本發(fā)明涉及肽或蛋白質(zhì)納米沉淀物或肽或蛋白質(zhì)和金屬離子(優(yōu)選二價金屬離子)納米共沉淀物的非變性制備方法，其中肽或蛋白質(zhì)具有低分子量，并且涉及可通過這種方法獲得的納米沉淀物或納米共沉淀物。本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，特別是控釋藥物組合物，其包含所述納米沉淀物或納米共沉淀物，并且涉及所述藥物組合物在人和動物健康領(lǐng)域中的用途。

背景技術(shù)：

肽和蛋白質(zhì)是復(fù)雜的，高度有機化的結(jié)構(gòu)，對它們的環(huán)境高度敏感，并且可容易地變性。肽或蛋白質(zhì)的變性通常導(dǎo)致活性的確定性或暫時性喪失。然而，迄今已知的用于沉淀肽或蛋白質(zhì)的方法是引起變性的，因為它們包括對肽/蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)潛在有害的條件，因此使它們失去活性，諸如高溫，快速攪拌或與疏水性表面、水性/有機界面或洗滌劑接觸的條件。

肽或蛋白質(zhì)，特別是治療性肽或蛋白質(zhì)的納米沉淀使得能夠例如改善它們在受體生物體中的釋放特征及它們的生物利用度。它還能實現(xiàn)濃縮的肽/蛋白質(zhì)懸浮液的凍干和高度富集肽或蛋白質(zhì)同時具有低的或沒有粘度的藥物組合物的制備，所述藥物組合物包括在不存在變性聚集的情況下獲得的納米沉淀物。

在文獻中存在蛋白質(zhì)納米沉淀的方法，例如蛋白質(zhì)去溶劑化技術(shù)，其產(chǎn)生尺寸通常大于一微米的蛋白質(zhì)沉淀物。然而，這些方法通常導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變性，或不可能在沒有所必需的除了非溶劑之外的聚合物的情況下獲得蛋白質(zhì)沉淀物。

例如，專利申請wo2009/043874公開了一種制備平均直徑為50至200nm的泊洛沙姆-蛋白納米顆粒的方法，其中蛋白質(zhì)的分子量優(yōu)選高于8kda，并且不變性。所述納米顆粒是泊洛沙姆-蛋白復(fù)合物；因此除了非溶劑之外的另外的聚合物是獲得它們所必需的。

因此，亟需開發(fā)用于低分子量肽或蛋白質(zhì)的非變性納米沉淀的技術(shù)，所述低分子量肽或蛋白質(zhì)不與促進它沉淀或與金屬離子(優(yōu)選二價金屬離子)共沉淀的另一分子復(fù)合。肽或蛋白質(zhì)優(yōu)選是治療性肽或蛋白質(zhì)，例如胰島素。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

在本發(fā)明的上下文中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種分子量為20kda或更低，優(yōu)選15kda或更低，有利地為10kda或更低，更有利地為8kda或更低的肽或蛋白質(zhì)的納米沉淀物的非變性制備的新方法，使得能夠獲得非變性肽或蛋白質(zhì)的納米沉淀物，或所述非變性肽或蛋白質(zhì)和金屬離子(優(yōu)選二價金屬離子)的納米共沉淀物，可將其摻入藥物組合物中，優(yōu)選控釋藥物組合物中。

本發(fā)明能夠在溫和、非變性條件下獲得低分子量肽或蛋白質(zhì)的納米沉淀物或低分子量肽或蛋白質(zhì)和金屬離子的納米共沉淀物。它包括接觸低分子量肽或蛋白質(zhì)的溶液，肽或蛋白質(zhì)的有機非溶劑，例如選自低分子量聚乙二醇或聚乙二醇衍生物的有機二醇，特別是peg550，以及選自己二醇、丁烷-1,4-二醇、戊烷-1,5-二醇、乙基己二醇、2-甲基戊烷-2,4-二醇(己二醇)、3-環(huán)戊烯-1,2-二醇、順-4-環(huán)戊烯-1,3-二醇、反-1,4-二噁烷-2,3-二醇、1,3-二噁烷-5,5-二甲醇、(3s,4s)-吡咯烷-3,4-二醇、(3r,4r)-(-)-1-芐基-3,4-吡咯烷二醇、(3s,4s)-(+)-1-芐基-3,4-吡咯烷二醇、3-環(huán)戊烯-1,2-二醇、2-甲基-丁烷-1,3-二醇的有機二醇。

根據(jù)本發(fā)明的納米沉淀方法能夠獲得可用作用于單次腸胃外施用的藥用產(chǎn)品的肽或蛋白質(zhì)納米沉淀物或納米共沉淀物，使得所述肽或蛋白質(zhì)的血漿濃度在治療窗內(nèi)的持續(xù)時間大于未按照本發(fā)明的制備方法進行制備的相同肽或蛋白質(zhì)在單次胃腸外施用之后的血漿濃度在治療窗內(nèi)的持續(xù)時間。因此，根據(jù)本發(fā)明的納米沉淀能夠控制肽或蛋白質(zhì)的釋放速率，特別是為了獲得生物活性形式的肽或蛋白質(zhì)的緩釋持續(xù)至少2天，優(yōu)選2天至幾個月。

根據(jù)本發(fā)明的納米沉淀還能夠制備高度富集所述肽或蛋白質(zhì)同時具有低粘度的藥物組合物。藥物組合物的低粘度，特別可用于其腸胃外施用，特別是其非靜脈內(nèi)腸胃外施用。

在第一方面中，本發(fā)明涉及平均直徑小于1μm的肽或蛋白質(zhì)納米沉淀物或肽或蛋白質(zhì)和金屬離子納米共沉淀物的非變性制備方法，其包括以下步驟：

a)制備肽或蛋白質(zhì)的水溶液、肽或蛋白質(zhì)的非溶劑以及任選的水溶性金屬鹽的混合物；

b)溫和攪拌在步驟a)中獲得的混合物；

c)固液分離在步驟b)中獲得的混合物；和

d)任選地，收集肽或蛋白質(zhì)納米沉淀物或肽或蛋白質(zhì)和金屬離子納米共淀物，

其中所述肽或蛋白質(zhì)的分子量為20kda或更低，優(yōu)選為15kda或更低，有利地為10kda或更低，更有利地為8kda或更低，并且所述非溶劑選自分子量小于2000da，有利地為200至2000da，更有利地為550da的聚乙二醇或聚乙二醇衍生物，以及選自己二醇、丁烷-1,4-二醇、戊烷-1,5-二醇，乙基己二醇、2-甲基戊烷-2,4-二醇(己二醇)、3-環(huán)戊烯-1,2-二醇、順-4-環(huán)戊烯-1,3-二醇、反-1,4-二噁烷-2,3-二醇、1,3-二噁烷-5,5-二甲醇、(3s,4s)-吡咯烷-3,4-二醇、(3r,4r)-(-)-1-芐基-3,4-吡咯烷二醇、(3s,4s)-(+)-1-芐基-3,4-吡咯烷二醇、3-環(huán)戊烯-1,2-二醇、2-甲基-丁烷-1,3-二醇的有機二醇。

在本發(fā)明的上下文中，“非變性制備方法”意思是不會使所述肽或蛋白質(zhì)變性的肽或蛋白質(zhì)的納米沉淀或納米共沉淀的方法。因此，根據(jù)本發(fā)明的納米沉淀或納米共沉淀的方法能夠獲得保留它們的正常三維構(gòu)象以及它們的完整性及它們的生物活性的肽或蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法能夠獲得其中85％，特別是90％，更特別是100％的蛋白質(zhì)或肽不變性的肽或蛋白質(zhì)納米沉淀物或納米共沉淀物。更優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法能夠獲得其中100％的蛋白質(zhì)或肽不變性的蛋白質(zhì)或肽納米沉淀物或納米共沉淀物。

在本發(fā)明的上下文中，“肽或蛋白質(zhì)納米沉淀物”意指平均直徑小于1μm，有利地為5nm至500nm，更有利地為5nm至200nm，甚至更有利地為5nm至170nm，特別地為5nm至150nm的顆粒，這是一種或多種肽和/或一種或多種蛋白質(zhì)在非溶劑中沉淀的結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明的肽或蛋白質(zhì)納米沉淀物基本上由(多種)肽或(多種)蛋白質(zhì)組成。

根據(jù)有利的實施方案，根據(jù)本發(fā)明的肽或蛋白質(zhì)納米沉淀物由大于90％，特別地大于95％，更特別地大于99％的(多種)肽或(多種)蛋白質(zhì)組成，其余為雜質(zhì)，例如所使用的非溶劑的雜質(zhì)。

有利地，本發(fā)明涉及一種低分子量肽或蛋白質(zhì)的納米沉淀物或低分子量肽或蛋白質(zhì)和金屬離子的納米共沉淀物的非變性制備方法，平均直徑為小于1μm，有利地為5nm至500nm，更有利地為5nm至200nm，甚至更有利地為5nm至170nm，特別地為5nm至150nm。

根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及肽或蛋白質(zhì)和金屬離子納米共沉淀物的非變性制備方法，其中所述肽或蛋白質(zhì)的分子量為20kda或更低，優(yōu)選15kda或更低，有利地為10kda或更低，更有利地為8kda或更低，并且所述金屬離子選自鋅(zn)、錳(mn)、鎂(mg)、鈣(ca)、鐵(fe)、鋰(li)和銅(cu)。優(yōu)選地，所述金屬離子是選自鋅(zn)、錳(mn)、鎂(mg)、鈣(ca)、鐵(fe)和銅(cu)，優(yōu)選鋅(zn)或錳(mn)的二價金屬離子。

“一價金屬離子”意指具有一價的離子，因此可以與另一個離子或分子形成鍵。例如，一價金屬陰離子是相對于它的元素態(tài)具有一個附加電子的離子。同樣地，一價金屬陽離子是相對于它的元素態(tài)缺失一個電子的離子。

同樣地，“二價金屬離子”意指具有二價的離子。例如，二價金屬陰離子是相對于它的元素態(tài)具有兩個附加電子的離子。同樣地，二價金屬陽離子是相對于它的元素態(tài)缺失兩個電子的離子。

“肽或蛋白質(zhì)和金屬離子納米共沉淀物”還稱為“肽或蛋白質(zhì)/金屬離子納米共沉淀物”意指一種或多種蛋白質(zhì)或肽與金屬離子共沉淀的結(jié)果。因此，這些納米共沉淀物基本上由(多種)肽或(多種)蛋白質(zhì)，所述金屬離子和任選地所使用的非溶劑的殘留物組成。

“低分子量肽或蛋白質(zhì)”意指分子量為20kda或更低，優(yōu)選為15kda或更低，有利地為10kda或更低，更優(yōu)選為8kda或更低的蛋白質(zhì)或肽。

肽或蛋白質(zhì)的有機非溶劑意指蛋白質(zhì)或肽在其中不可溶的溶劑，其導(dǎo)致沉淀物，優(yōu)選地納米沉淀物的形成。

根據(jù)本發(fā)明的“非溶劑”包括選自分子量小于2000da，有利地為200至2000da，更有利地為550da的聚乙二醇或聚乙二醇衍生物的有機二醇，以及選自己二醇、丁烷-1,4-二醇、戊烷-1,5-二醇，乙基己二醇、2-甲基戊烷-2,4-二醇(己二醇)、、3-環(huán)戊烯-1,2-二醇、順-4-環(huán)戊烯-1,3-二醇、反-1,4-二噁烷-2,3-二醇、1,3-二噁烷-5,5-二甲醇、(3s,4s)-吡咯烷-3,4-二醇、(3r,4r)-(-)-1-芐基-3,4-吡咯烷二醇、(3s,4s)-(+)-1-芐基-3,4-吡咯烷二醇、3-環(huán)戊烯-1,2-二醇、2-甲基-丁烷-1,3-二醇的有機二醇。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的肽或蛋白質(zhì)的非溶劑選自peg550、三縮四乙二醇(glycofurol)和己二醇((±)-2-甲基-2,4-戊二醇)，優(yōu)選peg550和己二醇。更優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的肽或蛋白質(zhì)的非溶劑是peg550。

在本發(fā)明的上下文中，表述“低分子量聚乙二醇或聚乙二醇衍生物”是指選自分子量小于2000da，有利地為200至2000da，更有利地為500da的聚乙二醇或聚乙二醇衍生物和己二醇的有機二醇。根據(jù)本發(fā)明的低分子量聚乙二醇或聚乙二醇衍生物選自peg100、peg200、peg300、peg400、peg550、peg600、peg900、peg1000、peg2000、三縮四乙二醇。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的低分子量聚乙二醇或聚乙二醇衍生物選自peg550和三縮四乙二醇，優(yōu)選地根據(jù)本發(fā)明的低分子量聚乙二醇是peg550。

在本發(fā)明的上下文中，以足夠的量使用肽或蛋白質(zhì)的非溶劑以平均直徑小于1μm的納米顆粒形式沉淀所述肽或蛋白質(zhì)，或納米共沉淀所述肽或蛋白質(zhì)和金屬離子?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法測定肽或蛋白質(zhì)溶液/肽或蛋白質(zhì)非溶劑體積比。納米沉淀或納米共沉淀產(chǎn)率特別地依賴待轉(zhuǎn)變?yōu)榧{米沉淀物或納米共沉淀物的肽或蛋白質(zhì)的量。實際上，如圖1所示，待轉(zhuǎn)變?yōu)榧{米沉淀物或納米共沉淀物的肽或蛋白質(zhì)的量越小，納米沉淀或納米共沉淀越容易，且產(chǎn)率越高。待轉(zhuǎn)變?yōu)榧{米沉淀物或納米共沉淀物的肽或蛋白質(zhì)的量的增加可導(dǎo)致產(chǎn)率的降低。

優(yōu)選地，本發(fā)明涉及治療性肽或蛋白質(zhì)納米沉淀物或治療性肽或蛋白質(zhì)/金屬離子納米共沉淀物的非變性制備方法。

“治療性肽或蛋白質(zhì)”意指任何這樣的肽或任何蛋白質(zhì)，其施用能實現(xiàn)一種或多種病理的治療。在治療性肽或蛋白質(zhì)中，可提及的是酶、細胞因子、生長因子、激素、抗體和凝血因子，以及診斷劑，特別是肽類激素，例如胰島素和衍生物，胰高血糖素和類似物(胰高血糖素樣肽)、生長激素、生長抑素、加壓素，降鈣素，lhrh(促黃體激素釋放激素)激動劑和拮抗劑、acth(促腎上腺皮質(zhì)激素)、acth-協(xié)同肽、促生長激素、促黃體激素、促甲狀腺激素、促卵泡激素、間質(zhì)細胞刺激激素(icsh)、促甲狀腺素釋放素、促腎上腺皮質(zhì)素釋放素、促生長素釋放素、促黃體素釋放素(luteoliberin)、催乳激素抑制因子、短桿菌酪肽a、青霉素、短桿菌肽、催產(chǎn)素、疫苗肽及它們的天然和合成衍生物或它們的片段。有利地，本發(fā)明涉及一種選自人胰島素、生長激素、胰高血糖素、肽激素或它們的治療有效的衍生物或其片段的肽或蛋白質(zhì)的納米沉淀物的非變性制備方法。更有利地，本發(fā)明涉及一種人胰島素或其治療有效的衍生物或其片段的納米沉淀物或人胰島素或其治療有效的衍生物或其片段和金屬離子的納米共沉淀物的非變性制備方法，優(yōu)選人胰島素/鋅納米共沉淀物。

肽或蛋白質(zhì)的表述“治療有效的衍生物”是指這樣的肽或蛋白質(zhì)，其中一個或多個氨基酸殘基已被其他氨基酸殘基取代和/或其中肽或蛋白質(zhì)的一個或多個氨基酸殘基已被除去和/或其中一個或多個氨基酸殘基已被添加到所述肽或蛋白質(zhì)。特別地，肽或蛋白質(zhì)的表述“治療有效的衍生物”是指peg化、糖基化、乙酰化、磷酸化的衍生物、環(huán)狀衍生物、偶聯(lián)至一種或多種天然或合成的脂質(zhì)、至一種或多種適體、至一種或多種肽序列、至一種或多種核酸(rna或dna)的衍生物，或與具有特征化學(xué)結(jié)構(gòu)的支架型結(jié)構(gòu)(例如樹枝狀大分子和多價結(jié)構(gòu))偶聯(lián)的蛋白質(zhì)或肽。有利地，肽或蛋白質(zhì)的表述“治療有效的衍生物”是指peg化、糖基化和乙?；幕虻鞍踪|(zhì)。

肽或蛋白質(zhì)的“治療有效的片段”意指比處于天然狀態(tài)的肽或蛋白質(zhì)的長度短并且具有有效的治療活性的多肽、肽或蛋白質(zhì)的一部分。例如，“胰島素的治療有效的片段”意指比處于天然狀態(tài)的胰島素蛋白的長度短的胰島素多肽的一部分，并且具有有效的治療活性，特別是針對糖尿病。

根據(jù)本發(fā)明，肽或蛋白質(zhì)的納米沉淀或肽或蛋白質(zhì)和金屬離子的納米共沉淀在寬的溫度范圍內(nèi)發(fā)生，特別是在-20至37℃的溫度下，更特別地在0至20℃的溫度下。該溫度范圍能夠限制肽或蛋白質(zhì)變性的任何風(fēng)險。

在優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，特別是通過機械或磁力攪拌，更特別地通過以50rpm或更低攪拌，進行溫和的攪拌。因此，根據(jù)本發(fā)明的方法在溫和、非變性條件下進行，包括非常低的剪切力(雷諾數(shù)低于2000)。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟b)是在a步驟之后，在此期間在0℃至10℃的溫度下將混合物有利地在冰浴中冷卻1分鐘至60分鐘。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟c)的固/液分離是離心，特別是在約500至50000g的離心力范圍內(nèi)。同樣地，通過膜過濾或切向過濾進行步驟d)的收集納米沉淀物。

可任選在諸如zncl2、mgcl2、cacl2、mncl2、fecl2、cuso4或licl的水溶性金屬鹽存在下進行納米沉淀。優(yōu)選地，水溶性金屬鹽是氯化鋅(zncl2)或氯化錳((mncl2)。這被稱為根據(jù)本發(fā)明的納米共沉淀。

有利地，通過形成金屬離子/蛋白質(zhì)(或肽)復(fù)合物，聯(lián)合使用水溶性鹽和肽或蛋白質(zhì)的非溶劑來促進和/或改善肽或蛋白質(zhì)的沉淀。特別地，鹽能夠獲得更好的沉淀產(chǎn)率，同時在沉淀和再溶解后保持肽或蛋白質(zhì)的活性。

水溶液的鹽濃度可在寬的間隔內(nèi)變化。對于給定量的肽或蛋白質(zhì)，在溶液的固定ph，固定的溫度和固定的水/水可混溶非溶劑體積比下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過常規(guī)實驗確定合適的最小鹽濃度，通常通過添加增加量的鹽直到觀察到肽或蛋白質(zhì)的沉淀。然而，當(dāng)在水溶性鹽存在下進行納米沉淀時，納米共沉淀產(chǎn)率依賴肽或蛋白質(zhì)的量以及鹽濃度。如圖2、圖3、圖4和圖5所示，當(dāng)肽或蛋白質(zhì)的量很少時，納米共沉淀產(chǎn)率強烈依賴鹽濃度并且它隨鹽濃度的降低而增加。

因此，根據(jù)本發(fā)明的方法的特征在于，步驟a)的所述混合物還包含至少一種選自zncl2、mgcl2、cacl2、mncl2、fecl2、licl和cuso4，有利地zncl2或mncl2的水溶性金屬鹽。

本發(fā)明還涉及可通過根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的蛋白質(zhì)或肽納米沉淀物或肽或蛋白質(zhì)和金屬離子納米共沉淀物，其中所述肽或蛋白質(zhì)具有20kda或更低，優(yōu)選15kda或更低，有利地10kda或更低，更有利地8kda或更低的分子量。

優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的納米沉淀物或納米共沉淀物由大于85％，特別地大于90％，更特別地100％的非變性蛋白質(zhì)或肽組成。

優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的納米沉淀物或納米共沉淀物具有小于1μm，有利地5nm至500nm，更有利地5nm至200nm，甚至更有利地5nm至170nm，特別地5nm至150nm的平均直徑。特別地，收集它們以摻入到合適的藥物制劑中。

更具體地，根據(jù)本發(fā)明的肽或蛋白質(zhì)納米沉淀物或納米共沉淀物可用作緩釋藥用產(chǎn)品，用于在體內(nèi)控制所述肽或蛋白質(zhì)的遞送。

在另一方面中，本發(fā)明涉及用作藥用產(chǎn)品的根據(jù)本發(fā)明的肽或蛋白質(zhì)納米沉淀物或肽或蛋白質(zhì)和金屬離子納米共沉淀物。

本發(fā)明還涉及用作單次腸胃外施用特別是通過非靜脈內(nèi)腸胃外途徑的藥用產(chǎn)品的根據(jù)本發(fā)明的肽或蛋白質(zhì)納米沉淀物或肽或蛋白質(zhì)和金屬離子納米共沉淀物，使得所述肽或蛋白質(zhì)的血漿濃度在治療窗內(nèi)的持續(xù)時間大于未按照本發(fā)明的制備方法進行制備的相同肽或蛋白質(zhì)在單次胃腸外施用(特別是通過非靜脈內(nèi)腸胃外途徑)之后的血漿濃度在治療窗內(nèi)的持續(xù)時間。

在本發(fā)明的上下文中，活性成分的“治療窗”意指所述活性成分的所有血漿濃度在所述活性成分的最小治療血漿濃度和所述活性成分的最大治療血漿濃度之間，最小治療血漿濃度是指活性成分具有有效治療活性的最小血漿濃度，最大治療血漿濃度是指可達到而不導(dǎo)致麻煩的副作用的所述活性成分的最大血漿濃度。

特別地，本發(fā)明涉及用作單次腸胃外施用特別是通過非靜脈內(nèi)腸胃外途徑的藥用產(chǎn)品的根據(jù)本發(fā)明的肽或蛋白質(zhì)納米沉淀物或肽或蛋白質(zhì)和金屬離子納米共沉淀物，使得所述肽或蛋白質(zhì)的血漿濃度在治療窗內(nèi)的持續(xù)時間大于2天，優(yōu)選大于7天，優(yōu)選大于21天，更優(yōu)選大于30天。

更具體地，本發(fā)明涉及用作單次腸胃外施用特別是通過非靜脈內(nèi)腸胃外途徑的藥用產(chǎn)品的根據(jù)本發(fā)明的肽或蛋白質(zhì)納米沉淀物或肽或蛋白質(zhì)和金屬離子納米共沉淀物，使得所述肽或蛋白質(zhì)的血漿濃度在治療窗內(nèi)的持續(xù)時間大于21天，更優(yōu)選大于30天。

在另一方面中，本發(fā)明涉及用作單次腸胃外施用特別是通過非靜脈內(nèi)腸胃外途徑的藥用產(chǎn)品的根據(jù)本發(fā)明的肽或蛋白質(zhì)納米沉淀物或肽或蛋白質(zhì)和金屬離子納米共沉淀物，使得所述肽或蛋白質(zhì)的血漿濃度在治療窗內(nèi)的持續(xù)時間比未按照本發(fā)明的制備方法進行制備的相同肽或蛋白質(zhì)在單次胃腸外施用特別是通過非靜脈內(nèi)腸胃外途徑之后的血漿濃度在治療窗內(nèi)的持續(xù)時間長2天，優(yōu)選長7天，更優(yōu)選長21天，甚至更優(yōu)選長30天。

特別地，本發(fā)明涉及用作單次腸胃外施用特別是通過非靜脈內(nèi)腸胃外途徑的藥用產(chǎn)品的根據(jù)本發(fā)明的肽或蛋白質(zhì)納米沉淀物或肽或蛋白質(zhì)和金屬離子納米共沉淀物，使得所述肽或蛋白質(zhì)的血漿濃度在治療窗內(nèi)的持續(xù)時間比未按照本發(fā)明的制備方法進行制備的相同肽或蛋白質(zhì)在單次胃腸外施用特別是通過非靜脈內(nèi)腸胃外途徑之后的血漿濃度在治療窗內(nèi)的持續(xù)時間長21天，優(yōu)選長30天。

在另一方面中，本發(fā)明涉及用作單次腸胃外施用特別是通過非靜脈內(nèi)腸胃外途徑的藥用產(chǎn)品的根據(jù)本發(fā)明的純肽或蛋白質(zhì)納米沉淀物或肽或蛋白質(zhì)和金屬離子納米共沉淀物，在tmax和tmax+2天之間、優(yōu)選地在tmax和tmax+7天之間、更優(yōu)選地在tmax和tmax+21天之間、甚至更優(yōu)選地在tmax和tmax+30天之間。

更具體地，在根據(jù)本發(fā)明的納米沉淀物或納米共沉淀物的單次腸胃外施用特別是通過非靜脈內(nèi)腸胃外途徑之后，在tmax和tmax+2天之間、優(yōu)選地在tmax和tmax+7天之間、更優(yōu)選地在tmax和tmax+21天之間、甚至更優(yōu)選地在tmax和tmax+30天之間，血漿肽或蛋白質(zhì)濃度優(yōu)選大于90％且更優(yōu)選大于98％的最大血漿濃度(cmax)值。

術(shù)語“最大血漿濃度(cmax)”是指表示其中血漿濃度在整個動力學(xué)中最高的點的峰值濃度。當(dāng)吸收和消除的量相等時達到該峰值；在施用單一劑量后測量它。

“tmax”是達到最大血漿濃度所需時間的值。該值表示藥物活性物質(zhì)的吸收速率。

“tmax+x天”對應(yīng)于達到最大血漿濃度所需的時間tmax加上x天，x對應(yīng)于整數(shù)，特別地x等于2、7、21或30。例如，“tmax+2天”對應(yīng)于時間tmax加上2天的值。

在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，本發(fā)明人調(diào)整了時間，在該時間期間必須保持血漿濃度大于cmax值的至少85％作為所用的活性成分的函數(shù)。例如并且以非限制性方式，根據(jù)本發(fā)明的純胰島素納米沉淀物或胰島素/鋅納米共沉淀物可用作通過腸胃外途徑特別是通過非靜脈內(nèi)腸胃外途徑僅施用一次的胰島素釋放藥用產(chǎn)品，使得血漿胰島素濃度在tmax和tmax+2天之間、優(yōu)選地在tmax和tmax+5天之間，特別地在tmax和tmax+7天之間大于85％，優(yōu)選大于90％，更優(yōu)選大于98％的cmax值。同樣地，根據(jù)本發(fā)明的純生長激素納米沉淀物或生長激素/金屬離子納米共沉淀物用作通過腸胃外途徑特別是通過非靜脈內(nèi)腸胃外途徑施用的生長激素釋放藥用產(chǎn)品，使得血漿生長激素濃度在tmax和tmax+21天之間、優(yōu)選地在tmax和tmax+30天之間大于85％，優(yōu)選大于90％，更優(yōu)選大于98％的cmax值。

在一個具體實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的納米沉淀物或納米共沉淀物能實現(xiàn)所述肽或蛋白質(zhì)體內(nèi)緩釋至少2天，有利地至少5天，更有利地至少30天，甚至更有利地90天。以有利的優(yōu)選方式，根據(jù)本發(fā)明的納米沉淀物或納米共沉淀物能實現(xiàn)所述肽或蛋白質(zhì)體內(nèi)緩釋至少7天，有利地至少21天，更有利地30天。

根據(jù)本發(fā)明的納米沉淀物或納米共沉淀物與能夠隨時間以受控的方式釋放蛋白質(zhì)或肽的任何系統(tǒng)或任何聚合物基質(zhì)的使用相容。因此，在優(yōu)選的實施方案中，將根據(jù)本發(fā)明的納米沉淀物或納米共沉淀物摻入到能實現(xiàn)它們在體內(nèi)的緩釋的聚合物基質(zhì)中。

在本發(fā)明的上下文中，“聚合物基質(zhì)”意指聚合物網(wǎng)絡(luò)，當(dāng)聚合物交聯(lián)時任選地是三維的，例如凝膠。優(yōu)選地，聚合物基質(zhì)特別地包括天然或合成的生物相容性聚合物，其選自基于乙醇酸、基于乳酸、基于普朗尼克酸、基于聚乙二醇，基于諸如透明質(zhì)酸的多糖、基于多肽、peo-ppo(聚(環(huán)氧乙烷)-聚(環(huán)氧丙烷))三嵌段共聚物、基于異丙基丙烯酰胺、脂質(zhì)基質(zhì)、樹枝狀大分子或它們的混合物的聚合物。優(yōu)選地，聚合物基質(zhì)是可生物降解的。

更具體地，聚合物基質(zhì)是凝膠，特別是可注射凝膠，更具體地?zé)崦裟z或脂質(zhì)基質(zhì)，甚至更具體地透明質(zhì)酸凝膠。

“摻入到聚合物基質(zhì)中的納米沉淀物或納米共沉淀物”意指在聚合物基質(zhì)中被包封、分散、接枝或交聯(lián)的根據(jù)本發(fā)明的納米沉淀物或納米共沉淀物。

本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明的納米沉淀物或納米共沉淀物的藥物組合物，并且有利地藥學(xué)上可接受的賦形劑。有利地，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包括摻入到聚合物基質(zhì)中的根據(jù)本發(fā)明的納米沉淀物或納米共沉淀物。

根據(jù)有利的實施方案，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物是緩釋藥物組合物。更具體地，根據(jù)本發(fā)明的組合物以延長的方式釋放肽或蛋白質(zhì)大于2天，有利地大于5天，更有利地大于30天，甚至更有利地大于90天。

藥物組合物特別適合通過腸胃外，優(yōu)選非靜脈內(nèi)、口服、舌下、鼻、透皮、局部、直腸、眼和粘膜途徑施用，優(yōu)選通過非靜脈內(nèi)腸胃外途徑施用。以有利的優(yōu)選方式，根據(jù)本發(fā)明的納米沉淀物或納米共沉淀物能實現(xiàn)體內(nèi)緩釋肽或蛋白質(zhì)7天，有利地21天，更有利地30天。

在優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物在單次腸胃外施用特別是通過非靜脈內(nèi)腸胃外途徑之后釋放根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或肽，使得所述肽或蛋白質(zhì)的血漿濃度在治療窗內(nèi)的持續(xù)時間大于未按照本發(fā)明的制備方法進行制備的相同肽或蛋白質(zhì)在單次胃腸外施用特別是通過非靜脈內(nèi)腸胃外途徑之后的血漿濃度在治療窗內(nèi)的持續(xù)時間。

特別地，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物在單次腸胃外施用，特別是通過非靜脈內(nèi)腸胃外途徑之后釋放根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或肽，使得所述肽或蛋白質(zhì)的血漿濃度在治療窗內(nèi)的持續(xù)時間大于2天，優(yōu)選大于7天，優(yōu)選大于21天，更優(yōu)選大于30天。

特別地，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物在單次腸胃外施用，特別是通過非靜脈內(nèi)腸胃外途徑之后釋放根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或肽，使得所述肽或蛋白質(zhì)的血漿濃度在治療窗內(nèi)的持續(xù)時間比未按照本發(fā)明的制備方法進行制備的相同肽或蛋白質(zhì)在單次胃腸外施用特別是通過非靜脈內(nèi)腸胃外途徑之后的血漿濃度在治療窗內(nèi)的持續(xù)時間長2天，優(yōu)選長7天，更優(yōu)選長21天，甚至更優(yōu)選長30天。

在另一方面中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物在單次腸胃外施用，特別是通過非靜脈內(nèi)腸胃外途徑之后釋放根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或肽，使得血漿肽或蛋白質(zhì)濃度在tmax和tmax+2天之間、優(yōu)選地在tmax和tmax+7天之間，優(yōu)選地在tmax和tmax+21天之間，甚至更優(yōu)選地在tmax和tmax+30天之間大于85％，優(yōu)選大于90％，更優(yōu)選大于98％的cmax值。

有利地，本發(fā)明涉及包含肽或蛋白質(zhì)的根據(jù)本發(fā)明的納米沉淀物或納米共沉淀物的藥物組合物，所述肽或蛋白質(zhì)選自人胰島素、生長激素、胰高血糖素、肽激素或它們的治療有效的衍生物或它們的片段。更有利地，本發(fā)明涉及包含人胰島素或其治療有效的衍生物或其片段的根據(jù)本發(fā)明的納米沉淀物或人胰島素或其治療有效的衍生物或其片段和金屬離子的根據(jù)本發(fā)明的納米共沉淀物，優(yōu)選人胰島素/鋅納米共沉淀物的藥物組合物。

更具體地，適于局部施用的組合物包括：乳膏、乳液、乳劑、軟膏、洗劑、油、水性或水醇或乙醇酸溶液、粉末、貼劑、噴霧劑、棒狀物或任何其他用于外部施用的產(chǎn)品。適合于口服施用的制劑可以膠囊，特別是軟膠囊，特別是明膠或植物、粉末、片劑，特別是吞咽或嚼，咀嚼或泡騰的形式出現(xiàn)。它們也可以液體、乳液、乳膏、貼劑、粉末、凝膠或懸浮液形式出現(xiàn)。最后，適合通過非靜脈內(nèi)腸胃外途徑施用的組合物，即通過皮下、皮內(nèi)或肌肉內(nèi)注射，特別地以懸浮液、可注射溶液或植入物形式出現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的組合物還可與諸如支架的醫(yī)療器械組合。

可根據(jù)在建立適于受試者的藥物治療(例如患者的年齡或體重、他的一般病況的嚴(yán)重性、對治療的耐受性、注意的副作用)中通?？紤]的標(biāo)準(zhǔn)來確定根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的施用方式、給藥方案和最佳的蓋侖形式。

藥學(xué)上可接受的賦形劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且根據(jù)藥物組合物的施用方式進行選擇。因此，藥學(xué)上可接受的賦形劑可選自稀釋劑、分散劑、潤濕劑、粘結(jié)劑、崩解劑、染料、潤滑劑、增溶劑、吸收促進劑、成膜劑、膠凝劑及它們的混合物。

舉例來說，片劑形式的固體組合物包含藥物載體，例如明膠、淀粉、乳糖、硬脂酸鎂、滑石、阿拉伯樹膠或類似物；和任選地蔗糖或其他合適材料的涂層。同樣地，膠囊制劑特別地包含較薄和軟或硬膠囊。糖漿或酏劑形式的制劑可包含活性成分連同甜味劑、防腐劑以及調(diào)味劑和合適的染料。水可分散的粉末或顆粒可包含與分散劑或潤濕劑或懸浮劑以及風(fēng)味增強劑或甜味劑混合的活性成分。對于直腸施用，使用在直腸溫度下熔化的粘結(jié)劑制備栓劑，例如可可脂或聚乙二醇。最后，對于腸胃外、鼻內(nèi)或眼內(nèi)施用，使用包含藥理學(xué)相容的分散劑和/或潤濕劑的水性懸浮液、等滲鹽溶液或無菌可注射溶液。

有利地，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包含摻入到聚合物基質(zhì)中的優(yōu)選胰島素或其治療有效的衍生物或其片段的根據(jù)本發(fā)明的納米沉淀物或納米共沉淀物，或胰島素和金屬離子的納米共沉淀物，優(yōu)選胰島素和鋅的納米共沉淀物，其是足夠流動以容易地注射和滅菌的穩(wěn)定的緩釋體系。它特別包括選自基于乙醇酸、基于乳酸、基于普朗尼克酸、基于聚乙二醇，基于諸如透明質(zhì)酸的多糖、基于多肽、peo-ppo(聚(環(huán)氧乙烷)-聚(環(huán)氧丙烷))三嵌段共聚物、基于異丙基丙烯酰胺、脂質(zhì)基質(zhì)，樹枝狀大分子或它們的混合物的聚合物的聚合物。更具體地，根據(jù)本發(fā)明的納米沉淀物配制在透明質(zhì)酸凝膠內(nèi)。

在一個特定方面中，本發(fā)明還涉及用作藥用產(chǎn)品的根據(jù)本發(fā)明的緩釋藥物組合物。

本發(fā)明還涉及用于人和動物健康領(lǐng)域，特別地用于腫瘤學(xué)、組織和骨變性、眼科學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)(包括i型和ii型糖尿病)、心血管疾病、皮膚病學(xué)、皮膚美容學(xué)、感染學(xué)、寄生蟲學(xué)、心臟病學(xué)、免疫學(xué)、肝臟病學(xué)、血液學(xué)、胃病學(xué)、腸病學(xué)、風(fēng)濕病學(xué)、創(chuàng)傷學(xué)、肺病學(xué)、婦科學(xué)、耳鼻喉科學(xué)、診斷產(chǎn)品中的根據(jù)本發(fā)明的納米沉淀物或納米共沉淀物或根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物。

此外，本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的納米沉淀物或納米共沉淀物或根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物用于制備藥用產(chǎn)品的用途，特別旨在用于治療和/或預(yù)防人類和動物健康領(lǐng)域中的疾病，特別是在腫瘤學(xué)、組織和骨變性、眼科學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)(包括i型和ii型糖尿病)、心血管疾病、皮膚病學(xué)、皮膚美容學(xué)、感染學(xué)、寄生蟲學(xué)、心臟病學(xué)、免疫學(xué)、肝臟病學(xué)、血液學(xué)、胃病學(xué)、腸病學(xué)、風(fēng)濕病學(xué)、創(chuàng)傷學(xué)、肺病學(xué)、婦科學(xué)、耳鼻喉科學(xué)、診斷產(chǎn)品中。

本發(fā)明還涉及用于治療和/或預(yù)防有需要的受試者中的人和動物健康領(lǐng)域中的疾病的方法，特別是在腫瘤學(xué)、組織和骨變性、眼科學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)(包括i型和ii型糖尿病)、心血管疾病、皮膚病學(xué)、皮膚美容學(xué)、感染學(xué)、寄生蟲學(xué)、心臟病學(xué)、免疫學(xué)、肝臟病學(xué)、血液學(xué)、胃病學(xué)、腸病學(xué)、風(fēng)濕病學(xué)、創(chuàng)傷學(xué)、肺病學(xué)、婦科學(xué)、耳鼻喉科學(xué)、診斷產(chǎn)品中，其包括對受試者施用治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的納米沉淀物或納米共沉淀物或根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物。

更具體地，本發(fā)明涉及用于治療和/或預(yù)防糖尿病的根據(jù)本發(fā)明的胰島素或其治療有效的衍生物或其片段的納米沉淀物或胰島素和金屬離子，優(yōu)選胰島素和鋅的納米共沉淀物或根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物。

以有利的優(yōu)選方式，根據(jù)本發(fā)明的胰島素納米沉淀物或胰島素/金屬離子納米共沉淀物能夠在單次胃腸外施用，特別是通過非靜脈內(nèi)腸胃外途徑之后實現(xiàn)胰島素的緩釋，使得血漿胰島素濃度在治療窗內(nèi)的持續(xù)時間大于未根據(jù)本發(fā)明的制備方法進行制備的胰島素在單次胃腸外施用之后的血漿濃度在治療窗內(nèi)的持續(xù)時間。特別地，根據(jù)本發(fā)明的胰島素納米沉淀物或胰島素/金屬離子納米共沉淀物能在單次腸胃外施用，特別是通過非靜脈內(nèi)腸胃外途徑之后實現(xiàn)胰島素的緩釋，使得所述肽或蛋白質(zhì)的血漿濃度在治療窗內(nèi)的持續(xù)時間大于2天，優(yōu)選大于7天，更優(yōu)選大于21天，甚至更優(yōu)選大于30天。

特別地，根據(jù)本發(fā)明的胰島素納米沉淀物或胰島素/金屬離子納米共沉淀物能夠在單次腸胃外施用，特別是通過非靜脈內(nèi)腸胃外途徑之后實現(xiàn)胰島素的緩釋，使得所述肽或蛋白質(zhì)的血漿濃度在治療窗內(nèi)的持續(xù)時間比未按照本發(fā)明的制備方法進行制備的相同肽或蛋白質(zhì)在單次胃腸外施用特別是通過非靜脈內(nèi)腸胃外途徑之后的血漿濃度在治療窗內(nèi)的持續(xù)時間長2天，優(yōu)選長7天，更優(yōu)選長21天，甚至更優(yōu)選長30天。

在另一方面中，根據(jù)本發(fā)明的胰島素納米沉淀物或胰島素/金屬離子納米共沉淀物能夠在單次腸胃外施用，特別是通過非靜脈內(nèi)腸胃外途徑之后實現(xiàn)胰島素的緩釋，使得血漿胰島素濃度在tmax和tmax+2天之間、有利地在tmax和tmax+5天之間，甚至更有利地在tmax和tmax+7天之間大于85％，優(yōu)選大于90％，更優(yōu)選大于98％的cmax值。

在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及用于治療和/或預(yù)防糖尿病的根據(jù)本發(fā)明的胰島素或其治療有效的衍生物或其片段的納米沉淀物或胰島素和金屬離子，優(yōu)選胰島素和鋅的納米共沉淀物的緩釋藥物組合物。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物能實現(xiàn)胰島素的體內(nèi)緩釋持續(xù)大于2天，有利地大于5天，更有利地大于30天，甚至更有利地持續(xù)90天。

有利地，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物能實現(xiàn)胰島素或其治療有效的衍生物或其片段或根據(jù)本發(fā)明的胰島素/金屬離子，優(yōu)選胰島素/鋅復(fù)合物在單次胃腸外施用，特別是通過非靜脈內(nèi)腸胃外途徑之后的緩釋，使得血漿胰島素濃度在治療窗口內(nèi)的持續(xù)時間大于未根據(jù)本發(fā)明的制備方法進行制備的胰島素在單次腸胃外施用之后的血漿濃度在治療窗內(nèi)的持續(xù)時間。

特別地，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物能實現(xiàn)胰島素或其治療有效的衍生物或其片段或根據(jù)本發(fā)明的胰島素/金屬離子，優(yōu)選胰島素/鋅復(fù)合物在單次胃腸外施用，特別是通過非靜脈內(nèi)腸胃外途徑之后的緩釋，使得所述肽或蛋白質(zhì)的血漿濃度在治療窗口內(nèi)的持續(xù)時間大于2天，優(yōu)選大于7天，優(yōu)選大于21天，更優(yōu)選大于30天。

特別地，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物能實現(xiàn)胰島素或其治療有效的衍生物或其片段或根據(jù)本發(fā)明的胰島素/金屬離子，優(yōu)選胰島素/鋅復(fù)合物在單次胃腸外施用，特別是通過非靜脈內(nèi)腸胃外途徑之后的緩釋，使得所述肽或蛋白質(zhì)的血漿濃度在治療窗內(nèi)的持續(xù)時間比未按照本發(fā)明的制備方法進行制備的相同肽或蛋白質(zhì)在單次胃腸外施用特別是通過非靜脈內(nèi)腸胃外途徑之后的血漿濃度在治療窗內(nèi)的持續(xù)時間長2天，優(yōu)選長7天，更優(yōu)選長21天，甚至更優(yōu)選長30天。

在另一方面中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物能實現(xiàn)胰島素或其治療有效的衍生物或其片段或根據(jù)本發(fā)明的胰島素/金屬離子，優(yōu)選胰島素/鋅復(fù)合物在單次胃腸外施用，特別是通過非靜脈內(nèi)腸胃外途徑之后的緩釋，使得血漿胰島素濃度在tmax和tmax+2天之間、有利地在tmax和tmax+5天之間，甚至更有利地在tmax和tmax+7天之間大于85％，優(yōu)選大于90％，更優(yōu)選大于98％的cmax。

在本發(fā)明的上下文中，“糖尿病”意指由導(dǎo)致過量血糖的胰島素缺乏或缺乏使用引起的不可治愈的慢性疾病。存在兩種類型的糖尿?。篿型糖尿病的特征在于完全沒有胰島素產(chǎn)生，2型糖尿病(非胰島素依賴性糖尿病或nidd)是特征在于血液中葡萄糖水平升高、高血糖的葡萄糖代謝障礙。

本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的胰島素或其治療有效的衍生物或其片段或胰島素/金屬離子，優(yōu)選胰島素/鋅復(fù)合物的納米沉淀物或根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物在制備旨在用于治療和/或預(yù)防糖尿病的藥用產(chǎn)品中的用途。

此外，本發(fā)明涉及對有需要的受試者治療和/或預(yù)防糖尿病的方法，其包括向受試者施用治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的納米沉淀物或納米共沉淀物或根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物。

附圖說明

圖1.作為所使用的胰島素質(zhì)量的函數(shù)的胰島素納米沉淀產(chǎn)率。

圖2.在氯化錳(mncl2)的存在下(條件(1)0.12mg的mncl2；條件(2)0.25mg的mncl2)，作為胰島素質(zhì)量的函數(shù)的胰島素納米共沉淀產(chǎn)率。

圖3.在氯化鈣(cacl2)的存在下(條件(1)0.12mg的cacl2；條件(2)0.25mg的cacl2)，作為胰島素質(zhì)量的函數(shù)的胰島素納米共沉淀產(chǎn)率。

圖4.在氯化鋅(zncl2)的存在下(條件(1)0.12mg的zncl2；條件(2)0.25mg的zncl2)，作為胰島素質(zhì)量的函數(shù)的胰島素納米共沉淀產(chǎn)率。

圖5.氯化鋅濃度對胰島素納米沉淀產(chǎn)率的影響。

圖6.使用0.12mg的zncl2時，溫度對胰島素納米沉淀或納米共沉淀產(chǎn)率的影響。

圖7.負載有胰島素納米沉淀物的聚合物微球的光學(xué)顯微鏡照片。

圖8.來自根據(jù)本發(fā)明的包含三縮四乙二醇(◆)或peg550(■)的胰島素納米沉淀物，來自1％透明質(zhì)酸凝膠的胰島素釋放的曲線。

圖9.來自根據(jù)本發(fā)明的包含三縮四乙二醇(◆)或peg550(■)的胰島素納米沉淀物，來自2％透明質(zhì)酸凝膠的胰島素釋放的曲線。

圖10.與來自透明質(zhì)酸凝膠的天然形式的胰島素的釋放曲線(■)比較，來自在透明質(zhì)酸凝膠內(nèi)，使用三縮四乙二醇和zncl2(●)、三縮四乙二醇和mncl2(◆)、peg550和zncl2(○)或peg550和mncl2(◇)制備的根據(jù)本發(fā)明的胰島素和金屬離子納米共沉淀物的胰島素釋放的曲線。

圖11.胰島素釋放曲線作為納米沉淀物的再懸浮步驟的存在或不存在的函數(shù)。在將胰島素納米沉淀物分散在透明質(zhì)酸基質(zhì)內(nèi)之前進行該懸浮步驟。沒有預(yù)先稀釋的條件(◆)僅對應(yīng)于納米沉淀形式的胰島素。具有預(yù)先稀釋的條件(■)對應(yīng)于溶液中納米沉淀的胰島素和非沉淀的胰島素的混合物。

圖12.通過動態(tài)光散射獲得的胰島素納米沉淀物的尺寸分布。

圖13.以5iu/kg/d的劑量皮下施用液體胰島素(elililly)和納米沉淀物后，大鼠的血糖的演變。在這種情況下，以1％透明質(zhì)酸凝膠的形式施用納米沉淀物。

圖14a.以5iu/kg/d的劑量皮下施用液體胰島素(elililly)和納米沉淀物后，大鼠的血糖的演變。在這種情況下，以聚合物溶液(175mg/ml的plga-peg-plga聚合物，20％三乙酸甘油酯)形式施用納米沉淀物。

圖14b.以5iu/kg/d的劑量皮下施用液體胰島素(elililly)和納米沉淀物后，大鼠的血糖的演變。在這種情況下，以聚合物溶液(175mg/ml的plga-peg-plga聚合物，20％三乙酸甘油酯)形式施用納米沉淀物。圖14a和14b來源于在單個實驗中從相同動物采集的數(shù)據(jù)。

圖15.以5iu/kg/d的劑量皮下施用液體胰島素(elililly)和納米沉淀物后，大鼠的血糖的演變。在這種情況下，以1％透明質(zhì)酸、10％的pluronicf127凝膠的形式施用納米沉淀物。

圖16.凍干胰島素納米沉淀物的掃描電子顯微鏡圖像。

圖17.來自包含根據(jù)本發(fā)明制備的白介素-2納米沉淀物的三個基質(zhì)的白介素-2(分子質(zhì)量為15kda)釋放的曲線。(菱形：3％的丙二醇海藻酸鹽，正方形：10％的透明質(zhì)酸，三角形：4％的卡波姆)。

具體實施方式

以下實施例旨在說明本發(fā)明。

實施例

實施例1：胰島素納米沉淀物的制備

在燒瓶中，將0.468mg的人胰島素(100iu/ml，來自lilly的umuline)的溶液與peg550溶液(胰島素的有機非溶劑)接觸。通過溫和攪拌將獲得的制劑混合，然后在4℃下將燒瓶置于冰浴中30分鐘。然后，使用10,000至50,000g范圍的離心力將混合物離心。最后，收集納米沉淀物，并通過hplc測定胰島素的量。

將納米沉淀產(chǎn)率表示為相對于開始時引入的胰島素質(zhì)量的百分比。

為了測量胰島素量對納米沉淀產(chǎn)率的影響，使用0.936mg、1.404mg、1.874mg和2.340mg的胰島素質(zhì)量重復(fù)上述方法，并計算各個納米沉淀的產(chǎn)率。

結(jié)果示于圖1。因此，可以注意到，沉淀的胰島素的量越小，則納米沉淀的產(chǎn)率越高。

通過動態(tài)光散射測量所獲得的納米沉淀物的平均直徑并在圖12中示出?？梢宰⒁獾剑撈骄睆叫∮?00nm。

圖16是凍干的胰島素納米沉淀物的掃描光學(xué)顯微鏡圖像。凍干物由彼此凝聚的根據(jù)上述方法制備的所有胰島素納米沉淀物組成?？梢杂^察到，各個納米沉淀物具有球形并且具有50至100nm的直徑。這些尺寸接近由光散射技術(shù)確定的那些尺寸。

實施例2：在納米沉淀過程中水溶性鹽的存在的影響

胰島素和mncl2、cacl2或zncl2的納米共沉淀

為了測量水溶性鹽的存在對作為鹽的量和胰島素的量的函數(shù)的根據(jù)本發(fā)明的胰島素納米沉淀的產(chǎn)率的影響，研究了三種鹽：氯化錳(mncl2)、氯化鈣(cacl2)和氯化鋅(zncl2)。對于各個鹽，根據(jù)下表1中給出的量制備產(chǎn)生納米沉淀物的四種溶液：

表1.產(chǎn)生納米沉淀物的溶液a、b、c和d的組成

對于各個溶液，以表1中提供的量將人胰島素(100iu/ml，來自elililly的umuline)與peg550和鹽接觸。通過溫和攪拌將獲得的制劑混合，然后在4℃下將燒瓶置于冰浴中30分鐘。然后，使用10,000至50,000g范圍的離心力將混合物離心。最后，收集納米共沉淀物，并通過hplc測定胰島素的量。

將納米共沉淀產(chǎn)率表示為相對于開始時引入的胰島素的量的百分比。

結(jié)果如圖2、3和4所示：

-從圖2和圖3可以看出，使用mncl2或cacl2能夠獲得胰島素納米沉淀物，產(chǎn)率接近60-70％，而不需要考慮所使用的mncl2、cacl2或胰島素的量；

-從圖4可以看出，使用zncl2能夠獲得胰島素納米沉淀物，產(chǎn)率接近80-90％，而不需要考慮所使用的mncl2或胰島素的量。

因此，使用mncl2、cacl2或zncl2具有雙重優(yōu)點：

-納米沉淀產(chǎn)率的最大化，

–形成的納米共沉淀物具有與在沒有鹽的情況下制備的納米沉淀物不同的性質(zhì)。

一般來說，圖2、3和4說明了根據(jù)本發(fā)明的方法相對于使用的鹽的性質(zhì)的靈活性。此外，相同的方法(相同的胰島素質(zhì)量、相同的非溶劑體積和性質(zhì))能夠通過僅改變鹽而獲得在物理化學(xué)性質(zhì)和生物化學(xué)性質(zhì)方面不同的產(chǎn)物。

胰島素和zncl2的納米共沉淀

為了補充實施例2中得到的結(jié)果，以下表2中給出的量根據(jù)實施例2的方法制備新溶液：

表2.產(chǎn)生納米沉淀物的溶液e、f、g、h、i、j、k、l、m、n、o、p的組成

將納米共沉淀產(chǎn)率表示為相對于開始時引入的胰島素質(zhì)量的百分比。

結(jié)果示于圖5。從這些結(jié)果可以注意到，對于最大質(zhì)量的胰島素獲得最高的產(chǎn)率。因此，氯化鋅濃度的影響可以忽略不計。

因此，我們可以得出結(jié)論：

-氯化鋅能夠優(yōu)化納米沉淀產(chǎn)率，獲得的產(chǎn)率接近100％；

-氯化鋅能夠形成具有特定性質(zhì)的納米共沉淀物。

實施例3：溫度對納米沉淀或納米共沉淀產(chǎn)率的影響

為了測量在存在或不存在水溶性鹽的情況下，溫度對根據(jù)本發(fā)明的胰島素納米沉淀的產(chǎn)率的影響，針對兩種不同的溫度條件研究了兩種不同溶液的納米沉淀產(chǎn)率：在4℃下和在室溫下。根據(jù)實施例1中所述的方法制備第一溶液，并包含1.404mg的人胰島素(100iu/ml，來自lilly的umuline)。第二溶液根據(jù)實施例2中所述的方法制備，并包含1.874mg的人胰島素(100iu/ml，來自lilly的umuline)和0.12mg的氯化鋅。

將納米沉淀產(chǎn)率表示為相對于開始時引入的胰島素質(zhì)量的百分比。

結(jié)果示于圖6。它們說明了可在室溫下進行納米沉淀的事實，其采用了兩個重要概念：

-根據(jù)本發(fā)明的方法的靈活性，從而易于使用和按比例縮放；

-與文獻中描述的方法有顯著差異，其中溫度是關(guān)鍵因素。

實施例4：從來自透明質(zhì)酸凝膠的根據(jù)本發(fā)明的胰島素納米沉淀物或納米共沉淀物釋放胰島素的曲線

為了研究來自在聚合物基質(zhì)內(nèi)配制的根據(jù)本發(fā)明的胰島素納米沉淀物的胰島素釋放的曲線，以及胰島素非溶劑的性質(zhì)的影響，使用peg550或三縮四乙二醇作為胰島素非溶劑，在1％的透明質(zhì)酸凝膠內(nèi)配制根據(jù)實施例1中描述的方法獲得的胰島素納米沉淀物。

圖7顯示了包含胰島素納米沉淀物(光學(xué)顯微鏡)的微球。

圖8顯示胰島素從1％的透明質(zhì)酸凝膠基質(zhì)中配制的所述胰島素納米沉淀物釋放。這些結(jié)果表明

-釋放發(fā)生超過20天的時間，并且

-非溶劑的性質(zhì)影響釋放速率；使用peg550作為胰島素非溶劑能夠在超過20天的時間內(nèi)獲得接近70％的血漿胰島素濃度，因此高于使用三縮四乙二醇時(在超過20天的時間內(nèi)血漿濃度接近30-40％)。

圖9顯示胰島素從2％的透明質(zhì)酸凝膠基質(zhì)中配制的所述胰島素納米沉淀物釋放。

同樣地，為了研究來自在聚合物基質(zhì)內(nèi)配制的根據(jù)本發(fā)明的胰島素和水溶性鹽的納米共沉淀物的胰島素釋放的曲線以及胰島素非溶劑和水溶性鹽的性質(zhì)的影響，使用peg550或三縮四乙二醇作為胰島素非溶劑以及zncl2或mncl2作為水溶性鹽，在1％的透明質(zhì)酸凝膠內(nèi)配制根據(jù)實施例2中描述的方法獲得的胰島素納米共沉淀物。

與天然形式的胰島素的釋放曲線相比，在圖10中觀察到來自在1％的透明質(zhì)酸凝膠基質(zhì)內(nèi)配制的胰島素和水溶性鹽的所述納米共沉淀物的胰島素釋放的曲線。這些結(jié)果表明

-胰島素從納米共沉淀物中的釋放發(fā)生超過20天的時間

而天然形式的胰島素的釋放少于1天；

-非溶劑的性質(zhì)影響釋放速率。使用peg550能夠獲得比使用三縮四乙二醇時更高的血漿胰島素濃度；且

-水溶性鹽的性質(zhì)也影響釋放速率。使用zncl2能夠獲得比使用mncl2時更高的血漿胰島素濃度。

實施例5：胰島素釋放曲線作為存在或不存在的根據(jù)本發(fā)明的納米共沉淀物的再懸浮步驟的函數(shù)

進行本研究以確定根據(jù)本發(fā)明的納米沉淀或納米共沉淀方法的可逆性的優(yōu)點。實際上，當(dāng)將根據(jù)本發(fā)明的納米沉淀物或納米共沉淀物懸浮在溶液中時，它們恢復(fù)它們的天然的，即非沉淀的形式。

對于本研究，將來自在透明質(zhì)酸凝膠基質(zhì)中配制(無稀釋條件)的根據(jù)本發(fā)明的胰島素和mncl2的納米共沉淀物的胰島素釋放的曲線與在透明質(zhì)酸凝膠基質(zhì)中配制之前懸浮在溶液中(有稀釋條件)的這些相同的納米共沉淀物的釋放曲線比較。結(jié)果示于圖11。

根據(jù)本發(fā)明的納米沉淀或納米共沉淀的可逆性是關(guān)鍵過程，幾個關(guān)鍵原因如下：

-保留蛋白質(zhì)或肽的生物活性；

-納米沉淀物作為來自藥性持久形式(depotform)的生物治療劑的體內(nèi)來源的能力；

-通過發(fā)揮該可逆性(納米沉淀物、部分懸浮的納米沉淀物、游離在溶液中的肽或蛋白質(zhì))調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)或肽的釋放速率的能力。

實施例6：胰島素納米沉淀物施用后大鼠的血糖和胰島素血癥的演變的研究.

以5iu/kg/d的劑量將在股靜脈插管的三組的六只大鼠皮下注射測試的制劑：

-在1％透明質(zhì)酸凝膠中的實施例1中制備的胰島素納米沉淀物(圖13)；

-在聚合物溶液(175mg/ml的plga-peg-plga聚合物，三乙酸甘油酯)中在實施例1中制備的胰島素納米沉淀物(圖14a和14b)；和

-在1％透明質(zhì)酸、10％pluronicf127凝膠中在實施例1中制備的胰島素納米沉淀物(圖15)。

以5iu/kg將在股靜脈插管的6只大鼠的對照組皮下注射商業(yè)(elililly)溶液。

在測試和對照體系的注射之前和之后的精確時間，按照以下時間表采集血液樣品：

-在測試的體系的注射之前三天，測定所有研究大鼠的基礎(chǔ)血糖。

-注射前六分鐘，采集血液樣品并指定為在t＝0分鐘的樣品。

-在測試的體系的注射后，在以下時間采集血液樣品：5分鐘、30分鐘、1小時、3小時、8小時、12小時、24小時、48小時、72小時和96小時。

使用來自roche的accu–chek系統(tǒng)測定血糖。

使用由mercodia銷售的elisa試劑盒測定胰島素血癥。

圖13至15顯示在皮下施用液體胰島素(elililly)和如上制備的納米沉淀物之后的大鼠中血糖或胰島素血癥的演變。

進行的實驗?zāi)軌虮容^各種制劑中所含的胰島素的生物學(xué)作用。商業(yè)液體胰島素制劑在30至60分鐘對血糖具有快速作用，并且呈現(xiàn)引起低血糖癥的風(fēng)險。實際上，藥代動力學(xué)譜在30分鐘時具有峰值活性。在注射后5分鐘至1小時遞送大多數(shù)胰島素劑量，這大大增加了低血糖癥的風(fēng)險?；谝葝u素納米沉淀物的制劑對血糖具有較慢的作用，并且能夠在某些情況下限制低血糖癥發(fā)生的風(fēng)險。例如，基于圖14a中提供的胰島素納米沉淀物的制劑就是這樣的情況：胰島素的作用減慢，且血糖控制更好，因為在5分鐘至12小時遞送大多數(shù)胰島素劑量。

與商業(yè)制劑相比，聚合物載體內(nèi)的納米沉淀物的配制的定量參數(shù)(圖14a和14b)如下：

關(guān)于胰島素血癥的演變(圖14b)，基于胰島素納米沉淀物的制劑的使用能夠平滑藥代動力學(xué)分布并將胰島素的血漿循環(huán)時間增加3倍。

實施例7：白介素-2納米沉淀物的制備

通過添加三縮四乙二醇(cas3169–2–85–0)沉淀白介素–2(-novartis)。對于各個測試，使用固定體積為1ml的三縮四乙二醇；只有白介素-2溶液的體積變化。將溶液留在冰上30分鐘，然后在4℃下以21,382g離心30分鐘。對在49μg至297μg范圍內(nèi)的白介素-2的量進行納米沉淀測試。

通過抽吸除去上清液，然后將白介素-2納米沉淀物溶于100μl的milli-q水中，并通過加入5ml的bradford試劑測定100μl體積。將樣品置于黑暗中5分鐘，然后在595nm下測量吸光度。在5至20μg/ml的白介素-2濃度范圍內(nèi)制備標(biāo)準(zhǔn)品范圍，r²＝0.99)。測定結(jié)果提供在下面的表3中：

表3.納米沉淀產(chǎn)率

將納米沉淀產(chǎn)率表示為相對于開始時引入的白介素-2的質(zhì)量的百分比

使用來自malvern的nanosizerz測量獲得的納米沉淀物的平均直徑。該平均直徑為14nm。

實施例8：從包含白介素-2納米沉淀物的凝膠基質(zhì)釋放白介素-2的研究

在37℃下進行釋放實驗。將根據(jù)實施例7中描述的方法制備的198μg的白介素-2納米沉淀物與200μl的凝膠基質(zhì)(10％的透明質(zhì)酸，3％的丙二醇海藻酸鹽或4％的卡波姆)混合，然后置于1.5ml的聚丙烯管中。然后，加入1ml的補充有甘露醇(1g/l)和sds(十二烷基硫酸鈉，150mg/l)的無菌dpbs(杜氏磷酸鹽緩沖鹽水，ph7.4)。在30天的時間內(nèi)以一定的時間間隔采集樣品(1ml)；在采集各個樣品后，加入新鮮培養(yǎng)基以維持恒定的總體積。使用市售的elisa試劑盒(thermohumanil–2elisa試劑盒)進行測定。

圖17顯示來自包含根據(jù)本發(fā)明制備的白介素-2納米沉淀物的三個基質(zhì)的白介素-2(分子質(zhì)量為15kda)的釋放。這些結(jié)果表明，釋放發(fā)生超過30天。

該圖表明基于白介素-2納米沉淀物的制劑能夠獲得白介素-2的體外緩釋。作為所使用的聚合物的類型的函數(shù)，釋放速率可更快或稍慢。在該實施例中，基于透明質(zhì)酸和卡波姆的制劑能夠獲得白介素-2的連續(xù)釋放而在等于30天的持續(xù)時間內(nèi)沒有“突釋”效應(yīng)。