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技術領域

本發(fā)明涉及用于向眼睛遞送有效量的一種或多種糖皮質激素的聚合物控釋制劑，以及其用于治療和預防疾病，特別是用于治療或預防移植物排斥的使用方法。

背景技術：

角膜是無血管的、透明的結締組織，用作眼睛的折射表面和保護屏障。角膜新生血管形成(NV)是由血管生成因子與抗血管生成因子之間的平衡的破壞引起的。病理狀況(諸如感染、炎癥、創(chuàng)傷和退行性疾病)可能誘導新血管從角膜緣侵入到正常無血管的角膜中。角膜NV可引起脂質滲出、持續(xù)性炎癥和角膜瘢痕形成，并且最終導致喪失角膜透明度和視敏度下降。角膜NV被認為是角膜成形術手術中角膜移植失敗的一個高危因素。

角膜新生血管形成的治療包括氬激光凝固、光動力療法、透熱療法和燒灼術、非類固醇抗炎藥、抗血管上皮生長因子(“VEGF”)劑、基質金屬蛋白酶(“MMP”)抑制劑和皮質類固醇。角膜新生血管形成治療的支柱仍然是局部皮質類固醇。皮質類固醇是用于治療各種免疫疾病和炎性疾病(包括眼睛)的有效的抗炎藥物。皮質類固醇已經顯示出具有有效的抗血管生成功能，并且各種皮質類固醇已被廣泛用于治療眼部新生血管形成。已經應用玻璃體內皮質類固醇或類固醇植入物來治療患者的新生血管性年齡相關性黃斑變性和糖尿病性視網膜病變，因為類固醇減少炎癥，并且還表現出抗血管生成性質以及阻斷血管內皮生長因子(VEGF)的上調(Augustin等人，Current therapies，Clin.Ophthalmol.3(2009)175-182；Pai等人，Saudi J.Ophthalmol.24(2010)143-149)。在不同的動物模型和臨床實踐中證實了針對角膜NV的抗血管生成作用。局部施用地塞米松有效地抑制燒灼術誘導的角膜新生血管形成(Proia等人，Exp.Eye.Res.57(1993)693-698)。對于地塞米松抑制角膜新生血管形成的功效，認為IL-1β誘導的角膜血管生成通過阻斷NF-kB信號而被部分地抑制。

局部皮質類固醇滴眼劑被最廣泛地使用并且對于患者來說是方便的。然而，局部施用的藥物(包括皮質類固醇)的吸收和保留是非常差的，因為通過眨眼、流淚、淚液翻轉和引流從眼表面快速清除。此外，未受損傷的角膜結構影響藥物分子的滲透和穿透。因此，滴眼劑表現出非常低的眼部生物利用度，并且通常小于5％的施用劑量穿透角膜到達眼內組織。因此，需要頻繁滴注滴眼劑以維持眼內藥物水平并且實現治療效果。它可能帶來其它潛在的問題，包括患者依從性和對眼表面的毒性。通過結膜下注射地塞米松磷酸鈉，可以實現前房中高藥物水平長達4小時。已經應用納米技術來改善眼部藥物遞送(Vandervoort，Nanomedicine 2(2007)11-21；Reimondez-Troitino等人，Eu.J.Pharm.Biopharm，2015年3月6日)。納米技術也用于治療角膜NV(Gonzalez等人，J.Ocul.Pharmacol.Ther.29(2013)124-134)。納米技術可以提供靶向、克服眼部屏障、改善眼部生物利用度、控釋、減少副作用等優(yōu)點。

角膜移植是最成熟和最常見的固體組織移植形式，其被廣泛用于治療角膜失效。在美國，每年進行約36,000例角膜移植手術。在無血管和非炎癥性的“低風險”角膜床上，2年移植物存活率可以高達90％，然而，在“高風險”角膜床上，所述比率可以低至50％，其可具有先前的移植物排斥或顯示新生血管形成或炎癥。針對適合于植入的有限的角膜組織，角膜移植失敗可大大地增加眼庫的負擔。

免疫排斥是人角膜移植失敗的主要原因之一。在“正常風險”的無血管和非炎癥性床上，第一年排斥率接近20％，而針對“高風險”新生血管化炎癥性受體床，所述比率可高達50％。用免疫抑制劑治療是提高角膜移植后角膜移植物存活率的正常策略。糖皮質激素是臨床上使用最廣泛的免疫抑制劑，并且它們的功效被廣泛接受。

糖皮質激素可以全身施用或通過局部滴注施用。然而，長期全身性類固醇可引起嚴重的副作用，諸如白內障、青光眼、葡萄糖異常、生長遲緩、機會性感染和骨質疏松?？焖俳悄で扒宄徒悄て琳峡梢酝ㄟ^局部滴注大大地損害滴眼劑的功效。因此，需要頻繁地局部應用類固醇以獲得可接受的結果，并且它可能具有額外確定的眼內壓升高和白內障的風險。

免疫角膜排斥是移植失敗的主要原因。已經將利用糖皮質激素、抗代謝物(即霉酚酸酯)、T細胞抑制劑(即環(huán)孢菌素A、他克莫司、FK506)的免疫抑制療法全身或通過滴眼劑應用于患有角膜移植的患者。針對手術后長時間(數周至數月)的施用，通常，相對全身施用滴眼劑為首選的，因為眼睛是藥物容易接近的器官，并且減少了與全身施用免疫抑制劑有關的全身性副作用。然而，滴眼劑仍然存在問題，諸如從眼前表面清除快速，以及前房中的藥物濃度較低、治療窗口時間短和施用頻繁。

糖皮質激素已被廣泛用于“低風險”和“高風險”角膜移植時控制角膜移植物排斥。局部糖皮質激素仍然是用于控制角膜移植物排斥的“黃金標準”，但它伴有副作用(諸如白內障、眼內壓升高、傷口裂開，以及細菌和真菌感染)的風險。與滴眼劑相比，結膜下(SC)注射地塞米松磷酸鈉(DSP)溶液顯示出在前房處遞送高水平的類固醇DSP更有效。甚至24小時后，前房中的DSP水平仍然是可檢測到的，其中眼部組織中延長的藥物保留是由SC施用的貯庫效應引起的。結膜下注射類固醇比局部施用和全身施用有許多優(yōu)點，然而，眼部組織中的藥物仍然太短，以至于不能單次施用就獲得良好的治療效果。

為了治療眼睛的慢性疾病，需要用于將糖皮質激素遞送到眼睛的長效方法。提供延長遞送的制劑將使與施用許多糖皮質激素相關的毒性的可能性減至最小。另外，減少頻繁注射的需要將降低眼內炎的風險，并且降低頻繁就醫(yī)(其是患者及其家屬的主要困難)的負擔。

因此，本發(fā)明的目的是提供具有改善的功效的糖皮質激素的制劑。

技術實現要素：

糖皮質激素是控制角膜排斥使用最廣泛的免疫抑制劑。由于快速眼部清除，需要頻繁地局部滴注糖皮質激素滴眼劑。它可能引起患者依從性差和嚴重的副作用的問題。已經發(fā)現，已經開發(fā)了可生物降解的聚合物顆粒，其被親水性聚合物致密地涂覆并且包封糖皮質激素(諸如通過金屬離子與磷酸基或羧基的螯合與形成納米顆粒的聚合物復合的糖皮質激素、與在所述聚合物末端的羧基端基復合的糖皮質激素，以及糖皮質激素的水溶性鹽)，所述可生物降解的聚合物顆粒在體外持續(xù)釋放糖皮質激素長達七天，可以通過結膜下(SC)注射施用，并且保留在眼睛的結膜組織中兩周。實例證明了將糖皮質激素(諸如地塞米松磷酸鈉(DSP))包封在基質(諸如可生物降解的聚(乳酸-共-羥基乙酸)(PLGA))中的納米顆粒的優(yōu)點，所述納米顆粒被親水性聚合物(諸如PEG或 F127)致密地涂覆，所述納米顆粒表現出在體外持續(xù)釋放DSP長達7天。載有DSP的PLGA納米顆粒(DSP-NP)可以通過結膜下(SC)注射容易地施用并且保留在結膜組織中長達2周的延長時間。SC注射后的游離DSP溶液通常在前2小時內清除，并且在24小時后眼部組織中幾乎沒有可檢測到的DSP。相比之下，在7天的研究時間內，DSP-NP可以在眼部組織(包括前房和玻璃體)中提供持續(xù)水平的DSP。在優(yōu)選的實施例中，糖皮質激素通過金屬離子與糖皮質激素中的磷酸基或羧基和納米顆粒中的可生物降解的聚合物的螯合而復合。使用含多羧基的聚合物獲得高載藥量、緩釋等；并且制備載有DSP的微球(水包油包固體乳劑法)，已發(fā)現所述載有DSP的微球大大增加了載藥量并且減慢了釋放速率。在一個實施例中，所述顆粒是具有高達100微米的直徑的微粒。在另一個實施例中，所述顆粒是納米顆粒。

如實例所證明的，與生理鹽水對照、空顆粒和游離DSP溶液相比，在大鼠角膜同種異體移植物排斥模型中每周SC注射的DSP-NP制劑顯示出顯著更大的功效。當用生理鹽水或空納米顆粒處理時，大多數移植物在2周內被排斥。使用DSP處理組，在手術后4周，移植物全部被排斥。當所有角膜移植物用DSP-NP處理時，它們在整個9周的研究時間內保持透明和不被排斥。這些結果證明，持續(xù)釋放糖皮質激素的納米顆粒可以通過SC施用、每月注射用于角膜排斥的DSP-PLA2COOH納米顆粒而有效地預防角膜同種異體移植物排斥。

如實例所證明的，提供皮質類固醇地塞米松磷酸鈉(DSP)的持續(xù)釋放的該可生物降解的納米顆粒制劑可以提供角膜新生血管形成、葡萄膜炎的有效抑制，并且可以有助于治療青光眼。所述顆?？梢栽谑中g時注射到眼睛中，并且然后還在此之后周期性地注射。在用于預防角膜新生血管形成的優(yōu)選實施例中，所述顆粒在結膜下被注射。在治療葡萄膜炎(全葡萄膜炎或中間/后葡萄膜炎)的優(yōu)選實施例中，所述顆粒經眼周注射而被注射，使得高水平的藥物存在于玻璃體中。DSP-NP結膜下注射可以通過視網膜炎性細胞因子水平測量來預防LPS誘導的葡萄膜炎。中間葡萄膜炎和后葡萄膜炎難以用局部滴眼劑治療，并且侵入性較少的眼周注射(包括結膜下注射)比侵入性較多的玻璃體內注射有利。

附圖說明

圖1是DSP/PLGA納米顆粒的體外藥物釋放分布的曲線圖，其繪制了隨時間(天)變化的累積釋放率(％)。

圖2是具有PS-PEG涂層的不可降解的聚苯乙烯顆粒(100nm、200nm、500nm、1微米、5微米)在結膜下(“SC”)注射到大鼠中后隨時間(天)變化的保留百分比的曲線圖，所述保留百分比通過熒光劑皮下施用于大鼠后的ZenogenIVIS Spectrum光學成像定量。

圖3是SC注射到大鼠中的PLGA/F127納米顆粒隨時間(天)變化在眼睛中的保留百分比的曲線圖。該值可能受到染料從聚合物鏈的斷裂的影響。

圖4A-4D是游離DSP溶液和DSP-NP皮下施用于大鼠后的藥代動力學(隨時間(天)變化的DSP/ml)的曲線圖。圖4A是在注射部位；圖4B是在房水中；圖4C是在玻璃體液中；以及圖4D是在血液中。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。

圖5是通過測量所有組織中³H-DSP的放射性而定量的眼外組織(移除視網膜、角膜、玻璃體液和房水后的眼部組織)中單獨注射或包封在NP中的保留的DSP劑量的曲線圖。在一些數據點沒有值意味著所述水平不可檢測到。

圖6是就角膜透明度、水腫和新血管而言用SC注射生理鹽水、NP、DSP或DSP-NP處理的移植物在結束時間點的臨床評價的條形圖。針對DSP-NP，在透明度和水腫上沒有顯示條，意味著移植物是完全透明的并且沒有水腫。

圖7是用SC注射生理鹽水對照、空NP、游離DSP或DSP-NP處理的移植角膜移植物的存活曲線。

圖8是隨時間(天或周)變化的眼內壓(IOP)的曲線圖，其中通過角膜移植物移植、接著用生理鹽水、空NP、游離DSP或DSP-NP處理在眼睛上測量IOP。將正常的眼睛用作對照。

圖9A-9B是用SC注射生理鹽水、DSP和DSP-NP處理后針對NV面積(圖9A)和血管長度(圖9B)的角膜新生血管形成的定量分析的曲線圖。

圖10A和10B是針對DSP-NP、游離DSP、生理鹽水和健康用RT-PCR測量的與在(圖10A)PO7天和(圖10B)PO14天的角膜新生血管形成相關的細胞因子水平的曲線圖。

圖11是SC注射生理鹽水、游離DSP和DSP-NP處理后的IOP(mm Hg)的曲線圖。

圖12是DSP-NP在漏槽條件下在體外在15天內持續(xù)藥物釋放的曲線圖，所述DSP-NP表現出200±8nm的尺寸、8wt％的載藥量。

圖13A和13B是在前房(圖13A)和玻璃體(圖13B)中顯示高藥物水平的大鼠中SC施用DSP-NP后至少7天的持續(xù)高眼部藥物水平的曲線圖。

圖14是IP注射LPS后3小時和24小時成像并評分的前段的炎癥評分的曲線圖，其顯示出DSP-NP預防組具有比對照組顯著更少的炎癥。

圖15是24小時免疫后三組EIU模型中視網膜中IL-1b、IL-6和TNF的mRNA表達的曲線圖，其顯示出與安慰劑-NP組和PBS組相比，DSP-NP組中的表達顯著降低。

圖16A-16D是DSP-PLA2COOH納米顆粒結膜下注射到大鼠的藥代動力學(隨時間(天)變化的ngDSP/ml)的曲線圖。圖16A，眼房；圖16B，玻璃體；圖16C，血液；以及圖16D，注射部位對照。

圖17A-17E是針對(17A-17C)DSP-PLA2COOH納米顆粒處理組和(17D-17F)生理鹽水對照組的整個12周隨訪期間隨時間(天)變化的移植物的臨床觀察的曲線圖。箭頭表示治療注射時間點。圖17A，17D是透明度分數；圖17B，17E是水腫分數，以及圖17C，17F是新生血管形成。

圖18是針對生理鹽水對照組和DSP-PLA2COOH納米顆粒處理組的存活曲線(隨時間(天)變化的存活百分比)。

圖19A和19B是與對照(19B)相比以每月間隔(19A)用DSP-PLA2COOH納米顆粒處理的動物隨時間(天)變化的眼內壓的曲線圖。

具體實施方式

I.定義

如本文所使用的，“活性劑”是指在體內局部和/或全身作用的生理學或藥理學活性物質?；钚詣┦鞘┯媒o患者用于治療(例如治療劑)、預防(例如預防劑)或者診斷(例如診斷劑)疾病或病癥的物質。如本文所使用的，“眼用藥物”或“眼用活性劑”是指施用給患者以緩解、延遲發(fā)作或預防眼睛疾病或病癥的一種或多種癥狀的試劑，或者可用于成像或以其它方式評估眼睛的診斷劑。

如本文所使用的，“有效量”或“治療有效量”是指有效緩解、延遲發(fā)作或預防一種或多種癥狀，特別是眼睛疾病或病癥的一種或多種癥狀的聚合物納米顆粒的量。在年齡相關性黃斑變性的情況下，有效量的聚合物納米顆粒延遲、減少或預防患者的視力損失。

如本文所使用的，“生物相容的”和“生物學上相容的”通常是指對受體通常無毒并且不會對受體造成任何顯著不良影響的材料(以及其任何代謝物或降解產物)。一般來說，生物相容的材料是當施用給患者時不會引起顯著的炎性反應或免疫反應的材料。

如本文所使用的，“可生物降解的聚合物”通常是指通過在生理條件下的酶促作用和/或水解降解或腐蝕成能夠被受試者代謝、消除或排泄的較小單元或化學物質的聚合物。降解時間是聚合物組成、形態(tài)(諸如孔隙率、顆粒尺寸)和環(huán)境的函數。

如本文所使用的，“親水性的”是指對水具有親和力的性質。例如，親水性聚合物(或親水性聚合物鏈段)是主要可溶于水溶液和/或具有吸水傾向的聚合物(或聚合物鏈段)。通常，聚合物越親水，該聚合物越趨向于溶于水、與水混合或被水潤濕。

如本文所使用的，“疏水性的”是指對水缺乏親和力或者甚至排斥水的性質。例如，聚合物(或聚合物鏈段)越疏水，該聚合物(或聚合物鏈段)越趨向于不溶于水、不與水混合或不被水潤濕。

親水性和疏水性可以用相對術語來表示，諸如但不限于一組聚合物或聚合物鏈段內的親水性/疏水性圖譜。在其中討論了兩種或更多種聚合物的一些實施例中，當與另一種更親水的聚合物相比時，可以基于聚合物的相對疏水性來定義術語“疏水性聚合物”。

如本文所使用的，“納米顆?！蓖ǔＪ侵妇哂屑s10nm直至但不包括約1微米、優(yōu)選地100nm至約1微米的直徑(諸如平均直徑)的顆粒。所述顆?？梢跃哂腥魏涡螤?。具有球形形狀的納米顆粒通常被稱為“納米球”。

如本文所使用的，“微?！蓖ǔＪ侵妇哂屑s1微米至約100微米、優(yōu)選地約1微米至約50微米、更優(yōu)選地約1至約30微米的直徑(諸如平均直徑)的顆粒。所述微?？梢跃哂腥魏涡螤睢＞哂星蛐涡螤畹奈⒘Ｍǔ１环Q為“微球”。

如本文所使用的，“分子量”通常是指本體聚合物的相對平均鏈長，除非另有說明。實際上，可以使用各種方法(包括凝膠滲透色譜法(GPC)或毛細管測粘法)估計或表征分子量。GPC分子量被報道為與數均分子量(Mn)相對的重均分子量(Mw)。毛細管測粘法提供分子量的估計，作為使用特定的一組濃度、溫度和溶劑條件從稀釋聚合物溶液測定的特性粘度。

如本文所使用的，“平均顆粒尺寸”通常是指顆粒群體中的顆粒的統(tǒng)計平均顆粒尺寸(直徑)?；厩蛐蔚念w粒的直徑可以指物理直徑或流體動力學直徑。非球形顆粒的直徑可以優(yōu)選地指流體動力學直徑。如本文所使用的，非球形顆粒的直徑可以指顆粒表面上的兩個點之間的最大線性距離。平均顆粒尺寸可以使用本領域已知的方法(諸如動態(tài)光散射)測量。

“單分散”和“均勻尺寸分布”在本文中可互換使用，并且描述納米顆?；蛭⒘Ｈ后w，其中所有顆粒具有相同或接近相同的尺寸。如本文所使用的，單分散分布是指其中90％或更多的分布在中值顆粒尺寸的15％以內、更優(yōu)選地在中值顆粒尺寸的10％以內、最優(yōu)選地在中值顆粒尺寸的5％以內的顆粒分布。

如本文所使用的，“藥學上可接受的”是指在合理的醫(yī)學判斷范圍內，適用于與人類和動物的組織接觸而沒有過度的毒性、刺激、過敏反應或者其它問題或并發(fā)癥，與合理的收益/風險比相稱的化合物、載體、賦形劑、組合物和/或劑型。

如本文所使用的，“分支點”是指用于將多個親水性聚合物鏈段連接到疏水性聚合物鏈段的一端或將多個疏水性聚合物鏈段連接到親水性鏈段的一端的聚合物納米顆粒的一部分。

如本文所使用的，“糖皮質激素”是指降低HIF-1的水平和/或其刺激在其啟動子區(qū)含有缺氧反應元件的基因轉錄的能力的藥物。

如本文通常所使用的，“植入物”是指被結構化、定尺寸或以其它方式構造成優(yōu)選地通過注射或手術植入被植入在身體的特定區(qū)域中以便通過在植入部位在延長的時間段內釋放一種或多種糖皮質激素提供治療益處的聚合物裝置或元件。例如，眼內植入物是被結構化、定尺寸或以其它方式構造成優(yōu)選地通過注射或手術植入放置在眼睛中，并且通過在延長時間內釋放一種或多種糖皮質激素治療眼睛的一種或多種疾病或病癥的聚合物裝置或元件。眼內植入物通常與眼睛的生理條件是生物相容的，并且不會引起不良的副作用。通常，眼內植入物可以被放置在眼睛中而不破壞眼睛的視力。

本文定義的值的范圍包括在該范圍內的所有值以及在該范圍內的所有子范圍。例如，如果范圍被定義為從0到10的整數，則所述范圍包括在該范圍內的所有整數以及在該范圍內的任何和所有子范圍，例如1-10、1-6、2-8、3-7、3-9等。

II.聚合物-葡萄糖皮質激素顆粒

在一些實施例中，一種或多種葡萄糖皮質激素分散或包封在聚合物基質中用于遞送到眼睛。聚合物基質可以由不可生物降解或可生物降解的聚合物形成；然而，聚合物基質優(yōu)選地是可生物降解的。聚合物基質可以形成為用于遞送到眼睛的植入物、微粒、納米顆粒或其組合。在施用時，一種或多種糖皮質激素在聚合物基質降解時、在一種或多種抑制劑從聚合物基質擴散出來時，或其組合的情況下在延長的時間段內釋放。通過采用聚合物納米顆粒，可以形成具有更受控制的載藥量和藥物釋放分布的顆粒。

在一些實施例中，控釋制劑含有由一種或多種聚合物納米顆粒形成的顆粒。所述聚合物納米顆粒是含有一種或多種糖皮質激素的嵌段共聚物。通常，嵌段共聚物含有糖皮質激素、一個或多個疏水性聚合物鏈段，以及一個或多個親水性聚合物鏈段。在某些情況下，一個或多個親水性聚合物鏈段通過分支點連接到一個或多個疏水性聚合物鏈段上。通過采用聚合物納米顆粒，可以形成具有更受控制的載藥量和藥物釋放分布的顆粒。另外，可以控制綴合物的溶解度以便使可溶性藥物濃度減至最小，從而使毒性減至最小。

聚合物納米顆粒含有一種或多種糖皮質激素，優(yōu)選地通過金屬離子與磷酸基或羧基的螯合而復合，最優(yōu)選地與在可生物降解的聚合物(諸如含有酯或其它可水解部分的聚合物)末端的羧基端基復合。糖皮質激素可以衍生成水溶性鹽，并且然后并入聚合物納米顆粒中。

A.糖皮質激素

糖皮質激素是一組抗炎類固醇樣化合物(諸如氫化可的松)，其由腎上腺皮質產生，參與碳水化合物、蛋白質和脂肪代謝，并且被用作抗炎劑。以下是以相對效力的順序的常見葡萄糖皮質激素的列表?？色@得的糖皮質激素具有不同的效力，例如1mg的地塞米松的效果與25mg的氫化可的松相同。下表指出了主要產品的相對效力：

糖皮質激素的相對效力

存在許多其它糖皮質激素，包括阿氯米松、布地奈德、氯倍他索、氯倍他松、地奈德、氟輕松、氟可龍、氟尼縮松、氟替卡松、甲基潑尼松龍、莫米松、帕拉米松、利美索龍和替可的松。涉及移植物排斥的大多數情況利用更有效的化合物，諸如地塞米松或倍他米松。

水溶性糖皮質激素鹽可以商業(yè)獲得或者使用常規(guī)化學合成。優(yōu)選的鹽包括磷酸鹽(諸如地塞米松磷酸鈉和氫化可的松磷酸鈉)和羧酸鹽(諸如氫化可的松琥珀酸鈉和甲基潑尼松龍琥珀酸鈉)。

B.形成納米顆粒的聚合物

聚合物納米顆?？梢院幸环N或多種聚合物、均聚物或共聚物。在優(yōu)選的實施例中，聚合物是可生物降解的聚合物。在疏水性聚合物是可生物降解的情況下，可以選擇聚合物降解分布以影響活性劑在體內的釋放速率。例如，可以選擇聚合物在7天至2年、更優(yōu)選地7天至56周、更優(yōu)選地4周至56周、最優(yōu)選地8周至28周的時間段內降解。

合適的疏水性聚合物的實例包括：聚羥基酸，諸如聚(乳酸)、聚(羥基乙酸)和聚(乳酸-共-羥基乙酸)；聚羥基鏈烷酸酯，諸如聚3-羥基丁酸酯或聚4-羥基丁酸酯；聚己內酯；聚(原酸酯)；聚酐；聚(磷腈)；聚(羥基鏈烷酸酯)；聚(丙交酯-共-己內酯)；聚碳酸酯，諸如酪氨酸聚碳酸酯；聚酰胺(包括合成和天然聚酰胺)、多肽和聚(氨基酸)；聚酯酰胺；聚酯；聚(二氧環(huán)己酮)；聚(亞烷基烷基化物)；疏水聚醚；聚氨酯；聚醚酯；聚縮醛；聚氰基丙烯酸酯；聚丙烯酸酯；聚甲基丙烯酸甲酯；聚硅氧烷；聚(氧化亞乙基)/聚(氧化丙烯基)共聚物；聚縮酮；聚磷酸酯；聚羥基戊酸酯；聚亞烷基草酸酯；聚亞烷基琥珀酸酯；聚(馬來酸)，以及它們的共聚物。

在優(yōu)選的實施例中，聚合物是聚羥基酯，諸如聚乳酸、聚羥基乙酸或其共聚物。可以優(yōu)化羥基乙酸與乳酸的比例以控制降解速率。

聚合物可以是聚酐。聚酐可以是脂肪族聚酐、不飽和聚酐或芳香族聚酐。代表性的聚酐包括聚己二酸酐、聚富馬酸酐、聚癸二酸酐、聚馬來酸酐、聚蘋果酸酐、聚鄰苯二甲酸酐、聚間苯二甲酸酐、聚天冬氨酸酐、聚對苯二甲酸酐、聚間苯二甲酸酐、聚羧基苯基氧丙烷酸酐、聚羧基苯基氧己烷酸酐，以及這些聚酐與其它聚酐以不同摩爾比的共聚物。在美國專利號4,757,128、4,857,311、4,888,176和4,789,724中公開了其它合適的聚酐。聚酐也可以是含有聚酐嵌段的共聚物。在某些實施例中，聚合物是聚癸二酸酐。在某些實施例中，聚合物是聚(1,6-雙(對羧基苯氧基)己烷-共-癸二酸)(聚(CPH-SA)。在某些實施例中，聚合物是聚(1,3-雙(對羧基苯氧基)丙烷-共-癸二酸)(聚(CPP-SA)。

疏水性聚合物的分子量可以改變以制備形成具有對于特定應用最佳的性質(諸如藥物釋放速率)的顆粒的聚合物納米顆粒。聚合物可以具有約150Da至1MDa的分子量。在某些實施例中，聚合物具有在約1kDa至約100kDa之間、更優(yōu)選地在約1kDa至約50kDa之間、最優(yōu)選地在約1kDa至約25kDa之間的分子量。

C.親水性聚合物

納米顆粒被親水性聚合物涂覆。這些必須是親水的、生物相容的(即它不誘導顯著的炎性反應或免疫反應)、無毒的聚合物或共聚物。合適的聚合物的實例可以包括：聚(亞烷基二醇)，諸如聚乙二醇(PEG)；聚(丙二醇)(PPG)；以及乙二醇和丙二醇、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯醇)的共聚物；以及其共聚物、三元共聚物和混合物。

在優(yōu)選的實施例中，一個或多個親水性聚合物鏈段含有聚(亞烷基二醇)鏈。聚(亞烷基二醇)鏈可以含有8至500個重復單元、更優(yōu)選地40至500個重復單元。合適的聚(亞烷基二醇)包括聚乙二醇、聚丙烯1,2-二醇、聚(環(huán)氧丙烷)、聚丙烯1,3-二醇，及其共聚物。在某些實施例中，一個或多個親水性聚合物鏈段是PEG鏈。在此類情況下，PEG鏈可以是直鏈或支鏈的，諸如在美國專利號5,932,462中描述的那些。在某些實施例中，PEG鏈是直鏈的。

一個或多個親水性聚合物鏈段中的每一個可以獨立地具有約300Da至1MDa的分子量。親水性聚合物鏈段可以具有范圍在上面列出的分子量中的任何兩者之間的分子量。在某些實施例中，一個或多個親水性聚合物鏈段中的每一個具有約1kDa至約20kDa、更優(yōu)選地約1kDa至約15kDa、最優(yōu)選地約1kDa至約10kDa的分子量。在優(yōu)選的實施例中，一個或多個親水性聚合物鏈段中的每一個具有約5kDa的分子量。

不是所有的親水性聚合物都有效。如實例所證明的，優(yōu)選的聚合物是BASF銷售的 F127。是由連接到兩個聚環(huán)氧乙烷(“PEO”)嵌段的一個聚環(huán)氧丙烷(“PPO”)嵌段組成的三嵌段共聚物。PEO嵌段在水性介質中溶解良好，因為它們主要是親水的，而PPO嵌段不溶解，因為它在環(huán)境溫度下主要是疏水的。

III.聚合物納米顆粒的合成

聚合物納米顆?？梢允褂帽绢I域已知的合成方法制備。下面討論了用于制備聚合物納米顆粒的代表性方法。可以根據許多因素，諸如聚合物納米顆粒的結構、構成綴合物的聚合物的特性、活性劑的特性以及作為整體的化合物的結構，來確定用于合成給定聚合物納米顆粒的合適途徑，因為其涉及官能團的相容性、保護基團策略和不穩(wěn)定鍵的存在。

提供了用于受控遞送一種或多種糖皮質激素、將其分散或包封在基質中的聚合物植入物(例如棒、圓盤、薄片等)、微粒和納米顆粒。在一些實施例中，所述顆?；蛑踩胛锖蟹稚⒒虬庠诰酆衔锘|中的一種或多種糖皮質激素。

所述顆?？梢宰鳛閮煞N或更多種不同的聚合物納米顆粒的混合物提供。例如，所述顆?？梢杂珊胁煌奶瞧べ|激素的兩種或更多種聚合物納米顆粒形成。在其它情況下，所述顆粒由含有相同的糖皮質激素的兩種或更多種聚合物納米顆粒形成，以改變糖皮質激素的釋放速率。

具有10nm至1000微米的平均顆粒尺寸的顆粒可用于本文描述的組合物中。在優(yōu)選的實施例中，所述顆粒具有10nm至100微米、更優(yōu)選地約100nm至約50微米、更優(yōu)選地約200nm至約50微米的平均顆粒尺寸。在某些實施例中，所述顆粒是具有500至700nm的直徑的納米顆粒。所述顆?？梢跃哂腥魏涡螤睿峭ǔ榍蛐涡螤?。

在一些實施例中，由一種或多種聚合物納米顆粒形成的顆粒群體是單分散顆粒群體。在其它實施例中，由一種或多種聚合物納米顆粒形成的顆粒群體是多分散顆粒群體。在由一種或多種聚合物納米顆粒形成的顆粒群體是多分散顆粒群體的一些情況下，大于50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的顆粒尺寸分布位于中值顆粒尺寸的10％以內。

優(yōu)選地，由一種或多種聚合物納米顆粒形成的顆粒在其表面上含有顯著量的親水性聚合物，諸如PEG。

微粒和納米顆?？梢允褂帽绢I域已知的用于形成聚合物微米或納米顆粒的任何合適的方法形成。用于顆粒形成的方法將取決于多種因素，包括聚合物納米顆?；蚓酆衔锘|中存在的聚合物的特性，以及所需的顆粒尺寸和尺寸分布。并入顆粒中的糖皮質激素的類型也可能是一些糖皮質激素在某些溶劑的存在下、在某些溫度范圍內和/或在某些pH范圍內不穩(wěn)定的因素。

在需要單分散顆粒群體的情況下，可以使用產生單分散納米顆粒群體的方法形成顆粒?？蛇x地，可以使用產生多分散納米顆粒分布的方法，并且可以使用本領域已知的方法(諸如篩分)分離顆粒，在顆粒形成之后以提供具有所需平均顆粒尺寸和顆粒尺寸分布的顆粒群體。

用于制備微粒和納米顆粒的常用技術包括但不限于溶劑蒸發(fā)、熱熔融顆粒形成、溶劑去除、噴霧干燥、相轉化、凝聚和低溫鑄造。下面簡要描述了顆粒形成的合適方法。在顆粒形成期間，可以將藥學上可接受的賦形劑(包括pH調節(jié)劑、崩解劑、防腐劑和抗氧化劑)任選地并入到顆粒中。

聚合物納米顆粒含有一種或多種糖皮質激素，優(yōu)選地通過金屬離子與磷酸基或羧基螯合而復合，最優(yōu)選地與在可生物降解的聚合物(諸如含有酯或其它可水解部分的聚合物)的末端的羧基端基復合，如在實例中所描述的。糖皮質激素可以衍生成水溶性鹽，并且然后并入到聚合物納米顆粒中。

眼內植入物可以是球形或非球形形狀。對于球形植入物，植入物可以具有約5μm至約2mm或者約10μm至約1mm的最大尺寸(例如，直徑)，以便用針施用，可以具有大于1mm、或者大于2mm(諸如3mm或至多10mm)的最大尺寸，以便通過手術植入施用。如果植入物是非球形的，則植入物可以具有約5μm至約2mm，或約10μm至約1mm的最大尺寸或最小尺寸，以便用針施用，可以具有大于1mm、或者大于2mm(諸如3mm或至多10mm)的最大尺寸或最小尺寸，以便通過手術植入施用。

人的玻璃體腔能夠容納不同幾何形狀的相對大的植入物，例如具有1至10mm的長度。植入物可以為具有約2mm×0.75mm直徑尺寸的圓柱形藥片(例如棒劑)。植入物可以是長度為約7mm至約10mm且直徑為約0.75mm至約1.5mm的圓柱形藥片。在某些實施例中，植入物為具有約0.5mm直徑、約6mm長度和大約1mg重量的外伸細絲的形式。在一些實施例中，所述尺寸為或者類似于已經批準用于通過針眼內注射的直徑為460微米且長度為6mm以及直徑為370微米且長度為3.5mm的植入物。

眼內植入物還可以被設計為至少有點柔性，以便在眼睛中(諸如在玻璃體中)插入植入物，并且隨后容納植入物。植入物的總重量通常為約250至5000μg、更優(yōu)選地約500至1000μg。在某些實施例中，眼內植入物具有約500μg、750μg或1000μg的質量。

植入物可以使用本領域已知的任何合適的技術制造。用于制備植入物的合適技術的實例包括溶劑蒸發(fā)法、相分離法、界面法、模塑法、注塑法、擠出法、共擠出法、刻壓法、模切法、熱壓縮法及其組合。考慮到許多因素，包括植入物中存在的聚合物/聚合物鏈段的性質、植入物中存在的一種或多種糖皮質激素的性質，以及所需的植入物的形狀和尺寸，可以選擇用于制造植入物的合適方法。例如在美國專利號4,997,652和美國專利申請公開號US 2010/0124565中描述了用于制備植入物的合適方法。

在某些情況下，可以使用擠出法，以避免在植入物制造期間需要溶劑。當使用擠出法時，選擇聚合物/聚合物鏈段和糖皮質激素以便在制造所需的溫度(通常至少約85攝氏度)下穩(wěn)定。然而，根據聚合物組分和一種或多種糖皮質激素的性質，擠出法可以采用約25℃至約150℃、更優(yōu)選地約65℃至約130℃的溫度。植入物可以共擠出，以便提供覆蓋植入物的全部或部分表面的涂層。

IV.藥物制劑

藥物制劑含有與一種或多種藥學上可接受的賦形劑組合的一種或多種聚合物納米顆粒。代表性的賦形劑包括溶劑、稀釋劑、pH調節(jié)劑、防腐劑、抗氧化劑、懸浮劑、潤濕劑、粘度調節(jié)劑、張度劑、穩(wěn)定劑及其組合。合適的藥學上可接受的賦形劑優(yōu)選地選自通常視為安全(GRAS)的材料，并且可以施用給個體而不引起不期望的生物學副作用或不想要的相互作用。

A.另外的活性劑

除了聚合物顆粒中存在的一種或多種糖皮質激素之外，所述制劑可以含有一種或多種另外的治療劑、診斷劑和/或預防劑?；钚詣┛梢允切》肿踊钚詣┗蛏锓肿?，諸如酶或蛋白質、多肽，或者核酸。合適的小分子活性劑包括有機化合物和有機金屬化合物。在一些情況下，小分子活性劑具有小于約2000g/mol、更優(yōu)選地小于約1500g/mol、最優(yōu)選地小于約1200g/mol的分子量。小分子活性劑可以是親水性化合物、疏水性化合物或兩親性化合物。

在一些情況下，一種或多種另外的活性劑可以包封在由一種或多種聚合物納米顆粒形成的顆粒中、分散在由一種或多種聚合物納米顆粒形成的顆粒中，或者以其它方式與由一種或多種聚合物納米顆粒形成的顆粒結合。在某些實施例中，一種或多種另外的活性劑也可以溶解或懸浮在藥學上可接受的載體中。

在用于治療眼部疾病的藥物組合物的情況下，所述制劑可以含有一種或多種眼用藥物。在特定實施例中，眼用藥物是用于治療、預防或診斷后段眼睛的疾病或病癥的藥物。眼用藥物的非限制性實例包括抗青光眼劑、抗血管生成劑、抗感染劑、抗炎劑、生長因子、免疫抑制劑、抗過敏劑，及其組合。

代表性的抗青光眼劑包括：前列腺素類似物(諸如曲伏前列素、比馬前列素和拉坦前列素)、β-腎上腺素能受體拮抗劑(諸如噻嗎洛爾、倍他洛爾、左倍他洛爾和卡替洛爾)、α-2腎上腺素能受體激動劑(諸如溴莫尼定和阿可樂定)、碳酸酐酶抑制劑(諸如布林佐胺、乙酰唑胺和多佐胺)、縮瞳劑(即擬副交感神經藥，諸如毛果蕓香堿和碘依可酯)、5-羥色胺能藥物(seretonergics)、毒蕈堿能藥物(muscarinics)、多巴胺能激動劑，以及腎上腺素能激動劑(諸如阿可樂定和溴莫尼定)。

代表性的抗血管生成劑包括但不限于：針對血管內皮生長因子(VEGF)的抗體，諸如貝伐單抗和rhuFAbV2(蘭尼單抗、)，以及其它抗VEGF化合物，包括阿柏西普(哌加他尼鈉、抗VEGF適體或EYE001)(Eyetech Pharmaceuticals)；色素上皮衍生因子(PEDF)；COX-2抑制劑，諸如塞來昔布和羅非昔布干擾素α；白細胞介素-12(IL-12)；沙利度胺及其衍生物，諸如來那度胺角鯊胺；內皮抑素；血管抑素；核糖酶抑制劑，諸如(Sima Therapeutics)；多功能抗血管生成劑，諸如(AE-941)(Aetema Laboratories，加拿大魁北克市)；受體酪氨酸激酶(RTK)抑制劑，諸如舒尼替尼酪氨酸激酶抑制劑，諸如索拉非尼和埃羅替尼針對表皮生長因子受體的抗體，諸如帕尼單抗和西妥昔單抗以及本領域已知的其它抗血管生成劑。

抗感染劑包括抗病毒劑、抗菌劑、抗寄生蟲劑和抗真菌劑。代表性的抗病毒劑包括更昔洛韋和阿昔洛韋。代表性的抗生素劑包括氨基糖苷類(諸如鏈霉素、阿米卡星、慶大霉素和妥布霉素)、安莎霉素類(諸如格爾德霉素和除莠霉素)、碳頭孢烯類、碳青霉烯類、頭孢菌素類、糖肽類(諸如萬古霉素、替考拉寧和特拉萬星)、林可酰胺類、脂肽類(諸如達托霉素)、大環(huán)內酯類(諸如阿奇霉素、克拉霉素、地紅霉素和紅霉素)、單環(huán)β-內酰胺類、硝基呋喃類、青霉素類、多肽類(諸如桿菌肽、粘菌素和多粘菌素B)、喹諾酮類、磺胺類，以及四環(huán)素類。

在一些情況下，活性劑是抗過敏劑，諸如奧洛他定和依匹斯汀。

抗炎劑包括非類固醇抗炎劑和類固醇抗炎劑。合適的類固醇活性劑包括糖皮質激素、孕激素、鹽皮質激素和糖皮質激素。

眼用藥物可以以其中性形式或以藥學上可接受的鹽的形式存在。在一些情況下，由于鹽的有利物理性質中的一個或多個，諸如增強的穩(wěn)定性或期望的溶解度或溶解曲線，可能期望制備含有活性劑的鹽的制劑。

通常，藥學上可接受的鹽可以通過游離酸或堿形式的活性劑與化學計量量的適當的堿或酸在水中或在有機溶劑中或者在這兩者的混合物中反應來制備；通常，優(yōu)選非水性介質，如醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈。藥學上可接受的鹽包括衍生自無機酸、有機酸、堿金屬鹽和堿土金屬鹽的活性劑的鹽，以及通過藥物與合適的有機配體(例如季銨鹽)反應形成的鹽。合適的鹽的列表可參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences，20th ed.，Lippincott Williams&Wilkins，Baltimore，MD，2000，p.704。有時以藥學上可接受的鹽的形式施用的眼用藥物的實例包括馬來酸噻嗎洛爾、酒石酸溴莫尼定和雙氯芬酸鈉。

在一些情況下，活性劑是使眼睛成像或以其它方式評估眼睛的診斷劑。示范性的診斷劑包括順磁分子、熒光化合物、磁性分子，以及放射性核素、x射線成像劑和造影劑。

在某些實施例中，藥物組合物含有一種或多種局部麻醉劑。代表性的局部麻醉劑包括丁卡因、利多卡因、阿美索卡因、丙美卡因、利多卡因和布比卡因。在一些情況下，還向所述制劑中加入一種或多種另外的試劑(諸如透明質酸酶)，以加速和改善局部麻醉劑的分散。

B.用于眼部施用的制劑

聚合物納米顆粒將優(yōu)選地配制為用于注射到眼睛的懸浮液。用于眼部施用的藥物制劑優(yōu)選地為由一種或多種聚合物納米顆粒形成的顆粒的無菌水性懸浮液的形式?？山邮艿娜軇┌ɡ缢⒘指袷先芤?、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，以及等滲氯化鈉溶液。所述制劑還可以是在無毒的、胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑(諸如1,3-丁二醇)中的無菌溶液、懸浮液或乳液。

在一些情況下，制劑以液體形式分配或包裝?？蛇x地，用于眼部施用的制劑可以被包裝為固體，例如通過合適的液體制劑的凍干獲得的固體。在施用之前，固體可以用適當的載體或稀釋劑重建。

用于眼部施用的溶液、懸浮液或乳液可以用維持適于眼部施用的pH所需的有效量的緩沖劑進行緩沖。合適的緩沖液是本領域技術人員公知的，并且有用的緩沖劑的一些實例是乙酸鹽緩沖劑、硼酸鹽緩沖劑、碳酸鹽緩沖劑、檸檬酸鹽緩沖劑和磷酸鹽緩沖劑。

用于眼部施用的溶液、懸浮液或乳液還可以含有一種或多種張度劑，以調節(jié)制劑的等滲范圍。合適的張度劑是本領域公知的，并且一些實例包括甘油、甘露醇、山梨醇、氯化鈉和其它電解質。

用于眼部施用的溶液、懸浮液或乳劑還可以含有一種或多種防腐劑，以預防眼用制劑的細菌污染。合適的防腐劑是本領域已知的，并且包括聚六亞甲基雙胍(PHMB)、苯扎氯銨(BAK)、穩(wěn)定化的氧氯復合物(另稱為)、乙酸苯汞、氯丁醇、山梨酸、氯己定、芐醇、對羥基苯甲酸酯、硫柳汞，以及其混合物。

用于眼部施用的溶液、懸浮液或乳劑還可以含有一種或多種本領域已知的賦形劑，諸如分散劑、潤濕劑和懸浮劑。

V.使用方法

用于遞送一種或多種糖皮質激素的控釋劑量制劑可用于治療或與血管形成相關的患者的疾病或病癥，諸如急性黃斑變性、炎癥，諸如角膜移植物排斥，或視網膜炎。在施用時，一種或多種糖皮質激素以足夠高以產生治療益處但足夠低以避免細胞毒性的濃度在延長的時間段內釋放。

在一個優(yōu)選的實施例中，施用藥物組合物以治療或預防與眼部新生血管形成相關的患者的疾病或病癥。

在另一個優(yōu)選的實施例中，制劑通過結膜下(SC)注射施用并且保留在結膜組織中，以治療或預防角膜移植物排斥。

當施用于眼睛時，顆粒在延長的時間段(優(yōu)選地長于3、7、10、15、21、25、30或45天)內釋放低劑量的一種或多種糖皮質激素和/或其它活性劑?？梢哉{整聚合物納米顆粒的結構或聚合物基質的組成、顆粒形態(tài)，以及施用的顆粒劑量以在延長的時間段內向眼睛施用治療有效量的一種或多種活性劑，同時使副作用(諸如適應暗光的ERG b-波振幅的減少和/或視網膜變性)減至最小。

可以通過玻璃體內注射(例如，前、中或后玻璃體注射)、結膜下注射、前房內注射、經由角膜緣注射到前房中、基質內注射、注射到脈絡膜下空間、角膜內注射、視網膜下注射和眼內注射將所述制劑局部地施用于眼睛。在優(yōu)選的實施例中，藥物組合物通過玻璃體內注射施用。

可以使用本領域已知的合適的植入方法將植入物施用于眼睛。在某些實施例中，使用針(諸如22號針)經玻璃體內注射植入物。植入物經玻璃體內的放置可以根據植入物尺寸、植入物形狀和待治療的疾病或病癥而改變。

在優(yōu)選的實施例中，通過玻璃體內注射(例如，前、中或后玻璃體注射)、結膜下注射、前房內注射、經由角膜緣注射到前房中、基質內注射、注射到脈絡膜下空間、角膜內注射、視網膜下注射和眼內注射將納米顆粒局部地施用于眼睛。

在優(yōu)選的實施例中，納米顆粒以有效量施用以預防或降低新生血管形成、移植物排斥或炎癥(諸如葡萄膜炎)。

在優(yōu)選的實施例中，納米顆粒的施用頻率不少于每周一次、每兩周一次、每四周一次、每月一次、每兩個月一次，或者每三個月一次。

在一些實施例中，本文所述的藥物組合物和/或植入物與一種或多種另外的活性劑共同施用。如本文所使用的，“共同施用”是指在相同的劑型內施用一種或多種糖皮質激素與一種或多種另外的活性劑的控釋制劑，以及同時或基本上同時使用不同的劑型施用。如本文所使用的，“基本上同時”通常是指在10分鐘內、優(yōu)選地在5分鐘內、更優(yōu)選地在2分鐘內、最優(yōu)選地在1分鐘內。

在一些實施例中，本文所述的藥物組合物和/或植入物與用于眼睛的新生血管性疾病或病癥的一種或多種另外的治療共同施用。在一些實施例中，本文所述的藥物組合物和/或植入物與一種或多種抗血管生成劑(諸如貝伐單抗蘭尼單抗、或者阿柏西普)共同施用。

優(yōu)選地，顆粒將在延長的時間段內釋放有效量的一種或多種糖皮質激素以預防或減少炎癥。在優(yōu)選的實施例中，顆粒在至少兩周的時間內、更優(yōu)選地在至少四周的時間內、更優(yōu)選地在至少六至八周的時間內釋放有效量的一種或多種糖皮質激素。在一些實施例中，顆粒在三個月或更長的時間內釋放有效量的一種或多種糖皮質激素。

通過參考以下非限制性實例將進一步理解本發(fā)明。

實例

實例1：用于遞送糖皮質激素的PLGA納米顆粒的制備。

材料和方法

PLGA納米顆粒的制備

將這里用作熒光標記物的Alexa Fluor 555(AF555)尸胺和Alexa Fluor 647(AF647)尸胺(Invitrogen，加利福尼亞州卡爾斯巴德)與PLGA(MW 3.2kDa，LA:GA＝50:50)(SurModics Pharmaceuticals，阿拉巴馬州伯明翰)化學綴合。通過溶劑擴散(或納米沉淀)法制備由標記或未標記的PLGA聚合物組成的納米顆粒。簡言之，將20mg的聚合物溶解在1mL的四氫呋喃(THF)中，并在700rpm的磁力攪拌下逐滴加入到40ml的超純水中。攪拌約1小時后，將溶液旋轉蒸發(fā)30分鐘以去除殘留的THF。通過以10,000g離心25分鐘收集顆粒，并且將其重懸浮于0.2mL的超純水中。對于涂覆有 F127的顆粒，在納米沉淀期間用5％FI27水溶液代替超純水。通過以10,000g離心25分鐘，用1％FI27洗滌涂覆有FI27的PLGA納米顆粒(PLGA/F127)，并將其重懸于0.2mL的超純水中。使用ZETASIZER ZS90(Malvern Instruments，馬薩諸塞州南鎮(zhèn))分別通過動態(tài)光散射和激光多普勒測速技術測量尺寸和ζ-電位(表面電荷)。

模型納米顆粒的制備

通過COOH-胺反應用甲氧基(MeO)-PEG-胺(NH₂)(MW 5kD；Creative PEGWorks)共價修飾大小為100、200、500、1000nm(分子探針公司(Molecular Probes))和5μm(Bangs Laborites，Inc.)的紅色熒光COOH修飾的PS顆粒。將PEG化的PS顆粒(PS-PEG)徹底洗滌，將其重懸于水中并儲存在+4℃?zhèn)溆?。PS-PEG顆粒用表面電荷和流體動力學直徑表征，并且其物理化學特性記錄在表3中。

載有DSP的PLGA納米顆粒的制備

根據修改溶劑擴散法，將地塞米松21-磷酸鈉鹽(DSP)(Sigma Aldrich，密蘇里州圣路易斯)包封到具有FI27涂層的PLGA納米顆粒中。簡言之，通過將1mL的0.5M乙酸鋅水溶液加入到0.5mL的含有10mgDSP的水溶液中形成DSP-鋅復合物。在以10,000g離心5分鐘后，將沉淀的復合物和50mg PLGA(MW 3.2kDa，LA:GA＝50:50)溶解于2.5mL的THF中，然后加入20μL的三乙醇胺(TEOA，Sigma Aldrich，密蘇里州圣路易斯)。在攪拌下將混合物逐滴加入到100mL的5％F127溶液中以形成涂覆有FI27的載有DSP的PLGA納米顆粒(DSP/PLGA/F127或DSP-NP)。在通過溶劑蒸發(fā)和旋轉蒸發(fā)完全去除THF之后，將1mL的0.5M乙二胺四乙酸(EDTA，Sigma Aldrich，密蘇里州圣路易斯)水溶液(pH7.5)加入到納米顆粒懸浮液中以螯合鋅并溶解任何未包封的DSP-鋅復合物。通過以10,000g離心25分鐘收集納米顆粒，將其用1％F127洗滌兩次，并重懸于0.2mL的超純水中。如上所述表征納米顆粒的流體動力學尺寸和表面電荷。使用Hitachi H-7600透射電子顯微鏡(Hitachi Co.Ltd.，日本東京)觀察顆粒形態(tài)。

載藥量和體外藥物釋放研究

為了測量DSP/PLGA/F127納米顆粒中的DSP含量，將大約50μL的PLGA納米顆粒冷凍干燥，稱重并溶解于0.5mL的乙腈中。隨后，加入1mL的50mMEDTA，以螯合鋅并溶解包封的DSP，并且通過反相HPLC測量溶液中的DSP濃度。在裝備有Pursuit 5Cl8柱(Varian Inc，加利福尼亞州森林湖)和由含有0.1％三氟乙酸(流速＝1mL/min)的乙腈/水(35/65v/v)組成的流動相的Shimadzu Prominence LC系統(tǒng)(日本東京)上進行等度分離。通過在241nm處的UV檢測監(jiān)測柱流出液。根據以下等式計算載藥量(LD)和包封效率(EE)：

DL(％)＝(納米顆粒中DSP的量/納米顆粒的重量)×100

EE(％)＝(測量的載藥量/理論載藥量)×100

為了測量DSP的體外釋放分布，將400μL的納米顆粒懸浮液密封在透析管纖維素膜(截留MW：10kDa，Sigma Aldrich，密蘇里州圣路易斯)中。將密封的透析膜置于含有12mL的釋放介質(PBS，pH 7.4)的50mL錐形管中，并在37℃下在平臺振蕩器(140rpm)上培養(yǎng)。以預定的時間間隔收集全部釋放介質，并用12mL的新鮮PBS替換。如上所述通過HPLC測量所收集的釋放介質中的DSP濃度。

動物

從Harlan(印第安納州印第安納波利斯)購買8周齡雄性Sprague Dawley、Lewis和Brown Norway大鼠。Sprague Dawley大鼠用于體內安全性和保留研究。Lewis大鼠用作受體動物，以及Brown-Norway大鼠用作供體動物。所有大鼠按照視覺與眼科研究協會決議關于在眼科研究中使用動物的聲明進行護理。在實驗程序之前將動物麻醉。所有實驗方案由約翰霍普金斯大學動物護理和使用委員會批準。

結膜下施用后納米顆粒的保留

通過在XenogenIVIS Spectrum光學成像系統(tǒng)(Caliper Life Sciences Inc.，馬薩諸塞州霍普金頓)上對整個眼進行成像來研究SC注射后納米顆粒的保留。通過肌內注射氯胺酮(80mg/kg)和賽拉嗪(8mg/kg)的混合物將大鼠麻醉。通過使用26號針SC注射(50μL)將具有紅色熒光的不可降解的模型顆粒PS-PEG NP(動態(tài)直徑約100nm、200nm、500nm、1μm和5μm)注射到Sprague Dawley大鼠。在成像期間用45G窺器(Focus Ophthalmics，LLC，加利福尼亞州安大略)擴增眼瞼。在550nm的激發(fā)波長和570nm的發(fā)射波長處記錄注射部位中的總熒光計數。通過Living Image軟件分析圖像，并且通過與0小時時SC注射納米顆粒的眼睛比較來定量納米顆粒的保留。將未經處理的大鼠眼睛用作基線。

在SC注射后以與上述相同的方式進行和分析可生物降解的PLGA/F127納米顆粒的保留。使用具有化學綴合的AlexaFluo 647(AF647)染料的PLGA/F127納米顆粒，并且使用640nm的激發(fā)波長和680nm的發(fā)射波長對整個眼睛成像。

未負載的PLGA納米顆粒的體內安全性分布

通過以1mg每只眼(n＝9)的劑量SC注射以生理鹽水(50μL)施用空PLGA納米顆粒(涂覆有F127和未涂覆)。對照眼睛用生理鹽水處理(n＝9)。在2天、7天和14天的時間點，將動物處死，并且在用H&E固定和染色后獲得整個眼睛以及結膜組織以便用于組織學研究。

SC注射后體內眼部DSP水平

為了檢測大鼠SC注射后的眼部DSP水平，在制備涂覆有F127的載有DSP的PLGA納米顆粒(DSP-NP)期間，標記有[3H]的DSP并入DSP(10μCi:1mg DSP)。將納米顆粒以20μCi/mL懸浮于鹽水中。以相同的混合比例制備20μCi/mL的游離DSP溶液。向相同動物(Sprague Dawley大鼠)的兩只眼睛注射40μL(每只眼～0.8μCi)相同的制劑。以指定的時間間隔，在注射后2小時、1天、3天、5天和7天，通過肌內注射氯胺酮/賽拉嗪溶液將大鼠麻醉。從尾靜脈收集兩滴血液后將所述動物處死。

小心地從大鼠中取出帶有結膜組織的眼球，并用PBS沖洗，用Kimwipe組織干燥。小心地切開并收集前房房水、角膜、玻璃體、視網膜和剩余的眼球組織。用PBS沖洗并用Kimwipe組織干燥角膜和視網膜組織。將樣品稱重，通過在50℃下培養(yǎng)過夜，用2mL的Solvable溶解。用0.2ml H₂O₂和20μL 0.5MEDTA漂白血液樣品。在閃爍計數器中計數放射性之前加入10ml Ultimold gold閃爍介質。結果表示為注射劑量的百分比，并且是每個數據點的四只眼睛(2只動物)的平均值±sd。血液中DSP的水平是每個時間點兩只動物的平均值。計算在眼周組織處的注射劑量的總百分比和每mg(或mL)組織的放射性。

角膜移植手術

用大鼠進行的所有程序由約翰霍普金斯大學動物護理和使用委員會批準。將Brown-Norway供體大鼠處死，并且用4.0-mm環(huán)鋸除去兩只眼睛的中央角膜扣狀體，并保持在生理溶液中備用。手術由角膜外科醫(yī)生(QP)在手術顯微鏡下進行。通過肌內注射氯胺酮(80mg/kg)和賽拉嗪(8mg/kg)的混合物將角膜受體Lewis大鼠麻醉。在手術前，在Lewis大鼠上重復滴注0.5％托品酰胺滴眼劑，以便進行全瞳孔擴張。在環(huán)鋸電離之前進行穿刺術，并且用透明質酸填充前房。用3.5-mm環(huán)鋸從受體Lewis大鼠中取出角膜扣狀體。通過8個縫合點將供體角膜扣狀體縫合到受體角膜。

穿透性角膜移植術(Penetratingkeratoplasty；PK)后的術后治療

穿透性角膜移植術后立即將動物隨機分為5組：第1組(4只大鼠)接受結膜下注射50μL生理鹽水，第2組(5只大鼠)接受SC注射50μl空NP，第3組(5只大鼠)接受SC注射50μL濃度為1mg/mL的DSP溶液，以及第4組(6只大鼠)接受SC注射50μL濃度為1mg DSP/mL的載有DSP的納米顆粒(DSP-NP)。所有組的動物進行相同的處理每周一次，直到移植物的失效或研究的終點(9周)。

由兩個眼科醫(yī)生(QP和LT)針對組1和組2在術后(post-operational；PO)2周，針對組3PO 4周和針對組4PO 9周使用裂隙燈顯微鏡進行臨床觀察。評價三個參數用于角膜移植物的檢查(角膜透明度、水腫和新生血管形成)。參數的評分表示如下。

監(jiān)測手術后PO 2天、1周、2周、4周、6周、8周和9的周眼內壓。針對每只眼睛記錄的IOP是三次成功測量的平均值。通過CO₂將處于結束時間點的動物處死，并且摘除通過PK手術的眼睛。將眼組織用10％福爾馬林固定24小時，然后包埋在石蠟中。從視神經和角膜的方向切下切片(5μM)，并用H&E染色。

統(tǒng)計分析

通過單因素方差分析(ANOVA)，隨后通過圖基(Tukey)檢驗進行數據的統(tǒng)計分析。在P<0.05水平時，認為差異是統(tǒng)計學上顯著的。

結果

載有DSP的PLGA納米顆粒的制備和表征

由于地塞米松和PLGA的不相容性，所以難以將疏水性地塞米松包封到PLGA納米粒子中。水溶性前藥、地塞米松21-磷酸二鈉(DSP)可以在體內轉化為母體藥物地塞米松，所述母體藥物地塞米松主要由存在于所有器官(包括眼部組織)中的磷酸酶促進。在 F127的存在下，水溶性DSP與鋅有效地共包封到PLGA納米顆粒中。載有DSP的PLGA納米顆粒(DSP-NP)的物理化學性質示于表3中。DSP-NP顯示出表明致密的PEG涂層的-5mV的表面電荷，這歸因于PLURONICS F127強結合在疏水性納米顆粒上。DSP-NP是通過TEM觀察證實形態(tài)為球形的。DSP-NP表現出～12％w/w的高載藥量，其對應于～72％的包封效率。DSP從DSP-NP的釋放以持續(xù)的方式進行長達15天，并且接近80％的所負載的DSP在前7天內釋放(圖1)。認為鋅增加了包封效率并且促進了水溶性糖皮質激素從PLGA納米顆粒的持續(xù)釋放，因為在PLGA上的末端羧基與藥物分子上的磷酸基之間形成離子橋。

表1

移植后的臨床參數的評價(分數0-4)

SC施用后納米顆粒的眼部保留

正常大鼠眼睛的熒光圖像并且利用熒光染料標記的納米顆粒的SC注射顯示出在SC注射于大鼠后不可降解的聚苯乙烯顆粒與生物惰性PEG涂層(PS-PEG)的保留。PS-PEG顆粒的保留通過XenogenIVIS Spectrum光學成像進行定量。使用實時成像來定量大鼠中SC施用后納米顆粒的保留。首先，應用不可降解的PS-PEG顆粒以研究尺寸對納米顆粒保留的影響。具有100nm、200nm、500nm、1μm和5μm尺寸的PS-PEG顆粒全部顯示為接近表明致密的PEG涂層的中性表面電荷。通過SC注射將PS-PEG顆粒施用于大鼠，并且用實時成像定量熒光信號。具有100nm、200nm和500nm尺寸的PS-PEG顆粒在SC注射后的前6小時都表現出熒光信號減少大約60％。然后，在剩余的2個月保留研究中觀察到恒定水平的熒光，表明在SC注射后對于小至100nm的顆粒這些不可降解的顆粒恒定保留。對于大顆粒(1μm和5μm)，通過整個保留研究觀察到顆粒接近100％的保留(圖2)。然而，通過26號針注射大顆粒更困難。即使這些顆粒被PEG化并且在注射前很好地懸浮，也觀察到納米顆粒的一些沉淀和聚集。

使用SC注射AF-647標記的PLGA/F127NP后在不同時間點的代表性熒光圖像和大鼠眼睛的保留曲線來計算SC注射后可生物降解的PLGA/F127納米顆粒(186nm)的保留。在制備PLGA/F127納米顆粒之前，將熒光染料與PLGA化學綴合。甚至在PO 30天后也檢測到熒光信號。在整個30天保留研究期間觀察到信號逐漸減少。在PO8天時保留小于10％的熒光信號。

SC注射后PLGA納米顆粒的眼部安全性

在用SC注射生理鹽水、PLGA/F127和未涂覆的PLGA納米顆粒處理的大鼠角膜和結膜組織的代表性圖像在PO 2天、7天和14天時的樣品角膜組織學表明，針對PLGA/F127 NP和PLGA NP，在PO 2天接近注射區(qū)域的結膜組織具有慢性炎癥(1級)，并且慢性炎癥在PO 7天和PO 14天時逐漸消失(0-1級)。對于生理鹽水對照組，觀察到類似的炎癥反應。生理鹽水注射在PO 2天顯示輕度慢性炎癥(1級)，并且在PO 7天和PO 14天恢復(0-1級)。(由病理學家Charles Eberhart博士觀察和分級，炎癥的全部級別為0-3、無炎癥至嚴重炎癥)。

為了確定空納米顆粒載體的體內毒性，將懸浮在生理鹽水中的PLGA(無PEG涂層)、PLGA/F127(致密-PEG涂層)納米顆粒通過SC注射施用于健康的Sprague Dawley大鼠。應用組織學檢查來確定眼部組織中的炎性反應。對于所有注射組(包括生理鹽水對照組)，在第2天僅觀察到結膜組織中的輕度炎癥。在第7天和14天，具有和不具有F127涂層的所有納米顆粒在所有眼部組織(包括結膜、角膜和視網膜)中沒有顯示炎癥。與生理鹽水對照類似，PLGA/F127納米顆粒在SC注射至大鼠眼睛后在第2天、第7天和第14天顯示出良好的安全性分布，具有非常輕度的炎癥至無炎癥。對于所有組，在其它眼部組織(包括視網膜、前房和角膜)中沒有觀察到炎癥。結果示于圖3中。

在SC施用DSP-NP后維持眼部組織中的DSP水平

在單次SC注射DSP游離藥物或載有DSP的PLGA/F127納米顆粒(DSP-NP)(均含有～0.08mg DSP)后，比較DSP的眼部組織水平。圖4A-4D是皮下施用于大鼠后游離DSP溶液和DSP-NP的藥代動力學(隨時間(天)變化的DSP/ml)的曲線圖。圖4A是在注射部位；圖4B是在房水中；圖4C是在玻璃體液中；以及圖4D是在血液中。

在PO 2小時，游離DSP溶液的總劑量的大約0.4％保留在結膜組織處，并且在PO 1天幾乎沒有檢測到DSP。相比之下，DSP-NP組顯示出在PO 2小時接近總劑量的65％保留在結膜組織處并且在PO7天保留在結膜組織處的DSP水平逐漸降低至5％。通過分析眼部組織、房水、玻璃體、視網膜和角膜，發(fā)現眼部組織處的DSP水平非常迅速地降低到達SC注射DSP游離藥物的基線。SC注射DSP-NP將在房水和玻璃體處的高水平DSP顯著延長直至PO7天。對于DSP組和DSP-NP組，在視網膜和角膜處的DSP水平都非常低。還測量在不同時間點收集的血液樣品中的DSP水平。DSP-NP組顯示出從PO 2小時到PO 7天持續(xù)低水平的DSP(～50ng DSP/ml)。相比之下，DSP組顯示出在PO 2小時在血液中高達350ng DSP/ml，并且然后迅速降至基線。通過測量所有組織中³H-DSP的放射性來定量DSP水平。在一些數據點沒有值意味著所述水平不可檢測到。這在圖5中示出。

在SC施用DSP-NP后預防角膜移植物排斥

對SC注射納米顆粒的移植角膜進行手術后裂隙檢查。對于SC注射生理鹽水和SC注射PLGA/F127(NP)的組，在PO2周時，排斥所有移植物。對于SC注射DSP(D)的組，在PO 4周時，排斥所有移植物，并且即使在PO 9周的結束研究點(E)時，在SC注射DSP/PLGA/F127(DSP-NP)下的所有移植物仍然透明。

就角膜透明度、水腫和新血管而言，在結束時間點臨床評價用SC注射生理鹽水、NP、DSP和DSP-NP處理的移植物。結果顯示在圖6和7中。對于DSP-NP，在圖6中沒有顯示關于透明度和水腫的條表示移植物是完全透明的并且沒有水腫。在SC注射后在PO 2周時用生理鹽水處理后、在PO 2周時用空NP處理后、在PO 4周時用游離DSP處理后以及在PO9周時用DSP-NP處理后，完成移植角膜的組織學圖像。外科手術都由經驗豐富的眼科醫(yī)生成功進行，并且沒有發(fā)生手術并發(fā)癥。在PK后立即將動物隨機分成4組，并且通過SC注射生理鹽水、NP、DSP和DSP-NP開始對每組進行治療。在臨床觀察中使用三個參數(包括角膜透明度、水腫和新生血管形成)對移植物進行評分。在術后(PO)2周時，生理鹽水對照組和NP對照組表現出嚴重的水腫，角膜移植物不透明，并且大量新血管不僅在縫合線周圍形成，而且形成角膜移植物。然而，用每周注射DSP處理的移植物顯示出顯著較少的水腫(p<0.0001)和較少的新生血管形成(p<0.001)。在DSP組中的角膜移植物與生理鹽水對照組和NP對照組一樣不透明。就角膜透明度、水腫和新生血管形成而言，DSP-NP處理組顯示出顯著更好的結果。對于DSP-NP處理組沒有水腫，并且6只大鼠中的所有角膜移植物在整個9周的研究中都是透明的。

縫合線周圍出現少量新血管，但是DSP-NP組中新生血管形成顯著少于所有其它3組(p<0.05)。當完整的角膜移植失敗(由嚴重水腫和嚴重不透明指示)時，將動物處死，觀察到在角膜處是清楚的。

用SC注射生理鹽水對照、空NP、游離DSP和DSP-NP處理的移植角膜移植物的存活曲線顯示在圖7中。相同樣品在9周內的眼內壓示于圖8中。對于生理鹽水對照組和NP對照組，完全移植物排斥發(fā)生在PO 2周時。通過每周SC注射DSP游離藥物實現輕微的改善，并且角膜移植物的存活率在PO 2周和PO 3周時分別為100％和80％。然而，DSP組的所有角膜在PO 4周時仍然被排斥。在研究結束(PO 9周)時，對于DSP-NP處理組觀察到顯著更高的存活率，具有100％存活率。在PO 9周時，DSP-NP組的角膜移植物都是清楚的、透明的、沒有任何角膜排斥發(fā)作的暗示。

在終點(對于生理鹽水和NP組為PO 2周，對于DSP組為PO 4周，以及對于DSP-NP組為PO 9周)獲得的角膜組織的組織學檢查表明，生理鹽水組、NP組和DSP組的角膜組織全部腫脹并且均比正常健康的角膜厚。對于所有三組，在角膜組織中觀察到中性粒細胞和巨噬細胞。針對所有三個對照組的移植物，觀察到明顯的內皮細胞死亡，并且在所有三個對照組中角膜移植物的上皮層喪失其完整性。相比之下，DSP-NP處理組的角膜顯示出具有未受損傷的上皮層、基質和內皮層的完整的角膜結構，并且角膜組織不存在腫脹。最重要的是，在DSP-NP處理的角膜中沒有發(fā)現炎性細胞，表明移植的角膜在整個研究期間通過SC注射具有完全功能的DSP-NP處理后存活，并且移植物開始正常發(fā)揮作用。

相同組在14天內的角膜新生血管形成顯示在圖9A和9B中。

結果概述

可以在延長時間內提供免疫抑制劑的持續(xù)釋放平臺將有利于臨床應用，并且改善患者依從性且減少副作用。納米顆?？梢跃S持藥物的釋放，并且已經廣泛用于通過各種途徑(包括玻璃體內注射、局部施用和結膜下注射)將治療劑遞送到眼睛。結膜下納米顆粒已顯示出將治療劑持續(xù)釋放數天至數月，這取決于應用。釋放速率可以通過選擇不同的聚合物或改變制劑來修改。已經開發(fā)了用于持續(xù)釋放糖皮質激素以預防角膜排斥的具有致密PEG涂層的可生物降解的納米顆粒平臺。某些(諸如F127)可以容易地吸附到PLGA納米顆粒上以形成致密的PEG涂層，其使顆粒呈生物惰性。眼睛是非常敏感的器官，并且刺激反應、炎性反應可以通過施用的眼科制劑引起，這可導致患者不適，并且甚至導致嚴重的眼睛疾病。因此，維持遞送免疫抑制劑的安全平臺和途徑可能是有利的。

PLGA/F127的藥物遞送平臺包含PLGA和F127，兩者均由FDA分類為通常視為安全(GRAS)的材料，并且在各種藥物制劑中(包括在眼科制劑中)具有長的使用歷史。然而，納米顆粒的眼科使用的安全問題仍然是主要關注的問題。在本研究中，通過所有檢查的時間點(PO 2天、7天和14天)，PLGA/F127組的炎性反應與SC注射生理鹽水對照組相當。健康大鼠在SC注射后在SC注射后前2天內引起輕度眼部炎癥，其在7天內減少。已經報道了在吸入BALB/C小鼠肺時和陰道施用于CF-1小鼠時，F127致密涂覆在納米顆粒上以降低炎癥的效果。在SC施用涂覆和未涂覆有F127的PLGA納米顆粒時，沒有觀察到嚴重的炎癥，這與肺和陰道中的研究不同。SC施用的眼周結膜組織(主要由肌肉和結締組織組成)可能不如與肺氣道和陰道相關的上皮一樣敏感。當具有不同涂層的PLGA應用于其它眼部部分時，安全性可能不同。即使F127涂層可能不會為SC施用的PLGA納米顆粒增加更多的安全性益處，但是與未涂覆的PLGA NP相比，F127的使用可以大大增加DSP-NP的產率。在納米顆粒收集期間，沒有F127涂層的PLGA NP發(fā)生大的聚集。

不可降解的模型PS-PEG納米顆粒可以在SC注射后保留長達2個月。在SC注射后的前6小時，100nm、200nm和500nm PS-PEG表現出40-60％的下降，這可由注射后的泄漏引起。對于大鼠結膜下空間，50μL體積的單次注射可能太多。由于缺乏對組織的粘附，納米顆粒上的親水性PEG涂層可以進一步幫助顆粒通過注射部位泄漏或遷移。已經報道，在SC注射后，在20-30μL體積中，具有200nm和2μm尺寸的非PEG化疏水性PS顆粒(羧酸酯修改的)被永久保留在結膜下組織中。較小的注射體積和疏水性顆粒性質可導致納米顆粒泄漏較少或不泄漏。對于大顆粒(1μm和5μm)，觀察到非常類似的結果，并且監(jiān)測到眼部保留降低非常小。大顆粒容易沉淀，并且當注射的水溶液漏出時，它們可以被阻塞在結膜組織內，并且表面性質不會對它們的保留改變太多。可生物降解的PLGA納米顆粒在SC注射后的前6小時顯示出類似的趨勢，并且降低接近40％的劑量，但是熒光信號持續(xù)減少15天，直到信號完全消失，這與不可降解的200nm PS-PEG納米顆粒不同。熒光信號的逐漸減少可能由聚合物的降解以及化學綴合的熒光染料的釋放引起。通過優(yōu)化注射條件，可以將合適量的納米顆粒/微粒成功地施用到SC空間中用于治療劑的持續(xù)釋放。

為了確認DSP可以在延長時間內有效地遞送到前房，甚至遞送到玻璃體，眼部藥代動力學研究利用具有氚標記的DSP的DSP-NP在健康大鼠中進行。使用游離DSP作為對照。Weijtens及其同事發(fā)現，與眼球周注射或劑量口服相比，SC注射是將DSP遞送到患者眼睛的前段和后段的最有效的方法。以前的報告表明，SC注射DSP導致在PO 2-3小時出現峰值玻璃體地塞米松濃度。在本研究中，在注射后2小時，針對游離DSP和DSP-NP兩者，觀察到大鼠眼睛中的眼房和玻璃體中的DSP的峰值濃度。非常清楚的趨勢表明，在注射后的前2小時內非常快速地實現了高濃度的DSP，即使基于該研究精確的Tmax并不清楚。與眼滴劑相比，結膜下注射DSP導致DSP保留在前房和玻璃體中。隨著頻繁施用滴眼劑，DSP滲透到玻璃體中是可忽略的，并且前房中的DSP濃度遠低于SC注射。然而，SC施用DSP游離藥物只能在前房中提供有效的DSP濃度小于6小時。在SC注射后PO 1天，在前房和玻璃體中的DSP水平大大降低至接近基線。在SC注射DSP-NP后PO 1天在前房和玻璃體中的DSP濃度分別為5157±3952ng/mL和1286±851ng/mL。對于DSP-NP，在SC施用后PO 7天，在前房和玻璃體中的高濃度的DSP仍然可檢測到，但是SC施用DSP的水平不可檢測到。

造血途徑、經鞏膜途徑和經角膜途徑可以有助于SC注射后DSP滲透到前房中，甚至滲透到玻璃體中。一些可能是由于在SC注射后前6小時內納米顆粒的潛在泄漏。親水性DSP的水溶液也可以從注射部位泄漏，這在SC注射后的前幾個小時減少了注射的DSP的保留時間，但是增加了淚膜處的DSP水平，這可以增強藥物遞送到眼睛中的經角膜途徑。SC注射增加了藥物對血管的暴露面積，這增強了藥物對血液循環(huán)的全身更新。連同在角膜前表面處泄漏的高DSP濃度，用于SC注射DSP的血液DSP水平在PO 2小時非常高，這比DSP-NP注射高8倍以上。在SC注射后，DSP-NP顯示出比游離DSP溶液更好的保留，并且以持續(xù)的方式釋放來自DSP-NP的DSP藥物。

總之，在SC注射后，針對DSP-NP，不僅在眼內組織中，而且在血液中實現了恒定水平的DSP(對于SC注射DSP-NP，恒定低水平的血液DSP水平)。避免高血液濃度可有助于減少類固醇的全身副作用的機會。

在PO7天，約20％的注射的空PLGA/F127納米顆粒保留在結膜組織中，并且來自納米顆粒的熒光水平的逐漸降低可源自納米顆粒的降解和來自納米顆粒中的PLGA的熒光染料的裂解。從100％至60％的第一明顯下降可能主要由注射的納米顆粒的泄漏引起，然而，該下降不影響眼部組織中期望的恒定高水平的DSP。通過小心施用和減少注射體積，可以使來自SC注射的納米顆粒的泄漏最小化。還觀察到在角膜、眼房、玻璃體和視網膜切開之后在眼外組織處的DSP水平的類似的逐漸減少。它可以由DSP-NP保留在結膜組織中后從納米顆粒持續(xù)釋放DSP造成。

DSP僅在由經角膜DSP表示，而不是由從房水和淚膜物理吸收的DSP表示的組織中檢測。角膜是包含上皮、基質和內皮層的緊密組織。只有具有合適的低分子量和親水性的藥物能夠滲透角膜。DSP不適合用于經角膜滲透。因此，只有在最初的幾個小時，當淚膜處的DSP濃度極高時，才能在角膜組織內檢測到低水平的DSP。除經角膜滲透之外的路徑可能有助于SC注射后眼內組織中的高水平的DSP。

DSP滲透到視網膜中可以忽略不計。眾所周知，糖皮質激素可以有效抑制大多數細胞因子的表達和作用，并且已經顯示誘導T細胞凋亡。需要長期糖皮質激素滴眼劑來預防正常PK后的角膜排斥。長期使用糖皮質激素滴眼劑可以產生安全性問題并且是對患者依從性的挑戰(zhàn)。本文所述的研究表明，用于SC注射的每周一次的DSP-NP制劑有效實現了角膜同種異體移植物排斥的有效預防。針對用SC注射DSP-NP局部處理觀察到的高功效與在房水中發(fā)現的高水平的DSP一致。與對照組、DSP組和PLGA/F127NP組相比，DSP-NP處理組1在組織學研究中缺乏炎性細胞。炎性細胞可產生各種細胞因子，包括IL-2、TNF-a、VEGF.IL-2，TNF-a可增加主要組織相容性復合體II抗原表達、激活導致更多的細胞因子釋放并引起免疫排斥的巨噬細胞和T淋巴細胞。相對于對照組，SC注射后來自DSP-NP的高水平DSP的持續(xù)釋放促進了長到角膜中的新血管的炎癥和遲緩的巨大抑制。角膜的無血管性質對于在角膜移植時維持其免疫優(yōu)先狀態(tài)是至關重要的，并且新生血管形成被認為是角膜排斥的驅動力。SC注射DSP對抑制角膜同種異體移植物的新生血管形成具有一定作用，但是來自SC注射DSP的DSP水平每周一次頻率不足以完全抑制新血管的生長。即使地塞米松顯示較高的抗炎效力(與潑尼松相比為7:1)，SC注射后高水平的DSP的較短保留仍然極大地損害其治療功效。

在針對SC注射DSP-NP的整個9周的研究期間沒有觀察到眼內壓增加。大部分包封的DSP，約80％，在體外釋放研究的第一周釋放，并且在注射后1周剩余的DSP降至大約5％。因此，如果觀察到任何副作用或IOP增加，則可以不通過進一步SC施用DSP-NP而容易地停止DSP。與其它貯庫裝置相比，不需要進一步的手術來去除藥物遞送裝置。一周的間隔在減少新生血管形成和保持移植物角膜清楚方面是有效的。該間隔可能需要延長，以使其成為臨床上可行的治療選擇，例如一個月。

成功構建了載有水溶性糖皮質激素地塞米松磷酸鈉的可生物降解的PLGA/F127納米顆粒(DSP-NP)，并且DSP-NP可以以持續(xù)方式釋放DSP長達7天。通過對大鼠SC注射實現納米顆粒在結膜組織處的延長保持，并且測量眼部組織處的恒定高DSP水平。通過整個9周的研究，SC注射DSP-NP有效地預防角膜同種異體移植物排斥，然而，具有游離DSP的對照組僅在4周內導致移植物失效。這種策略降低了施用頻率，避免了糖皮質激素的潛在的全身副作用，這可能潛在地改善患者依從性。

實例2：用DSP-NP預防新生血管形成

可以在體外和在大鼠SC注射后提供皮質類固醇地塞米松磷酸鈉(DSP)的持續(xù)釋放、被證明預防大鼠角膜同種異體移植物排斥的可生物降解的納米顆粒制劑也表明提供了角膜新生血管形成的有效抑制。

材料和方法

材料

聚(D，L-乳酸-共-羥基乙酸；50:50，Mw～3.4kDa，酸封端)(PLGA)購自Lakeshore Biomaterials(Evonik，阿拉巴馬州伯明翰)。地塞米松磷酸鈉鹽(DSP)購自MP Biomedicals(加利福尼亞州圣安娜)。[³H]標記的DSP購自American Radiolabeled Chemicals(密蘇里州圣路易斯)。普朗尼克F127(聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧丙烷-聚環(huán)氧乙烷三嵌段共聚物，或者PEO-PPO-PEO)、三乙醇胺(TEOA)、乙二胺四乙酸(EDTA)溶液(0.5M)、乙酸鋅二水合物和所有其它有機溶劑購自Sigma-Aldrich(密蘇里州圣路易斯)。Alexa Fluor 647(AF647)尸胺購自Invitrogen(加利福尼亞州卡爾斯巴德)。

熒光標記的DSP-NP的制備

使用由Xu等人，J.Control.Release 170(2013)279-286描述的方法將作為熒光標記的Alexa Fluor 647(AF647)尸胺與PLGA化學綴合。由AF647-PLGA組成的納米顆粒通過溶劑擴散(或納米沉淀)法制備。簡言之，通過將1mL的0.5M乙酸鋅水溶液加入到0.5mL的含有10mgDSP的水溶液中形成DSP-鋅復合物。在以10,000g離心5分鐘后，將沉淀的復合物和50mg PLGA(為1:3w/w的AF647-PLGA:PLGA)懸浮并溶解在1.25mL的THF中，然后加入20μL的TEOA。在攪拌下將混合物逐滴加到100mL的5％F127水溶液中以形成載有DSP的PLGA納米顆粒(DSP-NP)。在通過溶劑蒸發(fā)完全去除THF之后，向納米顆粒懸浮液中加入1mL的0.5M EDTA水溶液(pH7.5)以螯合過量的鋅并溶解任何未包封的DSP-鋅復合物。通過以8,000g離心25分鐘收集熒光標記的DSP-NP，將其用5％F127洗滌，并且重懸于0.2mL的超純水中。沒有熒光標記的DSP-NP是僅使用PLGA的類似的方法制備的。使用Zetasizer Nano ZS90(Malvern Instruments，馬薩諸塞州南鎮(zhèn))，通過動態(tài)光散射和激光多普勒測速技術測定顆粒尺寸和ζ-電位。將樣品在pH7.2的10mM NaCl溶液中稀釋。

結膜下施用后DSP-NP的保留

通過用XenogenIVIS Spectrum光學成像系統(tǒng)(Caliper Life Sciences Inc.，馬薩諸塞州霍普金頓)對整個眼進行成像來研究SC施用后DSP-NP的保留。通過肌內注射氯胺酮(80mg/kg)和賽拉嗪(8mg/kg)的混合物將大鼠麻醉。使用27號針通過SC施用(50μL)將AF647熒光標記的DSP-NP注射給Sprague Dawley大鼠。在S81手術眼科顯微鏡(Zeiss，德國)下進行注射程序。在用45G窺器(Focus Ophthalmics，LLC，加利福尼亞州安大略)成像期間縮回眼瞼。在640/680nm下記錄注射部位處的總熒光計數。使用Living Image 3.0軟件(Caliper Lifesciences，Inc.)分析圖像，并且通過與緊接著注射顆粒后相同的眼睛的熒光計數進行比較來定量納米顆粒的保留。將沒有注射顆粒的大鼠眼睛用作基線。

體內眼部DSP水平

實例1描述了SC注射后1周內的體內眼部DSP水平。使用相同的方法檢測在POD14處在大鼠中SC施用后眼部DSP水平。[³H]標記的DSP與未標記的DSP(10μCi:l mg DSP)混合并用于制備DSP-NP。通過SC注射向相同動物(Sprague Dawley大鼠)的兩只眼睛施用50μL(每只眼～0.8μCi)的相同制劑。在POD14處，在從尾靜脈收集兩滴血液后將麻醉下的大鼠處死。小心地切開并收集含有注射部位的眼房、玻璃體和剩余的眼部組織。將所有樣品稱重，并且然后通過在50℃下培養(yǎng)過夜，用2mL的Solvable(Perkin Elmer，馬薩諸塞州沃爾瑟姆)溶解。血液樣品用0.2mL的H₂O₂和20μL0.5M EDTA漂白。加入10毫升的Ultima gold閃爍介質(Perkin Elmer，馬薩諸塞州沃爾瑟姆)，然后在閃爍計數器(PerkinElmer，馬薩諸塞州沃爾瑟姆)中計數放射性。結果表示為注射劑量的百分比，并且是每個數據點的四只眼的平均值±標準偏差(SD)。血液中DSP的水平是每個時間點兩只動物的平均值。計算注射部位的注射劑量的總百分比和每mg組織或每mL血液的放射性。

動物

所有實驗方案由約翰霍普金斯大學動物護理和使用委員會批準。從Harlan(印第安納州印第安納波利斯)購得6-8周齡的雄性Sprague Dawley大鼠(體重200-250g)。所有大鼠按照視覺與眼科研究協會(ARVO)決議關于在眼科研究中使用動物的聲明進行護理和治療。在實驗過程中，通過肌內注射氯胺酮(80mg/kg)和賽拉嗪(8mg/kg)的混合物將動物麻醉。通過在眼睛上滴注0.5％丙美卡因滴眼劑來實現局部麻醉。

通過縫合的角膜NV模型

通過在角膜中放置縫合線誘導角膜NY模型。簡言之，通過肌內注射氯胺酮(80mg/kg)和賽拉嗪(8mg/kg)的混合物將大鼠麻醉。重復滴注0.5％托品酰胺滴眼劑和0.5％丙美卡因分別用于手術前的全瞳孔擴張和局部麻醉。通過在手術顯微鏡下用10-0尼龍(Alcon Laboratories，Inc，得克薩斯州沃思堡市)在上角膜中放置兩條縫合線誘導角膜NV?？p線與角膜緣之間的距離大約為2mm，并且兩條縫線之間的距離為1mm。放置縫線后，立即向動物施用結膜下注射：a)濃度為6mg DSP/mL的50μLLDSP-NP，b)50μLDSP溶液(6mg DSP/mL)以及c)鹽水對照。將紅霉素抗生素軟膏施用于角膜以預防角膜炎癥和角膜干燥。

角膜NV定量

通過數碼相機和裂隙燈顯微鏡(SL120；Carl Zeiss AG，德國上科亨)觀察角膜NV。通過肌內注射氯胺酮(80mg/kg)和賽拉嗪(8mg/kg)的混合物麻醉大鼠。在成像之前，使用0.5％托吡卡胺滴眼劑的重復滴注來完全擴大瞳孔。在12倍放大率下拍攝裂隙燈照片。使用Adobe Photoshop CS5(Adobe Corp.，San Jose，CA，USA)，使用角膜的裂隙燈照片來定量定量角膜新生血管形成。繪制沿著血管化區(qū)域的角膜緣的弧并且測量血管化區(qū)域像素。使用血管化區(qū)域像素/1mm²區(qū)域像素計算角膜NV區(qū)域。將血管化區(qū)域分成六個部分；將在弧的五個交叉點處的血管頂端與角膜緣之間的距離測量為血管長度，并且計算平均血管長度作為每個角膜的最終新血管長度。所有參數由不知道治療分配的研究者測量。

眼內壓測量

在手術后每周使用 Tonolab(芬蘭赫爾辛基)進行非侵入性眼內壓(IOP)測量。針對每只眼睛記錄的IOP是三次連續(xù)測量的平均值±平均數標準誤差(SEM)。

角膜組織病理學研究

在手術后7天和14天，將所有動物處死，并且摘除進行縫合程序的眼睛。將眼組織用10％福爾馬林固定24小時，然后包埋在石蠟中。切割具有前-后取向(從角膜到視神經)的軸向切片(5μm厚)，并用H&E染色。

實時定量逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)

使用RT-PCR測量一些血管生成細胞因子(包括VEGF、MMP-2、MMP-9、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、角膜中的TNF-α)的mRNA表達水平。分別在手術后7天和14天從治療的眼睛中切除角膜，并合并在一起(n＝3)。根據制造商的說明書，用試劑(Invitrogen，美國紐約格蘭德島)分離總核糖核酸(RNA)。然后，根據制造商的說明書，使用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(No.4368814，Applied Biosystems，美國加利福尼亞州福斯特城)將RNA轉錄為互補DNA。使用帶有 GreenMaster Mix(Applied Biosystems，加利福尼亞州福斯特城)的7100RealTimePCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，加利福尼亞州福斯特城)進行RT-PCR。所使用的引物列于表2中。相對于GAPDH將所有表達水平標準化并彼此比較。結果被表示為三次重復的平均值±平均數標準誤差(SEM)。

表2 RT-PCR引物序列

統(tǒng)計分析

使用t檢驗和多重比較檢驗(單向方差分析、Bonferroni檢驗)比較組間所有收集的數據。在P<0.05的水平時，認為差異是統(tǒng)計學上顯著的。

結果

DSP-NP在體外和在體內的表征

使用鋅螯合劑將水溶性皮質類固醇地塞米松磷酸鈉(DSP)成功地包封到PLGA納米顆粒(DSP-NP)中。為了定量在結膜下施用后可生物降解的DSP-NP的保留，在制備DSP-NP之前，通過將AF-647染料與PLGA綴合來對PLGA進行熒光標記。AF-647與PLGA的綴合確實影響具有8％載藥量和約200nm顆粒尺寸(表3)的DSP-NP的生理化學性質。在SC施用AF-647標記的DSP-NP后，使用活動物成像來定量3周保留研究中的眼睛中的熒光信號(圖3)。在前2天內觀察到熒光信號快速下降至原始信號的20％。

表3.納米顆粒的物理化學性質

VEGF、MMP-2、MMP-9、bFGF和TNF-α的水平示于圖10A(在七天時)和圖10B(在十四天時)。眼內壓示于圖11中。

實例3：葡萄膜炎的預防

葡萄膜炎是一種威脅視力的炎性眼部疾病。皮質類固醇是葡萄膜炎的最有效治療。然而，中間和后葡萄膜炎影響難以用局部類固醇治療的玻璃體和視網膜。結膜下注射的水溶性類固醇溶液非?？焖俚叵?，需要重復注射以長時間維持治療水平。載有地塞米松磷酸鈉(DSP)的納米顆粒(NP)提供高的載藥量和延長的藥物釋放。在大鼠全葡萄膜炎模型中測試它們的功效。

方法：

使用改進的溶劑擴散法制備含有DSP的可生物降解的聚(乳酸-共-羥基乙酸)(PLGA)納米顆粒，使用IP注射脂多糖(LPS)于6周齡Lewis大鼠開始對內毒素誘導的葡萄膜炎(EIU)模型進行24小時測試。通過臨床評價、mRNA表達和炎癥細胞因子在視網膜和組織病理學中的蛋白水平來測試負載DSP的納米顆粒減少由LPS免疫的大鼠的炎癥的能力。

結果：

納米顆粒顯示出200nm的平均直徑、8wt％的高載藥量和15天內的受控藥物釋放分布。圖12是在DSP-NP的漏槽條件下在體外15天內的持續(xù)藥物釋放的曲線圖。

這些載有DSP的納米顆粒在結膜下施用于大鼠眼睛后提供持續(xù)的眼部藥物水平。圖13A和13B是在前房(圖13A)和玻璃體(圖13B)中顯示高水平藥物的大鼠中SC施用DSP-NP后至少7天的持續(xù)高眼部藥物水平的曲線圖。

與為安慰劑顆粒、鹽水或游離藥物溶液的對照處理組比較，顯示載有DSP的NP治療葡萄膜炎大鼠模型顯示顯著更低的炎癥分數、mRNA表達和炎癥細胞因子蛋白水平。圖14是IP注射LPS后3小時和24小時成像并評分的前段的炎癥分數的曲線圖，其顯示出DSP-NP預防組具有比對照組顯著更少的炎癥。圖15是24小時免疫后三組EIU模型中視網膜中IL-1b、IL-6和TNF的mRNA表達的曲線圖，其顯示出與安慰劑-NP和PBS組相比，DSP-NP組中的表達顯著降低。

結論：

載有地塞米松磷酸鈉的PLGA納米顆粒提供皮質類固醇的持續(xù)釋放并且有效減少與大鼠中葡萄膜炎相關的炎癥。由于葡萄膜炎經常復發(fā)，這種治療應該降低施用頻率、避免皮質類固醇的潛在全身副作用，并且改善患者依從性，這具有有希望的臨床應用。

實例4：用于治療大鼠角膜同種異體移植物排斥和青光眼的皮質類固醇納米顆粒的每月結膜下施用

材料和方法

使用用于包封DSP的具有COOH基團的聚乳酸制備納米顆粒，如實例1所述。

如實例2所述將納米顆粒施用于大鼠，用于使用每月結膜下注射來預防角膜新生血管形成。

還將納米顆粒施用于青光眼模型。

結果

納米顆粒具有338±11nm的直徑；0.09±0.038的PDI，-3±1的ζ-電位(mV)和9.4±0.8的DL％。

對于顯示DSP水平隨時間變化的藥代動力學研究，結果顯示在圖16A-16D中。圖16A-16D是DSP-PLA2COOH納米顆粒結膜下注射到大鼠的藥代動力學(隨時間(天)變化的ngDSP/ml)的曲線圖。圖16A，眼房；圖16B，玻璃體；圖16C，血液；以及圖16D，注射部位對照。

圖17A-17E是在(17A-17C)DSP-PLA2COOH納米顆粒處理組和(17D-17F)鹽水對照組的整個12周隨訪期間移植物隨時間(天)變化的臨床觀察的曲線圖。箭頭表示處理注射時間點。圖17A，17D是透明度分數；圖17B，17E是水腫分數，以及17C，17F表示新生血管形成。

圖18是鹽水對照組和DSP-PLA2COOH納米顆粒處理組的存活曲線(隨時間(天)變化的存活百分比)。

圖19A和19B是與對照(19B)相比以每月間隔(19A)用DSP-PLA2COOH納米顆粒處理的動物隨時間(天)變化的眼內壓的曲線圖。

結果證明，對于使用DSP-PLA2COOH納米顆粒預防移植物排斥以及治療青光眼，每月注射獲得了相當的結果。

序列表

<110> 約翰霍普金斯大學

<120> 用于預防角膜同種異體移植物排斥和新生血管形成的載有糖皮質激素的納米顆粒

<130> GCI17HK0272

<150> 62/139,561

<151> 2015-03-27

<150> 62/037,000

<151> 2014-08-13

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 1

gcccatgaag tggtgaagtt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 2

actccagggc ttcatcattg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 3

agctttgatg gcccctatct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 4

ggagtgacag gtcccagtgt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 5

ccaccgagct atccactcat 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 6

gtccggtttc agcatgtttt 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 7

gaaccggtac ctggctatga 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 8

ccgttttgga tccgagttta 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 9

actcccagaa aagcaagcaa 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 10

cgagcaggaa tgagaagagg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 11

tgccactcag aagactgtgg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 12

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