本發(fā)明涉及構(gòu)建體，其包含(a)靶向性部分；(b)由衍生自登革熱病毒糖蛋白e的一個(gè)或多個(gè)融合序列組成的融合部分，所述融合序列包含序列drgwgngcglfgkggi(seqidno：1)或與seqidno：1相比顯示有1至8個(gè)取代、缺失或插入的序列；以及(c)待遞送至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子。此外，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體和任選的藥學(xué)上可接受的載體。此外，本發(fā)明涉及試劑盒，其包含衍生自登革熱病毒糖蛋白e的一個(gè)或多個(gè)融合序列，所述融合序列包含seqidno：1所示的序列或與seqidno：1相比顯示有1至8個(gè)取代、缺失或插入的序列。此外，本發(fā)明涉及衍生自登革熱病毒糖蛋白e的一種或多種融合序列用于將治療性部分、可檢測(cè)部分、核酸分子(優(yōu)選地是sirna)、載體分子(優(yōu)選地是納米顆粒、脂質(zhì)體和病毒載體)遞送進(jìn)入細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的用途。

在過去的十年中，核糖核酸酶a(rna酶a)超家族的成員已經(jīng)嶄露頭角，成為用于癌癥的抗體靶向治療的潛在新類型的效應(yīng)子化合物(newton等人，2001；delorenzo等人，2004；arndt等人，2005；chang等人，2010；liu等人，2014)。ranpirnase——一種來自北部豹蛙(ranapipiens)的rna酶——已作為抗腫瘤劑被廣泛研究。其能逃避人類rna酶抑制劑的作用(haigis等人，2003)，并通過降解t-rna抑制蛋白質(zhì)合成(saxena等人，2002)。此外，ranpirnase靶向在癌癥中受到異常調(diào)節(jié)的mirna和mirna前體，并因此特異性地中斷惡性細(xì)胞生長和腫瘤進(jìn)展所需的關(guān)鍵機(jī)制(goparaju等人，2011；qiao等人，2012)。盡管為兩棲起源，已經(jīng)顯示ranpirnase作為單一藥劑即使重復(fù)施用于癌癥患者時(shí)也未介導(dǎo)可觀的免疫原性(mikulski等人，1993；mikulski等人，2002)。先前已經(jīng)表明，通過使用化學(xué)綴合或與內(nèi)化抗體衍生物的遺傳融合來靶向遞送ranpirnase，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷的中度至數(shù)千倍增加(newton等人，2001；chang等人，2005；krauss等人，2005b；liu等人，2014)。ranpirnase經(jīng)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用而內(nèi)化，并且很可能從回收的內(nèi)體進(jìn)入細(xì)胞溶質(zhì)，這使其在rna酶a超家族成員中以細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸獨(dú)一無二(rodriguez等人，2007)。經(jīng)egfr內(nèi)化作用靶向遞送ranpirnase可導(dǎo)致具有內(nèi)體截留的不同的細(xì)胞內(nèi)途徑并在隨后發(fā)生在溶酶體或蛋白酶體的降解(sorkin和goh，2009)。據(jù)報(bào)道單體ranpirnase-抗-cd7scfv融合蛋白通過有效內(nèi)化后在內(nèi)體區(qū)室中積累。這樣，融合蛋白幾乎不顯示對(duì)表達(dá)cd7的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性，而當(dāng)通過蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染將免疫rna酶直接引入細(xì)胞溶質(zhì)時(shí)，觀察到強(qiáng)效細(xì)胞毒性(erickson等人，2006)。如果ranpirnase通過二硫鍵與cd7特異性抗體偶聯(lián)，則也能保持該免疫rna酶的細(xì)胞毒性。內(nèi)化后減少二硫鍵使得ranpirnase能夠進(jìn)入細(xì)胞溶質(zhì)并接近底物(erickson等人，2006)。

盡管許多不同的因素可能有助于不同免疫rna酶的顯著不同的細(xì)胞毒性特性，但是可以想象，對(duì)內(nèi)體截留的克服程度(erickson等人，2006)是rna酶接近細(xì)胞溶質(zhì)底物并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡的決定性因素之一。據(jù)報(bào)道，蛋白質(zhì)治療劑在內(nèi)溶酶體區(qū)室中被截留是功效損失或甚至喪失的主要原因(erickson等人，2006；pirie等人，2011)。

開發(fā)用于有效和特異性遞送靶向治療劑的方法在生物治療例如蛋白質(zhì)和基因治療中仍然是一個(gè)問題。任何生物制劑如dna、sirna和蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的主要吸收機(jī)制是內(nèi)吞途徑。細(xì)胞靶向試劑被截留在內(nèi)體中并將受到溶酶體中的特定酶的降解。因此，有效的基于生物的治療的先決條件是促進(jìn)內(nèi)體逃逸并確保治療劑在細(xì)胞溶質(zhì)內(nèi)的遞送。

已經(jīng)評(píng)估了不同的方法以克服靶向融合蛋白的內(nèi)體積累和溶酶體降解，例如，使用蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(snyder等人，2005)、滲漏誘導(dǎo)分子(weng等人，2012)或內(nèi)體膜的光誘導(dǎo)破壞(weyergang等人，2011)。在這些策略中，病毒蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域已被成功地用作分子載體，用于改善基于蛋白質(zhì)的治療劑的細(xì)胞溶質(zhì)遞送(chignola等人，1995；tolstikov等人，1997；hetzel等人，2008)。

近年來，包括病毒序列的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(ptd)已經(jīng)成功地被用于改善核糖核酸酶或基于毒素的免疫試劑的內(nèi)體逃逸和抗腫瘤活性(chignola等人，1995；hetzel等人，2008)?？梢匀菀椎赝ㄟ^重組dna技術(shù)將ptd并入融合蛋白中。

因此，研究者們已對(duì)來自不同來源的內(nèi)體逃逸劑進(jìn)行研究以促進(jìn)生物制劑的內(nèi)體逃逸。

基于蛋白質(zhì)和肽的試劑是內(nèi)體逃逸試劑的主要類型，其衍生于數(shù)種病毒、細(xì)菌、植物和人/動(dòng)物來源(也參見varkouhi等人，2011jcontr.release的綜述文章)。此外，重組dna技術(shù)已能夠生產(chǎn)具有精確組成、序列和長度的氨基酸重復(fù)區(qū)段的小分子量和大分子量多肽。此外，已經(jīng)應(yīng)用了化學(xué)試劑和光化學(xué)方法來破壞內(nèi)體膜。

病毒已進(jìn)化出幾種精細(xì)的機(jī)制，以克服進(jìn)入宿主細(xì)胞的障礙，因此是自然界中有效的膜穿透及內(nèi)體逃逸的優(yōu)秀實(shí)例。已有將病毒蛋白質(zhì)的小肽結(jié)構(gòu)域在抗體融合蛋白或抗體綴合物中用作蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域或細(xì)胞穿透肽。研究最廣泛的與膜有融合作用的病毒序列是來自hiv1轉(zhuǎn)錄激活蛋白tat的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域tat、來自乙型肝炎病毒表面抗原(tlm)的pres2結(jié)構(gòu)域的基序、hsv-1結(jié)構(gòu)蛋白vp22以及流感病毒的血凝素(ha)蛋白的ha2亞基的不同序列。

然而，融合蛋白的特異性可能會(huì)根據(jù)所使用的ptd有所減少，因?yàn)榇嬖诳梢越?jīng)由ptd的直接轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生進(jìn)入細(xì)胞的情況(bachran等人，2005)。因此，可觀察到靶外細(xì)胞毒性，即非特異性毒性(fuchs等人，2013)。

為了避免這些脫靶效應(yīng)，保持靶特異性是至關(guān)重要的。

因此，需要提供改進(jìn)的手段和方法將分子遞送到細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，從而提高需遞送到細(xì)胞質(zhì)的分子的效率。

驚人地，本發(fā)明證明源自登革熱病毒的融合序列可以用作連接細(xì)胞毒性部分與抗體部分的新連接子。該連接子含有糖蛋白e的推定融合肽的98-112號(hào)氨基酸殘基，其參與與內(nèi)體膜的融合，從而使得病毒核衣殼能夠釋放到細(xì)胞溶質(zhì)中(melo等人，2009；huang等人，2010；zaitseva等人，2010)。在本發(fā)明的實(shí)施例中，該融合肽已經(jīng)用于通過促進(jìn)ranpirnase有效被轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)溶膠中來特異性增強(qiáng)ranpirnase的細(xì)胞毒性。通過證明ranpirnase-den-scfv的細(xì)胞毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于缺乏融合連接子的ranpirnase-gs-scfv，本發(fā)明提供了證據(jù)，證明rna酶接近細(xì)胞溶質(zhì)底物是促進(jìn)抗腫瘤活性的關(guān)鍵步驟。

上述技術(shù)問題通過提供在權(quán)利要求中表征的實(shí)施方式得到解決。因此，本發(fā)明提供了構(gòu)建體，其包含(a)靶向性部分；(b)由衍生自登革熱病毒糖蛋白e的一個(gè)或多個(gè)融合序列組成的融合部分，所述融合序列包含序列drgwgngcglfgkggi(seqidno：1)或與seqidno：1相比顯示有1至8個(gè)取代、缺失或插入的序列；以及(c)待遞送到細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子。

令人驚訝的是，本發(fā)明證明衍生自登革熱病毒糖蛋白e的序列drgwgngcglfgkggi(seqidno：1)使得包含人源化抗egfrscfv和ranpirnase的免疫rna酶相比缺乏病毒序列的構(gòu)建體，其特異性細(xì)胞毒性有顯著改善，提高系數(shù)高達(dá)95，同時(shí)避免了脫靶效應(yīng)(非特異性細(xì)胞毒性)。

這尤其令人驚訝，因?yàn)閺钠洳《镜鞍椎奶烊槐尘爸袑?duì)特定序列進(jìn)行分離并且人工地在構(gòu)建體中進(jìn)行實(shí)施都是不可預(yù)測(cè)的，因?yàn)橥耆荒茴A(yù)測(cè)(i)相應(yīng)的病毒序列是否在發(fā)揮介導(dǎo)“內(nèi)體逃逸”的能力同時(shí)避免脫靶效應(yīng)，即避免產(chǎn)生非特異性細(xì)胞毒性。

然而，如上所述，解決了提供用于將分子遞送到細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，從而提高待遞送至細(xì)胞質(zhì)的分子的效率的改進(jìn)方式和方法的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建體，其包含(a)靶向性部分；(b)由衍生自登革熱病毒糖蛋白e的一個(gè)或多個(gè)融合序列組成的融合部分，所述融合序列包含序列drgwgngcglfgkggi(seqidno：1)或與seqidno：1相比顯示有1至8個(gè)取代、缺失或插入的序列；以及(c)待遞送到細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子。

本發(fā)明的構(gòu)建體優(yōu)選包含三個(gè)主要模塊，即靶向性部分；(b)由一個(gè)或多個(gè)融合序列組成的融合部分以及(c)待遞送到細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子(即，“貨物”)。然而，還可以設(shè)想，該構(gòu)建體也可以缺少這三個(gè)模塊中的一個(gè)。因此，如下文進(jìn)一步解釋的，構(gòu)建體還可缺少待遞送到細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子，因?yàn)榭梢韵胂蟀邢蛐圆糠直旧泶怼柏浳铩保礊閷⒁f送到細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子。因此，在這種情況下，構(gòu)建體僅包含兩個(gè)主要模塊，即靶向性部分；以及(b)由一個(gè)或多個(gè)融合序列組成的融合部分。

構(gòu)建體的一個(gè)模塊，即“靶向性部分”涉及能夠?qū)⑺B接的分子特異性遞送至給定細(xì)胞類型的分子，并且優(yōu)選能夠與給定標(biāo)記物(優(yōu)選為與該細(xì)胞類型相關(guān)抗原)結(jié)合。因此，“靶向性部分”能夠特異性地檢測(cè)并結(jié)合至其靶標(biāo)，即在特定的靶細(xì)胞中特異發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞表面上的給定(標(biāo)記物)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明關(guān)于“靶向性部分”不受限制，因?yàn)榘邢蛐圆糠值男再|(zhì)取決于“貨物”待遞送到其細(xì)胞質(zhì)中的期望細(xì)胞。因此，如下，進(jìn)一步地，僅給出靶向性部分的非限制性實(shí)例。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解對(duì)于給定細(xì)胞特異的“靶向性部分”(或相應(yīng)的抗原)是什么。對(duì)細(xì)胞特異是指特定靶向性部分(或相應(yīng)的抗原)專門地或至少主要地存在于給定(靶)細(xì)胞上，而其不存在于其它細(xì)胞上。

構(gòu)建體的第二個(gè)模塊，即由融合序列組成的融合部分是促進(jìn)膜穿透和內(nèi)體逃逸并由此介導(dǎo)給定分子從內(nèi)體釋放進(jìn)入細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)的部分或序列。

構(gòu)建體的第三個(gè)模塊，即“貨物”或待遞送到細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子可以是任何所需的分子，例如不是天然發(fā)生/存在于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。因此，可以使用任何可想像到的“貨物”，只要是期望將該分子導(dǎo)入某個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。因此，本發(fā)明不限于某類“貨物”，因此，下面進(jìn)一步提供的僅為非限制性實(shí)例。

構(gòu)建體可以以融合蛋白的形式存在，即通過表達(dá)由組合至少兩種基因序列制備的雜交基因而形成的蛋白質(zhì)。通常，如將在下文進(jìn)一步更詳細(xì)地解釋的，可通過將cdna與現(xiàn)有基因同框克隆到表達(dá)載體中來實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。因此，構(gòu)建體可以是融合蛋白，即通過在一個(gè)模塊的氨基末端和另一個(gè)分子的羧基末端之間的肽鍵連接兩個(gè)或更多個(gè)多肽而形成的嵌合分子。以這種方式，上述至少兩個(gè)模塊，優(yōu)選所有三個(gè)模塊以融合蛋白的形式連接在一起，只要所述至少兩個(gè)模塊，優(yōu)選地三個(gè)模塊是蛋白質(zhì)性質(zhì)的即可。一旦被克隆至閱讀框內(nèi)，即可通過編碼所述融合蛋白的相應(yīng)核酸序列來重組表達(dá)該融合蛋白。

備選地，所述至少兩個(gè)模塊，優(yōu)選地所有三個(gè)模塊也可以通過化學(xué)綴合物共價(jià)偶聯(lián)。因此，構(gòu)建體的模塊可以以共價(jià)鍵而化學(xué)偶聯(lián)。

還可以想像，兩個(gè)模塊以融合蛋白的形式，而第三個(gè)模塊以共價(jià)鍵而化學(xué)偶聯(lián)。具體而言，在“貨物”非蛋白質(zhì)性質(zhì)的情況下，其通過共價(jià)鍵與模塊(a)和模塊(b)化學(xué)偶聯(lián)。

綴合物內(nèi)的三個(gè)模塊的排列沒有具體限制。因此，融合部分/融合序列(b)可以位于靶向性部分(a)和待遞送至細(xì)胞質(zhì)的分子(即“貨物”)(c)之間。然而，本發(fā)明的融合部分/融合序列也可能在其它位置。因此，融合部分/融合序列也可以位于任一端(即融合蛋白的情況下在n-或c-末端)。因此，構(gòu)建體可具有(b)-(c)-(a)或(b)-(a)-(c)或(c)-(a)-(b)或(c)-(b)-(a)的排列。因此，模塊(c)、(a)和(b)可分別位于其他模塊(b)和(a)，(b)和(c)，(c)和(b)以及(c)和(a)之間。然而，優(yōu)選地，所述融合部分/融合序列位于靶向性部分(a)和將遞送至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子(c)之間，并因此，構(gòu)建體可以具有(a)-(b)-(c)或(c)-(b)-(a)的排列。

構(gòu)建體還可以缺少靶向性部分。因此，在這樣的構(gòu)建體中，融合部分/融合序列可以直接融合(或以共價(jià)鍵化學(xué)偶聯(lián))至待遞送到細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子。融合部分/融合序列的定位可以在任一端。

如上所述，構(gòu)建體還可缺少“貨物”，即待遞送至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)的分子，因?yàn)榘邢蛐圆糠肿陨砜梢酝瑫r(shí)是待遞送至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)的分子。因此，在這樣的構(gòu)建體中，融合部分/融合序列可以直接融合(或以共價(jià)鍵化學(xué)偶聯(lián))至靶向性部分。在這種情況下，靶向性部分優(yōu)選是下文進(jìn)一步定義的抗體或抗原結(jié)合片段。融合部分/融合序列的定位可以在任一端。

本發(fā)明構(gòu)建體的主要模塊是由一個(gè)或多個(gè)融合序列組成的靶向性部分，所述融合序列衍生自登革熱病毒糖蛋白e并且包含氨基酸序列drgwgngcglfgkggi(seqidno：1)。

“一個(gè)或多個(gè)”是指靶向性部分可以具有本發(fā)明的一個(gè)融合序列。靶向性部分還可以具有本發(fā)明的兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)融合序列。備選地，靶向性部分還可以具有本發(fā)明的5個(gè)或甚至更多個(gè)融合序列。

登革熱病毒糖蛋白e血清型2的全長序列是本領(lǐng)域已知的，并且具有如seqidno：21所示的序列。在所附實(shí)施例中雖然已使用的是登革熱病毒糖蛋白e血清型2的96至114號(hào)氨基酸序列(即，氨基酸序列mvdrgwgngcglfgkggiv(seqidno：3))，但本發(fā)明的融合序列至少包含登革熱病毒糖蛋白e血清型2的糖蛋白e的98至113號(hào)氨基酸核心區(qū)，即氨基酸序列drgwgngcglfgkggi(seqidno：1)。然而，優(yōu)選地，衍生自登革熱病毒糖蛋白e的融合序列包含氨基酸序列mvdrgwgngcglfgkggiv(seqidno：3)。

然而，本發(fā)明中使用的融合序列不具體限于上述特定序列，也可以是這樣的融合序列，其包含與seqidno：1相比顯示有1至8個(gè)取代、缺失或插入的序列。備選地，融合序列還可以是這樣的序列，其包含與seqidno：3相比顯示有1至8個(gè)取代、缺失或插入的序列。融合序列還可以是這樣的序列，其包含與seqidno：1(或seqidno：3)相比顯示有1至7個(gè)取代、缺失或插入的序列。融合序列還可以是這樣的序列，其包含與seqidno：1(或seqidno：3)相比顯示有1至6個(gè)取代、缺失或插入的序列。融合序列還可以是這樣的序列，其包含與seqidno：1(或seqidno：3)相比顯示有1至5個(gè)取代、缺失或插入的序列。融合序列還可以是這樣的序列，其包含與seqidno：1(或seqidno：3)相比顯示有1至4個(gè)取代、缺失或插入的序列。融合序列還可以是這樣的序列，其包含與seqidno：1(或seqidno：3)相比顯示有1至3個(gè)取代、缺失或插入的序列。融合序列還可以是這樣的序列，其包含與seqidno：1(或seqidno：3)相比顯示有1至2個(gè)取代、缺失或插入的序列。最優(yōu)選地，融合序列還可以是這樣的序列，其包含與seqidno：1(或seqidno：3)相比顯示有1個(gè)取代、缺失或插入的序列。

優(yōu)選地，與seqidno：1(或seqidno：3)相比，上述氨基酸取代、缺失或插入的位置在(a)seqidno：1(或seqidno：3)序列中與其它黃病毒科(flaviviridae)家族成員對(duì)應(yīng)登革熱病毒糖蛋白e序列的序列相比不那么保守的位置。已知本發(fā)明的序列在黃病毒科的成員中是高度保守的。

為了確定某一氨基酸位置是否較不保守，并能因此優(yōu)選受到如上所述的修飾，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用本領(lǐng)域熟知的方式和方法，例如，手動(dòng)或通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行比對(duì)。這種比對(duì)可以例如使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式和方法進(jìn)行，例如，通過使用已知的計(jì)算機(jī)算法如lipman-pearson方法(science227(1985)，1435)或clustal算法。優(yōu)選地，在這種比對(duì)中，為氨基酸序列中存在的保守氨基酸殘基分配最大同源性。優(yōu)選地，使用clustalw2進(jìn)行氨基酸序列的比較。在成對(duì)比較/比對(duì)的情況下，優(yōu)選地選擇以下設(shè)置：蛋白質(zhì)重量矩陣：blosum62；缺口打開：10；缺口延伸：0.1。在多重比較/比對(duì)的情況下，優(yōu)選地選擇以下設(shè)置：蛋白質(zhì)重量矩陣：blosum62；缺口打開：10；缺口延伸：0.2；缺口距離：5；無末端缺口。

那些被證明是“同一的”(即，在黃病毒科的成員中“保守的”)的位置優(yōu)選地不進(jìn)行取代、缺失或插入。根據(jù)本發(fā)明，在兩個(gè)或更多個(gè)核酸或氨基酸序列的情況中，術(shù)語“同一的”或“百分比同一性”是指兩個(gè)或更多個(gè)序列或子序列，它們是相同的，或它們具有指定百分比的氨基酸殘基或核苷酸與seqidno：1或seqidno：3中相同。優(yōu)選地，所描述的同一性存在于至少約19個(gè)氨基酸(即，上述登革熱病毒糖蛋白e血清型2的96至114號(hào)氨基酸)的區(qū)域(即，氨基酸序列mvdrgwgngcglfgkggiv(seqidno：3))或至少約16個(gè)氨基酸的區(qū)域(即，上述登革熱病毒糖蛋白e血清型2的糖蛋白e的98至113號(hào)氨基酸核心區(qū)域，即氨基酸序列drgwgngcglfgkggi(seqidno：1)中。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道如何使用例如基于本領(lǐng)域已知的clustalw計(jì)算機(jī)程序或fastdb(brutlagcomp.app.biosci.6(1990)，237-245)的算法來確定序列之間的百分比同一性(thompsonnucl.acidsres.2(1994)，4673-4680)。

盡管fastdb算法在其計(jì)算中通常不考慮序列中的內(nèi)部不匹配缺失或添加，即缺口，但是可以手動(dòng)校正以避免高估同一性％。然而，clustalw在其同一性計(jì)算中會(huì)考慮序列缺口。blast和blast2.0算法也是對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員開放的(altschul，(1997)nucl.acidsres.25：3389-3402；altschul(1993)j.mol.evol.36：290-300；altschul(1990)j.mol.biol.215：403-410)。用于核酸序列的blastn程序默認(rèn)使用字長(w)11，期望值(e)10，m＝5，n＝4并兩條鏈都進(jìn)行比較。對(duì)于氨基酸序列，blastp程序默認(rèn)使用字長(w)3，期望值(e)10。blosum62評(píng)分矩陣(henikoff(1989)pnas89：10915)使用比對(duì)(b)50，期望值(e)10，m＝5，n＝4，并默認(rèn)兩條鏈都進(jìn)行比較。

優(yōu)選地，參比seqidno:1和3的序列的上述多至1、2、3、4、5、6、7或8個(gè)氨基酸取代為保守氨基酸取代。

這些“保守性氨基酸取代”是指蛋白質(zhì)中氨基酸被具有相似特征(例如電荷，側(cè)鏈大小，疏水性/親水性，骨架構(gòu)象和剛性等)的其它氨基酸的取代，這樣可以經(jīng)常作出變化而不改變蛋白質(zhì)的生物活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，一般而言，多肽的非必需區(qū)域中的單個(gè)氨基酸的取代基本上不改變生物活性(參見例如watsonmolecularbiologyofthegene，thebenjamin/cummingspub.co.4thed.(1987),224)。另外，結(jié)構(gòu)上或功能上相似的氨基酸的取代更不會(huì)破壞生物學(xué)活性。在本發(fā)明的上下文中，本發(fā)明的融合序列包含這樣的多肽鏈，其序列當(dāng)與本文所公開的特定氨基酸序列例如seqidno：1或seqidno：3相比較時(shí)，包括至多0(無改變)、1、2、3、4、5、6、7或8個(gè)保守氨基酸取代。

根據(jù)如下表1所示的那些優(yōu)選地制備這樣的示例性取代：

表1

示例性保守氨基酸取代

與seqidno：1(或seqidno：3)相比具有一個(gè)或多個(gè)上述取代、缺失或插入的融合序列可以產(chǎn)生具有(在融合性質(zhì)方面)相似能力的融合序列，優(yōu)選具有比seqidno：1(或seqidno：3)更高的能力。與seqidno：1(或seqidno：3)相比的給定修飾的融合序列的特性/能力可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過本領(lǐng)域已知的并在所附實(shí)施例中概述的方法容易地確定。因此，與seqidno：1(或seqidno：3)相比的給定修飾的融合序列的(融合)特性/能力涉及某一具體序列的活性，以具有能力來介導(dǎo)“內(nèi)體逃逸”(即促進(jìn)融合序列以允許膜穿透和內(nèi)體逃逸，并因此調(diào)節(jié)給定分子從內(nèi)體向細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的釋放)，同時(shí)避免/減少脫靶效應(yīng)，即，非特異性細(xì)胞毒性?！皟?nèi)體逃逸”和“非特異性細(xì)胞毒性”可以例如通過所附實(shí)施例中描述的并在下文概述的方法進(jìn)行測(cè)定。

具有細(xì)胞毒性性質(zhì)的靶蛋白的內(nèi)體逃逸效率可以通過細(xì)胞活力測(cè)定來確定。使用該測(cè)定，可以測(cè)定使細(xì)胞活力降低50％所需的、包含融合序列(例如，免疫rnase融合蛋白)的靶蛋白的濃度(ic50)，并與缺乏融合序列的對(duì)照靶蛋白的ic50進(jìn)行比較。為此，將靶細(xì)胞接種在96孔平底板中并與不同濃度的靶蛋白或緩沖液(作為對(duì)照)在37℃，5％co2溫育72小時(shí)，總體積為100μl?？梢岳缤ㄟ^加入20μl的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(mtt)溶液(稀釋于pbs，5mg/ml)來測(cè)定細(xì)胞活力。在37℃，5％co2與mtt孵育4小時(shí)后，除去培養(yǎng)基并將細(xì)胞在每孔100μl裂解溶液(10％sds(w/v)和0.6％乙酸(v/v)亞砜)中裂解。將平板在室溫下溫育5分鐘，然后溫和攪拌5分鐘以溶解釋放的甲瓚晶體。通過使用酶標(biāo)儀(例如infinitef200protecan)測(cè)量570nm處的吸光度(620nm作為參考)來確定甲瓚濃度。備選地，可以通過每孔加入10μl的(thermoscientific，rockford，il，usa)并在37℃，5％co2孵育4小時(shí)，無需隨后的細(xì)胞裂解，來測(cè)定細(xì)胞活力?？梢灾苯訙y(cè)量吸光度，使用與mtt處理的細(xì)胞所用的相同的波長和儀器。細(xì)胞活力表示為用靶蛋白質(zhì)處理的活細(xì)胞相比用緩沖液對(duì)照處理的活細(xì)胞的百分比。因此，在上述測(cè)定中確定的細(xì)胞活力可作為確定給定融合序列的特性/能力的讀數(shù)。推定的融合序列具有與seqidno：1(或seqidno：3)相似的(在融合特性上的)能力，優(yōu)選如果與缺乏對(duì)應(yīng)(推定)融合序列的相應(yīng)對(duì)照融合蛋白相比，細(xì)胞活力得到減少，則其具有比seqidno：1(或seqidno：3)的更高能力。

可使用上文描述的細(xì)胞活力測(cè)定證明針對(duì)非靶細(xì)胞(例如抗原陰性細(xì)胞)的非特異性細(xì)胞毒性。

然而，本發(fā)明中使用的融合序列不具體受限于上述特定序列和上述缺失、取代或插入，而是還可涉及融合序列，其包含與seqidno：1或seqidno：3相比顯示有氨基酸添加的序列。氨基酸的添加可以在兩側(cè)或可以散在分布。因此，添加的氨基酸可以添加至本發(fā)明的融合序列的n-和/或c-末端。備選地，或除了這些在兩側(cè)添加的氨基酸之外，所添加的氨基酸也可以在本發(fā)明的融合序列的氨基酸序列內(nèi)。所添加的氨基酸包含多至0個(gè)(無變化)、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸，優(yōu)選多至20個(gè)氨基酸或甚至更優(yōu)選多至30個(gè)氨基酸的多肽鏈。鑒于氨基酸的添加不大可能改變本發(fā)明融合序列的上述功能特性的要求，氨基酸的添加長度也可以多至40、50、60、70、80、90或甚至100個(gè)氨基酸或甚至更多，多至200、300、400或500個(gè)氨基酸，只要這些序列具有與seqidno：1(或seqidno：3)相似的(在融合性上的)能力，優(yōu)選具有比如上定義的seqidno：1(或seqidno：3)更高的能力。

在根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體中，所述融合序列自以下序列構(gòu)成的組：

drgwgngcglfgkgsi(seqidno:5)；

drgwgngcglfgkgsl(seqidno:6)；

drgwgngcglfgkggv(seqidno:7)；

drgwhngcglfgkgsi(seqidno:8)；

drgwhngcgffgkgsi(seqidno:9)；

drgwgngcglfgkgsm(seqidno:10)；

drgwgngcglfgkgsy(seqidno:11)；

drgwnngcglfgkgsl(seqidno:12)；

nrgwnngcglfgkgdi(seqidno:13)；

drgwgnhcglfgkgsi(seqidno:14)；

drgwgnncglfgkgsi(seqidno:15)；

drgwgngcalfgkgsi(seqidno:16)；

drgwgnhcgffgkgsi(seqidno:17)；

drgwdsgcfifgkgev(seqidno:18)；

nrgwgtgcfkwgigfv(seqidno:19)及

nrgwgtgcfewglgqv(seqidno:20)。

然而，用于本發(fā)明的融合序列不具體受限于上述seqidno：5至20的特定序列，也可以是融合序列，其包含與seqidno：5至20相比分別顯示有1至8個(gè)取代、缺失或插入的序列。在這方面，在取代、缺失或插入的程度上，如上文已經(jīng)關(guān)于seqidno：1和seqidno：3所述的內(nèi)容加以必要的修改同樣適用于seqidno：5至20。此外，融合序列不限于上述seqidno：5至20，還可涉及融合序列，其包含與所述序列相比顯示有氨基酸添加的序列。在這方面，關(guān)于所述氨基酸的添加，如上文已針對(duì)seqidno：1和seqidno：3所述的內(nèi)容加以必要的修改同樣適用。

本發(fā)明的融合序列可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法重組產(chǎn)生或合成。更具體地，如下文進(jìn)一步描述的，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法重組產(chǎn)生本發(fā)明的融合肽，或者可以例如使用固相支持物和重復(fù)正交去保護(hù)并偶聯(lián)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)方便地在自動(dòng)肽合成儀中合成。將后續(xù)用于進(jìn)行部分或其它試劑的綴合的肽的游離氨基用標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基如boc基團(tuán)將其保護(hù)是有利的，而n-末端殘基可以被乙酰化以增加血清穩(wěn)定性。這些保護(hù)基團(tuán)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的；參見greeneandwutsprotectivegroupsinorganicsynthesis，1999(johnwileyandsons，n.y.)。當(dāng)制備肽后續(xù)用于本發(fā)明構(gòu)建體中，有利地是將其從樹脂上裂解以產(chǎn)生相應(yīng)的c-末端酰胺，以抑制體內(nèi)羧肽酶活性。

如上文提到的，構(gòu)建體的一個(gè)模塊，即“靶向性部分”涉及能夠?qū)⑦B接的分子特異性遞送至給定細(xì)胞類型并且優(yōu)選能夠與給定標(biāo)記物(優(yōu)選)結(jié)合的分子，所述標(biāo)記物與該細(xì)胞類型相關(guān)。因此，“靶向性部分”能夠特異性地檢測(cè)并結(jié)合其靶標(biāo)，即，在特定的靶細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞表面的給定(標(biāo)記物)結(jié)構(gòu)。

如在本發(fā)明的上下文中使用的術(shù)語“結(jié)合至”定義為至少兩個(gè)“抗原相互作用位點(diǎn)”彼此的結(jié)合(相互作用)，即一方面是靶向性部分，另一方面是細(xì)胞表面上的相應(yīng)的抗原或表位。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“抗原相互作用位點(diǎn)”定義為靶向性部分的基序，優(yōu)選為抗體或抗體片段的一部分或者細(xì)胞因子或配體，其顯示與待靶向的細(xì)胞的特異性抗原或抗原的特異性基團(tuán)的能力。所述結(jié)合/相互作用也被理解為定義了“特異性識(shí)別”。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“特異性識(shí)別”是指靶向性部分能夠與待靶向的細(xì)胞特異的至少一種表面結(jié)構(gòu)特異性相互作用和/或結(jié)合。靶向性部分可以與待靶向的細(xì)胞上的(一個(gè)或多個(gè))表位相互作用和/或結(jié)合，同時(shí)該結(jié)構(gòu)、抗原或表位對(duì)于待靶向的細(xì)胞是特異性的。術(shù)語“特異性識(shí)別”涉及靶向性部分的特異性，即涉及其區(qū)分待靶向的細(xì)胞和不靶向的細(xì)胞的特定區(qū)域的能力，因此，不靶向的細(xì)胞不會(huì)具有特異于待靶向的細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、抗原或表位。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解并且可以得到對(duì)于某些細(xì)胞是特異性的并且不存在于非靶細(xì)胞上的結(jié)構(gòu)、表位、表面標(biāo)志物和/或抗原，并且可以相應(yīng)地容易地選擇靶標(biāo)。下面進(jìn)一步給出非限制性實(shí)例。

根據(jù)本發(fā)明使用的術(shù)語“特異性相互作用”是指靶向性部分不與或基本上不與相似結(jié)構(gòu)的(多)肽、結(jié)構(gòu)、表位、表面標(biāo)記物和/或抗原交叉反應(yīng)。

可以例如通過在常規(guī)條件下評(píng)估所述靶向性部分對(duì)目標(biāo)結(jié)構(gòu)及多個(gè)或更多或更少(在結(jié)構(gòu)上和/或功能上)密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)的結(jié)合來測(cè)試研究中的一組靶向性部分的交叉反應(yīng)性(參見例如harlow和lane，antibodies：alaboratorymanual，coldspringharborlaboratorypress，(1988)和usingantibodies：alaboratorymanual，coldspringharborlaboratorypress，(1999))。只有那些結(jié)合至待靶向的細(xì)胞的某些選定結(jié)構(gòu)(即，對(duì)所述細(xì)胞是特異性的結(jié)構(gòu))，但不會(huì)或基本上不會(huì)結(jié)合任何其它結(jié)構(gòu)的靶向性部分被認(rèn)為是特異于所述目的細(xì)胞并被選擇。這些方法尤其可以包括結(jié)合研究，用結(jié)構(gòu)上和/或功能上密切相關(guān)的分子進(jìn)行封閉和競(jìng)爭(zhēng)研究。這些結(jié)合研究還包含facs分析、表面等離子體共振(spr，例如用)、分析型超速離心、等溫滴定量熱法、熒光各向異性、熒光光譜或通過放射性標(biāo)記的配體結(jié)合測(cè)定。

術(shù)語“結(jié)合至”不僅涉及線性結(jié)構(gòu)，例如線性表位，而且還涉及構(gòu)象表位、結(jié)構(gòu)表位或由人靶分子或其部分的兩個(gè)區(qū)域組成的不連續(xù)表位。在本發(fā)明的上下文中，構(gòu)象表位由在一級(jí)序列中分開的兩個(gè)或更多個(gè)不連續(xù)的氨基酸序列限定，當(dāng)多肽折疊成天然蛋白質(zhì)時(shí)，這些氨基酸在分子表面聚到一起(sela，science166(1969)，1365和laver，cell61(1990)，553-536)。此外，術(shù)語“結(jié)合至”在本發(fā)明的上下文中與術(shù)語“與...相互作用”或“識(shí)別”可交換使用。

因此，可以通過本領(lǐng)域已知的方法和本文所述的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)確定特異性。所述方法包括但不限于western印跡、elisa-、ria-、ecl-、irma-測(cè)試和肽掃描。

如上文提到的，本發(fā)明不限于“靶向性部分”，因?yàn)榘邢蛐圆糠值男再|(zhì)取決于要將“貨物”遞送至其細(xì)胞質(zhì)的所需細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解特異于給定細(xì)胞的“靶向性部分”或抗原。與上文一致，特異于某個(gè)細(xì)胞是指某個(gè)靶向性部分或抗原專門地或至少主要地存在于給定(靶)細(xì)胞上，而它不存在于其它細(xì)胞上。

因此，在根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體中，靶向性部分可以是抗體、抗體片段、設(shè)計(jì)的錨蛋白重復(fù)序列蛋白(darpin)、細(xì)胞因子或配體。

在本發(fā)明的上下文中的配體可以是某些細(xì)胞表面分子或結(jié)構(gòu)(優(yōu)選細(xì)胞表面受體(膜受體，跨膜受體))的對(duì)應(yīng)物，即通常參與特定細(xì)胞和外界通訊的專門的整合膜蛋白質(zhì)。細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)分子(即細(xì)胞表面受體的相應(yīng)配體，通常是激素、神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子、生長因子或細(xì)胞識(shí)別分子)與受體結(jié)合，觸發(fā)細(xì)胞功能的變化。這個(gè)過程稱為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。所述結(jié)合在膜的細(xì)胞內(nèi)側(cè)觸發(fā)化學(xué)變化。以這種方式，受體在細(xì)胞通訊和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮獨(dú)特和重要的作用。許多細(xì)胞表面受體對(duì)某種類型的細(xì)胞或細(xì)胞亞群是特異的，因此，就本發(fā)明而言，相應(yīng)的配體可以是用于特異性靶向特定細(xì)胞的合適的靶向性部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知特異于給定細(xì)胞的配體，并且可以基于所要靶向的所需細(xì)胞選擇某種配體。配體的氨基酸序列是本領(lǐng)域公知的，且任何這樣的已知序列都可以在本發(fā)明的上下文中用作靶向性部分。技術(shù)人員了解關(guān)于配體序列的眾多公共信息資源。例如，ncbi數(shù)據(jù)庫含有大量配體的蛋白質(zhì)和編碼核酸序列。對(duì)于技術(shù)人員而言，選擇和鑒定基本上適用于任何目的配體的氨基酸和/或核酸序列并將其用作根據(jù)本發(fā)明的靶向性部分是常規(guī)問題。

特異性配體可以是例如細(xì)胞因子。細(xì)胞因子是在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中重要的一類范圍廣泛和寬松的小蛋白質(zhì)它們由細(xì)胞釋放并影響其他細(xì)胞的行為，有時(shí)影響釋放細(xì)胞本身。細(xì)胞因子包括趨化因子、干擾素、白細(xì)胞介素、淋巴因子、腫瘤壞死因子，但通常不是激素或生長因子。細(xì)胞因子由廣泛的細(xì)胞產(chǎn)生，包括免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、b淋巴細(xì)胞、t淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞，以及內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和多種基底細(xì)胞；給定的細(xì)胞因子可以由多于一種類型的細(xì)胞產(chǎn)生。它們通過特異于給定細(xì)胞，某種類型的細(xì)胞或細(xì)胞亞群的相應(yīng)細(xì)胞因子受體起作用，因此，就本發(fā)明而言，根據(jù)上述要求，所述相應(yīng)的細(xì)胞因子可以是適于特異性靶向特定細(xì)胞的靶向性部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解特異于給定細(xì)胞的細(xì)胞因子，并且可以基于所要靶向的所需細(xì)胞選擇某種細(xì)胞因子。細(xì)胞因子的氨基酸序列是本領(lǐng)域公知的，且任何所述已知序列都可以在本發(fā)明的上下文中用作靶向性部分。技術(shù)人員了解關(guān)于細(xì)胞因子序列的大量公共信息資源。例如，ncbi數(shù)據(jù)庫包含大量細(xì)胞因子的蛋白質(zhì)和編碼核酸序列。對(duì)于技術(shù)人員而言，選擇和鑒定基本上適用于任何目的配體的氨基酸和/或核酸序列并將其用作根據(jù)本發(fā)明的靶向性部分是常規(guī)問題。不受理論的束縛，細(xì)胞因子的非限制性實(shí)例包括淋巴因子、單核因子、生長因子和傳統(tǒng)的多肽激素。細(xì)胞因子包括生長激素，例如人生長激素、n-甲硫氨酰基人生長激素和牛生長激素；甲狀旁腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素如促卵泡激素(fsh)、促甲狀腺激素(tsh)和黃體生成素(lh)；胎盤生長因子(plgf)、肝生長因子；前列腺素、成纖維細(xì)胞生長因子；催乳素；胎盤催乳素、ob蛋白；腫瘤壞死因子-α和-β；麻疹抑制物質(zhì)；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；激活素；血管內(nèi)皮生長因子；整合素；血小板生成素(tpo)；神經(jīng)生長因子如ngf-β；血小板生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子(tgf)如tgf-α和tgf-β；胰島素樣生長因子-i和-ii；紅細(xì)胞生成素(epo)；骨誘導(dǎo)因子；干擾素如干擾素-α、-β、-γ和-λ；集落刺激因子(csf)如巨噬細(xì)胞-csf(m-csf)；白介素(il)如il-1、il-1α、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12；il-13、il-14、il-15、il-16、il-17、il-18、il-21、il-25、lif、kit配體或flt-3、血管抑素、血小板反應(yīng)蛋白質(zhì)、內(nèi)皮抑制素、腫瘤壞死因子(tnf、例如tnf-α)和lt。細(xì)胞因子可以是ifn-α2b。

如所提到的，靶向性部分也可以為特異性抗體或抗體片段。

術(shù)語抗體或抗體片段是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，也稱為免疫球蛋白(ig)，其是由漿細(xì)胞產(chǎn)生的大y形蛋白，通常由免疫系統(tǒng)用于鑒別并中和外來物體如細(xì)菌和病毒?？贵w識(shí)別外來靶標(biāo)的獨(dú)特部分，稱為抗原。抗體的“y”的每個(gè)末端都包含對(duì)抗原上的一個(gè)特定表位特異的互補(bǔ)位(類似鎖結(jié)構(gòu))，允許這兩個(gè)結(jié)構(gòu)精確地結(jié)合在一起。因此，鑒于這種特異性，就本發(fā)明而言，抗體或抗體片段是最優(yōu)選的靶向性部分，因?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地制備對(duì)待靶向的給定細(xì)胞上的特定結(jié)構(gòu)/抗原/表位具有高度特異性的抗體或抗體片段。抗體是屬于免疫球蛋白超家族的糖蛋白。抗體通常由基本結(jié)構(gòu)單元形成，每個(gè)單元都具有兩個(gè)大的重鏈和兩個(gè)小的輕鏈。技術(shù)人員已知存在幾種不同類型的抗體重鏈和幾種不同種類的抗體，基于它們具有的重鏈將其分為不同的同種型。在哺乳動(dòng)物中已知五種不同的抗體同種型，其執(zhí)行不同的作用，并且有助于對(duì)其遇到的每種不同類型的異物誘導(dǎo)適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答。

盡管所有抗體的通用結(jié)構(gòu)是非常類似的，但這些蛋白質(zhì)尖端的一小片區(qū)域是極度可變的，這樣可存在數(shù)百萬種抗體，其僅僅是尖端結(jié)構(gòu)或抗原結(jié)合位點(diǎn)有輕微不同。此區(qū)域被稱為超變區(qū)。這些變體中的每個(gè)都可以結(jié)合不同的抗原?？贵w的這種巨大的可變性使得免疫系統(tǒng)能識(shí)別具有相同可變性的大量抗原并可在本發(fā)明的條件下用于制備能足夠特異地靶向所需靶細(xì)胞的特異性抗體或抗體片段。這種針對(duì)幾乎待靶向的細(xì)胞上任何可能的(特異性)結(jié)構(gòu)生成可能的抗體或抗體片段的能力使抗體或抗體片段成為本發(fā)明條件下用作靶向性部分的最好選擇。因此，由于這個(gè)原因，本發(fā)明的靶向性部分可以為抗體或抗體片段，用于將待遞送至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)的分子的靶向遞送。

用于本發(fā)明上下文中的抗體或其片段沒有具體限制，只要其是能夠特異性結(jié)合或特異性識(shí)別根據(jù)前述的待靶向細(xì)胞表面的結(jié)構(gòu)，或與其相互作用的抗體或其抗原結(jié)合片段即可。

用作靶向性部分的抗體或其抗原結(jié)合片段可以是單克隆抗體或多克隆抗體。

本文使用的術(shù)語“單克隆抗體”是指獲自基本上同質(zhì)的抗體群的抗體，即組成群體的單個(gè)抗體是相同的，除了可能有少量的天然發(fā)生的可能突變。單克隆抗體是高度特異性的，針對(duì)的是單個(gè)抗原位點(diǎn)。單克隆抗體有利的是它們可以通過雜交瘤培養(yǎng)物合成，基本上不受其它免疫球蛋白污染。修飾的“單克隆”表示抗體的特征與基本上同質(zhì)的抗體群相同，并且不應(yīng)解釋為需要通過任何特定方法來產(chǎn)生。如上所述，根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過kohler，nature256(1975),495描述的雜交瘤方法制備。

本文使用的術(shù)語“多克隆抗體”是指在一種或多種其它非同一性抗體當(dāng)中或在所述其它抗體存在下產(chǎn)生的抗體。通常，多克隆抗體是在產(chǎn)生非同一性抗體的數(shù)種其它b淋巴細(xì)胞的存在下由某種b淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。多克隆抗體經(jīng)常直接獲自經(jīng)免疫的動(dòng)物。

抗體還可以是“完全人源抗體”，指代僅包含人免疫球蛋白序列的抗體。如果所述完全人源抗體在小鼠、小鼠細(xì)胞或衍生自小鼠細(xì)胞的雜交瘤中產(chǎn)生，則可以包含鼠碳水化合物鏈。類似地，“小鼠抗體”或“鼠抗體”是指僅包含小鼠/鼠免疫球蛋白序列的抗體。備選地，如果“完全人源抗體”在大鼠、大鼠細(xì)胞，來源于大鼠細(xì)胞的雜交瘤中產(chǎn)生，則可以含有大鼠碳水化合物鏈。類似地，術(shù)語“大鼠抗體”是指僅包含大鼠免疫球蛋白序列的抗體。完全人源抗體也可以例如通過噬菌體展示產(chǎn)生，所述噬菌體展示是能夠產(chǎn)生和篩選完全人源抗體的廣泛使用的篩選技術(shù)。噬菌體抗體也可用于本發(fā)明的上下文中。噬菌體展示方法描述于例如us5,403,484、us5,969,108和us5,885,793中。能夠開發(fā)完全人源抗體的另一種技術(shù)涉及小鼠雜交瘤技術(shù)的修飾。對(duì)小鼠進(jìn)行轉(zhuǎn)基因使其含有人免疫球蛋白基因座以交換其自身的小鼠基因(參見例如us5,877,397)。

抗體還可以是“嵌合抗體”，其指代抗體，其中本發(fā)明的可變區(qū)融合或嵌合于另一種人或非人物種(例如小鼠、馬、兔、狗、牛、雞)的抗體區(qū)(例如，恒定區(qū))的。

術(shù)語抗體還涉及重組人源抗體、異源抗體和異源雜交抗體。術(shù)語“重組人源抗體”包括通過重組方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的所有人源序列抗體，例如分離自針對(duì)人免疫球蛋白基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物(例如小鼠)分離的抗體；使用轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)載體表達(dá)的抗體，分離自重組的組合人源抗體文庫的抗體，或通過涉及將人免疫球蛋白基因序列剪接至其它dna序列的任何其它方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體。此類重組人抗體具有衍生自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)(如果存在恒定區(qū))。然而，可以對(duì)這些抗體進(jìn)行體外誘變(或當(dāng)使用針對(duì)人ig序列進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物時(shí)，進(jìn)行體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，并且因此重組抗體的vh和vl區(qū)的氨基酸序列是這樣的序列，盡管其衍生自人類種系vh和vl序列并與之相關(guān)，但可以不在體內(nèi)天然存在于人源抗體種系所有組成成分中。

抗體還可以相對(duì)于產(chǎn)生所述抗體的轉(zhuǎn)基因非人生物體被定義為“異源抗體”。該術(shù)語指代具有對(duì)應(yīng)于在不由轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物組成的生物體中發(fā)現(xiàn)的那些氨基酸序列或編碼核酸序列的抗體，并且通常來自轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物以外的物種。

抗體也可以是“異源雜合抗體”，指代輕鏈和重鏈為不同生物來源的的抗體。例如，具有結(jié)合鼠輕鏈的人重鏈的抗體是異源雜合抗體。異源雜合抗體的實(shí)例包括嵌合和人源化抗體。

術(shù)語抗體也涉及人源化抗體。非人(例如鼠或兔)抗體的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(例如fv、fab、fab'、f(ab')2或抗體的其他抗原結(jié)合子序列)，其包含衍生自非人免疫球蛋白的最小化序列。通常，人源化抗體是這樣的人免疫球蛋白(受體抗體)，其中受體的互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)的殘基被來自非人物種(供體抗體)例如小鼠，大鼠或兔的cdr的殘基取代，所述供體抗體具有所需的特異性、親和力和功能。在一些例子下，人免疫球蛋白的fv框架殘基被相應(yīng)的非人殘基取代。此外，人源化抗體可以包含在受體抗體和導(dǎo)入的cdr或框架序列中均未發(fā)現(xiàn)的殘基。作出這些修飾可以進(jìn)一步改進(jìn)和優(yōu)化抗體性能。通常，人源化抗體會(huì)包含至少一個(gè)，通常兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域中所有或基本上所有結(jié)構(gòu)域，其中所有或基本上所有的cdr區(qū)都對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的cdr區(qū)，并且所有或基本上所有的fr區(qū)都具有人免疫球蛋白共有序列。人源化抗體還可包含免疫球蛋白恒定區(qū)(fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。詳見：jonesnature321(1986)，522-525；reichmannnature332(1998)，323-327和prestacurropstructbiol2(1992)，593-596。

用于抗體人源化的一種普及的方法涉及cdr植入，其中將來自非人“供體”抗體的功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)植入到到人“受體”抗體上。cdr植入方法是本領(lǐng)域已知的，并且描述于例如us5,225,539、us5,693,761和us6,407,213中。另一種相關(guān)方法是從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)生人源化抗體，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物經(jīng)遺傳工程化含有一個(gè)或多個(gè)能夠進(jìn)行基因重排和基因轉(zhuǎn)化的人源化免疫球蛋白基因座(參見例如us7,129,084)。

因此，在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“抗體”涉及完全免疫球蛋白分子以及這些免疫球蛋白分子的部分(即，“其抗原結(jié)合片段”)。此外，如上所述，該術(shù)語涉及經(jīng)修飾的和/或經(jīng)改變的抗體分子。該術(shù)語還涉及重組地或合成地產(chǎn)生/合成的抗體。該術(shù)語還涉及完整抗體以及其抗體片段，如分離的輕鏈和重鏈、fab、fv、fab'、fab'-sh、f(ab')2。術(shù)語抗體還包括但不限于完全人源抗體、嵌合抗體、人源化抗體、cdr植入抗體和抗體構(gòu)建體，如單鏈fv(scfv)或抗體融合蛋白。此外，靶向性部分可以是f(ab')2、f(ab)2、fab'、fv抗體片段、scfv、fab、vh、scfv-fc、sdfv、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、微小抗體(minibody)、串聯(lián)scfv、串聯(lián)scfv-fc、scfv-fc-scfv、fab-scfv、fab3、igg-scfv、scfv-igg、igg-vh或單結(jié)構(gòu)域抗體，優(yōu)選地sdab、來自駱駝的vhh片段或來自軟骨魚的vnar片段。

所述抗體可以為全長抗體，即常常被稱為全抗體的完全免疫球蛋白分子。

在本發(fā)明的上下文中，“單鏈fv”或“scfv”抗體片段具有抗體的vh和vl結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單個(gè)多肽鏈中。通常，scfv多肽還包含vh和vl結(jié)構(gòu)域之間的多肽連接子，其使得scfv形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。所描述的用于產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)描述于例如plückthuninthepharmacologyofmonoclonalantibodies，rosenburgandmooreeds.springer-verlag，n.y.(1994)，269-315。

如本文所用的，“fab片段”由一條輕鏈以及重鏈的ch1和可變區(qū)組成。fab分子的重鏈不能與另一個(gè)重鏈分子形成二硫鍵。

“fc”區(qū)域包含兩個(gè)重鏈片段，其包含抗體的ch2和ch3結(jié)構(gòu)域。所述兩個(gè)重鏈片段是由兩個(gè)或更多個(gè)二硫鍵及通過ch3結(jié)構(gòu)域的疏水相互作用保持在一起。

“fab'片段”含有一條輕鏈和一條重鏈的一部分，該部分含有vh結(jié)構(gòu)域和ch1結(jié)構(gòu)域，以及ch1和ch2結(jié)構(gòu)域之間的區(qū)域，使得可以在兩個(gè)fab'片段的兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵從而形成f(ab')2分子。

“f(ab')2片段”包含兩條輕鏈和兩條含有ch1和ch2結(jié)構(gòu)域之間的部分恒定區(qū)的重鏈，使得在兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵。因此，f(ab')2片段由通過兩條重鏈之間的二硫鍵保持在一起的兩個(gè)fab'片段組成。

“fv區(qū)”包含來自重鏈和輕鏈兩者的可變區(qū)，但缺乏恒定區(qū)。

根據(jù)本發(fā)明使用的抗體、抗體構(gòu)建體、抗體片段、抗體衍生物(均衍生自ig)或其相應(yīng)的免疫球蛋白鏈可以使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)一步修飾，例如通過使用氨基酸缺失、插入、取代、添加和/或重組，和/或本領(lǐng)域已知的任何其它修飾，這些修飾可以單獨(dú)使用或組合使用。向作為免疫球蛋白鏈的氨基酸序列基礎(chǔ)的dna序列中引入所述修飾的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的；參見，例如，在引文中的sambrook(1989)。術(shù)語“ig衍生結(jié)構(gòu)域”具體涉及包含至少一個(gè)cdr的(多)肽構(gòu)建體。所述ig衍生結(jié)構(gòu)域的片段或衍生物限定了這樣的(多)肽，其為上述抗體分子的部分和/或其通過化學(xué)/生物化學(xué)或分子生物學(xué)方法得到修飾。相應(yīng)的方法是本領(lǐng)域已知的，尤其在實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中描述(參見sambrook等人，molecularcloning：alaboratorymanual；coldspringharborlaboratorypress，第2版(1989)和第3版(2001)；gerhardt等人，methodsforgeneralandmolecularbacteriologyasmpress(1994)；lefkovits，immunologymethodsmanual：thecomprehensivesourcebookoftechniques；academicpress(1997)；golemis，protein-proteininteractions：amolecularcloningmanualcoldspringharborlaboratorypress(2002))。

本文提及的抗體或抗體片段可以具有特異性cdr，其決定靶向性部分針對(duì)待靶向的細(xì)胞的特異性。本文所用的術(shù)語“cdr”涉及“互補(bǔ)決定區(qū)”，其是本領(lǐng)域熟知的。cdr是免疫球蛋白中決定所述分子的特異性并與特異性配體發(fā)生接觸的部分。cdr是分子中最可變的部分，并有助于這些分子的多樣性。在每個(gè)v結(jié)構(gòu)域中有三個(gè)cdr區(qū)——cdr1、cdr2和cdr3。cdr-h描述了可變重鏈的cdr區(qū)，cdr-l描述了可變輕鏈的cdr區(qū)。vh意指可變重鏈，vl意指可變輕鏈。ig衍生區(qū)域中cdr區(qū)可以如kabat“sequencesofproteinsofimmunologicalinterest”，第5版，nihpublicationno.91-3242departmentofhealthandhumanservices(1991年)；chothiaj.mol.biol.196(1987)，901-917或chothianature342(1989)，877-883中所述方法測(cè)定。

因此，在本發(fā)明的上下文中，上文所述的抗體分子選自完全抗體(免疫球蛋白，如igg1、igg2、igg2a、igg2b、iga1、igga2、igg3、igg4、iga、igm、igd或ige)、f(ab)-、fab'-sh-、fv-、fab'-、f(ab')2-片段、嵌合抗體、cdr移植抗體、完全人源抗體、二價(jià)抗體構(gòu)建體、抗體融合蛋白、合成抗體、二價(jià)單鏈抗體、三價(jià)單鏈抗體和多價(jià)單鏈抗體。

“人源化手段”在本領(lǐng)域中是熟知的，具體而言，是針對(duì)抗體分子(例如ig衍生分子)描述的。術(shù)語“人源化”指代非人(例如鼠)抗體或其片段(例如fv、fab、fab'、f(ab')、scfv或抗體的其他抗原結(jié)合部分序列)的人源化形式，其含有來源于非人抗體的序列的某些部分。人源化抗體包括這樣的人免疫球蛋白，其中來自人免疫球蛋白的互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)的殘基被具有所需結(jié)合特異性、親和力和功能的來自非人物種如小鼠、大鼠或兔的cdr的殘基取代。通常，人源化抗體會(huì)包含至少一個(gè)，通常兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域中基本上所有的結(jié)構(gòu)域，其中所有或基本上所有的cdr區(qū)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的cdr區(qū)，且所有或基本上所有的fr區(qū)具有人免疫球蛋白共有序列。人源化抗體最優(yōu)還將包含免疫球蛋白恒定區(qū)(fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的fc；尤其可參見jones等人，nature321(1986)，522-525，presta，curr.op.struct.biol.2(1992),593-596。對(duì)非人抗體進(jìn)行人源化的方法是本領(lǐng)域熟知的。通常，人源化抗體具有從非人來源引入的仍保留抗體的原始結(jié)合活性的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。用于人源化抗體/抗體分子的方法進(jìn)一步在jones等人，nature321(1986)，522-525；reichmann等人，nature332(1988)，323-327；和verhoeyen等，science239(1988)，1534-1536中詳述。人源化抗體的具體實(shí)例是本領(lǐng)域已知的，例如針對(duì)epcam的抗體，參見例如，(lobuglio，proceedingsoftheamericansocietyofclinicaloncologyabstract(1997)，1562和khor，proceedingsoftheamericansocietyofclinicaloncologyabstract(1997)，847)。

因此，在本發(fā)明的上下文中，被人源化的抗體分子或其抗原結(jié)合片段被優(yōu)選用作靶向性部分，并且可以成功地用于藥物組合物中。

根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體是這樣的構(gòu)建體，其中靶向性部分靶向?qū)Π┌Y特異性的抗原、對(duì)感染性疾病特異性的抗原或?qū)ψ陨砻庖咝约膊√禺愋缘目乖１绢I(lǐng)域技術(shù)人員了解對(duì)癌癥特異性的細(xì)胞特異性的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)、表位或抗原，對(duì)感染性疾病特異性的抗原或?qū)ψ陨砻庖咝约膊√禺愋缘目乖?。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于待靶向的所需細(xì)胞選擇并挑選合適的靶向性部分，以靶向?qū)Π┌Y特異性的抗原、對(duì)感染性疾病特異性的抗原或?qū)ψ陨砻庖咝约膊√禺愋缘目乖?/p>

不受理論的束縛，可將相應(yīng)的靶向性部分并入本發(fā)明的構(gòu)建體中用于將待遞送到細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子的靶向遞送，所述細(xì)胞特征在于有對(duì)癌癥特異性的抗原。作為實(shí)例，可以使用特異于癌癥抗原的任何已知抗體、抗體片段、設(shè)計(jì)的錨蛋白重復(fù)序列蛋白質(zhì)(darpin)、配體或細(xì)胞因子。作為實(shí)例，只要抗體或抗體片段能夠靶向癌細(xì)胞并因此可以例如用于癌癥治療，則可以將任何已知的抗體或其抗體片段并入本發(fā)明的構(gòu)建體中。因此，可以選擇結(jié)合腫瘤相關(guān)抗原(tumorassociatedantigen，taa)的抗體或抗體片段。本領(lǐng)域已知多種腫瘤相關(guān)抗原，包括但不限于碳酸酐酶ix、cccl19、cccl21、csap、cd1、cd1a、cd2、cd3、cd4、cd5、cd8、cd11a、cd14、cd15、cd16、cd18、cd19、igf-1r、cd20、cd21、cd22、cd23、cd25、cd29、cd30、cd32b、cd33、cd37、cd38、cd40、cd40l、cd45、cd46、cd52、cd54、cd55、cd59、cd64、cd66a-e、cd67、cd70、cd74、cd79a、cd80、cd83、cd95、cd126、cd133、cd138、cd147、cd154、afp、psma、ceacam5、ceacam6、b7、纖連蛋白的ed-b、h因子、fhl-1、flt-3、葉酸受體、grob、hmgb-1、缺氧誘導(dǎo)因子(hif)、hm1.24、胰島素樣生長因子-1(ilgf-1)、ifn-γ、ifn-α、ifn-β、il-2、il-4r、il-6r、il-13r、il-15r、il-17r、il-18r、il-6、il-8、il-12、il-15、il-17、il-18、il-25、ip-10、mage、mcrp、mcp-1、mip-1a、mip-1b、mif、muc1、muc2、muc3、muc4、muc5ac、pam4抗原、nca-95、nca-90、ia、hm1.24、egp-1、egp-2、hla-dr、腱生蛋白、le(y)、rantes、t101、tac、tn抗原、thomson-friedenreich抗原、腫瘤壞死抗原、tnf-α、trail受體(r1和r2)、vegfr、egfr、plgf、補(bǔ)體因子c3、c3a、c3b、c5a、c5和癌基因產(chǎn)物?？梢杂糜诒景l(fā)明的構(gòu)建體中的示例性抗癌抗體可以為但不限于hr1(抗igf-1r，2009年1月20日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)61/145,896)、hpam4(抗muc1，美國專利號(hào)7,282,567)、ha20(抗cd20，美國專利號(hào)7,251,164)、ha19(抗cd19，美國專利號(hào)7,109,304)、himmu-31(抗afp，美國專利號(hào)7,300,655)、hll1(抗-cd74，美國專利號(hào)7,312,318)、hll2(抗-cd22，美國專利號(hào)7,074,403)、hmu-9(抗-csap，美國專利號(hào)7,387,773)、hl243(抗hla-dr，美國專利號(hào)7,612,180)、hmn-14(抗ceacam5，美國專利號(hào)6,676,924)，hmn-15(抗ceacam6，美國專利申請(qǐng)?zhí)?0/672,278)、hrs7(抗egp-1，美國專利號(hào)7,238,785)和hmn-3(抗-cea，美國專利號(hào)7,541,440)。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，該列表不是限制性的，且任何其它已知的抗taa抗體都可以并入本發(fā)明的構(gòu)建體中。

在根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體中，靶向性部分還可以為人源化抗-egfr抗體單鏈fv片段(scfv)。優(yōu)選地，人源化抗-egfrscfv抗體具有以下氨基酸序列：

evqlvesggglvqpggslrlscaasgfsltnygvhwvrqapgkglewlgviwsggntdyntpftsrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycaraltyydyefaywgqgttvtvssggggsggggsggggsdiqltqspsflsasvgdrvtitcrasqsigtnihwyqqkpgkapkllikyasesisgvpsrfsgsgsgteftltisslqpedfatyycqqnnnwpttfgagtkleikr(seqidno:2)。

然而，只要抗體或抗體結(jié)合片段具有結(jié)合至egfr的能力，則如本發(fā)明所用的人源化抗-egfr抗體單鏈fv片段(scfv)不具體限制于以上的具體序列，還可以為結(jié)合egfr的其變體，所述變體包含如下氨基酸序列或由如下氨基酸序列組成，所述氨基酸序列與seqidno:2的序列有至少95％、90％、85％、75％、70％、65％、60％、55％或50％的序列同源性。如上文描述的，技術(shù)人員能夠容易地生成這些抗體變體并用本領(lǐng)域已知的方法測(cè)試給定抗體、抗體片段或抗體單鏈fv片段(scfv)是否能夠結(jié)合egfr。進(jìn)一步地，所述抗體或其抗原結(jié)合片段或抗體單鏈fv片段(scfv)是包含如下氨基酸序列的分子，所述氨基酸序列參照seqidno：2序列具有多至0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個(gè)或更多保守氨基酸取代。

在根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體中，靶向性部分還可以是人源化抗-cd22抗體單鏈fv片段(scfv)。所述人源化抗-cd22抗體的序列先前在us7,456,260b2(sgiii克隆)中描述。

優(yōu)選地，所述人源化抗-cd22scfv(sgiii)抗體具有以下氨基酸序列：

evqlvesggglvqpggslrlscaasgfafsiydmswvrqvpgkglewvsyissgggttyypdtvkgrftisrdnsrntldlqmnslrvedtavyycarhsgygssygvlfaywggingtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdisnylnwlqqkpgkapklliyytsilhsgvpsrfsgsgsgteftltisslqpedfatyycqqgntlpwtfgqgtkleikr(seqidno:24)。

然而，只要抗體或抗體結(jié)合片段具有結(jié)合至cd22的能力，則如本發(fā)明所用的人源化抗-cd22抗體單鏈fv片段(scfv)不具體限制于以上的具體序列，還可以為結(jié)合cd22的其變體，所述變體包含如下氨基酸序列或由如下氨基酸序列組成，所述氨基酸序列與seqidno:24的序列有至少95％、90％、85％、75％、70％、65％、60％、55％或50％的序列同源性。如上文描述的，技術(shù)人員能夠容易地生成這些抗體變體并用本領(lǐng)域已知的方法測(cè)試它們是否給定抗體、抗體片段或抗體單鏈fv片段(scfv)能夠結(jié)合cd22。進(jìn)一步地，所述抗體或其抗原結(jié)合片段或抗體單鏈fv片段(scfv)是包含如下氨基酸序列的分子，所述氨基酸序列參照seqidno：24序列具有多至0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個(gè)或更多保守氨基酸取代。

為了確定某一氨基酸位置是否與seqidno:2或seqidno:24序列具有特定程度的的同一性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用本領(lǐng)域熟知的方式和方法，例如，手動(dòng)或通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行比對(duì)。這種比對(duì)可以例如使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式和方法進(jìn)行，例如，通過使用已知的計(jì)算機(jī)算法如lipman-pearson方法(science227(1985)，1435)或clustal算法。優(yōu)選地，在這種比對(duì)中，為氨基酸序列中存在的保守氨基酸殘基分配最大同源性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用clustalw2進(jìn)行氨基酸序列的比較。在成對(duì)比較/比對(duì)的情況下，優(yōu)選選擇以下設(shè)置：蛋白質(zhì)重量矩陣：blosum62；缺口開放：10；缺口延伸：0.1。在多重比較/比對(duì)的情況下，優(yōu)選選擇以下設(shè)置：蛋白質(zhì)重量矩陣：blosum62；缺口打開：10；缺口延伸：0.2；缺口距離：5；無末端缺口。

根據(jù)本發(fā)明，在兩個(gè)或更多核酸序列或氨基酸序列的情況下術(shù)語“同一的”或“同一性百分比”指代當(dāng)在比較窗口上或在測(cè)量的指定區(qū)域上如使用本領(lǐng)域已知的序列比較算法或通過手動(dòng)比對(duì)和目視檢查進(jìn)行比較并比對(duì)最大的對(duì)應(yīng)性時(shí)，兩個(gè)或更多序列或子序列與上文描述的能夠結(jié)合至egfr的氨基酸或核酸序列相同或有特定百分比的氨基酸殘基或核苷酸與之相同(例如60％或65％的同一性，優(yōu)選70-95％的同一性，更優(yōu)選至少95％的同一性)。具有例如60％至95％或更大的序列同一性的序列被認(rèn)為基本上同一。這一定義也可應(yīng)用于測(cè)試序列的互補(bǔ)序列。優(yōu)選地，所述同一性存在于長度為至少約15至25個(gè)氨基酸或核苷酸的區(qū)域上，更優(yōu)選地，在長度為約50至100個(gè)氨基酸或核苷酸的區(qū)域上。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道如何使用例如基于clustalw計(jì)算機(jī)程序(thompsonnucl.acidsres.2(1994)，4673-4680)或fastdb(基于計(jì)算機(jī)程序)的算法來確定序列之間的同一性百分比/brutlagcomp.app.biosci.6(1990)，237-245)，這些是本領(lǐng)域已知的。

盡管fastdb算法通常在其計(jì)算中不考慮序列內(nèi)部的不匹配刪除或添加，即缺口，這一點(diǎn)可以手動(dòng)糾正以避免對(duì)同一性％的高估。然而，clustalw確實(shí)在其同一性計(jì)算中考慮到序列缺口。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可用的是blast和blast2.0算法(altschul,(1997)nucl.acidsres.25:3389-3402；altschul(1993)j.mol.evol.36:290-300；altschul(1990)j.mol.biol.215:403-410)。用于核酸序列的blastn程序使用默認(rèn)字長(w)11，期望值(e)10，m＝5，n＝4并默認(rèn)兩條鏈都進(jìn)行比較。對(duì)于氨基酸序列，blastp程序默認(rèn)使用字長(w)3，期望值(e)10。blosum62評(píng)分矩陣(henikoff(1989)pnas89：10915)默認(rèn)使用比對(duì)(b)50，期望值(e)10，m＝5，n＝4，并默認(rèn)兩條鏈都進(jìn)行比較。

優(yōu)選地，上述seqidno:2或seqidno:24中的(多個(gè))氨基酸取代是“保守型取代”，指代蛋白質(zhì)中氨基酸被具有相似特征(例如電荷，側(cè)鏈大小，疏水性/親水性，骨架構(gòu)象和剛性等)的其它氨基酸的取代，這樣可以頻繁作出變化而不改變已經(jīng)在上文詳述的蛋白質(zhì)的生物活性。

類似地，為了對(duì)待遞送到特征在于具有對(duì)感染性疾病或?qū)ψ陨砻庖咝约膊√禺愋缘目乖募?xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子進(jìn)行靶向遞送，可將相應(yīng)的靶向性部分并入本發(fā)明的構(gòu)建體中。作為實(shí)例，可以使用對(duì)感染性疾病或?qū)ψ陨砻庖咝约膊】乖禺愋缘娜魏我阎贵w、抗體片段、設(shè)計(jì)的錨蛋白重復(fù)序列蛋白(darpin)、配體或細(xì)胞因子。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解對(duì)感染性疾病或?qū)ψ陨砻庖咝约膊√禺愋詫?duì)細(xì)胞的特異細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)、表位或抗原。

不受理論的束縛，為了對(duì)待遞送到特征在于具有對(duì)自身免疫疾病特異性的抗原的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子進(jìn)行靶向遞送，可將相應(yīng)的靶向性部分并入本發(fā)明的構(gòu)建體中。作為實(shí)例，可以使用對(duì)自身免疫性疾病特異性的抗原的任何已知抗體、抗體片段、設(shè)計(jì)的錨蛋白重復(fù)序列蛋白(darpin)、配體或細(xì)胞因子。作為實(shí)例，任何已知的抗體或其抗體片段可以并入本發(fā)明的構(gòu)建體中，只要抗體或抗體片段能夠靶向受自身免疫性疾病影響的細(xì)胞，并且因此可以用于例如自身免疫性疾病的治療。因此，可以選擇結(jié)合例如對(duì)自身免疫性疾病特異性的抗原的抗體或抗體片段。已知的對(duì)自身免疫疾病特異性的抗原是ampa-glur3、nmda-nr1、nmda-nr2a/b、mglur1、mglur5、dsg1、dsg3、dsc、cd40、cd40l、cd19、cd32b、cd20、cd22、cd6或cd74。

類似地，為了對(duì)待遞送到特征在于具有對(duì)感染性疾病特異性的抗原的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子進(jìn)行靶向遞送，可將相應(yīng)的靶向性部分并入本發(fā)明的構(gòu)建體中。作為實(shí)例，可以使用對(duì)感染性疾病抗原特異性的任何已知抗體、抗體片段、設(shè)計(jì)的錨蛋白重復(fù)序列蛋白(darpin)、配體或細(xì)胞因子。作為實(shí)例，任何已知的抗體或其抗體片段可以并入本發(fā)明的構(gòu)建體中，只要抗體或抗體片段能夠靶向受感染的細(xì)胞，并且因此可以用于例如感染性疾病的治療。因此，可以選擇結(jié)合例如對(duì)自身免疫性疾病特異性的抗原的抗體或抗體片段。在感染性疾病中，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何病毒表面蛋白質(zhì)都可以為靶標(biāo)蛋白質(zhì)。

本發(fā)明構(gòu)建體的第三個(gè)主要模塊是(c)待遞送至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子(即，“貨物”)?！柏浳铩?，即待遞送到細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子可以被認(rèn)為是在細(xì)胞中發(fā)揮所需功能的“效應(yīng)子部分”。“貨物”的性質(zhì)在很大程度上取決于通過將相應(yīng)的分子特異性遞送到細(xì)胞質(zhì)中要實(shí)現(xiàn)怎樣的效果，因此并不受限制?；旧先魏畏肿佣伎梢杂米餍?yīng)子或“貨物”，只要其具有待遞送到細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的功能/功能活性。

因此，根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體可以是這樣的構(gòu)建體，其中待遞送到細(xì)胞質(zhì)中的分子(即“貨物”)選自治療性部分、可檢測(cè)部分、核酸分子(優(yōu)選sirna)、載體分子(優(yōu)選納米顆粒)、脂質(zhì)體和病毒載體。所述待遞送到細(xì)胞質(zhì)中的“貨物”與上述模塊(a)和(b)綴合，或者以如上所述并在下文進(jìn)一步描述的共價(jià)鍵化學(xué)偶聯(lián)的形式，或者通過如上所述并在下文進(jìn)一步描述的重組方法學(xué)融合至上述模塊(a)和(b)以融合蛋白的形式。

術(shù)語治療性部分(或治療劑)、可檢測(cè)部分、核酸分子、sirna、載體分子、納米顆粒、脂質(zhì)體和病毒載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且這些“貨物”的性質(zhì)在本發(fā)明的上下文中不受具體限制。這些“貨物”的性質(zhì)在很大程度上取決于通過將相應(yīng)的分子特異性地遞送到細(xì)胞質(zhì)要實(shí)現(xiàn)怎樣的效果。

如果例如期望在待靶向的細(xì)胞中發(fā)揮對(duì)特定化合物已知的藥理學(xué)作用，則本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地挑選相應(yīng)的治療性部分或治療劑。下文進(jìn)一步給出治療劑或治療性部分的非限制性實(shí)例。通常，“治療劑”或“治療性部分”是可用于治療疾病的原子、分子或化合物。治療劑的實(shí)例包括但不限于抗體、抗體片段、肽、藥物、毒素、酶、核酸酶、激素、免疫調(diào)制劑、反義寡核苷酸、小干擾rna(sirna)、螯合劑、硼化合物、光活性劑、染料和放射性同位素。在多種實(shí)施方式中、治療性部分/試劑例如細(xì)胞毒性劑、抗血管生成劑、促凋亡劑、抗生素、激素、激素拮抗劑、趨化因子、藥物、前藥、毒素、酶或其它試劑可用作本文描述的干擾素-抗體dnl^tm構(gòu)建體的附加療法?？捎盟幬锢缇哂械乃幬锾匦赃x自抗有絲分裂劑、抗激酶、烷化劑、抗代謝物、抗生素、生物堿、抗血管生成劑、促凋亡劑及其組合。

示例性的可用藥物可以包括5-氟尿嘧啶、阿普立定、阿扎西平、阿那曲唑、蒽環(huán)霉素、苯達(dá)莫司汀、博來霉素、硼替佐米、苔蘚抑素-1、白消安、卡利霉素、喜樹堿(camptothecin)、卡鉑、10-羥基喜樹堿、卡莫司汀、塞來昔布、苯丁酸氮芥、順鉑(cddp)、cox-2抑制劑、伊立替康(cpt-11)、sn-38、卡鉑、克拉屈濱、氯法拉濱、阿糖胞苷、喜樹堿衍生物(camptothecans)、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、達(dá)卡巴嗪、多西紫杉醇、更生霉素、柔紅霉素、多柔比星、2-吡咯烷并多柔比星(2p-dox)、氰基-嗎啉多柔比星、多柔比星葡糖苷酸、表柔比星葡萄糖苷酸、雌莫司汀、表鬼臼脂素、雌激素受體結(jié)合劑、依托泊苷(vp16)、依托泊苷葡糖苷酸、磷酸依托泊苷、氟尿苷(fudr)、3',5'-o-二油?；?fudr(fudr-do)、氟達(dá)拉濱、氟他胺、法呢基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑、酪氨酸激酶和布魯頓激酶抑制劑、吉西他濱、羥基脲、伊達(dá)比星、異環(huán)磷酰胺、l-天冬酰胺酶、利奈唑胺、亞葉酸、洛莫司汀、氮芥、美法侖、巰基嘌呤、6-巰基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、光神霉素、絲裂霉素、米托坦、諾維本、亞硝基脲、普卡霉素、丙卡巴肼、紫杉醇、噴司他丁、psi-341、雷洛昔芬、司莫司汀、鏈佐星、他莫昔芬、紫杉醇、替馬唑胺(dtic的水溶液形式)、反鉑、沙利度胺、硫鳥嘌呤、噻替派、替尼泊苷、拓?fù)涮婵?、尿嘧啶氮芥、長春瑞濱、長春堿、長春新堿和長春花生物堿。使用的酪氨酸激酶抑制劑可包括lfm-a13、達(dá)沙替尼、伊馬替尼或尼羅替尼。

如下文更詳細(xì)概述的，使用的毒素可以例如包括蓖麻毒素、相思豆毒素、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(rna酶)(例如豹蛙抗瘤酶(onconase))、dna酶i、葡萄球菌腸毒素-a、美洲商陸抗病毒蛋白、白樹毒素、白喉毒素、假單胞菌外毒素和假單胞菌內(nèi)毒素。

使用的趨化因子可以包括rantes、mcaf、mip1-α、mip1-β和ip-10。在特定實(shí)施方式中可以為抗血管生成劑(例如血管抑素)、baculostatin、canstatin、乳腺絲氨酸蛋白酶抑制劑(maspin)、抗vegf抗體、抗plgf肽和抗體、抗血管生長因子抗體、抗flk-1抗體、抗flt-1抗體和肽、抗kras抗體、抗cmet抗體、抗mif(巨噬細(xì)胞遷移抑制因子)抗體、層粘連蛋白肽、纖連蛋白肽、纖溶酶原激活物抑制劑、組織金屬蛋白酶抑制劑、干擾素、白細(xì)胞介素-12、ip-10、gro-β、血小板反應(yīng)蛋白、2-甲氧基雌二醇、增生激素相關(guān)蛋白、羧基三唑、cm101、marimastat、戊聚糖多硫酸鹽、血管生成素-2、干擾素-α、除莠霉素a、pnu145156e、16k催乳素片段、萊諾米特(roquinimex)、沙利度胺、己酮可可堿、染料木黃酮(genistein)、tnp-470、內(nèi)皮抑制素、紫杉醇、accutin、血管抑制素、西多福韋、長春新堿、博來霉素、agm-1470、血小板因子4或米諾環(huán)素。其它有用的治療劑可以包括寡核苷酸，尤其是優(yōu)選針對(duì)致癌基因和癌基因產(chǎn)物如bcl-2或p53的反義寡核苷酸。治療性寡核苷酸的優(yōu)選形式是如下文進(jìn)一步描述的sirna。

所述治療劑或部分還可以是放射性核素。

術(shù)語“治療性部分/試劑”還可更廣義地理解，并包括“診斷劑/部分”。診斷劑或部分是可用于診斷疾病的原子、分子或化合物。有用的診斷劑或部分包括但不限于放射性同位素、染料(例如具有生物素-鏈霉親和素復(fù)合物)、造影劑、熒光化合物或分子及用于磁共振成像(mri)的增強(qiáng)劑(例如順磁離子)。診斷劑或部分優(yōu)選地選自放射性核素、放射性造影劑、順磁離子、金屬、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、超聲造影劑和光活性劑。所述診斷劑是眾所周知的，可以使用任何這樣的已知診斷劑。診斷劑的非限制性實(shí)例可包括放射性核素例如110in、111in、177lu、18f、19f、52fe、62cu、64cu、67cu、67ga、68ga、86y、90y、89zr、94mtc、94tc、99mtc、120i、123i、124i、125i、131i、154-158gd、32p、11c、13n、15o、186re、188re、51mn、52mmn、55co、72as、75br、76br、82mrb、83sr或其它γ-、β-或正電子發(fā)射器。順磁離子可以包括鉻(iii)、錳(ii)、鐵(iii)、鐵(ii)、鈷(ii)、鎳(ii)、銅(ii)、釹(iii)、釤(iii)、鐿(iii)、釓(iii)、釩(ii)、鋱(iii)、鏑(iii)、鈥(iii)或鉺(iii)。金屬造影劑可以包括鑭(iii)、金(iii)、鉛(ii)或鉍(iii)。超聲造影劑可以包括脂質(zhì)體，例如充氣脂質(zhì)體。不透射線診斷劑可以選自以下化合物：鋇化合物、鎵化合物和鉈化合物。多種熒光標(biāo)記物是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于異硫氰酸熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、鄰苯二甲醛和熒光胺。使用的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物可以包括魯米諾、異魯米諾、芳族吖啶酯、咪唑、吖啶鎓鹽或草酸酯。

如下文將更詳細(xì)示例性概述的，待遞送至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)的分子(其是根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建體的一部分)還可包括一種或多種其他效應(yīng)子，例如蛋白質(zhì)、肽、免疫調(diào)制劑、細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素、干擾素、結(jié)合蛋白、肽配體、載體蛋白、毒素、核糖核酸酶如onconase、抑制性寡核苷酸如sirna、抗原或異種抗原、聚合物如peg、酶、治療劑、激素、細(xì)胞毒劑、抗血管生成劑、促凋亡劑或任何其它分子或聚集體。

可檢測(cè)部分應(yīng)理解為視覺可檢測(cè)的或在光的非視覺范圍內(nèi)的化學(xué)部分?！耙曈X可檢測(cè)的部分”是指該部分或染料可以簡(jiǎn)單地由個(gè)體的肉眼在染料的視覺范圍內(nèi)檢測(cè)。這包括熒光可檢測(cè)的染料，其也可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員肉眼在熒光可檢測(cè)染料吸收特定波長的光而發(fā)射特異波長的光時(shí)檢測(cè)到。因此，在本發(fā)明的上下文中，可檢測(cè)部分或染料可以是例如熒光可檢測(cè)的部分。然而，可檢測(cè)部分也可在光的非視覺范圍內(nèi)檢測(cè)。在這方面，可使用放射性部分作為實(shí)例。

視覺可檢測(cè)的部分和非視覺可檢測(cè)部分對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，其通常應(yīng)用于生物學(xué)領(lǐng)域，例如用于檢測(cè)或定位特定細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解這些可檢測(cè)部分的很多應(yīng)用。不收理論限制，現(xiàn)有技術(shù)中優(yōu)選并廣泛知曉的是熒光可檢測(cè)部分，包括例如eosiny(linf,fanw,wisege.analbiochem.1991aug1；196(2):279-83)、syproorange/red(steinbergth,joneslj,hauglandrp,singervl.analbiochem.1996aug1；239(2):223-37)、syproruby(berggrenk,steinbergth,lauberwm,carrollja,lopezmf,chernokalskayae,zieskel,diwuz,hauglandrp,pattonwf.analbiochem.1999dec15；276(2):129-43)、deeppurple/lightningfast(bellpj,karusop.jamchemsoc.2003aug6；125(31):9304-5；mackintoshja,choihy,baesh,vealda,bellpj,ferraribc,vandykdd,verrillsnm,paikyk,karusop.proteomics.2003dec；3(12):2273-88)及alexa染料(panchuk-voloshinan,hauglandrp,bishop-stewartj,bhalgatmk,millardpj,maof,leungwy,hauglandrp.jhistochemcytochem.1999sep；47(9):1179-88.)。

具體而言，可能期望將核酸分子遞送到細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。核酸分子的遞送在基因治療中有特別的重要性。在此方面，技術(shù)人員了解如何制備所需核酸分子的許多方法。優(yōu)選地，核酸分子是sirna分子，其可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的rna干擾機(jī)制用于特異性敲低具體基因的表達(dá)。

此外，核酸分子(優(yōu)選sirna(構(gòu)建體))可以以病毒載體的形式被遞送到細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。

待作為效應(yīng)子或作為“貨物”被遞送到細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的治療性部分或治療劑可以選自細(xì)胞毒性部分、抗體、抗體片段、藥劑、化學(xué)治療劑、小分子、酶、激素、反義寡核苷酸、sirna、rnai、放射性核素、硼化合物、光活性劑、抗血管生成劑和促凋亡劑。

細(xì)胞毒性部分/試劑/化合物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且涉及對(duì)細(xì)胞有毒性的物質(zhì)。細(xì)胞毒性化合物可以例如導(dǎo)致多種細(xì)胞命運(yùn)，例如壞死、細(xì)胞裂解和細(xì)胞凋亡。藥劑可以是小分子，包括例如化療劑(即化學(xué)物質(zhì))，放射性核素(例如lu-177、y-90、in-111、i-131)，來自植物、微生物或動(dòng)物的毒素(其可以是小分子、肽或蛋白質(zhì))，例如細(xì)胞毒素、氰基毒素、外毒素、神經(jīng)毒素。已知促凋亡劑可誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡。促凋亡劑是本領(lǐng)域已知的，bax、bak、galectin3和bbc3只是作為非限制性實(shí)例在此引用。

可以用作治療性部分或治療劑的酶是具有高度選擇性的大分子生物催化劑，其通過將底物轉(zhuǎn)化為不同的產(chǎn)物而起作用，因此可適于用作治療性部分。用作治療性部分或治療劑的酶的性質(zhì)不受限制，并取決于待治療或預(yù)防的疾病或病癥。可適于用作治療性部分或治療劑的非限制性的酶類可以是例如絲氨酸蛋白酶，dna酶或rna酶。

可用作治療性部分或治療劑的激素屬于調(diào)節(jié)生理和行為(如代謝、生長和發(fā)育、排泄和/或消化)的一類信號(hào)傳導(dǎo)分子。激素可以屬于下列類別之一：胺類(例如去甲腎上腺素)、肽(例如催產(chǎn)素)、蛋白質(zhì)(例如人生長激素)、類固醇(例如睪酮)?？捎米髦委熜圆糠只蛑委焺┑募に氐男再|(zhì)不受限制，并取決于待治療或預(yù)防的疾病或病癥。

“貨物”或效應(yīng)子部分也可以是免疫調(diào)制劑。免疫調(diào)制劑是當(dāng)其存在時(shí)會(huì)改變、抑制或刺激身體免疫系統(tǒng)的試劑。使用的免疫調(diào)制劑可包括細(xì)胞因子、干細(xì)胞生長因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(csf)、干擾素(ifn)、促紅細(xì)胞生成素、血小板生成素及其組合。特別有用的是淋巴毒素例如腫瘤壞死因子(tnf)、造血因子例如白細(xì)胞介素(il)、集落刺激因子例如粒細(xì)胞集落刺激因子(g-csf)或粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)、干擾素(例如干擾素-α、干擾素-β、干擾素-γ或干擾素-λ)以及干細(xì)胞生長因子例如稱為“s1因子”的干細(xì)胞生長因子。

因此，待遞送到細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子可以是細(xì)胞因子，例如淋巴因子、單核因子、生長因子和傳統(tǒng)的多肽激素。細(xì)胞因子在上文“靶向性部分”的上下文中已經(jīng)有所定義。然而，考慮到一旦遞送到細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞因子由于具有如上所述的免疫調(diào)制劑的能力也可以根據(jù)本發(fā)明被用作“貨物”或“效應(yīng)子”，則在如上文關(guān)于“靶向性部分”的上下文中對(duì)細(xì)胞因子所闡述的內(nèi)容加以必要修正同樣適用于在“貨物”和“效應(yīng)子”的上下文中所闡述的細(xì)胞因子。蛋白質(zhì)或肽免疫調(diào)制劑例如細(xì)胞因子的氨基酸序列是本領(lǐng)域熟知的，并且任何這樣的已知序列都可用于本發(fā)明的上下文中。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道關(guān)于細(xì)胞因子序列的眾多資源，如上所述。此外，技術(shù)人員知道在上文作為“靶向性部分”的細(xì)胞因子的上下文中所已經(jīng)提及的許多細(xì)胞因子的實(shí)例。

本發(fā)明的構(gòu)建體還可以是這樣的構(gòu)建體，其中細(xì)胞毒性部分選自核糖核酸酶a家族成員、蓖麻毒素、相思豆毒素、α毒素、皂草素、dna酶i、葡萄球菌腸毒素-a、美洲商陸抗病毒蛋白、白樹毒素、白喉毒素、假單胞菌外毒素和假單胞菌內(nèi)毒素。

細(xì)胞毒性是對(duì)細(xì)胞有毒性的細(xì)胞毒性部分的能力。毒性是物質(zhì)(即本發(fā)明條件下的細(xì)胞毒性部分)可對(duì)細(xì)胞或生物體損傷的程度。毒性可以指對(duì)整個(gè)生物體例如動(dòng)物、細(xì)菌或植物的效應(yīng)，以及對(duì)生物體亞結(jié)構(gòu)，例如細(xì)胞(此時(shí)即為細(xì)胞毒性)或器官的效應(yīng)。具體而言，在本發(fā)明的上下文中，毒性指代對(duì)細(xì)胞的毒性。通常，細(xì)胞毒性劑或部分可以是化學(xué)、生物或物理性質(zhì)的?；瘜W(xué)毒性劑包括例如無機(jī)物質(zhì)如鉛、汞和氫氟酸，以及有機(jī)化合物如甲醇，大多數(shù)藥物和來自生物的毒物。放射性化學(xué)品由于其化學(xué)性質(zhì)并不是有毒的，但是因?yàn)橛珊税l(fā)射的輻射是高能的，并且破壞細(xì)胞和組織，放射性毒性在本發(fā)明條件下也可以被理解為“細(xì)胞毒性的”。生物毒性劑包括具有毒性作用的任何生物分子。下文會(huì)進(jìn)一步給出實(shí)施例。物理毒性劑是由于其物理性質(zhì)而干擾生物過程的物質(zhì)。實(shí)例包括煤灰、石棉纖維或二氧化硅細(xì)粉，所有這些物質(zhì)如果遞送到生物體或細(xì)胞中都可能最終是致命的。

可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法測(cè)量對(duì)靶標(biāo)(生物體、器官、組織，或優(yōu)選直接對(duì)細(xì)胞)的效應(yīng)而測(cè)量生物毒性。

毒素或細(xì)胞毒性部分是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員了解關(guān)于這些細(xì)胞毒性部分的眾多公共信息資源。此外，技術(shù)人員知道這些細(xì)胞毒性部分的許多實(shí)例，并且可以容易地挑選細(xì)胞毒性部分。

如上文已經(jīng)提到的，核糖核酸酶a(rna酶a)超家族的成員已經(jīng)作為用于癌癥的抗體靶向治療的潛在新類型的效應(yīng)子化合物而嶄露頭角(newton等人，2001；delorenzo等人，2004；arndt等人，2005；chang等人，2010；liu等人，2014)。因此，核糖核酸酶a(rna酶a)超家族的成員是優(yōu)選的“貨物”或效應(yīng)子部分，即，待遞送至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子。

rna酶a家族成員已知來源于多種生物體，并且可以用作優(yōu)選的“貨物”或效應(yīng)子部分，即，待遞送至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子。例如，可以使用兩棲類rna酶a成員。兩棲類rna酶a成員的非限制性實(shí)例是amphinase(衍生自豹蛙)和rc-rnase(衍生自牛蛙(ranacatesbeiana))。

作為其它實(shí)例，人類rnase可以用作優(yōu)選的“貨物”?？捎米鞲鶕?jù)本發(fā)明的“貨物”的人類rna酶a成員的非限制性實(shí)例是人胰腺rna酶(rna酶1或hp-rna酶；seqidno：22)、嗜酸性粒細(xì)胞衍生的神經(jīng)毒素(rna酶2)、嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白(rna酶3)、人rna酶4、血管生成素(rna酶5；seqidno：23)、人rna酶7和人rna酶8。

作為另一些實(shí)例，可使用牛rna酶a。

所有以上rna酶的實(shí)例都參與蛋白質(zhì)合成的rna代謝/抑制，并能以與本文上文和下文有較詳細(xì)描述的ranpirnase相同的方式進(jìn)行治療性使用，所述使用方式加以必要的修正對(duì)于這些rna酶同樣適用。

優(yōu)選的rna酶超家族成員是ranpirnase其是來自北部豹蛙豹蛙的rna酶，已經(jīng)作為抗腫瘤劑受到廣泛研究。其逃避人類rna酶抑制劑的作用(haigis等人，2003)，并通過降解t-rna抑制蛋白質(zhì)合成(saxena等人，2002)。此外，ranpirnase靶向在癌癥中異常調(diào)節(jié)的mirna和mirna前體，因此特異性地中斷惡性細(xì)胞生長和腫瘤進(jìn)展所需的關(guān)鍵機(jī)制(goparaju等人，2011；qiao等人，2012)。盡管為兩棲起源，ranpirnase作為單一藥劑即使重復(fù)施用于癌癥患者時(shí)也未介導(dǎo)可觀的免疫原性(mikulski等人，1993；mikulski等人，2002)。先前已經(jīng)表明，通過使用化學(xué)綴合或與內(nèi)化抗體衍生物的遺傳融合而靶向遞送ranpirnase，可以使對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷實(shí)現(xiàn)中度至數(shù)千倍的增加(newton等人，2001；chang等人，2005；krauss等人，2005b；liu等人，2014)。因此，在本發(fā)明的上下文中，這些特性使得來自豹蛙的rna酶是優(yōu)選的rna酶a家族成員。因此，根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體可以是這樣的構(gòu)建體，其中rnasea家族成員是來自豹蛙的rna酶。

ranpirnase的序列在本領(lǐng)域熟知，如下文seqidno:4所示：

q^*dwltfqkkhitntrdvdcdnimstnlfhckdkntfiysrpepvkaickgiiasknvlttsefylsdcnvtsrpckyklkkstnkfcvtcenqapvhfvgvgsc，其中(^*)代表焦谷氨酸鹽；(seqidno:4)。

本發(fā)明不具體受限于上述ranpirnase的特異序列。相反，rna酶a超家族成員可以為rna酶a變體，其包含如下氨基酸序列或由如下氨基酸序列組成，所述氨基酸序列與seqidno:4的序列有至少95％、90％、85％、75％、70％、65％、60％、55％或50％的序列同源性，只要具有所述氨基酸序列的所述蛋白質(zhì)或肽具有的細(xì)胞毒性活性的能力與對(duì)ranpirnase描述的活性相當(dāng)即可。因此，所述變體的細(xì)胞毒性能力或活性與ranpirnase的活性是類似的，或優(yōu)選甚至更高。應(yīng)用本領(lǐng)域已知的方法如在實(shí)施例中示例性說明的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員能制備相應(yīng)的變體并能容易地確定給定變體是否具有相應(yīng)的所需活性。

此外，具有上述所需功能的rna酶a的變體參考seqidno：4的序列可以具有多至0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多，多至15、20、30、40或50個(gè)保守氨基酸取代。

優(yōu)選的rna酶a超家族成員是人胰腺rna酶(rna酶1或hp-rna酶)。因此，根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體可以是這樣的構(gòu)建體，其中rna酶a家族成員是人胰腺rna酶(rna酶1)。

人胰腺rna酶(rna酶1)的序列在本領(lǐng)域熟知，且顯示于下文seqidno:22：malekslvrllllvlillvlgwvqpslgkesrakkfqrqhmdsdsspsssstycnqmmrrrnmtqgrckpvntfvheplvdvqnvcfqekvtckngqgncyksnssmhitdcrltngsrypncayrtspkerhiivacegspyvpvhfdasvedst；(seqidno:22)。

本發(fā)明不具體受限于上述人胰腺rna酶(rna酶1)的特定序列。相反，rna酶a超家族成員可以為rna酶a變體，其包含如下氨基酸序列或由如下氨基酸序列組成，所述氨基酸序列與seqidno:22的序列有至少95％、90％、85％、75％、70％、65％、60％、55％或50％的序列同源性，只要具有所述氨基酸序列的所述蛋白質(zhì)或肽具有的細(xì)胞毒性活性的與對(duì)人胰腺rna酶(rna酶1)描述的活性相當(dāng)即可。因此，所述變體的細(xì)胞毒性能力或活性與人胰腺rna酶(rna酶1)的活性是相似的，或優(yōu)選甚至更高。應(yīng)用本領(lǐng)域已知的方法如在實(shí)施例中示例性說明的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員能制備相應(yīng)的變體并能容易地確定給定變體是否具有相應(yīng)的所需活性。

此外，具有上述所需功能的rna酶a的變體參考seqidno：22的序列可以具有多至0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多，多至15、20、30、40或50個(gè)保守氨基酸取代。

優(yōu)選的rna酶a超家族成員是血管生成素(rna酶5)。因此，根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體可以是這樣的構(gòu)建體，其中rna酶a家族成員是血管生成素(rna酶5)。

血管生成素(rna酶5)的序列在本領(lǐng)域熟知，且顯示于下文seqidno:23：mvmglgvlllvfvlglgltpptlaqdnsrythfltqhydakpqgrddrycesimrrrgltspckdintfihgnkrsikaicenkngnphrenlriskssfqvttcklhggspwppcqyratagfrnvvvacenglpvhldqsifrrp；(seqidno:23)。

本發(fā)明不具體受限于上述血管生成素(rna酶5)的特定序列。相反，rna酶a超家族成員可以為rna酶a變體，其包含如下氨基酸序列或由如下氨基酸序列組成，所述氨基酸序列與seqidno:23的序列有至少95％、90％、85％、75％、70％、65％、60％、55％或50％的序列同源性，只要具有所述氨基酸序列的所述蛋白質(zhì)或肽具有的細(xì)胞毒性活性的能力與對(duì)血管生成素(rna酶5)描述的活性相當(dāng)即可。因此，所述變體的細(xì)胞毒性能力或活性與血管生成素(rna酶5)的活性相比是相似的，或優(yōu)選甚至更高。應(yīng)用本領(lǐng)域已知的方法如在實(shí)施例中示例性說明的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員能制備相應(yīng)的變體并能容易地確定給定變體是否具有相應(yīng)的所需活性。

此外，具有上述所需功能的rna酶a的變體參考seqidno：23的序列可以具有多至0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多，多至15、20、30、40或50個(gè)保守氨基酸取代。

本發(fā)明涉及上文定義的(a)靶向性部分，(b)由衍生自登革熱病毒糖蛋白e的一個(gè)或多個(gè)融合序列組成的融合部分，所述融合序列包含序列drgwgngcglfgkggi(seqidno：1)或與seqidno：1相比顯示有1至8個(gè)取代、缺失或插入的序列；和/或(c)“貨物”，即待遞送至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子。

本發(fā)明涉及的具體的優(yōu)選構(gòu)建體如下：

本發(fā)明涉及構(gòu)建體，其包含(a)作為靶向性部分的人源化抗egfr抗體單鏈fv片段(scfv)；(b)由衍生自登革熱病毒糖蛋白e的一個(gè)或多個(gè)融合序列組成的融合部分，所述融合序列包含序列drgwgngcglfgkggi(seqidno：1)或與seqidno：1相比顯示有1至8個(gè)取代、缺失或插入的序列；和(c)衍生自豹蛙的rna酶作為待遞送至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子。

本發(fā)明還涉及構(gòu)建體，其包含(a)作為靶向性部分的人源化抗egfr抗體單鏈fv片段(scfv)，其中所述人源化抗-egfrscfv抗體具有以下氨基酸序列：

evqlvesggglvqpggslrlscaasgfsltnygvhwvrqapgkglewlgviwsggntdyntpftsrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycaraltyydyefaywgqgttvtvssggggsggggsggggsdiqltqspsflsasvgdrvtitcrasqsigtnihwyqqkpgkapkllikyasesisgvpsrfsgsgsgteftltisslqpedfatyycqqnnnwpttfgagtkleikr(seqidno:2)；(b)由衍生自登革熱病毒糖蛋白e的一個(gè)或多個(gè)融合序列組成的融合部分，所述融合序列包含序列drgwgngcglfgkggi(seqidno：1)或與seqidno：1相比顯示有1至8個(gè)取代、缺失或插入的序列；和(c)衍生自豹蛙的rna酶作為待遞送至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子。

本發(fā)明還涉及構(gòu)建體，其包含(a)作為靶向性部分的人源化抗egfr抗體單鏈fv片段(scfv)，其中所述人源化抗-egfrscfv抗體具有以下氨基酸序列：

evqlvesggglvqpggslrlscaasgfsltnygvhwvrqapgkglewlgviwsggntdyntpftsrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycaraltyydyefaywgqgttvtvssggggsggggsggggsdiqltqspsflsasvgdrvtitcrasqsigtnihwyqqkpgkapkllikyasesisgvpsrfsgsgsgteftltisslqpedfatyycqqnnnwpttfgagtkleikr(seqidno:2)；(b)由衍生自登革熱病毒糖蛋白e的一個(gè)或多個(gè)融合序列組成的融合部分，所述融合序列包含序列drgwgngcglfgkggi(seqidno：1)或與seqidno：1相比顯示有1至8個(gè)取代、缺失或插入的序列；和(c)衍生自豹蛙的rna酶作為待遞送至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子，其中所述衍生自豹蛙的rna酶為ranpirnase其具有以下氨基酸序列seqidno:4:

q^*dwltfqkkhitntrdvdcdnimstnlfhckdkntfiysrpepvkaickgiiasknvlttsefylsdcnvtsrpckyklkkstnkfcvtcenqapvhfvgvgsc，其中(^*)代表焦谷氨酸鹽；(seqidno:4)。

本發(fā)明還涉及構(gòu)建體，其包含(a)作為靶向性部分的人源化抗egfr抗體單鏈fv片段(scfv)，其中所述人源化抗-egfrscfv抗體具有以下氨基酸序列：

evqlvesggglvqpggslrlscaasgfsltnygvhwvrqapgkglewlgviwsggntdyntpftsrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycaraltyydyefaywgqgttvtvssggggsggggsggggsdiqltqspsflsasvgdrvtitcrasqsigtnihwyqqkpgkapkllikyasesisgvpsrfsgsgsgteftltisslqpedfatyycqqnnnwpttfgagtkleikr(seqidno:2)；(b)由一個(gè)或多個(gè)融合序列組成的融合部分，所述融合序列選自：drgwgngcglfgkggi(seqidno:1)，mvdrgwgngcglfgkggiv(seqidno:3)，drgwgngcglfgkgsi(seqidno:5)；drgwgngcglfgkgsl(seqidno:6)；drgwgngcglfgkggv(seqidno:7)；drgwhngcglfgkgsi(seqidno:8)；drgwhngcgffgkgsi(seqidno:9)；drgwgngcglfgkgsm(seqidno:10)；drgwgngcglfgkgsy(seqidno:11)；drgwnngcglfgkgsl(seqidno:12)；nrgwnngcglfgkgdi(seqidno:13)；drgwgnhcglfgkgsi(seqidno:14)；drgwgnncglfgkgsi(seqidno:15)；drgwgngcalfgkgsi(seqidno:16)；drgwgnhcgffgkgsi(seqidno:17)；drgwdsgcfifgkgev(seqidno:18)；nrgwgtgcfkwgigfv(seqidno:19)及nrgwgtgcfewglgqv(seqidno:20)，或與seqidno:1和seqidno:5至20相比分別顯示有1至8個(gè)取代、刪除或添加的序列；以及(c)衍生自豹蛙的rna酶作為待遞送至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子，其中所述衍生自豹蛙的rna酶為ranpirnase其具有以下氨基酸序列seqidno:4:

q^*dwltfqkkhitntrdvdcdnimstnlfhckdkntfiysrpepvkaickgiiasknvlttsefylsdcnvtsrpckyklkkstnkfcvtcenqapvhfvgvgsc，其中(^*)代表焦谷氨酸鹽；(seqidno:4)。

本發(fā)明還涉及構(gòu)建體，其包含(a)作為靶向性部分的人源化抗cd22抗體單鏈fv片段(scfv)；(b)由衍生自登革熱病毒糖蛋白e的一個(gè)或多個(gè)融合序列組成的融合部分，所述融合序列包含序列drgwgngcglfgkggi(seqidno：1)或與seqidno：1相比顯示有1至8個(gè)取代、缺失或插入的序列；和(c)衍生自豹蛙的rna酶作為待遞送至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子。

本發(fā)明還涉及構(gòu)建體，其包含(a)作為靶向性部分的人源化抗cd22抗體單鏈fv片段(scfv)，其中所述人源化抗-cd22scfv抗體具有以下氨基酸序列：

evqlvesggglvqpggslrlscaasgfafsiydmswvrqvpgkglewvsyissgggttyypdtvkgrftisrdnsrntldlqmnslrvedtavyycarhsgygssygvlfaywggingtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdisnylnwlqqkpgkapklliyytsilhsgvpsrfsgsgsgteftltisslqpedfatyycqqgntlpwtfgqgtkleikr(seqidno:24)；(b)由衍生自登革熱病毒糖蛋白e的一個(gè)或多個(gè)融合序列組成的融合部分，所述融合序列包含序列drgwgngcglfgkggi(seqidno：1)或與seqidno：1相比顯示有1至8個(gè)取代、缺失或插入的序列；和(c)衍生自豹蛙的rna酶作為待遞送至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子。

本發(fā)明還涉及構(gòu)建體，其包含(a)作為靶向性部分的人源化抗cd22抗體單鏈fv片段(scfv)，其中所述人源化抗-cd22scfv抗體具有以下氨基酸序列：

evqlvesggglvqpggslrlscaasgfafsiydmswvrqvpgkglewvsyissgggttyypdtvkgrftisrdnsrntldlqmnslrvedtavyycarhsgygssygvlfaywggingtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdisnylnwlqqkpgkapklliyytsilhsgvpsrfsgsgsgteftltisslqpedfatyycqqgntlpwtfgqgtkleikr(seqidno:24)；(b)由衍生自登革熱病毒糖蛋白e的一個(gè)或多個(gè)融合序列組成的融合部分，所述融合序列包含序列drgwgngcglfgkggi(seqidno：1)或與seqidno：1相比顯示有1至8個(gè)取代、缺失或插入的序列；和(c)衍生自豹蛙的rna酶作為待遞送至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子，其中所述衍生自豹蛙的rna酶為ranpirnase其具有以下氨基酸序列seqidno:4:

q^*dwltfqkkhitntrdvdcdnimstnlfhckdkntfiysrpepvkaickgiiasknvlttsefylsdcnvtsrpckyklkkstnkfcvtcenqapvhfvgvgsc，其中(^*)代表焦谷氨酸鹽；(seqidno:4)。

本發(fā)明還涉及構(gòu)建體，其包含(a)作為靶向性部分的人源化抗cd22抗體單鏈fv片段(scfv)，其中所述人源化抗-cd22scfv抗體具有以下氨基酸序列：

evqlvesggglvqpggslrlscaasgfafsiydmswvrqvpgkglewvsyissgggttyypdtvkgrftisrdnsrntldlqmnslrvedtavyycarhsgygssygvlfaywggingtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdisnylnwlqqkpgkapklliyytsilhsgvpsrfsgsgsgteftltisslqpedfatyycqqgntlpwtfgqgtkleikr(seqidno:24)；(b)由一個(gè)或多個(gè)融合序列組成的融合部分，所述融合序列選自drgwgngcglfgkggi(seqidno:1)，mvdrgwgngcglfgkggiv(seqidno:3)；drgwgngcglfgkgsi(seqidno:5)；drgwgngcglfgkgsl(seqidno:6)；drgwgngcglfgkggv(seqidno:7)；drgwhngcglfgkgsi(seqidno:8)；drgwhngcgffgkgsi(seqidno:9)；drgwgngcglfgkgsm(seqidno:10)；drgwgngcglfgkgsy(seqidno:11)；drgwnngcglfgkgsl(seqidno:12)；nrgwnngcglfgkgdi(seqidno:13)；drgwgnhcglfgkgsi(seqidno:14)；drgwgnncglfgkgsi(seqidno:15)；drgwgngcalfgkgsi(seqidno:16)；drgwgnhcgffgkgsi(seqidno:17)；drgwdsgcfifgkgev(seqidno:18)；nrgwgtgcfkwgigfv(seqidno:19)和nrgwgtgcfewglgqv(seqidno:20)，或與seqidno:1和seqidno:5至20相比分別顯示有1至8個(gè)取代、刪除或添加的序列；以及(c)衍生自豹蛙的rna酶作為待遞送至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子，其中所述衍生自豹蛙的rna酶為ranpirnase其具有以下氨基酸序列seqidno:4:

q^*dwltfqkkhitntrdvdcdnimstnlfhckdkntfiysrpepvkaickgiiasknvlttsefylsdcnvtsrpckyklkkstnkfcvtcenqapvhfvgvgsc，其中(^*)代表焦谷氨酸鹽；(seqidno:4)。

本發(fā)明涉及構(gòu)建體，其包含(a)作為靶向性部分的人源化抗egfr抗體單鏈fv片段(scfv)；(b)由衍生自登革熱病毒糖蛋白e的一個(gè)或多個(gè)融合序列組成的融合部分，所述融合序列包含序列drgwgngcglfgkggi(seqidno：1)或與seqidno：1相比顯示有1至8個(gè)取代、缺失或插入的序列；和(c)人胰腺rna酶(rna酶1或hp-rna酶)作為待遞送至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子。

本發(fā)明還涉及構(gòu)建體，其包含(a)作為靶向性部分的人源化抗egfr抗體單鏈fv片段(scfv)，其中所述人源化抗-egfrscfv抗體具有以下氨基酸序列：

evqlvesggglvqpggslrlscaasgfsltnygvhwvrqapgkglewlgviwsggntdyntpftsrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycaraltyydyefaywgqgttvtvssggggsggggsggggsdiqltqspsflsasvgdrvtitcrasqsigtnihwyqqkpgkapkllikyasesisgvpsrfsgsgsgteftltisslqpedfatyycqqnnnwpttfgagtkleikr(seqidno:2)；(b)由衍生自登革熱病毒糖蛋白e的一個(gè)或多個(gè)融合序列組成的融合部分，所述融合序列包含序列drgwgngcglfgkggi(seqidno：1)或與seqidno：1相比顯示有1至8個(gè)取代、缺失或插入的序列；和(c)人胰腺rna酶(rna酶1或hp-rna酶)作為待遞送至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子。

本發(fā)明還涉及構(gòu)建體，其包含(a)作為靶向性部分的人源化抗egfr抗體單鏈fv片段(scfv)，其中所述人源化抗-egfrscfv抗體具有以下氨基酸序列：

evqlvesggglvqpggslrlscaasgfsltnygvhwvrqapgkglewlgviwsggntdyntpftsrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycaraltyydyefaywgqgttvtvssggggsggggsggggsdiqltqspsflsasvgdrvtitcrasqsigtnihwyqqkpgkapkllikyasesisgvpsrfsgsgsgteftltisslqpedfatyycqqnnnwpttfgagtkleikr(seqidno：2)；(b)由衍生自登革熱病毒糖蛋白e的一個(gè)或多個(gè)融合序列組成的融合部分，所述融合序列包含序列drgwgngcglfgkggi(seqidno：1)或與seqidno：1相比顯示有1至8個(gè)取代、缺失或插入的序列；和(c)人胰腺rna酶(rna酶1或hp-rna酶)作為待遞送至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子，其中所述人胰腺rna酶(rna酶1或hp-rna酶)具有以下氨基酸序列seqidno:22:malekslvrllllvlillvlgwvqpslgkesrakkfqrqhmdsdsspsssstycnqmmrrrnmtqgrckpvntfvheplvdvqnvcfqekvtckngqgncyksnssmhitdcrltngsrypncayrtspkerhiivacegspyvpvhfdasvedst；(seqidno:22)。

本發(fā)明還涉及構(gòu)建體，其包含(a)作為靶向性部分的人源化抗egfr抗體單鏈fv片段(scfv)，其中所述人源化抗-egfrscfv抗體具有以下氨基酸序列：

evqlvesggglvqpggslrlscaasgfsltnygvhwvrqapgkglewlgviwsggntdyntpftsrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycaraltyydyefaywgqgttvtvssggggsggggsggggsdiqltqspsflsasvgdrvtitcrasqsigtnihwyqqkpgkapkllikyasesisgvpsrfsgsgsgteftltisslqpedfatyycqqnnnwpttfgagtkleikr(seqidno:2)；(b)由一個(gè)或多個(gè)融合序列組成的融合部分，所述融合序列選自drgwgngcglfgkggi(seqidno:1)，mvdrgwgngcglfgkggiv(seqidno:3)，drgwgngcglfgkgsi(seqidno:5)；drgwgngcglfgkgsl(seqidno:6)；drgwgngcglfgkggv(seqidno:7)；drgwhngcglfgkgsi(seqidno:8)；drgwhngcgffgkgsi(seqidno:9)；drgwgngcglfgkgsm(seqidno:10)；drgwgngcglfgkgsy(seqidno:11)；drgwnngcglfgkgsl(seqidno:12)；nrgwnngcglfgkgdi(seqidno:13)；drgwgnhcglfgkgsi(seqidno:14)；drgwgnncglfgkgsi(seqidno:15)；drgwgngcalfgkgsi(seqidno:16)；drgwgnhcgffgkgsi(seqidno:17)；drgwdsgcfifgkgev(seqidno:18)；nrgwgtgcfkwgigfv(seqidno:19)和nrgwgtgcfewglgqv(seqidno:20)，或與seqidno:1和seqidno:5至20相比分別顯示有1至8個(gè)取代、刪除或添加的序列；和(c)人胰腺rna酶(rna酶1或hp-rna酶)作為待遞送至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子，其中所述人胰腺rna酶(rna酶1或hp-rna酶)具有以下氨基酸序列seqidno:22:

malekslvrllllvlillvlgwvqpslgkesrakkfqrqhmdsdsspsssstycnqmmrrrnmtqgrckpvntfvheplvdvqnvcfqekvtckngqgncyksnssmhitdcrltngsrypncayrtspkerhiivacegspyvpvhfdasvedst；(seqidno:22)。

本發(fā)明還涉及構(gòu)建體，其包含(a)作為靶向性部分的人源化抗cd22抗體單鏈fv片段(scfv)；(b)由衍生自登革熱病毒糖蛋白e的一個(gè)或多個(gè)融合序列組成的融合部分，其包含序列drgwgngcglfgkggi(seqidno：1)或與seqidno：1相比顯示有1至8個(gè)取代、缺失或插入的序列；和(c)人胰腺rna酶(rna酶1或hp-rna酶)作為待遞送至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子。

本發(fā)明還涉及構(gòu)建體，其包含(a)作為靶向性部分的人源化抗cd22抗體單鏈fv片段(scfv)，其中所述人源化抗-cd22scfv抗體具有以下氨基酸序列：

evqlvesggglvqpggslrlscaasgfafsiydmswvrqvpgkglewvsyissgggttyypdtvkgrftisrdnsrntldlqmnslrvedtavyycarhsgygssygvlfaywggingtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdisnylnwlqqkpgkapklliyytsilhsgvpsrfsgsgsgteftltisslqpedfatyycqqgntlpwtfgqgtkleikr(seqidno:24)；(b)由衍生自登革熱病毒糖蛋白e的一個(gè)或多個(gè)融合序列組成的融合部分，其包含序列drgwgngcglfgkggi(seqidno：1)或與seqidno：1相比顯示有1至8個(gè)取代、缺失或插入的序列；和(c)人胰腺rna酶(rna酶1或hp-rna酶)作為待遞送至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子。

本發(fā)明還涉及構(gòu)建體，其包含(a)作為靶向性部分的人源化抗cd22抗體單鏈fv片段(scfv)，其中所述人源化抗-cd22scfv抗體具有以下氨基酸序列：

evqlvesggglvqpggslrlscaasgfafsiydmswvrqvpgkglewvsyissgggttyypdtvkgrftisrdnsrntldlqmnslrvedtavyycarhsgygssygvlfaywggingtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdisnylnwlqqkpgkapklliyytsilhsgvpsrfsgsgsgteftltisslqpedfatyycqqgntlpwtfgqgtkleikr(seqidno:24)；(b)由衍生自登革熱病毒糖蛋白e的一個(gè)或多個(gè)融合序列組成的融合部分，其包含序列drgwgngcglfgkggi(seqidno：1)或與seqidno：1相比顯示有1至8個(gè)取代、缺失或插入的序列；和(c)人胰腺rna酶(rna酶1或hp-rna酶)作為待遞送至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子，其中所述人胰腺rna酶(rna酶1或hp-rna酶)具有以下氨基酸序列seqidno:22:malekslvrllllvlillvlgwvqpslgkesrakkfqrqhmdsdsspsssstycnqmmrrrnmtqgrckpvntfvheplvdvqnvcfqekvtckngqgncyksnssmhitdcrltngsrypncayrtspkerhiivacegspyvpvhfdasvedst；(seqidno:22)。

本發(fā)明還涉及構(gòu)建體，其包含(a)作為靶向性部分的人源化抗cd22抗體單鏈fv片段(scfv)，其中所述人源化抗-cd22scfv抗體具有以下氨基酸序列：

evqlvesggglvqpggslrlscaasgfafsiydmswvrqvpgkglewvsyissgggttyypdtvkgrftisrdnsrntldlqmnslrvedtavyycarhsgygssygvlfaywggingtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdisnylnwlqqkpgkapklliyytsilhsgvpsrfsgsgsgteftltisslqpedfatyycqqgntlpwtfgqgtkleikr(seqidno:24)；(b)由一個(gè)或多個(gè)融合序列組成的融合部分，所述融合序列選自drgwgngcglfgkggi(seqidno:1)，mvdrgwgngcglfgkggiv(seqidno:3)，drgwgngcglfgkgsi(seqidno:5)；drgwgngcglfgkgsl(seqidno:6)；drgwgngcglfgkggv(seqidno:7)；drgwhngcglfgkgsi(seqidno:8)；drgwhngcgffgkgsi(seqidno:9)；drgwgngcglfgkgsm(seqidno:10)；drgwgngcglfgkgsy(seqidno:11)；drgwnngcglfgkgsl(seqidno:12)；nrgwnngcglfgkgdi(seqidno:13)；drgwgnhcglfgkgsi(seqidno:14)；drgwgnncglfgkgsi(seqidno:15)；drgwgngcalfgkgsi(seqidno:16)；drgwgnhcgffgkgsi(seqidno:17)；drgwdsgcfifgkgev(seqidno:18)；nrgwgtgcfkwgigfv(seqidno:19)和nrgwgtgcfewglgqv(seqidno:20)，或與seqidno:1和seqidno:5至20相比分別顯示有1至8個(gè)取代、刪除或添加的序列；以及(c)人胰腺rna酶(rna酶1或hp-rna酶)作為待遞送至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子，其中所述人胰腺rna酶(rna酶1或hp-rna酶)具有以下氨基酸序列seqidno:22:

malekslvrllllvlillvlgwvqpslgkesrakkfqrqhmdsdsspsssstycnqmmrrrnmtqgrckpvntfvheplvdvqnvcfqekvtckngqgncyksnssmhitdcrltngsrypncayrtspkerhiivacegspyvpvhfdasvedst；(seqidno:22)。

本發(fā)明涉及構(gòu)建體，其包含(a)作為靶向性部分的人源化抗egfr抗體單鏈fv片段(scfv)；(b)由衍生自登革熱病毒糖蛋白e的一個(gè)或多個(gè)融合序列組成的融合部分，所述融合序列包含序列drgwgngcglfgkggi(seqidno：1)或與seqidno：1相比顯示有1至8個(gè)取代、缺失或插入的序列；和(c)血管生成素(rna酶5)作為待遞送至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子。

本發(fā)明還涉及構(gòu)建體，其包含(a)作為靶向性部分的人源化抗egfr抗體單鏈fv片段(scfv)，其中所述人源化抗-egfrscfv抗體具有以下氨基酸序列：

evqlvesggglvqpggslrlscaasgfsltnygvhwvrqapgkglewlgviwsggntdyntpftsrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycaraltyydyefaywgqgttvtvssggggsggggsggggsdiqltqspsflsasvgdrvtitcrasqsigtnihwyqqkpgkapkllikyasesisgvpsrfsgsgsgteftltisslqpedfatyycqqnnnwpttfgagtkleikr(seqidno:2)；(b)由衍生自登革熱病毒糖蛋白e的一個(gè)或多個(gè)融合序列組成的融合部分，所述融合序列包含序列drgwgngcglfgkggi(seqidno：1)或與seqidno：1相比顯示有1至8個(gè)取代、缺失或插入的序列；和(c)血管生成素(rna酶5)作為待遞送至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子。

本發(fā)明還涉及構(gòu)建體，其包含(a)作為靶向性部分的人源化抗egfr抗體單鏈fv片段(scfv)，其中所述人源化抗-egfrscfv抗體具有以下氨基酸序列：

evqlvesggglvqpggslrlscaasgfsltnygvhwvrqapgkglewlgviwsggntdyntpftsrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycaraltyydyefaywgqgttvtvssggggsggggsggggsdiqltqspsflsasvgdrvtitcrasqsigtnihwyqqkpgkapkllikyasesisgvpsrfsgsgsgteftltisslqpedfatyycqqnnnwpttfgagtkleikr(seqidno:2)；(b)由衍生自登革熱病毒糖蛋白e的一個(gè)或多個(gè)融合序列組成的融合部分，所述融合序列包含序列drgwgngcglfgkggi(seqidno：1)或與seqidno：1相比顯示有1至8個(gè)取代、缺失或插入的序列；和(c)血管生成素(rna酶5)作為待遞送至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子，其中所述血管生成素(rna酶5)具有氨基酸序列seqidno:23:

mvmglgvlllvfvlglgltpptlaqdnsrythfltqhydakpqgrddrycesimrrrgltspckdintfihgnkrsikaicenkngnphrenlriskssfqvttcklhggspwppcqyratagfrnvvvacenglpvhldqsifrrp；(seqidno:23)。

本發(fā)明還涉及構(gòu)建體，其包含(a)作為靶向性部分的人源化抗egfr抗體單鏈fv片段(scfv)，其中所述人源化抗-egfrscfv抗體具有以下氨基酸序列：

evqlvesggglvqpggslrlscaasgfsltnygvhwvrqapgkglewlgviwsggntdyntpftsrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycaraltyydyefaywgqgttvtvssggggsggggsggggsdiqltqspsflsasvgdrvtitcrasqsigtnihwyqqkpgkapkllikyasesisgvpsrfsgsgsgteftltisslqpedfatyycqqnnnwpttfgagtkleikr(seqidno:2)；(b)由一個(gè)或多個(gè)融合序列組成的融合部分，所述融合序列選自drgwgngcglfgkggi(seqidno:1)，mvdrgwgngcglfgkggiv(seqidno:3)，drgwgngcglfgkgsi(seqidno:5)；drgwgngcglfgkgsl(seqidno:6)；drgwgngcglfgkggv(seqidno:7)；drgwhngcglfgkgsi(seqidno:8)；drgwhngcgffgkgsi(seqidno:9)；drgwgngcglfgkgsm(seqidno:10)；drgwgngcglfgkgsy(seqidno:11)；drgwnngcglfgkgsl(seqidno:12)；nrgwnngcglfgkgdi(seqidno:13)；drgwgnhcglfgkgsi(seqidno:14)；drgwgnncglfgkgsi(seqidno:15)；drgwgngcalfgkgsi(seqidno:16)；drgwgnhcgffgkgsi(seqidno:17)；drgwdsgcfifgkgev(seqidno:18)；nrgwgtgcfkwgigfv(seqidno:19)和nrgwgtgcfewglgqv(seqidno:20)，或與seqidno:1和seqidno:5至20相比分別顯示有1至8個(gè)取代、刪除或添加的序列；和(c)血管生成素(rna酶5)作為待遞送至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子，其中所述血管生成素(rna酶5)具有氨基酸序列seqidno:23:

mvmglgvlllvfvlglgltpptlaqdnsrythfltqhydakpqgrddrycesimrrrgltspckdintfihgnkrsikaicenkngnphrenlriskssfqvttcklhggspwppcqyratagfrnvvvacenglpvhldqsifrrp；(seqidno:23)。

本發(fā)明還涉及構(gòu)建體，其包含(a)作為靶向性部分的人源化抗cd22抗體單鏈fv片段(scfv)；(b)由衍生自登革熱病毒糖蛋白e的一個(gè)或多個(gè)融合序列組成的融合部分，所述融合序列包含序列drgwgngcglfgkggi(seqidno：1)或與seqidno：1相比顯示有1至8個(gè)取代、缺失或插入的序列；和(c)血管生成素(rna酶5)作為待遞送至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子。

本發(fā)明還涉及構(gòu)建體，其包含(a)作為靶向性部分的人源化抗cd22抗體單鏈fv片段(scfv)，其中所述人源化抗-cd22scfv抗體具有以下氨基酸序列：

evqlvesggglvqpggslrlscaasgfafsiydmswvrqvpgkglewvsyissgggttyypdtvkgrftisrdnsrntldlqmnslrvedtavyycarhsgygssygvlfaywggingtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdisnylnwlqqkpgkapklliyytsilhsgvpsrfsgsgsgteftltisslqpedfatyycqqgntlpwtfgqgtkleikr(seqidno:24)；(b)由衍生自登革熱病毒糖蛋白e的一個(gè)或多個(gè)融合序列組成的融合部分，所述融合序列包含序列drgwgngcglfgkggi(seqidno：1)或與seqidno：1相比顯示有1至8個(gè)取代、缺失或插入的序列；和(c)血管生成素(rna酶5)作為待遞送至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子。

本發(fā)明還涉及構(gòu)建體，其包含(a)作為靶向性部分的人源化抗cd22抗體單鏈fv片段(scfv)，其中所述人源化抗-cd22scfv抗體具有以下氨基酸序列：

evqlvesggglvqpggslrlscaasgfafsiydmswvrqvpgkglewvsyissgggttyypdtvkgrftisrdnsrntldlqmnslrvedtavyycarhsgygssygvlfaywggingtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdisnylnwlqqkpgkapklliyytsilhsgvpsrfsgsgsgteftltisslqpedfatyycqqgntlpwtfgqgtkleikr(seqidno:24)；(b)由衍生自登革熱病毒糖蛋白e的一個(gè)或多個(gè)融合序列組成的融合部分，所述融合序列包含序列drgwgngcglfgkggi(seqidno：1)或與seqidno：1相比顯示有1至8個(gè)取代、缺失或插入的序列；和(c)血管生成素(rna酶5)作為待遞送至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子，其中所述血管生成素(rna酶5)具有以下氨基酸序列seqidno:23:

mvmglgvlllvfvlglgltpptlaqdnsrythfltqhydakpqgrddrycesimrrrgltspckdintfihgnkrsikaicenkngnphrenlriskssfqvttcklhggspwppcqyratagfrnvvvacenglpvhldqsifrrp；(seqidno:23)。

本發(fā)明還涉及構(gòu)建體，其包含(a)作為靶向性部分的人源化抗cd22抗體單鏈fv片段(scfv)，其中所述人源化抗-cd22scfv抗體具有以下氨基酸序列：

evqlvesggglvqpggslrlscaasgfafsiydmswvrqvpgkglewvsyissgggttyypdtvkgrftisrdnsrntldlqmnslrvedtavyycarhsgygssygvlfaywggingtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdisnylnwlqqkpgkapklliyytsilhsgvpsrfsgsgsgteftltisslqpedfatyycqqgntlpwtfgqgtkleikr(seqidno:24)；(b)由一個(gè)或多個(gè)融合序列組成的融合部分，所述融合序列選自drgwgngcglfgkggi(seqidno:1)，mvdrgwgngcglfgkggiv(seqidno:3)；drgwgngcglfgkgsi(seqidno:5)；drgwgngcglfgkgsl(seqidno:6)；drgwgngcglfgkggv(seqidno:7)；drgwhngcglfgkgsi(seqidno:8)；drgwhngcgffgkgsi(seqidno:9)；drgwgngcglfgkgsm(seqidno:10)；drgwgngcglfgkgsy(seqidno:11)；drgwnngcglfgkgsl(seqidno:12)；nrgwnngcglfgkgdi(seqidno:13)；drgwgnhcglfgkgsi(seqidno:14)；drgwgnncglfgkgsi(seqidno:15)；drgwgngcalfgkgsi(seqidno:16)；drgwgnhcgffgkgsi(seqidno:17)；drgwdsgcfifgkgev(seqidno:18)；nrgwgtgcfkwgigfv(seqidno:19)和nrgwgtgcfewglgqv(seqidno:20)，或與seqidno:1和seqidno:5至20相比分別顯示有1至8個(gè)取代、刪除或添加的序列；以及(c)血管生成素(rna酶5)作為待遞送至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子，其中所述血管生成素(rna酶5)具有以下氨基酸序列seqidno:23:

mvmglgvlllvfvlglgltpptlaqdnsrythfltqhydakpqgrddrycesimrrrgltspckdintfihgnkrsikaicenkngnphrenlriskssfqvttcklhggspwppcqyratagfrnvvvacenglpvhldqsifrrp；(seqidno:23)。

如上所述，根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體包含至少兩個(gè)，優(yōu)選上述三個(gè)主要模塊，即(a)靶向性部分，(b)由一個(gè)或多個(gè)融合序列組成的融合部分和(c)待遞送至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子。所有三個(gè)主模塊可以(化學(xué)地或通過重組技術(shù))單獨(dú)合成，任選地經(jīng)過純化，然后通過共價(jià)鍵化學(xué)偶聯(lián)。因此，根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體可以是這樣的構(gòu)建體，其中靶向性部分、由一個(gè)或多個(gè)融合序列組成的融合部分和待遞送至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的分子由共價(jià)鍵化學(xué)偶聯(lián)。備選地，模塊(a)和(b)可以是融合蛋白，而模塊(c)以共價(jià)鍵與包含模塊(a)和(b)的所述融合蛋白化學(xué)偶聯(lián)。在另一個(gè)備選方案中，模塊(a)和(c)可以是融合蛋白，而模塊(b)以共價(jià)鍵與包含模塊(a)和(c)的所述融合蛋白化學(xué)偶聯(lián)。在另一個(gè)備選方案中，模塊(b)和(c)可以是融合蛋白，而模塊(a)以共價(jià)鍵與包含模塊(b)和(c)的所述融合蛋白化學(xué)偶聯(lián)。

術(shù)語“以共價(jià)鍵化學(xué)偶聯(lián)”涉及技術(shù)人員熟知的綴合技術(shù)。許多用于制備與蛋白質(zhì)或肽(具體而言是與本發(fā)明的融合部分或融合序列/肽)的共價(jià)或非共價(jià)綴合物的方法是本領(lǐng)域已知的，并且任何這樣的已知方法都可以使用。不受理論束縛，根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體可以通過使用異雙功能交聯(lián)劑如n-琥珀酰-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(spdp)來制備。yu等人，int.j.cancer56：244(1994)。這種綴合的一般技術(shù)是本領(lǐng)域公知的；參見例如wong，chemistryofproteinconjugationandcross-linking(crcpress1991)；upeslacis等人，“modificationofantibodiesbychemicalmethods，”見monoclonalantibodies：principlesandapplications，birch等人(eds.)，187-230頁(wiley-liss，inc.1995)；price，“productionandcharacterizationofsyntheticpeptide-derivedantibodies”，monoclonalantibodies：production，engineeringandclinicalapplication，ritter等人(eds.)，第60-84頁(cambridgeuniversitypress1995)。因此，考慮到用于將各部分彼此共價(jià)相連，優(yōu)選連接至蛋白質(zhì)/肽(其可以是“靶向性部分”，由一個(gè)或多個(gè)促融合序列組成的融合部分和/或根據(jù)本發(fā)明的“貨物”)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的事實(shí)，因此提供的實(shí)施例不是限制性的。對(duì)將染料(共價(jià))偶聯(lián)至蛋白質(zhì)參比品的方法的概述參見例如brinkleym.bioconjugchem.1992jan-feb3(1)：2-13的綜述文章；和lopez-jaramillo等人的文章，第16章，題為“vinylsulfone：amulti-purposefunctioninproteomics”；biochemistry，geneticsandmolecularbiology“integrativeproteomics”一書，作者：hon-chiueastwoodleung，主題編輯：tsz-kwongman和ricardoj.flores，isbn978-953-51-0070-6，發(fā)表日期：2012年2月24日。

根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體不僅可以包含上述三個(gè)主模塊(a)，(b)和(c)。相反，還可能期望在單個(gè)模塊(a)之間放置連接子部分/部分，其可以例如促進(jìn)構(gòu)建體的構(gòu)建。

本發(fā)明的構(gòu)建體還可以是融合蛋白。已知有多種方法可用于制備融合蛋白，包括核酸合成、雜交和/或擴(kuò)增以產(chǎn)生編碼目的融合蛋白的合成雙鏈核酸。這樣的雙鏈核酸可以通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)插入到用于產(chǎn)生融合蛋白的表達(dá)載體中(參見例如sambrook等，molecularcloning，alaboratorymanual，第2版，1989)。

本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明的融合蛋白形式的構(gòu)建體的核酸分子。核酸是例如編碼本發(fā)明的構(gòu)建體的三個(gè)主要模塊之一的dna。備選地，所述核酸(優(yōu)選dna)編碼如上所定義的框內(nèi)連接的所有三個(gè)主要模塊。因此，核酸分子也可以編碼本發(fā)明的主要模塊中的一個(gè)、兩個(gè)或所有三個(gè)。本發(fā)明的上述核酸分子可以是天然核酸分子以及重組核酸分子。因此，本發(fā)明的核酸分子可以是天然來源的、合成的或半合成的。其可以包含dna、rna以及pna，并且其可以是其雜交體。

對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可將調(diào)控序列添加到本發(fā)明的核酸分子中。例如，可以使用允許本發(fā)明的多核苷酸進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子和/或序列。合適的誘導(dǎo)型系統(tǒng)為例如四環(huán)素調(diào)控的基因表達(dá)，例如由gossen和bujard，natl.acad.sci.usa89(1992)，5547-5551)和gossen，trendsbiotech.12(1994)，58-62)描述，或地塞米松誘導(dǎo)型基因表達(dá)系統(tǒng)，例如由crook，emboj.8(1989)，513-519描述。

進(jìn)一步地，所述核酸分子可以包含例如硫酯鍵和/或核苷酸類似物。所述修飾可用于使核酸分子針對(duì)細(xì)胞中的內(nèi)切核酸酶和/或外切核酸酶進(jìn)行穩(wěn)定化。所述核酸分子可以通過含有允許所述核酸分子在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的嵌合基因的合適載體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。在本發(fā)明的上下文中，所述核酸分子受到標(biāo)記。用于檢測(cè)核酸的方法是本領(lǐng)域熟知的，例如southern和northern印跡、pcr或引物延伸等方法。

本發(fā)明的核酸分子可以是重組產(chǎn)生的嵌合核酸分子，其包含單獨(dú)或組合的任何上述核酸分子。優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸分子是載體的一部分。

因此，本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的核酸分子的載體。本發(fā)明由此涉及載體，優(yōu)選包含本發(fā)明的核酸的表達(dá)載體。

本發(fā)明的載體可以是例如常規(guī)用于遺傳工程的質(zhì)粒、粘粒、病毒、噬菌體或其它載體，并且可以包含其它的基因，例如標(biāo)記物基因，其允許在合適的宿主細(xì)胞中和在合適的條件下對(duì)所述載體進(jìn)行選擇。

此外，除了本發(fā)明的核酸序列之外，本發(fā)明的載體可以包含表達(dá)控制元件，允許編碼區(qū)在合適的宿主中得到適當(dāng)表達(dá)。這樣的控制元件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可以包括啟動(dòng)子、剪接盒、翻譯起始密碼子及用于將插入片段引入載體的翻譯和插入位點(diǎn)。優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸分子可操作地連接到允許其在真核或原核細(xì)胞中表達(dá)的所述表達(dá)控制序列。因此，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的核酸的載體，其中所述核酸可操作地連接至控制序列，當(dāng)用該載體轉(zhuǎn)染真核和/或原核(宿主)細(xì)胞宿主細(xì)胞是，宿主細(xì)胞可識(shí)別所述控制序列。

確保在真核和原核(宿主)細(xì)胞中表達(dá)的對(duì)照元件是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。如上文所述，它們通常包含確保轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控序列和任選的多聚a信號(hào)，后者確保轉(zhuǎn)錄終止和轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定。另外的調(diào)控元件可以包括轉(zhuǎn)錄和翻譯增強(qiáng)子，及/或天然結(jié)合的或異源的啟動(dòng)子區(qū)。允許在例如哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中表達(dá)的可能的調(diào)控元件包括cmv-hsv胸苷激酶啟動(dòng)子、sv40、rsv-啟動(dòng)子(勞氏肉瘤病毒)、人延伸因子1α-啟動(dòng)子、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型mmtv-啟動(dòng)子(小鼠乳腺腫瘤病毒)、金屬硫蛋白或四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或增強(qiáng)子如cmv增強(qiáng)子或sv40增強(qiáng)子。為了在神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)，預(yù)期可以使用神經(jīng)纖維、pgdf-、nse-、prp-或thy-1-啟動(dòng)子。所述這些啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知的，并且尤其在charron，j.biol.chem.270(1995)，25739-25745中得到描述。對(duì)于在原核細(xì)胞中的表達(dá)，已經(jīng)描述有許多啟動(dòng)子，包括例如tac-lac-啟動(dòng)子或trp啟動(dòng)子。除了負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄起始的元件之外，這些調(diào)控元件還可以包含在多核苷酸下游的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，例如sv40多聚a位點(diǎn)或tk多聚a位點(diǎn)。在本文中，合適的表達(dá)載體是本領(lǐng)域已知的，諸如okayama-bergcdna表達(dá)載體pcdv1(pharmacia)、prc/cmv、pcdna1、pcdna3(invitrogene)、psport1(gibcobrl)、px(pagano，science255(1992)，1144-1147)，酵母雙雜交載體如peg202和dpjg4-5(gyuris，cell75(1995)，791-803)或原核表達(dá)載體例如λgt11或pgex(amersham-pharmacia)。除了本發(fā)明的核酸分子之外，所述載體還可以進(jìn)一步包含編碼分泌信號(hào)的核酸序列。這些序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。此外，根據(jù)所用表達(dá)系統(tǒng)，可將能夠使本發(fā)明的肽導(dǎo)向細(xì)胞區(qū)室的前導(dǎo)序列加到本發(fā)明的核酸分子的編碼序列上，這些前導(dǎo)序列也是本領(lǐng)域熟知的。在適當(dāng)時(shí)期將所述(這些)前導(dǎo)序列與翻譯、起始和終止序列組裝，優(yōu)選是能夠指導(dǎo)將翻譯后的蛋白質(zhì)或其蛋白質(zhì)分泌到周質(zhì)空間或細(xì)胞外培養(yǎng)基中的前導(dǎo)序列。任選地，異源序列可以編碼包括c-或n-末端識(shí)別肽的融合蛋白，其中所述識(shí)別肽賦予了期望特征例如使表達(dá)的重組產(chǎn)物穩(wěn)定化或純化簡(jiǎn)化。一旦載體已經(jīng)并入合適的宿主中，將宿主維持于適合核苷酸序列高水平表達(dá)的條件下，如果需要，隨后可以收集和純化本發(fā)明的抗體分子或其片段。

此外，本發(fā)明的載體也可以是表達(dá)載體。本發(fā)明的核酸分子和載體可以設(shè)計(jì)為直接引入或通過脂質(zhì)體、病毒載體(例如腺病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒)、電穿孔、發(fā)射(例如基因槍)或其它遞送系統(tǒng)引入細(xì)胞中。另外，桿狀病毒系統(tǒng)可以用作本發(fā)明的核酸分子的真核表達(dá)系統(tǒng)。

本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的載體的宿主細(xì)胞。因此，本發(fā)明涉及用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的宿主或攜帶本發(fā)明的載體的非人宿主，即，涉及經(jīng)過根據(jù)本發(fā)明的核酸分子或包含所述核酸分子的載體的遺傳修飾哦哦宿主細(xì)胞或宿主。術(shù)語“遺傳修飾的”是指宿主細(xì)胞或宿主除了其天然基因組外還包含根據(jù)本發(fā)明的核酸分子或載體，其被引入細(xì)胞或宿主或者其前體/親本中。核酸分子或載體可以作為基因組外部的獨(dú)立分子，優(yōu)選作為能夠復(fù)制的分子存在于遺傳修飾的宿主細(xì)胞或宿主中，或者其可以穩(wěn)定地整合到宿主細(xì)胞或宿主的基因組中。用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行，例如sambrook和russell(2001)，molecularcloning：alaboratorymanual，cshpress，coldspringharbor，ny，usa；methodsinyeastgenetics，alaboratorycoursemanual，coldspringharborlaboratorypress，1990。在滿足所使用的特定宿主細(xì)胞的要求的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞，具體而言在ph值、溫度、鹽濃度、通氣、抗生素、維生素、微量元素等方面滿足要求。

本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以是任何原核或真核細(xì)胞。合適的原核細(xì)胞是通常用于克隆的原核細(xì)胞，如大腸桿菌(e.coli)或枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)。此外，真核細(xì)胞包括例如真菌或動(dòng)物細(xì)胞。合適的真菌細(xì)胞的實(shí)例是酵母細(xì)胞，優(yōu)選酵母屬，最優(yōu)選釀酒酵母種屬的那些細(xì)胞。合適的動(dòng)物細(xì)胞是例如昆蟲細(xì)胞、脊椎動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如，hek293、nso、cho、cos-7、mdck、u2-os、hela、nih3t3、molt-4、jurkat、pc-12、pc-3、imr、nt2n、sk-n-sh、caski、c33a。這些宿主細(xì)胞，例如cho細(xì)胞可以為本發(fā)明的抗體分子提供翻譯后(二級(jí))修飾，包括去除前導(dǎo)肽，h和c鏈的折疊和裝配、在正確的一側(cè)對(duì)分子進(jìn)行糖基化和功能分子的分泌。本領(lǐng)域已知的其它合適的細(xì)胞系可從細(xì)胞系保藏中心獲得，例如德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh，dsmz)或美國典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc)。根據(jù)本發(fā)明，進(jìn)一步預(yù)期的是原代細(xì)胞/細(xì)胞培養(yǎng)物可以作為宿主細(xì)胞。所述細(xì)胞具體衍生自昆蟲(如果蠅或蜚蠊種屬的昆蟲)或哺乳動(dòng)物(如人、豬、小鼠或大鼠)。所述宿主細(xì)胞還可以包含來自和/或衍生自如神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的細(xì)胞系的細(xì)胞。上述原代細(xì)胞在本領(lǐng)域中是熟知的，并且尤其包括原代星形膠質(zhì)細(xì)胞、(混合)脊髓培養(yǎng)物或海馬培養(yǎng)物。

本發(fā)明還涉及方法，通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有編碼本發(fā)明的單個(gè)模塊或本發(fā)明的融合蛋白的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞用以生產(chǎn)本發(fā)明構(gòu)建體，以及從所述宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收所述構(gòu)建體/融合蛋白。本發(fā)明還可涉及生產(chǎn)本發(fā)明的構(gòu)建體的方法，包括培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞并從培養(yǎng)物中回收所述構(gòu)建體。

宿主細(xì)胞，例如cho細(xì)胞可以對(duì)本發(fā)明的表達(dá)的結(jié)合化合物提供翻譯后(二級(jí))修飾。這些修飾尤其包括糖基化和磷酸化。

本發(fā)明的構(gòu)建體的回收和/或隨后進(jìn)行純化的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。

如上定義的構(gòu)建體在醫(yī)療背景中特別有用。因此，本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包含本發(fā)明的構(gòu)建體、本發(fā)明的核酸分子、本發(fā)明的載體或本發(fā)明的宿主細(xì)胞和任選的藥學(xué)上可接受載體。

本文使用的術(shù)語“治療”等通常是指獲得期望的藥理學(xué)和/或生理學(xué)效應(yīng)。因此，本發(fā)明的治療可涉及對(duì)某種疾病的(急性)狀態(tài)的治療，但在完全或部分地預(yù)防疾病或其癥狀條件下也可涉及預(yù)防性治療。優(yōu)選地，術(shù)語“治療”被理解為在部分或完全治愈疾病和/或不良反應(yīng)和/或歸因于疾病的癥狀方面是治療性的。在這方面，“急性”是指受試者表現(xiàn)出疾病的癥狀。換言之，待治療的受試者實(shí)際上需要治療，并且在本發(fā)明的上下文中的術(shù)語“急性治療”涉及在疾病發(fā)作后或在疾病突然發(fā)生后對(duì)所述疾病實(shí)際采取的措施。治療也可以是預(yù)防性或預(yù)防性治療，即為了預(yù)防疾病而采取的措施，例如為了預(yù)防感染和/或疾病的發(fā)作。

本發(fā)明的藥物組合物可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種種類的施用形式進(jìn)行施用，包括但不限于霜?jiǎng)?、泡沫劑、凝膠劑、洗劑和軟膏劑。

如所提到的，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含有效量的根據(jù)上文的本發(fā)明的構(gòu)建體和至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體。

賦形劑或載體是與活性成分(即根據(jù)上述的本發(fā)明的構(gòu)建體)配制在一起的無活性物質(zhì)，用于使含有有效活性成分的制劑膨脹化。賦形劑通常被稱為“膨脹劑”、“填充劑”或“稀釋劑”。膨脹化允許在生產(chǎn)劑型時(shí)方便和準(zhǔn)確地分配藥物物質(zhì)。它們還可以達(dá)到各種增強(qiáng)治療的目的，例如促進(jìn)藥物吸收或溶解，或其它藥代動(dòng)力學(xué)的作用。除了有助于目的活性物質(zhì)的體外穩(wěn)定性，如防止其在期望的保質(zhì)期內(nèi)變性以外，賦形劑在制造過程中也可能有助于處理目的活性物質(zhì)，例如通過促進(jìn)粉末流動(dòng)性或不粘的特性。合適的賦形劑的選擇還取決于施用途徑和劑型，以及活性成分和其它因素。

因此，與上述一致，包含有效量的本發(fā)明的構(gòu)建體的藥物組合物可以是固體、液體或氣體形式，尤其可以是以下形式：(一種或多種)粉劑、(一種或多種)片劑、(一種或多種)溶液或(一種或多種)氣霧劑。優(yōu)選地，所述藥物組合物任選地包含藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑。

合適的藥物載體、賦形劑和/或稀釋劑的實(shí)例是本領(lǐng)域熟知的，并且包括磷酸鹽緩沖鹽溶液、水、乳液例如油/水乳液、各種類型的潤濕劑、無菌溶液等。包含這些載體的組合物可以可通過熟知的常規(guī)方法配制。這些藥物組合物可以以合適的劑量，即“有效量”施用于受試者，其可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過本領(lǐng)域已知的方法容易地確定。根據(jù)本發(fā)明，通過局部施用施用合適的藥物組合物是有效的。劑量方案將由主治醫(yī)師和臨床因素確定。如在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中熟知的，用于任何一個(gè)患者的劑量都取決于許多因素，包括患者或受試者的體型、體表面積、年齡、待施用的具體化合物、性別、施用時(shí)間和途徑、總體健康狀況和其他同時(shí)施用的藥物情況。蛋白質(zhì)性藥物活性物質(zhì)的存在量可以為每劑量1-20mg/kg體重；然而，低于或高于該示例性范圍的劑量也是預(yù)期中的，特別是考慮到上述因素的時(shí)候。

因此，優(yōu)選地，本發(fā)明的構(gòu)建體以有效量包括在內(nèi)。術(shù)語“有效量”是指足以在待施用藥物組合物的受試者中誘導(dǎo)可檢測(cè)的治療性應(yīng)答的量。根據(jù)上文，只要其可用于如上所述的治療，本發(fā)明的構(gòu)建體在藥物組合物中的含量不受限制，但優(yōu)選占每種總組合物重量的0.0000001-10％。進(jìn)一步地，本文所述的構(gòu)建體優(yōu)選地在載體中使用。通常，在載體中使用適量的藥學(xué)上可接受的鹽以使組合物等滲。載體的實(shí)例包括但不限于生理鹽水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。優(yōu)選地，可接受的賦形劑、載體或穩(wěn)定劑在所使用的劑量和濃度下是無毒的，包括緩沖液例如檸檬酸鹽、磷酸鹽和其它有機(jī)酸溶液；成鹽反離子例如鈉和鉀；低分子量(>10個(gè)氨基酸殘基)多肽；蛋白質(zhì)如血清白蛋白或明膠；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如組氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸、天冬酰胺、精氨酸或甘氨酸；碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；單糖；二糖；其它糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；螯合劑如edta；非離子表面活性劑，例如吐溫、普朗尼克(pluronics)或聚乙二醇；抗氧化劑包括甲硫氨酸、抗壞血酸和生育酚；和/或防腐劑，例如十八烷基二甲基芐基氯化銨；六甲基氯化銨；苯扎氯銨、芐索氯銨；苯酚、丁醇或芐醇；烷基對(duì)羥基苯甲酸酯如甲基或丙基對(duì)羥基苯甲酸酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇和和間苯甲酚)。合適的載體及其制劑更詳細(xì)地描述于remington'spharmaceuticalsciences，17thed.，1985，mackpublishingco.。

可以通過定期評(píng)估監(jiān)測(cè)進(jìn)展情況。本發(fā)明的構(gòu)建體或本發(fā)明的藥物組合物可以是無菌水性或非水性溶液，懸浮液和乳液以及霜?jiǎng)┖退▌?。非水溶劑的?shí)例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油及有機(jī)酯如油酸乙酯。水性載體包括水、醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括生理鹽水和緩沖介質(zhì)。也可以存在防腐劑和其它添加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體等。此外，根據(jù)藥物組合物的預(yù)期用途，本發(fā)明的藥物組合物可以包含其它試劑。所述試劑可以是例如吐溫、edta、檸檬酸鹽、蔗糖以及適合于藥物組合物的預(yù)期用途的其它試劑，其為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。

根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“藥物組合物”涉及用于施用于患者、優(yōu)選人類患者的組合物。

本發(fā)明的藥物組合物可用于治療癌癥、心血管疾病、病毒感染、免疫功能障礙、自身免疫疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、遺傳性代謝疾病或遺傳性疾病。癌癥的實(shí)例包括頭頸癌、乳腺癌、腎癌、膀胱癌、肺癌、前列腺癌、骨癌、腦癌、宮頸癌、肛門癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、闌尾癌、眼癌、胃癌、白血病、淋巴瘤、肝癌、皮膚癌、卵巢癌、陰莖癌、胰腺癌、睪丸癌、甲狀腺癌、陰道癌、外陰癌、子宮內(nèi)膜癌、心臟癌和肉瘤。

心血管疾病的實(shí)例包括動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、肺心病和心肌病。

免疫功能障礙和自身免疫疾病的實(shí)例包括但不限于風(fēng)濕性疾病和哮喘。

病毒感染的實(shí)例包括但不限于人免疫缺陷病毒、單純皰疹病毒、人乳頭瘤病毒以及乙型和丙型肝炎病毒的感染。

神經(jīng)病癥的實(shí)例包括但不限于帕金森病、多發(fā)性硬化和癡呆。

遺傳性代謝疾病的實(shí)例包括但不限于高雪氏病和苯丙酮尿癥。

本發(fā)明還涉及用于治療癌癥、心血管疾病、病毒感染、免疫功能障礙、自身免疫性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、遺傳性代謝疾病或遺傳性疾病的方法。關(guān)于治療方法的優(yōu)選實(shí)施方案，如上文在構(gòu)建體或藥物組合物用于治療癌癥、心血管疾病、病毒感染、免疫功能障礙、自身免疫疾病、神經(jīng)病癥、遺傳性代謝病癥或如上定義的遺傳病癥的上下文中所闡述的那些經(jīng)過必要的修正也同樣適用。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的實(shí)施方案中受試者是哺乳動(dòng)物，例如狗、貓、豬、牛、羊、馬、嚙齒動(dòng)物(例如大鼠、小鼠和豚鼠)或靈長類動(dòng)物(例如大猩猩、黑猩猩和人類)。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，受試者是人。

本發(fā)明還涉及試劑盒，其包含由衍生自登革熱病毒糖蛋白e的一個(gè)或多個(gè)融合序列組成的融合部分(所述融合序列包含seqidno：1所示的序列或與seqidno：1相比顯示有1至8個(gè)取代、缺失或插入的序列)、根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體、根據(jù)本發(fā)明的核酸分子、根據(jù)本發(fā)明的載體或根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞。關(guān)于優(yōu)選的實(shí)施方案，上文在根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體、核酸分子、載體或宿主細(xì)胞的上下文中所闡述的那些經(jīng)過必要的修正同樣適用。有利地，本發(fā)明的試劑盒進(jìn)一步任選地包含上述和下述用途和方法所需的(一種或多種)緩沖液、儲(chǔ)存溶液和/或其他試劑或材料。進(jìn)一步地，本發(fā)明的試劑盒的部分可以單獨(dú)包裝在小瓶或瓶中或者組合包裝在容器或多容器單元中。本發(fā)明的試劑盒可以尤其有利地用于實(shí)施本發(fā)明的方法、制備本發(fā)明的構(gòu)建體，并且可以用于本文提及的各種應(yīng)用中，例如在上文和下文所概述的用途中?？梢园ㄔ谠噭┖兄械牧硪唤M分是對(duì)試劑盒使用者的使用說明書。試劑盒的制造優(yōu)選地遵循本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)程序。

最后，本發(fā)明還涉及由衍生自登革熱病毒糖蛋白e的一種或多種融合序列組成的融合部分用于遞送如上所定義的靶向性部分的用途。因此，本發(fā)明還涉及融合部分的用途，所述融合部分由一個(gè)或多個(gè)衍生自如上所定義的登革熱病毒糖蛋白e的融合序列組成，用于將治療劑、可檢測(cè)部分、核酸分子優(yōu)選sirna、載體分子(優(yōu)選納米顆粒，脂質(zhì)體和病毒載體)遞送進(jìn)入細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。關(guān)于用途的優(yōu)選實(shí)施方案，如上文在構(gòu)建體的上下文中所闡述的那些內(nèi)容經(jīng)過必要的修正同樣適用。本發(fā)明還涉及上述用途，其中所述一種或多種源自登革熱病毒糖蛋白e的融合序列包含seqidno：1所示的序列。優(yōu)選地，本發(fā)明可以涉及上述用途，其中所述一個(gè)或多個(gè)融合序列是與seqidno：1相比顯示有1至8個(gè)取代，缺失或插入的序列。同樣，關(guān)于這些用途的優(yōu)選實(shí)施方案，如上文在構(gòu)建體的上下文中所述的內(nèi)容經(jīng)過必要的修正同樣適用。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的實(shí)施方案中受試者是哺乳動(dòng)物，例如狗、貓、豬、牛、羊、馬、嚙齒動(dòng)物(例如大鼠、小鼠和豚鼠)或靈長類動(dòng)物(例如大猩猩、黑猩猩和人類)。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，受試者是人。

圖1:顯示了scfv(a)、ranpirnase-gs-scfv(b)和ranpirnase-den-scfv(c)的示意圖。通過甘氨酸-絲氨酸連接子(b)或通過來自登革熱病毒的融合肽(其序列如(c)所示)將ranpirnase與scfv片段的n末端融合。vh和vl：分別為衍生自西妥昔單抗的人源化scfv片段的重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域。分別使用c-末端c-myc標(biāo)簽(c-myc)和六組氨酸標(biāo)簽(his6)進(jìn)行檢測(cè)和純化目的。

圖2:顯示了對(duì)體外特異性抗腫瘤活性的評(píng)估。用指定濃度的scfv、ranpirnase、ranpirnase-gs-scfv或ranpirnase-den-scfv處理72小時(shí)后，測(cè)定egfr陽性(a)和egfr陰性(b)腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞活力。結(jié)果表示為相對(duì)于緩沖液處理的對(duì)照細(xì)胞的情況。數(shù)據(jù)描述了重復(fù)三次的代表性實(shí)驗(yàn)的平均值±se。

圖3:顯示了ranpirnase-den-scfv的抗原特異性細(xì)胞毒性。在加或不加摩爾量過量50倍的抗egfrscfv(1000nm)的情況下，用ranpirnase-den-scfv(20nm)處理hno211細(xì)胞。對(duì)于對(duì)照，僅用抗egfrscfv(1000nm)處理細(xì)胞。72小時(shí)后通過mtt測(cè)定法測(cè)定細(xì)胞活力。數(shù)據(jù)描繪了重復(fù)的代表性實(shí)驗(yàn)的平均值±se。

本發(fā)明的其它方面和優(yōu)點(diǎn)將在以下實(shí)施例中描述，所述實(shí)施例是為了說明目的給出，而不是出于限制目的。本申請(qǐng)中引用的所有出版物、專利、專利申請(qǐng)或其它文獻(xiàn)通過引用整體并入本文。

實(shí)施例

材料和方法

1.ranpirnase-gs-scfv和ranpirnase-den-scfv融合蛋白的克隆

合成ranpirnase基因(uniprotkb/swiss-prot：p22069.2)使其具有用作c-末端(g4s)3連接子和兩側(cè)限制性位點(diǎn)的附加基因區(qū)段，以用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行最佳表達(dá)(entelechon，badabbach，germany)，并將其以apali/pvuii片段的形式克隆到亞克隆載體pmja-1b(krauss等人，2005a)中。為了生成免疫rna酶ranpirnase-gs-scfv基因，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)擴(kuò)增由抗體c225生成的人源化抗表皮生長因子受體(egfr)scfvizi08(seifert等人，2012)的dna序列(goldstein等人，1995)，其中使用esr-1s(5'-tatagaagtgcagctggttgaaagc-3')正向引物在vh結(jié)構(gòu)域dna序列的5'端引入pvuii限制性位點(diǎn)以及esr-2as(5'-tataggatccacgtttaatttccag-3')反向引物在vl結(jié)構(gòu)域dna序列的3'末端附加bamhi限制性位點(diǎn)。在將izi08基因插入含有ranpirnase基因的亞克隆載體中之前，引入沉默突變用于破壞序列其他的內(nèi)部pvuii和bamhi位點(diǎn)。隨后將抗egfrscfvizi08基因作為在ranpirnase基因下游的pvuii/bamhi片段克隆到含有編碼c-myc標(biāo)簽和六組氨酸標(biāo)簽的dna序列的亞克隆載體pmja-1b中。通過重疊延伸pcr將rna酶和抗體部分之間的標(biāo)準(zhǔn)(g4s)3連接子的dna序列被編碼登革熱病毒血清型2的糖蛋白e的96-114號(hào)氨基酸的dna序列交換，得到ranpirnase-den-scfv盒亞克隆載體pden14。用ecori消化ranpirnase-gs-scfv和ranpirnase-den-scfv融合蛋白編碼基因并克隆到哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pee12.4(lonzabiologics，slough，uk)中。通過使用bamhi的限制性消化來證實(shí)dna插入片段方向的正確性。

2.細(xì)胞系和蛋白質(zhì)

細(xì)胞系a431(人表皮樣癌)、mcf7(人乳腺癌)和raji(人burkitt淋巴瘤)購自atcc(manassas，va，usa)。在得到患者知情同意后并通過海德堡大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)許可后，由人類頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(hnscc)患者的手術(shù)標(biāo)本建立hnscc細(xì)胞系hno97(來自口腔)、hno211(來自口咽)和hno410(來自下咽淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)。在5％co2、37℃的加濕培養(yǎng)箱中用補(bǔ)充有10％胎牛血清(sigma-aldrich)、100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素(sigma-aldrich)的dulbecco's改良的eagle's培養(yǎng)基(sigma-aldrich，taufkirchen，德國)培養(yǎng)a431、mcf7和hnscc細(xì)胞系。在相同條件下用補(bǔ)充有10％胎牛血清，100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的rpmi1640培養(yǎng)基(sigma-aldrich)培養(yǎng)raji細(xì)胞。在37℃，5％co2、速度120rpm的振蕩培養(yǎng)箱中用補(bǔ)充有0.1％kolliphorp188(sigma-aldrich)，4mm谷氨酰胺(invitrogen)和25μg/mlg418(carlroth，karlsruhe，germany)的f17培養(yǎng)基(invitrogen，lifetechnologies，darmstadt，germany)培養(yǎng)hek293-6e細(xì)胞(獲自nationalresearchcouncil，biotechnologicalresearchinstitute，montreal，canada)。

用于對(duì)照的ranpirnase由kuslimashogen，alfacell公司友情提供。

3.scfv和免疫rna酶的表達(dá)和純化

使用載體pab1(müller等人，2007)使抗egfrscfv可溶性表達(dá)進(jìn)入大腸桿菌tg1細(xì)胞(stratagene，agilenttechnologies，santaclara，ca，usa)周質(zhì)中，方法如前所述(diebolder等，2014)。在4℃下將含scfv的周質(zhì)提取物對(duì)sp10緩沖液(20mmnah2po4，300mmnacl，10mm咪唑，ph8.0)進(jìn)行充分透析，以通過固定化金屬離子親和色譜法(imac)進(jìn)一步純化。在懸浮生長于搖瓶中(falcon，bectondickinson，heidelberg，germany)的hek293-6e細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)rna酶融合蛋白。分別在1/20的最終培養(yǎng)物體積的f17培養(yǎng)基(不含g418)中制備1μg無內(nèi)毒素質(zhì)粒dna和2μg聚乙烯亞胺(polysciences，warrington，pa，usa)，將二者混合，室溫孵育3min并加到細(xì)胞密度為1.7至2×10⁶細(xì)胞/ml的hek293-6e細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后一天，向細(xì)胞中補(bǔ)充加入0.5％(w/v)胰蛋白胨tn1(organotechnies.a.s，lacourneuve，france)。轉(zhuǎn)染后5天后，收集含有蛋白質(zhì)的上清液，并分別對(duì)sp20(20mmnah2po4，300mmnacl，10mm咪唑，ph8.0)進(jìn)行透析用于ranpirnase-gs-scfv或?qū)ris-hcl緩沖液(25mmtris，500mmnacl，ph8.2)進(jìn)行透析用于ranpirnase-den-scfv，使用slice200臺(tái)式流系統(tǒng)(sartorius，goettingen，germany)。使用經(jīng)相應(yīng)的緩沖液平衡后的ni-nta柱(gehealthcare，muenchen，germany)通過imac進(jìn)行重組蛋白的純化。經(jīng)緩沖液充分洗滌后，用含有咪唑的緩沖液多步梯度洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。合并含有重組蛋白的級(jí)分(通過sds-page和simplybluesafestain(invitrogen)和western印跡確定)，并在4℃下對(duì)pbs透析過夜。通過在pbs緩沖液中使用hiload16/60superdex75制備級(jí)柱(gehealthcare)進(jìn)行尺寸排阻色譜對(duì)單體scfv片段和來自更高分子量種類的免疫rna酶進(jìn)行最終純化和分離。

4.核糖核酸分解活性的確定

通過監(jiān)測(cè)熒光底物6-羧基熒光素-darudgda-black-hole-quencher-1(6-fam-darudgda-bhq-1)(biomers.net，ulm，germany)隨時(shí)間的裂解情況來測(cè)量ranpirnase和免疫rna酶的核糖核酸分解活性。使用具有485/535nm(激發(fā)/發(fā)射)濾片組的infinitef200pro酶標(biāo)儀(tecan，maennedorf，switzerland)在96孔黑色微量滴定板中測(cè)量熒光強(qiáng)度。在25℃下，在含有100mmnacl和6-fam-darudgda-bhq-1(5nm)的100mmmes-naoh緩沖液(ph6.0)中以進(jìn)行反應(yīng)，總反應(yīng)體積為每孔200μl。將不含rna酶的緩沖液用作陰性對(duì)照，濃度過量的rna酶a用作陽性對(duì)照。進(jìn)行至少三次獨(dú)立的測(cè)定，每次包含三個(gè)復(fù)樣。

使用以下公式計(jì)算kcat/km值：

該公式中，△f/△t代表起始反應(yīng)速率，fmin是添加rna酶之前的起始熒光強(qiáng)度。fmax是過量rna酶a對(duì)底物進(jìn)行完全裂解后的熒光強(qiáng)度，而[e]是rna酶濃度。

5.抗體結(jié)合

為確定平衡結(jié)合曲線，將a431細(xì)胞在系列稀釋的純化的抗-egfrscfv、ranpirnase-gs-scfv或ranpirnase-den-scfv中培養(yǎng)，均做三個(gè)復(fù)樣。使用小鼠抗-c-myc單克隆抗體(克隆號(hào)9e10)(roche,penzberg,germany)和羊抗小鼠異硫氰酸熒光素(fitc)綴合物(jacksonimmunoresearch，suffolk，uk)進(jìn)行結(jié)合抗體或免疫rna酶的檢測(cè)。使用facsdiva軟件(bectondickinson)在facscantoii流式細(xì)胞儀(bectondickinson)上測(cè)量染色細(xì)胞的熒光。用測(cè)量的熒光中值減去背景熒光，并使用graphpadprism5.0(graphpadsoftware，lajolla，ca，usa)通過非線性回歸計(jì)算相對(duì)親和力。

6.細(xì)胞活力測(cè)定和競(jìng)爭(zhēng)分析

為了評(píng)估重組蛋白質(zhì)的抗腫瘤功效，將細(xì)胞接種在96孔平底板(falcon)中，并在37℃，5％co2與不同濃度的蛋白質(zhì)或緩沖液(作為對(duì)照)孵育72小時(shí)，總體積為110μl。對(duì)于貼壁細(xì)胞系(a431、hno97、hno211、hno410、mcf7)，通過加入20μl的稀釋在pbs中5mg/ml的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(mtt)溶液來確定細(xì)胞活力。在37℃、5％co2與mtt孵育后4小時(shí)除去培養(yǎng)基，并將細(xì)胞在每孔100μl裂解溶液(10％sds(w/v)和0.6％乙酸(v/v)溶于二甲基亞砜)中裂解。將板在室溫下孵育5分鐘，然后溫和攪拌5分鐘以溶解釋放的甲瓚晶體。通過使用infinitef200pro酶標(biāo)儀(tecan)測(cè)量570nm處的吸光度(參考波長：620nm)來測(cè)定甲瓚濃度。為了測(cè)定懸浮細(xì)胞系raji的活力，將細(xì)胞與每孔10μl(thermoscientific，rockford，il，usa)在37℃、5％co2孵育4小時(shí)，而不進(jìn)行隨后的細(xì)胞裂解。使用與mtt處理的細(xì)胞相同的波長和儀器直接測(cè)量吸光度。

細(xì)胞活力表示為蛋白質(zhì)處理組相比緩沖液對(duì)照組的活細(xì)胞百分比。ic50定義為與緩沖液對(duì)照相比細(xì)胞活力降低50％的濃度。每個(gè)測(cè)定至少進(jìn)行兩次重復(fù)，其中每次測(cè)定含有三個(gè)復(fù)樣。

對(duì)于競(jìng)爭(zhēng)分析，將hno211細(xì)胞接種在96孔平底板(falcon)中，并且在加入ranpirnase-den-scfv(20nm)之前用濃度為1000nm的抗egfrscfvizi08預(yù)孵育3小時(shí)。對(duì)于對(duì)照，將細(xì)胞與單獨(dú)的ranpirnase-den-scfv(20nm)或抗egfrscfv(1000nm)一起孵育。在37℃、5％co2孵育72小時(shí)后，使用如上所述的mtt測(cè)定法測(cè)定細(xì)胞活力。所有反應(yīng)做三個(gè)復(fù)樣。

實(shí)施例1：ranpirnase-gs-scfv和ranpirnase-den-scfv的生成

為了靶向殺死表達(dá)egfr的癌細(xì)胞，將ranpirnase通過柔性(g4s)3連接子與人源化scfv片段(其具有與臨床建立的mab西妥昔單抗相同的特異性)的n末端融合(ranpirnase-gs-scfv)。備選地，通過由病毒序列組成的連接子將ranpirnase與scfv片段融合，所述病毒序列包括登革熱病毒血清型2的推定病毒融合肽，據(jù)報(bào)道其參與病毒的內(nèi)體逃逸機(jī)制(melo等人，2009；zaitseva等人，2010)，得到免疫rna酶ranpirnase-den-scfv。所研究的蛋白質(zhì)的示意圖如圖1所示。

實(shí)施例2：scfv和免疫rna酶的表達(dá)和純化

在大腸桿菌中表達(dá)scfv片段并從周質(zhì)空間將其分離，而在hek293-6e細(xì)胞中產(chǎn)生免疫rna酶ranpirnase-gs-scfv和ranpirnase-den-scfv，并通過采用igvh前導(dǎo)肽(krauss等人，2005a)使其分泌至細(xì)胞培養(yǎng)物上清。通過ni-nta柱純化蛋白質(zhì)，然后進(jìn)行尺寸排阻色譜，產(chǎn)生純度>95％的均質(zhì)蛋白質(zhì)制劑。完全純化后的生產(chǎn)產(chǎn)量分別為scfv的1.9mg/l，ranpirnase-gs-scfv的0.9mg/l，ranpirnase-den-scfv的3.2mg/l。

實(shí)施例3：免疫rna酶的功能分析

通過流式細(xì)胞術(shù)在表達(dá)egfr的a431細(xì)胞上測(cè)定scfv、ranpirnase-gs-scfv和ranpirnase-den-scfv的細(xì)胞結(jié)合和表觀平衡解離常數(shù)(kd)。如表i所示，兩種免疫rna酶以與單獨(dú)scfv相似的高親和力結(jié)合靶抗原。

表i:流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果：抗體構(gòu)建物結(jié)合a431細(xì)胞的親和力。

ranpirnase、ranpirnase-gs-scfv和ranpirnase-den-scfv的核糖核酸分解活性是通過其裂解匹配ranpirnase的核堿基特異性的熒光rna底物的能力來測(cè)量(lee和raines，2003)。與野生型ranpirnase相比，ranpirnase與scfv片段的n-末端通過柔性甘氨酸-絲氨酸連接子的融合輕微降低了其催化活性(表ii)。

表ii：ranpirnase和ranpirnase融合蛋白的核糖核酸裂解活性

*裂解6-fam-darudgda-bhq-1的kcat/km(±se)值如材料與方法章節(jié)中所述進(jìn)行確定。

ranpirnase-den-scfv的催化活性與ranpirnase-gs-scfv相比是約2倍低，表明可能發(fā)生了ranpirnase的折疊和構(gòu)象的連接子依賴性變化或與底物相互作用的空間位阻。

實(shí)施例4：體外細(xì)胞毒性

為了評(píng)價(jià)對(duì)表達(dá)egfr的癌細(xì)胞的特異性毒性，將scfv片段、ranpirnase-gs-scfv、ranpirnase-den-scfv和ranpirnase與egfr-過表達(dá)的表皮樣癌細(xì)胞系a431和幾種來自頭頸部癌癥患者的切除腫瘤的egfr陽性原代細(xì)胞系(hno97，hno211，hno410)一同孵育。用egfr陰性的乳腺癌細(xì)胞系mcf7和burkitt淋巴瘤細(xì)胞系raji作為陰性對(duì)照。如圖2和表iii所示，單獨(dú)的抗egfrscfv片段對(duì)細(xì)胞活力幾乎沒有影響。

表iii：測(cè)試的構(gòu)建體對(duì)egfr陽性細(xì)胞系的體外抗腫瘤活性。ic50值表示為平均值±se，其來自至少兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)以三個(gè)復(fù)樣進(jìn)行。

由于ranpirnase能夠以不依賴egfr的方式進(jìn)入細(xì)胞(rodriguez等人，2007)，單獨(dú)的ranpirnase對(duì)egfr陰性和egfr陽性細(xì)胞都具有細(xì)胞毒性(圖2)。通過柔性甘氨酸-絲氨酸連接子將ranpirnase與scfv片段的n末端融合(ranpirnase-gs-scfv)導(dǎo)致其與單一藥劑ranpirnase相比細(xì)胞毒性顯著降低。相比之下，含有源自登革熱病毒的融合肽的免疫rna酶(ranpirnase-den-scfv)表現(xiàn)出與單獨(dú)ranpirnase對(duì)表達(dá)egfr的細(xì)胞類似的抗腫瘤功效，但即使在非常高的濃度下也不影響egfr陰性細(xì)胞(圖2b)。ranpirnase-den-scfv對(duì)原代hno211細(xì)胞系顯示出最強(qiáng)的細(xì)胞毒性，平均ic50值為18nm，對(duì)應(yīng)與ranpirnase-gs-scfv相比效力79倍增加。

為了證明引入的病毒連接子序列對(duì)ranpirnase-den-scfv的特異性沒有負(fù)面影響，我們?cè)趆no211細(xì)胞系上進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定。如圖3所示，ranpirnase-den-scfv的細(xì)胞毒性可以在摩爾量過量50倍的scfv存在下完全消除，證實(shí)兩種化合物結(jié)合相同的靶向表位，并且ranpirnase-den-scfv進(jìn)入細(xì)胞是egfr特異性的，并且不由融合肽與質(zhì)膜的非特異性相互作用介導(dǎo)。

參考文獻(xiàn)

arndt,m.a.,krauss,j.,vu,b.k.,newton,d.l.andrybak,s.m.(2005)j.immunother.,28,245-251.

bachran,c.,heisler,i.,fuchs,h.andsutherland,m.(2005)biochem.biophys.res.commun.,337,602-609.

chang,c.h.,gupta,p.,michel,r.,loo,m.,wang,y.,cardillo,t.m.andgoldenberg,d.m.(2010)mol.cancerther.,9,2276-2286.

chang,c.h.,sapra,p.,vanama,s.s.,hansen,h.j.,horak,i.d.andgoldenberg,d.m.(2005)blood,106,4308-4314.

chignola,r.,anselmi,c.,dallaserra,m.,franceschi,a.,fracasso,g.,pasti,m.,chiesa,e.,lord,j.m.,tridente,g.andcolombatti,m.(1995)j.biol.chem.,270,23345-23351.

delorenzo,c.,arciello,a.,cozzolino,r.,palmer,d.b.,laccetti,p.,piccoli,r.andd'alessio,g.(2004)cancerres.,64,4870-4874.

diebolder,p.,keller,a.,haase,s.,schlegelmilch,a.,kiefer,j.d.,karimi,t.,weber,t.,moldenhauer,g.,kehm,r.,eis-hubinger,a.m.,etal.(2014)mabs,6,130-142.

erickson,h.a.,jund,m.d.andpennell,c.a.(2006)proteineng.des.sel.,19,37-45.

fuchs,h.,bachran,c.andflavell,d.j.(2013)antibodies,2,209-235.

goldstein,n.i.,prewett,m.,zuklys,k.,rockwell,p.andmendelsohn,j.(1995)clin.cancerres.,1,1311-1318.

goparaju,c.m.,blasberg,j.d.,volinia,s.,palatini,j.,ivanov,s.,donington,j.s.,croce,c.,carbone,m.,yang,h.andpass,h.i.(2011)oncogene,30,2767-2777.haigis,m.c.,kurten,e.l.andraines,r.t.(2003)nucleicacidsres.,31,1024-1032.

hetzel,c.,bachran,c.,fischer,r.,fuchs,h.,barth,s.andstocker,m.(2008)j.immunother.,31,370-376.

huang,c.y.,butrapet,s.,moss,k.j.,childers,t.,erb,s.m.,calvert,a.e.,silengo,s.j.,kinney,r.m.,blair,c.d.androehrig,j.t.(2010)virology,396,305-315.

krauss,j.,arndt,m.a.,vu,b.k.,newton,d.l.andrybak,s.m.(2005a)br.j.haematol.,128,602-609.

krauss,j.,arndt,m.a.,vu,b.k.,newton,d.l.,seeber,s.andrybak,s.m.(2005b)biochem.biophys.res.commun.,331,595-602.

lee,j.e.andraines,r.t.(2003)biochemistry,42,11443-11450.

liu,d.,cardillo,t.m.,wang,y.,rossi,e.a.,goldenberg,d.m.andchang,c.h.(2014)mol.cancer,13,53.

melo,m.n.,sousa,f.j.,carneiro,f.a.,castanho,m.a.,valente,a.p.,almeida,f.c.,dapoian,a.t.andmohana-borges,r.(2009)j.mol.biol.,392,736-746.

mikulski,s.,grossman,a.,carter,p.,shogen,k.andcostanzi,j.(1993)int.j.oncol.,3,57-64.

mikulski,s.m.,costanzi,j.j.,vogelzang,n.j.,mccachren,s.,taub,r.n.,chun,h.,mittelman,a.,panella,t.,puccio,c.,fine,r.,etal.(2002)j.clin.oncol.,20,274-281.

müller,d.,karle,a.,meissburger,b.,hofig,i.,stork,r.andkontermann,r.e.(2007)j.biol.chem.,282,12650-12660.

newton,d.l.,hansen,h.j.,mikulski,s.m.,goldenberg,d.m.andrybak,s.m.(2001)blood,97,528-535.

pirie,c.m.,hackel,b.j.,rosenblum,m.g.andwittrup,k.d.(2011)j.biol.chem.,286,4165-4172.

qiao,m.,zu,l.d.,he,x.h.,shen,r.l.,wang,q.c.andliu,m.f.(2012)cellres.,22,1199-1202.

rodriguez,m.,torrent,g.,bosch,m.,rayne,f.,dubremetz,j.f.,ribo,m.,benito,a.,vilanova,m.andbeaumelle,b.(2007)j.cellsci.,120,1405-1411.

saxena,s.k.,sirdeshmukh,r.,ardelt,w.,mikulski,s.m.,shogen,k.andyoule,r.j.(2002)j.biol.chem.,277,15142-15146.

schulenburg,c.,ardelt,b.,ardelt,w.,arnold,u.,shogen,k.,ulbrich-hofmann,r.anddarzynkiewicz,z.(2007)cancerbiol.ther.,6,1233-1239.

seifert,o.,plappert,a.,heidel,n.,fellermeier,s.,messerschmidt,s.k.,richter,f.andkontermann,r.e.(2012)proteineng.des.sel.,25,603-612.

snyder,e.l.,saenz,c.c.,denicourt,c.,meade,b.r.,cui,x.s.,kaplan,i.m.anddowdy,s.f.(2005)cancerres.,65,10646-10650.

sorkin,a.andgoh,l.k.(2009)exp.cellres.,315,683-696.

tolstikov,v.v.,cole,r.,fang,h.andpincus,s.h.(1997)bioconjug.chem.,8,38-43.

weng,a.,thakur,m.,vonmallinckrodt,b.,beceren-braun,f.,gilabert-oriol,r.,wiesner,b.,eichhorst,j.,bottger,s.,melzig,m.f.andfuchs,h.(2012)j.control.release,164,74-86.

weyergang,a.,selbo,p.k.,berstad,m.e.,bostad,m.andberg,k.(2011)laserssurg.med.,43,721-733.

zaitseva,e.,yang,s.t.,melikov,k.,pourmal,s.andchernomordik,l.v.(2010)plospathog.,6,e1001131.

序列表

<110>ruprecht-karls-universit?theidelberg

<120>用于將分子遞送至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的構(gòu)建體

<130>x1963pcts3

<150>ep14183990.2

<151>2014-09-08

<160>26

<170>bissap1.2

<210>1

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>病毒融合序列

<400>1

aspargglytrpglyasnglycysglyleupheglylysglyglyile

151015

<210>2

<211>242

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>病毒融合序列

<400>2

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglypheserleuthrasntyr

202530

glyvalhistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpleu

354045

glyvaliletrpserglyglyasnthrasptyrasnthrprophethr

505560

serargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyrleu

65707580

glnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcysala

859095

argalaleuthrtyrtyrasptyrgluphealatyrtrpglyglngly

100105110

thrthrvalthrvalserserglyglyglyglyserglyglyglygly

115120125

serglyglyglyglyseraspileglnleuthrglnserproserphe

130135140

leuseralaservalglyaspargvalthrilethrcysargalaser

145150155160

glnserileglythrasnilehistrptyrglnglnlysproglylys

165170175

alaprolysleuleuilelystyralasergluserileserglyval

180185190

proserargpheserglyserglyserglythrgluphethrleuthr

195200205

ileserserleuglnprogluaspphealathrtyrtyrcysglngln

210215220

asnasnasntrpprothrthrpheglyalaglythrlysleugluile

225230235240

lysarg

<210>3

<211>19

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>病毒融合序列

<400>3

metvalaspargglytrpglyasnglycysglyleupheglylysgly

151015

glyileval

<210>4

<211>104

<212>prt

<213>豹蛙

<220>

<221>mod_res

<222>1

<223>焦谷氨酸

<400>4

glnasptrpleuthrpheglnlyslyshisilethrasnthrargasp

151015

valaspcysaspasnilemetserthrasnleuphehiscyslysasp

202530

lysasnthrpheiletyrserargprogluprovallysalailecys

354045

lysglyileilealaserlysasnvalleuthrthrsergluphetyr

505560

leuseraspcysasnvalthrserargprocyslystyrlysleulys

65707580

lysserthrasnlysphecysvalthrcysgluasnglnalaproval

859095

hisphevalglyvalglysercys

100

<210>5

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>病毒融合序列

<400>5

aspargglytrpglyasnglycysglyleupheglylysglyserile

151015

<210>6

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>病毒融合序列

<400>6

aspargglytrpglyasnglycysglyleupheglylysglyserleu

151015

<210>7

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>病毒融合序列

<400>7

aspargglytrpglyasnglycysglyleupheglylysglyglyval

151015

<210>8

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>病毒融合序列

<400>8

aspargglytrphisasnglycysglyleupheglylysglyserile

151015

<210>9

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>病毒融合序列

<400>9

aspargglytrphisasnglycysglyphepheglylysglyserile

151015

<210>10

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>病毒融合序列

<400>10

aspargglytrpglyasnglycysglyleupheglylysglysermet

151015

<210>11

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>病毒融合序列

<400>11

aspargglytrpglyasnglycysglyleupheglylysglysertyr

151015

<210>12

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>病毒融合序列

<400>12

aspargglytrpasnasnglycysglyleupheglylysglyserleu

151015

<210>13

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>病毒融合序列

<400>13

asnargglytrpasnasnglycysglyleupheglylysglyaspile

151015

<210>14

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>病毒融合序列

<400>14

aspargglytrpglyasnhiscysglyleupheglylysglyserile

151015

<210>15

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>病毒融合序列

<400>15

aspargglytrpglyasnasncysglyleupheglylysglyserile

151015

<210>16

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>病毒融合序列

<400>16

aspargglytrpglyasnglycysalaleupheglylysglyserile

151015

<210>17

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>病毒融合序列

<400>17

aspargglytrpglyasnhiscysglyphepheglylysglyserile

151015

<210>18

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>病毒融合序列

<400>18

aspargglytrpaspserglycyspheilepheglylysglygluval

151015

<210>19

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>病毒融合序列

<400>19

asnargglytrpglythrglycysphelystrpglyileglypheval

151015

<210>20

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>病毒融合序列

<400>20

asnargglytrpglythrglycyspheglutrpglyleuglyglnval

151015

<210>21

<211>495

<212>prt

<213>登革熱病毒（糖蛋白e血清型2）

<400>21

metargcysileglyileserasnargaspphevalgluglyvalser

151015

glyglysertrpvalaspilevalleugluhisglysercysvalthr

202530

thrmetalalysasnlysprothrleuaspphegluleuilelysthr

354045

glualalyshisproalathrleuarglystyrcysileglualalys

505560

leuthrasnthrthrthralaserargcysprothrglnglyglupro

65707580

serleuasnglugluglnasplysargphevalcyslyshissermet

859095

valaspargglytrpglyasnglycysglyleupheglylysglygly

100105110

ilevalthrcysalametphethrcyslyslysasnmetgluglylys

115120125

valvalglnprogluasnleuglutyrthrilevalilethrprohis

130135140

serglyglugluasnalavalglyasnaspthrglylyshisglylys

145150155160

gluilelysvalthrproglnserserilethrglualagluleuthr

165170175

glytyrglythrvalthrmetglucysserproargthrglyleuasp

180185190

pheasnglumetvalleuleuglnmetgluasnlysalatrpleuval

195200205

hisargglntrppheleuaspleuproleuprotrpleuproglyala

210215220

aspthrglnglyserasntrpileglnlysgluthrleuvalthrphe

225230235240

lysasnprohisalalyslysglnaspvalvalvalleuglysergln

245250255

gluglyalamethisthralaleuthrglyalathrgluileglnmet

260265270

serserglyasnleuleuphethrglyhisleulyscysargleuarg

275280285

metasplysleuglnleulysglymetsertyrsermetcysthrgly

290295300

lysphelysvalvallysgluilealagluthrglnhisglythrile

305310315320

valileargvalglntyrgluglyaspglyserprocyslysilepro

325330335

phegluilemetaspleuglulysarghisvalleuglyargleuile

340345350

thrvalasnproilevalthrglulysaspserprovalasnileglu

355360365

alaglupropropheglyaspsertyrileileileglyvalglupro

370375380

glyglnleulysleusertrpphelyslysglyserserileglygln

385390395400

metphegluthrthrmetargglyalalysargmetalaileleugly

405410415

aspthralatrpasppheglyserleuglyglyvalphethrserile

420425430

glylysalaleuhisglnvalpheglyalailetyrglyalaalaphe

435440445

serglyvalsertrpthrmetlysileleuileglyvalvalilethr

450455460

trpileglymetasnserargserthrserleuservalserleuval

465470475480

leuvalglyvalvalthrleutyrleuglyvalmetvalglnala

485490495

<210>22

<211>156

<212>prt

<213>人

<220>

<223>人胰腺rna酶（rna酶1）

<400>22

metalaleuglulysserleuvalargleuleuleuleuvalleuile

151015

leuleuvalleuglytrpvalglnproserleuglylysgluserarg

202530

alalyslyspheglnargglnhismetaspseraspserserproser

354045

serserserthrtyrcysasnglnmetmetargargargasnmetthr

505560

glnglyargcyslysprovalasnthrphevalhisgluproleuval

65707580

aspvalglnasnvalcyspheglnglulysvalthrcyslysasngly

859095

glnglyasncystyrlysserasnsersermethisilethraspcys

100105110

argleuthrasnglyserargtyrproasncysalatyrargthrser

115120125

prolysgluarghisileilevalalacysgluglyserprotyrval

130135140

provalhispheaspalaservalgluaspserthr

145150155

<210>23

<211>147

<212>prt

<213>人

<220>

<223>人血管生成素（rna酶5）p03950

<400>23

metvalmetglyleuglyvalleuleuleuvalphevalleuglyleu

151015

glyleuthrproprothrleualaglnaspasnserargtyrthrhis

202530

pheleuthrglnhistyraspalalysproglnglyargaspasparg

354045

tyrcysgluserilemetargargargglyleuthrserprocyslys

505560

aspileasnthrpheilehisglyasnlysargserilelysalaile

65707580

cysgluasnlysasnglyasnprohisarggluasnleuargileser

859095

lysserserpheglnvalthrthrcyslysleuhisglyglyserpro

100105110

trpproprocysglntyrargalathralaglypheargasnvalval

115120125

valalacysgluasnglyleuprovalhisleuaspglnserilephe

130135140

argargpro

145

<210>24

<211>245

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化抗cd22scfv(sgiii)

<400>24

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphealapheseriletyr

202530

aspmetsertrpvalargglnvalproglylysglyleuglutrpval

354045

sertyrileserserglyglyglythrthrtyrtyrproaspthrval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserargasnthrleuasp

65707580

leuglnmetasnserleuargvalgluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaarghisserglytyrglysersertyrglyvalleuphealatyr

100105110

trpglyglythrleuvalthrvalserserglyglyglyglysergly

115120125

glyglyglyserglyglyglyglyseraspileglnmetthrglnser

130135140

proserserleuseralaservalglyaspargvalthrilethrcys

145150155160

argalaserglnaspileserasntyrleuasntrpleuglnglnlys

165170175

proglylysalaprolysleuleuiletyrtyrthrserileleuhis

180185190

serglyvalproserargpheserglyserglyserglythrgluphe

195200205

thrleuthrileserserleuglnprogluaspphealathrtyrtyr

210215220

cysglnglnglyasnthrleuprotrpthrpheglyglnglythrlys

225230235240

leugluilelysarg

245

<210>25

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來源

<222>1..25

<223>/mol_type="unassigneddna"

/note="esr-1sfwd"

/organism="人工序列"

<400>25

tatagaagtgcagctggttgaaagc25

<210>26

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來源

<222>1..25

<223>/mol_type="unassigneddna"

/note="esr-2asrev"

/organism="人工序列"

<400>26

tataggatccacgtttaatttccag25