(分別為sictrl或siil-25)后，注入人類間葉干細胞(1x10⁵細胞/小鼠)。于第3天犧牲小鼠，并取得脾細胞以測定cd4t細胞中之il-17a⁺表達。

染色質(zhì)免疫沉淀(chip)

chip分析系以ez-zyme^tm染色質(zhì)制備試劑盒(millipore)及ez-chip^tm染色質(zhì)免疫沉淀試劑盒(millipore)依據(jù)制造商之說明書進行。經(jīng)消化之染色質(zhì)系用以進行多重免疫沉淀，系使用抗-stat3(124h6)小鼠單克隆抗體(cellsignalingtechnology)及一般小鼠igg。百分之一之反應系移除以作為輸入染色質(zhì)。pcr檢測系利用對人類cd274啟動子區(qū)域中stat3之推定之鍵結(jié)位置為專一性之引物組進行。該引物組之序列為：

正向5′-aggtgcgttcagatgttggc-3′及

反向5′-tgcccaaggcagcaaatccag-3′，可擴增-337bp至-118bp之片段；以及，

正向5′-tgacaccatcgtctgtcatc-3′及5′-gtcagcagcagacccatatg-3′，可擴增-803bp至-477bp之片段。

免疫印記分析

全細胞溶胞液之制備，系將細胞置于溶解緩沖液(300mmnacl、50mmhepes[ph7.6]、1.5mmmgcl2、10％甘油、1％tritonx-100、10mmnapyrpo4、1mmegta、0.1mmedta、1mmdtt、1mmpmsf、及1mmna4vo3)中于4℃下達15分鐘而溶解細胞。溶胞液首先以12,000×g離心20分鐘。將等量的樣本溶解于7％sds-page，接著轉(zhuǎn)移至硝化纖維素(gehealthcare)并以抗-il-25r抗體(genetex)點漬。

統(tǒng)計分析

以學生t測試(雙側(cè))進行兩組之間的統(tǒng)計分析，并以anova進行多組的統(tǒng)計分析。統(tǒng)計顯著性系設(shè)定為p<0.05。所有數(shù)據(jù)均以平均值±sd表示。

結(jié)果

人類間葉干細胞抑制th17反應

由于msc-th17的交互作用有許多相互矛盾的報告，本發(fā)明首先設(shè)定以回答人類間葉干細胞系促進或抑制th17細胞擴增。為了檢測，系使用胎盤衍生性人類間葉干細胞，其已于先前證實可為三種系多能祖細胞且為免疫調(diào)節(jié)性，類似于bmmscs(yen,b.l.etal.,stemcells2005,23,3-9；chang,c.j.etal.,stemcells2006,24,2466-2477；yen,b.l.etal.,stemcellreports2013,1,139-151)。該等人類間葉干細胞接著與人類外周血白血球(外周血白血球)或經(jīng)純化之cd4t細胞于穩(wěn)態(tài)下共培養(yǎng)3天。于佛波醇12-肉豆蔻酸鹽13-乙酸鹽(pma)/離子霉素處理6小時后，約1至3％之未激活(non-primed)t細胞變成il-17a生產(chǎn)者，并發(fā)現(xiàn)，當人類間葉干細胞存在時，外周血白血球(圖2a，代表數(shù)據(jù)；圖2b，合并數(shù)據(jù))或cd4t細胞(圖2c，代表數(shù)據(jù)；圖2d，合并數(shù)據(jù))中之il-17a-表達之t細胞之頻率強烈減少60％-65％。為了進一步確認此表征，以抗-cd3/cd28珠粒并添加離子霉素體外刺激外周血白血球或t細胞以活化th17作用者表型(santarlasci,v.etal.,immunity2012,36,201-214)。發(fā)現(xiàn)到，體外擴增之il-17a表達之外周血白血球(圖1a，代表數(shù)據(jù)；圖1b，合并數(shù)據(jù))及t細胞(圖1c，代表數(shù)據(jù)；圖1d，合并數(shù)據(jù))之頻率系顯著減少，與人類間葉干細胞存在的情況一致。已知tregs及th17種系互為連鎖，其中一種會被選擇超過另一種以維持體內(nèi)免疫平衡(weaver,c.t.etal.,nat.rev.immunol.2009,9,883-889)。附隨地，發(fā)現(xiàn)在與人類間葉干細胞共培養(yǎng)后，外周血白血球及cd4細胞中的foxp3表達之天然tregs之頻率系增加(圖1e及1f)。人類間葉干細胞不只抑制il-17a細胞，亦顯著地抑制il-17a/ifn-γ雙重生產(chǎn)者細胞，其為th17細胞在發(fā)炎位置的主要次型(annunziato,f.etal.,j.exp.med.2007,204,1849-1861；zielinski,c.e.etal.,nature2012,484,514-518)。先前報導顯示，于外周血白血球及t細胞中，人類間葉干細胞系強力抑制ifn-γ—一種典型的th1細胞介素—產(chǎn)生(aksu,a.e.etal.,clin.immunol.2008,127,348-358；aggarwal,s.etal.,blood2005,105,1815-1822)，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)此情況為真(分別為圖2e及2g)。另外發(fā)現(xiàn)人類間葉干細胞系實質(zhì)上抑制ifn-γ/il-17a表達之t細胞(針對外周血白血球：圖2e，代表數(shù)據(jù)；圖2f，合并數(shù)據(jù)；針對cd4細胞：圖2g，代表數(shù)據(jù)；圖2h，合并數(shù)據(jù))。亦已知th17細胞可產(chǎn)生il-22(dong,c.,nat.rev.immunol.2008,8,337-348)，且將cd4t細胞與人類間葉干細胞共培養(yǎng)亦顯著降低il-22產(chǎn)生(圖2i，代表數(shù)據(jù)；圖2j，合并數(shù)據(jù))。此等結(jié)果證實，人類間葉干細胞系有效地抑制th17反應。

人類間葉干細胞持續(xù)表達il-25

于人類系統(tǒng)中，間葉干細胞-t細胞交互作用系主要牽涉于旁分泌因子(kim,n.etal.,ann.hematol.2013,92,1295-1308)；因此，為了鑒定能夠抑制th17反應之可能候選分泌因子，系對人類間葉干細胞之條件培養(yǎng)基進行質(zhì)譜(ms)分析。令人驚訝地是，ms/ms研究顯示人類間葉干細胞可高量分泌il-25(亦已知為il17e，及為th17反應之潛在抑制劑(kleinschek,m.a.etal.,j.exp.med.2007,204,161-170；zaph,c.etal.,j.exp.med.2008,205,2191-2198))。為了重新驗證ms/ms結(jié)果，發(fā)明人檢驗了不同來源之人類間葉干細胞之il-25之轉(zhuǎn)錄子，并與其它體細胞類型如纖維母細胞比對。il-25信使rna(mrna)可于人類間葉干細胞中被檢測到，但于纖維母細胞株mrc-5或ws-1則否(圖3a)。于來自三個不同提供者之人類胎盤衍生性間葉干細胞及人類骨髓間葉干細胞中，亦檢測到il-25mrna之表達(圖3b)，表示在橫跨不同來源之人類間葉干細胞之il-25表達之信賴度。為確認il-25蛋白質(zhì)產(chǎn)生，以全部蛋白質(zhì)產(chǎn)物進行蛋白質(zhì)印記(圖3c)及以胞內(nèi)流式細胞儀偵測il-25(圖3d)，于兩種分析中均可檢測得蛋白質(zhì)表達。另外亦發(fā)現(xiàn)，以elisa檢測，可測得人類間葉干細胞于條件培養(yǎng)基中所表達之il-25蛋白質(zhì)為分泌型(圖3e)。該等發(fā)現(xiàn)系暗示人類間葉干細胞持續(xù)性產(chǎn)生il-25。

沉默人類間葉干細胞所衍生之il-25，系于體外及體內(nèi)逆轉(zhuǎn)th17反應之抑制作用，但僅外生性il-25則不足以抑制th17反應。為測定人類間葉干細胞所分泌之il-25是否涉及抑制th17反應，將il-25于人類間葉干細胞中的表達藉由rna干擾作用(siil-25)而沉默。于確認減弱效果后(圖4a及4b)發(fā)現(xiàn)，與對照組經(jīng)沉默之人類間葉干細胞(silencedhmsc，sictrl)(圖5a)相較，以對人類間葉干細胞基因?qū)Ｒ恍灾《胃蓴_rna(sirna)沉默il-25分泌作用幾乎完全逆轉(zhuǎn)了對th17細胞的抑制效果。于il-17a-表達之t細胞中，與sictrl-人類間葉干細胞共培養(yǎng)者，可見平均降低35％；當使用siil-25-人類間葉干細胞時，則完全消失(圖5b)。當sictrl或siil-25-人類間葉干細胞與經(jīng)純化之cd4淋巴球共培養(yǎng)時，亦可見類似傾向(圖5c)。當以sictrl-人類間葉干細胞共培養(yǎng)時，th17淋巴球平均降低至基準線之52％；而采用siil-25-人類間葉干細胞時為87％(圖5d)。藉由將sictrl-人類間葉干細胞或siil-25-人類間葉干細胞之一過繼轉(zhuǎn)移至脂多糖(lps)處理之c57bl/6j小鼠中，進一步證實在體內(nèi)發(fā)炎條件下，人類間葉干細胞所衍生之il-25對于th17抑制之能力(圖5e)。發(fā)現(xiàn)sictrl-人類間葉干細胞之體內(nèi)轉(zhuǎn)移系抑制脾臟之il-17a表達之cd4t細胞之族群，而siil-25-人類間葉干細胞則并未達成此種反應(圖5f及5g)。于sictrl-人類間葉干細胞之轉(zhuǎn)移，il-17a表達之t細胞系平均降低至基準線之41％，但轉(zhuǎn)移siil-25-人類間葉干細胞幾乎完全消除該等效果，使il-17a表達之t細胞系平均回到基準線之98％(圖5h)。該等數(shù)據(jù)證實，人類間葉干細胞所分泌之il-25系涉及體外及體內(nèi)之抑制th17反應。

為進一步確認il-25于抑制th17反應中的角色，以重組人類il-25(rhil-25)處理cd4t細胞達18小時，再以pma/離子霉素刺激并檢測cd4細胞中之il-17a之量。令人驚訝的是，發(fā)現(xiàn)單獨添加il-25至cd4細胞無法抑制th17反應至明顯程度(圖6a，代表數(shù)據(jù)；圖6b，合并數(shù)據(jù))。另外，當藉由transwell膜將cd4t細胞與人類間葉干細胞分離，于cd4細胞中之傾向th17細胞之抑制性反應喪失(圖6c，代表數(shù)據(jù)；圖6d，合并數(shù)據(jù))。此暗示膜結(jié)合因子似乎亦參與il-25調(diào)控之效果。

藉由上游調(diào)控pd-l1之表面表達，人類間葉干細胞所分泌之il-25系抑制th17反應。

已有報導(chang,c.j.etal.,stemcells2006,24,2466-2477；stagg,j.etal.,blood2006,107,2570-2577)，持續(xù)表達于人類間葉干細胞表面之pd-l1配體，于人類t細胞中為一種對il-17a產(chǎn)生之強力抑制劑(brown,j.a.etal.,j.immunol.2003,170,1257-1266；hirahara,k.etal.,immunity2012,36,1017-1030)。因此，考慮到人類間葉干細胞所分泌之il-25對th17反應之效果，可能經(jīng)由與此種間葉干細胞表面分子之交互作用而調(diào)控。為了確認先前報導中pd-l1于th17細胞上之抑制效果，以sipd-l1減弱pd-l1于人類間葉干細胞之表達(圖7a)。發(fā)現(xiàn)與先前報導一致的結(jié)果，于人類間葉干細胞中減弱pd-l1，系逆轉(zhuǎn)對th17細胞之抑制作用(圖7b及7c)，但與siil-25處理者相較為明顯較低程度(圖7d)。為檢測pd-l1于th17反應之il-25依賴性抑制作用中之角色，需探討il-25是否涉及pd-l1于人類間葉干細胞之表達。發(fā)現(xiàn)當il-25于人類間葉干細胞中被沉默時，pd-l1之表面表達被強力減少，且減少至類似于以對其專一性之sirna減弱之程度(圖7e，代表數(shù)據(jù)；圖7f，siil-25vs.sipd-l1之合并數(shù)據(jù))，表示il-25可能誘導pd-l1表達。il-25之受體為il25r(lee,j.etal.,j.biol.chem.2001,276,1660-1664)，檢查il25r于人類間葉干細胞之表達，蛋白質(zhì)印記顯示人類間葉干細胞持續(xù)表達此受體(圖8a)。當以siil-25r沉默il-25r于人類間葉干細胞上之表達(圖8b)，發(fā)現(xiàn)人類間葉干細胞對th17反應之抑制作用明顯被消除(圖8c&8d)。故，人類間葉干細胞所分泌之il-25需要于人類間葉干細胞上與其受體il-25r交互作用，以引導th17反應之抑制作用。

為了進一步確認il-25于pd-l1表達之交互作用，將rhil-25直接添加至人類間葉干細胞，以分析pd-l1之進一步之正調(diào)控。發(fā)現(xiàn)外生性rhil-25可進一步提升pd-l1于人類間葉干細胞之表面表達，但未達顯著程度(圖7g)，可能系因pd-l1原本即為持續(xù)性高度表達于人類間葉干細胞上，因而掩蓋了rhil-25之進一步效果。故，為進一步厘清il-25對pd-l1表達之顯著性，采用來自外周血白血球之人類初級單核細胞，已知該等細胞會對il-25反應且其pd-l1表達量以基準線而言為低濃度(caruso,r.etal.,blood2009,113,3512-3519)。發(fā)現(xiàn)當人類外周血白血球以rhil-25處理時，單核細胞中pd-l1表達系戲劇性及顯著性的增加，且具有劑量依賴性(圖7h，代表數(shù)據(jù)；圖7i，合并數(shù)據(jù))。因此，此等發(fā)現(xiàn)證實il-25系涉及人類間葉干細胞及人類單核細胞中之pd-l1表面表達之正向調(diào)控。

il-25誘導之pd-l1正向調(diào)控系經(jīng)由jnk及stat3所調(diào)控，且stat3涉及pd-l1之轉(zhuǎn)錄控制

接著欲探討il-25調(diào)控之pd-l1之訊號途徑。首先采用來自人類外周血白血球之單核細胞以回答此一問題，于該種細胞中pd-l1為誘發(fā)性而非持續(xù)性表達。于人類初級單核細胞中，wp1066：一種stat3抑制劑，或sp600125：一種jnk抑制劑，實質(zhì)上消除了il-25調(diào)控之pd-l1誘導(圖9a，代表數(shù)據(jù)；圖9b，合并數(shù)據(jù))。反之，pd98059：一種mek1/2抑制劑顯示最小效果，而ly294002：一種pi3k抑制劑及akt抑制劑ii僅部分影響il-25誘導之pd-l1之表達(圖10a及10b)。于持續(xù)性高量表達pd-l1之人類間葉干細胞中，亦發(fā)現(xiàn)wp1066之stat3抑制作用(圖9c)或sp600125之jnk抑制作用(圖9d)會大幅減少pd-l1之表達。

由于stat3亦已知為轉(zhuǎn)錄因子，合理推測此分子可能不只涉及il-25調(diào)控之pd-l1表達，還可能在pd-l1之轉(zhuǎn)錄控制上扮演某種角色。為了回答此一問題，首先分析介于-700核苷酸及+1核苷酸之間之人類pd-l1基因之啟動子，其為假設(shè)之stat3鍵結(jié)單元。以軟件預測為基準，發(fā)現(xiàn)介于轉(zhuǎn)錄起始位置上游595至116bp之間之三種假設(shè)gas單元(stat3鍵結(jié)位置)(圖9e)，提高了stat3可直接鍵結(jié)至pd-l1啟動子之可能性。為測試此種可能性，以染色質(zhì)免疫沉淀(chip)測定stat3于人類間葉干細胞中是否鍵結(jié)至pd-l1啟動子，發(fā)現(xiàn)stat3系持續(xù)加至該pd-l1啟動子之gas單元(圖9f)。此數(shù)據(jù)證實，于人類間葉干細胞中，il-25系經(jīng)由jnk及stat3而調(diào)控pd-l1之細胞表面表達，而stat3系涉及pd-l1之轉(zhuǎn)錄控制(圖9g)。

為了進一步確認il-25可誘導來自外周血之骨髓衍生性抑制細胞(mdscs)擴增，同種異體之pbl(2提供者)系單獨培養(yǎng)或如指示添加不同劑量之il-25(圖11)。經(jīng)處理之細胞首先以前向散射(fsc)/側(cè)向散射(ssc)(r1)過閘，接著針對cd14^-及cd11b⁺(r2)分析，并進一步針對cd33⁺分析(r3，表示細胞百分比)。此數(shù)據(jù)證實il-25可于外周血白血球中擴增cd33-/cd11b+/cd33+mdscs。

討論

人類間葉干細胞已知為廣泛性免疫調(diào)節(jié)性，且此等效果具治療關(guān)連性(caplan,a.i.etal.,cellstemcell2011,9,11-15；leblanc,k.etal.,nat.rev.immunol.2012,12,383-396；uccelli,a.etal.,nat.rev.immunol.2008,8,726-736)。現(xiàn)已知th17細胞涉及多種自體免疫及慢性炎癥之病理學(miossec,p.etal.,nat.rev.drugdiscov.2012,11,763-776)；然而，人類間葉干細胞與此種重要的白血球族群間的交互作用卻顯示了矛盾的結(jié)論(darlington,p.j.etal.,ann.neurol.2010,68,540-545；ghannam,s.etal.,j.immunol.2010,185,302-312；gonzalez,m.a.etal.,arthritisrheum.2009,60,1006-1019；tso,g.h.etal.,stemcells2010,28,939-954；xu,j.etal.,blood2012,120,3142-3151)。本發(fā)明數(shù)據(jù)顯示，人類間葉干細胞對th17細胞為抑制性效果，且需要旁分泌因子il-25及細胞表面分子pd-l1兩者。又，pd-l1于人類間葉干細胞之表達系經(jīng)由il-25r連結(jié)至il-25，進一步到下游之jnk及stat3，后者系涉及pd-l1之轉(zhuǎn)錄控制。th17細胞已被認為與移植排斥相關(guān)，但機轉(zhuǎn)不明(antonysamy,m.a.etal.,j.immunol.1999,162,577-584；faust,s.m.etal.,j.immunol.2009,183,7297-7306)。對于人類間葉干細胞可在相關(guān)疾病治療中產(chǎn)生強力療效，該數(shù)據(jù)可對背后機轉(zhuǎn)提供一些線索(bassi,e.j.etal.,diabetes2012,61,2534-2545；sun,l.etal.,stemcells2009,27,1421-1432；zhou,b.etal.,clin.immunol.2011,141,328-337)，并暗示il-25促效劑在改善自體免疫/炎癥及移植排斥上所扮演的角色。

il-25(il-17e)為il-17家族之一員(iwakura,y.etal.,immunity2011,34,149-162)。然而，不像il-17a或f(此白介素家族中較為人所知者)于自體免疫及慢性炎癥之直接的角色，il-25實際上顯示為對抗il-17a/th17及th1狀態(tài)之保護作用(caruso,r.etal.,gastroenterology2009a,136,2270-2279)。于th17所調(diào)控之實驗性自體免疫腦脊髓炎(eae)(一種人類多發(fā)性硬化癥之模式)中，額外促進th1反應之il-25缺乏之小鼠，系具有較高量之il-17a-表達之t細胞及ifn-γ-表達之t細胞(kleinschek,m.a.etal.,j.exp.med.2007,204,161-170)。有趣的是，累積的數(shù)據(jù)證實，il-25在免疫系統(tǒng)中具有其它角色，藉由促進th2反應，而預防寄生蟲感染(fallon,p.g.etal.,j.exp.med.2006,203,1105-1116)及嗜酸粒細胞性氣道炎癥(kim,m.r.etal.,blood2002,100,2330-2340)。直至今日，il-25經(jīng)報導之來源包括免疫細胞，如t細胞、巨噬細胞、單核細胞衍生之樹突細胞、巨細胞、嗜酸性球及嗜堿性球，以及非免疫細胞如上皮及內(nèi)皮細胞(monteleone,g.etal.,interleukin&growthfactorrev.2010,21,471-475)。發(fā)現(xiàn)不同來源之人類間葉干細胞可高量且持續(xù)表達il-25，但纖維母細胞則否。又，此數(shù)據(jù)顯示il-25系直接負責人類間葉干細胞對同種異體th17反應之抑制作用，包含減少高度病原性之il-17a/ifn-γ⁺細胞；進一步證實il-25系廣泛保護性地拮抗th17及th1反應。由于其持續(xù)且高量的表達，合理推測il25于人類間葉干細胞中其它可能的生物學角色?？沙掷m(xù)進行更深入的研究，以評估此細胞介素是否在人類間葉干細胞之增殖及/或分化中扮演某種角色。

本研究重要發(fā)現(xiàn)之一為，il-25可于白血球(單核細胞)及非白血球(人類間葉干細胞)兩種族群中直接提升表面分子pd-l1。pd-l1具有強烈的免疫抑制性，于多種自體免疫疾病中為自體t細胞活化之抑制劑(keir,m.e.etal.,annu.rev.immunol.2008,26,677-704)，而，最近證實，在t細胞上封鎖其受體pd-1可非常有效地拮抗癌癥免疫抑制作用(topalian,s.l.etal.,n.engl.j.med.2012,366,2443-2454)。近來，一報導顯示小鼠間葉干細胞經(jīng)由此途徑抑制th17反應(luz-crawford,p.etal.,plosone2012,7,e45272)。然而，該報導之數(shù)據(jù)顯示，封鎖該pd-l1/pd-1途徑僅部分地逆轉(zhuǎn)小鼠間葉干細胞對th17反應之抑制作用，暗示了其它因子參與此過程。此數(shù)據(jù)亦證實，沉默pd-l1會部分逆轉(zhuǎn)人類間葉干細胞對th17反應之抑制作用，而沉默il-25則造成人類間葉干細胞所調(diào)控之th17抑制作用為明顯較高的逆轉(zhuǎn)或幾乎完全逆轉(zhuǎn)(圖7d)。另外，pd-l1表達的減弱程度系類似于使用il-25或pd-l1專一性之sirna(圖7f)。又，發(fā)現(xiàn)il-25可于人類間葉干細胞及人類白血球兩者中，經(jīng)由stat3直接影響pd-l1之轉(zhuǎn)錄之證據(jù)，有助于回答pd-l1轉(zhuǎn)錄控制的問題(sumpter,t.l.etal.,eur.j.immunol.2011,41,286-290；wolfle,s.j.etal.,eur.j.immunol.2011,41,413-424)。重要的是，穩(wěn)定狀態(tài)之小鼠間葉干細胞并不表達pd-l1，而人類間葉干細胞則持續(xù)表達高量pd-l1(stagg,j.etal.,blood2006,107,2570-2577)。重要的是，應注意來自小鼠系統(tǒng)的數(shù)據(jù)雖然很重要，但在間葉干細胞的免疫生物學上，來自小鼠系統(tǒng)與人類系統(tǒng)的數(shù)據(jù)有時會互相矛盾(eliopoulos,n.etal.,blood2005,106,4057-4065；leblanc,k.etal.,lancet2008,371,1579-1586)，例如pd-l1表達的案例。以對人類間葉干細胞治療不同免疫相關(guān)疾病之臨床反應為基礎(chǔ)，顯示人類間葉干細胞可發(fā)揮強力免疫調(diào)節(jié)效果(leblanc,k.etal.,nat.rev.immunol.2012,12,383-396)，但于小鼠研究中并不總是如此(eliopoulos,n.etal.,blood2005,106,4057-4065)。因此，為探究人類間葉干細胞治療應用之機轉(zhuǎn)，仍然必須以人類間葉干細胞進行體外試驗。

綜上所述，該等發(fā)現(xiàn)證實人類間葉干細胞系抑制th17反應，且需要分泌因子il-25及由il-25正向調(diào)控之表面pd-l1兩者。jnk及stat3之下游訊號途徑系涉及pd-l1之il-25調(diào)控作用，其中stat3系牽涉到pd-l1之轉(zhuǎn)錄控制。于th17細胞在自體免疫及慢性炎癥中已知角色之外，近來研究亦顯示th17細胞于增進檢查點免疫療法(checkpointimmunotherapy)效果的重要性(lutz,e.r.etal.,cancerimmunol.res.2014,2,616-631)。因此，il-25之調(diào)整可能具有強烈的臨床關(guān)連性，因為此細胞介素可調(diào)控pd-l1/pd-1交互作用以及th17細胞。該等發(fā)現(xiàn)提供了人類間葉干細胞及th17細胞之間交互關(guān)系之較佳理解，以及強調(diào)了該il-25/stat3/pd-l1序列軸可作為相關(guān)疾病之治療標的候選者。