發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于增強(qiáng)人類受試者中的免疫應(yīng)答的方法和組合物。具體地，所述方法和組合物在人類受試者中提供對(duì)于針對(duì)免疫原的b細(xì)胞和t細(xì)胞活性的強(qiáng)誘導(dǎo)，所述方法和組合物可以用于在人類受試者中提供針對(duì)疾病諸如腫瘤或感染性疾病、更具體地為絲狀病毒感染的有效治療和/或保護(hù)。

背景技術(shù)：

疫苗可以用于提供針對(duì)病原體(諸如病毒、細(xì)菌、真菌或原生動(dòng)物)以及癌癥的免疫保護(hù)。

感染性疾病為世界范圍內(nèi)繼心血管疾病之后第二主要死亡原因，但是為嬰兒和兒童的主要死亡原因(lee和nguyen,2015,immunenetwork,15(2):51-7)。疫苗接種為用于預(yù)防多種感染性疾病的最有效的工具。疫苗接種的目標(biāo)為產(chǎn)生病原體特異性免疫應(yīng)答，從而提供針對(duì)感染的持久性保護(hù)。盡管疫苗已獲得大量成功，但是由于新病原體的出現(xiàn)、舊病原體的再次出現(xiàn)以及現(xiàn)有疫苗所賦予的次最佳保護(hù)而仍需要開發(fā)安全且強(qiáng)力的疫苗。最近重要的出現(xiàn)或再次出現(xiàn)的疾病包括：2003年的重度急性呼吸器官綜合癥(sars)、2009年的h1n1流感大流行以及2014年的埃博拉病毒。因此，需要開發(fā)針對(duì)新出現(xiàn)疾病的新穎且有效的疫苗。

癌癥為西方世界中的主要?dú)⑹种?，其中肺癌、乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸直腸癌是最常見的(butterfield,2015,bmj,350:h988)。若干種癌癥治療的臨床方法為可用的，包括外科手術(shù)、化學(xué)療法、放射療法以及使用小分子信號(hào)傳導(dǎo)途徑抑制劑的治療。這些標(biāo)準(zhǔn)方法各自已顯示通過(guò)增加腫瘤內(nèi)的腫瘤抗原的表達(dá)或者引起抗原從垂死腫瘤細(xì)胞中釋放并且通過(guò)促進(jìn)治療益處的抗腫瘤免疫來(lái)調(diào)整抗腫瘤免疫。免疫療法為提供用于治療癌癥的替代方法的有前景領(lǐng)域。癌癥疫苗被設(shè)計(jì)為促進(jìn)腫瘤特異性免疫應(yīng)答，具體地為對(duì)腫瘤抗原特異的細(xì)胞毒性cd8+t細(xì)胞。必需提高臨床功效，以便使癌癥疫苗成為傳統(tǒng)癌癥治療的有效替代方案或補(bǔ)充方案。目前為止已進(jìn)行適當(dāng)?shù)呐?lái)更好地理解臨床上有效的癌癥疫苗的基本要求。最新數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)的是，重要的要求以及其他要求為(1)使用多表位免疫原，其可能來(lái)源于不同腫瘤抗原；(2)選擇有效佐劑；(3)癌癥疫苗與藥劑締合能夠抵消腫瘤微環(huán)境中存在的調(diào)節(jié)環(huán)境；以及(4)需要在準(zhǔn)確預(yù)先測(cè)試之后選擇確定疫苗制劑和方案以比較不同抗原制劑(fenoglio等，2013,humvaccinimmunother,(12):2543-7)。需要提供有免疫學(xué)功效和臨床功效的新一代癌癥疫苗來(lái)解決這些要求。

埃博拉病毒(諸如扎伊爾(zaire)埃博拉病毒(ebov)和蘇丹(sudan)埃博拉病毒(sudv))和近緣馬爾堡病毒(marv)與北美、歐洲和非洲的人類和靈長(zhǎng)類動(dòng)物中高致死性埃博拉出血熱(ehf)的爆發(fā)相關(guān)聯(lián)。這些病毒為已知感染人類和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物并伴隨嚴(yán)重健康后果(包括死亡)的絲狀病毒。絲狀病毒感染已在人類中導(dǎo)致高達(dá)90％的病例致死率。ebov、sudv和marv感染導(dǎo)致ehf，其中通常在感染后7至10天內(nèi)發(fā)生死亡。ehf表現(xiàn)為急性發(fā)熱性綜合癥，其出現(xiàn)突然發(fā)熱、惡心、嘔吐、腹瀉、斑狀丘疹、不適、虛脫、增加的血管通透性的全身性體征、凝血功能異常以及先天性免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)障礙。大部分疾病似乎是由對(duì)感染的先天性免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)障礙以及由血管內(nèi)皮細(xì)胞中的病毒復(fù)制引起，所述病毒誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的死亡和內(nèi)皮屏障的破壞。絲狀病毒可通過(guò)小顆粒氣溶膠或通過(guò)與人類或nhp來(lái)源的感染血液、器官和體液直接接觸來(lái)傳播。據(jù)報(bào)道單個(gè)病毒粒子的感染足以在人類中引起埃博拉出血熱(ehf)。目前，不存在批準(zhǔn)用于治療或預(yù)防ehf的治療劑或疫苗。支持性護(hù)理仍然是感染有絲狀病毒的個(gè)體的唯一批準(zhǔn)的醫(yī)療干預(yù)。

作為嚴(yán)重人類疾病的原因，絲狀病毒作為天然感染的來(lái)源并且也作為可能的生物恐怖主義試劑而獲得持續(xù)關(guān)注。尚未明確鑒別出絲狀病毒在野外的儲(chǔ)層。已描述引起ehf的四種亞型的埃博拉病毒，即在扎伊爾、蘇丹、本迪布焦(bundibugyo)和象牙海岸地區(qū)的埃博拉病毒(sancheza.等，1996,pnasusa,93:3602–3607)這些亞型的埃博拉病毒具有相似的基因結(jié)構(gòu)，例如含有七個(gè)線性排列的基因的負(fù)鏈rna病毒。結(jié)構(gòu)基因產(chǎn)物包括例如以兩種替代形式存在的包膜糖蛋白、由rna編輯產(chǎn)生的分泌的可溶性糖蛋白(ssgp)和介導(dǎo)病毒進(jìn)入的跨膜糖蛋白(gp)(sancheza.等，1996,pnasusa,93:3602–3607)。

已表明免疫可適用于針對(duì)埃博拉感染進(jìn)行保護(hù)，因?yàn)榘２├瓉喰蛢?nèi)核苷酸多態(tài)性似乎比其他rna病毒更少(sancheza.等，1996,pnasusa,93:3602–3607)。直到最近，針對(duì)絲狀病毒的預(yù)防疫苗的發(fā)展已具有變化的結(jié)果，部分是因?yàn)閷?duì)針對(duì)絲狀病毒感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答的要求知之甚少。另外，在天然儲(chǔ)層內(nèi)循環(huán)的大量絲狀病毒使得設(shè)計(jì)針對(duì)所有種類的絲狀病毒進(jìn)行保護(hù)的疫苗的努力復(fù)雜化。

目前，存在若干疫苗抗原遞送平臺(tái)，其在暴露于高感染劑量的絲狀病毒的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(nhp)中證實(shí)有多種保護(hù)水平。疫苗候選物在發(fā)展中是基于多種平臺(tái)技術(shù)，包括具有復(fù)制能力的載體(例如水泡性口炎病毒；狂犬病病毒；副流感病毒)；不具有復(fù)制能力的載體(腺病毒、改性的安卡拉牛痘病毒)；包括細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞中表達(dá)的病毒樣顆粒在內(nèi)的蛋白質(zhì)亞基；dna疫苗；和/或活的和殺死的減毒絲狀病毒(friedrich等，2012,viruses,4(9):1619-50)。ebov糖蛋白gp為針對(duì)暴露于相同種類的ebov進(jìn)行保護(hù)的疫苗的必要組分。此外，包括來(lái)自ebov和sudv(兩種最致命種類的埃博拉病毒)的gp可保護(hù)猴子使其免于ebov和sudv肌內(nèi)暴露，以及暴露于遠(yuǎn)緣本迪布焦病毒(bdbv)、塔伊森林(forest)埃博拉病毒(tafv；以前稱為象牙海岸或科特迪瓦埃博拉病毒)種類。同樣，包括來(lái)自marv的gp可保護(hù)猴子使其免于肌內(nèi)和氣溶膠marv暴露。用于這些病毒的醫(yī)學(xué)防護(hù)措施的發(fā)展為高度優(yōu)先的，尤其是pan-絲狀病毒疫苗的發(fā)展—所述疫苗為針對(duì)全部致病絲狀病毒進(jìn)行保護(hù)的一種疫苗。

復(fù)制缺陷型腺病毒載體(rad)為胞內(nèi)免疫應(yīng)答的強(qiáng)大誘導(dǎo)物并且因此已經(jīng)充當(dāng)基于基因的疫苗的載體，尤其是對(duì)于慢病毒屬和絲狀病毒以及其他非病毒病原體的疫苗(shiver等，2002,nature,415(6869):331-5；hill等，2010,humvaccin6(1):78-83；sullivan等，2000,nature,408(6812):605-9；sullivan等，2003,nature,424(6949):681-4；sullivan等，2006,plosmed,3(6):e177；radosevic等，2007,infectimmun,75(8):4105-15；santra等，2009,vaccine,27(42):5837-45)。

基于腺病毒的疫苗作為人類疫苗具有若干優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗鼈冊(cè)趃mp條件下可產(chǎn)生至高滴度并且已證明在人類中為安全的和免疫原性的(asmuth等，2010,jinfectdis201(1):132-41；kibuuka等，2010,jinfectdis201(4):600-7；koup等，2010,plosone5(2):e9015；catanzaro等，2006,jinfectdis,194(12):1638-49；harro等，2009,clinvaccineimmunol,16(9):1285-92)。盡管由于rad5在引起廣泛的抗體和cd8+t細(xì)胞應(yīng)答中的顯著效能而使用所述rad5進(jìn)行大多數(shù)初始疫苗工作，但是人類中預(yù)先存在的對(duì)rad5的免疫可限制功效(catanzaro等，2006,jinfectdis,194(12):1638-49；cheng等，2007,plospathog,3(2):e25；mccoy等，2007,jvirol,81(12):6594-604；buchbinder等，2008,lancet,372(9653):1881-93)。此性質(zhì)可能限制rad5在許多疫苗的臨床應(yīng)用中的使用，所述疫苗目前處在發(fā)展中并且包括埃博拉病毒(ebov)和馬爾堡病毒(marv)。

從腺病毒血清型26和血清型35衍生的復(fù)制缺陷型腺病毒載體rad26和rad35分別具有規(guī)避ad5預(yù)先存在的免疫的能力。rad26可在適于以大范圍且以臨床等級(jí)產(chǎn)生這些載體的ad5e1互補(bǔ)細(xì)胞系中生長(zhǎng)至高滴度(abbink等，2007,jvirol,81(9):4654-63)，并且已顯示此載體在初免-加強(qiáng)疫苗策略中誘導(dǎo)體液介導(dǎo)和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(abbink等，2007,jvirol,81(9):4654-63；liu等，2009,nature,457(7225):87-91)。rad35載體在適于產(chǎn)生臨床等級(jí)的疫苗的細(xì)胞系上生長(zhǎng)至高滴度(havenga等，2006,jgenvirol,87:2135-43)，并且已配制用于注射以及穩(wěn)定的可吸入粉末(jin等，2010,vaccine28(27):4369-75)。這些載體顯示人類樹突狀細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)導(dǎo)(degruijl等，2006,jimmunol,177(4):2208-15；lore等，2007,jimmunol,179(3):1721-9)，并且因此具有介導(dǎo)高水平的抗原遞送和呈遞的能力。

改性的安卡拉牛痘(mva)病毒與牛痘病毒有關(guān)，為痘病毒科中正痘病毒屬的成員。已知痘病毒因?yàn)槠浒麧{內(nèi)表達(dá)而為cd8t細(xì)胞應(yīng)答的良好誘導(dǎo)物。然而，它們不擅長(zhǎng)于產(chǎn)生cd4mhcii類限制性t細(xì)胞(參見，例如haslett等，2000,journalofinfectiousdiseases,181:1264-72，第1268頁(yè))。mva已被工程化為用作用于重組基因表達(dá)的病毒載體或用作重組疫苗。

為開發(fā)更安全的產(chǎn)物(諸如疫苗或藥物)，具有增強(qiáng)的安全性能的mva的病毒株已由bavariannordic育出。mva由bavariannordic進(jìn)一步傳代并且指定為mva-bn，其代表樣品于2000年8月30日以登錄號(hào)v00083008儲(chǔ)存在歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏所(europeancollectionofcellcultures，ecacc；英國(guó)sp40jg，威爾特郡，索爾淄博里市，camr(camr,salisbury,wiltshiresp40jguk))。在wo02/42480(us2003/0206926)和wo03/048184(us2006/0159699)中進(jìn)一步描述mva-bn，所述兩份專利均以引用的方式整體并入本文。

mva-bn可連接并且進(jìn)入人細(xì)胞，其中病毒編碼的基因非常有效地表達(dá)。mva-bn不具有復(fù)制能力，這意味著所述病毒并不在人類細(xì)胞中復(fù)制。在人類細(xì)胞中，表達(dá)病毒基因并且不產(chǎn)生感染病毒。根據(jù)美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心，mva-bn被分類為生物安全等級(jí)1生物體。mva-bn和衍生物的制劑已施用至許多類型的動(dòng)物和超過(guò)2000名人類受試者，包括免疫缺陷型個(gè)體。所有疫苗接種已經(jīng)證明總體上安全并良好耐受的。盡管其高減毒作用和減少的毒性，在臨床前研究中已顯示mva-bn引發(fā)對(duì)疫苗和由克隆到mva基因組中的基因所編碼的異源基因產(chǎn)物的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答兩者[e.harrer等(2005),antivir.ther.10(2):285-300；a.cosma等(2003),vaccine22(1):21-9；m.dinicola等(2003),hum.genether.14(14):1347-1360；m.dinicola等(2004),clin.cancerres.,10(16):5381-5390]。

對(duì)感染的保護(hù)性免疫依賴于先天性免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。適應(yīng)性免疫應(yīng)答包括由b細(xì)胞產(chǎn)生抗體(體液免疫應(yīng)答)和cd8+效應(yīng)t細(xì)胞(細(xì)胞免疫應(yīng)答)與cd4+t細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性，所述cd4+t細(xì)胞也稱為輔助性t細(xì)胞，其在體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答中起到關(guān)鍵性作用。

cd4+t細(xì)胞被抗原刺激，以提供促進(jìn)免疫應(yīng)答的信號(hào)。cd4+t細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞-細(xì)胞相互作用并釋放細(xì)胞因子來(lái)起作用，以幫助觸發(fā)b細(xì)胞活化和抗體產(chǎn)生、細(xì)胞毒性cd8+t細(xì)胞的活化和增殖以及巨噬細(xì)胞活性。

抗體介導(dǎo)的保護(hù)可以是歷時(shí)非常久的，并且在病原體接觸的時(shí)候存在的中和抗體可以預(yù)防而不是抵抗感染，從而實(shí)現(xiàn)‘消除性’免疫(swain等，2012,natrevimmunol,12(2):136-148)。在病毒感染之后，cd4+信號(hào)傳導(dǎo)為指導(dǎo)生發(fā)中心形成所必需的，其中cd4+細(xì)胞促進(jìn)b細(xì)胞同種型轉(zhuǎn)換和抗體應(yīng)答的親和力成熟以及b細(xì)胞記憶和長(zhǎng)壽的產(chǎn)抗體漿細(xì)胞的產(chǎn)生。因此，cd4+細(xì)胞可能對(duì)于產(chǎn)生對(duì)大部分(如果不是所有的話)病原體的長(zhǎng)久抗體應(yīng)答和保護(hù)性免疫是重要的。

cd4+t細(xì)胞幫助初免的作用、效應(yīng)物功能和cd8+t細(xì)胞的記憶在慢性感染的情況下，當(dāng)cd8+t細(xì)胞取決于繼續(xù)的增殖循環(huán)時(shí)(對(duì)此而言，cd4+t細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生為關(guān)鍵的)是尤其重要的(swain等，2012,natrevimmunol,12(2):136-148)。

最新數(shù)據(jù)指示cd4+t細(xì)胞的作用進(jìn)一步擴(kuò)展超出細(xì)胞因子產(chǎn)生的作用。例如，cd4+t細(xì)胞可以將關(guān)鍵性淋巴樣群體募集到二級(jí)淋巴組織或病原體感染部位(sant和mcmichael,2012,jexpmed,209(8):1391-5)。確切地說(shuō)，cd4+t細(xì)胞可以促進(jìn)cd8+t細(xì)胞與二級(jí)淋巴組織中的樹突細(xì)胞接合，引起淋巴樣細(xì)胞流入到引流淋巴結(jié)中，并且將效應(yīng)物募集到病毒復(fù)制部位。另外，cd4+t細(xì)胞還可以通過(guò)細(xì)胞溶解活性來(lái)防御病原體。

在分辨初次免疫應(yīng)答之后或者在成功疫苗接種之后，大部分病原體特異性效應(yīng)cd4+t細(xì)胞死亡，留下一小群長(zhǎng)壽記憶細(xì)胞。記憶cd4+t細(xì)胞增強(qiáng)在組織中感染之后的早期先天性免疫應(yīng)答，這有助于病原體控制(swain等，2012,natrevimmunol,12(2):136-148)。重要的是，cd4+t細(xì)胞提供對(duì)b細(xì)胞以及潛在地對(duì)cd8+t細(xì)胞的更快輔助，從而有助于產(chǎn)生更快且更強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答。

在免疫應(yīng)答期間cd4+t細(xì)胞的功能范圍突出顯示了其在產(chǎn)生針對(duì)病原體的高效免疫保護(hù)方面的關(guān)鍵性作用。最新研究已提供cd4+t細(xì)胞作為抗病毒免疫中的直接效應(yīng)物的新證據(jù)(sant等，2012,j.exp.med.209:1391-1395)。據(jù)報(bào)道預(yù)先存在的流感特異性cd4+t細(xì)胞與針對(duì)人類中的流感攻擊的疾病預(yù)防相關(guān)(wilkinson等，2012,naturemedicine,18:274-280)。

使用若干種測(cè)定來(lái)檢測(cè)免疫應(yīng)答，所述測(cè)定包括例如elisa(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)、elispot(酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法)和ics(細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法)。elisa測(cè)定分析例如分泌型抗體或細(xì)胞因子的水平。當(dāng)使用elisa測(cè)定來(lái)確定結(jié)合到特定抗原(體液免疫應(yīng)答的指示物)的抗體水平時(shí)，它們還可反映cd4+t細(xì)胞活性，因?yàn)閎細(xì)胞對(duì)高親和力抗體的產(chǎn)生取決于cd4+輔助t細(xì)胞的活性。elispot和ics為分析例如對(duì)特定抗原的t細(xì)胞應(yīng)答的單細(xì)胞測(cè)定。elispot測(cè)定測(cè)量個(gè)別細(xì)胞的分泌活性，并且ics測(cè)定分析細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的水平。cd4+特異性和cd8+特異性t細(xì)胞應(yīng)答可以使用ics測(cè)定來(lái)確定。

存在使用動(dòng)物諸如猴子和小鼠中的mva-ad初免-加強(qiáng)方案的出版論文的測(cè)試方法。然而，迄今為止沒(méi)有mva-ad初免-加強(qiáng)方案顯示比互補(bǔ)ad-mva初免-加強(qiáng)方案更有效地刺激免疫應(yīng)答。例如，barouch等(2012,nature,482(7383):89-93)發(fā)現(xiàn)在猴子中，包含mva/ad26的異源方案“比ad26/mva或ad35/ad26相對(duì)更低效，所述ad26/mva或ad35/ad26使病毒載量設(shè)定點(diǎn)減小大于100倍”。具體地說(shuō)，對(duì)于以0-24周時(shí)間表施用的mva/ad26初免-加強(qiáng)方案而言，在獼猴中對(duì)sivgag、pol和env的細(xì)胞免疫應(yīng)答比相反的ad26/mva方案更不明顯，如通過(guò)ifn-γelispot和ics測(cè)定所測(cè)量的。對(duì)于mva/ad26方案而言，抗體應(yīng)答也比ad26/mva方案更低效，如通過(guò)elisa測(cè)定所證明的，盡管程度較低。roshorm等(2012,eurjimmunol,42(12):3243-55)發(fā)現(xiàn)以0-4周時(shí)間表在小鼠中施用的mva/chadv68初免-加強(qiáng)方案并不比相反的chadv68/mva方案在誘導(dǎo)對(duì)hivgag的免疫應(yīng)答方面更有效，如通過(guò)cd8+t細(xì)胞活性的ics測(cè)定所測(cè)量的。gilbert等(2002,vaccine,20(7-8):1039-45)發(fā)現(xiàn)以0-14周時(shí)間表在小鼠中施用的mva/ad5初免-加強(qiáng)方案比相反的ad5/mva方案在誘導(dǎo)對(duì)瘧原蟲cs的免疫應(yīng)答方面稍微更低效，如通過(guò)elispot測(cè)定所測(cè)量的。當(dāng)兩者均以0-10天時(shí)間表施用時(shí)，mva/ad5方案甚至比ad5/mva方案更低效。另外，mva/ad5方案在保護(hù)免疫小鼠使其免于攻擊性感染方面更低效(80％對(duì)比100％保護(hù))。這些報(bào)道并未指示mva/ad方案可以在人類中引起比ad/mva方案更強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答。

對(duì)于在人類中引發(fā)針對(duì)抗原蛋白的廣泛且強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答的改良疫苗并且尤其是提供針對(duì)致命埃博拉和馬爾堡絲狀病毒的保護(hù)性免疫的疫苗存在未滿足的需要。

發(fā)明概述

現(xiàn)在首次發(fā)現(xiàn)施用無(wú)復(fù)制能力載體的初免-加強(qiáng)方案的特定順序產(chǎn)生提高的有效免疫應(yīng)答，所述免疫應(yīng)答可適于在人類受試者中提供針對(duì)疾病諸如腫瘤或感染性疾病、更具體地為絲狀病毒感染的治療和/或保護(hù)。出人意料地，現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)，不同于先前報(bào)道的動(dòng)物研究，使用mva載體作為初免物并使用腺病毒載體作為加強(qiáng)免疫物，產(chǎn)生針對(duì)免疫原的優(yōu)異免疫應(yīng)答，其特征在于t細(xì)胞活性的強(qiáng)誘導(dǎo)和高水平的對(duì)免疫原特異的抗體應(yīng)答。

在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，無(wú)復(fù)制能力載體的mva-初免和腺病毒-加強(qiáng)組合在人類受試者中產(chǎn)生針對(duì)抗原蛋白或其免疫原性多肽的增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。所述抗原蛋白或其免疫原性多肽可以是任何抗原蛋白或其免疫原性多肽。例如，所述抗原蛋白或其免疫原性多肽可以來(lái)源于病原體，例如病毒、細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物或腫瘤。

因此，本發(fā)明的一個(gè)總體方面涉及一種增強(qiáng)人類受試者中的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括：

a.將包含免疫有效量的mva載體的第一組合物施用于所述人類受試者以用于引發(fā)免疫應(yīng)答，所述mva載體包含編碼抗原蛋白或其免疫原性多肽的第一多核苷酸；以及

b.將包含免疫有效量的腺病毒載體的第二組合物施用于所述受試者以用于加強(qiáng)免疫應(yīng)答，所述腺病毒載體包含編碼抗原蛋白或其免疫原性多肽的第二多核苷酸；

從而在人類受試者中獲得針對(duì)抗原蛋白的增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，增強(qiáng)的免疫應(yīng)答包括在人類受試者中針對(duì)抗原蛋白的增強(qiáng)的抗體應(yīng)答。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，增強(qiáng)的免疫應(yīng)答包括在人類受試者中針對(duì)抗原蛋白的增強(qiáng)的cd4+和/或cd8+t細(xì)胞應(yīng)答。

本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種引發(fā)人類受試者中的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括：

a.將包含免疫有效量的mva載體的第一組合物施用于所述人類受試者以用于引發(fā)免疫應(yīng)答，所述mva載體包含編碼抗原蛋白或其免疫原性多肽的第一多核苷酸；以及

b.將包含免疫有效量的腺病毒載體的第二組合物施用于所述受試者以用于加強(qiáng)免疫應(yīng)答，所述腺病毒載體包含編碼抗原蛋白或其免疫原性多肽的第二多核苷酸；

從而在人類受試者中獲得相對(duì)于在施用第二組合物進(jìn)行初免并且施用第一組合物加強(qiáng)免疫應(yīng)答的情況下觀察到的免疫應(yīng)答增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)所述方法產(chǎn)生的增強(qiáng)的免疫應(yīng)答包括在人類受試者中針對(duì)抗原蛋白的增強(qiáng)的抗體應(yīng)答。此應(yīng)答的特征可在于高比例應(yīng)答者的存在，諸如超過(guò)50％、60％、70％、80％、90％或100％測(cè)試的受試者。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)所述方法產(chǎn)生的增強(qiáng)的免疫應(yīng)答包括在人類受試者中針對(duì)抗原蛋白的增強(qiáng)的cd8+t細(xì)胞應(yīng)答[例如，應(yīng)答的特征在于高比例cd8+應(yīng)答者的存在，諸如超過(guò)50％、60％、70％、80％、90％或100％測(cè)試的受試者，如通過(guò)ics測(cè)定所確定的，其中平均總細(xì)胞因子應(yīng)答為約0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％或更大]。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)所述方法產(chǎn)生的增強(qiáng)的cd8+t細(xì)胞應(yīng)答包括對(duì)抗原蛋白特異的多功能cd8+t細(xì)胞的增加或誘導(dǎo)。此多功能cd8+t細(xì)胞表達(dá)超過(guò)一種細(xì)胞因子，諸如ifn-γ、il-2和tnf-α中的兩種或更多種。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)所述方法產(chǎn)生的增強(qiáng)的免疫應(yīng)答包括在人類受試者中針對(duì)抗原蛋白的增強(qiáng)的cd4+t細(xì)胞應(yīng)答[例如，應(yīng)答的特征在于高比例cd4+應(yīng)答者的存在，諸如超過(guò)50％、60％、70％、80％、90％或100％測(cè)試的受試者，如通過(guò)ics測(cè)定所確定的，其中平均總細(xì)胞因子應(yīng)答為約0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％或更大]。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)所述方法產(chǎn)生的增強(qiáng)的cd4+t細(xì)胞應(yīng)答包括對(duì)抗原蛋白特異的多功能cd4+t細(xì)胞的增加或誘導(dǎo)。此多功能cd4+t細(xì)胞表達(dá)超過(guò)一種細(xì)胞因子，諸如ifn-γ、il-2和tnf-α中的兩種或更多種。

在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，增強(qiáng)的免疫應(yīng)答還包括在人類受試者中針對(duì)抗原蛋白的增強(qiáng)的抗體應(yīng)答。此應(yīng)答的特征可在于高比例的應(yīng)答者的存在，諸如超過(guò)50％、60％、70％、80％、90％或100％測(cè)試的受試者。

在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)所述方法產(chǎn)生的增強(qiáng)的免疫應(yīng)答還包括在人類受試者中針對(duì)抗原蛋白的增強(qiáng)的cd8+t細(xì)胞應(yīng)答[例如，應(yīng)答的特征在于高比例cd8+應(yīng)答者的存在，諸如超過(guò)50％、60％、70％、80％、90％或100％測(cè)試的受試者，如通過(guò)ics測(cè)定所確定的，其中平均總細(xì)胞因子應(yīng)答為約0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％或更大]。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)所述方法產(chǎn)生的增強(qiáng)的cd8+t細(xì)胞應(yīng)答包括在人類受試者中對(duì)抗原蛋白特異的多功能cd8+t細(xì)胞的增加或誘導(dǎo)。

在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，增強(qiáng)的免疫應(yīng)答包括在人類受試者中針對(duì)抗原蛋白的增強(qiáng)的cd4+t細(xì)胞應(yīng)答、增強(qiáng)的抗體應(yīng)答和/或增強(qiáng)的cd8+t細(xì)胞應(yīng)答。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，腺病毒載體為rad26載體。

在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，加強(qiáng)步驟(b)在初免步驟(a)之后1-12周進(jìn)行。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，加強(qiáng)步驟(b)在初始加強(qiáng)步驟之后重復(fù)一次或多次。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，加強(qiáng)步驟(b)在初免步驟(a)之后2-12周進(jìn)行。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，加強(qiáng)步驟(b)在初免步驟(a)之后4-12周進(jìn)行。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，加強(qiáng)步驟(b)在初免步驟(a)之后1周進(jìn)行。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，加強(qiáng)步驟(b)在初免步驟(a)之后2周進(jìn)行。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，加強(qiáng)步驟(b)在初免步驟(a)之后4周進(jìn)行。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，加強(qiáng)步驟(b)在初免步驟(a)之后8周進(jìn)行。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗原蛋白來(lái)源于病原體，諸如病毒、細(xì)菌、真菌或原生動(dòng)物。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，抗原蛋白來(lái)源于腫瘤，優(yōu)選地為癌癥。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸編碼相同的抗原蛋白或其免疫原性多肽。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸編碼相同抗原蛋白的不同免疫原性多肽或表位。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸編碼不同但相關(guān)的抗原蛋白或其免疫原性多肽。例如，相關(guān)抗原蛋白可以是來(lái)源于相同抗原蛋白的基本上相似的蛋白質(zhì)或者來(lái)源于相同病原體或腫瘤的不同抗原蛋白。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法為人類受試者提供針對(duì)與抗原蛋白相關(guān)的疾病諸如腫瘤或感染性疾病的保護(hù)性免疫。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，無(wú)復(fù)制能力mva和腺病毒載體的初免-加強(qiáng)組合增強(qiáng)人類受試者中針對(duì)腫瘤的保護(hù)性免疫應(yīng)答。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，無(wú)復(fù)制能力mva和腺病毒載體的初免-加強(qiáng)組合增強(qiáng)人類受試者中針對(duì)病原體，更優(yōu)選地一種或多種絲狀病毒亞型，諸如埃博拉和/或馬爾堡絲狀病毒的免疫應(yīng)答。

根據(jù)本發(fā)明的絲狀病毒亞型可以是任何絲狀病毒亞型。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀病毒亞型選自下組：扎伊爾、蘇丹、雷斯頓(reston)、本迪布焦、塔伊森林和馬爾堡。抗原蛋白可為來(lái)自包含抗原決定簇的任何絲狀病毒的蛋白質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗原蛋白為糖蛋白或核蛋白。由包含在根據(jù)本發(fā)明的第一組合物和第二組合物中的mva載體或腺病毒載體編碼的抗原蛋白可以是來(lái)自任何絲狀病毒的任何抗原蛋白。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一組合物中的mva載體包含編碼至少四種絲狀病毒亞型的抗原蛋白的核酸。優(yōu)選地，mva載體包含編碼具有seqidno:1、seqidno:2、seqidno:4和seqidno:5的氨基酸序列的一種或多種抗原蛋白的核酸。最優(yōu)選地，mva載體包含編碼具有seqidno:1、seqidno:2、seqidno:4和seqidno:5的氨基酸序列的四種抗原蛋白的核酸。

在某些實(shí)施方案中，第二組合物還包含至少一種腺病毒載體，所述腺病毒載體包含編碼至少一種絲狀病毒亞型的抗原蛋白的核酸。由腺病毒編碼的至少一種絲狀病毒亞型可以選自由mva載體編碼的四種絲狀病毒亞型中的任一種或不是由mva載體編碼的新亞型。在一個(gè)實(shí)施方案中,由腺病毒載體編碼的至少一種絲狀病毒亞型的抗原蛋白具有選自由以下組成的組的氨基酸序列：seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4和seqidno:5。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二組合物還包含超過(guò)一種腺病毒載體，每種腺病毒載體包含編碼至少一種絲狀病毒亞型的抗原蛋白的核酸。由超過(guò)一種腺病毒載體編碼的抗原蛋白可以是相同或不同的抗原蛋白。例如，第二組合物可以包含第一腺病毒載體，所述第一腺病毒載體包含編碼具有選自由以下組成的組的氨基酸序列的第一抗原蛋白的核酸：seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4和seqidno:5。第二組合物可以還包含第二腺病毒載體，所述第二腺病毒載體包含編碼具有選自由以下組成的組的氨基酸序列的第二抗原蛋白的核酸：seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4和seqidno:5。第二組合物可以另外包含第三腺病毒載體，所述第三腺病毒載體包含編碼具有選自由以下組成的組的氨基酸序列的第三抗原蛋白的核酸：seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4和seqidno:5。第一腺病毒載體、第二腺病毒載體和第三腺病毒載體可以是相同或不同的。第一抗原蛋白、第二抗原蛋白和第三抗原蛋白可以是相同或不同的。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二組合物包含第一腺病毒載體，所述第一腺病毒載體包含編碼具有seqidno:1的氨基酸序列的抗原蛋白的核酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二組合物還包含第二腺病毒載體，所述第二腺病毒載體包含編碼具有seqidno:2的氨基酸序列的抗原蛋白的核酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二組合物另外包含第三腺病毒載體，所述第三腺病毒載體包含編碼具有seqidno:3的氨基酸序列的抗原蛋白的核酸。

可以設(shè)想的是本文描述的方法、疫苗和組合物可體現(xiàn)在試劑盒中。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明可以包括一種試劑盒，所述試劑盒包含：

(a)第一組合物，其包含免疫有效量的mva載體和藥學(xué)上可接受的載體，所述mva載體包含編碼第一絲狀病毒亞型的抗原蛋白或基本上相似的抗原蛋白的核酸；以及

(b)第二組合物，其包含免疫有效量的腺病毒載體和藥學(xué)上可接受的載體，所述腺病毒載體包含編碼至少一種絲狀病毒亞型的抗原蛋白或基本上相似的抗原蛋白的核酸；

其中組合物(a)為初免組合物并且組合物(b)為加強(qiáng)組合物。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種組合疫苗、一種試劑盒或一種用途，其中所述第一組合物中的mva載體包含編碼來(lái)自四種不同絲狀病毒亞型的具有seqidno:1、seqidno:2、seqidno:4和seqidno:5的氨基酸序列的一種或多種抗原蛋白，優(yōu)選所有四種抗原蛋白的核酸；并且其中所述第二組合物中的腺病毒載體包含編碼具有seqidno:1的氨基酸序列的抗原蛋白的核酸。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種組合疫苗、一種試劑盒或一種用途，其中組合物(a)中的mva載體包含編碼來(lái)自四種不同絲狀病毒亞型的具有seqidno:1、seqidno:2、seqidno:4和seqidno:5的氨基酸序列的一種或多種抗原蛋白，優(yōu)選所有四種抗原蛋白的核酸；并且其中所述第二組合物包含含有編碼具有seqidno:1的抗原蛋白的核酸的至少一種腺病毒、含有編碼具有seqidno:2的抗原蛋白的核酸的至少一種腺病毒和含有編碼具有seqidno:3的抗原蛋白的核酸的至少一種腺病毒。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含在本發(fā)明的組合疫苗或試劑盒中的腺病毒載體或用于產(chǎn)生針對(duì)至少一種絲狀病毒亞型的保護(hù)性免疫應(yīng)答的腺病毒載體為rad26或rad35載體。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在第0周進(jìn)行初免疫苗接種，隨后在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周或隨后幾周進(jìn)行加強(qiáng)疫苗接種。優(yōu)選地，在第1-10周，更優(yōu)選地在第1、2、4或8周施用加強(qiáng)疫苗接種。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，加強(qiáng)步驟(b)在初始加強(qiáng)步驟之后重復(fù)一次或多次。另外的加強(qiáng)施用可以在例如初免施用之后6個(gè)月、1年、1.5年、2年、2.5年、3年或更晚進(jìn)行。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法包括使用免疫有效量的表達(dá)一種或多種絲狀病毒糖蛋白的一種或多種mva載體進(jìn)行初免疫苗接種，隨后使用免疫有效量的表達(dá)一種或多種絲狀病毒糖蛋白或基本上相似的糖蛋白的一種或多種腺病毒載體(優(yōu)選地為ad26載體)進(jìn)行加強(qiáng)疫苗接種。

在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，一種或多種絲狀病毒為埃博拉病毒或馬爾堡病毒。埃博拉病毒可以是任何種類，例如，扎伊爾埃博拉病毒(ebov)和蘇丹埃博拉病毒(sudv)、雷斯頓病毒、本迪布焦病毒、塔伊森林病毒。馬爾堡病毒(marv)可以是任何種類。合適的絲狀病毒抗原蛋白的示例性氨基酸序列示出在seqidno:1至seqidno:5。

本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的第一組合物和第二組合物用于增強(qiáng)人類受試者中的免疫應(yīng)答的用途，其中所述第一組合物施用于人類受試者以用于引發(fā)免疫應(yīng)答，并且所述第二組合物施用于人類受試者以用于加強(qiáng)免疫應(yīng)答，從而在人類受試者中獲得針對(duì)抗原蛋白的增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。

本發(fā)明還涉及：

a.第一組合物，其包含免疫有效量的mva載體，所述mva載體包含編碼抗原蛋白或其免疫原性多肽的第一多核苷酸；以及

b.第二組合物，其包含免疫有效量的用于加強(qiáng)免疫應(yīng)答的腺病毒載體，所述腺病毒載體包含編碼抗原蛋白或其免疫原性多肽的第二多核苷酸；

第一組合物和第二組合物用于在人類受試者中誘導(dǎo)針對(duì)抗原蛋白的增強(qiáng)的免疫應(yīng)答，其中所述第一組合物施用于人類受試者以用于引發(fā)免疫應(yīng)答，并且所述第二組合物施用于人類受試者一次或多次以用于加強(qiáng)免疫應(yīng)答。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)第一多核苷酸編碼的抗原蛋白或其免疫原性多肽來(lái)源于病原體或腫瘤。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)第一多核苷酸編碼的抗原蛋白或其免疫原性多肽來(lái)源于絲狀病毒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗原蛋白包含選自下組的氨基酸序列：seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4和seqidno:5。最優(yōu)選地，mva載體包含編碼具有seqidno:1、seqidno:2、seqidno:4和seqidno:5的氨基酸序列的抗原蛋白的多核苷酸。

更優(yōu)選地，腺病毒載體包含編碼具有seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3的氨基酸序列的至少一種抗原蛋白的多核苷酸。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，腺病毒載體包含編碼具有seqidno:1的氨基酸序列的抗原蛋白的多核苷酸。優(yōu)選地，所述腺病毒載體為rad26載體。

本發(fā)明還涉及：

a.第一組合物，其包含免疫有效量的mva載體，所述mva載體包含編碼抗原蛋白或其免疫原性多肽的第一多核苷酸；以及

b.第二組合物，其包含免疫有效量的用于加強(qiáng)免疫應(yīng)答的腺病毒載體，所述腺病毒載體包含編碼抗原蛋白或其免疫原性多肽的第二多核苷酸；

其中所述第一組合物施用于人類受試者以用于引發(fā)免疫應(yīng)答，并且所述第二組合物施用于人類患者以用于加強(qiáng)免疫應(yīng)答，以供用于在人類受試者中誘導(dǎo)相對(duì)于在將施用第二組合物進(jìn)行初免并且將施用第一組合物來(lái)加強(qiáng)免疫應(yīng)答的情況下觀察到的體液免疫應(yīng)答和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答增強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)所述組合物a.和b.產(chǎn)生的增強(qiáng)的免疫應(yīng)答包括在人類受試者中針對(duì)抗原蛋白的抗體應(yīng)答連同cd4+和cd8+應(yīng)答的增強(qiáng)[例如，應(yīng)答的特征在于高比例cd4+和cd8+應(yīng)答者的存在，諸如超過(guò)50％、60％、70％、80％、90％或100％測(cè)試的受試者，如通過(guò)ics測(cè)定所確定的，其中平均總細(xì)胞因子應(yīng)答為約0.2％、0.3％、0.4％、0.5％或更大]。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)所述組合物a.和b.產(chǎn)生的增強(qiáng)的cd4+和cd8+t細(xì)胞應(yīng)答包括對(duì)抗原蛋白特異的多功能cd4+和cd8+t細(xì)胞的增加或誘導(dǎo)。此多功能cd4+t細(xì)胞表達(dá)超過(guò)一種細(xì)胞因子，諸如ifn-γ、il-2和tnf-α中的兩種或更多種。

附圖簡(jiǎn)述

當(dāng)結(jié)合附圖閱讀時(shí)，上述概述以及本發(fā)明的以下詳述將更好地理解。應(yīng)了解，本發(fā)明不限于附圖中所示的精確的實(shí)施方案。

專利或申請(qǐng)文件包含至少一幅以彩色繪制出的繪圖。在提出請(qǐng)求并支付必要費(fèi)用后，本事務(wù)所將提供具有一張或多張彩色附圖的本專利或?qū)＠暾?qǐng)公布的副本。

在附圖中：

圖1匯總動(dòng)物研究中的分組；

圖2示出研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；

圖3示出使用攻擊性病毒株埃博拉扎伊爾基奎特1995(ebolazairekikwit1995)進(jìn)行攻擊的結(jié)果；

圖4示出從動(dòng)物研究觀察到的埃博拉扎伊爾糖蛋白特異性體液免疫應(yīng)答(通過(guò)elisa評(píng)估)：獨(dú)立于疫苗接種方案獲得非常高的抗體滴度(nd＝未分析時(shí)間點(diǎn))；

圖5示出從動(dòng)物研究觀察到的蘇丹古盧(sudangulu)糖蛋白特異性體液免疫應(yīng)答(通過(guò)elisa評(píng)估)：獨(dú)立于疫苗接種方案獲得非常高的抗體滴度(nd＝未分析時(shí)間點(diǎn))；

圖6示出從動(dòng)物研究觀察到的馬爾堡安哥拉(marburgangola)糖蛋白特異性體液免疫應(yīng)答(通過(guò)elisa評(píng)估)：獨(dú)立于疫苗接種方案獲得非常高的抗體滴度(nd＝未分析時(shí)間點(diǎn))；

圖7示出通過(guò)ifn-γelispot分析的對(duì)zebov、sebov和marvagp的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答；

圖8示出通過(guò)抗ebovgpelisa分析的對(duì)zebovgp的特異性免疫應(yīng)答，其中在加強(qiáng)免疫后21天，在使用mva作為初免物并使用ad26作為加強(qiáng)免疫物而非相反順序的疫苗來(lái)免疫的受試者中觀察到加強(qiáng)免疫后更高的體液免疫應(yīng)答；

圖9示出通過(guò)elispot測(cè)定分析的人類中對(duì)zebovgp的特異性t細(xì)胞應(yīng)答；

圖10示出通過(guò)ics測(cè)定分析的人類中對(duì)zebovgp的特異性cd8+細(xì)胞免疫應(yīng)答；

圖11示出當(dāng)使用28天初免加強(qiáng)間隔時(shí)，通過(guò)ics測(cè)定的人類中ebovgp-特異性cd8+t細(xì)胞應(yīng)答的功能分布；

圖12示出當(dāng)使用56天初免加強(qiáng)間隔時(shí)，通過(guò)ics測(cè)定的人類中ebovgp-特異性cd8+t細(xì)胞應(yīng)答的功能分布；

圖13示出通過(guò)ics測(cè)定分析的人類中對(duì)zebovgp的特異性cd4+細(xì)胞免疫應(yīng)答；并且

圖14示出當(dāng)使用28天初免加強(qiáng)間隔時(shí)，通過(guò)ics測(cè)定的人類中ebovgp-特異性cd4+t細(xì)胞應(yīng)答的功能分布；

圖15示出當(dāng)使用56天初免加強(qiáng)間隔時(shí)，通過(guò)ics測(cè)定的人類中ebovgp-特異性cd4+t細(xì)胞應(yīng)答的功能分布；

圖16示出通過(guò)使用ad26.zebov進(jìn)行初免免疫隨后在14天后進(jìn)行mva-bn-filo加強(qiáng)來(lái)誘導(dǎo)的通過(guò)elisa(a)、elispot(b)和ics(c和d)評(píng)估的免疫應(yīng)答；

圖17示出通過(guò)抗-ebovgpelisa分析的對(duì)zebovgp的特異性免疫應(yīng)答；

圖18示出通過(guò)elispot測(cè)定分析的人類中對(duì)zebovgp的特異性t細(xì)胞應(yīng)答；

圖19示出當(dāng)使用mva作為初免物并在14天后使用ad26作為加強(qiáng)免疫物，通過(guò)ics測(cè)定分析的人類中對(duì)zebovgp特異的強(qiáng)且平衡的cd4+(a)和cd8+(b)細(xì)胞免疫應(yīng)答以及通過(guò)ics測(cè)定的人類中ebovgp-特異性cd8+(c)和cd4+(d)t細(xì)胞應(yīng)答的功能分布。

圖20示出通過(guò)用由gpelisa測(cè)定的ad26.zebov/mva-bn-filo和mva-bn-filo/ad26.zebov方案進(jìn)行的疫苗接種所引發(fā)的ebovmayingagp結(jié)合的抗體。疫苗接種方案指示于下方x軸。高im和標(biāo)準(zhǔn)im是指mvabnfilo的劑量和路徑。水平虛線指示lod。

發(fā)明詳述

在背景中和貫穿本說(shuō)明書中引用或描述各種出版物、文章和專利；這些參考文獻(xiàn)各自以引用的方式整體并入本文。對(duì)本說(shuō)明中已包括的文件、法案、材料、裝置、物品等的討論是出于提供本發(fā)明的上下文的目的。所述討論并非承認(rèn)任何或全部的這些內(nèi)容形成關(guān)于公開的或要求的任何發(fā)明的當(dāng)前技術(shù)的部分。

除非另外定義，否則本文使用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)均具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。另外，本文使用的某些術(shù)語(yǔ)具有本說(shuō)明書中闡述的含義。本文引用的所有專利、公開的專利申請(qǐng)和公布以引用的方式并入，就如同完全在本文闡述一樣。必需指出，除非上下文另外清楚地指出，否則如本文和所附權(quán)利要求書中所用的，單數(shù)形式“一個(gè)/種(a/an)”和“所述”包括復(fù)數(shù)引用。

除非另外指明，否則在一系列要素前的術(shù)語(yǔ)“至少”應(yīng)當(dāng)理解為是指系列中的每一要素。本領(lǐng)域技術(shù)人員僅僅使用常規(guī)試驗(yàn)將認(rèn)識(shí)到或者能夠確定本文所描述的發(fā)明的具體實(shí)施方案的很多等效方案。所述等效方案意圖由本發(fā)明涵蓋。

貫穿本說(shuō)明書和以下權(quán)利要求書，除非上下文另有要求，否則詞語(yǔ)“包含(comprise)”和變型諸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”應(yīng)理解為暗示包括所陳述的整體或步驟或者整體或步驟的組，但不排除任何其他整體或步驟或者整體或步驟的組。當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“包含(comprising)”可由術(shù)語(yǔ)“含有(containing)”或“包括(including)”替代或者當(dāng)在本文中使用時(shí)經(jīng)常用術(shù)語(yǔ)“具有(having)”替代。當(dāng)在本文中使用時(shí)，“由...組成”排除了在權(quán)利要求要素中未指明的任何要素、步驟、或成分。當(dāng)在本文中使用時(shí)，“基本上由…組成”不排除本質(zhì)上并不影響所述權(quán)利要求的基本特征和新穎特征的材料或步驟。在本文中的每種情況下，術(shù)語(yǔ)“包括”、“基本上由……組成”和“由……組成”中的任何術(shù)語(yǔ)可由其他兩個(gè)術(shù)語(yǔ)中的任一個(gè)代替。

如本文所用的，多個(gè)引用的要素之間的連接術(shù)語(yǔ)“和/或”應(yīng)理解為包含單獨(dú)的和組合的選項(xiàng)兩者。例如，當(dāng)兩個(gè)要素由和/或連接時(shí)，第一選項(xiàng)是指在不具有第二要素的情況下第一要素的應(yīng)用。第二選項(xiàng)是指在不具有第一要素的情況下第二要素的應(yīng)用。第三選項(xiàng)是指第一要素和第二要素一起的應(yīng)用。這些選項(xiàng)中的任一個(gè)應(yīng)理解為屬于所述含義之內(nèi)，并且因此滿足如本文所用的術(shù)語(yǔ)“和/或”的要求。所述選項(xiàng)中的多于一個(gè)的同時(shí)應(yīng)用也應(yīng)理解為屬于所述含義之內(nèi)，并且因此滿足術(shù)語(yǔ)“和/或”的要求。

如本文所用的，“受試者”意指將或已通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的方法處理的任何動(dòng)物，優(yōu)選地為哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選地為人類。本文所用的術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物”包括任何哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物的實(shí)例包括但不限于牛、馬、羊、豬、貓、狗、小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、猴子、人類等，更優(yōu)選地為人類。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“保護(hù)性免疫”或“保護(hù)性免疫應(yīng)答”意指疫苗接種的受試者能夠控制與疫苗接種所針對(duì)的抗原蛋白或其免疫原性多肽相關(guān)的疾病或感染。通常，已發(fā)展“保護(hù)性免疫應(yīng)答”的受試者僅發(fā)展輕度到中度的臨床癥狀或根本無(wú)癥狀。通常，具有針對(duì)某一抗原蛋白的“保護(hù)性免疫應(yīng)答”或“保護(hù)性免疫”的受試者將不會(huì)因與所述抗原蛋白相關(guān)的感染或疾病而死亡。

抗原蛋白可以是來(lái)自病原體或腫瘤的天然蛋白或者基于來(lái)自病原體或腫瘤的天然蛋白的改性蛋白。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“病原體”是指在其宿主中引起疾病的傳染劑，諸如病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲或朊病毒。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“增強(qiáng)”當(dāng)相對(duì)于免疫應(yīng)答諸如cd4+t細(xì)胞應(yīng)答、抗體應(yīng)答或cd8+t細(xì)胞應(yīng)答來(lái)使用時(shí)是指在使用根據(jù)本發(fā)明的無(wú)復(fù)制能力mva和腺病毒載體的初免-加強(qiáng)組合施用的人類受試者中的免疫應(yīng)答相對(duì)于從使用相反初免-加強(qiáng)組合施用的人類受試者中觀察到的對(duì)應(yīng)免疫應(yīng)答的增加，其中腺病毒載體作為初免物提供并且mva載體被提供來(lái)加強(qiáng)免疫應(yīng)答，所述兩個(gè)組合使用相同的初免-加強(qiáng)間隔。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“主要cd4+或cd8+t細(xì)胞應(yīng)答”是指特征在于在疫苗接種后在總反應(yīng)性t細(xì)胞群體內(nèi)觀察到高比例的免疫原特異性cd4+t細(xì)胞的t細(xì)胞免疫應(yīng)答?？偯庖咴禺愋詔細(xì)胞應(yīng)答可以通過(guò)ifn-γelispot測(cè)定來(lái)確定。免疫原特異性cd4+或cd8+t細(xì)胞免疫應(yīng)答可以通過(guò)ics測(cè)定來(lái)確定。例如，主要cd4+t細(xì)胞應(yīng)答可以包括人類受試者中總抗原特異性t-細(xì)胞應(yīng)答的超過(guò)50％，諸如51％、60％、70％、80％、90％或100％的抗原特異性cd4+t細(xì)胞應(yīng)答。優(yōu)選地，主要cd4+t細(xì)胞應(yīng)答還代表人類受試者中總細(xì)胞因子應(yīng)答的0.1％或更多，諸如0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％或更多。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“增強(qiáng)的抗體應(yīng)答”是指在使用根據(jù)本發(fā)明的無(wú)復(fù)制能力mva和腺病毒載體的初免-加強(qiáng)組合施用的人類受試者中的抗體應(yīng)答，所述抗體應(yīng)答相對(duì)于從使用相反初免-加強(qiáng)組合施用的人類受試者中觀察到的對(duì)應(yīng)免疫應(yīng)答增加至少1.5倍、2倍、2.5倍或更多倍，其中腺病毒載體作為初免物提供并且mva載體被提供來(lái)加強(qiáng)免疫應(yīng)答，所述兩種組合使用相同的初免-加強(qiáng)間隔。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“多功能”當(dāng)相對(duì)于cd4+或cd8+t細(xì)胞使用時(shí)意指表達(dá)超過(guò)一種細(xì)胞因子，諸如以下至少兩種的t細(xì)胞：il-2、ifn-γ和tnf-α。

“腺病毒衣殼蛋白”是指腺病毒(例如，ad26或ad35)的衣殼上的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)涉及決定特定腺病毒的血清型和/或向性。腺病毒衣殼蛋白通常包含纖維、五鄰體蛋白和/或六鄰體蛋白。如本文所用的，“ad26衣殼蛋白”或“ad35衣殼蛋白”可以是例如包含ad26或ad35衣殼蛋白的至少一部分的嵌合衣殼蛋白。在某些實(shí)施方案中，衣殼蛋白為ad26或ad35的整個(gè)衣殼蛋白。在某些實(shí)施方案中，六鄰體蛋白、五鄰體蛋白和纖維屬于ad26或ad35。

術(shù)語(yǔ)“佐劑”和“免疫刺激劑”在本文中可互換使用，并且被定義為引起免疫系統(tǒng)刺激的一種或多種物質(zhì)。在此上下文中，佐劑用于增強(qiáng)對(duì)本發(fā)明的腺病毒載體和/或mva載體的免疫應(yīng)答。

當(dāng)應(yīng)用到序列中的氨基酸殘基的位置時(shí)，術(shù)語(yǔ)“對(duì)應(yīng)于”意指當(dāng)序列最佳比對(duì)時(shí)多個(gè)序列中對(duì)應(yīng)的位置。

在兩個(gè)或更多個(gè)核酸或多肽序列(例如，絲狀病毒的糖蛋白和編碼所述糖蛋白的多核苷酸)的上下文中，術(shù)語(yǔ)“同一的”或“同一性”百分百是指在進(jìn)行比較和比對(duì)以獲得最大對(duì)應(yīng)性時(shí)，如使用以下序列比較算法之一或通過(guò)目視檢查所測(cè)量的，相同或具有指定百分比的相同氨基酸殘基或核酸的兩個(gè)或更多個(gè)序列或子序列。

針對(duì)序列比較，通常一個(gè)序列充當(dāng)參比序列，測(cè)試序列與其比較。當(dāng)使用序列比較算法時(shí)，將測(cè)試序列和參照序列輸入計(jì)算機(jī)中，指定子序列坐標(biāo)(如果需要)，并且指定序列算法的程序參數(shù)。隨后基于指定的程序參數(shù)計(jì)算測(cè)試序列相對(duì)于參考序列的序列同一性百分比。

可進(jìn)行用于比較的序列的最佳比對(duì)，例如通過(guò)smith&waterman,adv.appl.math.2:482(1981)的局部同源性算法；通過(guò)needleman&wunsch,j.mol.biol.48:443(1970)的同源性比對(duì)算法；通過(guò)pearson&lipman,proc.nat’l.acad.sci.usa85:2444(1988)的相似性搜索方法；通過(guò)這些算法的計(jì)算機(jī)化實(shí)施方式(gap,bestfit,fasta,andtfastainthewisconsingeneticssoftwarepackage,geneticscomputergroup,575sciencedr.,madison,wi)，或通過(guò)目視檢查(通常參見currentprotocolsinmolecularbiology,f.m.ausubel等編輯,currentprotocols,ajointventurebetweengreenepublishingassociates,inc.andjohnwiley&sons,inc.,(1995supplement)(ausubel))。

適于測(cè)定序列同一性百分比和序列相似性的算法的實(shí)例為blast和blast2.0算法，所述算法分別描述于altschul等(1990)j.mol.biol.215:403-410和altschuel等(1977)nucleicacidsres.25:3389-3402。用于執(zhí)行blast分析的軟件是通過(guò)國(guó)家生物技術(shù)信息中心公共可利用的。這種算法包括首先通過(guò)鑒定查詢序列中長(zhǎng)度為w的短詞來(lái)鑒定高分?jǐn)?shù)序列對(duì)(hsps)，所述短詞在與數(shù)據(jù)庫(kù)序列中具有相同長(zhǎng)度的詞比對(duì)時(shí)匹配或滿足某些正值的閾值分?jǐn)?shù)t。t稱為相鄰字評(píng)分閾值(altschul等，同上)。這些初始鄰域詞命中作為種子啟動(dòng)搜索，用以尋找含有它們的較長(zhǎng)hsp。接著該詞命中沿著每條序列在兩個(gè)方向延伸，遠(yuǎn)至能夠提高累積比對(duì)分?jǐn)?shù)。

對(duì)于核苷酸序列，利用參數(shù)m(一對(duì)匹配殘基的獎(jiǎng)勵(lì)分?jǐn)?shù)，通常>0)和n(非配對(duì)殘基的罰分，通常<0)計(jì)算累積分?jǐn)?shù)。對(duì)于氨基酸序列，使用分?jǐn)?shù)矩陣計(jì)算累積分?jǐn)?shù)。字命中在每個(gè)方向上的延伸在下列情況時(shí)停止：累積比對(duì)評(píng)分由其達(dá)到的最大值降低數(shù)量x；由于一個(gè)或者多個(gè)負(fù)評(píng)分殘基比對(duì)的積累而使累積評(píng)分降至0或者以下；或者達(dá)到任一序列的末端。blast算法參數(shù)w、t和x決定所述比對(duì)的靈敏度和速度。blastn程序(對(duì)于核苷酸序列)使用的默認(rèn)值是字長(zhǎng)(w)為11，期望值(e)為10，m＝5，n＝-4并且進(jìn)行兩條鏈的比較。對(duì)于氨基酸序列，blastp程序使用的默認(rèn)值是字長(zhǎng)(w)為3，期望值(e)為10和blosum62評(píng)分矩陣(參見henikoff&henikoff,proc.natl.acad.sci.usa89:10915(1989))。

除了計(jì)算序列同一性百分比之外，blast算法還進(jìn)行兩個(gè)序列之間的相似性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(參見，例如karlin&altschul,proc.nat’l.acad.sci.usa90:5873-5787(1993))。blast算法提供的一種相似性測(cè)定是最小總和概率(p(n))，其表示通過(guò)兩個(gè)核苷酸或者核酸序列之間偶然發(fā)生配對(duì)的概率。例如，如果在測(cè)試核酸與參比核酸的比較中，最小和概率小于約0.1、更優(yōu)選地小于約0.01并且最優(yōu)選地小于約0.001，認(rèn)為核酸與參比序列相似。

兩個(gè)核酸序列或多肽基本上相同的另一個(gè)指示為：如下所述的，由第一核酸編碼的多肽與由第二核酸編碼的多肽具有免疫交叉反應(yīng)。因此，多肽通常與第二多肽基本上相同，例如，在兩種多肽僅因保守取代而不同的情況下。兩個(gè)核酸序列基本上相同的另一個(gè)指示為：如下所述的，兩個(gè)分子在嚴(yán)格條件下互相雜交。

在本發(fā)明的絲狀病毒抗原蛋白的上下文中術(shù)語(yǔ)“基本上相似”指示在10-20個(gè)氨基酸的比較窗上，多肽包含與參考序列具有至少90％、優(yōu)選地至少95％的序列同一性的序列。序列同一性百分比通過(guò)在比較窗上比較兩個(gè)最佳比對(duì)的序列來(lái)確定，其中比較窗中的多核苷酸序列的部分與參考序列(其不包含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即空位)以用于兩個(gè)序列的最佳比對(duì)。所述百分比通過(guò)以下進(jìn)行計(jì)算：確定兩個(gè)序列中出現(xiàn)相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置數(shù)以得到匹配位置數(shù)，將匹配位置數(shù)除以比較窗口中的位置總數(shù)，并且將結(jié)果乘以100以得到序列同一性百分比。

在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)，異源初免-加強(qiáng)組合(具體地說(shuō)，用mva進(jìn)行初免，隨后用ad26進(jìn)行加強(qiáng))出人意料地有效于在人類受試者中產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。

抗原蛋白

任何感興趣的dna均可以插入到本文所述的病毒載體中以便從所述載體中異源表達(dá)。用于插入到可表達(dá)形式的病毒的基因組中的外源基因可以使用用于分離所需基因的常規(guī)技術(shù)來(lái)獲得。對(duì)于含有dna基因組的生物體而言，編碼感興趣的抗原的基因可以從基因組dna中分離；對(duì)于具有rna基因組的生物體而言，所需基因可以從基因組的cdna拷貝中分離?？乖鞍走€可以通過(guò)基于天然存在的序列改性的重組dna編碼，例如以便優(yōu)化抗原應(yīng)答、基因表達(dá)等。

在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，無(wú)復(fù)制能力載體的mva-初免和腺病毒-加強(qiáng)組合在人類受試者中產(chǎn)生針對(duì)抗原蛋白或其免疫原性多肽的增強(qiáng)的免疫應(yīng)答?？乖鞍卓梢允桥c感染或疾病相關(guān)的任何抗原蛋白。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，抗原蛋白或其免疫原性多肽可以分離自或來(lái)源于病原體，諸如病毒(例如，絲狀病毒、腺病毒、蟲媒病毒、星狀病毒、冠狀病毒、柯沙奇病毒、巨細(xì)胞病毒、登革病毒、埃-巴二氏病毒(epstein-barrvirus)、肝炎病毒、皰疹病毒、人免疫缺陷病毒、人乳頭瘤病毒、人嗜t淋巴細(xì)胞病毒、流感病毒、jc病毒、淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、麻疹病毒、傳染性軟疣病毒、腮腺炎病毒、諾瓦克病毒、細(xì)小病毒(parovirus)、脊髓灰質(zhì)炎病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞體病毒、鼻病毒、輪狀病毒、輪狀病毒、風(fēng)疹病毒、天花病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、西尼羅河病毒等)、細(xì)菌(例如，空腸彎曲菌、大腸桿菌、幽門螺旋桿菌、結(jié)核分枝桿菌、淋病奈瑟氏菌、腦膜炎奈瑟氏菌(neisseriameningitides)、沙門氏菌、志賀氏桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌等)、真菌(例如，粗球孢子菌、皮炎芽生菌、新型隱球菌、念珠菌屬、曲霉屬等)、原生動(dòng)物(例如，瘧原蟲、利什曼蟲、錐體蟲、隱孢子蟲、等孢子球蟲屬、福氏耐格里阿米巴(naegleriafowleri)、棘阿米巴屬、巴拉姆希阿米巴、剛地弓形蟲、卡氏肺孢子蟲等)或者癌癥(例如，膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、腎癌、白血病、肺癌、黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、甲狀腺癌等)。

在一些實(shí)施方案中，核酸表達(dá)抗原結(jié)構(gòu)域而不是整個(gè)抗原蛋白。這些片段可以具有對(duì)于免疫原性或抗原性而言足夠的任何長(zhǎng)度。片段可以是至少四個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，優(yōu)選8-20個(gè)氨基酸，但也可以是更長(zhǎng)的，例如像100、200、660、800、1000、1200、1600、2000個(gè)氨基酸長(zhǎng)度或更長(zhǎng)或者在其之間的任何長(zhǎng)度。

在一些實(shí)施方案中，編碼抗原蛋白或其免疫原性多肽的至少一種核酸片段插入到病毒載體中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼不同抗原蛋白的約2-8種不同核酸插入到一種或多種病毒載體中。在一些實(shí)施方案中，可以使用多個(gè)免疫原性片段或各種蛋白質(zhì)的亞基。例如，來(lái)自單一蛋白質(zhì)的不同位點(diǎn)或來(lái)自相同種類的不同蛋白質(zhì)或來(lái)自不同種類的蛋白質(zhì)直向同源物的若干種不同表位可以由載體表達(dá)。

絲狀病毒抗原蛋白

埃博拉病毒和遺傳相關(guān)性馬爾堡病毒為與北美、歐洲和非洲的人類和靈長(zhǎng)類動(dòng)物中高致死性出血熱的爆發(fā)相關(guān)聯(lián)的絲狀病毒(peters,c.j.等，在：fieldsvirology編輯fields,b.n.等1161-1176,philadelphia,lippincott-raven,1996；peters,c.j.等1994seminvirol5:147-154中)。盡管已定義了若干亞型，但這些病毒的基因結(jié)構(gòu)為相似的，各自含有七個(gè)線性排列的基因。在所述病毒蛋白之間，包膜糖蛋白以兩種替代形式存在，即由rna編輯產(chǎn)生的50-70千道爾頓(kda)分泌蛋白(sgp)和介導(dǎo)病毒進(jìn)入的130kda跨膜糖蛋白(gp)(peters,c.j.等，在：fieldsvirology編輯fields,b.n.等1161-1176,philadelphia,lippincott-raven,1996；sanchez,a.等1996pnasusa93:3602–3607中)。其他結(jié)構(gòu)基因產(chǎn)物包括核蛋白(np)、基質(zhì)蛋白vp24和vp40、假定非結(jié)構(gòu)蛋白vp30和vp35以及病毒聚合酶(綜述于peters,c.j.等，在：fieldsvirology編輯fields,b.n.等1161-1176,philadelphia,lippincott-raven,1996中)。

包含在腺病毒和mva載體中的核酸分子可編碼任何絲狀病毒種類的結(jié)構(gòu)基因產(chǎn)物，諸如扎伊爾亞型(典型種類，在本文中也稱為zebov)、蘇丹(在本文中也稱為sebov)、雷斯頓亞型、本迪布焦亞型和象牙海岸亞型。存在單一種類的馬爾堡病毒(在本文中也稱為marv)。

本發(fā)明的腺病毒載體和mva載體可用于表達(dá)抗原蛋白，所述抗原蛋白為包含多種多樣的絲狀病毒抗原的抗原決定簇的蛋白質(zhì)。在一個(gè)典型和優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體包含編碼跨膜形式的病毒糖蛋白(gp)的核酸。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體可編碼分泌形式的病毒糖蛋白(ssgp)或病毒核蛋白(np)。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，編碼絲狀病毒抗原蛋白的核酸分子可以被改性，例如，只要改性的表達(dá)的蛋白質(zhì)引發(fā)針對(duì)病原體或疾病的免疫應(yīng)答，本文闡述的核酸分子就可以突變。因此，如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“抗原蛋白”或“絲狀病毒蛋白”是指包含如上所述的絲狀病毒蛋白的至少一個(gè)抗原決定簇的蛋白質(zhì)。所述術(shù)語(yǔ)包括絲狀病毒糖蛋白(即絲狀病毒的基因產(chǎn)物)或絲狀病毒核蛋白以及包含一個(gè)或多個(gè)絲狀病毒糖蛋白決定簇的重組蛋白。術(shù)語(yǔ)抗原蛋白也包括基本上相似的抗原蛋白。

在一些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)可以突變來(lái)使得其對(duì)細(xì)胞的毒性更小(參見，例如wo/2006/037038)或者可在細(xì)胞中以增加或降低的水平表達(dá)。本發(fā)明也包括含有核酸分子的組合的疫苗。例如并且不限于，編碼扎伊爾、蘇丹、馬爾堡和象牙海岸/塔伊森林埃博拉病毒株的gp、ssgp和np的核酸分子可以任何組合方式組合在一種疫苗組合物中。

腺病毒

根據(jù)本發(fā)明的腺病毒屬于腺病毒科并且優(yōu)選地為屬于哺乳動(dòng)物腺病毒屬的腺病毒。腺病毒可為人類腺病毒，而且可為感染其他物種的腺病毒，包括但不限于牛腺病毒(例如，牛腺病毒3，badv3)、犬腺病毒(例如cadv2)、豬腺病毒(例如padv3或padv5)或猿腺病毒(其包括猴腺病毒和猿猴腺病毒，諸如黑猩猩腺病毒或大猩猩腺病毒)。優(yōu)選地，腺病毒為人類腺病毒(hadv或adhu；在本發(fā)明中如果提及ad而未指示種類則意指人類腺病毒，例如簡(jiǎn)寫符號(hào)“ad5”意指與hadv5相同，其為人類腺病毒血清型5)或猿腺病毒諸如黑猩猩腺病毒或大猩猩腺病毒(chad、adch或sadv)。

使用人類腺病毒進(jìn)行最先進(jìn)的研究，并且根據(jù)本發(fā)明的某些方面優(yōu)選人類腺病毒。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的重組腺病毒是基于人類腺病毒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組腺病毒是基于人類腺病毒血清型5、11、26、34、35、48、49或50。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，腺病毒為血清型26或35之一的人類腺病毒。

這些血清型的優(yōu)點(diǎn)為人類群體中的低血清陽(yáng)性率和/或低預(yù)先存在的中和抗體滴度。例如在wo2007/104792和在abbink等,(2007)virol81(9):4654-63中描述了rad26載體的制備，所述兩份文獻(xiàn)均以引用的方式整體并入本文。ad26的示例性基因組序列可見于genbank登錄ef153474和wo2007/104792的seqidno:1中。例如在美國(guó)專利號(hào)7,270,811中、在wo00/70071中以及在vogels等,(2003)jvirol77(15):8263-71中描述了rad35載體的制備，所有文獻(xiàn)均以引用的方式整體并入本文。ad35的示例性基因組序列可見于genbank登錄ac_000019和wo00/70071的圖6中。

猿腺病毒通常在人類群體中也具有低血清陽(yáng)性率和/或低預(yù)先存在的中和抗體滴度并且報(bào)告了使用黑猩猩腺病毒載體的大量的工作(例如us6083716；wo2005/071093；wo2010/086189；wo2010085984；farina等，2001,jvirol75:11603-13；cohen等,2002,jgenvirol83:151-55；kobinger等,2006,virology346:394-401；tatsis等,2007,moleculartherapy15:608-17；也參見bangari和mittal的綜述,2006,vaccine24:849-62；以及l(fā)asaro和ertl的綜述,2009,molther17:1333-39)。因此，在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的重組腺病毒是基于猿腺病毒，例如黑猩猩腺病毒。在某些實(shí)施方案中，重組腺病毒是基于猿腺病毒類型1、7、8、21、22、23、24、25、26、27.1、28.1、29、30、31.1、32、33、34、35.1、36、37.2、39、40.1、41.1、42.1、43、44、45、46、48、49、50或sa7p。

腺病毒載體rad26和rad35

在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，腺病毒載體包含來(lái)自以下兩種稀有血清型的衣殼蛋白：ad26和ad35。在典型的實(shí)施方案中，載體為rad26或rad35病毒。

因此，可用于本發(fā)明的載體包括ad26或ad35衣殼蛋白(例如纖維、五鄰體或六鄰體蛋白)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，將整個(gè)ad26或ad35衣殼蛋白用于本發(fā)明的載體中是不必要的。因此，包含ad26或ad35衣殼蛋白的至少一部分的嵌合衣殼蛋白可用于本發(fā)明的載體中。本發(fā)明的載體也可包含衣殼蛋白，其中只要至少一種衣殼蛋白來(lái)源于ad26或ad35，那么纖維、五鄰體蛋白和六鄰體蛋白各自來(lái)源于不同的血清型。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，纖維、五鄰體蛋白和六鄰體蛋白各自來(lái)源于ad26或各自來(lái)源于ad35。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，來(lái)源于多種血清型的元件可組合在單個(gè)重組腺病毒載體中。因此，可產(chǎn)生組合來(lái)自不同血清型的所需性質(zhì)的嵌合腺病毒。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合腺病毒可將ad26和ad35血清型預(yù)先存在的免疫的缺乏與各種特性組合，所述特性諸如溫度穩(wěn)定性、組裝、錨定、產(chǎn)生率、重定向或改善的感染、目標(biāo)細(xì)胞中dna的穩(wěn)定性等等。

在某些實(shí)施方案中，適用于本發(fā)明的重組腺病毒載體主要或整個(gè)來(lái)源于ad35或ad26(即載體為rad35或rad26)。在一些實(shí)施方案中，腺病毒為復(fù)制缺陷型，例如因?yàn)樗蚪M的e1區(qū)域中的缺失。對(duì)于本發(fā)明的腺病毒，在來(lái)源于ad26或ad35的情況下，典型的是將腺病毒的e4-orf6編碼序列與人類亞型c(諸如ad5)的腺病毒的e4-orf6交換。這允許此類腺病毒在已熟知的表達(dá)ad5的e1基因的互補(bǔ)細(xì)胞系中增殖，所述細(xì)胞系例如像293細(xì)胞、per.c6細(xì)胞等等(參見，例如havenga等,2006,jgenvirol87:2135-43；wo03/104467)。在某些實(shí)施方案中，腺病毒為血清型35的人類腺病毒，其具有已克隆有編碼抗原的核酸的e1區(qū)域中的缺失，并且具有ad5的e4orf6區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，腺病毒為血清型26的人類腺病毒，其具有在已克隆有編碼抗原的核酸的e1區(qū)域中的缺失，并且具有ad5的e4orf6區(qū)域。對(duì)于ad35腺病毒，典型的是在腺病毒中保留e1b55k開放閱讀框的3’末端，例如就在pix開放閱讀框上游的166bp或者就在pix起始密碼子上游的包含它的片段諸如243bp片段，通過(guò)bsu36i限制性位點(diǎn)在5’末端標(biāo)記，因?yàn)檫@增加腺病毒的穩(wěn)定性，因?yàn)閜ix基因的啟動(dòng)子部分停留在此區(qū)域中(參見，例如havenga等,2006,同上；wo2004/001032)。

重組腺病毒載體的制備在本領(lǐng)域中為已熟知的。

例如在wo2007/104792和在abbink等，(2007)virol81(9):4654-63中描述了rad26載體的制備。ad26的示例性基因組序列可見于genbank登錄ef153474和wo2007/104792的seqidno:1中。例如在美國(guó)專利號(hào)7,270,811和vogels等,(2003)jvirol77(15):8263-71中描述了rad35載體的制備。ad35的示例性基因組序列可見于genbank登錄ac_000019中。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，適用于本發(fā)明的載體包括描述于wo2012/082918的那些載體，所述專利的公開內(nèi)容以引用的方式整體并入本文。

通常，使用包含整個(gè)重組腺病毒基因組的核酸產(chǎn)生適用于本發(fā)明的載體(例如，質(zhì)粒、粘?；驐U狀病毒載體)。因此，本發(fā)明也提供編碼本發(fā)明的腺病毒載體的分離的核酸分子。本發(fā)明的核酸分子可以是通過(guò)克隆或合成產(chǎn)生的rna形式或者dna形式。所述dna可以是雙鏈或單鏈的。

適用于本發(fā)明的腺病毒載體通常為復(fù)制缺陷型的。在這些實(shí)施方案中，通過(guò)使對(duì)病毒的復(fù)制至關(guān)重要的區(qū)域諸如e1區(qū)域缺失或失活來(lái)使得病毒成為復(fù)制缺陷型。所述區(qū)域可通過(guò)例如插入目標(biāo)基因(通常連接到啟動(dòng)子)來(lái)基本上缺失或失活。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體可包含其他區(qū)域諸如e2、e3或e4區(qū)域中的缺失，或連接到啟動(dòng)子的異源基因的插入。對(duì)于e2和/或e4突變的腺病毒而言，e2和/或e4互補(bǔ)細(xì)胞系通常用于產(chǎn)生重組腺病毒。腺病毒的e3區(qū)域中的突變無(wú)需由細(xì)胞系補(bǔ)充，因?yàn)閑3對(duì)于復(fù)制是不需要的。

包裝細(xì)胞系通常用于產(chǎn)生足夠量的本發(fā)明的腺病毒載體。包裝細(xì)胞為包含在復(fù)制缺陷型載體中已缺失或失活的那些基因的細(xì)胞，因此允許病毒在細(xì)胞中復(fù)制。合適的細(xì)胞系包括例如per.c6、911、293和e1a549。

在一些實(shí)施方案中，腺病毒載體可表達(dá)編碼抗原肽的基因或基因部分。這些外來(lái)的、異源的或外源的肽或多肽可以包括免疫原性序列，例如像腫瘤特異性抗原(tsa)、細(xì)菌、病毒、真菌以及原生動(dòng)物抗原。

如以上所指出，多種多樣的絲狀病毒糖蛋白可在載體中表達(dá)。如果需要，編碼絲狀病毒糖蛋白的異源基因可為密碼子優(yōu)化的，以確保在治療的宿主(例如人類)中的適當(dāng)表達(dá)。密碼子優(yōu)化為本領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用的技術(shù)。通常，異源基因克隆到腺病毒基因組的e1和/或e3區(qū)域。

異源絲狀病毒基因可以處于腺病毒來(lái)源的啟動(dòng)子的控制(即可操作地連接到)下或者可以處于異源啟動(dòng)子的控制下。合適的異源啟動(dòng)子的實(shí)例包括cmv啟動(dòng)子和rsv啟動(dòng)子。優(yōu)選地，啟動(dòng)子位于表達(dá)盒內(nèi)目標(biāo)異源基因的上游。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，適用于本發(fā)明的腺病毒載體可包含對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種各樣的絲狀病毒糖蛋白。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，rad載體包含選自由以下組成的組的一個(gè)或多個(gè)gp：扎伊爾埃博拉病毒(ebov)的gp、蘇丹埃博拉病毒(sudv)的gp、馬爾堡病毒(marv)的gp以及與它們基本上相似的gp。

mva載體

適用于本發(fā)明的mva載體利用來(lái)源于改性牛痘安卡拉病毒的減毒病毒，其特征在于所述病毒在人類細(xì)胞系中進(jìn)行繁殖性復(fù)制的能力的損失。

在一些實(shí)施方案中，mva病毒可表達(dá)編碼抗原肽的基因或基因部分。這些外來(lái)的、異源的或外源的肽或多肽可以包括免疫原性序列，例如像腫瘤特異性抗原(tsa)、細(xì)菌、病毒、真菌以及原生動(dòng)物抗原。

在其他實(shí)施方案中，mva載體表達(dá)各種各樣的絲狀病毒糖蛋白以及其他結(jié)構(gòu)性絲狀病毒蛋白，諸如vp40和核蛋白(np)。在一方面，本發(fā)明提供一種重組改性的安卡拉牛痘病毒(mva)，所述病毒包含編碼絲狀病毒糖蛋白(gp)(具體地為包膜糖蛋白)的抗原決定簇的核苷酸序列。在另一方面，本發(fā)明提供一種重組mva載體，所述mva載體包含編碼絲狀病毒糖蛋白(具體地為包膜糖蛋白)的抗原決定簇的異源核苷酸序列，以及編碼另一絲狀病毒蛋白的抗原決定簇的異源核苷酸序列。

通過(guò)對(duì)安卡拉真皮牛痘病毒株的雞胚胎成纖維細(xì)胞進(jìn)行超過(guò)570次連續(xù)傳代[絨毛膜尿囊牛痘病毒安卡拉病毒，cva；關(guān)于綜述參見mayr等(1975),infection3,6-14]來(lái)產(chǎn)生mva，所述安卡拉真皮牛痘病毒株在土耳其安卡拉疫苗接種研究所(vaccinationinstitute,ankara,turkey)中保存許多年并且用作人類接種疫苗的基礎(chǔ)。然而，由于通常發(fā)生與牛痘病毒相關(guān)聯(lián)的嚴(yán)重接種后并發(fā)癥，所以多次試圖產(chǎn)生更加減毒、更加安全的天花疫苗。

在1960至1974時(shí)段期間，antonmayr教授通過(guò)在cef細(xì)胞中超過(guò)570次連續(xù)傳代成功使cva減毒[mayr等(1975)]。在多種動(dòng)物模型中顯示，產(chǎn)生的mva為無(wú)毒的[mayr,a.&danner,k.(1978),dev.biol.stand.41:225-234]。作為mva的早期發(fā)展的一部分(作為天花前期疫苗的)，存在處于來(lái)自疫苗的不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)下的受試者中使用mva-517與listerelstree結(jié)合的臨床試驗(yàn)[stickl(1974),prev.med.3:97-101；stickl和hochstein-mintzel(1971),munch.med.wochenschr.113:1149-1153]。在1976年，在德國(guó)，將來(lái)源于mva-571菌種儲(chǔ)備(對(duì)應(yīng)于第571次傳代)的mva登記為兩階段腸胃外天花疫苗接種程序中的初免疫苗(primervaccine)。隨后，mva-572用于大約120,000個(gè)白種人個(gè)體中，大部分1歲與3歲之間的兒童中，他們未報(bào)告嚴(yán)重的副作用，即使許多受試者為具有與疫苗相關(guān)聯(lián)的并發(fā)癥的高風(fēng)險(xiǎn)的群體中(mayr等(1978),zentralbl.bacteriol.(b)167:375-390)。mva-572在1994年1月27日作為ecaccv94012707儲(chǔ)存在歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏所(europeancollectionofanimalcellcultures；英國(guó)sp40jg，威爾特郡，索爾淄博里市，camr(camr,salisbury,wiltshiresp40jguk))。

由于傳代用于將mva減毒，根據(jù)cef細(xì)胞中進(jìn)行的傳代數(shù)目，存在許多不同病毒株或分離物。例如，在德國(guó)在天花根治項(xiàng)目期間將mva-572以小劑量用作前期疫苗，并且mva-575廣泛用作獸醫(yī)疫苗。與祖cva病毒相比，mva以及mva-bn缺少大約15％(來(lái)自六個(gè)區(qū)域的31kb)的基因組。所述缺失影響許多毒性和宿主范圍細(xì)胞以及甲型包涵體基因。mva-575在2000年12月7日在以登錄號(hào)v00120707儲(chǔ)存在歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏所(ecacc；英國(guó)sp40jg，威爾特郡，索爾淄博里市，camr(camr,salisbury,wiltshiresp40jguk))。通過(guò)cva在原代雞胚胎成纖維細(xì)胞上的連續(xù)增殖(超過(guò)570次傳代)獲得減毒的cva-病毒mva(改性安卡拉牛痘病毒)。

即使mayr等在20世紀(jì)70年代證實(shí)，mva在人類和哺乳動(dòng)物中為高度減毒的和無(wú)毒的，但某些研究員已報(bào)告，mva在哺乳動(dòng)物和人類細(xì)胞系中不是完全減毒的，因?yàn)榭赡茉谶@些細(xì)胞中發(fā)生殘余的復(fù)制[blanchard等(1998),j.gen.virol.79:1159-1167；carroll&moss(1997),virology238:198-211；美國(guó)專利號(hào)5,185,146；ambrosini等(1999),j.neurosci.res.55:569]。假定這些公開中報(bào)告的結(jié)果已使用各種已知的mva病毒株來(lái)獲得，因?yàn)樗褂玫牟《驹谄湫再|(zhì)方面，尤其是在各種細(xì)胞系中的生長(zhǎng)行為方面基本不同。出于各種原因，包括與在人類中使用有關(guān)的安全考慮，此類殘余的復(fù)制是不需要的。

為開發(fā)更安全的產(chǎn)物(諸如疫苗或藥物)，具有增強(qiáng)的安全性能的mva的病毒株已由bavariannordic育出。mva由bavariannordic進(jìn)一步傳代并且指定為mva-bn，其代表樣品于2000年8月30日以登錄號(hào)v00083008儲(chǔ)存在歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏所(europeancollectionofcellcultures，ecacc)。在wo02/42480(us2003/0206926)和wo03/048184(us2006/0159699)中進(jìn)一步描述mva-bn，所述兩份專利均以引用的方式整體并入本文。

mva-bn可連接并且進(jìn)入人細(xì)胞，其中病毒編碼的基因非常有效地表達(dá)。mva-bn非常適于初代雞胚成纖維(cef)細(xì)胞并且不在人類細(xì)胞中復(fù)制。在人類細(xì)胞中，表達(dá)病毒基因并且不產(chǎn)生感染病毒。根據(jù)美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心，mva-bn被分類為生物安全等級(jí)1生物體。mva-bn和衍生物的制劑已施用至許多類型的動(dòng)物和超過(guò)2000名人類受試者，包括免疫缺陷型個(gè)體。所有疫苗接種已經(jīng)證明總體上安全并良好耐受的。盡管其高減毒作用和減少的毒性，在臨床前研究中已顯示mva-bn引發(fā)對(duì)疫苗和由克隆到mva基因組中的基因所編碼的異源基因產(chǎn)物的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答兩者[e.harrer等(2005),antivir.ther.10(2):285-300；a.cosma等(2003),vaccine22(1):21-9；m.dinicola等(2003),hum.genether.14(14):1347-1360；m.dinicola等(2004),clin.cancerres.,10(16):5381-5390]。

mva的“衍生物”或“變體”是指表現(xiàn)出與如本文所述的mva基本上相同的復(fù)制特性，但在其基因組的一個(gè)或多個(gè)部分中表現(xiàn)出差異的病毒。mva-bn以及mva-bn的衍生物或變體未能在人類和小鼠，甚至在嚴(yán)重免疫抑制小鼠體內(nèi)繁殖性復(fù)制。更具體地，mva-bn或mva-bn的衍生物或變體也優(yōu)選地也具有在雞胚胎成纖維細(xì)胞(cef)中復(fù)制性繁殖的能力，但是不具有在人類角質(zhì)細(xì)胞系hacat[boukamp等(1988),j.cellbiol.106:761-771]、人類骨肉瘤細(xì)胞系143b(ecacc儲(chǔ)存號(hào)91112502)、人類胚胎腎細(xì)胞系293(ecacc儲(chǔ)存號(hào)85120602)和人類宮頸腺癌細(xì)胞系hela(atcc儲(chǔ)存號(hào)ccl-2)中復(fù)制性繁殖的能力。另外，mva-bn的衍生物或變體在hela細(xì)胞和hacat細(xì)胞系中具有比mva-575少兩倍，更優(yōu)選地少三倍的病毒擴(kuò)增率。mva變體的這些性質(zhì)的測(cè)試和測(cè)定描述于wo02/42480(us2003/0206926)和wo03/048184(us2006/0159699)中。

術(shù)語(yǔ)“不能繁殖性復(fù)制”或“不具有繁殖性復(fù)制的能力”描述于例如wo02/42480中，所述專利也教導(dǎo)如何獲得具有如上提及的所需性質(zhì)的mva。所述術(shù)語(yǔ)適用于使用wo02/42480或美國(guó)專利號(hào)6,761,893中描述的測(cè)定在感染之后4天具有小于1的病毒擴(kuò)增率的病毒，所述兩份專利均以引用的方式整體并入本文。

術(shù)語(yǔ)“未能繁殖性復(fù)制”是指在感染之后4天具有小于1的病毒擴(kuò)增率的病毒。wo02/42480或美國(guó)專利號(hào)6,761,893中所描述的測(cè)定適用于測(cè)定病毒擴(kuò)增率。

病毒的擴(kuò)增或復(fù)制通常表示為由感染細(xì)胞產(chǎn)生的病毒(輸出)與最初用于首先感染細(xì)胞的量(輸入)的比率，所述比率稱為“擴(kuò)增率”。“1”的擴(kuò)增率定義在由感染細(xì)胞產(chǎn)生的病毒的量與初始用于感染細(xì)胞的量相同的情況下的擴(kuò)增狀態(tài)，所述狀態(tài)意指感染細(xì)胞容許病毒感染和復(fù)制。相反，小于1的擴(kuò)增率(即輸出與輸入水平相比的降低)指示繁殖性復(fù)制的缺少并且因此使病毒減毒。

基于mva的疫苗的優(yōu)點(diǎn)包括其針對(duì)大范圍疫苗生產(chǎn)的安全性能以及可用性。臨床前測(cè)試顯示與其他mva病毒株相比，mva-bn展示出極好的減毒和功效(wo02/42480)。mva-bn病毒株另外的性質(zhì)是當(dāng)與dna初免/牛痘病毒加強(qiáng)方案相比時(shí)，在牛痘病毒初免/牛痘病毒加強(qiáng)方案中誘導(dǎo)基本上相同水平的免疫的能力。

重組mva-bn病毒為本文最優(yōu)選的實(shí)施方案，其被視為安全的，因?yàn)樗诓溉閯?dòng)物細(xì)胞中有明顯的復(fù)制缺陷并且它有良好建立的無(wú)毒性。此外，除了重組mva-bn病毒的功效之外，工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的可行性也可為有利的。另外，基于mva的疫苗可遞送多種異源抗原并且允許同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫。

可使用本領(lǐng)域已知的方法，諸如在wo/2002/042480和wo/2002/24224中描述的方法制備適用于本發(fā)明的mva載體，所述專利的相關(guān)公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。

在另一方面，復(fù)制缺陷型mva病毒株也可為合適的，諸如病毒株mva-572、mva-575或任何相似減毒的mva病毒株。突變體mva也可以是合適的，諸如缺失的絨毛膜尿囊安卡拉牛痘病毒(dcva)。dcva包含mva基因組的缺失位點(diǎn)deli、delii、deliii、deliv、delv以及delvi。所述位點(diǎn)尤其適用于插入多個(gè)異源序列。dcva可在人類細(xì)胞系(諸如人類293、143b和mrc-5細(xì)胞系)中繁殖性復(fù)制(以大于10的擴(kuò)增率)，然后使得通過(guò)對(duì)基于病毒的免疫策略有用的進(jìn)一步突變來(lái)實(shí)現(xiàn)優(yōu)化(參見wo2011/092029)。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，mva載體包含編碼選自由以下組成的組的一個(gè)或多個(gè)抗原蛋白的核酸：扎伊爾埃博拉病毒(ebov)的gp、蘇丹埃博拉病毒(sudv)的gp、馬爾堡病毒(marv)的gp、塔伊森林病毒的np以及與它們基本上相似的gp或np。

絲狀病毒蛋白可以插入到mva的一個(gè)或多個(gè)基因間區(qū)(igr)中。在某些實(shí)施方案中，igr選自igr07/08、igr44/45、igr64/65、igr88/89、igr136/137和igr148/149。在某些實(shí)施方案中，少于5、4、3或2個(gè)igr的重組mva包含編碼絲狀病毒包膜糖蛋白和/或另一種絲狀病毒蛋白的抗原決定簇的異源核苷酸序列。異源核苷酸序列可另外地或可替代地插入到一個(gè)或多個(gè)天然存在的缺失位點(diǎn)中，具體地為插入到mva基因組的主要缺失位點(diǎn)i、ii、iii、iv、v或vi中。在某些實(shí)施方案中，少于5、4、3或2個(gè)天然存在的缺失位點(diǎn)的重組mva包含編碼絲狀病毒包膜糖蛋白和/或另一種絲狀病毒蛋白的抗原決定簇的異源核苷酸序列。

包含異源核苷酸序列的mva的插入位點(diǎn)的數(shù)目可為1、2、3、4、5、6、7個(gè)或更多，所述異源核苷酸序列編碼絲狀病毒蛋白的抗原決定簇。在某些實(shí)施方案中，異源核苷酸序列插入到4、3、2或更少個(gè)的插入位點(diǎn)中。優(yōu)選地，使用兩個(gè)插入位點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中，使用三個(gè)插入位點(diǎn)。優(yōu)選地，重組mva包含至少2、3、4、5、6或7個(gè)插入到2或3個(gè)插入位點(diǎn)中的基因。

本文提供的重組mva病毒可通過(guò)本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法產(chǎn)生。獲得重組痘病毒或?qū)⑼庠淳幋a序列插入到痘病毒基因組中的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。例如，標(biāo)準(zhǔn)分子生物技術(shù)方法，諸如dna克隆、dna和rna分離、蛋白質(zhì)印跡分析、rt-pcr和pcr擴(kuò)增技術(shù)描述于molecularcloning,alaboratorymanual(第二版)[j.sambrook等,coldspringharborlaboratorypress(1989)]，并且病毒的處理和操作技術(shù)描述于virologymethodsmanual[b.w.j.mahy等(編輯),academicpress(1996)]。相似地，mva的處理、操作和遺傳工程的技術(shù)和技能知識(shí)描述于molecularvirology:apracticalapproach[a.j.davison&r.m.elliott(編輯),thepracticalapproachseries,irlpressatoxforduniversitypress,oxford,uk(1993)(參見，例如，第9章：expressionofgenesbyvacciniavirusvectors)]和現(xiàn)代分子生物學(xué)方法[johnwiley&son,inc.(1998)(參見，例如，第16章，第iv章節(jié)：expressionofproteinsinmammaliancellsusingvacciniaviralvector)]。

對(duì)于本文公開的各種重組mva的產(chǎn)生，不同的方法可以是適用的。待插入到病毒中的dna序列可放入到大腸桿菌質(zhì)粒構(gòu)建體中，與mva的dna區(qū)段同源的dna已插入到所述質(zhì)粒構(gòu)建體。單獨(dú)地，可將待插入的dna序列連接至啟動(dòng)子。啟動(dòng)子基因連鎖可定位在質(zhì)粒構(gòu)建體中，以使得啟動(dòng)子-基因連鎖兩斷側(cè)接有與含有非必需基因座的mvadna區(qū)側(cè)接的dna序列同源的dna。所得質(zhì)粒構(gòu)建體可通過(guò)在大腸桿菌細(xì)菌內(nèi)增殖來(lái)擴(kuò)增并分離。包含待插入的dna基因序列的分離質(zhì)粒可轉(zhuǎn)染到細(xì)胞培養(yǎng)物中，例如雞胚胎成纖維細(xì)胞(cef)的細(xì)胞培養(yǎng)物，同時(shí)用mva感染所述培養(yǎng)物。質(zhì)粒中同源mvadna與病毒基因組之間的重組可分別產(chǎn)生通過(guò)外源dna序列的存在來(lái)改性的mva。

根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，合適的細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞諸如cef細(xì)胞可用痘病毒感染。隨后可用包含單個(gè)或多個(gè)外源或異源基因的第一質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染感染的細(xì)胞，優(yōu)選地在痘病毒表達(dá)控制元件的轉(zhuǎn)錄控制下。如上文所說(shuō)明的，質(zhì)粒載體也包含能夠引導(dǎo)外源序列插入到痘病毒基因組的選擇部分中的序列。任選地，質(zhì)粒載體也含有包含可操作地連接到痘病毒啟動(dòng)子的標(biāo)記基因和/或選擇基因的盒。

合適的標(biāo)記基因或選擇基因?yàn)槔缇幋a綠色熒光蛋白、β半乳糖苷、新霉素磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶或其他標(biāo)記的基因。選擇基因盒或標(biāo)記基因盒的使用簡(jiǎn)化了所產(chǎn)生的重組痘病毒的鑒定和分離。然而，重組痘病毒也可通過(guò)pcr技術(shù)來(lái)鑒定。隨后，可以將另一種細(xì)胞用如上所述地獲得的重組痘病毒感染并且用包含單個(gè)或多個(gè)第二外源或異源基因的第二載體轉(zhuǎn)染。如果此基因應(yīng)引入到痘病毒基因組的不同插入位點(diǎn)中，則第二載體在引導(dǎo)單個(gè)或多個(gè)第二外源基因整合到痘病毒基因組的痘病毒同源序列中有所不同。在發(fā)生同源重組后，可分離包含兩個(gè)或更多個(gè)外源或異源基因的重組病毒。為將另外的外源基因引入到重組病毒，可通過(guò)使用在先前的步驟中分離的重組病毒用于進(jìn)行感染并且通過(guò)使用包含另一種單個(gè)或多個(gè)外源基因的另一種載體用于進(jìn)行轉(zhuǎn)染來(lái)重復(fù)感染和轉(zhuǎn)染的步驟。

可替代地，如上所述的感染和轉(zhuǎn)染的步驟為可互換的，即合適的細(xì)胞可首先通過(guò)包含外源基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染并且然后用痘病毒感染。作為另一替代方案，可以將各個(gè)外源基因引入到不同病毒，使用所有獲得的重組病毒共同感染細(xì)胞并篩選包含全部外源基因的重組體。第三替代方案為將dna基因組與外源序列體外連接并且使用輔助病毒重建重組牛痘病毒dna基因組。第四替代方案為在大腸桿菌或另一種菌種內(nèi)在克隆為細(xì)菌人工染色體(bac)的牛痘病毒基因組(諸如mva)與線性外源序列之間的同源重組，所述線性外源序列側(cè)接有與側(cè)接牛痘病毒基因組中所需的整合位點(diǎn)的序列同源的dna序列。

異源絲狀病毒基因可以在一個(gè)或多個(gè)痘病毒啟動(dòng)子的控制下(即，可操作地連接到所述啟動(dòng)子)。在某些實(shí)施方案中，痘病毒啟動(dòng)子為pr7.5啟動(dòng)子、雜合早期/晚期啟動(dòng)子或prs啟動(dòng)子、prs5e啟動(dòng)子、合成或天然的早期或晚期啟動(dòng)子或牛痘病毒ati啟動(dòng)子。

免疫原性組合物

免疫原性組合物為包含免疫有效量的純化或部分純化的用于本發(fā)明的腺病毒或mva載體的組合物。根據(jù)本領(lǐng)域已熟知的方法，所述組合物可以配制為疫苗(也稱為“免疫原性組合物”)。所述組合物可包含增強(qiáng)免疫應(yīng)答的佐劑。鑒于本公開，可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已熟知的技術(shù)確定制劑中各種組分的最佳比率。

所述免疫原性組合物的制備和用途為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。液態(tài)藥物組合物通常包含液態(tài)載體諸如水、石油、動(dòng)物油或植物油、礦物油或合成油。可以包含生理鹽水溶液、葡萄糖或其他糖溶液或二醇類諸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。

本發(fā)明的組合物還可包含任何抗原。這些抗原肽或多肽可以包括免疫原性序列，例如像腫瘤特異性抗原(tsa)、細(xì)菌、病毒、真菌以及原生動(dòng)物抗原。

本發(fā)明的組合物可包含絲狀病毒抗原或者引發(fā)或加強(qiáng)接種可包含其他抗原。與本發(fā)明的腺病毒載體結(jié)合使用的其他抗原對(duì)本發(fā)明不是至關(guān)重要的并且可以是例如絲狀病毒抗原或表達(dá)所述抗原的核酸。

適用于本發(fā)明的免疫原性組合物可包含佐劑。

適于根據(jù)本發(fā)明共同施用的佐劑應(yīng)為在人群中潛在安全的、良好耐受的且有效的佐劑，其包括qs-21、detox-pc、mpl-se、mogm-csf、titermax-g、crl-1005、gerbu、teramide、psc97b、adjumer、pg-026,gsk-i、gcmaf、b-alethine、mpc-026、adjuvax、cpgodn、betafectin、alum以及mf59。

可以施用的其他佐劑包括凝集素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和淋巴因子諸如α干擾素、γ干擾素、血小板衍化生長(zhǎng)因子(pdgf)、粒細(xì)胞集落刺激因子(gcsf)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gmcsf)、腫瘤壞死因子(tnf)、表皮生長(zhǎng)因子(egf)、il-i、il-2、il-4、il-6、il-8、il-io和il-12或因此的編碼核酸。

本發(fā)明的組合物可包含藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體、緩沖液、穩(wěn)定劑或本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其他物質(zhì)。所述物質(zhì)應(yīng)為無(wú)毒的并且應(yīng)不干擾活性成分的功效。載體或其他物質(zhì)的確切性質(zhì)可取決于施用路徑，例如肌內(nèi)、皮下、口服、靜脈內(nèi)、皮膚、黏膜內(nèi)(例如腸內(nèi))、鼻內(nèi)或腹腔路徑。

用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答的方法

本發(fā)明提供一種在人類受試者中使用mva載體與腺病毒載體的組合引發(fā)并加強(qiáng)對(duì)任何抗原蛋白或其免疫原性多肽的免疫應(yīng)答的方法。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)總體方面，在人類受試者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法包括：

a.將包含免疫有效量的mva載體的第一組合物施用于所述人類受試者以用于引發(fā)免疫應(yīng)答，所述mva載體包含編碼抗原蛋白或其免疫原性多肽的第一多核苷酸；以及

b.將包含免疫有效量的腺病毒載體的第二組合物施用于所述受試者以用于加強(qiáng)免疫應(yīng)答，所述腺病毒載體包含編碼抗原蛋白或其免疫原性多肽的第二多核苷酸；

從而在人類受試者中獲得針對(duì)抗原蛋白的增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，增強(qiáng)的免疫應(yīng)答包括在人類受試者中針對(duì)抗原蛋白的增強(qiáng)的抗體應(yīng)答。

優(yōu)選地，增強(qiáng)的免疫應(yīng)答還包括在人類受試者中針對(duì)抗原蛋白的增強(qiáng)的cd4+應(yīng)答或增強(qiáng)的cd8+t細(xì)胞應(yīng)答。通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的方法產(chǎn)生的增強(qiáng)的cd4+t細(xì)胞應(yīng)答可以是例如在人類受試者中針對(duì)抗原蛋白的主要cd4+t細(xì)胞應(yīng)答的增強(qiáng)或誘導(dǎo)和/或?qū)乖鞍滋禺惖亩喙δ躢d4+t細(xì)胞的增加或誘導(dǎo)。多功能cd4+t細(xì)胞表達(dá)超過(guò)一種細(xì)胞因子，諸如ifn-γ、il-2和tnf-α中的兩種或更多種。通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的方法產(chǎn)生的增強(qiáng)的cd8+t細(xì)胞應(yīng)答可以是例如在人類受試者中對(duì)抗原蛋白特異的多功能cd8+t細(xì)胞的增加或誘導(dǎo)。

更優(yōu)選地，由根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的方法產(chǎn)生的增強(qiáng)的免疫應(yīng)答包括在人類受試者中針對(duì)抗原蛋白的增強(qiáng)的cd4+t細(xì)胞應(yīng)答、增強(qiáng)的抗體應(yīng)答和/或增強(qiáng)的cd8+t細(xì)胞應(yīng)答。

在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，一種或多種mva載體用于引發(fā)免疫應(yīng)答，并且一種或多種rad26或rad35載體用于加強(qiáng)免疫應(yīng)答。

在相應(yīng)初免和加強(qiáng)組合物中的抗原(然而采用許多加強(qiáng)組合物)無(wú)需相同，但是應(yīng)共享抗原決定簇或彼此基本上相似。

包含載體的免疫原性組合物的施用通常為肌內(nèi)的或皮下的。然而也可設(shè)想其他施用方式諸如靜脈內(nèi)、皮膚、皮內(nèi)或經(jīng)鼻施用?？梢酝ㄟ^(guò)使用針注射腺病毒載體的懸浮液來(lái)實(shí)現(xiàn)免疫原性組合物的肌內(nèi)施用。一種替代方案為使用無(wú)針注射裝置施用含有疫苗的組合物(使用，例如，biojector(tm))或凍干粉末。

對(duì)于靜脈內(nèi)、皮膚或皮下注射或在患病位點(diǎn)注射，載體將為胃腸外可接受的水溶液形式，所述水溶液不含熱源并且具有合適的ph、等滲性和穩(wěn)定性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠很好地使用例如等滲賦形劑諸如氯化鈉注射液、林格式注射液、乳酸林格式注射液制備合適的溶液。在需要時(shí)可以包含防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖液、抗氧化劑和/或其他添加劑。也可采用緩慢釋放的制劑。

通常，施用將具有在感染或癥狀發(fā)展之前產(chǎn)生針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的預(yù)防目的?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明治療或預(yù)防的疾病和病癥包括免疫應(yīng)答可以起保護(hù)或治療作用的疾病和病癥。在其他實(shí)施方案中，mva和腺病毒載體可以施用來(lái)用于暴露后預(yù)防。

將含有mva載體的免疫原性組合物施用于受試者，在受試者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答。組合物足以誘導(dǎo)可檢測(cè)免疫應(yīng)答的量被定義為“免疫有效劑量”。如下所示的，本發(fā)明的免疫原性組合物誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答以及細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。在一個(gè)典型的實(shí)施方案中，免疫應(yīng)答為保護(hù)性免疫應(yīng)答。

施用的實(shí)際量以及施用的速率和時(shí)間過(guò)程將取決于所治療的疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重性。治療的處方(例如，劑量的確定等)在全科醫(yī)師和其他醫(yī)生的職責(zé)內(nèi)，并且通常考慮待治療的病癥、個(gè)體患者的病狀、遞送的部位、施用的方法和醫(yī)師已知的其他因素。上文提及的技術(shù)和協(xié)議的實(shí)例可見于remington'spharmaceuticalsciences，第16版，osol，a編輯，1980。

在mva和腺病毒載體以及所述顆粒的任選制劑產(chǎn)生為組合物后，載體可以施用到個(gè)體，具體地為人類。

在一個(gè)示例性方案中，以含有約10⁴至10¹²個(gè)病毒顆粒/ml的濃度的約100μl至約10ml之間范圍的體積施用(例如，肌內(nèi)地)腺病毒載體。優(yōu)選地，以0.25與約1.0ml之間范圍的體積施用腺病毒載體。更優(yōu)選地，以0.5ml的體積施用腺病毒載體。

通常，在一個(gè)施用期間以約10⁹至約10¹²個(gè)病毒顆粒(vp)的量，更通常地以約10¹⁰至約10¹²vp的量將腺病毒施用到人類受試者。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，以約5x10¹⁰vp的量施用腺病毒載體。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，以約0.8x10¹⁰vp的量施用腺病毒載體。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，以約2x10¹⁰vp的量施用腺病毒載體。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，以約4x10¹⁰vp的量施用腺病毒載體。在某些實(shí)施方案中，腺病毒被配制為三價(jià)組合物，其中各自具有不同插入點(diǎn)的三種腺病毒混合在一起。在三價(jià)組合物中，各種不同的腺病毒優(yōu)選地以約4x10¹⁰vp的量存在。在所述三價(jià)組合物中，每劑量腺病毒顆粒的總數(shù)達(dá)到約1.2x10¹¹vp。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，三價(jià)組合物中各種不同的腺病毒優(yōu)選地以約1x10¹¹vp的量存在。在所述三價(jià)組合物中，然后每劑量腺病毒顆粒的總數(shù)達(dá)到約3x10¹¹vp。在初始疫苗接種后為如上所述的加強(qiáng)疫苗接種。

在一個(gè)示例性方案中，以包含約1x10⁷tcid50至1x10⁹tcid50(50％組織培養(yǎng)感染劑量)或inf.u.(感染單位)的劑量的約100μl至約10ml之間范圍的體積的鹽溶液施用mva載體。優(yōu)選地，以0.25與1.0ml之間范圍的體積施用mva載體。更優(yōu)選地，以0.5ml的體積施用mva載體。

通常，在一個(gè)施用期間以約1x10⁷tcid50至1x10⁹tcid50(或inf.u.)的劑量將mva載體施用于人類受試者。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，以約5x10⁷tcid50至5x10⁸tcid50(或inf.u.)的量施用mva載體。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，以約5x10⁷tcid50(或inf.u.)的量施用mva載體。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，以約1x10⁸tcid50(或inf.u.)的量施用mva載體。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，以約1.9x10⁸tcid50(或inf.u.)的量施用mva載體。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，以約4.4x10⁸tcid50(或inf.u.)的量施用mva載體。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，以約5x10⁸tcid50(或inf.u.)的量施用mva載體

組合物在需要時(shí)可以存在于試劑盒、包裝或分配器中，其可以含有包含活性成分的一個(gè)或多個(gè)單位劑型。試劑盒例如可包括金屬或塑料箔，諸如泡罩包裝。試劑盒、包裝或分配器可以隨附施用說(shuō)明書。

本發(fā)明的組合物可以單獨(dú)施用或與其他治療組合施用，同時(shí)或依次施用取決于待治療的病狀。

通常在施用初免組合物數(shù)周或數(shù)月后施用一次或多次加強(qiáng)組合物，例如，約1或2周、或3周、或4周、或6周、或8周、或12周、或16周、或20周、或24周、或28周、或32周或一到兩年。

優(yōu)選地，在初免后1-12周或2-12周，更優(yōu)選地在初免后1、2、4或8周給予初始加強(qiáng)接種。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在初免后4或8周施用初始加強(qiáng)接種。在另外優(yōu)選的實(shí)施方案中，在初免后至少1周、或至少2周、或至少4周進(jìn)行初始加強(qiáng)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在初免后4-12周或4-8周進(jìn)行初始加強(qiáng)。

在根據(jù)所述方法的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，mva載體用于初免，隨后用rad26載體加強(qiáng)。優(yōu)選地，在初免后1-12周，更優(yōu)選地在初免后1、2、4或8周施用加強(qiáng)組合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在初免后8周施用加強(qiáng)組合物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在初免后1周施用加強(qiáng)組合物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在初免后2周施用加強(qiáng)組合物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在初免后4周施用加強(qiáng)組合物。

可以在初始加強(qiáng)之后進(jìn)行一個(gè)或多次另外的加強(qiáng)施用。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，加強(qiáng)組合物包含ad26載體。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種增強(qiáng)人類受試者中針對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答的方法。所述方法包括：

a.將包含免疫有效量的mva載體的第一組合物施用于所述人類受試者以用于引發(fā)免疫應(yīng)答，所述mva載體包含編碼由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗原蛋白、基本上相似的抗原蛋白或其免疫原性多肽的第一多核苷酸；以及

b.將包含免疫有效量的腺病毒載體的第二組合物施用于所述受試者以用于加強(qiáng)免疫應(yīng)答，所述腺病毒載體包含編碼抗原蛋白、基本上相似的抗原蛋白或其免疫原性多肽的第二多核苷酸；

從而在人類受試者中獲得針對(duì)腫瘤的增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。

優(yōu)選地，增強(qiáng)的免疫應(yīng)答為人類受試者提供針對(duì)腫瘤的保護(hù)性免疫。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在第一初免步驟后1-12周或2-12周進(jìn)行加強(qiáng)步驟。也可以在比初免步驟后12周更晚時(shí)進(jìn)行加強(qiáng)步驟。在另外優(yōu)選的實(shí)施方案中，在初免步驟后至少2周或至少4周進(jìn)行加強(qiáng)步驟。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，在初免步驟后4-12周或4-8周進(jìn)行加強(qiáng)步驟。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，加強(qiáng)步驟在初始加強(qiáng)施用之后重復(fù)一次或多次。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，腺病毒載體為ad26載體。

通過(guò)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗原蛋白可以是任何腫瘤抗原。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，腫瘤抗原為僅存在于腫瘤細(xì)胞上的腫瘤特異性抗原。腫瘤抗原也可以是存在于一些腫瘤細(xì)胞上并且也存在于一些正常細(xì)胞上的腫瘤相關(guān)抗原。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及一種增強(qiáng)在人類受試者中針對(duì)至少一種絲狀病毒亞型的免疫應(yīng)答的方法。所述方法包括：

a.將包含免疫有效量的mva載體的第一組合物施用于所述人類受試者以用于引發(fā)免疫應(yīng)答，所述mva載體包含編碼至少一種絲狀病毒亞型的抗原蛋白、基本上相似的抗原蛋白或其免疫原性多肽的多核苷酸；以及

b.將包含免疫有效量的腺病毒載體的第二組合物施用于所述受試者以用于加強(qiáng)免疫應(yīng)答，所述腺病毒載體包含編碼至少一種絲狀病毒亞型的抗原蛋白、基本上相似的抗原蛋白或其免疫原性多肽的多核苷酸；

從而在人類受試者中獲得針對(duì)至少一種絲狀病毒亞型的增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。

優(yōu)選地，增強(qiáng)的免疫應(yīng)答為人類受試者提供針對(duì)至少一種絲狀病毒亞型的保護(hù)性免疫。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在第一步驟后1-12周或2-12周，更優(yōu)選地在初免后1、2、4或8周進(jìn)行加強(qiáng)步驟。在另外優(yōu)選的實(shí)施方案中，在初免后至少1周或至少2周進(jìn)行加強(qiáng)步驟。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，在初免后4-12周或4-8周進(jìn)行加強(qiáng)步驟。

也可以在比初免后12周更晚時(shí)進(jìn)行加強(qiáng)步驟。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，加強(qiáng)步驟在初始加強(qiáng)施用之后重復(fù)一次或多次，諸如初免后6個(gè)月、1年、1.5年、2年、2.5年或3年。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，腺病毒載體為ad26載體。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗原蛋白為線狀病毒亞型的糖蛋白或核蛋白。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在第一組合物中的mva載體包含編碼來(lái)源于超過(guò)一種絲狀病毒亞型的抗原蛋白的多核苷酸。更優(yōu)選地，第一組合物中的mva載體包含編碼來(lái)自四種絲狀病毒亞型的具有seqidno:1、2、4和5的氨基酸序列的四種抗原蛋白或其免疫原性多肽的多核苷酸。

在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，第二組合物包含至少一種腺病毒載體，其包含編碼來(lái)源于絲狀病毒亞型的抗原蛋白的多核苷酸，所述絲狀病毒亞型與由mva載體編碼的絲狀病毒亞型相同或不同。例如，腺病毒載體可以包含編碼具有選自由seqidno:1-5組成的組的氨基酸序列的抗原蛋白的多核苷酸。優(yōu)選地，第二組合物可以包含超過(guò)一種腺病毒載體，所述腺病毒載體編碼來(lái)自超過(guò)一種絲狀病毒亞型的超過(guò)一種抗原蛋白或其免疫原性多肽。例如，第二組合物可以包含編碼具有seqidno:1、2和3的氨基酸序列的一至三種抗原蛋白的一至三種腺病毒載體。

實(shí)施例

提供以下實(shí)施例來(lái)說(shuō)明，但并非限制所要求保護(hù)的發(fā)明。

實(shí)施例1

以鑒定針對(duì)多種[例如，馬爾堡、埃博拉(又稱扎伊爾)和蘇丹]絲狀病毒具有≥80％的實(shí)際功效的多價(jià)絲狀病毒疫苗為目標(biāo)進(jìn)行動(dòng)物研究，以用于繼續(xù)推進(jìn)發(fā)展。研究使用兩或三種疫苗接種測(cè)試延長(zhǎng)的疫苗接種時(shí)間表并且測(cè)試使用異源(與同源相反)疫苗組合對(duì)于隨后對(duì)目標(biāo)絲狀病毒的nhp免疫應(yīng)答的影響。使用埃博拉病毒基奎特攻擊疫苗接種的nhp以測(cè)試所應(yīng)用的疫苗接種的功效。

動(dòng)物操作

這些研究符合動(dòng)物福利法規(guī)最終條例(finalrulesoftheanimalwelfareactregulations)的所有適用章節(jié)(cfr第9篇，第1、2和3部分)和實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和使用指南(guideforthecareanduseoflaboratoryanimals)–nationalacademypress,washingtond.c.第八版(theguide)。

總計(jì)16只短尾獼猴(食蟹猴)(nhp)(12只雄性和4只雌性)，毛里求斯來(lái)源，短尾獼猴，4-5歲，每只大約4-8kg，購(gòu)自primgen(hines,il)。動(dòng)物在疫苗接種之前通過(guò)elisa在實(shí)驗(yàn)上首次接種雷斯頓病毒(restv)。排除先前暴露于分枝桿菌肺結(jié)核、猿免疫缺陷病毒(siv)、猿t淋巴細(xì)胞病毒-1(stlv-1)、恒河猴皰疹病毒1(b型皰疹病毒)和猿逆轉(zhuǎn)錄病毒(srv1和srv2)的動(dòng)物，測(cè)試沙門氏菌和志賀氏菌的活性感染并且確認(rèn)對(duì)結(jié)核桿菌呈陰性。

絲狀病毒為危險(xiǎn)組4(高度封閉的)病原體；因此在cdc認(rèn)可的生物安全水平(bsl)-4/動(dòng)物生物安全水平(absl-4)封閉設(shè)施下進(jìn)行涉及扎伊爾埃博拉病毒、蘇丹埃博拉病毒或馬爾堡病毒的全部操作。

疫苗材料

通過(guò)crucellhollandb.v.生產(chǎn)rad載體。所述載體為包含在e1位點(diǎn)插入的腺病毒糖蛋白(gp)基因的純化的e1/e3缺失的復(fù)制缺陷型重組腺病毒類型26或類型35疫苗載體(分別為ad26和ad35)。這些載體在細(xì)胞中得以復(fù)蘇，噬斑純化，放大并且然后通過(guò)兩步cscl顯帶程序來(lái)純化，并且隨后在基于tris的制劑緩沖液中配制并且儲(chǔ)存在-65℃之下。這些載體的體內(nèi)使用釋放包括生物載量測(cè)試、低內(nèi)毒素水平(<5eu/ml)和轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和完整的確認(rèn)。

具體地，rad載體表達(dá)ebovmayingagp(seqidno:1)、sudv古盧gp(seqidno:2)和marv安哥拉gp(seqidno:3)。各種rad載體表達(dá)一種單一抗原蛋白(gp)。

mva載體由bavariannordic生產(chǎn)。具體地，mva多重載體(mva-bn-filo)表達(dá)4種不同的抗原蛋白：ebovmayingagp(seqidno:1)；sudv古盧gp(seqidno:2)；marv莫索克(musoke)gp(seqidno:4)；以及塔伊森林病毒(tafv)np(seqidno:5)。

疫苗材料儲(chǔ)存在-80℃溫控冷凍機(jī)中。

疫苗接種和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

關(guān)于研究分組和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，參見圖1和圖2。

已使用兩種不同的疫苗平臺(tái)對(duì)短尾獼猴(食蟹猴)(nhp)進(jìn)行疫苗接種，每組2只動(dòng)物，此外對(duì)照組由兩個(gè)首次(空載體)攻擊對(duì)照組成。在圖1所示的組中首先用重組載體對(duì)動(dòng)物進(jìn)行疫苗接種。將每只獼猴麻醉并且接受疫苗到左后大腿的肌內(nèi)(im)注射。間隔4周或8周給予初免和加強(qiáng)劑量(圖1)。各個(gè)劑量的腺病毒由到左后大腿的單一im注射組成。皮下施用mva載體。

在第28天、第56天和第63天在室溫下將edta或肝素全血連夜運(yùn)輸?shù)絫exasbiomed。另外，當(dāng)在texasbiomed飼喂動(dòng)物時(shí)，在第77天收集肝素或edta全血。在所有這些時(shí)間點(diǎn)，將在texasbiomed處理edta全血以獲得pbmc和血漿。

使用埃博拉扎伊爾肽庫(kù)1和2、蘇丹古盧肽庫(kù)1和2、埃博拉病毒共有肽庫(kù)、馬爾堡安哥拉肽庫(kù)1和2以及馬爾堡病毒共有肽庫(kù)，連同僅dmso陰性對(duì)照和抗cd3刺激陽(yáng)性對(duì)照，將pbmc用于ifn-gelispot測(cè)定。一式兩份進(jìn)行全部刺激，合計(jì)每nhp20個(gè)孔。

另外，在第0天、第28天、第56天和第68天在bioqual處理不具有抗凝劑的全血以獲得血清并且在第77天在texasbiomed處理以獲得血清。在bioqual收集的等分試樣的血清將在第68天冷凍發(fā)送到texasbiomed。在zebovgp特異性elisa中測(cè)定各個(gè)血清。另外，在sebovgp和marvagp特異性elisa(兩種不同的測(cè)定)中測(cè)定來(lái)自第0天、第56天和第77天的血清。

表1：在用埃博拉病毒攻擊之前測(cè)量的參數(shù)

用于動(dòng)物攻擊的絲狀病毒接種體

如圖2所示，在加強(qiáng)疫苗接種后約4周，用ebov攻擊動(dòng)物。具體地，ebov基奎特-9510621用于動(dòng)物攻擊并且由texasbiomed供應(yīng)。ebov基奎特9510621的第二次細(xì)胞培養(yǎng)傳代(p2)在2012年獲自tomksiazek博士(在utmb健康加爾維斯頓國(guó)家實(shí)驗(yàn)室的niaid的wrceva)并且在veroe6細(xì)胞中在texasbiomed第三次增殖并且具有2.1x10⁵pfu/ml的滴度。ebov基奎特-9510621。產(chǎn)品目錄號(hào)2012099171。

在收獲時(shí)的滴度：2.1x10⁵pfu/ml用于研究。

通過(guò)在與基因庫(kù)p2共有序列的僅有1個(gè)snp差異的情況下進(jìn)行深測(cè)序來(lái)確認(rèn)攻擊儲(chǔ)備物為野生型ebov基奎特9510621。攻擊儲(chǔ)備物作為包含含有10％fbs的培養(yǎng)基(mem)的500±50μl等分試樣儲(chǔ)存在液態(tài)氮蒸汽相中。對(duì)于100pfu攻擊，將絲狀病毒攻擊劑以磷酸緩沖鹽水稀釋至200pfu/ml的目標(biāo)劑量。簡(jiǎn)言之，通過(guò)以pbs進(jìn)行三次連續(xù)的1:10稀釋來(lái)稀釋儲(chǔ)備病毒以獲得200pfu/ml攻擊材料濃度。給予每只動(dòng)物合計(jì)0.5ml的攻擊材料。

在病毒注射之前，通過(guò)肌內(nèi)注射telazol(2至6mg/kg；5至8mg/kg氯胺酮imprn，以用于輔助麻醉)來(lái)使猴子鎮(zhèn)靜。在研究的第0天，收集血液并且隨后通過(guò)在臂右三角肌中進(jìn)行肌內(nèi)注射來(lái)用0.5ml體積中的100pfu目標(biāo)劑量的ebov攻擊每只猴子。記錄攻擊位點(diǎn)。

在施用病毒之后，將每只猴子返回居住籠并且觀察猴子直到其從麻醉中恢復(fù)(胸骨橫臥/維持直立姿勢(shì)的能力)。此研究中的終點(diǎn)為存活/未存活。通過(guò)患有終端疾病或處在瀕死狀態(tài)的動(dòng)物來(lái)定義未存活。通過(guò)每日臨床觀察評(píng)分表來(lái)評(píng)估動(dòng)物的健康。

抗ebovgpiggelisa

通過(guò)改性的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)在表1描述的時(shí)間點(diǎn)測(cè)定絲狀病毒特異性體液應(yīng)答，如先前sulivan等(2006)(immuneprotectionofnonhumanprimatesagainstebolaviruswithsinglelow-doseadenovirusvectorsencodingmodifiedgps.plosmedicine3,e177)所述，所述文獻(xiàn)以引用的方式整體并入本文。簡(jiǎn)言之，用10μg/ml雪花蓮(galanthusnivalis)凝集素過(guò)夜涂覆elisa板。然后，在封端后，用埃博拉或馬爾堡病毒株特異性gp上清液涂覆所述板。通過(guò)用編碼缺失跨膜區(qū)和胞質(zhì)尾區(qū)的絲狀病毒糖蛋白的表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染hek293t來(lái)產(chǎn)生這些上清液。在以1:50開始的4倍稀釋系列中測(cè)試猴子血清樣品。通過(guò)在492nm處的比色法檢測(cè)結(jié)合igg。計(jì)算針對(duì)絲狀病毒糖蛋白病毒株特異性參考血清的相對(duì)血清滴度。在圖4-圖6中示出elisa測(cè)定的結(jié)果。

ifn-gelispot測(cè)定

通過(guò)干擾素γ酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisapot)在表1描述的時(shí)間點(diǎn)測(cè)定絲狀病毒特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，如先前ophorst等2007(increasedimmunogenicityofrecombinantad35-basedmalariavaccinethroughformulationwithaluminiumphosphateadjuvant.vaccine25,6501-6510)所述，所述文獻(xiàn)以引用的方式整體并入本文。用于各種埃博拉和馬爾堡病毒株糖蛋白的刺激的肽庫(kù)由通過(guò)11個(gè)氨基酸重疊的15聚體組成。為將庫(kù)中太高數(shù)目的肽的不需要的影響最小化，將各個(gè)糖蛋白肽庫(kù)分成兩半，一個(gè)n末端和一個(gè)c末端。將與三種埃博拉病毒(扎伊爾、蘇丹和塔伊大森林)或兩種馬爾堡病毒(馬爾堡和ravn病毒)內(nèi)超過(guò)九種連續(xù)氨基酸重疊的肽組合在共有庫(kù)中。在每種單一肽1μg/ml最終濃度下使用肽庫(kù)和單一肽。在圖7中示出elispot測(cè)定的結(jié)果。

如圖3-7中匯總的結(jié)果所示，本文的動(dòng)物研究顯示rad和mva載體在用于預(yù)防靈長(zhǎng)類動(dòng)物中絲狀病毒感染的初免-加強(qiáng)組合中的實(shí)用性。具體地，一種或多種表達(dá)一種或多種類型的絲狀病毒的gp的rad26載體或者表達(dá)多重絲狀病毒抗原的mva載體的施用引起對(duì)一種或多種類型的絲狀病毒的體液應(yīng)答的高效初免。在第8周用異源載體加強(qiáng)免疫后，全部疫苗方案對(duì)一種或多種類型的絲狀病毒誘導(dǎo)了相似的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答并且提供針對(duì)高度致病的埃博拉扎伊爾攻擊的100％保護(hù)。

實(shí)施例2

進(jìn)行第二個(gè)nhp研究，以確認(rèn)在0-4周和0-8周間隔2個(gè)初免加強(qiáng)方案的免疫原性和保護(hù)功效。一個(gè)方案包括將單價(jià)ad26.zebov疫苗作為初免物并且將mva-bn-filo作為加強(qiáng)免疫物；另一個(gè)方案包括將mva-bn-filo作為初免物并且將ad26.zebov作為加強(qiáng)免疫物。全部免疫軍為肌內(nèi)免疫。將ad26.zebov(5x10¹⁰vp)用作0-8周方案的初免物，并且將其與1x10⁸tcid50mva-bn-filo(4只nhp)和5x10⁸tcid50mva-bn-filo(4只nhp)的加強(qiáng)免疫物組合，以評(píng)定所述方案中標(biāo)準(zhǔn)劑量和高劑量的mva的影響。分別用1x10⁸tcid50mva-bn-filo和5x10⁸tcid50mva-bn-filo初免兩個(gè)另外組的4只nhp；隨后在兩種情況下在4周后用ad26.zebov(5x10¹⁰vp)加強(qiáng)，以測(cè)試4-周方案中mva-bn-filo劑量作為初免物的影響。另外，先用ad26.zebov(5x10¹⁰vp)隨后通過(guò)1x10⁸tcid50mva-bn-filo初免2只nhp。最終，用空ad26載體(不表達(dá)任何絲狀病毒抗原，5x10¹⁰vpim)免疫2只nhp并且tbs作為研究的陰性免疫對(duì)照。在最后用100pfu的ebov基奎特1995野生型p3攻擊病毒進(jìn)行免疫的4周后攻擊全部動(dòng)物。此研究的分組匯總在表2中。

表2：用ebov攻擊的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中的保護(hù)研究的實(shí)驗(yàn)分組

縮寫：tbs:tris-緩沖鹽水；tcid50：50％組織培養(yǎng)感染劑量；vp：病毒顆粒。粗體表示100％存活。

免疫原性

nhp中的免疫應(yīng)答特征為與絲狀病毒gp結(jié)合和中和抗體(elisa)以及產(chǎn)細(xì)胞因子t細(xì)胞(elispot)有關(guān)。

elisa：

通過(guò)針對(duì)全部時(shí)間點(diǎn)的gp特異性elisa來(lái)分析ebovmayingagp反應(yīng)抗體(參見圖20)。如實(shí)驗(yàn)1中所述地進(jìn)行抗ebovgpiggelisa。在對(duì)照疫苗接種的動(dòng)物中未觀察到elisa滴度。疫苗方案在全部動(dòng)物中均為免疫原性的。在b組中觀察到最高滴度，該組以8-周間隔接受ad26.zebov和高劑量的mva-bn-filo。

保護(hù)功效

8-周ad26.zebov/mva-bn-filo初免/加強(qiáng)方案兩者使得在ebov攻擊之后能完全存活，而不論mva-bn-filo的劑量(1×10⁸tcid50或5×10⁸tcid50)如何。另外，ad26.zebov/mva-bn-filo的4-周方案在2只nhp的2只中給予保護(hù)。4-周mva-bn-filo/ad26.zebov方案兩者在4只nhp的2只中給予保護(hù)。

實(shí)施例3

在人類中使用1x10⁸tcid50劑量的mva-bn-filo和5x10¹⁰vp劑量的ad26.zebov進(jìn)行臨床研究以評(píng)估方案的安全性、耐受性和免疫原性。研究由兩部分組成。

主要的研究為在72位健康成人受試者中進(jìn)行的隨機(jī)的、安慰劑對(duì)照的、觀察者雙盲的研究，所述受試者之前未接受過(guò)實(shí)驗(yàn)性埃博拉候選疫苗并且不具有已知的對(duì)埃博拉病毒的暴露或埃博拉疾病的診斷。在此研究中測(cè)試4種方案：2種方案以28或56天間隔將mva-bn-filo作為初免物并將ad26.zebov作為加強(qiáng)免疫物，并且2個(gè)方案以28或56天間隔將ad26.zebov作為初免物并將mva-bn-filo作為加強(qiáng)免疫物。

子研究由評(píng)估方案的安全性、耐受性和免疫原性的開放性、無(wú)對(duì)照的非隨機(jī)化治療臂組成，所述方案用5x10¹⁰vp劑量的ad26.zebov作為初免物并在14天后用1x10⁸tcid50劑量的mva-bn-filo作為增強(qiáng)免疫物，并且在15位健康成人受試者中進(jìn)行所述子研究。

研究由疫苗接種周期組成，其中在基線(第1天)處疫苗接種受試者，隨后在第15天、第29天或第57天進(jìn)行加強(qiáng)，并且進(jìn)行加強(qiáng)后隨訪，直到全部受試者已進(jìn)行其21天加強(qiáng)后訪問(wèn)(第36天、第50天或第78天)或更早中斷。

主要研究中的受試者加入各有18位健康受試者的4個(gè)不同組?？傊诮M內(nèi)以5:1比率隨機(jī)分配受試者，以如下通過(guò)im注射(0.5ml)接受活性疫苗或安慰劑(0.9％生理鹽水)：

·在第1天注射mva-bn-filo(1x10⁸tcid50)，隨后在第29天(組1)或第57天(組2)進(jìn)行ad26.zebov(5x10¹⁰vp)的加強(qiáng)注射，或者

·在第1天注射ad26.zebov(5x10¹⁰vp)，隨后在第29天(組3)或第57天(組4)進(jìn)行mva-bn-filo(1x10⁸tcid50)的加強(qiáng)注射。

子研究中的15位受試者如下通過(guò)im注射(0.5ml)接受活性疫苗：

·在第1天注射ad26.zebov(5x10¹⁰vp)，隨后在第15天(組5)進(jìn)行mva-bn-filo(1x10⁸tcid50)的加強(qiáng)注射。

示例性研究疫苗接種時(shí)間表匯總在表3中。

表3：研究疫苗接種時(shí)間表

n：接受研究疫苗的受試者的數(shù)目；tcid50：50％組織培養(yǎng)感染劑量；vp：病毒顆粒

通過(guò)收集訴求的局部和全身性不良事件、未訴求的不良事件和嚴(yán)重不良事件并且通過(guò)身體檢查來(lái)評(píng)定安全性。另外，在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)參數(shù)、血液學(xué)參數(shù)(包括凝血參數(shù))和尿分析參數(shù)。

使用匯總在表4和表5中的免疫學(xué)測(cè)定評(píng)定免疫原性。探索性測(cè)定包可包括但不限于列出的測(cè)定。

表4：免疫學(xué)測(cè)定的匯總(血清學(xué))

表5：免疫學(xué)測(cè)定的匯總(細(xì)胞)

安全性測(cè)定

通過(guò)收集訴求的局部和全身性不良事件、未訴求的不良事件和嚴(yán)重不良事件并通過(guò)身體檢查來(lái)評(píng)定安全性。另外，在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)參數(shù)、血液學(xué)參數(shù)(包括凝血參數(shù))和尿分析參數(shù)。

首先來(lái)自人類的這些參數(shù)的安全性數(shù)據(jù)顯示，兩種疫苗在具有通常預(yù)期來(lái)自疫苗接種的瞬時(shí)反應(yīng)的階段似乎為良好耐受的。無(wú)顯著不良事件與疫苗方案相關(guān)聯(lián)。大多數(shù)事件為溫和的,發(fā)生在疫苗接種后一至兩天并且平均持續(xù)一至兩天。觀察到非常少的發(fā)熱情況。

免疫應(yīng)答的評(píng)定

加強(qiáng)免疫達(dá)21天后使用elisa測(cè)定分析結(jié)合到ebovgp的抗體，使用elispot測(cè)定分析ebovgp特異性t細(xì)胞應(yīng)答，并且使用ics測(cè)定檢測(cè)對(duì)ebovgp的cd4+和cd8+t細(xì)胞應(yīng)答，從而評(píng)定免疫原性。在第1天、第8天、第29天、第36天和第50天在組1和組3中并且在第1天、第8天、第29天、第57天、第64天和第78天為組2和組4收集用于分析由研究疫苗誘導(dǎo)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答的樣品。

體液免疫應(yīng)答的評(píng)定

通過(guò)抗ebovgpelisa測(cè)定來(lái)評(píng)定研究疫苗誘導(dǎo)的結(jié)合抗體應(yīng)答(圖8)。重要的是，接受疫苗方案的全部受試者在加強(qiáng)免疫21天后顯示血清轉(zhuǎn)化。當(dāng)在7％至40％的受試者中僅觀察到用mva-bn-filo初免后產(chǎn)生的低水平的ebovgp特異性免疫應(yīng)答時(shí)，通過(guò)在初免28天或56天后施用的ad26.zebov進(jìn)行加強(qiáng)后觀察到強(qiáng)抗原特異性應(yīng)答。出人意料地，所述應(yīng)答的強(qiáng)度高于加強(qiáng)免疫21天后在相同的初免-加強(qiáng)時(shí)間間隔由相反的疫苗方案誘導(dǎo)的應(yīng)答的強(qiáng)度(組3和組4分別用ad26.zebov初免，隨后在28或56天后用mva-bn-filo加強(qiáng))[對(duì)于組1和組3分別為具有eu/ml10573(6452；17327)和4274(2350；7775)的95％置信區(qū)間的幾何平均滴度，并且對(duì)于組2和組4分別為具有eu/ml18729(12200；28751)和7553(511；1115)的95％置信區(qū)間的幾何平均滴度]。

必須指出，在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(nhp)中，加強(qiáng)用ad26進(jìn)行的mva初免引起ebovgp特異性免疫應(yīng)答，所述應(yīng)答在強(qiáng)度上相當(dāng)于在相同的初免-加強(qiáng)時(shí)間間隔時(shí)由相反的疫苗方案(ad/mva)誘導(dǎo)的應(yīng)答(參見圖4)，或者在強(qiáng)度上更低(圖20)。因此，對(duì)于nhp的一個(gè)特異性初免-加強(qiáng)方案觀察到的免疫應(yīng)答不預(yù)測(cè)在人類中在相同的初免-加強(qiáng)方案后觀察到的免疫應(yīng)答。

細(xì)胞免疫應(yīng)答的評(píng)定

通過(guò)干擾素γ(ifn-γ)elispot和ics測(cè)量ebovgp特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。為評(píng)定細(xì)胞免疫應(yīng)答，將儲(chǔ)存的pbmc(外周血單核細(xì)胞)解凍并用2個(gè)庫(kù)(庫(kù)1和庫(kù)2)中組織的肽刺激。在圖9中示出每個(gè)庫(kù)中刺激的t細(xì)胞應(yīng)答的總和。

通過(guò)elispot分析(圖9)，在用ad26.zebov引發(fā)免疫后第29天在50％至60％受試者中可容易地檢測(cè)ifn-γ應(yīng)答(對(duì)于組3和組4，平均ifn-γ應(yīng)答分別為103個(gè)和58個(gè)斑點(diǎn)形成單位/每百萬(wàn)pbmc)并且在ad26.zebov引發(fā)免疫后第57天在86％受試者中可容易地檢測(cè)ifn-γ應(yīng)答(組4，平均ifn-γ應(yīng)答為283個(gè)斑點(diǎn)形成單位/百萬(wàn)(sfu/10⁶)pbmc)。通過(guò)在第29天或第57天用mva-bn-filo進(jìn)行免疫來(lái)進(jìn)一步加強(qiáng)這些應(yīng)答(對(duì)于組3，87％的應(yīng)答者，平均ifn-γ應(yīng)答為463sfu/10⁶pbmc；對(duì)于組4，86％的應(yīng)答者，648sfu/10⁶pbmc)并且這些應(yīng)答維持在加強(qiáng)后第21天的水平(對(duì)于組3，79％應(yīng)答者，平均ifn-γ應(yīng)答為390sfu/10⁶pbmc并且對(duì)于組4，100％應(yīng)答者，464sfu/10⁶pbmc)。

相比之下，在mva初免后僅可檢測(cè)到非常低水平的ebovgp-特異性ifn-γ分泌細(xì)胞(對(duì)于組1和組2而言，在第29天分別有7％和0％應(yīng)答者)。然而，分別在第29天和第57天加強(qiáng)的93％和100％受試者中出乎意料地觀察到強(qiáng)ifn-γ應(yīng)答，在ad26.zebov加強(qiáng)后7天達(dá)到峰值(平均應(yīng)答為882和440水平高于使用相同時(shí)間表的ad26.zebov-prime/mva-bn-filo-加強(qiáng)組合之后觀察到的水平(組3和組4)。

圖10-圖15中示出通過(guò)ics進(jìn)行的測(cè)量特異性cd4+和cd8+t細(xì)胞應(yīng)答的細(xì)胞測(cè)定的結(jié)果。

正如預(yù)期的，在安慰劑免疫的個(gè)體中未觀察到ebovgp特異性cd8+或cd4+t細(xì)胞應(yīng)答(圖10和圖13)。在用mva-bn-filo引發(fā)免疫后第29天或第57天未觀察到cd8+細(xì)胞因子應(yīng)答(組1和組2)。然而，在用ad26.zebov加強(qiáng)7天后在53％的受試者中觀察到疫苗誘導(dǎo)的cd8+t細(xì)胞應(yīng)答(當(dāng)分別在第29天或第57天施用ad26加強(qiáng)免疫時(shí)，平均總細(xì)胞因子應(yīng)答為：0.08％和0.07％；圖10)。在加強(qiáng)免疫后第21天維持此應(yīng)答(當(dāng)分別在第29天或第57天施用ad26來(lái)加強(qiáng)免疫時(shí)，平均總細(xì)胞因子應(yīng)答為：0.1％和0.06％；圖10)。相比之下，接受使用ad26.zebov引發(fā)免疫(組3和組4)的57％受試者在第29天顯示cd8+t細(xì)胞應(yīng)答(平均總細(xì)胞因子應(yīng)答：分別為0.12％和0.05％)，在ad26.zebov引發(fā)免疫(組4)后第57天86％的受試者顯示cd8+t細(xì)胞應(yīng)答(平均總細(xì)胞因子應(yīng)答：0.19％)。在第29天用mva-bn-filo加強(qiáng)免疫后進(jìn)一步增強(qiáng)此應(yīng)答，在加強(qiáng)的7和21天后分別有67％和73％的受試者應(yīng)答(平均應(yīng)答：兩天皆為0.27％)。

出人意料地，雖然與組3(ad26-mva初免-加強(qiáng)0-28天時(shí)間表)相比，在組1中觀察到更小百分比的應(yīng)答者(mva-ad26初免-加強(qiáng)0-28天時(shí)間表)，但是在這些應(yīng)答者中由mva-ad26初免-加強(qiáng)方案誘導(dǎo)的多功能cd8+t細(xì)胞(表達(dá)超過(guò)一種細(xì)胞因子的cd8+t細(xì)胞)的比例相比于由ad26-mva初免-加強(qiáng)方案誘導(dǎo)的多功能cd8+t細(xì)胞的比例在加強(qiáng)后更高(圖11)。在第57天施用初免物和加強(qiáng)免疫物時(shí)，未觀察到此差異。使用此時(shí)間表，mva初免ad26加強(qiáng)方案(組2)和ad26初免mva加強(qiáng)(組4)方案兩者相似地誘導(dǎo)高比例的多功能cd8+t細(xì)胞(圖12)。

出人意料地，先用mva-bn-filo引發(fā)免疫，隨后以28天間隔用ad26.zebov加強(qiáng)免疫(組1)來(lái)誘導(dǎo)非常激烈的cd4+t細(xì)胞應(yīng)答，所述應(yīng)答在加強(qiáng)免疫7天后達(dá)到峰值(93％應(yīng)答者，平均總細(xì)胞因子應(yīng)答為0.37％；圖13)。在峰值處，所述cd4+t細(xì)胞應(yīng)答的強(qiáng)度比先用ad26.zebov引發(fā)免疫隨后以28天間隔用mva-bn-filo加強(qiáng)免疫后(67％應(yīng)答者，平均總細(xì)胞因子應(yīng)答為0.11％)的組3中可見的強(qiáng)度更高。在加強(qiáng)21天后，由兩種方案誘導(dǎo)的cd4+t細(xì)胞應(yīng)答為相當(dāng)?shù)?。將mva-bn-filo/ad26.zebov方案的間隔時(shí)間延長(zhǎng)到56天，這引起更低的cd4+t細(xì)胞應(yīng)答。ad26.zebov/mva-bn-filo方案在28天間隔時(shí)誘導(dǎo)略低的cd4+t細(xì)胞應(yīng)答并且在56天間隔時(shí)誘導(dǎo)相當(dāng)?shù)膽?yīng)答。由兩種疫苗組合誘導(dǎo)的cd4+t細(xì)胞主要為多功能的(圖14和圖15)。

評(píng)定先用5x10¹⁰vp的ad26.zebov初免隨后在14天后用1x10⁸tcid50mva-bn-filo加強(qiáng)的免疫原性的子研究的結(jié)果匯總?cè)缦隆?/p>

總之，使用初免和加強(qiáng)之間的14天間隔的此相對(duì)短的方案已顯示為免疫原性的。通過(guò)elisa評(píng)定對(duì)疫苗接種的體液免疫應(yīng)答。當(dāng)對(duì)更長(zhǎng)的間隔進(jìn)行觀察時(shí)，全部受試者通過(guò)加強(qiáng)免疫21天后顯示血清轉(zhuǎn)化(圖16a)。此外，加強(qiáng)免疫21天后在92％的受試者中通過(guò)elispot觀察到細(xì)胞免疫應(yīng)答(圖16b)。此細(xì)胞免疫應(yīng)答由cd4+(67％應(yīng)答者，加強(qiáng)后第21天平均應(yīng)答為0.08％)和cd8+(64％應(yīng)答者，加強(qiáng)后第7天平均應(yīng)答為0.15％)特異性t細(xì)胞兩者組成。使用在初免與加強(qiáng)之間的2周間隔誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答比在使用更長(zhǎng)間隔時(shí)誘導(dǎo)的應(yīng)答略低(參考之前的章節(jié))。

實(shí)施例4

進(jìn)行隨機(jī)的、安慰劑對(duì)照的、觀察者雙盲的研究(在合計(jì)6名標(biāo)記研究受試者的初始開放性疫苗接種之前)，以評(píng)估如下異源方案的安全性、耐受性和免疫原性：(a)將單一劑量的mva-bn-filo(1x10⁸tcid50)或安慰劑(0.9％生理鹽水)作為初免物隨后在不同時(shí)間點(diǎn)(初免后14、28或56天；組1至組3)用單一劑量的ad26.zebov(5x10¹⁰vp)或安慰劑作為加強(qiáng)免疫物，以及(b)將單一劑量的ad26.zebov(5x10¹⁰vp)或安慰劑作為初免物隨后在初免28天后用單一劑量的mva-bn-filo(1x10⁸tcid50)或安慰劑作為加強(qiáng)免疫物后(組4)。

為獨(dú)立評(píng)定2種疫苗的安全性，包括組5和組6，其中2個(gè)單一劑量的mva-bn-filo(1x10⁸tcid50)或安慰劑或2個(gè)單一劑量的ad26.zebov(5x10¹⁰vp)或安慰劑的同源方案以1和15天的更短初免-加強(qiáng)時(shí)間表來(lái)施用。在大約92位年齡在18歲與50歲(包括50歲)之間的健康受試者的目標(biāo)中進(jìn)行所述研究，所述受試者之前未接受過(guò)實(shí)驗(yàn)性埃博拉候選疫苗并且不具有已知的對(duì)埃博拉疾病的暴露或診斷。

研究由疫苗接種時(shí)段組成，其中受試者在其基線訪問(wèn)(第1天)時(shí)進(jìn)行疫苗接種，隨后在第15天、第29天或第57天進(jìn)行加強(qiáng)，并且加強(qiáng)后隨訪直到全部受試者已進(jìn)行其21天加強(qiáng)后訪問(wèn)或更早中斷。此時(shí)，研究將為非盲的。

受試者加入6個(gè)不同組，各組包含18位(組1至組4)或10位(組5和組6)健康受試者。在組1至組4內(nèi)，在整個(gè)研究中以5:1的比率隨機(jī)分配患者以接受活性疫苗或安慰劑。組5和組6各自以按開放方式接受活性疫苗的3位受試者的標(biāo)記群組開始，隨后為以6:1比率隨機(jī)分配以接受活性疫苗或安慰劑的7位受試者的雙盲群組。

不同組中的研究疫苗接種時(shí)間表匯總在表6中。

表6：研究疫苗接種時(shí)間表

在全部組中mva-bn-filo劑量水平為1x10⁸tcid50(50％組織培養(yǎng)感染劑量)；在全部組中ad26.zebov劑量水平為5x10¹⁰vp(病毒顆粒)；安慰劑為0.9％生理鹽水

通過(guò)收集訴求的局部和全身性不良事件、未訴求的不良事件和嚴(yán)重不良事件并且通過(guò)身體檢查來(lái)評(píng)定安全性。另外，在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)參數(shù)、血液學(xué)參數(shù)(包括凝血參數(shù))和尿分析參數(shù)。

使用匯總在表7和表8中的免疫學(xué)測(cè)定評(píng)定免疫原性。探索性測(cè)定包可包括但不限于列出的測(cè)定。

表7：免疫學(xué)測(cè)定的匯總(血清學(xué))

表8：免疫學(xué)測(cè)定的匯總(細(xì)胞)

伊森林病毒；tnf：腫瘤壞死因子

臨床研究正在進(jìn)行。如下描述一些初始結(jié)果。

體液免疫應(yīng)答的評(píng)定

如圖17所示，當(dāng)通過(guò)elisa評(píng)定時(shí)，全部受試者在加強(qiáng)免疫21天后顯示血清轉(zhuǎn)化。與先前的實(shí)驗(yàn)相似，當(dāng)將mva用作初免物并且在28天后將ad26作為加強(qiáng)免疫物施用時(shí)(組2，幾何平均濃度eu/ml6987)，與相反的疫苗免疫順序(組4，幾何平均濃度eu/ml2976)相比，在加強(qiáng)免疫21天后觀察到更高的免疫反應(yīng)。

體液免疫應(yīng)答的強(qiáng)度和初免與加強(qiáng)之間的間隔相關(guān)聯(lián)，與更短時(shí)間表相比(組1，14天間隔，幾何平均濃度eu/ml4418，以及組2，28天間隔，幾何平均濃度eu/ml6987)，當(dāng)使用mva初免與ad26加強(qiáng)之間的56天間隔時(shí)(組3，幾何平均濃度eu/ml14048)觀察到更高抗體濃度。

出人意料地，當(dāng)將mva-bn-filo用作初免物并且隨后在14天后用ad26.zebov加強(qiáng)免疫時(shí)，觀察到激烈的體液免疫應(yīng)答，如由elisa評(píng)定的。接受疫苗方案的全部受試者在加強(qiáng)免疫21天后顯示血清轉(zhuǎn)化，并且比起當(dāng)使用28天間隔的ad26初免mva加強(qiáng)組合，在此時(shí)間點(diǎn)的抗體濃度達(dá)到相似或更高的水平(幾何平均濃度分別為eu/ml4418和2976)。出人意料地，由14天間隔的此mva/ad26初免加強(qiáng)組合誘導(dǎo)的抗體濃度明顯高于由相同初免加強(qiáng)時(shí)間間隔的相反疫苗方案誘導(dǎo)的應(yīng)答(參考實(shí)施例2，圖16a，幾何平均濃度eu/ml915)。這確認(rèn)mva初免ad26加強(qiáng)組合誘導(dǎo)激烈的免疫應(yīng)答以及當(dāng)使用短初免加強(qiáng)間隔時(shí)(14天)所述組合的優(yōu)勢(shì)。

細(xì)胞免疫應(yīng)答的評(píng)定

通過(guò)干擾素γ(ifn-γ)elispot和ics測(cè)量ebovgp特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。為評(píng)定細(xì)胞免疫應(yīng)答，將儲(chǔ)存的pbmc(外周血單核細(xì)胞)解凍并用2個(gè)庫(kù)(庫(kù)1和庫(kù)2)中組織的肽刺激。在圖18-圖19中示出每庫(kù)中刺激的t細(xì)胞應(yīng)答的總和。

出人意料地，當(dāng)使用mva-bn-filo作為初免物隨后用ad26.zebov作為加強(qiáng)免疫物時(shí)，與由28天間隔(組2，73％和67％應(yīng)答者，在加強(qiáng)后第7天和第21天的平均應(yīng)答為427和375sfu/10⁶pbmc)或56天間隔(組3，47％應(yīng)答者，在加強(qiáng)后第7天和第21天的平均應(yīng)答為118和153sfu/10⁶pbmc)誘導(dǎo)的應(yīng)答相比，當(dāng)使用初免與加強(qiáng)之間更短的14天間隔時(shí)(對(duì)于組1，87％和93％應(yīng)答者，在加強(qiáng)后第7天和第21天分別為395和577sfu/10⁶pbmc)觀察到更強(qiáng)的應(yīng)答。

顯著地，由14天間隔的mva-bn-filo初免ad26.zebov加強(qiáng)誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答與ebovgp特異性cd8+和cd4+t細(xì)胞應(yīng)答兩者取得良好平衡(對(duì)于cd4+和cd8+t細(xì)胞兩者有73％應(yīng)答者，在加強(qiáng)后第7天和第21天cd4+平均總細(xì)胞因子應(yīng)答分別為0.15％和0.19％；在加強(qiáng)后第7天和第21天cd8+平均總細(xì)胞因子應(yīng)答分別為0.19％和0.34％；圖19a和圖19b)。由此疫苗組合誘導(dǎo)的cd8+和cd4+t細(xì)胞兩者主要為多功能的(圖19c和圖19d)。

出乎意料地，由14天間隔的此mva/ad26初免加強(qiáng)組合誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答明顯高于由使用相同初免加強(qiáng)時(shí)間間隔的相反疫苗方案誘導(dǎo)的應(yīng)答(參考實(shí)施例2，圖16b、圖16c和圖16d)。這證實(shí)當(dāng)使用短初免加強(qiáng)時(shí)間間隔(14天)時(shí)mva初免ad26加強(qiáng)組合的潛能。

以下表9-12呈現(xiàn)為本文表現(xiàn)的臨床研究的匯總。在實(shí)施例3和4中呈現(xiàn)的研究分別為編號(hào)的研究1001和1002。

表9為實(shí)施例3和4所述的研究期間在elisa測(cè)定中確定的體液免疫應(yīng)答的匯總。

表9：臨床研究中elisa滴度的概況

數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為以elisa/ml計(jì)的幾何平均濃度(gmc)。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)應(yīng)答者的百分比指示在括號(hào)中；ad26：用ad26.zebov進(jìn)行免疫；mva：用mva-bn-filo進(jìn)行免疫；初免加強(qiáng)時(shí)間表指示在表頭中。0，14：初免與加強(qiáng)免疫之間的14天間隔；0，28：初免與加強(qiáng)免疫之間的28天間隔；0，56：初免與加強(qiáng)免疫之間的56天間隔；*：加強(qiáng)的天數(shù)；gmc：幾何平均濃度。研究1001描述于實(shí)施例3并且研究1002描述于實(shí)施例4。

表10為實(shí)施例3和4所述的研究期間在elispot測(cè)定中確定的細(xì)胞免疫應(yīng)答的匯總。

表10：在臨床研究中通過(guò)elispot測(cè)定的細(xì)胞免疫應(yīng)答的概況

數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為平均sfu/10⁶pbmc。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)應(yīng)答者的百分比指示在括號(hào)中；ad26：用ad26.zebov進(jìn)行免疫；mva：用mva-bn-filo進(jìn)行免疫；初免加強(qiáng)時(shí)間表指示在表頭中。0，14：初免與加強(qiáng)免疫之間的14天間隔；0，28：初免與加強(qiáng)免疫之間的28天間隔；0，56：初免與加強(qiáng)免疫之間的56天間隔；加強(qiáng)的天數(shù)；sfu：斑點(diǎn)形成單位；pbmc：外周血單核細(xì)胞。研究1001描述于實(shí)施例3并且研究1002描述于實(shí)施例4。

表11為實(shí)施例3和4所述的研究期間通過(guò)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(ics)確定的cd4+t細(xì)胞應(yīng)答的匯總。

表11：臨床研究中通過(guò)ics測(cè)定的cd4+t細(xì)胞免疫應(yīng)答的概況

數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為以％計(jì)的平均總體cd4+細(xì)胞因子應(yīng)答。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)應(yīng)答者的百分比指示在括號(hào)中；ad26：用ad26.zebov進(jìn)行免疫；mva：用mva-bn-filo進(jìn)行免疫；初免加強(qiáng)時(shí)間表指示在表頭中。0，14：初免與加強(qiáng)免疫之間的14天間隔；0，28：初免與加強(qiáng)免疫之間的28天間隔；0，56：初免與加強(qiáng)免疫之間的56天間隔；*：加強(qiáng)的天數(shù)。研究1001描述于實(shí)施例3并且研究1002描述于實(shí)施例4。

表12為實(shí)施例3和4所述的研究期間通過(guò)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(ics)確定的cd8+t細(xì)胞應(yīng)答的匯總。

表12：臨床研究中通過(guò)ics測(cè)定的cd8+t細(xì)胞免疫應(yīng)答的概況

數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為以％計(jì)的平均總體cd8+細(xì)胞因子應(yīng)答。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)應(yīng)答者的百分比指示在括號(hào)中；ad26：用ad26.zebov進(jìn)行免疫；mva：用mva-bn-filo進(jìn)行免疫；初免加強(qiáng)時(shí)間表指示在表頭中。0，14：初免與加強(qiáng)免疫之間的14天間隔；0，28：初免與加強(qiáng)免疫之間的28天間隔；0，56：初免與加強(qiáng)免疫之間的56天間隔；*：加強(qiáng)的天數(shù)。研究1001描述于實(shí)施例3并且研究1002描述于實(shí)施例4。

應(yīng)該理解本文所描述的實(shí)施例和實(shí)施方案僅出于說(shuō)明目的，并且將建議本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)它們進(jìn)行各種修改或變化，并且它們被包括在本申請(qǐng)的精神和范圍以及隨附權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。

序列表

seqidno:1

糖蛋白埃博拉扎伊爾病毒，mayinga病毒株(氨基酸序列)：

mgvtgilqlprdrfkrtsfflwviilfqrtfsiplgvihnstlqvsdvdklvcrdklsstnqlrsvglnlegngvatdvpsatkrwgfrsgvppkvvnyeagewaencynleikkpdgseclpaapdgirgfprcryvhkvsgtgpcagdfafhkegafflydrlastviyrgttfaegwaflilpqakkdffsshplrepvnatedpssgyysttiryqatgfgtneteylfevdnltyvqlesrftpqfllqlnetiytsgkrsnttgkliwkvnpeidttigewafwetkknltrkirseelsftvvsngaknisgqspartssdpgtntttedhkimasenssamvqvhsqgreaavshlttlatistspqslttkpgpdnsthntpvykldiseatqveqhhrrtdndstasdtpsattaagppkaentntskstdfldpatttspqnhsetagnnnthhqdtgeesassgklglitntiagvaglitggrrtrreaivnaqpkcnpnlhywttqdegaaiglawipyfgpaaegiyieglmhnqdglicglrqlanettqalqlflrattelrtfsilnrkaidfllqrwggtchilgpdcciephdwtknitdkidqiihdfvdktlpdqgdndnwwtgwrqwipagigvtgviiavialfcickfvf

seqidno：2

糖蛋白埃博拉蘇丹病毒，古盧病毒株(氨基酸序列)：

mgglsllqlprdkfrkssffvwviilfqkafsmplgvvtnstlevteidqlvckdhlastdqlksvglnlegsgvstdipsatkrwgfrsgvppkvvsyeagewaencynleikkpdgseclppppdgvrgfprcryvhkaqgtgpcpgdyafhkdgafflydrlastviyrgvnfaegviaflilakpketflqsppireavnytentssyyatsyleyeienfgaqhsttlfkidnntfvrldrphtpqflfqlndtihlhqqlsnttgrliwtldaninadigewafwenkknlseqlrgeelsfealslnetedddaassritkgrisdratrkysdlvpknspgmvplhipegettlpsqnstegrrvgvntqetitetaatiigtngnhmqistigirpsssqipssspttapspeaqtptthtsgpsvmateepttppgsspgptteaptlttpenittavktvlpqestsnglitstvtgilgslglrkrsrrqtntkatgkcnpnlhywtaqeqhnaagiawipyfgpgaegiyteglmhnqnalvcglrqlanettqalqlflrattelrtytilnrkaidfllrrwggtcrilgpdcciephdwtknitdkinqiihdfidnplpnqdnddnwwtgwrqwipagigitgiiiaiiallcvckllc

seqidno：3

糖蛋白馬爾堡安哥拉病毒(氨基酸序列)：

mkttcllisliliqgvktlpileiasniqpqnvdsvcsgtlqktedvhlmgftlsgqkvadspleaskrwafragvppknveytegeeaktcynisvtdpsgksllldpptnirdypkcktihhiqgqnphaqgialhlwgafflydriasttmyrgkvftegniaamivnktvhkmifsrqgqgyrhmnltstnkywtssngtqtndtgcfgtlqeynstknqtcapskkplplptahpevkltststdatklnttdpnsddedlttsgsgsgeqepyttsdaatkqglsstmpptpspqpstpqqggnntnhsqgvvtepgktnttaqpsmpphntttistnntskhnlstpsvpiqnatnyntqstapeneqtsapskttllptenpttakstnstksptttvpnttnkystspsptpnstaqhlvyfrrkrnilwregdmfpfldglinapidfdpvpntktifdessssgasaeedqhaspnisltlsyfpkvnentahsgenendcdaelriwsvqeddlaaglswipffgpgieglytagliknqnnlvcrlrrlanqtakslelllrvtteertfslinrhaidfllarwggtckvlgpdccigiedlsrniseqidqikkdeqkegtgwglggkwwtsdwgvltnlgillllsiavlialscicriftkyig

seqidno：4

糖蛋白馬爾堡莫索克病毒(氨基酸序列)：

mkttcflisliliqgtknlpileiasnnqpqnvdsvcsgtlqktedvhlmgftlsgqkvadspleaskrwafrtgvppknveytegeeaktcynisvtdpsgksllldpptnirdypkcktihhiqgqnphaqgialhlwgafflydriasttmyrgkvftegniaamivnktvhkmifsrqgqgyrhmnltstnkywtssngtqtndtgcfgalqeynstknqtcapskippplptarpeikltstptdatklnttdpssddedlatsgsgsgerephttsdavtkqglsstmpptpspqpstpqqggnntnhsqdavteldknnttaqpsmpphntttistnntskhnfstlsaplqnttndntqstiteneqtsapsittlpptgnpttakstsskkgpattapnttnehftsppptpsstaqhlvyfrrkrsilwregdmfpfldglinapidfdpvpntktifdessssgasaeedqhaspnisltlsyfpninentaysgenendcdaelriwsvqeddlaaglswipffgpgieglytavliknqnnlvcrlrrlanqtakslelllrvtteertfslinrhaidflltrwggtckvlgpdccigiedlskniseqidqikkdeqkegtgwglggkwwtsdwgvltnlgillllsiavlialscicriftkyig

seqidno：5

核蛋白埃博拉塔伊森林/象牙海岸病毒(氨基酸序列)：

mesrahkawmthtasgfetdyhkiltaglsvqqgivrqrviqvhqvtnleeicqliiqafeagvdfqesadsfllmlclhhayqgdykqflesnavkyleghgfrfevrkkegvkrleellpaassgksirrtlaampeeetteanagqflsfaslflpklvvgekaclekvqrqiqvhseqgliqyptawqsvghmmvifrlmrtnflikfllihqgmhmvaghdandaviansvaqarfsgllivktvldhilqktehgvrlhplartakvknevnsfkaalsslaqhgeyapfarllnlsgvnnlehglfpqlsaialgvatahgstlagvnvgeqyqqlreaateaekqlqkyaesreldhlglddqekkilkdfhqkkneisfqqttamvtlrkerlaklteaitstsllktgkqydddndipfpgpindnenseqqdddptdsqdttipdiivdpddgrynnygdypsetanapedlvlfdledgdeddhrpssssennnkhsltgtdsnktsnwnrnptnmpkkdstqnndnpaqraqeyardniqdtptphraltpiseetgsnghneddidsipplesdeenntettitttknttappapvyrsnsekeplpqeksqkqpnqvsgsentdnkphseqsveemyrhilqtqgpfdailyyymmteepivfstsdgkeyvypdslegehppwlsekealnednrfitmddqqfywpvmnhrnkfmailqhhk

序列表

<110>巴法里安諾迪克有限公司

詹森疫苗及預(yù)防私人有限公司.

美利堅(jiān)合眾國(guó),由健康及人類服務(wù)部部長(zhǎng)代表

<120>用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答的方法和組合物

<130>bn0088pct-ii

<150>us62/045,522

<151>2014-09-03

<150>us62/116,021

<151>2015-02-13

<150>us62/159,823

<151>2015-05-11

<150>us62/189,109

<151>2015-07-06

<160>5

<170>patentin3.5版

<210>1

<211>676

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>糖蛋白埃博拉扎伊爾病毒(ebolaviruszaire)，病毒株mayinga

<400>1

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151015

thrserphepheleutrpvalileileleupheglnargthrpheser

202530

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asplysleuvalcysargasplysleuserserthrasnglnleuarg

505560

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100105110

ilelyslysproaspglyserglucysleuproalaalaproaspgly

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tyrvalglnleugluserargphethrproglnpheleuleuglnleu

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leualatrpileprotyrpheglyproalaalagluglyiletyrile

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thrgluleuargthrpheserileleuasnarglysalaileaspphe

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leuleuglnargtrpglyglythrcyshisileleuglyproaspcys

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lysphevalphe

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<210>2

<211>676

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>糖蛋白埃博拉蘇丹病毒(ebolavirussudan)，病毒株古盧(gulu)

<400>2

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505560

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115120125

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290295300

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<213>人工序列

<220>

<223>糖蛋白馬爾堡安哥拉病毒(marburgvirusangola)

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<223>糖蛋白馬爾堡莫索克病毒(marburgvirusmusoke)

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asnthrthrthrileserthrasnasnthrserlyshisasnpheser

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proprothrglyasnprothrthralalysserthrserserlyslys

385390395400

glyproalathrthralaproasnthrthrasngluhisphethrser

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proproprothrproserserthralaglnhisleuvaltyrphearg

420425430

arglysargserileleutrparggluglyaspmetphepropheleu

435440445

aspglyleuileasnalaproileasppheaspprovalproasnthr

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485490495

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500505510

aspalagluleuargiletrpservalglngluaspaspleualaala

515520525

glyleusertrpileprophepheglyproglyilegluglyleutyr

530535540

thralavalleuilelysasnglnasnasnleuvalcysargleuarg

545550555560

argleualaasnglnthralalysserleugluleuleuleuargval

565570575

thrthrglugluargthrpheserleuileasnarghisalaileasp

580585590

pheleuleuthrargtrpglyglythrcyslysvalleuglyproasp

595600605

cyscysileglyilegluaspleuserlysasnilesergluglnile

610615620

aspglnilelyslysaspgluglnlysgluglythrglytrpglyleu

625630635640

glyglylystrptrpthrserasptrpglyvalleuthrasnleugly

645650655

ileleuleuleuleuserilealavalleuilealaleusercysile

660665670

cysargilephethrlystyrilegly

675680

<210>5

<211>739

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>核蛋白埃博拉塔伊森林/象牙海岸病毒(ebolavirustaiforest/ivorycoast)

<400>5

metgluserargalahislysalatrpmetthrhisthralasergly

151015

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202530

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leuglugluilecysglnleuileileglnalapheglualaglyval

505560

asppheglngluseralaaspserpheleuleumetleucysleuhis

65707580

hisalatyrglnglyasptyrlysglnpheleugluserasnalaval

859095

lystyrleugluglyhisglypheargphegluvalarglyslysglu

100105110

glyvallysargleuglugluleuleuproalaalaserserglylys

115120125

serileargargthrleualaalametprogluglugluthrthrglu

130135140

alaasnalaglyglnpheleuserphealaserleupheleuprolys

145150155160

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