優(yōu)先權(quán)要求

根據(jù)35usc§119(e)，本申請(qǐng)要求于2014年7月24日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)序列no.62/028,638的優(yōu)先權(quán)。上述專利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容以引用的方式納入本文。

聯(lián)邦資助的研究或開(kāi)發(fā)

本發(fā)明是在由國(guó)立衛(wèi)生研究院授予的基金ey10581和5p30ey14104的政府支持下完成的。政府對(duì)本發(fā)明享有某些權(quán)利。

本發(fā)明涉及治療患有由于編碼色素性視網(wǎng)膜炎gtpase調(diào)節(jié)因子(rpgr)蛋白的基因中的功能喪失突變而導(dǎo)致的x連鎖色素性視網(wǎng)膜炎(xlrp)或另一種眼科病癥的人類受試者的方法，所述方法包括將包含腺伴隨病毒載體的核酸給予所述受試者，所述腺伴隨病毒載體包含縮短的人rpgrcdna。

背景技術(shù)：

色素性視網(wǎng)膜炎(rp)是人類遺傳性失明的首要形式。在三種通常的遺傳模式(常染色體顯性、常染色體隱性和x連鎖)中，x連鎖的rp(xlrp)與嚴(yán)重形式的涉及視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞作為主要靶標(biāo)的疾病有關(guān)(berson1993；sandbergandothers2007)。超過(guò)70％的x連鎖的rp和10％-20％的全部rp病例是由編碼rpgr的基因中的突變引起的(baderandothers2003；branhamandothers2012；churchillandothers；pelletierandothers2007)。鑒于目前已知超過(guò)100種基因中的突變導(dǎo)致rp和更嚴(yán)重的x連鎖疾病，rpgr是最重要的rp疾病基因之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明是基于成功地重新產(chǎn)生功能性rpgr活性的縮短形式的人rpgr的發(fā)現(xiàn)，并因此包括治療患有由rpgr中的突變引起的rp的受試者的方法?？赏ㄟ^(guò)本發(fā)明方法治療的受試者可包括視覺(jué)功能喪失(例如對(duì)視網(wǎng)膜電圖(erg)測(cè)試的受損應(yīng)答)但是保留了一些感光細(xì)胞(通過(guò)光學(xué)相干斷層成像術(shù)(oct)測(cè)定)的那些。

因此，在一方面，本發(fā)明提供了治療患有由于編碼色素性視網(wǎng)膜炎gtpase調(diào)節(jié)因子(rpgr)蛋白的基因中的功能喪失突變而導(dǎo)致的xlrp或另一種臨床上定義的眼科病癥的人類受試者的方法。所述方法包括將包含腺伴隨病毒載體的核酸給予所述受試者，所述腺伴隨病毒載體包含縮短的人rpgrcdna，其中所述縮短的人rpgrcdna編碼與seqidno:2全長(zhǎng)至少80％相同的蛋白，所述蛋白任選地在seqidno:2中的缺失區(qū)(即seqidno:2的氨基酸861和862之間)周圍的區(qū)域中具有最多達(dá)共200個(gè)額外的氨基酸的缺失。

在一些實(shí)施方案中，rpgrcdna受人視紫紅質(zhì)激酶(hrk)啟動(dòng)子(例如包含seqidno:5或基本上由seqidno:5組成的hrk啟動(dòng)子)的控制。

在一些實(shí)施方案中，所述腺伴隨病毒載體是aav-2，血清型-8(aav2/8)或aav-8。

在一些實(shí)施方案中，所述rpgrcdna包含與seqidno:1至少80％相同的序列或基本上由該序列組成。

在一些實(shí)施方案中，所述人rpgrcdna編碼與seqidno:2全長(zhǎng)至少95％相同的蛋白。

在一些實(shí)施方案中，所述方法包括以約2×10¹⁰vg/ml的低劑量、約2×10¹¹vg/ml的中等劑量，或約2×10¹²vg/ml的高劑量給予所述核酸。在一些實(shí)施方案中，將所述核酸給予到視網(wǎng)膜下隙。在一些實(shí)施方案中，將微注射插管插入到視網(wǎng)膜下隙——位于視神經(jīng)的顳部并且剛好位于主弓形血管(majorarcadevessel)的上方，以使液體流動(dòng)能夠朝向視網(wǎng)膜黃斑。

在另一方面，本發(fā)明提供了編碼縮短的人rpgr的核酸，其中所述縮短的人rpgrcdna編碼與seqidno:2全長(zhǎng)至少80％相同的蛋白，所述蛋白任選地在seqidno:2中的缺失區(qū)周圍具有最多達(dá)200個(gè)額外的氨基酸的缺失。

在一些實(shí)施方案中，rpgrcdna受人視紫紅質(zhì)激酶(hrk)啟動(dòng)子(例如包含seqidno:5或基本上由seqidno:5組成的hrk啟動(dòng)子)的控制。

在一些實(shí)施方案中，所述rpgrcdna包含與seqidno:1至少80％相同的序列或基本上由該序列組成。

在一些實(shí)施方案中，所述人rpgrcdna編碼與seqidno:2全長(zhǎng)至少95％相同的蛋白。

在一些實(shí)施方案中，所述人rpgrcdna與seqidno:1全長(zhǎng)至少80％相同，任選地在缺失區(qū)周圍具有編碼最多達(dá)200個(gè)額外氨基酸的核苷酸的缺失。

本文還提供了載體，例如腺伴隨病毒載體，例如aav-2，血清型-8(aav2/8)或aav-8，其包含編碼本文所述的縮短的人rpgr的核酸，以及含有編碼縮短的人rpgr的核酸并任選地表達(dá)所述縮短的人rpgr蛋白的分離的細(xì)胞(即不存在于活的人類受試者或宿主動(dòng)物中的細(xì)胞)。

除非另有說(shuō)明，本文使用的全部技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義。本文記載了用于本發(fā)明的方法和材料；另外，也可使用本領(lǐng)域已知的適合的方法和材料。所述材料、方法和實(shí)施例僅為說(shuō)明性的，不意欲進(jìn)行限制。本文提到的全部出版物、專利申請(qǐng)、專利、序列、數(shù)據(jù)庫(kù)條目(entry)和其他參考文獻(xiàn)以引用的方式全文納入本文。如果出現(xiàn)沖突，以本說(shuō)明書(shū)(包括定義)為準(zhǔn)。

根據(jù)以下詳細(xì)描述和附圖以及權(quán)利要求，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)勢(shì)將是顯而易見(jiàn)的。

附圖說(shuō)明

圖1a-b：(a)天然人rpgrorf15編碼區(qū)和兩種縮短形式的aav遞送的人orf15cdna的圖。(b)兩種重組形式的人rpgr-orf15的免疫印跡。小缺失的人cdna的aav遞送(aav-orf15-l，“長(zhǎng)型”)導(dǎo)致大小約160kd的人rpgr-orf15蛋白的表達(dá)。大缺失的人cdna的aav遞送(aav-orf15-s，“短型”)導(dǎo)致大小約130kd的蛋白的表達(dá)。這兩種形式的人rpgr-orf15蛋白比人視網(wǎng)膜組織中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源人rpgrorf15(約200kd)更小。

圖2a-d：在aav-rpgrorf15的視網(wǎng)膜下遞送之后，rpgr-^/-小鼠視網(wǎng)膜中的rpgrorf15表達(dá)。(a)疊加在nomarski圖像上以說(shuō)明外視網(wǎng)膜的分層的人rpgrorf15蛋白的短型(orf15-s)和長(zhǎng)型(orf15-l)的熒光圖像。在1-2月齡時(shí)進(jìn)行處理之后3周，對(duì)未固定的冷凍視網(wǎng)膜切片進(jìn)行染色。(b)與小根蛋白(rootletin)共定位的兩種形式的人rpgrorf15的熒光圖像。類似于野生型，兩種形式的人rpgrorf15準(zhǔn)確定位于剛好在小根蛋白遠(yuǎn)端的感光細(xì)胞連接纖毛。rpe，視網(wǎng)膜色素上皮；os，外段；cc(tz)，連接纖毛(過(guò)渡區(qū))；is，內(nèi)段；onl，外核層。(c)對(duì)于用orf15-s處理的rpgr^-/-眼(n＝3)、用orf15-l處理的rpgr^-/-眼(n＝3)和野生型眼(n＝3)，hrpgr熒光粒子與連接纖毛處的熒光小根蛋白纖維的比例。獲得內(nèi)段內(nèi)的小根蛋白和在100μm長(zhǎng)的中部周邊視網(wǎng)膜上剛好在小根蛋白遠(yuǎn)端的rpgr的計(jì)數(shù)。數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。(d)在rpgr^-/-小鼠的固定漂浮的視網(wǎng)膜切片中，短型和長(zhǎng)型orf15蛋白的表達(dá)模式。在2-3月齡時(shí)進(jìn)行處理之后4-6周，對(duì)切片進(jìn)行染色以對(duì)人rpgrorf15蛋白定位。在野生型視網(wǎng)膜中，觀察到鼠rpgrorf15蛋白為占據(jù)感光細(xì)胞內(nèi)段和外段之間區(qū)域的離散的綠色熒光信號(hào)(點(diǎn))，其處于過(guò)渡區(qū)或連接纖毛的水平。相比之下，短型orf15(aav-orf15-s)的熒光信號(hào)不限于感光細(xì)胞連接纖毛的水平，但是觀察到其也是遍及內(nèi)段和外段的離散信號(hào)。長(zhǎng)型orf15的熒光信號(hào)顯示出非常少(如果有的話)的錯(cuò)誤定位，并且主要限于與野生型類似的連接纖毛區(qū)。os，外段；cc(tz)，連接纖毛(過(guò)渡區(qū))；is，內(nèi)段；onl，外核層。

圖3：在13月齡時(shí)(注射后6個(gè)月)，對(duì)經(jīng)處理的(長(zhǎng)型和短型orf15)和對(duì)照rpgr-^/-小鼠視網(wǎng)膜中視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞的免疫組織化學(xué)(初始為黃色)分析。在用短型orf15(aav8-orf15-s)處理的rpgr-^/-小鼠視網(wǎng)膜中，實(shí)際上不能區(qū)分視紫紅質(zhì)和視錐視蛋白(在下半部視網(wǎng)膜中的混合s&m視錐)錯(cuò)誤定位染色模式與在對(duì)照視網(wǎng)膜中觀察到的那些。在這兩種小鼠視網(wǎng)膜中，注意到在內(nèi)段和突觸層中的視錐視蛋白錯(cuò)誤定位。類似地，與月齡匹配的野生型視網(wǎng)膜相比，視桿和視錐外段縮短且無(wú)序，具有減少的外核層。相比之下，在用長(zhǎng)型orf15(aav8-orf15-1)處理的rpgr^-/-小鼠視網(wǎng)膜中，視紫紅質(zhì)顯示出類似于野生型小鼠視網(wǎng)膜的外段分隔(partitioning)。另外，與對(duì)照視網(wǎng)膜相比，在orf15長(zhǎng)型處理的視網(wǎng)膜中，視桿外段更長(zhǎng)且組織有序，并且onl更厚。與對(duì)照相比，在orf15長(zhǎng)型處理的rpgr^-/-小鼠視網(wǎng)膜中，視錐視蛋白染色顯示出更多的具有伸長(zhǎng)且組織有序的外段的視錐細(xì)胞。

圖4a-b：在rpgr^-/-小鼠中用rpgrorf15-1處理后對(duì)感光細(xì)胞的拯救。(a)示出了在3只18月齡的小鼠中經(jīng)處理的眼(初始為紅色)和對(duì)側(cè)對(duì)照眼(初始為藍(lán)色)的onl厚度(上圖)和is/os長(zhǎng)度(下圖)的堆疊條形圖。(b)來(lái)自野生型小鼠和來(lái)自18月齡的rpgr-^/-小鼠的經(jīng)orf15-1處理的眼和對(duì)側(cè)對(duì)照眼的代表性光顯微圖像。圖像取自上半部視網(wǎng)膜中沿著垂直經(jīng)線的中部周邊。

圖5a-c：(a)11-14月齡時(shí)來(lái)自16只rpgr^-/-小鼠的視桿a波、視桿b波和視錐b波振幅。與野生型小鼠的下限相比，對(duì)照眼(od)顯示出視錐b波振幅相對(duì)于視桿b波振幅的不成比例的損耗。除了在一種情況中，所有經(jīng)處理的眼(os)都比對(duì)側(cè)對(duì)照眼具有更大的反應(yīng)。特別地，注意到在該月齡時(shí)一半以上的經(jīng)處理的眼具有等于或大于野生型下限的視桿ergb波振幅。眼之間的所有三次測(cè)量的平均值顯著不同(p<0.01)。(b)對(duì)于暗適應(yīng)的(視桿)b波(上圖)和光適應(yīng)的(視錐)b波(下圖)，在對(duì)數(shù)尺度上22只9至18月齡的rpgr^-/-小鼠的erg振幅的散點(diǎn)圖。對(duì)于各月齡組，數(shù)據(jù)點(diǎn)在水平方向上輕微移動(dòng)以使數(shù)據(jù)重疊最小化。使用基于全部可用數(shù)據(jù)的sas的procmixed，通過(guò)重復(fù)測(cè)量縱向回歸來(lái)擬合經(jīng)處理的眼和對(duì)照眼的回歸線。(c)來(lái)自一對(duì)18月齡的經(jīng)orf15-1處理的和對(duì)側(cè)對(duì)照rpgr^-/-眼的代表性暗適應(yīng)(da)和光適應(yīng)(la)erg波形。示出野生型(月齡匹配)erg波形用于比較。在該月齡時(shí)，對(duì)照眼分別具有嚴(yán)重減少或幾乎消失的視桿和視錐erg。然而，經(jīng)處理的眼在該時(shí)間點(diǎn)時(shí)仍具有顯著的視桿和視錐功能，其分別為野生型數(shù)值的約70％和35％。

圖6：5名因rpgrorf15突變而患有xlrp的患者對(duì)0.5hz白光閃光和對(duì)30hz相同的白光閃光的全視野erg。將三次或多次跡線疊加以說(shuō)明重現(xiàn)性。跡線上方的點(diǎn)指示閃光開(kāi)始。盡管對(duì)0.5hz閃光的反應(yīng)僅比正常下限(350μv)減小6％至65％，對(duì)30hz閃光的反應(yīng)未能如圖說(shuō)明被檢測(cè)出(即，沒(méi)有帶通濾波和信號(hào)平均)。

具體實(shí)施方式

病毒載體介導(dǎo)的體基因療法已在治療人視網(wǎng)膜變性疾病的動(dòng)物模型中表現(xiàn)出廣闊的前景。迄今為止，已有許多在小動(dòng)物模型(aliandothers2000；pangandothers2012；pawlykandothers2010；pawlykandothers2005；tanandothers2009)和大動(dòng)物模型(aclandandothers2001；alexanderandothers2007；beltranandothers2012；komaromyandothers2010；lheriteauandothers2009)中使用腺伴隨病毒(aav)介導(dǎo)的基因遞送以拯救感光細(xì)胞變性的成功的研究。在這些病例中，視網(wǎng)膜色素上皮(rpe)或感光細(xì)胞是轉(zhuǎn)基因表達(dá)的主要靶標(biāo)。此外，i期臨床試驗(yàn)——包括對(duì)患有靶向rpe的先天性利伯氏黑蒙(lca)(bainbridgeandothers2008；cideciyanandothers2008；maguireandothers2008)以及最近的無(wú)脈絡(luò)膜(maclarenandothers2014)的患者的基因治療——已經(jīng)取得了一些成功。目前沒(méi)有臨床試驗(yàn)使用aav介導(dǎo)的基因置換療法來(lái)治療患有x連鎖的rp的患者。

本發(fā)明人之前已使用轉(zhuǎn)基因方法，利用在富含嘌呤的羧基末端缺少約600bp的縮短的鼠rpgrorf15同源體證明了在缺少rpgr的小鼠中對(duì)視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞的功能和形態(tài)拯救(hongandothers2005)。在正常個(gè)體中頻繁發(fā)現(xiàn)在重復(fù)區(qū)長(zhǎng)度中的一些變異(baderandothers2003；jacobiandothers2005；karraandothers2006)。然而，縮短的人rpgr的功能尚未被描述。

在本研究中，由之前記載的視紫紅質(zhì)激酶(rk)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)(khaniandothers2007；sunandothers2010)并且在快速作用的aav8載體中遞送(alloccaandothers2007；natkunarajahandothers2008)的縮短的人rpgrorf15置換基因能夠在rpgr敲除小鼠模型中拯救感光細(xì)胞變性表型。orf15外顯子的富含嘌呤的重復(fù)區(qū)是rpgr的準(zhǔn)確的亞細(xì)胞定位和功能所必需的，但是將其長(zhǎng)度縮短最多達(dá)1/3似乎并未損害它的功能。在未來(lái)的人類基因治療試驗(yàn)中，這種縮短的rpgr替換基因提供了迄今為止回避的“全長(zhǎng)”rpgrorf15的可行的替代物。

rpgr

rpgr以復(fù)雜的模式表達(dá)，已記載默認(rèn)的變體和orf15變體(vervoortandothers2000)。rpgr的默認(rèn)型或組成型跨越外顯子1-19，并且orf15在外顯子16-19開(kāi)始之前在被指定為orf15的大可變外顯子中終止。orf15外顯子的獨(dú)特之處在于，它包含很長(zhǎng)一段富含嘌呤的重復(fù)序列，該序列被證明難以克隆成cdna并且在許多重組dna操作步驟中不穩(wěn)定。盡管rpgr的更小的默認(rèn)形式是具有運(yùn)動(dòng)纖毛(hongetal,2003)和許多類型的原纖毛(我們未公開(kāi)的數(shù)據(jù))的組織中的主要形式，rpgr的orf15同源體是視網(wǎng)膜中正常視桿和視錐功能必需的(vervoortandothers2000；vervoortandwright2002)，并且主要在感光細(xì)胞中表達(dá)(hongandothers2003)。orf15也是rpgr突變的通常位點(diǎn)，具有在22-60％的x連鎖的rp患者中鑒定的突變(breuerandothers2002；vervoortandothers2000)。

本發(fā)明人促成開(kāi)發(fā)了攜帶rpgr中的無(wú)效突變、任何rpgr的同源體的水平都不可檢測(cè)的第一個(gè)x連鎖rp的小鼠模型(hongandothers2000)。rpgr無(wú)效小鼠表現(xiàn)出緩慢發(fā)展的視網(wǎng)膜變性，其特征在于早期視錐細(xì)胞視蛋白在細(xì)胞體和突觸中的錯(cuò)誤定位以及視桿細(xì)胞中的視紫紅質(zhì)水平降低。因此，這些小鼠具有視錐-視桿變性。到12月齡時(shí)，通過(guò)視網(wǎng)膜電圖(erg)測(cè)量的顯著的感光細(xì)胞損失以及視錐和視桿功能減退變得明顯。在視網(wǎng)膜中，rpgr經(jīng)由rpgr相互作用蛋白(rpgrip1)結(jié)合于位于內(nèi)段和外段之間的感光細(xì)胞連接纖毛(參見(jiàn)，例如boylanandwright2000；hongandothers2001；roepmanandothers2000)。所述連接纖毛類似于運(yùn)動(dòng)纖毛或原纖毛的過(guò)渡區(qū)，其可充當(dāng)通向外段的通道。這種亞細(xì)胞定位模式和突變的小鼠表型表明，rpgr可在視桿和視錐的內(nèi)段和外段之間的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮作用(hongandli2002；hongandothers2000；hongandothers2001)。為了開(kāi)發(fā)具有更快變性進(jìn)程的rpgr突變小鼠模型，最近已開(kāi)發(fā)了若干其他rpgr小鼠系(brunner,etal,2010；huangetal,2012)。最近還報(bào)道了天然存在的x連鎖rpgr模型(rd9)(thompsonandothers2012)。在全部這些情況中，包括rpgr無(wú)效小鼠表現(xiàn)出緩慢發(fā)展的感光細(xì)胞損失，但是視桿和視錐參與程度不同，這可能部分是由于應(yīng)力(strain)和/或色素沉著的差異。這些發(fā)現(xiàn)表明，敲除模型中的緩慢的變性速率是由于物種差異而非脫離(ablation)不完全，并且確認(rèn)了該鼠模型在患者中的無(wú)效rpgr突變的治療研究中的適用性。

全長(zhǎng)人rpgr的兩種變體(a和c)(也已知為crd；rp3；cod1；pcdx；rp15；xlrp3；orfl5；和cordx1)記載于genbank；同源體a的登錄號(hào)為nm_000328.2(核酸)和np_000319.1(蛋白)；同源體c的登錄號(hào)為nm_001034853.1(核酸)和np001030025.1(蛋白)。與變體c相比，變體(a)使用可變剪接位點(diǎn)并且在3’編碼區(qū)包含多個(gè)可變外顯子，并且編碼同源體a(也稱為同源體1)，所述同源體a與同源體c相比更短并且具有不同的c端。用于本文所述的示例性組合物的序列如以下seqidno：1所示。可用于本文所述的組合物和方法的人rpgr的序列可與seqidno：1全長(zhǎng)至少80％，例如85％、90％、95％或100％相同，從缺失區(qū)缺失最多達(dá)額外的50、100、150或200個(gè)氨基酸，所述缺失在以下序列中通過(guò)破折號(hào)來(lái)表示。

具有378bp缺失的人rpgrorf15序列的縮短形式，缺失區(qū)由破折號(hào)表示(“-”；破折號(hào)的數(shù)目與缺失的大小不相關(guān))。

atgagggagccggaagagctgatgcccgattcgggtgctgtgtttacatttgggaaaagtaaatttgctgaaaataatcccggtaaattctggtttaaaaatgatgtccctgtacatctttcatgtggagatgaacattctgctgttgttaccggaaataataaactttacatgtttggcagtaacaactggggtcagttaggattaggatcaaagtcagccatcagcaagccaacatgtgtcaaagctctaaaacctgaaaaagtgaaattagctgcctgtggaaggaaccacaccctggtgtcaacagaaggaggcaatgtatatgcaactggtggaaataatgaaggacagttggggcttggtgacaccgaagaaagaaacacttttcatgtaattagcttttttacatccgagcataagattaagcagctgtctgctggatctaatacttcagctgccctaactgaggatggaagactttttatgtggggtgacaattccgaagggcaaattggtttaaaaaatgtaagtaatgtctgtgtccctcagcaagtgaccattgggaaacctgtctcctggatctcttgtggatattaccattcagcttttgtaacaacagatggtgagctatatgtgtttggagaacctgagaatgggaagttaggtcttcccaatcagctcctgggcaatcacagaacaccccagctggtgtctgaaattccggagaaggtgatccaagtagcctgtggtggagagcatactgtggttctcacggagaatgctgtgtatacctttgggctgggacaatttggtcagctgggtcttggcacttttctttttgaaacttcagaacccaaagtcattgagaatattagggatcaaacaataagttatatttcttgtggagaaaatcacacagctttgataacagatatcggccttatgtatacttttggagatggtcgccacggaaaattaggacttggactggagaattttaccaatcacttcattcctactttgtgctctaattttttgaggtttatagttaaattggttgcttgtggtggatgtcacatggtagtttttgctgctcctcatcgtggtgtggcaaaagaaattgaattcgatgaaataaatgatacttgcttatctgtggcgacttttctgccgtatagcagtttaacctcaggaaatgtactgcagaggactctatcagcacgtatgcggcgaagagagagggagaggtctccagattctttttcaatgaggagaacactacctccaatagaagggactcttggcctttctgcttgttttctccccaattcagtctttccacgatgttctgagagaaacctccaagagagtgtcttatctgaacaggacctcatgcagccagaggaaccagattatttgctagatgaaatgaccaaagaagcagagatagataattcttcaactgtagaaagccttggagaaactactgatatcttaaacatgacacacatcatgagcctgaattccaatgaaaagtcattaaaattatcaccagttcagaaacaaaagaaacaacaaacaattggggaactgacgcaggatacagctcttactgaaaacgatgatagtgatgaatatgaagaaatgtcagaaatgaaagaagggaaagcatgtaaacaacatgtgtcacaagggattttcatgacgcagccagctacgactatcgaagcattttcagatgaggaagtagagatcccagaggagaaggaaggagcagaggattcaaaaggaaatggaatagaggagcaagaggtagaagcaaatgaggaaaatgtgaaggtgcatggaggaagaaaggagaaaacagagatcctatcagatgaccttacagacaaagcagaggtgagtgaaggcaaggcaaaatcagtgggagaagcagaggatgggcctgaaggtagaggggatggaacctgtgaggaaggtagttcaggagcagaacactggcaagatgaggagagggagaagggggagaaagacaagggtagaggagaaatggagaggccaggagagggagagaaggaactagcagagaaggaagaatggaagaagagggatggggaagagcaggagcaaaaggagagggagcagggccatcagaaggaaagaaaccaagagatggaggagggaggggaggaggagcatggagaaggagaagaagaggagggagacagagaagaggaagaagagaaggagggagaagggaaagaggaaggagaaggggaagaagtggagggagaacgtgaaaaggaggaaggagagaggaaaaaggaggaaagagcggggaaggaggagaaaggagaggaagaaggagaccaaggagagggggaagaggaggaaacagaggggagaggggaggaaaaagaggagggaggggaagtagagggaggggaagtagaggaggggaaaggagagagggaagaggaagaggaggagggtgagggggaagaggaggaaggggagggggaagaggaggaaggggagggggaagaggaggaaggagaagggaaaggggaggaagaa-ggggagggggaagaggaggaaggggaagaagaaggggaggaagaaggagagggagaggaagaaggggagggagaaggggaggaagaagaggaaggggaagtggaaggggaggtggaaggggaggaaggagagggggaaggagaggaagaggaaggagaggaggaaggagaagaaagggaaaaggagggggaaggagaagaaaacaggaggaacagagaagaggaggaggaagaagaggggaagtatcaggagacaggcgaagaagagaatgaaaggcaggatggagaggagtacaaaaaagtgagcaaaataaaaggatctgtgaaatatggcaaacataaaacatatcaaaaaaagtcagttactaacacacagggaaatgggaaagagcagaggtccaaaatgccagtccagtcaaaacgacttttaaaaaatgggccatcaggttccaaaaagttctggaataatatattaccacattacttggaattgaagtaa(seqidno：1)

縮短形式的人rpgrorf15的蛋白序列，缺失區(qū)由破折號(hào)表示(“-”；破折號(hào)的數(shù)目與缺失的大小不相關(guān))

全長(zhǎng)人rpgrorf15cdna序列；縮短形式中缺失的378bp在以下序列中以加粗和下劃線示出。

全長(zhǎng)人rpgrorf15氨基酸序列；縮短形式中缺失的氨基酸在以下序列中以加粗和下劃線示出。

可使用數(shù)學(xué)算法來(lái)實(shí)現(xiàn)序列比較并確定兩條序列之間的同一性百分?jǐn)?shù)。例如，可使用needleman和wunsch((1970)j.mol.biol.48：444-453)算法(其在gcg軟件包(可在萬(wàn)維網(wǎng)gcg.com獲得)中被并入gap程序)，使用默認(rèn)參數(shù)(例如blossum62計(jì)分矩陣，空位罰分12，空位延伸罰分4，移碼空位罰分5)來(lái)確定兩條氨基酸序列之間的同一性百分?jǐn)?shù)。

rk啟動(dòng)子

在本文所述方法的一些實(shí)施方案中，使用了置換基因構(gòu)建體，其中縮短的人rpgrcdna被置于人視紫紅質(zhì)激酶(hrk)啟動(dòng)子的控制下。在一些實(shí)施方案中，所述rk啟動(dòng)子的長(zhǎng)度約為200bp(來(lái)自視紫紅質(zhì)激酶(rk)基因的短啟動(dòng)子，其已顯示出在視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)細(xì)胞特異性表達(dá)(khanietal，2007；sunetal，2010；youngetal，2003))。示例性的hrk啟動(dòng)子序列是-112/+87(khanietal.，2007)：

gggccccagaagcctggtggttgtttgtccttctcaggggaaaagtgaggcggccccttggaggaaggggccgggcagaatgatctaatcggattccaagcagctcaggggattgtctttttctagcaccttcttgccactcctaagcgtcctccgtgaccccggctgggatttagcctggtgctgtgtcagccccggt(seqidno：5)

病毒遞送載體

上述縮短的人rpgrcdna被包裝成遞送載體，例如aav8或aav2/8載體。

可以以任何有效的載體(例如任何能夠?qū)⒔M分基因有效遞送到體內(nèi)細(xì)胞的制劑或組合物)來(lái)給予置換基因(cdna)。方法包括將所述基因插入到非致病性、非復(fù)制型的病毒載體(包括重組逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、慢病毒和單純皰疹病毒-1)或重組的細(xì)菌或真核質(zhì)粒。病毒載體直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞；質(zhì)粒dna可在裸露狀態(tài)下遞送，或借助例如陽(yáng)離子脂質(zhì)體(lipofectamine)或衍生的(例如抗體綴合的)多聚賴氨酸綴合物、gramacidins、人工病毒包膜或其他這類胞內(nèi)載體，以及在體內(nèi)進(jìn)行的基因構(gòu)建體的直接注射或capo4沉淀。

在體內(nèi)將核酸引入細(xì)胞中的優(yōu)選方法是通過(guò)使用包含核酸(例如cdna)的病毒載體。用病毒載體感染細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)在于，大部分靶細(xì)胞能夠接收核酸。此外，在病毒載體內(nèi)編碼的分子(例如通過(guò)病毒載體中包含的cdna)可在吸收病毒載體核酸的細(xì)胞中有效表達(dá)。

腺病毒載體和腺伴隨病毒載體可用作重組基因遞送系統(tǒng)，用于在體內(nèi)轉(zhuǎn)移外源基因，特別是轉(zhuǎn)移到人中。這些載體提供基因到細(xì)胞中的有效遞送，并且被轉(zhuǎn)移的核酸被穩(wěn)定整合到宿主的染色體dna中。僅產(chǎn)生復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒的特定的細(xì)胞系(被稱為“包裝細(xì)胞”)的開(kāi)發(fā)增大了逆轉(zhuǎn)錄病毒用于基因治療的實(shí)用性，并且缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒被表征為用于以基因治療為目的的基因轉(zhuǎn)移(參見(jiàn)miller，blood76：271(1990))。復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒可被包裝成病毒粒子，所述病毒粒子可用于通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)使用輔助病毒來(lái)感染靶細(xì)胞。產(chǎn)生重組逆轉(zhuǎn)錄病毒和在體外或體內(nèi)用這樣的病毒感染細(xì)胞的方案可參見(jiàn)ausubel，etal，eds.，currentprotocolsinmolecularbiology，greenepublishingassociates，(1989)，sections9.10-9.14和其他標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)。適合的逆轉(zhuǎn)錄病毒的實(shí)例包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的plj、pzip、pwe和pem。用于制備親嗜性和兼嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)的適合的包裝病毒系包括ψcrip、ψcre、ψ2和ψam。逆轉(zhuǎn)錄病毒用于在體外和/或體內(nèi)將多種基因引入許多不同的細(xì)胞類型，包括上皮細(xì)胞(參見(jiàn)，例如eglitis,etal.(1985)science230:1395-1398；danosandmulligan(1988)proc.natl.acad.sci.usa85:6460-6464；wilsonetal.(1988)proc.natl.acad.sci.usa85:3014-3018；armentanoetal.(1990)proc.natl.acad.sci.usa87:6141-6145；huberetal.(1991)proc.natl.acad.sci.usa88:8039-8043；ferryetal.(1991)proc.natl.acad.sci.usa88:8377-8381；chowdhuryetal.(1991)science254:1802-1805；vanbeusechemetal.(1992)proc.natl.acad.sci.usa89:7640-7644；kayetal.(1992)humangenetherapy3:641-647；daietal.(1992)proc.natl.acad.sci.usa89:10892-10895；hwuetal.(1993)j.immunol.150:4104-4115；u.s.patentno.4,868,116；u.s.patentno.4,980,286；pct申請(qǐng)wo89/07136；pct申請(qǐng)wo89/02468；pct申請(qǐng)wo89/05345；和pct申請(qǐng)wo92/07573)。

另一種可用于本發(fā)明方法的病毒基因遞送系統(tǒng)利用衍生自腺病毒的載體?？刹倏v腺病毒的基因組，以使它編碼和表達(dá)目的基因產(chǎn)物，但是喪失其在正常的裂解病毒生命周期中復(fù)制的能力。參見(jiàn)，例如berkneretal,biotechniques6:616(1988)；rosenfeldetal,science252:431-434(1991)；和rosenfeldetal,cell68:143-155(1992)。源自腺病毒毒株ad5型dl324或腺病毒其他毒株(例如ad2、ad3或ad7等)的適合的腺病毒載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。重組腺病毒在某些情況下的優(yōu)勢(shì)在于，它們不能感染非分裂細(xì)胞并且可用于感染多種細(xì)胞類型，包括上皮細(xì)胞(rosenfeldetal,(1992)，見(jiàn)上文)。此外，病毒粒子是相對(duì)穩(wěn)定的并且易于被純化和濃縮，并且如上文所述，可對(duì)病毒粒子進(jìn)行修飾以影響感染性范圍。此外，被引入的腺病毒dna(和其中包含的外源dna)未被整合到宿主細(xì)胞的基因組中，而是保持游離，從而避免了由于原位(被引入的dna整合到宿主基因組中的位置(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒dna))插入誘變而產(chǎn)生的潛在問(wèn)題。此外，腺病毒基因組對(duì)外源dna的攜帶能力相對(duì)于其他基因遞送載體更大(最多達(dá)8千堿基)(berkneretal，見(jiàn)上文；haj-ahmandandgraham,j.virol.57:267(1986))。

另一種可用于遞送核酸的病毒載體系統(tǒng)是腺伴隨病毒(aav)。腺伴隨病毒是天然存在的缺陷型病毒，其需要另一種病毒(例如腺病毒或皰疹病毒)作為輔助病毒以實(shí)現(xiàn)有效復(fù)制和生產(chǎn)性的生命周期(參見(jiàn)muzyczkaetal,curr.topicsinmicro,andimmunol.l58:97-129(1992))。它也是可將其dna整合到非分裂細(xì)胞中并且表現(xiàn)出高頻率穩(wěn)定整合的少數(shù)病毒之一(參見(jiàn)，例如flotteetal,am.j.respir.cell.mol.biol.7:349-356(1992)；samulskietal,j.virol.63:3822-3828(1989)；和mclaughlinetal,j.virol.62:1963-1973(1989))。aav的包含少達(dá)300堿基對(duì)的載體能夠被包裝并整合。外源dna的空間被限制在約4.5kb。aav載體(如tratschinetal,mol.cell.biol.5:3251-3260(1985)中記載的載體)可用于將dna引入細(xì)胞中。已使用aav載體將許多核酸引入不同的細(xì)胞類型中(參見(jiàn)，例如hermonatetal,proc.natl.acad.sci.usa81:6466-6470(1984)；tratschinetal,mol.cell.biol.4:2072-2081(1985)；wondisfordetal,mol.endocrinol.2:32-39(1988)；tratschinetal,j.virol.51:611-619(1984)；和flotteetal,j.biol.chem.268:3781-3790(1993))。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述病毒遞送載體是重組的aav2/8病毒。

在給藥前，最終產(chǎn)品將經(jīng)過(guò)一系列超純化步驟以符合臨床級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

受試者選擇

為本發(fā)明的治療方法的候選者的受試者包括被診斷具有由編碼rpgr的基因中的突變引起的rp的那些。也可使用本文所述的方法來(lái)治療患有由編碼rpgr的基因中的突變引起的其他眼科臨床確定的病癥(例如x連鎖的視錐-視桿營(yíng)養(yǎng)不良)的受試者。可使用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)診斷由編碼rpgr的基因中的突變引起的xlrp或另一種眼科病癥。

本文所述的方法可包括鑒定受試者(例如，兒童、青少年或年輕成年受試者)，其患有由編碼rpgr的基因中的突變引起的xlrp或另一種眼科病癥，或疑似患有由編碼rpgr的基因中的突變引起的xlrp或另一種眼科病癥(例如，基于存在所述病癥的癥狀并且沒(méi)有其他明顯的原因)；以及從所述受試者獲得包含基因組dna的樣品，使用已知的分子生物學(xué)方法檢測(cè)rpgr中突變的存在，以及選擇具有導(dǎo)致xlrp或另一種病癥的rpgr中的突變的患者。檢測(cè)rpgr中的突變可包括檢測(cè)orf15中的突變，例如sandbergetal,(2007).investophthalmolvissci48,1298-304；droretal,amjhumgenet.nov2003；73(5):1131-1146中所記載的。

rpgrorf15中的突變包括移碼突變、無(wú)義突變、剪接位點(diǎn)突變和錯(cuò)義突變。示例性的突變包括orf15glu446(1-bp-del)、orf15glu447(2-bp-del)和orf15glys521(l-bp-ins)。

檢測(cè)rpgr中的突變也可包括對(duì)受試者的rpgr基因進(jìn)行全部測(cè)序或部分(例如orf15區(qū)域)測(cè)序，以及比較所述序列與參照序列(例如，genbank登錄號(hào)ng_009553.1)以檢測(cè)突變。移碼突變、截短突變、改變保守氨基酸的突變或影響調(diào)控區(qū)(例如啟動(dòng)子)的突變可被認(rèn)為是導(dǎo)致本文所述的xlrp或另一種眼科病癥的突變；可通過(guò)體外(例如在培養(yǎng)的細(xì)胞中)或體內(nèi)(例如在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中)表達(dá)突變體并測(cè)定例如功能或亞細(xì)胞定位來(lái)確認(rèn)功能改變。

可使用本文所述的方法來(lái)治療的患有因rpgr突變而導(dǎo)致的xlrp或另一種眼科病癥的患者優(yōu)選保留一些感光細(xì)胞和視覺(jué)功能，例如通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)視覺(jué)功能或視野測(cè)試和/或光學(xué)相干斷層成像術(shù)(otc，例如譜域otc(sd-oct))所測(cè)量的；參見(jiàn)，例如sandbergetal,investophthalmolvissci.2007；48:1298-1304。本文所述的方法可包括鑒定受試者，其被診斷為患有因rpgr突變而導(dǎo)致的xlrp或另一種眼科病癥，其具有導(dǎo)致他們的病癥的rpgr中的經(jīng)確認(rèn)的突變；以及檢測(cè)他們的視覺(jué)能力并檢測(cè)剩余的中央感光細(xì)胞的存在?？墒褂帽景l(fā)明方法來(lái)治療的受試者(例如兒童、青少年、年輕成年人或成年人受試者)優(yōu)選具有至少20/200的視敏度(用于測(cè)定視敏度的方法是本領(lǐng)域熟知的；參見(jiàn)例如johnson,deafnessandvisiondisorders:anatomyandphysiology,assessmentprocedures,ocularanomalies,andeducationalimplications,charlesc.thomaspublisher；1999；carlson,n；kurtz,d.；heath,d.；hines,c.clinicalproceduresforocularexamination.appleton&lange；norwalk,ct.1990)和中央凹中的可檢測(cè)的外核層(例如，至少正常厚度的75％、80％、90％、95％或99％)。

實(shí)施例

在以下實(shí)施例中對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，所述實(shí)施例并不限制權(quán)利要求中所述的本發(fā)明的范圍。

材料和方法

以下材料和方法用于下文所述的實(shí)施例。

動(dòng)物

之前記載了rpgr^-/-小鼠的產(chǎn)生和分析(hongandothers2000)。用于本研究的rpgr^-/-小鼠是從我們的機(jī)構(gòu)動(dòng)物設(shè)施中養(yǎng)育的缺合型rpgr雄性和純合型(rpgr^-/-)雌性之間的同胞交配而繁殖的。用于研究的野生型小鼠是來(lái)自charlesriver實(shí)驗(yàn)室(wilmington,ma)的c57bl。將小鼠養(yǎng)育在12hr光照/12hr黑暗的光照周期中。研究按照在眼科和視覺(jué)研究中使用動(dòng)物的arvo聲明完成，并且由馬薩諸塞州眼耳醫(yī)院的iacuc批準(zhǔn)。

質(zhì)粒構(gòu)建和重組aav8的產(chǎn)生

使用被設(shè)計(jì)以包含全部rpgrorf15同源體編碼區(qū)的引物，通過(guò)pcr從人視網(wǎng)膜cdna擴(kuò)增人rpgrorf15cdna。盡管使用多種方法反復(fù)嘗試，仍未得到全長(zhǎng)orf15cdna，這與其他研究者和我們自己的經(jīng)驗(yàn)一致(hongandothers2005)。相反，我們獲得了在orf15外顯子中包含大的314個(gè)密碼子(942bp)框內(nèi)缺失的縮短的orf15cdna(剩余2517bp)，其中富含嘌呤的重復(fù)區(qū)被移除(密碼子696-1010del，“短型”)(圖1a)。通過(guò)重組dna操作來(lái)構(gòu)建第二orf15cdna，其在外顯子15的高度重復(fù)區(qū)中包含126個(gè)密碼子(378bp)框內(nèi)缺失(在orf15外顯子中剩余3081bp)(密碼子862-988del，“長(zhǎng)型”)。對(duì)這些orf15cdna進(jìn)行測(cè)序以驗(yàn)證保真度。為了構(gòu)建aav載體，將rpgrcdna插入到親本paav-rk-zsgreen載體的多克隆位點(diǎn)。將所得的paav-rk-mrpgr和paav-rk-hrpgr載體包裝成aav。通過(guò)三部分轉(zhuǎn)染產(chǎn)生aav2/8假型載體：(1)編碼目的基因的aav載體質(zhì)粒；(2)編碼來(lái)自血清型2的aavrep蛋白和來(lái)自血清型8的cap蛋白的aav輔助質(zhì)粒plt-rc03；和(3)進(jìn)入293a細(xì)胞的腺病毒輔助小質(zhì)粒phgti-adeno1)。使用xiao及其合作者開(kāi)發(fā)的方案進(jìn)行轉(zhuǎn)染(xiao,etal,1998)。轉(zhuǎn)染后兩天，通過(guò)反復(fù)的冷融循環(huán)來(lái)裂解細(xì)胞。在初步除去細(xì)胞碎片后，通過(guò)核酸酶(benzonase)處理來(lái)除去病毒生產(chǎn)細(xì)胞的核酸組分。通過(guò)碘克沙醇密度梯度純化重組的aav載體粒子。將純化的載體粒子用pbs大量透析，并通過(guò)斑點(diǎn)印跡雜交進(jìn)行滴定。

視網(wǎng)膜下注射

使用腹膜內(nèi)注射氯胺酮(90mg/kg)/甲苯噻嗪(9mg/kg)，將小鼠置于全身麻醉。將0.5％丙對(duì)卡因溶液作為局部麻醉劑施用到角膜。通過(guò)局部施用環(huán)噴托酯和鹽酸去氧腎上腺素使瞳孔擴(kuò)大。在眼科手術(shù)顯微鏡下，使用18號(hào)針頭，穿過(guò)與角膜緣鄰近的角膜切開(kāi)一個(gè)小切口。將安裝到hamilton注射器的33號(hào)鈍針頭通過(guò)切口插入到晶狀體后并推過(guò)視網(wǎng)膜。在視網(wǎng)膜的鼻象限內(nèi)的位置，在視網(wǎng)膜下進(jìn)行全部注射。在視網(wǎng)膜的鼻象限內(nèi)，在視網(wǎng)膜下進(jìn)行注射。每只眼接受2×10⁹載體基因組(aav-orf15-l)/μl或5×10⁹載體基因組(aav-orf15-s)/μl。將rpgr-orf15載體給予至左眼(os，左眼)，并且將對(duì)照載體(aav8-rk-egfp)給予至右眼(od，右眼)。這些在本文中分別被稱為“經(jīng)處理的”或“對(duì)照”。通過(guò)向載體懸浮液中添加0.1體積％的熒光素(100mg/mlak-fluor,alcon,inc.)來(lái)輔助注射期間的可視化(visualization)。注射之后的眼底檢查發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)情況下>30％的視網(wǎng)膜分離，確認(rèn)了成功的視網(wǎng)膜下遞送。在1月齡時(shí)對(duì)小鼠群(總共n＝50)進(jìn)行注射以進(jìn)行蛋白表達(dá)研究，并且在主要感光細(xì)胞喪失之前在3至7月齡時(shí)(因?yàn)閑rg在該月齡期間保持正常)進(jìn)行注射以進(jìn)行功能(erg)和組織學(xué)研究。

組織學(xué)和免疫熒光法

對(duì)于光學(xué)顯微鏡檢查和透射電子顯微鏡檢查，將摘出的眼固定在溶于0.1m二甲胂酸鹽緩沖液(ph7.5)中的1％甲醛、2.5％戊二醛中10分鐘。在除去前段和晶狀體之后，在4℃將眼杯(eyecup)留在相同的固定劑中過(guò)夜。將眼杯用緩沖液沖洗，然后在四氧化鋨中后固定，通過(guò)分級(jí)醇系列脫水并包埋在epon中。切割半薄切片(1μm)，用于光學(xué)顯微鏡觀察。對(duì)于em，將超薄切片在乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛中染色，然后在jeol100cx電子顯微鏡上檢查。

對(duì)于纖毛蛋白的免疫熒光染色，摘除眼睛，速凍并在低溫恒溫器中切成10μm切片。然后在玻片上收集未固定的冷凍切片并進(jìn)行染色。對(duì)于所有其他蛋白的免疫染色，收集漂浮的視網(wǎng)膜切片并進(jìn)行染色。對(duì)于這一過(guò)程，將眼置于固定劑(2％甲醛，0.25％戊二醛/pbs)中并除去它們的前段和晶狀體。固定的持續(xù)時(shí)間通常為20分鐘。將固定的組織浸泡在30％蔗糖/pbs中至少2小時(shí)，速凍并與未固定的組織類似地切成切片。然后將切片收集到pbs緩沖液中并使其在免疫染色過(guò)程的持續(xù)時(shí)間中保持自由漂浮。觀察染色的切片并在激光掃描共焦顯微鏡(modeltcssp2；leica)上拍照。使用的抗體是小鼠rpgr(si)、人rpgrc100、抗小根蛋白、1d4(抗視紫紅質(zhì))、混合藍(lán)/綠視錐抗視蛋白和hoechst33342、核染料染色。

免疫印跡分析

在ripa緩沖液中使視網(wǎng)膜組織均質(zhì)化，在laemmli緩沖液中煮沸并在5％sds-page凝膠上以15μg/泳道上樣。凝膠分離后，通過(guò)電轉(zhuǎn)移將蛋白質(zhì)印在pvdf膜上。將膜用5％脫脂乳封閉，并在室溫下用一級(jí)抗體孵育過(guò)夜。沖洗后，將膜用過(guò)氧化物酶綴合的二級(jí)抗體孵育。westpico化學(xué)發(fā)光底物(pierce)用于檢測(cè)。對(duì)于歸一化(normalization)，將蛋白質(zhì)樣品在sds-page上分離并用轉(zhuǎn)導(dǎo)素α抗體(vanderbilt大學(xué)heidihamm博士的贈(zèng)予)探測(cè)。

erg記錄

使小鼠在黑暗中過(guò)夜適應(yīng)，在試驗(yàn)前經(jīng)腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉來(lái)麻醉小鼠。使用鹽酸去氧腎上腺素和鹽酸環(huán)噴托酯來(lái)使每只動(dòng)物的兩個(gè)瞳孔局部放大，然后將小鼠置于加熱的平臺(tái)上。在ganzfeld拱頂(dome)中使用以1分鐘間隔出現(xiàn)的白光的10-μs閃光(1.37×10⁵cd/m²)在黑暗中引起視桿主導(dǎo)的反應(yīng)。在41cd/m²視桿脫敏的白光背景下，使用以1hz間隔出現(xiàn)的相同閃光(1.37×10⁵cd/m²)來(lái)引起光適應(yīng)的視錐反應(yīng)。使用與每只角膜(其用鹽酸丙對(duì)卡因局部麻醉并用羥丙甲纖維素眼液(goniosol)潤(rùn)濕)接觸的銀線環(huán)形電極同時(shí)從雙眼監(jiān)測(cè)erg，使用頸部中的皮下電極作為參照；將電屏蔽的室用作接地端(ground)。

將所有反應(yīng)在1000增益(在2hz和300hz下-3db；am502,tektronixinstruments,beaverton,or)下差異放大，使用可調(diào)節(jié)的峰峰輸入振幅在16位分辨率下數(shù)字化(pci-6251,nationalinstruments,austin,tx)，并使用定制軟件在個(gè)人計(jì)算機(jī)上顯示(labview,version8.2,nationalinstruments)。單獨(dú)地對(duì)于每只眼，將視錐反應(yīng)通過(guò)60hz陷波濾波器和可調(diào)節(jié)的產(chǎn)物-拒絕窗口(artifact-rejectwindow)進(jìn)行調(diào)整，求和(n＝4-20)，然后擬合到具有可變硬度的三次樣條函數(shù)以提高信噪比而不影響時(shí)間特征；以這種方式，我們能夠以小至2μv來(lái)解析b波反應(yīng)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用jmp，版本6(sasinstitute,cary,nc)來(lái)比較橫向的erg振幅和隱含的次數(shù)。使用procmixedofsas，版本9.3(sasinstitute)的重復(fù)測(cè)量分析用于組織學(xué)比較并用于比較處理的眼相對(duì)于未處理的眼的縱向erg數(shù)據(jù)。

患者

檢查從sharon,etal(2003)中記載的數(shù)據(jù)組獲得的針對(duì)111名患有因orf15rpgr突變而導(dǎo)致的xlrp的患者的全視野視網(wǎng)膜電圖(erg)數(shù)據(jù)，以比較對(duì)0.5hz白光的b波振幅，其反映了剩余的視桿+視錐功能，以及對(duì)相同白光的30hz閃光的b波振幅，其反映了剩余的單獨(dú)的視錐功能。為了確定他們是否患有視桿-視錐或視錐-視桿疾病，我們計(jì)算了對(duì)于od和對(duì)于os他們對(duì)0.5hz閃光的振幅除以他們對(duì)30hz閃光的振幅的比值；在我們的系統(tǒng)中正常的下限的相同比值為350μv/50μv＝7。為了更精確地定量對(duì)0.5hz閃光的反應(yīng)振幅并且使主要的感光細(xì)胞變性的可能的次要效應(yīng)最小化，我們集中在其對(duì)0.5hz閃光的振幅>50μv(反映出早期或程度較輕的疾病)的那些患者(n＝14)。

具有orf15突變的患者的erg

對(duì)于14名對(duì)0.5hz白光閃光具有最強(qiáng)反應(yīng)(反映出剩余的視桿+視錐功能)的患者而言，對(duì)該條件的振幅范圍為53μv至329μvod和59μv至282μvos。他們對(duì)相同白光的30hz閃光的振幅(反映出單獨(dú)的視錐功能并使用帶通濾波和振幅<10μv的信號(hào)平均來(lái)進(jìn)行監(jiān)測(cè))范圍為0.98μv至23.5μvod和0.95μv至20μvos。對(duì)0.5hz閃光的反應(yīng)振幅除以對(duì)30hz閃光的反應(yīng)振幅的比值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差為47.0±12.7od和48.7±13.0os。這些平均值顯著不同于7.0——基于正常的下限的比值(非參數(shù)符號(hào)秩檢驗(yàn)，p＝0.0004od和p＝0.001os)。換言之，這些具有orf15突變的患者具有顯著不成比例的視錐功能喪失。這些erg的實(shí)例示于圖6。

實(shí)施例1.aav介導(dǎo)的人rpgrorf15的表達(dá)

我們構(gòu)建了兩種人rpgrorf15置換基因，一種具有126個(gè)密碼子的框內(nèi)缺失(長(zhǎng)型，orf15-l)，另一種具有314個(gè)密碼子的框內(nèi)缺失(短型，orf15-s)。將這兩種基因插入到aav8載體中，所述載體受人視紫紅質(zhì)激酶啟動(dòng)子(圖1a)的控制(khaniandothers2007；sunandothers2010)。所述兩種人rpgrorf15置換基因的視網(wǎng)膜下遞送(左眼)導(dǎo)致產(chǎn)生重組rpgr蛋白。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法，在給予aav載體之后2周，長(zhǎng)型orf15產(chǎn)生約160kd蛋白，而短型orf15產(chǎn)生約125kd蛋白。這兩種蛋白產(chǎn)物都小于人視網(wǎng)膜組織中的天然orf15(約200kd)(圖1b、c)。當(dāng)使用針對(duì)人rpgr的c端的抗體探測(cè)時(shí)，這兩種置換orf15形式呈現(xiàn)為單一條帶。在我們的實(shí)驗(yàn)條件和給予的劑量下，orf15-s和orf15-l的表達(dá)水平是相當(dāng)?shù)?。?duì)照眼(右眼)接受aav-gfp。

通過(guò)未固定的冰凍切片的免疫熒光染色可在rpgr^-/-小鼠的視網(wǎng)膜中看見(jiàn)orf15的兩種形式(視網(wǎng)膜下注射之后3周)，其準(zhǔn)確定位于連接纖毛所在的內(nèi)段和外段之間的層。然而，短型(aav8-orf15-s)產(chǎn)生的信號(hào)比長(zhǎng)型(aav8-orf15-l)產(chǎn)生的信號(hào)弱得多(圖2a)。在良好轉(zhuǎn)導(dǎo)的視網(wǎng)膜區(qū)，來(lái)自經(jīng)長(zhǎng)型處理的視網(wǎng)膜的信號(hào)似乎無(wú)法與野生型信號(hào)區(qū)分開(kāi)(圖2a、b)。使用抗體對(duì)纖毛根絲——其源自基體的近端并向細(xì)胞內(nèi)部延伸，因此被用作纖毛區(qū)的極好的標(biāo)記物(hongandothers2003；yangandothers2002)——進(jìn)行的雙標(biāo)記確認(rèn)了重組rpgr到連接纖毛的準(zhǔn)確亞細(xì)胞定位(圖2b)。不同于通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定的蛋白表達(dá)水平的相似性，只有長(zhǎng)型orf15似乎在與根絲數(shù)目匹配的每個(gè)cc具有強(qiáng)信號(hào)，而在短型處理的視網(wǎng)膜中，許多根絲在其遠(yuǎn)端不具有rpgr信號(hào)。圖2c示出了相對(duì)于用長(zhǎng)型或短型人orf15處理的rpgr^-/-小鼠視網(wǎng)膜中以及未處理的野生型小鼠視網(wǎng)膜中的小根蛋白纖維的計(jì)數(shù)，代表rpgr標(biāo)記計(jì)數(shù)的柱狀圖。orf15長(zhǎng)型相對(duì)于野生型，平均比值(rpgr信號(hào)計(jì)數(shù)除以小根蛋白纖維計(jì)數(shù))沒(méi)有差異(dunnett’s方法，p＝.24)，但是與野生型相比，orf15短型的平均比值顯著更低(p＝.0019)。

鑒于通過(guò)免疫印跡法測(cè)定的相似的表達(dá)水平，在連接纖毛處的蛋白定位差異表明，或許一部分短型orf15錯(cuò)誤定位到感光細(xì)胞內(nèi)部的其他位置。通過(guò)免疫染色對(duì)固定的視網(wǎng)膜切片(其以損耗信號(hào)強(qiáng)度為代價(jià)，更好地保存組織)的進(jìn)一步分析揭示出短型orf15的錯(cuò)誤定位到感光細(xì)胞內(nèi)段和外段的orf15模式(圖2d)。對(duì)于長(zhǎng)型orf15而言，未見(jiàn)到錯(cuò)誤定位，所述長(zhǎng)型orf15與野生型具有相似的染色模式。因此，短型rpgr在cc處的染色缺乏是由于定位于或局限于該亞細(xì)胞區(qū)室的能力降低，而非總體表達(dá)水平更低。

實(shí)施例2.在rpgr無(wú)效的小鼠中的人orf15-l(長(zhǎng)型)表達(dá)促進(jìn)視桿和視錐細(xì)胞存活

為了研究所述兩種置換基因的治療功效，我們通過(guò)免疫染色評(píng)估了rpgr^-/-小鼠感光細(xì)胞以尋找視桿和視錐細(xì)胞形態(tài)改善的征象。到13月齡(處理后6個(gè)月)時(shí)，使用短型人orf15未觀察到視桿或視錐細(xì)胞形態(tài)的顯著差異(圖3)；在該月齡時(shí)對(duì)照和短型orf15處理的眼都具有典型的變性外觀。與野生型眼相比，視桿和視錐外段縮短且無(wú)序，可看見(jiàn)視桿視蛋白在整個(gè)外核層的錯(cuò)誤定位以及視錐視蛋白另外在突觸層中的錯(cuò)誤定位。在對(duì)照和短型orf15處理的眼中，外核層的厚度也同樣減小。

相比之下，用長(zhǎng)型人orf15處理的眼在視桿細(xì)胞中具有正確分布于外段的視蛋白表達(dá)，沒(méi)有明顯的錯(cuò)誤定位征象。類似地，在這些用更長(zhǎng)的orf15構(gòu)建體處理的眼中，視錐視蛋白的錯(cuò)誤定位是罕見(jiàn)的。此外，發(fā)現(xiàn)經(jīng)orf15-l處理的眼比對(duì)照或經(jīng)orf15-s處理的眼具有更多的視桿和視錐細(xì)胞(具有幾乎正常的外段)。

基于這些發(fā)現(xiàn)，在用長(zhǎng)型orf15處理的小鼠中進(jìn)行縱向研究。為了定量經(jīng)orf15-l處理的眼相對(duì)于對(duì)照眼的拯救程度，我們測(cè)量了3只rpgr^-/-小鼠的對(duì)側(cè)眼中外核層(onl)的厚度和感光細(xì)胞內(nèi)段/外段的長(zhǎng)度。這些在上半球的3個(gè)區(qū)和下半球的3個(gè)區(qū)中進(jìn)行測(cè)量，每個(gè)區(qū)分隔600μm并且在沿著垂直經(jīng)線距視神經(jīng)頭的任一側(cè)600μm處開(kāi)始；在11月齡和18月齡時(shí)，使用重復(fù)測(cè)量全因子回歸來(lái)鑒定作為主效應(yīng)的眼、半球和區(qū)域以及它們的交叉產(chǎn)物的差異，以確定治療作用是否在位置上發(fā)生改變。在11月齡時(shí)，onl厚度正常分布但是內(nèi)段/外段長(zhǎng)度不是正常分布(shapiro-wilkw擬合優(yōu)度檢驗(yàn)，p＝.016)；在18月齡時(shí)，onl厚度和內(nèi)段/外段長(zhǎng)度都不是正常分布(分別為p＝.0011和p＝.0002)。在11月齡時(shí)，經(jīng)處理的眼的平均onl厚度(48.0μm)顯著大于對(duì)照眼(38.0μm,p＝.0015)；經(jīng)處理的眼的平均內(nèi)段/外段長(zhǎng)度(45.1μm)也顯著大于對(duì)照眼(29.5μm，p<.0001，對(duì)于歸一化的秩p<.0001)。在該月齡時(shí)，對(duì)于上半球和下半球而言，關(guān)于onl厚度和is/os長(zhǎng)度的治療益處是相當(dāng)?shù)?。?8月齡時(shí)，對(duì)側(cè)眼之間的視網(wǎng)膜形態(tài)差異更加顯著：對(duì)于經(jīng)處理的眼，平均onl厚度為22.8μm；對(duì)于對(duì)照眼，平均onl厚度為13.7μm(p<.0001，對(duì)于歸一化的秩p<.0001)；而對(duì)于經(jīng)處理的眼，平均內(nèi)段/外段長(zhǎng)度為19.8μm；對(duì)于對(duì)照眼，平均內(nèi)段/外段長(zhǎng)度為7.3μm(p<.0001，對(duì)于歸一化的秩p<.0001)。在該月齡時(shí)，我們最初觀察到，18月齡時(shí)對(duì)于is/os長(zhǎng)度而言在上部視網(wǎng)膜的治療益處顯著大于在下部視網(wǎng)膜的治療益處(p＝.0036)，但是將長(zhǎng)度轉(zhuǎn)換為歸一化的秩之后不再成立(p＝.17)。圖4a說(shuō)明了3只18月齡的小鼠中經(jīng)處理的眼和對(duì)照眼中根據(jù)區(qū)域的onl厚度和is/os長(zhǎng)度。

圖4b示出了取自18月齡時(shí)代表性的經(jīng)orf15-l處理的眼和對(duì)側(cè)對(duì)照眼的代表性光顯微圖像。在對(duì)照視網(wǎng)膜中，保存最好的區(qū)域僅有約2-3排松散排列的感光細(xì)胞核，具有縮短和無(wú)序的感光細(xì)胞內(nèi)段/外段。注意到內(nèi)段和外段的邊緣不再明顯。另一方面，經(jīng)處理的視網(wǎng)膜始終具有約5-6排感光細(xì)胞，具有更長(zhǎng)、更有序和明顯的內(nèi)段和外段。

實(shí)施例3.人rpgrorf15長(zhǎng)型表達(dá)改善了視桿和視錐細(xì)胞功能

在9-18月齡的rpgr^-/-小鼠群體(n＝22)中評(píng)估視網(wǎng)膜功能，所述視網(wǎng)膜功能通過(guò)全視野視桿和視錐erg來(lái)監(jiān)測(cè)。小鼠在3至7月齡之間接受治療，并且在注射之后6個(gè)月時(shí)立即記錄后續(xù)erg。圖5a示出了在11至14月齡之間進(jìn)行測(cè)試的16只小鼠的眼的視桿和視錐erg振幅。與野生型小鼠的下限相比，對(duì)照眼(od)顯示出視錐b波振幅相對(duì)于視桿b波振幅的不成比例的損耗，如之前在rpgr^-/-小鼠的鼠模型中所觀察到的以及如視錐-視桿變性所顯示的。在每只小鼠(除一只小鼠以外)中，與對(duì)側(cè)對(duì)照眼(od)相比，經(jīng)處理的眼(os)具有更大的erga波和b波振幅，表明視桿和視錐感光細(xì)胞功能的改善。實(shí)際上，一半以上的經(jīng)處理的眼(9/16)具有等于或大于月齡匹配的野生型值下限(虛線)的視桿b波振幅。視桿erga波振幅的幾何平均值為121μvos和65μvod，視桿ergb波振幅的幾何平均值為482μvos和267μvod。平均視錐ergb波振幅為22μvos和11μvod。這些數(shù)據(jù)表明，對(duì)于該月齡范圍，aav-orf15處理使視桿功能改善81-86％，視錐功能改善100％。

在全部22只小鼠群組中，我們使用重復(fù)測(cè)量縱向回歸來(lái)比較眼的視桿和視錐b波振幅的變化速率(圖5b)。對(duì)于對(duì)照眼的視桿b波振幅，估計(jì)的平均變化速率為-8.6％/月，對(duì)于經(jīng)處理的眼的視桿b波振幅，估計(jì)的平均變化速率為-3.8％/月；這兩個(gè)平均值之間的差異是顯著的(p＝0.0001)。對(duì)于對(duì)照眼的視錐b波振幅，估計(jì)的平均變化速率為-5.8％/月，對(duì)于經(jīng)處理的眼的視錐b波振幅，估計(jì)的平均變化速率為-0.8％/月；這兩個(gè)平均值之間的差異也是顯著的(p<0.0001)。此外，發(fā)現(xiàn)經(jīng)處理的眼的視錐b波振幅的衰減并非顯著不同于零(p＝0.54)，表明視錐功能的穩(wěn)定性，不具有可觀察到的進(jìn)展。

圖5c示出了代表性的視桿和視錐erg以說(shuō)明在經(jīng)處理的眼和對(duì)照眼(包括18月齡(最終時(shí)間點(diǎn))的野生型)中的波形。在該月齡時(shí)對(duì)照眼的視桿功能嚴(yán)重降低(平均降低75％)，而視錐功能最小且在一些情況下實(shí)際上是不可檢測(cè)的。相反，在該時(shí)間點(diǎn)經(jīng)處理的眼仍具有顯著的視桿和視錐功能，盡管其功能低于在野生型眼中所見(jiàn)的那些功能。

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其他實(shí)施方案

應(yīng)理解，盡管已結(jié)合本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但前述說(shuō)明意欲說(shuō)明而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍通過(guò)所附的權(quán)利要求書(shū)的范圍來(lái)限定。其他方面、優(yōu)勢(shì)和修改在以下權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。

序列表

<110>麻省眼耳科醫(yī)院

<120>色素性視網(wǎng)膜炎的rpgr基因治療

<130>00633-0182wo1

<150>us62/028,638

<151>2014-07-24

<160>5

<170>fastseqforwindowsversion4.0

<210>1

<211>3081

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>缺失378bp的人rpgrorf15序列

<400>1

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<210>2

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>缺失126個(gè)氨基酸的人rpgrorf15序列

<400>2

metarggluproglugluleumetproaspserglyalavalphethr

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202530

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354045

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glyglnleuglyleuglyserlysseralaileserlysprothrcys

65707580

vallysalaleulysproglulysvallysleualaalacysglyarg

859095

asnhisthrleuvalserthrgluglyglyasnvaltyralathrgly

100105110

glyasnasngluglyglnleuglyleuglyaspthrglugluargasn

115120125

thrphehisvalileserphephethrsergluhislysilelysgln

130135140

leuseralaglyserasnthrseralaalaleuthrgluaspglyarg

145150155160

leuphemettrpglyaspasnsergluglyglnileglyleulysasn

165170175

valserasnvalcysvalproglnglnvalthrileglylysproval

180185190

sertrpilesercysglytyrtyrhisseralaphevalthrthrasp

195200205

glygluleutyrvalpheglygluprogluasnglylysleuglyleu

210215220

proasnglnleuleuglyasnhisargthrproglnleuvalserglu

225230235240

ileproglulysvalileglnvalalacysglyglygluhisthrval

245250255

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260265270

glnleuglyleuglythrpheleuphegluthrsergluprolysval

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ilegluasnileargaspglnthrilesertyrilesercysglyglu

290295300

asnhisthralaleuilethraspileglyleumettyrthrphegly

305310315320

aspglyarghisglylysleuglyleuglyleugluasnphethrasn

325330335

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340345350

leuvalalacysglyglycyshismetvalvalphealaalaprohis

355360365

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420425430

glythrleuglyleuseralacyspheleuproasnservalphepro

435440445

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500505510

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ileglygluleuthrglnaspthralaleuthrgluasnaspaspser

530535540

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545550555560

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565570575

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595600605

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gluglyglugluglugluglyaspargglugluglugluglulysglu

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755760765

glulysglugluglygluarglyslysglugluargalaglylysglu

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glulysglygluglugluglyaspglnglygluglygluglugluglu

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thrgluglyargglygluglulysglugluglyglygluvalglugly

805810815

glygluvalglugluglylysglygluarggluglugluglugluglu

820825830

glygluglyglugluglugluglygluglyglugluglugluglyglu

835840845

glyglugluglugluglygluglylysglygluglugluglyglugly

850855860

glugluglugluglygluglugluglygluglugluglygluglyglu

865870875880

glugluglygluglygluglygluglugluglugluglygluvalglu

885890895

glygluvalgluglyglugluglygluglygluglygluglugluglu

900905910

glygluglugluglyglugluargglulysgluglygluglygluglu

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101010151020

leulys

1025

<210>3

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<213>智人（homosapiens）

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gatggtcgccacggaaaattaggacttggactggagaattttaccaatcacttcattcct1020

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gtactgcagaggactctatcagcacgtatgcggcgaagagagagggagaggtctccagat1260

tctttttcaatgaggagaacactacctccaatagaagggactcttggcctttctgcttgt1320

tttctccccaattcagtctttccacgatgttctgagagaaacctccaagagagtgtctta1380

tctgaacaggacctcatgcagccagaggaaccagattatttgctagatgaaatgaccaaa1440

gaagcagagatagataattcttcaactgtagaaagccttggagaaactactgatatctta1500

aacatgacacacatcatgagcctgaattccaatgaaaagtcattaaaattatcaccagtt1560

cagaaacaaaagaaacaacaaacaattggggaactgacgcaggatacagctcttactgaa1620

aacgatgatagtgatgaatatgaagaaatgtcagaaatgaaagaagggaaagcatgtaaa1680

caacatgtgtcacaagggattttcatgacgcagccagctacgactatcgaagcattttca1740

gatgaggaagtagagatcccagaggagaaggaaggagcagaggattcaaaaggaaatgga1800

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gagaaaacagagatcctatcagatgaccttacagacaaagcagaggtgagtgaaggcaag1920

gcaaaatcagtgggagaagcagaggatgggcctgaaggtagaggggatggaacctgtgag1980

gaaggtagttcaggagcagaacactggcaagatgaggagagggagaagggggagaaagac2040

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ggggaagaagtggagggagaacgtgaaaaggaggaaggagagaggaaaaaggaggaaaga2340

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gaggggaaaggagagagggaagaggaagaggaggagggtgagggggaagaggaggaaggg2520

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gaaggggagggagaagaggaaggagaaggggagggagaagaggaggaaggagaagggaaa2760

ggggaggaggaaggagaggaaggagaaggggagggggaagaggaggaaggagaaggggaa2820

ggggaggatggagaaggggagggggaagaggaggaaggagaatgggagggggaagaggag2880

gaaggagaaggggagggggaagaggaaggagaaggggaaggggaggaaggagaaggggag2940

ggggaagaggaggaaggagaaggggagggggaagaggaggaaggggaagaagaaggggag3000

gaagaaggagagggagaggaagaaggggagggagaaggggaggaagaagaggaaggggaa3060

gtggaaggggaggtggaaggggaggaaggagagggggaaggagaggaagaggaaggagag3120

gaggaaggagaagaaagggaaaaggagggggaaggagaagaaaacaggaggaacagagaa3180

gaggaggaggaagaagaggggaagtatcaggagacaggcgaagaagagaatgaaaggcag3240

gatggagaggagtacaaaaaagtgagcaaaataaaaggatctgtgaaatatggcaaacat3300

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<210>4

<211>1152

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>4

metarggluproglugluleumetproaspserglyalavalphethr

151015

pheglylysserlysphealagluasnasnproglylysphetrpphe

202530

lysasnaspvalprovalhisleusercysglyaspgluhisserala

354045

valvalthrglyasnasnlysleutyrmetpheglyserasnasntrp

505560

glyglnleuglyleuglyserlysseralaileserlysprothrcys

65707580

vallysalaleulysproglulysvallysleualaalacysglyarg

859095

asnhisthrleuvalserthrgluglyglyasnvaltyralathrgly

100105110

glyasnasngluglyglnleuglyleuglyaspthrglugluargasn

115120125

thrphehisvalileserphephethrsergluhislysilelysgln

130135140

leuseralaglyserasnthrseralaalaleuthrgluaspglyarg

145150155160

leuphemettrpglyaspasnsergluglyglnileglyleulysasn

165170175

valserasnvalcysvalproglnglnvalthrileglylysproval

180185190

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245250255

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<213>智人（homosapiens）

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