本發(fā)明涉及一種將以人為代表的宿主細(xì)胞的生物分子作為靶標(biāo)的抗流感病毒劑、以及對該抗流感病毒劑的候選分子進(jìn)行篩選的方法。本申請基于2014年9月22日提出的日本申請?zhí)卦?014-192752號要求優(yōu)先權(quán)，在此援引其內(nèi)容。
背景技術(shù)：
：流感病毒每年都引發(fā)疫病，有時會引發(fā)導(dǎo)致幾百萬人傷亡的大流行流感(pandemic)。因此，要求開發(fā)更有效的抗流感病毒劑。作為抗流感病毒劑的靶分子，優(yōu)選相比于病毒蛋白質(zhì)，有助于病毒的感染、復(fù)制的宿主細(xì)胞的生物分子。這是因為，對宿主細(xì)胞的生物分子而言，相比于病毒蛋白，難以產(chǎn)生因藥劑的選擇壓力而導(dǎo)致的變異。近年來，通過6個全基因組篩選，鑒定了被認(rèn)為在流感病毒的生命周期中發(fā)揮著某種作用的總計為1449個人類基因(包含110個果蠅(drosophila)基因的人類同源基因。)(參見非專利文獻(xiàn)1～6。)。各全基因組篩選的結(jié)果分別是僅有一部分一致，但推測是因為實驗條件不同而造成的?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1：brass，etal.，cell，2009，vol.139，p.1243～1254；非專利文獻(xiàn)2：hao，etal.，nature，2008，vol.454，p.890～893；非專利文獻(xiàn)3：karlas，etal.，nature，2010，vol.463，p.818～822；非專利文獻(xiàn)4：konig，etal.，nature，2010，vol.463，p.813～817；非專利文獻(xiàn)5：shapira，etal.，cell，2009，vol.139，p.1255～1267；非專利文獻(xiàn)6：sui，etal.，virology，2009，vol.387，p.473～481；非專利文獻(xiàn)7：neumann，etal.，proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica，1999，vol.96，p.9345～9350；非專利文獻(xiàn)8：tobita，etal.，medicalmicrobiologyandimmunology，1975，vol.162，p.9～14；非專利文獻(xiàn)9：ozawaetal.,journalofgeneralvirology，2011，vol.92，p.2879～2888；非專利文獻(xiàn)10：octavianietal.，journalofvirology，2010，vol.84，p.10918～10922；非專利文獻(xiàn)11：kawakamietal.，journalofvirologicalmethods，2011，vol.173，p.1～6；非專利文獻(xiàn)12：wishartetal.，nucleicacidsresearch，2006，vol.34，p.d668～672；非專利文獻(xiàn)13：pattersonetal.，journalofgeneralvirology，1979，vol.43，p.223～229；非專利文獻(xiàn)14：widjajaetal.，journalofvirology，2010，vol.84，p.9625～9631；非專利文獻(xiàn)15：nodaetal.，nature，2006，vol.439，p.490～492。技術(shù)實現(xiàn)要素：發(fā)明所要解決的問題通過幾個全基因組篩選，與流感病毒的復(fù)制等有關(guān)的宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)被確定。然而，這些蛋白質(zhì)如何影響流感感染癥還尚未明確，是否能成為新的抗流感病毒劑的候選分子還不明確。本發(fā)明的主要目的在于提供一種抗流感病毒劑，該抗流感病毒劑以作為以人為代表的宿主細(xì)胞內(nèi)的生物分子的、參與流感病毒的生命周期的蛋白質(zhì)為靶標(biāo)，本發(fā)明的目的還在于提供一種新的抗流感病毒劑的候選分子的篩選方法。解決問題的技術(shù)方案本發(fā)明人等進(jìn)行了精心的研究，其結(jié)果是，通過利用來自人胚腎的hek293細(xì)胞的細(xì)胞溶解液的免疫沉降法，對與流感病毒蛋白質(zhì)具有相互作用的1292個人類蛋白質(zhì)進(jìn)行確定，然后，利用rna干涉，從這些人類蛋白質(zhì)中，確定出抑制其表達(dá)量時不會顯著損害宿主細(xì)胞的增殖性、而使流感病毒的增殖被顯著抑制的蛋白質(zhì)，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明的抗流感病毒劑以及抗流感病毒劑的篩選方法為下述[1]～[10]。[1]一種抗流感病毒劑，其特征在于，具有抑制對蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的基因的表達(dá)的作用、或者抑制所述蛋白質(zhì)的功能的作用，所述蛋白質(zhì)參與宿主細(xì)胞內(nèi)的流感病毒的vrna或np蛋白質(zhì)向流感病毒樣顆粒中的進(jìn)入，所述基因是選自由jak1基因、cherp基因、ddx21基因、dnajc11基因、eef1a2基因、hnrnpk基因、itm2b基因、mrcl3基因、myh10基因、ndufs8基因、psmd13基因、rpl26基因、sdf2l1基因、sdf4基因、sfrs2b基因、snrpc基因、sqstm1基因、taf15基因、tomm40基因、trm2b基因、usp9x基因、basp1基因、thoc2基因、ppp6c基因、tesc基因以及pcdhb12基因所組成的組中的一種以上。[2]如所述[1]中的抗流感病毒劑，所述基因為jak1基因或usp9x基因。[3]如所述[1]中的抗流感病毒劑，所述抗流感病毒劑是選自由魯索利替尼(ruxolitinib)、托法替尼(tofacitinib)、托法替尼(tofacitinib)(cp-690550)檸檬酸鹽(citrate)、酪氨酸磷酸化抑制劑(tyrphostin)b42(ag-490)、巴瑞克替尼(baricitinib)(ly3009104、incb028050)、at9283、莫米洛替尼(momelotinib)、cep33779、nvp-bsk805、zm39923、非哥替尼(filgotinib)、janex-1、nvp-bsk805、sb1317以及wp1130所組成的組中的一種以上。[4]一種抗流感病毒劑，其特征在于，具有抑制對蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的基因的表達(dá)的作用、或者抑制所述蛋白質(zhì)的功能的作用，所述蛋白質(zhì)參與宿主細(xì)胞內(nèi)的流感病毒的復(fù)制或轉(zhuǎn)錄，所述基因是選自由ccdc56基因、cltc基因、cyc1基因、nibp基因、zc3h15基因、c14orf173基因、anp32b基因、bag3基因、brd8基因、ccdc135基因、ddx55基因、dpm3基因、eef2基因、igf2bp2基因、krt14基因以及s100a4基因所組成的組中的一種以上。[5]一種抗流感病毒劑，其特征在于，具有抑制對蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的基因的表達(dá)的作用、或者抑制所述蛋白質(zhì)的功能的作用，所述蛋白質(zhì)參與宿主細(xì)胞內(nèi)的流感病毒樣顆粒的形成，所述基因是選自由gbf1基因、ascc3l1基因、brd8基因、c19orf43基因、ddx55基因、dkfzp564k142基因、dpm3基因、eef2基因、fam73b基因、flj20303基因、ncln基因、c14orf173基因、lrpprc基因以及rcn1基因所組成的組中的一種以上。[6]如所述[5]中的抗流感病毒劑，所述基因為gbf1基因。[7]如所述[5]中的抗流感病毒劑，所述抗流感病毒劑為golgicidea。[8]一種抗流感病毒劑的篩選方法，其是對抗流感病毒劑的候選化合物進(jìn)行篩選的方法，其特征在于，將對選自由jak1基因、cherp基因、ddx21基因、dnajc11基因、eef1a2基因、hnrnpk基因、itm2b基因、mrcl3基因、myh10基因、ndufs8基因、psmd13基因、rpl26基因、sdf2l1基因、sdf4基因、sfrs2b基因、snrpc基因、sqstm1基因、taf15基因、tomm40基因、trm2b基因、usp9x基因、basp1基因、thoc2基因、ppp6c基因、tesc基因、pcdhb12基因、ccdc56基因、cltc基因、cyc1基因、nibp基因、zc3h15基因、c14orf173基因、anp32b基因、bag3基因、brd8基因、ccdc135基因、ddx55基因、dpm3基因、eef2基因、igf2bp2基因、krt14基因、s100a4基因、gbf1基因、ascc3l1基因、c19orf43基因、dkfzp564k142基因、fam73b基因、flj20303基因、ncln基因、lrpprc基因以及rcn1基因所組成的組中的一種以上的基因的表達(dá)或所述基因所編碼的蛋白質(zhì)的功能具有抑制或阻斷能力的化合物作為抗流感病毒劑的候選化合物來進(jìn)行篩選。[9]如所述[8]中的抗流感病毒劑的篩選方法，包括：導(dǎo)入工序，在細(xì)胞中導(dǎo)入作為評價是否為抗流感病毒劑的候選化合物的對象的化合物；測定工序，對導(dǎo)入了所述化合物的細(xì)胞中的所述基因的表達(dá)量進(jìn)行測定；選擇工序，在所述基因的表達(dá)量與導(dǎo)入所述化合物前的細(xì)胞相比明顯下降的情況下，選擇該化合物作為抗流感病毒劑的候選化合物。[10]如所述[8]中的抗流感病毒劑的篩選方法，所述基因所編碼的蛋白質(zhì)是酶，所述篩選方法包括：測定工序，在作為評價是否為抗流感病毒劑的候選化合物的對象的化合物的存在下，對所述基因所編碼的蛋白質(zhì)的酶活性進(jìn)行測定；選擇工序，在所述化合物的存在下的所述蛋白質(zhì)的酶活性與未存在所述化合物時相比下降時，選擇該化合物作為抗流感病毒劑的候選化合物。發(fā)明效果本發(fā)明的抗流感病毒劑不是構(gòu)成流感病毒的物質(zhì)，而是以宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)為靶標(biāo)，因此，具有難以產(chǎn)生因藥劑的選擇壓力而導(dǎo)致的變異的優(yōu)點。另外，本發(fā)明的抗流感病毒劑的篩選方法能夠篩選出以參與流感病毒的感染、復(fù)制的宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)為靶標(biāo)的抗流感病毒劑的候選分子，因此，適用于新的抗流感病毒劑的設(shè)計和制造。附圖說明圖1是表示在實施例2中用golgicidea處理的細(xì)胞的病毒效價(log10(pfu/ml))與細(xì)胞存活率(％)的測定結(jié)果的圖。圖2是表示在實施例2中用魯索利替尼處理的細(xì)胞的病毒效價(log10(pfu/ml))與細(xì)胞存活率(％)的測定結(jié)果的圖。圖3是實施例3中的導(dǎo)入了對照sirna的細(xì)胞(上方)、以及導(dǎo)入了jak1基因的sirna的細(xì)胞(下方)的電子顯微鏡照片。具體實施方式＜抗流感病毒劑＞本發(fā)明的抗流感病毒劑是與流感病毒蛋白質(zhì)進(jìn)行相互作用的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)，具有抑制對下述蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的基因(以下，有時稱作“抗flu基因”。)的表達(dá)的作用、或者抑制該蛋白質(zhì)的功能的作用，所述蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)被抑制的情況下不會過度損害宿主細(xì)胞的增殖性，而流感病毒的復(fù)制被抑制。作為抗flu基因，具體而言，可舉出jak1基因、cherp基因、ddx21基因、dnajc11基因、eef1a2基因、hnrnpk基因、itm2b基因、mrcl3基因、myh10基因、ndufs8基因、psmd13基因、rpl26基因、sdf2l1基因、sdf4基因、sfrs2b基因、snrpc基因、sqstm1基因、taf15基因、tomm40基因、trm2b基因、usp9x基因、basp1基因、thoc2基因、ppp6c基因、tesc基因、pcdhb12基因、ccdc56基因、cltc基因、cyc1基因、nibp基因、zc3h15基因、c14orf173基因、anp32b基因、bag3基因、brd8基因、ccdc135基因、ddx55基因、dpm3基因、eef2基因、igf2bp2基因、krt14基因、s100a4基因、ascc3l1基因、c19orf43基因、dkfzp564k142基因、fam73b基因、flj20303基因、gbf1基因、ncln基因、lrpprc基因或rcn1基因。如后述實施例所示，這些抗flu基因所編碼的蛋白質(zhì)是與11種流感病毒蛋白質(zhì)(pb2、pb1、pa、ha、np、na、m1、m2、ns1、ns2以及pb1-f2)直接或間接結(jié)合的蛋白質(zhì)，兩者的相互作用在流感病毒的生命周期中發(fā)揮重要作用。在本發(fā)明的抗flu基因中，jak1基因、cherp基因、ddx21基因、dnajc11基因、eef1a2基因、hnrnpk基因、itm2b基因、mrcl3基因、myh10基因、ndufs8基因、psmd13基因、rpl26基因、sdf2l1基因、sdf4基因、sfrs2b基因、snrpc基因、sqstm1基因、taf15基因、tomm40基因、trm2b基因、usp9x基因、basp1基因、thoc2基因、ppp6c基因、tesc基因以及pcdhb12基因是對參與宿主細(xì)胞內(nèi)的流感病毒的vrna或np蛋白質(zhì)向流感病毒樣顆粒中進(jìn)入的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的基因。因此，通過將具有抑制所述基因的表達(dá)的作用、或者具有抑制所述基因所編碼的蛋白質(zhì)的功能的作用的物質(zhì)給藥宿主細(xì)胞中，從而在宿主細(xì)胞內(nèi)抑制vrna或np蛋白質(zhì)進(jìn)入流感病毒樣顆粒中，其結(jié)果，發(fā)揮抗流感病毒效果(流感病毒的復(fù)制阻斷效果)。在本發(fā)明的抗flu基因中，ccdc56基因、cltc基因、cyc1基因、nibp基因、zc3h15基因、c14orf173基因、anp32b基因、bag3基因、brd8基因、ccdc135基因、ddx55基因、dpm3基因、eef2基因、igf2bp2基因、krt14基因以及s100a4基因?qū)⑴c宿主細(xì)胞內(nèi)的流感病毒的復(fù)制或轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼。因此，通過將具有抑制所述基因的表達(dá)的作用、或者抑制所述基因所編碼的蛋白質(zhì)的功能的作用的物質(zhì)給藥宿主細(xì)胞，從而在宿主細(xì)胞內(nèi)使流感病毒的復(fù)制或轉(zhuǎn)錄被抑制，其結(jié)果，發(fā)揮出抗流感病毒效果。本發(fā)明的抗flu基因中，ascc3l1基因、brd8基因、c19orf43基因、ddx55基因、dkfzp564k142基因、dpm3基因、eef2基因、fam73b基因、flj20303基因、gbf1基因、ncln基因、c14orf173基因、lrpprc基因以及rcn1基因?qū)⑴c宿主細(xì)胞內(nèi)的流感病毒樣顆粒的形成的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼。因此，通過將具有抑制所述基因的表達(dá)的作用、或者具有抑制所述基因所編碼的蛋白質(zhì)的功能的作用的物質(zhì)給藥宿主細(xì)胞，從而在宿主細(xì)胞內(nèi)使流感病毒樣顆粒的形成被抑制，其結(jié)果，發(fā)揮出抗流感病毒效果。作為本發(fā)明的抗流感病毒劑，可舉出以具有抑制本發(fā)明的抗flu基因的表達(dá)的作用的物質(zhì)為有效成分的藥劑。作為具有抑制抗flu基因的表達(dá)的作用的物質(zhì)，例如，可舉出具有由抗flu基因的cdna的部分區(qū)域(rnai(rna干涉)靶區(qū)域)的正義鏈與反義鏈構(gòu)成的雙鏈結(jié)構(gòu)的sirna(小干擾rna(smallinterferingrna))、shrna(短發(fā)夾rna(shorthairpinrna))或mirna(小分子rna(microrna))。另外，宿主細(xì)胞內(nèi)，可以是能夠使sirna等產(chǎn)生的rnai誘導(dǎo)載體。對sirna、shrna、mirna以及rnai誘導(dǎo)載體的制備而言，其能夠根據(jù)作為靶標(biāo)的抗flu基因的cdna的堿基序列信息，通過常規(guī)方法來設(shè)計制備。另外，rnai誘導(dǎo)載體也能夠通過在市售的各種rnai載體的堿基序列中插入rnai靶區(qū)域的堿基序列來制備。作為本發(fā)明的抗流感病毒劑，可舉出以下述物質(zhì)為有效成分的藥劑，該物質(zhì)具有抑制本發(fā)明的抗flu基因所編碼的蛋白質(zhì)的功能(以下，有時簡稱為“本發(fā)明的抗flu基因的功能”。)的作用。作為具有抑制抗flu基因的功能的作用的物質(zhì)，可舉出如針對本發(fā)明的抗flu基因所編碼的蛋白質(zhì)(以下，有時簡稱為“本發(fā)明的抗flu蛋白質(zhì)”。)的抗體那樣的、通過與本發(fā)明的抗flu蛋白質(zhì)結(jié)合而抑制該蛋白質(zhì)的功能的物質(zhì)。作為該抗體，可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體。另外，還可以是嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體等人工合成的抗體。這些抗體能夠通過常規(guī)方法進(jìn)行制造。本發(fā)明的抗flu蛋白質(zhì)是酶時，作為具有抑制抗flu基因的功能的作用的物質(zhì)，可以是針對該酶的阻斷劑。作為本發(fā)明的抗流感病毒劑，可以是具有抑制一種抗flu基因的表達(dá)、功能的作用的抗流感病毒劑，也可以是具有抑制兩種以上的抗flu基因的表達(dá)、功能的作用的抗流感病毒劑。作為本發(fā)明的抗流感病毒劑，優(yōu)選具有抑制選自由jak1基因、gbf1基因以及usp9x基因所組成的組中的一種以上的抗flu基因的表達(dá)、功能的作用的抗流感病毒劑，更優(yōu)選具有抑制選自由jak1基因及gbf1基因所組成的組中的一種以上的抗flu基因的表達(dá)、功能的作用的抗流感病毒劑，進(jìn)一步優(yōu)選具有抑制jak1基因的表達(dá)、功能的作用的抗流感病毒劑。作為具有抑制jak1基因的功能的作用的物質(zhì)，可舉出魯索利替尼(casno.：941678-49-5)、托法替尼(casno.：477600-75-2)等jak阻斷劑。魯索利替尼獲準(zhǔn)用作骨髓纖維化癥的治療藥，托法替尼獲準(zhǔn)用作風(fēng)濕藥，對人體而言，它們是能相對安全地使用的物質(zhì)。另外，作為具有抑制gbf1基因的功能的作用的物質(zhì)，可舉出golgicidea(casno.：1005036-73-6)。對golgicidea而言，通過適當(dāng)?shù)卦O(shè)定給藥濃度，能夠抑制流感病毒的增殖，而不會影響宿主細(xì)胞的增殖。除此以外，托法替尼(cp-690550)檸檬酸鹽(3-((3r,4r)-4-甲基-3-(甲基(7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)哌啶-1-基)-3-氧代丙腈)、酪氨酸磷酸化抑制劑b42(ag-490)((e)-n-芐基-2-氰基-3-(3,4-二羥基苯基)丙烯酰胺)、巴瑞克替尼(ly3009104，incb028050)(2-[1-乙基磺?；?3-[4-(7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)吡唑-1-基]氮雜環(huán)丁烷-3-基]乙腈)、at9283(1-環(huán)丙基-3-(3-(5-(嗎啉甲基)-1h-苯并[d]咪唑-2-基)-1h-吡唑-4-基)脲)、莫米洛替尼(cyt387)(n-(氰基甲基)-4-(2-(4-嗎啉基苯基氨基)嘧啶-4-基)苯甲酰胺)、cep33779([1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-胺，n-[3-(4-甲基-1-哌嗪基)苯基]-8-[4-(甲基磺?；?苯基]-)、nvp-bsk805(8-(3,5-二氟代-4-(嗎啉代甲基)苯基)-2-(1-(哌啶-4-基)-1h-吡唑-4-基)喹喔啉)、zm39923(1-丙酮,3-[(1-甲基乙基)(苯甲基)氨基]-1-(2-萘基)-,鹽酸鹽(1:1))、非哥替尼(glpg0634)(n-[5-[4-[(1,1-二氧代-4-硫代嗎啉基)甲基]苯基][1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基]環(huán)丙烷甲酰胺)、janex-1(4-[(6,7-二甲氧基-4-喹唑啉)氨基]-苯酚)、nvp-bsk805(4-[[2,6-二氟-4-[3-(1-哌啶-4-基吡唑-4-基)喹喔啉-5-基]苯基]甲基]嗎啉；二鹽酸鹽)、sb1317(20-氧雜-5,7,14,27-四氮雜四環(huán)[19.3.1.12,6.18,12]二十七烷-1(25),2,4,6(27),8,10,12(26),16,21,23-十烯,14-甲基-)等jak阻斷劑也被用作本發(fā)明的抗流感病毒劑。另外，作為具有抑制usp9x基因的功能的作用的物質(zhì)，可舉出作為dub阻斷劑的wp1130(degrasyn)((2e)-3-(6-溴-2-吡啶基)-2-氰基-n-[1s-苯基丁基]-2-丙烯酰胺)。將具有抑制本發(fā)明的抗flu基因的表達(dá)的作用的物質(zhì)作為有效成分時，作為本發(fā)明的抗流感病毒劑，優(yōu)選能使抗flu基因的表達(dá)量相比于不存在該抗流感病毒劑時降低50％以上的抗流感病毒劑，更優(yōu)選能使所述表達(dá)量降低75％以上的抗流感病毒劑，進(jìn)一步優(yōu)選能使所述表達(dá)量降低80％以上的抗流感病毒劑。同樣地，將具有抑制抗flu基因的功能的作用的物質(zhì)作為有效成分時，作為本發(fā)明的抗流感病毒劑，優(yōu)選能使抗flu基因的功能相比于不存在該抗流感病毒劑時降低50％以上的抗流感病毒劑，更優(yōu)選能夠降低75％以上的抗流感病毒劑，進(jìn)一步優(yōu)選能夠降低80％以上的抗流感病毒劑。本發(fā)明的抗流感病毒劑能夠用于對動物進(jìn)行流感病毒的感染預(yù)防、對感染了流感病毒的動物的治療中。作為用于對流感病毒進(jìn)行感染預(yù)防或治療流感時被給藥本發(fā)明的抗流感病毒劑的動物，例如，可舉出人、猴、豬、馬、狗、貓、虎等哺乳類；雞、家鴨、鵪鶉、鵝、野鴨、火雞、虎皮鸚鵡、鸚鵡、鴛鴦、天鵝等鳥類。作為本發(fā)明的抗流感病毒劑，優(yōu)選用于對人進(jìn)行流感病毒的感染預(yù)防、對感染了流感病毒的動物進(jìn)行治療的抗流感病毒劑。對于感染了流感病毒的動物或有必要進(jìn)行預(yù)防流感病毒感染的動物，通過給藥有效量的本發(fā)明的抗流感病毒劑，能夠進(jìn)行流感的治療。對抗流感病毒劑的有效量而言，可以是對于已給藥的動物而言，相比于未給藥的情況，能使體內(nèi)的流感病毒的量降低的量，或者是能夠防止流感病毒的感染的量，優(yōu)選不會因該抗流感病毒劑而產(chǎn)生嚴(yán)重副作用的量。對于各抗流感病毒劑的有效量而言，能夠考慮抗流感病毒劑的種類、作為給藥對象的動物的種類、給藥方法等以實驗的方式求出。例如，在對感染了流感病毒的實驗動物給藥的情況下，將與未給藥的實驗動物相比，能夠使以pfu計的該實驗動物的體內(nèi)的流感病毒量成為70％以下、優(yōu)選成為80％以下、更優(yōu)選成為90％以下的量規(guī)定為有效量。本發(fā)明的抗流感病毒劑能夠通過常規(guī)方法進(jìn)行制劑化而成為適于口服給藥、靜脈注射、對鼻腔或口腔直接給藥、經(jīng)皮給藥等各種給藥形式的劑型。作為該劑型，可舉出片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊劑、咀嚼片劑、糖漿劑、溶液劑、懸浮液劑、注射劑、含漱劑、噴霧劑、貼劑、軟膏劑等。本發(fā)明的抗流感病毒劑除了包含具有抑制抗flu基因的表達(dá)、功能的作用的物質(zhì)以外，還可以包含各種添加劑。作為該添加劑，可舉出賦形劑、粘合劑、潤滑劑、潤濕劑、溶劑、崩解劑、增溶劑、懸浮劑、乳化劑、等滲劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、防腐劑、抗氧化劑、調(diào)味劑、著色劑等。作為所述添加劑，是藥學(xué)上可接受的物質(zhì)，能夠適當(dāng)?shù)貜挠糜谒幬锏闹苿┗奈镔|(zhì)中選擇而使用。＜抗流感病毒劑的篩選方法＞本發(fā)明的抗流感病毒劑的篩選方法(以下，有時也稱作“本發(fā)明的篩選方法”。)是對抗流感病毒劑的候選化合物進(jìn)行篩選的方法，其特征在于，篩選對本發(fā)明的抗flu基因的表達(dá)或功能具有抑制或阻斷能力的候選化合物，作為抗流感病毒劑的候選化合物。在本發(fā)明的篩選方法中，可以是篩選對一種抗flu基因的表達(dá)或功能具有抑制或阻斷能力的物質(zhì)的方法，也可以是篩選對兩種以上的抗flu基因的表達(dá)或功能具有抑制或阻斷能力的物質(zhì)的方法。具體而言，對抗flu基因的表達(dá)具有抑制能力或阻斷能力的物質(zhì)的篩選是，首先，在細(xì)胞中導(dǎo)入作為評價是否為抗流感病毒劑的候選化合物的對象的化合物，檢測抗flu基因的表達(dá)是否被抑制。當(dāng)抗flu基因的表達(dá)被明顯抑制時，選擇該化合物作為抗流感病毒劑的候選化合物。即，通過下述工序來進(jìn)行篩選：導(dǎo)入工序，在細(xì)胞中導(dǎo)入作為評價是否為抗流感病毒劑的候選化合物的對象的化合物；測定工序，對導(dǎo)入了所述化合物的細(xì)胞中的抗flu基因的表達(dá)量進(jìn)行測定；選擇工序，當(dāng)所述抗flu基因的表達(dá)量與導(dǎo)入所述化合物之前的細(xì)胞中的該抗flu基因的表達(dá)量相比顯著下降時，選擇該化合物作為抗流感病毒劑的候選化合物。對于用于篩選的細(xì)胞而言，優(yōu)選作為流感病毒的宿主的生物物種的細(xì)胞，從處理的方便性考慮，更優(yōu)選哺乳類、鳥類的培養(yǎng)細(xì)胞株，進(jìn)一步優(yōu)選人的培養(yǎng)細(xì)胞株。另外，對作為評價對象的化合物而言，能夠采用電穿孔法、脂質(zhì)體法、磷酸鈣法等導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)作為評價對象的化合物為低分子化合物時，通過將該化合物添加于培養(yǎng)液中，能夠?qū)⒃摶衔飳?dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。對于抗flu基因的表達(dá)量的變化而言，可以通過mrna水平進(jìn)行評價，也可以通過蛋白質(zhì)水平進(jìn)行評價。例如，能夠采用rt-pcr法等的核酸擴(kuò)增反應(yīng)，或者通過免疫組織化學(xué)法、蛋白質(zhì)免疫印跡(westernblot)法，定量地比較抗flu基因的表達(dá)量。具體而言，例如，從在導(dǎo)入了作為評價對象的化合物的狀態(tài)下培養(yǎng)了1～2天的細(xì)胞中提取rna，通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，由該rna合成cdna，以該cdna為模板進(jìn)行pcr，對抗flu基因的cdna的全長或一部分進(jìn)行擴(kuò)增。當(dāng)?shù)玫降臄U(kuò)增產(chǎn)物量與由導(dǎo)入該化合物之前的細(xì)胞以同樣的方式得到的擴(kuò)增產(chǎn)物量相比顯著減少時，評價為該化合物對抗flu基因的表達(dá)具有抑制能力或阻斷能力。另外，例如，針對在導(dǎo)入了作為評價對象的化合物的狀態(tài)下培養(yǎng)了1～2天的細(xì)胞與導(dǎo)入該化合物前的細(xì)胞，使用經(jīng)熒光標(biāo)記的抗體對細(xì)胞內(nèi)的抗flu蛋白質(zhì)進(jìn)行染色，對比各細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。當(dāng)導(dǎo)入了該化合物的細(xì)胞中的各細(xì)胞的熒光強(qiáng)度與未導(dǎo)入該化合物的細(xì)胞相比顯著小時，則評價為該化合物對抗flu基因的表達(dá)具有抑制或阻斷能力。另外，例如，對在導(dǎo)入了作為評價對象的化合物的狀態(tài)下培養(yǎng)了1～2天的細(xì)胞與導(dǎo)入該化合物之前的細(xì)胞的細(xì)胞提取液(裂解液)進(jìn)行電泳并分離，然后轉(zhuǎn)印至膜，使用經(jīng)熒光標(biāo)記的抗體對該膜上的抗flu蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行染色，對比條帶的熒光強(qiáng)度。當(dāng)來自于導(dǎo)入了該化合物的細(xì)胞的抗flu蛋白質(zhì)條帶的熒光強(qiáng)度與未導(dǎo)入該化合物的細(xì)胞相比顯著小時，評價為該化合物對抗flu基因的表達(dá)具有抑制或阻斷能力。當(dāng)抗flu蛋白質(zhì)的功能是與特定生物分子的相互作用時，例如，在作為評價對象的化合物的存在下以及未存在下，進(jìn)行抗flu蛋白質(zhì)與該特定生物分子的結(jié)合分析測試，相比于未存在下，在作為評價對象的化合物的存在下，兩者的結(jié)合性降低時，評價為該化合物對抗flu基因的功能具有抑制或阻斷能力。另外，當(dāng)抗flu蛋白質(zhì)是酶時，例如，在作為評價對象的化合物的存在下以及未存在下，對抗flu蛋白質(zhì)的酶活性進(jìn)行測定，與未存在下相比，在作為評價對象的化合物的存在下，抗flu蛋白質(zhì)的酶活性降低時，評價為該化合物對抗flu基因的功能具有抑制或阻斷能力。實施例下面，通過實施例等進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受這些實施例的限定。＜細(xì)胞的培養(yǎng)＞在下述的實施例中，使用含有10％fcs(胎牛血清)以及抗生素的dmem培養(yǎng)基(西格瑪奧德里奇公司(シグマアルドリッチ社)制)，在5％二氧化碳環(huán)境下，在37℃溫度培養(yǎng)hek293細(xì)胞及a549細(xì)胞(來自于人肺上皮細(xì)胞)。使用含5％ncs(新生胎牛血清)伊格爾最小必需培養(yǎng)基(eagle'smem)(gibco公司制)，在5％二氧化碳環(huán)境下，在37℃溫度培養(yǎng)mdck(犬腎上皮細(xì)胞系(madin-darbycaninekidney))細(xì)胞。＜流感病毒＞對于下述實施例中使用的流感病毒而言，只要沒有特別的記載，就使用a型流感病毒(a/wsn/33，h1n1亞型；wsn)。該病毒是適應(yīng)于小鼠的人源流感病毒，是通過利用反向遺傳學(xué)的方法(參見非專利文獻(xiàn)7。)制成的流感病毒，使其在mdck細(xì)胞中進(jìn)行增殖。另外，通過使用mdck細(xì)胞的空斑測試(plaqueassay)對病毒的效價進(jìn)行測定(參見非專利文獻(xiàn)8。)。pb2-ko/rluc病毒(具有螢火蟲熒光素酶基因的pb2敲除的病毒)是缺失復(fù)制能力的病毒，在聚合酶pb2蛋白質(zhì)的編碼區(qū)域具有編碼海腎熒光素酶(renillaluciferase)的報告基因。pb2-ko/rluc病毒由ppolipb2(120)rluc(120)(對被來自于pb2片段的n末端及c末端的120個堿基夾持的海腎熒光素酶基因進(jìn)行編碼的質(zhì)粒)、以及對七個病毒rna片段進(jìn)行編碼的質(zhì)粒來進(jìn)行制備。對于pb2-ko/rluc病毒的增殖與效價的測定而言，在恒定地表達(dá)pb2蛋白質(zhì)的mdck細(xì)胞中進(jìn)行(參見非專利文獻(xiàn)9。)。＜抗體＞用于下述實施例的小鼠抗ha抗體(ws3-54)、小鼠抗na抗體(ws5-29)、以及小鼠抗m1抗體(ws-27/52)使用由國立感染癥研究所的高下惠美主任研究員提供的抗體。小鼠抗aichinp抗體(2s-347/3)以及兔抗wsn病毒抗體(r309)使用發(fā)明人等通過常規(guī)方法制備的抗體。抗β-肌動蛋白(β-actin)(ac-74)抗體使用由西格瑪奧德里奇(シグマアルドリッチ)公司購買的抗體。[實施例1]＜與流感病毒蛋白質(zhì)進(jìn)行相互作用的宿主蛋白質(zhì)的鑒定＞本發(fā)明人等首先通過免疫沉降法，對與流感病毒蛋白質(zhì)進(jìn)行相互作用的宿主蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。具體而言，首先，對于11種流感病毒蛋白質(zhì)(pb2、pb1、pa、ha、np、na、m1、m2、ns1、ns2以及pb1-f2)，分別使flag標(biāo)簽融合于n末端或c末端從而制成flag融合蛋白質(zhì)，將對該融合蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至hek293細(xì)胞。使用transit293試劑(mirusbiocorp制造)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)了24小時的細(xì)胞混合于細(xì)胞溶解緩沖液(50mmtris-hcl(ph7.5)，150mmnacl,1mmedta,0.5％nonidetp-40,蛋白酶抑制劑混合物(proteaseinhibitormixture)completemini(roche，mannheim，germany))中，在4℃溫度進(jìn)行1小時孵育，從而進(jìn)行溶解，得到裂解液。將得到的裂解液進(jìn)行離心分離處理，于回收的上清液中混合已結(jié)合抗flag抗體的親和凝膠(anti-flagm2affinitygel，西格瑪奧德里奇公司制造)，在4℃溫度孵育18小時。然后，用細(xì)胞溶解緩沖液將親和凝膠清洗3次，接著用ip(免疫沉降)緩沖液(50mmtris-hcl(ph7.5),150mmnacl,1mmedta)清洗2次，然后，用含有0.5mg/ml的flag肽(f1804，西格瑪奧德里奇公司制)的ip緩沖液在4℃溫度攪拌2小時。然后，通過離心分離處理去除親和凝膠，回收上清液。將回收的上清液用ultrafree-mc過濾器(ultrafree-mcfilter)(密里博公司(ミリポア社)制)進(jìn)行過濾后，通過nanolc-ms/ms(納流液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(nanoflowliquidchromatographytandemmassspectrometry))分析，對所含的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。在質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的解析中，使用組合了dina(kya科技公司(ケーワイエーテクノロジーズ社)制)的q-starelite(美國應(yīng)用公司(エービー·サイエックス社)制)。將得到的ms/ms信號與refseq(美國國家生物技術(shù)信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation)人類蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫)進(jìn)行對比，從而對免疫共沉降的hek293細(xì)胞(宿主細(xì)胞)的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。使用mascot算法(版本2.2.04；矩陣科技公司(matrixscience社)制)，在下述條件下進(jìn)行上述對比：可變修飾(variablemodifications)，氧化(oxidation)(met)，n-乙?；?n-acetylation)；最大漏切位點個數(shù)(maximummissedcleavages)，2；肽段質(zhì)量誤差范圍(peptidemasstolerance)，200ppm；串聯(lián)質(zhì)譜誤差(ms/mstolerance)，0.5da.)。蛋白質(zhì)的鑒定的條件是：mascot得分顯著超過閾值的ms/ms信號至少存在一個。其結(jié)果，388個宿主蛋白質(zhì)與pb2蛋白質(zhì)免疫共沉降，322個宿主蛋白質(zhì)與pb1蛋白質(zhì)免疫共沉降，304個宿主蛋白質(zhì)與pa蛋白質(zhì)免疫共沉降，351個宿主蛋白質(zhì)與ha蛋白質(zhì)免疫共沉降，574個宿主蛋白質(zhì)與np蛋白質(zhì)免疫共沉降，675個宿主蛋白質(zhì)與na蛋白質(zhì)免疫共沉降，659個宿主蛋白質(zhì)與m1蛋白質(zhì)免疫共沉降，531個宿主蛋白質(zhì)與m2蛋白質(zhì)免疫共沉降，113個宿主蛋白質(zhì)與ns1蛋白質(zhì)免疫共沉降，42個宿主蛋白質(zhì)與ns2蛋白質(zhì)免疫共沉降，81個宿主蛋白質(zhì)與pb1-f2蛋白質(zhì)免疫共沉降。即，總計為1292個宿主蛋白質(zhì)與11種流感病毒蛋白質(zhì)中的任意種免疫共沉降。＜sirna＞然后，針對編碼通過免疫沉降而鑒定的1292個宿主蛋白質(zhì)的基因，進(jìn)行rna干涉，檢測這些蛋白質(zhì)實際上是否參與流感病毒的增殖。對使用的sirna而言，針對各宿主基因，分別從全基因組人類sirna文庫(humansirnalibrary)(flexitubesirna；凱杰公司(キアゲン社)制)中選擇兩種使用。另外，作為陰性對照，使用allstars陰性對照sirna(allstarsnegativecontrolsirna)(凱杰公司(キアゲン社)制)(對照sirna)。另外，wsn病毒的np基因的sirna(ggaucuuauuucuucggaguu)從西格瑪奧德里奇公司購入。具體而言，首先，使用rnaimax試劑(美國英杰生命技術(shù)公司(invitrogen社)制)，將兩種sirna分別以25nm(最終濃度：50nm)添加于hek293細(xì)胞，進(jìn)行兩次轉(zhuǎn)染。＜細(xì)胞的存活性＞對于sirna的第二次轉(zhuǎn)染后經(jīng)過24小時后的細(xì)胞的存活性，按照附帶的說明書，使用celltiter-glo測試系統(tǒng)(celltiter-gloassaysystem)(普洛麥格公司(プロメガ社)制)進(jìn)行檢測。計算導(dǎo)入了各sirna的細(xì)胞的活細(xì)胞數(shù)目相對于導(dǎo)入了對照sirna的細(xì)胞的活細(xì)胞數(shù)目的比率，作為細(xì)胞存活率(％)。＜qrt-pcr＞針對sirna的轉(zhuǎn)染前的細(xì)胞與轉(zhuǎn)染后經(jīng)過48小時后的細(xì)胞，進(jìn)行qrt-pcr(反轉(zhuǎn)錄定量pcr(quantitativereversetranscription-pcr))，確認(rèn)了是否因sirna而導(dǎo)致靶宿主基因的表達(dá)被抑制。具體而言，首先，與所述＜sirna＞同樣地進(jìn)行操作，將sirna轉(zhuǎn)染至hek293細(xì)胞，將第二次轉(zhuǎn)染后經(jīng)過48小時后的細(xì)胞溶解于所述細(xì)胞溶解緩沖液中，制備裂解液。使用maxwell16levsimplyrna組織試劑盒(maxwell16levsimplyrnatissuekit)(普洛麥格公司(プロメガ社)制)從制備的裂解液中提取總rna，并將其作為模板，使用利用高效反轉(zhuǎn)錄酶revertraace進(jìn)行的實時定量pcr反應(yīng)試劑(revertraaceqpcrrtmastermix)(東洋紡公司制)或superscriptiii反轉(zhuǎn)錄酶(superscriptiiireversetranscriptase)(美國英杰生命技術(shù)公司(invitrogen社)制)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以合成的cdna為模板，使用對各宿主基因具有特異性的引物組與thunderbirdsybr定量pcr試劑(thunderbirdsybrqpcrmix)(東洋紡公司制)進(jìn)行定量pcr。對于各宿主基因的mrna表達(dá)量水平的對比而言，以β-肌動蛋白為內(nèi)源性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，通過δδct法計算。對導(dǎo)入了各sirna的細(xì)胞中的mrna表達(dá)量相對于導(dǎo)入了對照sirna的細(xì)胞中的mrna表達(dá)量的比率進(jìn)行計算，作為沉默率(％)。＜病毒的增殖性＞在兩個24孔培養(yǎng)皿中，與所述＜sirna＞同樣地進(jìn)行操作，將sirna轉(zhuǎn)染至hek293細(xì)胞，使50pfu(plaque-formingunit)的流感病毒感染第二次轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞。病毒感染后經(jīng)過48小時后，回收培養(yǎng)上清液，通過利用mdck細(xì)胞的空斑測試(plaqueassay)，對病毒的效價進(jìn)行檢測。計算出導(dǎo)入了各sirna的細(xì)胞的病毒效價的常用對數(shù)值除以導(dǎo)入了對照sirna的細(xì)胞中的病毒效價的常用對數(shù)值而得到的值，作為病毒效價的變化量。其結(jié)果，在323個宿主基因中，通過sirna的轉(zhuǎn)染，基因表達(dá)水平下降。在該323個基因中，對299個宿主基因而言，流感病毒的效價降低程度以常用對數(shù)值計為2以上(即，病毒效價的變化量為-2以上)，對于24個宿主基因而言，流感病毒的效價升高程度以常用對數(shù)值計為1以上(即，病毒效價的變化量為1以上)。其中，對下述91個宿主基因而言，顯示出雖然宿主細(xì)胞的存活性保持為80％以上，但流感病毒的效價以常用對數(shù)值計的3以上的程度下降，作為抗流感病毒劑的靶標(biāo)很有用：anp32b基因、ap2a2基因、ascc3l1基因、atp5o基因、bag3基因、basp1基因、brd8基因、bub3基因、c14orf173基因、c19orf43基因、caprin1基因、ccdc135基因、ccdc56基因、cherp基因、cirbp基因、cltc基因、cnot1基因、ctnnb1基因、cyc1基因、ddx21基因、ddx55基因、dkfzp564k142基因、dnajc11基因、dpm3基因、eef1a2基因、eef2基因、fam73b基因、flj20303基因、gbf1基因、gemin4基因、hnrnpk基因、iars基因、igf2bp2基因、itga3基因、itgb4bp基因、itm2b基因、jak1基因、kiaa0664基因、krt14基因、lrpprc基因、mrcl3基因、myh10基因、ncapd3基因、ncln基因、ndufa10基因、ndufs8基因、nfia基因、nibp基因、nup160基因、nup205基因、pcdhb12基因、phb基因、ppp6c基因、psma4基因、psma5基因、psmb2基因、psmc1基因、psmc4基因、psmc6基因、psmd11基因、psmd12基因、psmd13基因、psmd14基因、psmd2基因、psmd6基因、rcn1基因、rpl26基因、s100a4基因、samhd1基因、sdf2l1基因、sdf4基因、sf3a2基因、sf3b2基因、sf3b4基因、sfrs10基因、sfrs2b基因、snrp70基因、snrpc基因、snrpd3基因、sqstm1基因、stk38基因、taf15基因、tesc基因、thoc2基因、tomm40基因、trim28基因、uap1基因、usp9x基因、vcp基因、xpo1基因、zc3h15基因。將所述91個宿主基因的病毒效價的變化量、細(xì)胞存活率(％)以及沉默率(％)示于表1～3中。表1表2表3＜對細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成的影響＞對抑制所述91個宿主基因的表達(dá)是否對細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成產(chǎn)生影響進(jìn)行了檢測。具體而言，與所述＜sirna＞同樣地進(jìn)行操作，將sirna轉(zhuǎn)染至hek293細(xì)胞，在第二次轉(zhuǎn)染后經(jīng)過24小時后的細(xì)胞中，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的rna聚合酶ii啟動子(例如，雞β-肌動蛋白啟動子)的控制下，將表達(dá)海腎熒光素酶的質(zhì)粒用作對照。對于轉(zhuǎn)染后經(jīng)過48小時后的細(xì)胞，使用海腎熒光素酶測試系統(tǒng)(renillaluciferaseassaysystem)(普洛麥格公司(プロメガ社)制)，進(jìn)行熒光素酶測定。熒光素酶活性使用glomax-96微孔板發(fā)光檢測儀(glomax-96microplateluminometer)(普洛麥格公司制)進(jìn)行測定。對導(dǎo)入了各sirna的細(xì)胞中的海腎熒光素酶活性相對于導(dǎo)入了對照sirna的細(xì)胞中的海腎熒光素酶活性的比率進(jìn)行了計算，作為細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成效率(％)。將算出的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成效率(％)示于表4中。其結(jié)果是，在所述91個宿主基因中，在導(dǎo)入了28個宿主基因(atp5o基因、cnot1基因、gemin4基因、itgb4bp基因、ncapd3基因、nup160基因、nup205基因、psma4基因、psma5基因、psmb2基因、psmc1基因、psmc4基因、psmd11基因、psmd2基因、psmd6基因、sf3a2基因、sf3b4基因、snrpd3基因、vcp基因、psmc6基因、psmd12基因、psmd14基因、samhd1基因、sf3b2基因、snrp70基因、caprin1基因、phb基因以及sfrs10基因)的sirna的細(xì)胞中，螢火蟲熒光素酶活性與導(dǎo)入了對照sirna的細(xì)胞相比，降低了80％以上(p＜0.05)。該結(jié)果顯示：所述宿主基因參與宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄、翻譯，通過使該宿主基因的表達(dá)降低，流感病毒的轉(zhuǎn)錄、翻譯被抑制，進(jìn)而流感病毒的復(fù)制被阻斷。表4＜微型復(fù)制測試(minirepliconassary)＞通過對流感病毒的rna聚合酶活性進(jìn)行檢測的微型復(fù)制測試(參見非專利文獻(xiàn)10。)，對所述91個宿主基因是否參與病毒基因組復(fù)制及轉(zhuǎn)錄進(jìn)行檢測。更具體而言，微型復(fù)制測試是基于編碼螢火蟲熒光素酶報告蛋白質(zhì)的病毒樣rna的復(fù)制活性對病毒復(fù)制復(fù)合體(含有pb2蛋白質(zhì)、pb1蛋白質(zhì)、pa蛋白質(zhì)以及np蛋白質(zhì)的復(fù)合體)的活性進(jìn)行檢測的測試。具體而言，與所述＜sirna＞同樣地進(jìn)行操作，將sirna轉(zhuǎn)染至hek293細(xì)胞，將用于表達(dá)pa的質(zhì)粒、用于表達(dá)pb1的質(zhì)粒、用于表達(dá)pb2的質(zhì)粒、用于表達(dá)np的質(zhì)粒以及用于表達(dá)編碼螢火蟲熒光素酶的病毒樣rna的質(zhì)粒(ppolinp(0)1uc2(0))轉(zhuǎn)染至第二次轉(zhuǎn)染后經(jīng)過24個小時后的細(xì)胞中。需要說明的是，用于表達(dá)pa、pb1、pb2或np的質(zhì)粒是分別將編碼各蛋白質(zhì)的cdna組合于質(zhì)粒pcaggs的多克隆位點而成的質(zhì)粒。另外，將在宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的rna聚合酶ii啟動子(例如，雞β-肌動蛋白啟動子)的控制下使海腎熒光素酶進(jìn)行表達(dá)的質(zhì)粒用作對照。對于轉(zhuǎn)染后經(jīng)過48小時后的細(xì)胞，使用dual-glo熒光素酶測試系統(tǒng)(dual-gloluciferaseassaysystem)(普洛麥格公司制)進(jìn)行熒光素酶測試。熒光素酶活性是使用glomax-96微孔板發(fā)光檢測儀(glomax-96microplateluminometer)(普洛麥格公司制)進(jìn)行測定。計算病毒rna聚合酶活性，作為利用海腎熒光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化的螢火蟲熒光素酶活性。對導(dǎo)入了各sirna的細(xì)胞的螢火蟲熒光素酶活性相對于導(dǎo)入了對照sirna的細(xì)胞的螢火蟲熒光素酶活性的比率進(jìn)行計算，作為病毒聚合酶活性(％)。該病毒聚合酶活性表示螢火蟲熒光素酶報告蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，作為病毒基因組復(fù)制以及轉(zhuǎn)錄的效率的指標(biāo)。將算出的病毒聚合酶活性(％)示于表5中。其結(jié)果是，在所述91個宿主基因中，對于導(dǎo)入了9個宿主基因(bub3基因、ccdc56基因、cltc基因、cyc1基因、nibp基因、zc3h15基因、c14orf173基因、ctnnb1基因以及anp32b基因)的sirna的細(xì)胞而言，病毒聚合酶活性、即病毒基因組復(fù)制及轉(zhuǎn)錄與導(dǎo)入了對照sirna的細(xì)胞相比降低了50％以上(p＜0.05)。該結(jié)果顯示：所述宿主基因參與病毒基因組復(fù)制及轉(zhuǎn)錄，通過使這些宿主基因的表達(dá)降低，流感病毒的基因組復(fù)制及轉(zhuǎn)錄被抑制。表5＜pb2-ko/rluc病毒測試＞針對所述91個宿主基因，為了對其是否參與病毒的生命周期的初始階段進(jìn)行檢測，因此進(jìn)行了pb2-ko/rluc病毒測試，檢測病毒的侵入效率。具體而言，與所述＜sirna＞同樣地進(jìn)行操作，將sirna轉(zhuǎn)染至hek293細(xì)胞，使pb2-ko/rluc病毒感染第二次轉(zhuǎn)染后經(jīng)過24小時后的細(xì)胞。對于感染后經(jīng)過8小時后的細(xì)胞，使用海腎熒光素酶測試系統(tǒng)(renillaluciferaseassaysystem)(普洛麥格公司制)進(jìn)行熒光素酶測試。熒光是使用glomax-96微孔板發(fā)光檢測儀(glomax-96microplateluminometer)(普洛麥格公司制)進(jìn)行測定。對導(dǎo)入了各sirna的細(xì)胞的海腎熒光素酶活性相對于導(dǎo)入了對照sirna的細(xì)胞的海腎熒光素酶活性的比率進(jìn)行計算，作為病毒的侵入效率(％)。將算出的病毒侵入效率(％)示于表6中。其結(jié)果，在所述91個宿主基因中，對于23個宿主基因(sf3a2基因、gemin4基因、sfrs10基因、bag3基因、caprin1基因、ccdc135基因、igf2bp2基因、krt14基因、atp5o基因、samhd1基因、psmd6基因、brd8基因、psmd11基因、sf3b2基因、sf3b4基因、dpm3基因、ncapd3基因、eef2基因、phb基因、nup205基因、s100a4基因、psmd14基因以及ddx55基因)而言，病毒侵入效率與導(dǎo)入了對照sirna的細(xì)胞相比下降了50％以上(p＜0.05)。該結(jié)果顯示：所述宿主基因參與流感病毒侵入宿主細(xì)胞，通過使所述宿主基因的表達(dá)降低，流感病毒對宿主細(xì)胞的侵入受到阻斷，進(jìn)而流感病毒的復(fù)制受到阻斷。表6另外，可知在所述23個宿主基因中，9個宿主基因(bag3基因、brd8基因、ccdc135基因、ddx55基因、dpm3基因、eef2基因、igf2bp2基因、krt14基因以及s100a4基因)不參與宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄、翻譯，而特異性地參與流感病毒的轉(zhuǎn)錄、翻譯。另外，對所述9個宿主基因而言，在所述微型復(fù)制測試中未能確認(rèn)到流感病毒的復(fù)制的阻斷活性，因此，所述宿主基因在病毒結(jié)合于宿主細(xì)胞表面、進(jìn)入宿主細(xì)胞、vrnp(病毒核糖核酸蛋白質(zhì))復(fù)合體移動至核等的病毒的生命周期的初始階段發(fā)揮重要的作用。＜vlp形成測試＞通過病毒樣顆粒(virus-likeparticle，vlp)形成測試，檢測所述91個宿主基因是否參與病毒顆粒形成。具體而言，與所述＜sirna＞同樣地進(jìn)行操作，將sirna轉(zhuǎn)染至hek293細(xì)胞，在該細(xì)胞中使用transit293轉(zhuǎn)染試劑(transit293transfectionreagent)(mirus社制)，將用于表達(dá)ha的質(zhì)粒、用于表達(dá)na的質(zhì)粒以及用于表達(dá)m1的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。需要說明的是，用于表達(dá)ha、na或m1的質(zhì)粒分別是將編碼各蛋白質(zhì)的cdna組合于質(zhì)粒pcaggs的多克隆位點而成的質(zhì)粒。使用含有100mmdtt的sds樣本緩沖溶液(sdssamplebuffersolution)(和光純藥公司制)，使質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后經(jīng)過48小時后的細(xì)胞進(jìn)行溶解。將得到的裂解液回收，進(jìn)行離心分離處理(3000×g、4℃、5分鐘)，從細(xì)胞殘渣中分離并回收含有vlp的上清液。將得到的上清液施加在注入于超離心用管中的含有30質(zhì)量/容量％蔗糖的pbs(磷酸緩沖生理鹽水)上，進(jìn)行超離心分離處理(50000rpm，4℃，1小時，sw55ti轉(zhuǎn)子)。使得到的沉淀物溶解于含有100mmdtt的sds樣本緩沖溶液(sdssamplebuffersolution)(和光純藥公司制)而制成的溶液作為蛋白質(zhì)免疫印跡(westernblotting)用樣本。將tris-甘氨酸sds樣本緩沖液(tris-glycinesdssamplebuffer)(美國英杰生命技術(shù)公司(invitrogen社)制)與已制備的蛋白質(zhì)免疫印跡(westernblotting)用樣本進(jìn)行混合，將混合成的樣本加入4％-20％mini-proteantgx梯度凝膠(mini-proteantgxgradientgels)(伯樂公司(バイオ·ラッド社)制)中，進(jìn)行sds-page，將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印于pvdf膜，使用封閉溶液(blockingonesolution)(納卡拉組織公司(ナカライテスク社)制)，對轉(zhuǎn)印膜封閉。在初級抗體溶液(將兔抗wsn病毒抗體(r309)或抗β-肌動蛋白(ac-74)抗體用附屬于cangetsignal(東洋紡公司制)的溶液-溶液i(solutioni)稀釋而成的溶液)中，在室溫條件下，將該轉(zhuǎn)印膜至少孵育1小時。接著，用含有0.05容量％吐溫-20(tween-20)的tbs(tbst)清洗該轉(zhuǎn)印膜3次，然后，在次級抗體溶液(將連接有辣根過氧化物酶的ecl驢抗小鼠igg抗體(ge醫(yī)療集團(tuán)制)用附屬于cangetsignal(東洋紡公司制)的溶液-溶液ii(solutionii)稀釋而成的溶液)中進(jìn)行孵育后，用tbst清洗3次。該轉(zhuǎn)印膜在eclprime蛋白質(zhì)免疫印跡檢測試劑(eclprimewesternblottingdetectionreagent)(ge醫(yī)療集團(tuán)制)中進(jìn)行孵育后，通過versadoc成像系統(tǒng)(versadocimagingsystem)(伯樂公司(バイオ·ラッド社)制)，檢測因化學(xué)發(fā)光而產(chǎn)生的信號，檢測vlp中的ha蛋白質(zhì)及m1蛋白質(zhì)的條帶、以及β-肌動蛋白的條帶。將vlp產(chǎn)生量作為vlp中的ha蛋白質(zhì)或m1蛋白質(zhì)的量相對于裂解液中的ha蛋白質(zhì)或m1蛋白質(zhì)的量的比率來計算。計算出導(dǎo)入了各sirna的細(xì)胞的vlp的產(chǎn)生量相對于導(dǎo)入了對照sirna的細(xì)胞的vlp的產(chǎn)生量的比率，作為vlp的產(chǎn)生效率(％)。將基于ha蛋白質(zhì)的vlp產(chǎn)生效率(％)的結(jié)果示于表7，將基于m1蛋白質(zhì)的vlp產(chǎn)生效率(％)的結(jié)果示于表8。其結(jié)果，在所述91個宿主基因中，對于15個宿主基因(ascc3l1基因、brd8基因、c19orf43基因、ddx55基因、dkfzp564k142基因、dpm3基因、eef2基因、fam73b基因、flj20303基因、gbf1基因、ncln基因、c14orf173基因、xpo1基因、lrpprc基因以及rcn1基因)而言，vlp的形成效率與導(dǎo)入了對照sirna的細(xì)胞相比降低了50％以上(p＜0.05)。該結(jié)果顯示：所述宿主基因參與vlp的形成，通過使該宿主基因的表達(dá)降低，vlp的形成被阻斷，進(jìn)而流感病毒的復(fù)制被阻斷。表7表8＜vrnp進(jìn)入子代病毒顆粒的效率＞為了檢測所述91個宿主基因是否參與vrnp進(jìn)入子代病毒顆粒，對vrna及np進(jìn)入子代病毒顆粒進(jìn)行了檢測。具體而言，首先，與所述＜sirna＞同樣地進(jìn)行操作，將sirna轉(zhuǎn)染至hek293細(xì)胞，使moi(感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection))為5的流感病毒感染第二次轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞。從感染起經(jīng)過12小時后，通過離心分離處理(3000×g，4℃，5分鐘)，從細(xì)胞殘渣中分離并回收所放出的含有病毒顆粒的培養(yǎng)上清液。將得到的上清液施加在注入于超離心用管中的含有30重量/容量％蔗糖的pbs上，進(jìn)行超離心分離處理(50000rpm，4℃，1小時，sw55ti轉(zhuǎn)子)。將含有病毒顆粒的沉淀物在pbs中均質(zhì)，使用maxwell16levsimplyrna組織試劑盒(maxwell16levsimplyrnatissuekit)提取病毒rna。根據(jù)kawakami等人的方法(參見非專利文獻(xiàn)11。)，通過鏈特異性實時pcr，對上清液中的病毒rna量以及細(xì)胞中的病毒rna量進(jìn)行定量。需要說明的是，使用superscriptiii反轉(zhuǎn)錄酶(superscriptiiireversetranscriptase)及在5’末端附加有由19個堿基構(gòu)成的標(biāo)簽序列的流感病毒基因組特異性引物(vrnatag_np_1f；ggccgtcatggtggcgaatagcaaaagcagggtagataatcactc(小寫字母部分為標(biāo)簽序列))，進(jìn)行以總rna為模板的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。另外，使用對所述標(biāo)簽序列具有特異性的引物(vrnatag；ggccgtcatggtggcgaat)、對病毒基因組具有特異性的引物(wsn-np_100r；gttctccatcagtctccatc)、以6-fam/zen/ibfq標(biāo)記的探針(idt，wsn-np_46-70；atggcgaccaaaggcaccaaacgat)以及thunderbird探針定量pcr試劑(thunderbirdprobeqpcrmix)進(jìn)行定量pcr。對于vrna及np蛋白質(zhì)進(jìn)入子代病毒顆粒的量，通過用從培養(yǎng)上清液中回收的病毒中的vrna或np蛋白質(zhì)的量除以裂解液中的vrna或np蛋白質(zhì)的量而得到的值確定。計算出導(dǎo)入了各sirna的細(xì)胞中的vrna進(jìn)入子代病毒顆粒的量相對于導(dǎo)入了對照sirna的細(xì)胞中的vrna進(jìn)入子代病毒顆粒的量的比率，將其作為vrna的進(jìn)入效率(％)。計算出導(dǎo)入了各sirna的細(xì)胞中的np蛋白質(zhì)進(jìn)入子代病毒顆粒的量相對于導(dǎo)入了對照sirna的細(xì)胞中的np蛋白質(zhì)進(jìn)入子代病毒顆粒的量的比率，將其作為np蛋白質(zhì)的進(jìn)入效率(％)。將算出的結(jié)果示于表9及10中。其結(jié)果，在所述91個宿主基因中，對于導(dǎo)入了16個宿主基因(hnrnpk基因、ddx21基因、jak1基因、eef1a2基因、sfrs2b基因、dnajc11基因、sqstm1基因、basp1基因、pcdhb12基因、kiaa0664基因、snrpc基因、ppp6c基因、mrcl3基因、itm2b基因、taf15基因以及sdf4基因)的sirna的細(xì)胞而言，vrna進(jìn)入子代病毒顆粒中的效率與導(dǎo)入了對照sirna的細(xì)胞相比降低了50％以上(p＜0.05)，在導(dǎo)入了27個宿主基因(sfrs2b基因、basp1基因、thoc2基因、snrpc基因、kiaa0664基因、ppp6c基因、hnrnpk基因、itm2b基因、sqstm1基因、rpl26基因、ndufs8基因、sdf2l1基因、jak1基因、ddx21基因、eef1a2基因、trim28基因、sdf4基因、usp9x基因、psmd13基因、taf15基因、cirbp基因、cherp基因、tesc基因、myh10基因、tomm40基因、mrcl3基因以及pcdhb12基因)的sirna的細(xì)胞中，np蛋白質(zhì)進(jìn)入子代病毒顆粒中的效率與導(dǎo)入了對照sirna的細(xì)胞相比降低了50％以上(p＜0.05)。所述結(jié)果顯示：所述宿主基因參與vrna或np蛋白質(zhì)向子代病毒顆粒的進(jìn)入，通過降低所述宿主基因的表達(dá)，vrna或np蛋白質(zhì)被阻止進(jìn)入子代病毒顆粒，進(jìn)而流感病毒的復(fù)制受到阻斷。表9表10[實施例2]在實施例1中，針對因sirna的導(dǎo)入而導(dǎo)致流感病毒的效價以常用對數(shù)值計降低了2以上的299個宿主基因，檢測公知的阻斷劑是否能用作抗流感病毒劑。首先，從藥物銀行數(shù)據(jù)庫(drugbankdatabase)(參見非專利文獻(xiàn)12。)、ipa(ingenuity)、以及制藥公司(密里博(millipore)，西格瑪奧德里奇，賽力克化學(xué)(selleckchemicals))的數(shù)據(jù)庫中，檢測作為所述宿主基因的功能的阻斷劑的化合物。其結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了61個化合物，作為對44個宿主基因的阻斷劑。從所述61個化合物中，選擇表11所示的11個阻斷劑，檢測這些化合物對流感病毒的復(fù)制的影響。在所述化合物中，硼替佐米(bortezomib)與秋水仙堿(colchicine)作為流感病毒的復(fù)制阻斷劑廣為人知(參見非專利文獻(xiàn)13及14。)。表11具體而言，使moi為0.001的流感病毒感染hek293細(xì)胞或a549細(xì)胞。對感染后經(jīng)過1小時后的細(xì)胞進(jìn)行清洗，然后，在含有各阻斷劑的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。作為對照，使用dmso溶液(最終濃度：1容量％)來代替各阻斷劑。在阻斷劑的存在下培養(yǎng)48小時，然后，回收培養(yǎng)上清液，與實施例1同樣地進(jìn)行操作，求出病毒的效價。另外，對于細(xì)胞的存活率(％)而言，按照附帶的說明書使用celltiter-glo測試系統(tǒng)(celltiter-gloassaysystem)(普洛麥格公司制)，計算出用含有各阻斷劑的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞的活細(xì)胞數(shù)相對于用含有對照(dmso溶液)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞的活細(xì)胞數(shù)的比率，作為細(xì)胞存活率(％)。其結(jié)果可知，2,3-丁二酮2-肟(30mm)以及wp1130(50μm)能夠使以常用對數(shù)值表示的病毒效價降低5以上，但細(xì)胞存活率也顯著降低，對宿主細(xì)胞的毒性強(qiáng)。作為公知的抗流感病毒劑的硼替佐米(0.2μm)與秋水仙堿(2.5μm)在a549細(xì)胞中，不會表現(xiàn)嚴(yán)重的細(xì)胞毒性，能夠使以常用對數(shù)值表示的病毒效價降低4(硼替佐米)或2(秋水仙堿)以上。另一方面，目前未指出與流感病毒的復(fù)制的相互關(guān)系的golgicidea(10μm)與魯索利替尼(30μm)能夠顯著地使病毒效價降低。魯索利替尼(30μm)不會表現(xiàn)顯著的毒性，確認(rèn)了golgicidea(10μm)在hek293細(xì)胞中的細(xì)胞存活率降低，但在a549細(xì)胞中未能確認(rèn)。分別將golgicidea的結(jié)果示于圖1、將魯索利替尼的結(jié)果示于圖2。根據(jù)所述結(jié)果，組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑ii(histoneacetyltransferaseinhibitorii)、染料木黃酮(genistein)、2,3-丁二酮2-肟、wp1130、golgicidea及魯索利替尼與硼替佐米及秋水仙堿同樣地，具有抗流感病毒作用，其中，golgicidea及魯索利替尼對宿主細(xì)胞的毒性相對小，作為抗流感病毒劑非常有用。[實施例3]魯索利替尼是對于作為酪氨酸激酶的jak1的阻斷劑。如實施例1所示，在通過導(dǎo)入sirna而使jak1的表達(dá)下降的細(xì)胞中，基于m1蛋白質(zhì)的vlp產(chǎn)生效率為57.7％，接近于作為截止值設(shè)定的50％。于是，通過電子顯微鏡對導(dǎo)入了jak1的sirna的細(xì)胞進(jìn)行觀察，檢測jak1基因的表達(dá)下降對流感病毒的病毒顆粒形成的影響。具體而言，首先，與所述＜sirna＞同樣地進(jìn)行操作，將jak1基因的sirna或?qū)φ誷irna轉(zhuǎn)染至hek293細(xì)胞，使moi為5的流感病毒感染第二次轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞。在感染后經(jīng)過12小時后的細(xì)胞中，按照noda等人的方法(非專利文獻(xiàn)15)，制備細(xì)胞的超薄切片，通過電子顯微鏡對其觀察。電子顯微鏡使用泰克萊(tecnai)(注冊商標(biāo))f20電子顯微鏡(fei公司制)。將導(dǎo)入了對照sirna的細(xì)胞的電子顯微鏡照片(上方)、以及導(dǎo)入了jak1基因的sirna的細(xì)胞的電子顯微鏡照片(下方)示于圖3?？芍c導(dǎo)入了對照sirna的細(xì)胞相比，在導(dǎo)入了jak1基因的sirna的細(xì)胞中，已形成的病毒樣顆粒明顯較少，通過使jak1基因的表達(dá)降低，病毒顆粒的形成降低。所述結(jié)果顯示，jak1在流感病毒復(fù)制周期的后期發(fā)揮重要作用。[實施例4]將表12中所示的蛋白質(zhì)阻斷劑作為受檢化合物，檢測細(xì)胞毒性、以及對流感病毒的增殖的效果。表12阻斷劑名cas號功能j1托法替尼(cp-690550)檸檬酸鹽477600-75-2jak阻斷劑j4酪氨酸磷酸化抑制劑b42133550-30-8jak阻斷劑j6巴瑞克替尼1187594-09-7jak阻斷劑j7at9283896466-04-9jak阻斷劑j8莫米洛替尼1056634-68-4jak阻斷劑j11cep337791257704-57-6jak阻斷劑j13nvp-bsk8052hcl1092499-93-8(游離堿)jak阻斷劑j15zm39923hcl1021868-92-7jak阻斷劑j19非哥替尼1206161-97-8jak阻斷劑j20janex-1202475-60-3jak阻斷劑j21nvp-bsk805二鹽酸鹽1092499-93-8(游離堿)jak阻斷劑j23sb1317937270-47-8jak阻斷劑j25wp1130856243-80-6dub阻斷劑＜細(xì)胞毒性試驗＞首先，作為受檢化合物溶液，用含有1％二甲基亞砜的mem制備受檢化合物，以使作為終濃度成為1000μm、100μm、10μm、1μm、0.1μm、0.01μm或0.001μm。用最小必需培養(yǎng)基(minimumessentialmedium；mem)將mdck細(xì)胞、a549細(xì)胞以及hek293細(xì)胞分別制成濃度為6.25×105細(xì)胞/ml、2.5×106細(xì)胞/ml、1.25×105細(xì)胞/ml的細(xì)胞液，將該細(xì)胞液分別以0.1ml/孔添加于96孔板，播種細(xì)胞。在二氧化碳培養(yǎng)箱中以37℃溫度對該96孔板中的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，在播種日的次日用mem進(jìn)行清洗。在清洗后的96孔板中的細(xì)胞中，以每個濃度添加三個孔的方式，添加各受檢化合物溶液0.1ml，然后，將該96孔板中的細(xì)胞在二氧化碳培養(yǎng)箱中以37℃溫度培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)后，將細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8(cellcountingkit-8)溶液(同仁化學(xué)研究所制)分別以10μl添加于各孔，進(jìn)而在37℃溫度培養(yǎng)幾小時。培養(yǎng)后，利用酶標(biāo)儀對該96孔板的各孔中的溶液的450nm處的吸光度進(jìn)行測定。將添加溶劑(含1％二甲基亞砜的mem)來代替受檢化合物時的吸光度值作為全部細(xì)胞存活的情況、即100％，計算吸光度為50％時的受檢化合物的終濃度值，作為50％細(xì)胞毒性濃度(cc50值)。＜抗病毒效果試驗＞首先，作為受檢化合物溶液，用含1％二甲基亞砜的mem制備受檢化合物，以使作為終濃度成為1000μm、100μm、10μm、1μm、0.1μm、0.01μm或0.001μm。用mem分別將mdck細(xì)胞、a549細(xì)胞以及hek293細(xì)胞制成濃度為1.25×106細(xì)胞/ml、5×106細(xì)胞/ml、2.5×105細(xì)胞/ml的細(xì)胞液，將制備的細(xì)胞液分別以0.1ml/孔添加于96孔板，播種細(xì)胞。將該96孔板中的細(xì)胞在二氧化碳培養(yǎng)箱中以37℃溫度進(jìn)行培養(yǎng)，在播種日的次日用mem進(jìn)行清洗。在清洗后的96孔板中的細(xì)胞中，以每個濃度添加三個孔的方式，添加各受檢化合物溶液0.1ml，然后，將該96孔板中的細(xì)胞在二氧化碳培養(yǎng)箱中以37℃溫度培養(yǎng)1小時。培養(yǎng)后，從各孔中除去受檢化合物溶液，使50μl的流感病毒a/wsnrg#1-1株感染，以使moi(每個細(xì)胞感染病毒的個數(shù))成為0.001，在二氧化碳培養(yǎng)箱中以37℃溫度培養(yǎng)1小時。培養(yǎng)后，從各孔中除去病毒液，分別以0.1ml/孔添加含有1μg/ml胰蛋白酶的受檢化合物溶液，進(jìn)一步地在37℃溫度培養(yǎng)48小時。檢測培養(yǎng)后的各孔中有無病毒，算出當(dāng)添加了相同濃度的受檢化合物的培養(yǎng)孔的半數(shù)(50％)計算為沒有病毒時的受檢化合物的終濃度值，作為50％病毒增殖阻斷濃度(ic50)。需要說明的是，通過判定在從各培養(yǎng)孔中采集的50μl的培養(yǎng)液中添加含有1％豚鼠紅血球的紅血球溶液50μl時有無凝集，從而判定各培養(yǎng)孔有無病毒。將各蛋白質(zhì)阻斷劑的cc50及ic50的常用對數(shù)值示于表13中。表中，空欄是ic50與cc50的差小于10倍(常用對數(shù)值的差小于1)的情況。其結(jié)果，對于所述蛋白質(zhì)阻斷劑而言，至少在mdck細(xì)胞、a549細(xì)胞以及hek293細(xì)胞中的任意細(xì)胞中，ic50為比cc50低10倍以上的低濃度。即，所述蛋白質(zhì)阻斷劑能抑制流感病毒的增殖，而不會顯著損害宿主細(xì)胞的增殖性，優(yōu)選作為抗流感病毒劑的有效成分。表13序列表<110>國立研究開發(fā)法人科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu)<120>抗流感病毒劑及抗流感病毒劑的篩選方法<130>pc-20682<160>5<170>patentinversion3.1<210>1<211>21<212>rna<213>人工序列<220><223>人工序列的說明:wsn病毒的np基因<400>1ggaucuuauuucuucggaguu21<210>2<211>45<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的說明:vrnatag_np_1f引物.<400>2ggccgtcatggtggcgaatagcaaaagcagggtagataatcactc45<210>3<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的說明:vrnatag引物.<400>3ggccgtcatggtggcgaat19<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的說明:wsn-np_100r引物.<400>4gttctccatcagtctccatc20<210>5<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的說明:idt,wsn-np_46-70引物.<400>5atggcgaccaaaggcaccaaacgat25當(dāng)前第1頁12