相關申請案交互參照本申請案主張美國暫時專利申請?zhí)?2/068,987于2014年10月27日之優(yōu)先權，其內(nèi)容在此并入本案以作為參考數(shù)據(jù)。本發(fā)明是有關一種新穎之植物防御訊息勝肽及其應用。
背景技術：
：：所有多細胞生物皆演化出感知及反應細胞外化學訊息之機制。其中，勝肽為動物中最常見之細胞間交互作用調(diào)節(jié)者，系因其在序列、長度、及/或轉譯后修飾(ptms)提供更多變化，以代表不同生理反應(boller，2005)。相對于動物中發(fā)現(xiàn)之勝肽，植物中僅找到少數(shù)訊息勝肽(farrokhi等人，2008a；butenko等人，2009)。據(jù)估計，多數(shù)在細胞間溝通扮演杰出角色之內(nèi)源性植物訊息勝肽仍未被發(fā)現(xiàn)。由于阿拉伯芥(arabidopsis)基因體之完整序列顯示，故植物具有比動物多達十倍之預測之勝肽受體(shiuandbleecker，2003)及運輸?shù)鞍?initiative，2000)。此外，于現(xiàn)今找到之植物勝肽中，僅相當少數(shù)被發(fā)現(xiàn)在防御訊息上具功用。此主要基于一事實，即防御訊息勝肽系大多衍生自蛋白酶對較大之前驅物蛋白之選擇作用，其系低量表現(xiàn)且高度動態(tài)。已知蕃茄受損可誘發(fā)抗蟲害(anti-herbivore)反應，其系由勝肽激素系統(tǒng)素(systemin)，以及小分子激素茉莉酸(jasmonicacid；ja)及其甲酯(meja)調(diào)節(jié)(pearce等人，1991；orozco-cardenas等人，2001)。系統(tǒng)素(systemin)是第一個發(fā)現(xiàn)的植物訊息勝肽，也是第一個經(jīng)確認之損傷相關分子模式(damageassociatedmolecularpatterns；damps)激發(fā)子。目前植物被認為可利用多種訊息勝肽對抗蟲害及病原體攻擊(cheong等人，2002；francia等人，2007；chassot等人，2008)，但在損傷受迫期間，勝肽對于調(diào)節(jié)抗蟲害及抗病原體反應之細節(jié)仍待厘清。于其他植物物種已發(fā)現(xiàn)數(shù)種damp勝肽，并指出在蕃茄內(nèi)具生物活性(bollerandfelix，2009b；campos等人，2014)；這些勝肽包括hypsys(pearce等人，2001a；narvaez-vasquez等人，2007)、ralf(pearce等人，2001b)及pep1(huffaker等人，2006；a.p.trivilin，2014)。pep1于阿拉伯芥中清楚發(fā)現(xiàn)與病原體相關，且近來其于蕃茄中預測之假定原蛋白發(fā)現(xiàn)涉及抗病原體反應(a.p.trivilin，2014)。然而，其勝肽于蕃茄中之內(nèi)源性含量尚未被證實由組織損傷或meja誘發(fā)，meja系蕃茄中整體損傷訊號及反應之潛在誘發(fā)劑(scheerandryan，1999)。截至目前為止，尚未有研究以全面定量方式剖析植物在誘發(fā)壓力反應前及/或后之細胞整體勝肽表現(xiàn)之變化。有必要找尋新的植物防御訊息勝肽，其不僅增進植物逆境生物學，還能有助于發(fā)展替代方法，以改進逆境耐受性及抗性，減少農(nóng)用化學品之使用(pearce等人，1991；pearce等人，2001a；huffaker等人，2006)。技術實現(xiàn)要素：于本發(fā)明中，不可預期地發(fā)現(xiàn)一種衍生自蕃茄病原性相關蛋白1(pathogenesis-relatedprotein1；pr-1)之勝肽可調(diào)節(jié)植物免疫反應對抗生物性威脅，如病原體感染，其含有一橫跨許多植物物種之保留之11個胺基酸之訊息勝肽模體(pxgnxxxxxpy)(seqidno:1)。發(fā)現(xiàn)具此模體之勝肽可作為植物防御訊息勝肽，其于施加至植物時，可藉增加免疫反應如產(chǎn)生h2o2或植物激素或活化一或多種抗蟲害或抗病原體基因而增加植物防御活性。亦發(fā)現(xiàn)cnyx模體為內(nèi)源性蛋白酶辨識的重要序列，以切割一前驅物(如全長之pr-1)，產(chǎn)生具活性之植物防御訊息勝肽。因此，具15個胺基酸模體之勝肽(cnyxpxgnxxxxxpy)(seqidno:28)亦可施加至植物，其中經(jīng)由內(nèi)源性蛋白酶之特定切割，可產(chǎn)生一植物防御訊息勝肽(具pxgnxxxxxpy模體，seqidno:1)。此外，以具cnyx模體(seqidno:55)但缺乏11個胺基酸訊息勝肽模體(pxgnxxxxxpy)(seqidno:1)之勝肽作為負調(diào)節(jié)子，以向下調(diào)節(jié)植物防御活性。因此，于一態(tài)樣，本發(fā)明提供一經(jīng)分離之植物防御訊息多勝肽，其包含如seqidno:1所示之11個胺基酸模體(pxgnxxxxxpy)。于一些具體實施例中，本發(fā)明之植物防御訊息多勝肽系選自于由seqidno:2-27組成之群組。本發(fā)明亦提供一經(jīng)分離之植物防御訊息多勝肽，其包含如seqidno:28所示之15個胺基酸模體(cnyxpxgnxxxxxpy)。于一些具體實施例中，本發(fā)明之植物防御訊息多勝肽系選自于由seqidno:29-54組成之群組。于另一態(tài)樣，本發(fā)明系有關一組合物，其包含一本文所述之植物防御訊息多勝肽。于又另一態(tài)樣，本發(fā)明系有關一處理植物以增加植物防御活性之方法，包含施加該植物一植物防御訊息多勝肽或一含本文所述之植物防御訊息多勝肽之組合物。于一些具體實施例中，防御活性包括抗蟲害或抗病原體反應，例如，產(chǎn)生過氧化氫(h2o2)、產(chǎn)生植物激素，如茉莉酸酯(jasmonate；ja)，ja共軛結合胺基酸異白胺酸(ja-ile)或水楊酸(sa)、或表現(xiàn)抗蟲害或抗病原體蛋白，如蛋白酶抑制劑1(pi-1)、蛋白酶抑制劑2(pi-2)、病原相關蛋白1b(pr-1b，cape1前驅物基因)、β-1,3-聚葡萄糖酶(pr-2)、cys蛋白酶(pr-7)、第二類幾丁質酶(chi2；1)、乙烯反應因子5(erf5)、或avrpto依賴型pto作用蛋白3(avrpto-dependentpto-interactingprotein3；adi3)。于一些具體實施例中，防御活性不僅存在于局部經(jīng)處理之位點，還存在于整體未經(jīng)處理之葉部，例如，產(chǎn)生植物激素、水楊酸(sa)、或表現(xiàn)抗病原體蛋白，如病原相關蛋白1b(pr-1b，cape1前驅物基因)、及乙烯反應因子5(erf5)。于一些具體實施例中，cnyx為蛋白酶抑制劑設計之核心結構，以用于防止蛋白酶作用減少防御活性。于一些具體實施例中，可施加本發(fā)明方法之植物包括單子葉植物(monocotyledon)及雙子葉植物(dicotyledon)。單子葉植物之實例包括但不局限于，米、麥、小麥、黑麥、燕麥、玉米、竹子、甘蔗、洋蔥、韭菜、及姜。雙子葉植物之實例包括但不局限于，阿拉伯芥(arabidopsisthaliana)、茄子、煙草植物、辣椒、西紅柿、牛蒡、茼蒿、萵苣、桔梗、菠菜、甜菜、馬鈴薯、芹菜、胡蘿卜、水芹、香菜、中國白菜、白菜、蘿卜、西瓜、冬瓜、黃瓜、南瓜、絲瓜、草莓、大豆、綠豆、蕓豆、及豌豆。于一些具體實施例中，植物防御訊息多勝肽系以濃度約50nm或以上、100nm或以上、150nm或以上、200nm或以上、或250nm或以上存在于組合物。于一些具體實施例中，在組合物噴灑至植物后，植物防御反應可于2小時內(nèi)誘發(fā)并持續(xù)24小時以上。于一些具體實施例中，本發(fā)明之防御訊息多勝肽可結合鹽類處理而施加，以增進抗病原體活性。因此，亦提供一結合物，包含本文所述之防御訊息多勝肽及鹽類，且除了施加本文所述之植物以外，本文所述之本發(fā)明方法可進一步包含以鹽類處理植物。于特定具體實施例中，防御訊息多勝肽系混合適量之鹽，且混合物(以溶液或粉末形式)系施加至植物，如藉噴灑或浸入方式。鹽之特定實例為nacl，其濃度約25mm或以上、50mm或以上、100mm或以上、150mm或以上。于一進一步態(tài)樣，本發(fā)明系有關一向下調(diào)節(jié)植物防御活性之方法，包含處理植物一勝肽，其具cnyx模體但缺乏11個胺基酸訊息勝肽模體(pxgnxxxxxpy)，其量可有效減少或抑制一蛋白酶切割前驅物勝肽(如cnyxpxgnxxxxxpy或全長之pr-1)之酵素活性，以產(chǎn)生具上述11個胺基酸模體之pxgnxxxxxpy之植物防御訊息勝肽。本發(fā)明之一或多個具體實施例之細節(jié)系闡述如下。本發(fā)明之其他特征或優(yōu)勢將因下列數(shù)個具體實施例及所附申請專利范圍之詳盡說明而顯見。附圖說明前述
發(fā)明內(nèi)容及下列實施方式，將因結合附圖而能更佳理解。就說明本發(fā)明之目的而言，所示之圖示具體實施例系較佳之呈現(xiàn)。然而，應理解到，本發(fā)明未局限于所示之精準安排及手段。下列圖示中：圖1顯示內(nèi)源性cape1等同度之驗證及由損傷與損傷加上meja引發(fā)之表現(xiàn)量。未損傷(uw)、機械性損傷(mw)、及損傷加上meja(w)處理之蕃茄內(nèi)源性cape1表現(xiàn)量之lc-srm-ms定量分析。數(shù)據(jù)代表三生物樣本之平均值與sd。根據(jù)student’st檢定，uw、mw、及w樣本間之統(tǒng)計上顯著差異系以***(p<0.001)表示。圖2顯示cape1生物活性引發(fā)葉組織h2o2產(chǎn)生之研究。蕃茄落葉系分別以水(對照組)、機械損傷(mw)、1.25mmmeja、250nm系統(tǒng)素、及250nmcape1勝肽處理4小時。于處理后，施加1mg/ml之二胺基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine；dab)以觀察h2o2累積。實驗系以三生物重復數(shù)表示，以確認取得類似結果。圖3顯示噴灑cape1所誘發(fā)之蕃茄植物抗病原體及抗蟲害防御基因。定量抗蟲害及抗病原體防御基因之相對表現(xiàn)量，系藉比較未經(jīng)處理植物及以水或250nmcape1處理4、8、及24小時(各時間點之n＝5)植物之表現(xiàn)量。以內(nèi)部對照組ef-1α進行標準化。根據(jù)student’st檢定，以cape1及水處理之樣本間之所有統(tǒng)計上顯著差異系以*(p<0.05)、**(p<0.01)、或***(p<0.001)表示。圖4顯示噴灑cape1所誘發(fā)之蕃茄植物抗蟲害及抗病原體防御反應。(a)喂養(yǎng)水或250nmcape1處理之蕃茄葉后之幼蟲大小(larvalsizes)變化。每天記錄三十只幼蟲之幼蟲重(larvalweights)。(b)植物之pstdc3000感染表型，其系于病原體接種前預噴灑水或100nmcape1勝肽2小時(n＝3)。細菌數(shù)，其以每克葉組織之菌落形成單位對數(shù)值(logcfu)表示，代表三生物樣本之平均值及sd。根據(jù)student’st檢定，cape1及水處理之樣本間之所有統(tǒng)計上顯著差異系以*(p<0.05)或***(p<0.001)表示。圖5顯示經(jīng)切割之植物以cape1及系統(tǒng)素誘發(fā)茉莉酸酯激素累積。cape1及系統(tǒng)素誘發(fā)之ja及ja-ile濃度。植物以10mm磷酸鹽緩沖液(buffer)、365nm系統(tǒng)素(sys)、或含365nmcape1之緩沖液處理2及4小時，其系經(jīng)由切開之莖進行(n＝3)。以lc-srm-ms量化ja及ja-ile之量，并根據(jù)摻入標準品h2ja之含量計算。數(shù)據(jù)代表三獨立生物重復數(shù)之平均值及sd。根據(jù)student’st檢定，相較于相應之以水(或緩沖液)處理之樣本，統(tǒng)計上顯著差異系以**(p<0.01)或***(p<0.001)表示。圖6顯示蕃茄以cape1及flg22誘發(fā)之sa累積、抗病原體基因、及反應。(a)cape1及flg22誘發(fā)之sa量。經(jīng)切割之植物以10mm磷酸鹽緩沖液(buffer)或含365nmcape1或365nmflg22之緩沖液處理8小時，其系經(jīng)由切開之莖進行(n＝3)。以lc-srm-ms量化sa之量，并根據(jù)摻入sa同位素標準品(d6-sa)之含量計算。(b)量化wrky53與pr-1b之相對表現(xiàn)，系比較未經(jīng)處理之落葉與經(jīng)水、250nmcape1、或250nmflg22處理2小時之落葉(n＝4)。以內(nèi)部對照組ubi3進行標準化。(c)植物之pstdc3000感染表型于病原體接種前預噴灑水、100nmcape1、或100nmflg22勝肽2小時(n＝3)。于接種后4天觀察感染癥狀。于接種后4天計算細菌數(shù)，并以每克葉組織之菌落形成單位對數(shù)值(logcfu)表示。數(shù)據(jù)代表三生物樣本之平均值及sd。根據(jù)student’st檢定，相較于相應之以水(或緩沖液)處理之樣本，統(tǒng)計上顯著差異系以**(p<0.01)或***(p<0.001)表示。圖7顯示cape1可驅動蕃茄之整體免疫反應。將植物分為局部葉及整體葉，整體葉以塑料袋覆蓋以阻隔處理，且局部葉以水或250nmcape1處理24小時。(a)cape1可誘發(fā)局部及整體蕃茄葉之sa量。sa量系以lc-srm-ms量化，并以摻入之標準品d6sa之含量計算。(b)藉比較未處理之葉及以水、250nmcape1處理24小時之葉而量化erf5及pr-1b之相對表現(xiàn)。以內(nèi)部對照組ubi3進行標準化。圖8顯示多樣性品種基于蕃茄cape1之保留性cape序列及原蛋白質(proproteins)之鑒定。(a)cape1原蛋白質(蕃茄pr-1b)(seqidno:57)之序列及經(jīng)分類之模體。(b)十七個選定之cape原蛋白質之種系分析，該原蛋白質系由mega5.2產(chǎn)生，其系使用最大近似法(maximumlikelihoodmethod)并根據(jù)惠蘭及高盛模型(whelanandgoldmanmodel)。自舉值(bootstrapvalues)設定為1,000個重復數(shù)。(c)以weblogo(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)產(chǎn)生30個cape1同系物之序列標識及標志圖。sp：訊息勝肽；cap結構域：富含半胱胺酸之分泌蛋白、抗原5、及病原相關1蛋白結構域。圖9顯示阿拉伯芥cape同系物之鑒定及atcape1(seqidno:19)及atcape9之抗病原體活性。(a)源自阿拉伯芥cap蛋白之推定之a(chǎn)tcape勝肽，其含有保留之切割(cnyx)(seqidno:55)及訊息勝肽(pxgnxxxxxpy)模體(seqidno:28)。根據(jù)其等同度，cape之最高等同度系源自at4g33730，稱作atcape1；cape之最低等同度系源自at2g14610(pr1)，稱作atcape9。紅色字母代表相較于solcape1之不同胺基酸。(b)植物于病原體接種前以水、100nmatcape1、atcape9、或100nmflg22勝肽預噴灑2小時之pstdc3000感染表型(n＝3)。于接種4天后觀察感染癥狀。于接種4天后計算細菌數(shù)，并以每克葉組織之菌落形成單位對數(shù)值(logcfu)表示。數(shù)據(jù)代表三生物樣本之平均值及sd。根據(jù)student’st檢定，相較于相應之水處理樣本之統(tǒng)計上顯著差異系以**(p<0.01)或***(p<0.001)表示。圖10顯示鹽類可誘發(fā)阿拉伯芥atcape1產(chǎn)生。(a)前驅物proatcape1之產(chǎn)生，且cape1oxcnyd于無(-)或有不同nacl濃度24小時之下，由proatcape1切割成atcape1勝肽。推定之cape系以紅色顯示。數(shù)字代表以eyfp標記之前驅物蛋白(45.7kda)及以eyfp標記之經(jīng)切割前驅物(26.3kda)之預期分子量。(b)以指定時間內(nèi)生長于有(+)及無(-)125mmnacl之含atcape1-eyfp融合體之轉基因株(cape1oxcnyd)蛋白質萃取物進行西方墨點分析。上方及下方系約略45.7kda及26.3kda大小之層帶，其分別代表proatcape1-eyfp融合蛋白及atcape1-eyfp融合蛋白之預期大小。以gfp抗體檢測融合蛋白。α-微管蛋白，填載對照品。(c)芽及根之內(nèi)源性atcape1相對量。以無(1/2ms)及有125mmnacl生長24小時之種苗進行之lc-ms/ms量化分析。is：內(nèi)標準品。結果系顯示二生物重復數(shù)之平均值。誤差杠，平均值±se。星號代表鹽類處理及未處理樣本間之統(tǒng)計上顯著差異(student’st檢定；**p≤0.01)。圖11顯示鹽類處理可誘發(fā)atcapes以增進阿拉伯芥之植物免疫反應。以50mmnacl處理5天大之阿拉伯芥種苗24小時，接著以或不以250nmatcape1處理6小時。于pstdc3000接種4天后觀察感染癥狀。于接種7天后計算細菌數(shù)，并以每克葉組織之菌落形成單位對數(shù)值(logcfu)表示。數(shù)據(jù)代表三生物樣本之平均值及sd。圖12顯示前驅物proatcape1之產(chǎn)生，及cape1oxcnyd與cape1oxcnad轉基因植物之經(jīng)切割之proatcape1，其中eyfp系分別融合至含野生型(cnyd，seqidno:61)及突變型(cnad，seqidno:62)連接序列之proatcape1。取樣個別轉基因株之t3種苗，并以gfp抗體進行西方墨點法。以考馬斯藍(coomassieblue)染色作為蛋白質填載控制。圖13顯示表現(xiàn)于蕃茄之pr-1b抑制性防御基因之切割模體(cnyx.)。蕃茄葉以107cfu/mlpstdc3000hrcc-或緩沖液處理2小時后進行qrt-pcr，分析pr-1b及wrky53之相對表現(xiàn)量，該蕃茄葉系分別以水、100nmcape1、或1μmcnydpv預先處理2小時。具體實施方式除非另有定義，本文所使用的所有技術性及科學性術語具有本發(fā)明領域之技術人員所能常規(guī)理解之意義。除非另有指明，本文所使用的單數(shù)形式「一」、「一者」、及「該」包括復數(shù)參考體。因此，舉例而言，參考「一組分」包括復數(shù)個本領域技術人員習知之此類組分及其等同物?！赴够颉负小沟仍~一般而言用于代表包括/涵蓋，意指容許存在一或多個特征、成分、或組分?！赴够颉负小沟仍~涵蓋「組成自」或「由～組成」。本文所使用的「多勝肽」及「勝肽」等詞可互換使用。本文所使用的「防御訊息勝肽/多勝肽」乙詞是指約10個或以上胺基酸殘基長度之勝肽或多勝肽，其實質上具防御訊息勝肽活性，如活化抗蟲害或抗病原體基因，或誘發(fā)植物激素以增進免疫活性。較佳地，本文所述之防御訊息勝肽或多勝肽包括至多約150個胺基酸殘基、或100、或90、或80、或70、或60、或50、或40、或30、或20、或15個胺基酸殘基。本研究系開發(fā)以ms為主之勝肽體學(peptidomics)，其以一假想勝肽數(shù)據(jù)庫結合標靶誘餌搜尋策略(target-decoysearchstrategy)及差異數(shù)據(jù)庫相符評分(differentialdatabasematchscoring)，以探索防御訊息勝肽。此平臺之驗證系藉鑒定損傷加上甲基茉莉酸酯(meja)處理之蕃茄(solanumlycopersicum)所誘發(fā)之防御勝肽。利用此平臺，數(shù)種勝肽包括系統(tǒng)素，系經(jīng)鑒定及量化為損傷加上meja誘發(fā)型。僅損傷或損傷加上meja誘發(fā)之勝肽之一者發(fā)現(xiàn)可活化免疫訊息以防御生物性威脅。據(jù)此，本發(fā)明提供一種分離之勝肽，其具如seqidno:1(pxgnxxxxxpy)所示之保留模體，其可作為防御訊息勝肽。本發(fā)明亦提供一種分離之勝肽，其具如seqidno:28(cnyxpxgnxxxxxpy)所示之保留模體，其亦可應用于植物，其中可發(fā)生藉蛋白水解酶之專一性切割，使得產(chǎn)生具seqidno:1之防御訊息勝肽，以提供植物所需之防御活性。參見表1。表1模體seqinnopxgnxxxxxpy1cnyxpxgnxxxxxpy28于一些具體實施例中，本文所述之植物防御訊息勝肽系選自于由seqidno:2-27或seqidno:29-54組成之群組。參見表2。表2本文所述之植物防御訊息勝肽可藉化學合成方法制造，其系使用蛋白質化學領域習知之技術，如固相合成或于均質液中和成。或者，本發(fā)明之勝肽可以重組技術制備。于此方面，系提供含編碼本發(fā)明多勝肽之核苷酸序列之重組型核酸及含此重組型核酸之宿主細胞。宿主細胞可于適當條件下培養(yǎng)，以表現(xiàn)感興趣之多勝肽。多勝肽之表現(xiàn)可為組成性(constitutive)，使其持續(xù)產(chǎn)生或誘發(fā)，其需要刺激以啟動表現(xiàn)。于誘發(fā)表現(xiàn)情況下，當例如需加入誘導劑物質如異丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(isopropylβ-d-1-thiogalactopyranoside；iptg)或甲醇至培養(yǎng)基時，可啟動蛋白質產(chǎn)生?？蓮乃拗骷毎厥占凹兓鄤匐?，系藉本領域習知之許多技術，例如層析法，如hplc或親合性管柱。于一些具體實施例中，本發(fā)明之勝肽若實質上無細胞材料或化學前驅物或其他涉及勝肽制程之化學物質，則可稱作「經(jīng)分離」或「經(jīng)純化」?？衫斫獾氖?，「經(jīng)分離」或「經(jīng)純化」等詞未必反映出勝肽「絕對地」經(jīng)分離或經(jīng)純化之程度，例如藉移除所有其他物質(如雜質或細胞組分)之方式。于一些情況下，舉例而言，經(jīng)分離或經(jīng)純化之勝肽包括一含勝肽之制備物，其具小于50％、40％、30％、20％、或10％(重量)之其他蛋白質(如細胞蛋白質)、具小于50％、40％、30％、20％、或10％(體積)之培養(yǎng)基、或具小于50％、40％、30％、20％、或10％(重量)之化學前驅物或其他涉及合成程序之化學物質。使用時，本發(fā)明之防御訊息勝肽可與農(nóng)業(yè)上可接受之載體混合以形成農(nóng)業(yè)組合物，其系施加于有需求之植物。農(nóng)業(yè)上可接受之載體之實例包括但不局限于，水、酒精、礦物質、或植物油、碳酸鈣、滑石、粉末氧化鎂、石膏及硅藻土。農(nóng)業(yè)組合物之形式可為乳劑、液體、油、水溶性粉劑、濕性粉劑、流動劑、粉劑、細粒劑、顆粒劑、氣霧劑、熏蒸劑(fumigants)、糊劑、及其類似物。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明之防御訊息勝肽或含其之組合物可施加至植物，以增加植物防御活性。其有效誘發(fā)整體免疫反應，以加強防御生物性威脅。具體而言，相較于未施加本發(fā)明之防御訊息勝肽或含其之組合物之對照組植物，施加本發(fā)明之防御訊息勝肽或含其之組合物之植物呈現(xiàn)增強之防御活性。于特定具體實施例中，本文所述之防御活性包括產(chǎn)生過氧化氫(h2o2)、產(chǎn)生植物激素，如茉莉酸酯(jasmonate；ja)，ja共軛結合胺基酸異白胺酸(ja-ile)或水楊酸(sa)、或表現(xiàn)抗蟲害或抗病原體蛋白，如蛋白酶抑制劑1(pi-1)、蛋白酶抑制劑2(pi-2)、病原相關蛋白1b(pr-1b，cape1前驅物基因)、β-1,3-聚葡萄糖酶(pr-2)、cys蛋白酶(pr-7)、第二類幾丁質酶(chi2；1)、乙烯反應因子5(erf5)、或avrpto依賴型pto作用蛋白3(avrpto-dependentpto-interactingprotein3；adi3)。參見圖3。特別的是，本發(fā)明適于增加植物抗性以對抗各種病原體，包括但不局限于，細菌、昆蟲、線蟲、真菌、及其類似物。于特定具體實施例中，相較于喂食預先處理水之植物葉之對照組昆蟲幼蟲，喂食預先處理本發(fā)明防御訊息勝肽之植物葉之昆蟲幼蟲體型減少約20％。參見圖4(a)。于特定具體實施例中，相較于未施加本發(fā)明防御訊息勝肽之對照組植物，于細菌接種后，預先噴灑本發(fā)明防御訊息勝肽之植物呈現(xiàn)降低之感染癥狀及減少之每一鮮重(perfreshweight)細菌數(shù)。參見圖4(b)。本發(fā)明之防御訊息勝肽系施加至多種植物物種。本發(fā)明方法可施加之植物包括單子葉植物與雙子葉植物兩者。單子葉植物之實例包括但不局限于，稻米、大麥、小麥、黑麥、燕麥、玉米、竹子、甘蔗、洋蔥、韭菜、及姜。雙子葉植物之實例包括但不局限于，阿拉伯芥、茄子、煙草植物、紅辣椒、蕃茄、牛蒡、茼蒿、生菜、桔梗、菠菜、甜菜、馬鈴薯、芹菜、胡蘿卜、水芹菜、香菜、中國白菜、白菜、蘿卜、西瓜、冬瓜、黃瓜、南瓜、絲瓜、草莓、大豆、綠豆、蕓豆、及豌豆。于一些具體實施例中，本文所述之防御訊息勝肽系以約50nm或以上、100nm或以上、150nm或以上、200nm或以上、或250nm或以上之濃度含于組合物中。于一些具體實施例中，含有本文所述防御訊息勝肽之組合物系噴灑至有需求之植物1分鐘或以上，且防御反應可于2小時內(nèi)誘發(fā)并維持超過24小時。據(jù)此，本發(fā)明中以本文所述防御訊息勝肽處理植物以增加植物防御活性之方法提供多個優(yōu)勢，至少包括：(1)其有效誘發(fā)植物整體免疫反應以防御多種生物性威脅；(2)其系藉簡單地施加本發(fā)明防御訊息勝肽至有需求之植物之方式進行；(3)低劑量之本發(fā)明防御訊息勝肽即足夠；(4)本發(fā)明之防御訊息勝肽長度短且可易于藉化學合成制造；以及(5)毋須轉基因技術或農(nóng)化品，其可能導致環(huán)境問題。于一些具體實施例中，太強的植物防御活性并非優(yōu)選的情形，原因是可能降低生長。因此，需要適當調(diào)節(jié)防御活性。于本發(fā)明中，發(fā)現(xiàn)cnyx(seqidno:55)為設計蛋白酶抑制劑之核心結構，以預防進程(processing)及減少防御活性。因此，具cnyx模體(seqidno:55)但缺乏提供指定活性之活化型pxgnxxxxxpy模體(seqidno:1)之勝肽可作為蛋白酶抑制劑/競爭劑，以減少或抑制內(nèi)源性蛋白酶切割前驅物勝肽并產(chǎn)生活化型防御訊息勝肽pxgnxxxxxpy(seqidno:1)之活性，從而調(diào)節(jié)植物防御活性。據(jù)此，本發(fā)明系有關向下調(diào)節(jié)植物防御活性之方法，包含處理植物一具cnyx模體(seqidno:54)但缺少11個胺基酸訊息勝肽模體(pxgnxxxxxpy)(seqidno:1)之勝肽，其用量能有效地減少或抑制酵素切割前驅物勝肽(如cnyxpxgnxxxxxpy(seqidno:15)或全長之pr-1)之活性，以產(chǎn)生前述之植物防御訊息勝肽pxgnxxxxxpy(seqidno:1)。于一些具體實施例中，作為本發(fā)明蛋白酶抑制劑之勝肽，其較佳地具至多約50個胺基酸殘基、或40個、或30個、或20個、或15個、或10個胺基酸殘基，例如，至少4個胺基酸殘基，具體而言，5、6、7、8、9、或10個胺基酸殘基。于一具體實例中，seqidno:55(cnydpv)可作為本發(fā)明蛋白酶抑制劑之勝肽。本發(fā)明進一步以下列實例闡述，其提供之目的在于證實而非局限。鑒于本發(fā)明之揭露，本領域之技術人員應理解到，于特定具體實施例中進行許多改變，其系經(jīng)揭露且仍可獲得相同或類似結果，而不背離本發(fā)明之精神及范疇。實施例多細胞生物體之許多重要細胞間通訊事件系由勝肽介導，但僅少數(shù)勝肽于植物中發(fā)現(xiàn)。為了解決鑒定植物訊息勝肽之困難，發(fā)明人開發(fā)一新穎之勝肽體學方法，并以此方法找尋植物防御訊息勝肽。除了典型之勝肽系統(tǒng)素以外，確信于蕃茄(solanumlycopersicum)鑒定出數(shù)個新穎勝肽，經(jīng)量化為損傷及meja誘發(fā)型。衍生自病原相關蛋白1(pr-1)家族之損傷或損傷加上meja誘發(fā)型勝肽，發(fā)現(xiàn)于蕃茄誘發(fā)顯著抗病原體及輕微抗蟲害反應。此研究凸顯pr-1于免疫訊息之角色，并提出植物內(nèi)源性勝肽之潛在應用，系致力于防御作物生產(chǎn)之生物性威脅。由于pr-1于多個生物體中高度保留，且at-pr1之推定勝肽亦發(fā)現(xiàn)于阿拉伯芥中具生物活性，發(fā)明人之結果指出，此勝肽可用于增進其他植物物種之抗壓性。1.材料及方法1.1化學品、酵素、及材料三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(tcep)、甲基甲烷硫基磺酸鹽(mmts)、3,3-二胺基聯(lián)苯胺(dab)、氫氧化鉀(koh)、氫氧化鈉(naoh)、氯化氫(hcl)、10xmurashige與skoog(ms)基礎鹽類微營養(yǎng)混合物、金氏瓊脂b(kingagarb)培養(yǎng)基、異丙醇、乙醇、氯仿、甲基茉莉酸酯(meja，95％溶液)、tritonx-100、β-酪蛋白、水楊酸(sa)、2-羥基苯甲酸-[2h6](d6-sa)、及茉莉酸(ja)系購自sigma-aldrich(st.louis，mo)。二氫茉莉酸(h2ja)系購自olchemim(olomouc，czechrepublic)。分析級甲醇、乙腈(acn)、及三氟乙酸(tfa)系購自merck(darmstadt，germany)。lc-ms級can伴隨0.1％甲酸(fa)系購自j.t.baker(phillipsburg，nj)。整個作業(yè)中使用milli-q系統(tǒng)(millipore，bedford，ma)之去離子水(18.1mω·cm電阻率)。c18ziptip及millexha0.45μm濾膜系購自millipore(billerica，ma)。tripurernaisolationreagent及faststartuniversalsybrgreenmaster(rox)kit系購自roche(indianapolis，in)。rna純化試劑rnamate系購自biochain(hayward，ca)。superscriptiiireversetranscriptasekit系購自invitrogen(carlsbad，ca)。fast‐runhotstartpcrmix系購自postech(taipei，taiwan)。miracloth系購自calbiochem(lajolla，ca)?？椭浦畇ep-pakc18匣60cc(20g)系購自waters(wexford，ireland)。凝膠過濾xk16/40管柱及填充凝膠(sephadexg-25fine)系購自gehealthcarebio-sciencesab(uppsala，sweden)。胰蛋白酶性烯醇酶(trypticenolase)及[glu1]-纖維蛋白勝肽(gfp)系購自waters(milford，ma)。胰蛋白酶(經(jīng)修飾，定序級)系購自promega(madison，wi)。系統(tǒng)素(avqskppskrdppkmqtd，seqidno:58)、cape1(pvgnwigqrpy，seqidno:2)、atcape1(pagnyigarpy，seqidno:19)atcape9(prgnyvnekpy，seqidno:27)、切割模體(cnydpv，seqidno:56)、及內(nèi)標準品(paaayigaray，seqidno:59)系由yao-hongbiotechnology(taipei，taiwan)合成且純化至>95％純度。純度>95％之flg22(qrlstgsrinsakddaaglqia，seqidno:60)系購自karebaybiochem,inc.(monmouthjunction，nj)。合成勝肽之純度系進一步以nanouhplc-ms檢查其大于95％。1.2植物材料及生長條件蕃茄(solanumlycopersicumcv.cl5915)種子系由avrdc–theworldvegetablecenter(tainan，taiwan)提供。蕃茄植物系維持在白天25℃/夜晚20℃之溫度，并使用12小時照光/12小時黑暗之光周期。蕃茄種子系于土壤中發(fā)芽，并于生長箱中生長2周。在檢測內(nèi)源性勝肽方面，將2周大植物轉移且維持在人工氣候室內(nèi)6周。用于勝肽處理之蕃茄植物系持續(xù)生長于生長箱中5周。欲檢查阿拉伯芥之勝肽活性，阿拉伯芥(哥倫比亞生態(tài)型(ecotypecolumbia))種子系于土壤中發(fā)芽，并生長于白天22℃/夜晚20℃溫度之生長箱中4周，其系8小時照光/16小時黑暗之光周期。在鹽類處理方面，種子以30％漂白劑(clorox)表面除菌8分鐘，接著以除菌之ddh2o清洗五次。種子系于半量之murashige與skoog(1/2ms)培養(yǎng)基中發(fā)芽，其系22℃下之16小時光周期(80-100μmolm-2s-1照度)。1.3植物處理欲萃取傷口誘發(fā)型勝肽，蕃茄植物以剪刀剪穿葉肉表面產(chǎn)生機械性傷口，并以含1.25mmmeja之0.1％tritonx-100溶液噴灑15小時(pearce等人，2001a)。在直接量化蕃茄之cape1方面，以未損傷、損傷、或損傷加上meja處理各15小時之植物研究勝肽誘發(fā)。欲以cdna微數(shù)組分析經(jīng)檢驗勝肽之可能功能，將蕃茄落葉分別浸入水或含250nmcape1之水溶液中1、2、4、及8小時。欲確認勝肽誘發(fā)之基因表現(xiàn)，以250nmcape1或水噴灑0、4、8、及24小時后，收集蕃茄植物。欲比較不同處理所誘發(fā)之ros，以水(對照組)、機械性損傷(mw)、1.25mmmeja、250nm系統(tǒng)素、或250nmcape1處理蕃茄落葉4小時。欲測試勝肽誘發(fā)之抗蟲害活性，于喂養(yǎng)昆蟲前，以250nmcape1或水噴灑24小時，之后收集蕃茄植物。欲比較勝肽誘發(fā)之pi基因，將蕃茄落葉浸入250nmcape1、250nm系統(tǒng)素、或水中1、2、及4小時。欲比較勝肽誘發(fā)之茉莉酸酯，以10mm磷酸鹽緩沖液、365nm系統(tǒng)素、或含365nmcape1之緩沖液處理經(jīng)切割之蕃茄植物2及4小時，其系通過切開之莖進行(schaller等人，1995；howe等人，1996)。欲比較勝肽誘發(fā)之水楊酸，以10mm磷酸鹽緩沖液、365nmflg22、或含365nmcape1之緩沖液處理蕃茄植物8小時，其系通過經(jīng)切割之植物所切開之莖進行。欲比較勝肽誘發(fā)之wrky53及pr-1b基因，將蕃茄落葉浸入250nmcape1、250nmflg22、或水中2小時。欲測試勝肽誘發(fā)之抗病原體活性，于處理病原體前，三組蕃茄植物以100nmcape1、100nmflg22、或水噴灑2小時。欲測試勝肽于阿拉伯芥所誘發(fā)之抗病原體活性，于處理病原體前，植物分別以100nmatcape1、atcape9、100nmflg22、或水噴灑2小時。阿拉伯芥種苗以50mmnacl處理24小時，并于鹽類處理后以或不以250nmatcape1或atcape9處理6小時。欲測試經(jīng)切割之模體為蛋白酶抑制劑，于病原體處理前，蕃茄植物以1μmcnydpv噴灑2小時。1.4蕃茄及阿拉伯芥之內(nèi)源性勝肽萃取收集未損傷及損傷加上meja處理之蕃茄葉，并分別于液態(tài)氮存在下以摻合機(waringcommercial，newhartford，ny)研磨成粉末。將冷凍之葉粉(150g)溶于200ml之1％tfa，并以摻合機均質化2分鐘成葉汁。將葉汁通過四層棉布及一層miracloth過濾。經(jīng)過濾之葉汁隨即于4℃下以10,000×g離心20分鐘。上清液以10nnaoh調(diào)至ph4.5，并于4℃下以10,000×g離心20分鐘。接著，上清液以tfa再調(diào)至ph2.5，并于純化前將150μg之胰蛋白酶性β-酪蛋白勝肽加入上清液以作為勝肽量之內(nèi)部對照品。欲避免胰蛋白酶殘余物與內(nèi)源性蛋白質或勝肽反應，胰蛋白酶性β-酪蛋白勝肽系藉tfa酸化，并以c18ziptip純化。在以sep-pak匣純化上清液前，固定相首先以60ml0.1％tfa平衡。將上清液裝載至sep-pak匣、以120ml0.1％tfa清洗、及以200ml之含60％甲醇之0.1％tfa沖提。將沖提液真空蒸發(fā)以移除甲醇，其系首先使用真空離心濃縮儀(mivacduoconcentrator，genevac，gardiner，ny)，接著以凍干機(eyela，miyagi，japan)干燥(pearce等人，1991)。欲以數(shù)據(jù)依賴型采集(datadependentacquisition；dda)模式操作之lc-ms分析總內(nèi)源性勝肽，將凍干之粗萃取物溶于1ml之0.1％tfa、于4℃下以10,000×g離心10分鐘、及通過millexha0.45μm濾膜過濾，而后分離勝肽。在勝肽分離方面，將過濾之勝肽萃取物注射至sephadexg-25管柱，并以1ml/min之0.1％tfa沖提，伴隨1個分液/分鐘之方式收集。由22-31分鐘之沖提時間可收集10個分液，并以真空離心濃縮儀蒸發(fā)至干燥。各分液系藉c18ziptip純化以進行l(wèi)c-ms/ms分析。在以選擇型反應監(jiān)測(selectedreactionmonitoring；srm)模式操作之lc-ms分析標靶勝肽方面，從未損傷、僅損傷、及損傷加上meja處理之蕃茄葉萃取內(nèi)源性勝肽，其系使用相同程序但無凝膠過濾分離。將10天大之培養(yǎng)于1/2ms培養(yǎng)基上之垂直生長之阿拉伯芥種苗移至無蔗糖之1/2ms液態(tài)培養(yǎng)基，以進行水耕系統(tǒng)培養(yǎng)。每4天更換培養(yǎng)基。種植后3周，收取植物組織。在鹽類處理方面，交換存在或不存在125mmnacl之新鮮1/2ms培養(yǎng)基，且該處理延長至24小時。樣本于摻合機中以200ml之1％(v/v)冷卻之三氟乙酸(tfa；sigma-aldrich)均質化2分鐘。欲標準化樣本制備之變異，且為了液相層析術-串聯(lián)質譜(lc-ms/ms)分析之更佳量化準確性，于分離粗勝肽時，將20μl之1pmoleμl–1內(nèi)標準品(合成勝肽：paaayigaray，seqidno:59)加入萃取緩沖液，其中該標準品具atcape1之二個胺基酸取代位置g3a及n4a。萃取物隨即通過四層miracloth(calbiochem，sandiego，ca，usa)過濾，以移除植物碎屑。該程序遵照前述之步驟(pearce等人，2001a,b)。于4℃下以8500rpm離心20min后(beckmancoulter，avantij-26xp)，將上清液ph值調(diào)整至4.5。萃取物隨即于4℃下以8500rpm再次離心20min，并將上清液ph值調(diào)整至2.5。接著，將上清液結合于客制之sep-pakc18固相萃取匣(waters，milford，ma，usa)，其系根據(jù)下列步驟：c18匣首先以0.1％(v/v)tfa調(diào)整、結合于上清液，接著以0.1％(v/v)tfa清洗。最后，多勝肽系以60％(v/v)甲醇/0.1％(v/v)tfa沖提。于高度真空下，以回旋蒸發(fā)方式將最終溶析物中之勝肽蒸發(fā)至干燥，并將團塊再懸浮于0.1％(v/v)tfa。多勝肽系進一步藉快速蛋白質液相層析術(purifier)分液，以粒徑排除管柱移除蛋白質污染物(superdexpeptide10/300gl；gehealthcare，littlechalfont，uk)。將含多勝肽或具類似于atcape1大小之少量蛋白質之分液收集且合并。合并之溶析物系于高度真空下回旋蒸發(fā)并再懸浮于0.1％(v/v)tfa，以供ziptip(millipore，billerica，ma，usa)移除鹽類污染。在最終蒸發(fā)及再懸浮于0.1％(v/v)甲酸(fluka)后，進行標靶l(wèi)c-ms/ms分析。標靶l(wèi)c-ms/ms分析。1.5以lc-ms/ms剖析內(nèi)源性勝肽在內(nèi)源性勝肽分析方面，進行l(wèi)c-ms/ms分析，其系以nanouhplc系統(tǒng)(nanoacquityuplc，waters，millford，ma)聯(lián)機至混合型四極飛行時間質譜儀之奈米電撒源(synapthdmsg1，waters，manchester，uk)。synapthdmsg1儀器系以陽離子模式及dda法操作，以檢測內(nèi)源性勝肽。將樣本裝載至填充20mm之5μmsymmetryc18顆粒之180μm×50mm隧道熔塊捕獲管柱(tunnelfrittrapcolumn)(waters，millford，ma)，并聯(lián)機以填充250mm之1.7μmbehc18顆粒(waters，millford，ma)之75μm×250mm隧道熔塊分析管柱分離，其系使用95分鐘之300nl/min梯度流速及5-90％acn/0.1％fa比例(chen等人，2012)。當檢測到前驅物離子電荷為2+、3+、及4+且強度大于20計數(shù)時，將dda擷取參數(shù)設定為一次全ms掃描(m/z400-1600)，其中掃描時間為0.6秒鐘，并轉換成三次產(chǎn)物離子掃描(m/z100-1990)，其中掃描時間為1.2秒鐘。由synapthdmsg1產(chǎn)生之數(shù)據(jù)系首先以masswolf(version4.3.1)轉換成mzxml格式(pedrioli等人，2004)，之后藉由uniqua以synapthdmsg1之預設參數(shù)處理(chang等人，2013)。將uniqua處理之波譜轉換成mascot通用模式(.mgf)，其系使用transproteomicspipeline(tpp)版本4.4修訂版1之mzxml2search(pedrioli，2010)。在檢測阿拉伯芥cape1方面，以耦接在線毛細管nanouhplc系統(tǒng)(waters)之ltqvelospro質譜儀(thermoscientific，waltham，ma，usa)用于勝肽鑒定及定量。以配備自制c18阱匣(5μm顆粒，symmetryc18；waters)及自制c18逆相分析管柱(1.7μm顆粒，beh130c18；waters)(chen等人，2012)之毛細管lc系統(tǒng)用于傳輸溶劑及標靶勝肽，其中線性梯度為歷時95分鐘之8至90％(v/v)之溶于0.1％(v/v)甲酸之乙腈之奈米流速(約300nlmin–1)。分析管柱系耦接至奈米電灑離子化源，且數(shù)據(jù)擷取系以全ms掃描進行，接著為標靶前驅物離子之ms/ms掃描。選擇atcape1(pagnyigarpy(seqidno:19)；m/z589.8)及內(nèi)標準品(paaayigaray(seqidno:59)；m/z562.4)之前驅物離子進行后續(xù)之標靶ms/ms掃描。以碎片離子m/z563.2、676.3、及900.5，以及m/z537.2、650.3、及813.34進行atcape1及內(nèi)標準品之進一步個別鑒定及定量。1.6假設及誘餌(decoy)數(shù)據(jù)庫蕃茄假設性勝肽數(shù)據(jù)庫(tomht數(shù)據(jù)庫)之組成系取自internationaltomatoannotationgroup(itag)蛋白質數(shù)據(jù)庫(發(fā)行版2.3，總蛋白質項目＝34,728)之所有蛋白質c端序列之50個殘基，并加上胎牛β-酪蛋白序列。隨機數(shù)據(jù)庫(randatabases)系藉將標靶數(shù)據(jù)庫之序列洗牌產(chǎn)生，其系使用matrixscience(london，uk)提供之perlscript(decoy.pl)。1.7內(nèi)源性勝肽鑒定及定量經(jīng)處理之mgf檔案系進行tomht數(shù)據(jù)庫搜尋，而不以mascotms/ms離子搜尋(matrixscience，服務器版本2.3)指定酵素切割規(guī)則。勝肽前驅物及片段之ms/ms離子搜尋之質量偏差值為±0.1da。以隨機數(shù)據(jù)庫之mascot搜尋結果評估隨機匹配勝肽之截止值評分。1.8植物激素萃取于勝肽處理后，從葉組織萃取代謝物以量化植物激素。萃取程序系由先前公開之步驟修改(pan等人，2010)。葉組織(約0.6g鮮重)系于液態(tài)氮存在下磨成粉末，并移至50ml螺旋蓋管。將冷凍之葉粉末溶于6ml萃取溶劑，并加入d6-sa(3ng至0.6g葉組織)及h2ja(15ng至0.6g葉組織)以作為內(nèi)標準品。樣本于4℃下以100rpm之速度搖晃30分鐘萃取，之后各樣本加入12ml二氯甲烷并于4℃下以100rpm搖晃30分鐘。樣本系于4℃下以13,000×g離心5分鐘，并形成二相。將下層相小心地移至新試管，并以真空離心濃縮儀蒸發(fā)約1小時至干燥。將干燥之樣本溶于300μl甲醇、良好地混合、及于4℃下以10,000×g離心5分鐘，之后將上清液移至樣本小瓶，以利lc-ms/ms進行標靶定量分析。1.9以lc-ms/ms定量標靶勝肽及植物激素在標靶勝肽定量方面，nanouhplc法系與內(nèi)源性勝肽分析方式相同，且ms(ltqvelospro，thermofisherscientific，sanjose，ca)設定為一次全ms掃描(m/z400-1600)并增加掃描速度，并切換為一次選擇性反應監(jiān)測(selectedreactionmonitoring；srm)掃描，其中掃描速度正常。在srm靶向cape1方面，選擇雙電荷cape1前驅物離子m/z(m/z643.84)進行碎裂反應(fragmentation)，并監(jiān)測產(chǎn)物離子m/z620.34、733.37、及1090.57。藉由結合產(chǎn)物離子之srm尖峰面積，評估損傷及未損傷樣本之cape1相對含量。在植物激素定量方面，使用線型離子阱-軌道阱質譜儀(orbitrapelite，thermofisherscientific，bremen，germany)并耦接連線uhplc系統(tǒng)(acquityuplc，waters，millford，ma)。植物激素系藉hsst3管柱分離(waters，millford，ma)，其使用之梯度為0.5-25％can歷時0-2min、25-75％can歷時2-7分鐘、及75-9.5％can歷時7-7.5分鐘。質譜儀系以負離子模式操作，并設定一次全ft-ms掃描(m/z100-600)，其具60,000分辨率，且針對五個前驅物，切換成五次ft-ms產(chǎn)物離子掃描(于30,000分辨率)：m/z為137.02(針對sa)、209.12(針對ja)、322.20(針對ja-ile)、141.05(針對d6-sa解離成d4-sa)、及211.13(針對h2ja)。選擇sa之137.02至93.03、ja之209.12至59.01、ja-ile之322.20至130.09、d6-sa之141.05至97.06、及h2ja之211.13至59.01等m/z碎片反應進行定量。計算ja、ja-ile、及sa對d6-sa與h2ja含量之絕對含量。1.10定量實時pcr(qrt-pcr)以定量實時pcr(qrt-pcr)驗證一些特定基因之表現(xiàn)。以三生物樣本重復數(shù)進行qrt-pcr分析。qrt-pcr系以sybrgreen試劑及abi7500realtimepcr系統(tǒng)(fostercity，ca)進行。pcr循環(huán)步驟為50℃歷時2min且94℃歷時10min以進形初始步驟，接著95℃歷時15s且60℃歷時1min并進行40次循環(huán)。不同樣本之基因表現(xiàn)系以內(nèi)部對照組ef-1α或ubi3進行標準化。所使用之引子列于表3。以熔化曲線驗證pcr產(chǎn)物之特異性。表3：qrt-pcr引子1.11體內(nèi)檢測h2o2將3,3-二胺基聯(lián)苯胺(dab)溶于1nhcl，并以naoh調(diào)整至ph3.8，其最終濃度為1mg/ml。植物于處理后，落葉系于陰暗條件下持續(xù)供應dab溶液8小時，之后以煮沸之乙醇(96％)脫色10分鐘。將葉冷卻至室溫，并保存于新鮮乙醇中。1.12食植行為(herbivory)處理斜紋夜盜蛾(spodopteralitura)幼蟲卵系取自臺灣農(nóng)業(yè)藥物毒物試驗所(taiwanagriculturalchemicalsandtoxicsubstancesresearchinstitute)(taichungcounty，taiwan)。以30只大小一致之第一齡期階段幼蟲進行抗昆蟲生物試驗研究。幼蟲每24小時以收取自水或cape1預噴灑植物之蕃茄葉持續(xù)喂食且歷時5天。每天記錄所有幼蟲重量，并計算幼蟲重量平均值。于喂養(yǎng)5天后，觀察幼蟲大小。1.13病原體生長及感染(challenge)細菌病原體西紅柿細菌性斑點菌(pseudomonassyringaepv.tomatodc3000；pstdc3000)或pstdc3000hrcc-系于28℃下生長于含100mg/l利福平(rifampicin)之金氏b(king’sb；kb)瓊脂培養(yǎng)基2天。于感染前，細菌系于28℃下培養(yǎng)于kb液體培養(yǎng)基，其中以230rpm搖晃隔夜。將細菌離心沈淀，并再懸浮于10mmmgso4，其中a600＝0.25(約108cfu/ml)。于真空下，將植物浸入含105cfu/mlpstdc3000之10mmmgso4稀釋懸浮液中30秒鐘，內(nèi)含0.005％silwetl-77。pstdc3000或hrcc-系生長于水或勝肽處理之植物數(shù)天以觀察癥狀，之后根據(jù)前述方法收集葉之細菌并評估細菌效價(zimmerli等人，2000)。1.14西方墨點分析將10天大之cape1oxcnyd或cape1oxcnad種苗加至培養(yǎng)基，其具或不具不同nacl濃度，并于不同時間點具或不具125mmnacl。收集之樣本系伴隨yszgrindingmedia(ee-tec，ezeag0500)于2ml微離心管中以超音波(kurabo，sh-48)碎裂。于制備期間，將樣本浸入液態(tài)氮以快速冰凍。樣本隨即于95℃下之萃取緩沖液(50mmtris-hcl，ph7.5、150mmnacl、20mmedta、1％[w/v]sds、及10％[v/v]甘油)中均質化5分鐘。以12,000rpm離心10min后，將上清液移至新的微離心管。將50微克之總蛋白質裝載至10％sds-聚丙烯酰胺凝膠，并以西方墨點法分析。以gfp抗體(roche；11814460001)檢測重組型proatcape1標記之eyfp，并以山葵過氧化酶鍵接之小鼠抗體(invitrogen；616520)作為二級抗體。欲確認總蛋白質之均等填載，隨后以α-微管蛋白抗體(sigma-aldrich；t5168)探測同一墨染片。1.15登錄號本文之序列數(shù)據(jù)可于internationaltomatoannotationgroup(itag)蛋白質數(shù)據(jù)庫或genbank/embl數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)。本文推定之阿拉伯芥cape勝肽之序列數(shù)據(jù)可于阿拉伯芥基因體計劃(arabidopsisgenomeinitiative)中發(fā)現(xiàn)，其登錄號如下：at4g33730.1、at4g25780.1、at4g33720.1、at4g25790.1、at5g57625.1、at4g30320.1、at2g14580.1(prb1)、at5g26130.1、及at2g14610.1(pr1)。2.結果2.1鑒定損傷加上meja誘發(fā)之蕃茄葉勝肽定量分析顯示一新穎之勝肽及一習知之勝肽(系統(tǒng)素)，其顯示于未損傷植物無明顯表現(xiàn)，但在損傷加上meja處理后高度表現(xiàn)。新穎之勝肽系源自病原相關蛋白1b(pr-1b)，其顯示類似于系統(tǒng)素的表現(xiàn)反應。由于pr-1b系歸類為富含半胱胺酸之分泌型蛋白、抗原5、及病原相關1蛋白(cap)超家族(gibbs等人，2008)之成員，此勝肽系稱作cap衍生型勝肽1(cape1)。在cape1鑒定方面，除了y1與b1離子以外，多數(shù)y與b片段離子可匹配至cape1序列之理論片段。利用此方法，用于整體勝肽鑒定之組織量系<150g。欲確認經(jīng)匹配之序列，以ms/ms分析合成之cape1，且所得之圖譜完全符合于內(nèi)源性cape1。若無勝肽預片段化(pre-fractionation)，由未損傷、機械性損傷、及損傷加上meja處理之蕃茄植物萃取之總勝肽系直接以nanouhplc-srm-ms分析，其系靶向特異性cape1碰撞誘發(fā)解離(collisionalinduceddissociation；cid)反應。定量結果顯示，cape1于未損傷植物中表現(xiàn)量低，但在損傷或損傷加上meja處理后明顯誘發(fā)(圖1)。2.2cape1之生物活性處理cape1可誘發(fā)蕃茄葉產(chǎn)生h2o2，系如dab染色之檢測(圖2)。藉微數(shù)組所得之誘發(fā)基因之分析結果顯示，cape1可提升數(shù)個基因之表現(xiàn)，該基因習知涉及抗蟲害及抗病原體防御反應。cape1主要誘發(fā)涉及壓力反應、防御反應、先天性免疫反應、細菌防御、及系統(tǒng)性后天抗性(systemicacquiredresistance；sar)之基因表現(xiàn)。反轉錄定量pcr(qrt-pcr)分析可進一步確認的是，于處理cape1后可活化抗蟲害基因蛋白酶抑制劑1與2(pi-1與pi-2)及病原體相關基因病原相關蛋白1b(pr-1b，cape1前驅物基因)、β-1,3-聚葡萄糖酶(pr-2)、cys蛋白酶(pr-7)、第二類幾丁質酶(chi2；1)、乙烯反應因子5(erf5)、及avrpto依賴型pto作用蛋白3(adi3)(圖3)?？瓜x害反應系藉30只斜紋夜盜蛾之平均幼蟲重量而評估，該幼蟲系喂以預處理水或cape1之蕃茄葉。預先噴灑cape1之蕃茄植物可抑制幼蟲生長，并減少幼蟲重量約20％(圖4a)。欲證實植物抗性亦可藉cape1而強化，二組蕃茄植物系以水或合成之cape1預先噴灑2小時。于處理后，二植物組進行病原體西紅柿細菌性斑點菌(pstdc3000)之沖擊。如圖4b所示，預處理水之蕃茄植物顯示嚴重病原體感染癥狀。欲比較系統(tǒng)素與cape1之抗蟲害反應，使用切開之蕃茄植物，系因先前已使用切開之植物處理勝肽溶液以測試系統(tǒng)素之生物活性(schaller等人，1995；howe等人，1996)。ja及ja-ile據(jù)觀察可于處理系統(tǒng)素2小時后明顯誘發(fā)，但以cape1處理則4小時后誘發(fā)，且表現(xiàn)量低于系統(tǒng)素約4倍(圖5)。其結果顯示，cape1可為誘發(fā)免疫性至病原性之新穎damp訊息，其次，cape1可比擬典型之病原體/微生物相關分子模式(pathogen/microbeassociatedmolecularpattern；pamp/mamp)勝肽「flg22」(hayashi等人，2001)。如圖6a所示，當供應至切開之植物時，cape1及flg22明顯誘發(fā)sa。于圖6b，flg22高度誘發(fā)蕃茄之wrky轉錄因子53(wrky53)表現(xiàn)而非pr-1b。此結果與蕃茄功能基因體數(shù)據(jù)庫(tomatofunctionalgenomicsdatabase；tfgd)之公開rna-seq數(shù)據(jù)一致(fei等人，2011)，其系基于「處理不同細菌及pamps之蕃茄葉轉錄體(transcriptome)定序」(rosli等人，2013)。rna-seq數(shù)據(jù)顯示，蕃茄以flg22處理30分鐘或6小時后，可誘發(fā)wrky53，但無法明顯誘發(fā)pr-1b、adi3、及erf5。然而，cape1無法誘發(fā)wrky53，但高度誘發(fā)其前驅物基因pr-1b。以cape1或flg22噴灑植物2小時，使其對pstdc3000感染產(chǎn)生抗性(圖6c)?？共≡w反應，包括sa生合成及防御基因(erf5及pr-1b)表現(xiàn)，可藉cape1整體誘發(fā)。此數(shù)據(jù)顯示，cape1為調(diào)節(jié)整個植物中不僅是局部還有整體防御反應之訊息勝肽(圖7)。2.3cape1原蛋白質成熟之cape1勝肽系源自蕃茄pr-1b之c端。此原蛋白質系由n端訊息勝肽、cap結構域、及延伸之c端構成(圖8a)。molecularevolutionarygeneticsanalysisversion5.2(mega5.2)之種系分析(tamura等人，2011)及pr-1b蛋白之c端比對證實，于單子葉至雙子葉之不同開花植物中，完整蛋白及延伸之c端系高度保留(圖8b)。有趣的是，pxgnxxxxxpy模體(seqidno:1)于cape1序列中系保留，且于切割位點前之三殘基序列具保留之cnyx模體(seqidno:55)(圖8c)。此顯示，cnyx.pxgnxxxxxpy-(seqidno:28)可為功能性模體，其可標記其他物種之生物活性勝肽。2.4阿拉伯芥之cape勝肽欲證實源自cnyx.pxgnxxxxxpy模體(seqidno:28)之勝肽可具生物活性，選用阿拉伯芥cape同系物atcape1及atcape9。相較于solcape1，atcape1及atcape9具有最高及最低序列同源性。兩勝肽皆顯示增加對pstdc3000感染之免疫性(圖9)。欲確認此atcape1前驅物之蛋白水解過程，發(fā)明人產(chǎn)生一轉基因植物cape1oxcnyd，其中野生型proatcape1融合至c端強化型黃色熒光蛋白(eyfp)，其系藉35s啟動子持續(xù)地過量產(chǎn)生。此數(shù)據(jù)顯示，當于預期之切割位點發(fā)生切割時，有二層帶之mws分別接近標記eyfp之前驅物蛋白(45.76kda)及atcape1融合至eyfp(26.3kda)(圖10a及10b)。于阿拉伯芥，處理鹽類可誘發(fā)atcape1產(chǎn)生，且甚而引發(fā)atcape1由根運輸至芽(圖10c)。處理鹽類亦可增進阿拉伯芥之抗病原體活性(圖11)，其可能系因鹽類壓力可誘發(fā)cape1產(chǎn)生及運輸。此結果顯示，cape勝肽之移動可調(diào)節(jié)整體免疫反應。2.5保留之切割模體之重要性欲確認保留之切割模體之重要性，發(fā)明人接著產(chǎn)生轉基因株，稱作cape1oxcnad，其中eyfp系融合于proatcape1，但在cnyx模體有一突變(y160a)。發(fā)明人接著檢查經(jīng)突變之proatcape1–eyfp之表現(xiàn)。于所有三個別之轉基因株中，僅檢測到mw為45.76kda之單一層帶(圖12)。該些結果顯示，經(jīng)鑒定之a(chǎn)tcape1系源自其前驅物proatcape1，其系經(jīng)由在保留之cnyx模體之切割(seqidno:55)，且芳族胺基酸殘基酪胺酸于過程中相當重要。發(fā)明人亦以保留之cnyx模體(seqidno:55)設計蛋白酶抑制劑，以預防蕃茄之進程。結果顯示，蕃茄植物在處理cnydpv后，防御基因之表現(xiàn)下降(圖13)。3.討論于本研究中，定量之勝肽體學分析顯示三勝肽，包括系統(tǒng)素，其于未損傷之植物未顯著表現(xiàn)，但在損傷加上meja處理后高程度表現(xiàn)。此勝肽系抗蟲害反應之整體活化之訊息分子(pearce等人，1991)。系統(tǒng)素為抗蟲害訊息瀑流放大之上游因子，且整體訊息傳遞系由茉莉酸(ja)介導(li等人，2003；stratmann，2003)。發(fā)明人于此顯示損傷加上meja處理之誘發(fā)前及后，內(nèi)源性系統(tǒng)素(一已知之損傷誘發(fā)型勝肽)之濃度變化。系統(tǒng)素之檢測亦證實，本研究提出之平臺，能檢測防御訊息勝肽。第二個勝肽，其發(fā)現(xiàn)于處理時向上調(diào)節(jié)，系源自葉綠體光系統(tǒng)ii次單元x。此勝肽與葉綠體誘發(fā)活性氧系(reactiveoxygenspecies；ros)相關聯(lián)。第三個勝肽(稱作cape1)系源自病原相關蛋白1b(pr-1b)，其系功能不明之蛋白。由cape1誘發(fā)之h2o2及防御基因反應顯示，此勝肽調(diào)節(jié)植物防御反應。h2o2為ros，其涉及損傷、昆蟲攻擊、及病原體感染期間之數(shù)個防御反應(doke等人，1996；lambanddixon，1997；orozco-cardenasandryan，1999)。本研究顯示cape1為damp誘導劑，系因其由損傷誘發(fā)且活化防御反應。盡管蕃茄中有數(shù)個勝肽被視為damps，不過勝肽damp之證據(jù)主要基于考慮到前驅物基因系由損傷或合成之推定勝肽之生物活性所誘發(fā)(pearce等人，1991；huffaker等人，2006；a.p.trivilin，2014)。微數(shù)組及qrt-pcr分析顯示，cape1可誘發(fā)防御基因產(chǎn)生免疫反應，以對抗蟲害及病原體。cape1可誘發(fā)ja及sa激素，其說明何以抗蟲害及抗病原體基因系藉處理勝肽而誘發(fā)。ja及sa生合成路徑習知具拮抗性(robert-seilaniantz等人，2011；thaler等人，2012)，但其亦可于植物免疫訊息網(wǎng)絡之sa-ja-乙烯骨干中發(fā)揮協(xié)同作用，從而復位向(redirecting)防御輸出(verhage等人，2010)。相較于分別以系統(tǒng)素及flg22活化抗蟲害及抗病原體反應，cape1顯示輕度抗蟲害反應，但活化可比擬之抗病原體反應。由cape1誘發(fā)之輕度抗蟲害反應可由pi基因及ja激素之誘發(fā)量比以系統(tǒng)素處理的低而加以說明。cape1明顯誘發(fā)數(shù)個病原體相關標記基因，包括pr-2、pr-7、chi2；1、及cape1前驅物(pr-1b)。不同于flg22，其誘發(fā)wrky53(xiao等人，2007)，cape1引發(fā)之免疫性不會誘發(fā)pti反應基因wrky53但誘發(fā)pr-1b。此意指flg22及cape1分別作為pamp/mamp及damp之誘導劑，從而于抗病原體反應中調(diào)節(jié)不同機制。此外，erf5，其系gcc盒(agccgcc)結合蛋白，系由cape1誘發(fā)。發(fā)明人顯示，erf5為cape1防御反應之媒介物，系因gcc盒，其系發(fā)現(xiàn)于許多茉莉酸(ja)/乙烯(et)誘導性及pr基因之啟動子之同側作用組件(cis-actingelement)。erf5亦證實正向調(diào)節(jié)sa訊息及植物免疫性以對抗細菌病原體pstdc3000，并藉活化數(shù)個pr基因改進植物之病原體抗性(moffat等人，2012；son等人，2012)。于蕃茄，觀察到erf5之過度表現(xiàn)，以誘發(fā)pr基因，并提供青枯病菌(ralstoniasolanacearum)抗性(li等人，2011)。本研究提出另一增進植物抗性之方法，系經(jīng)由erf5，其可由低濃度之勝肽而不以轉基因調(diào)節(jié)。此外，adi3，其系編碼效應子引發(fā)之免疫性(eti)反應之組分，可負向調(diào)節(jié)程序性細胞死亡(programmedcelldeath；pcd)(devarenne等人，2006)，系于處理cape1后誘發(fā)。adi3為細胞死亡抑制劑(celldeathsuppressor；cds)且其定位系透過adi3t-環(huán)圈延伸所發(fā)現(xiàn)之核定位訊息，其系經(jīng)磷酸化以活化激酶(ek-ramos等人，2010b)。adi3cds功能之去活化系藉pto之交互作用而初始化，其僅在當pto與pst效應子蛋白avrpto作用時發(fā)生。此cds活性之去活化可導致hr，其功能系局限病原體擴散。通過adi3功能去活化之hr經(jīng)證實可藉過度表現(xiàn)adi3而補償(devarenne等人，2006；ek-ramos等人，2010a)。于本研究中，發(fā)現(xiàn)cape1可活化「防御-無-死亡(defense-no-death)」表型，以增進植物對抗細菌病原體pstdc3000之抗性，而不誘發(fā)hr(yu等人，1998)。此表型可由抗病原體及細胞死亡抑制基因之轉錄程度及sa之量的增加而說明。其亦顯示，整體性誘發(fā)之免疫反應可藉cape1活化，系因sa及ja分別為誘發(fā)sar及誘發(fā)性整體抗性(inducedsystemicresistance；isr)之必需激素(pieterse等人，2009)。植物昆蟲及病原體為每年全球實質作物損失及越來越多環(huán)竟問題之成因，以農(nóng)用化學品打擊生物壓力遭遇越來越多局限。cape1可用于活化抗性以對抗蕃茄之生物性威脅。此外，cape1及其原蛋白質之高度保留序列顯示，cape1亦可存在于其他物種并具生物活性。此研究證實pr-1b于蕃茄防御訊息之角色，亦證實源自阿拉伯芥之推定之cape勝肽pxgnxxxxxpy-模體(seqidno:1)可于阿拉伯芥誘發(fā)抗性以對抗pstdc3000。此外，處理鹽類可誘發(fā)atcape1產(chǎn)生，并由植物根運輸至之地上部。此結果顯示cape勝肽于多樣性植物物種整體免疫調(diào)節(jié)之角色。保留之切割模體cnyx(seqidno:55)亦經(jīng)鑒定為植物免疫性之重要序列，其系藉調(diào)節(jié)進程而達成。盡管at-pr1被視為抗病原體反應之常見標記基因，其功能先前尚未厘清。本研究突顯pr1及cap蛋白于整體防御訊息之生物學角色。參考文獻a.p.trivilin,s.h.a.m.g.m.(2014)。componentsofdifferents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lyglnargprotyr151015<210>39<211>15<212>prt<213>沙特沃思葡萄<400>39cysasntyraspproproglyasntyrvalglyglnargprotyr151015<210>40<211>15<212>prt<213>大油菜<400>40cysasntyraspproargglyasntyrvalasnglulysprotyr151015<210>41<211>15<212>prt<213>蕪菁<400>41cysasntyraspproargglyasntyrvalasnglulysprotyr151015<210>42<211>15<212>prt<213>大豆<400>42cysasntyralaproproglyasntyrvalglyglnargprotyr151015<210>43<211>15<212>prt<213>苜蓿<400>43cysasntyraspproproglyasntyrvalglyglnlysprotyr151015<210>44<211>15<212>prt<213>水稻<400>44cysasntyrasnproproglyasnpheargglyglnargprotyr151015<210>45<211>15<212>prt<213>水稻<400>45cysasntyrgluproargglyasnilevalglyargargprotyr151015<210>46<211>15<212>prt<213>阿拉伯芥<400>46cysasntyraspproalaglyasntyrileglyalaargprotyr151015<210>47<211>15<212>prt<213>阿拉伯芥<400>47cysasntyraspproproglyasntyrileglyglnlysprotyr151015<210>48<211>15<212>prt<213>阿拉伯芥<400>48cysasntyraspproproglyasntrpvalglyglutrpprotyr151015<210>49<211>15<212>prt<213>阿拉伯芥<400>49cysasntyraspproproglyasntyrvalglyglulysprotyr151015<210>50<211>15<212>prt<213>阿拉伯芥<400>50cysasntyraspproproglyasntyrvalglyglulysprotyr151015<210>51<211>15<212>prt<213>阿拉伯芥<400>51cysasntyraspproproglyasnpheleuglyarglysprotyr151015<210>52<211>15<212>prt<213>阿拉伯芥<400>52cysasntyraspproproglyasntyralaasnglnlysprotyr151015<210>53<211>15<212>prt<213>阿拉伯芥<400>53cysasntyrtyrproproglyasntyrargglyargtrpprotyr151015<210>54<211>15<212>prt<213>阿拉伯芥<400>54cysasntyraspproargglyasntyrvalasnglulysprotyr151015<210>55<211>4<212>prt<213>人工序列<220><223>cnyx模體以作為蛋白酶抑制劑<220><221>雜項特征<222>(4)..(4)<223>xaa可為任何天然存在之胺基酸<400>55cysasntyrxaa1<210>56<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>cnydpv以作為蛋白酶抑制劑<400>56cysasntyraspproval15<210>57<211>159<212>prt<213>西紅柿<400>57metglyleupheasnileserleuleuleuthrcysleumetvalleu151015alailephehissercysglualaglnasnserproglnasptyrleu202530alavalhisasnaspalaargalaglnvalglyvalglyprometser354045trpaspalaasnleualaserargalaglnasntyralaasnserarg505560alaglyaspcysasnleuilehisserglyalaglygluasnleuala65707580lysglyglyglyaspphethrglyargalaalavalglnleutrpval859095sergluargprosertyrasntyralathrasnglncysvalglygly100105110lyslyscysarghistyrthrglnvalvaltrpargasnservalarg115120125leuglycysglyargalaargcysasnasnglytrptrppheileser130135140cysasntyraspprovalglyasntrpileglyglnargprotyr145150155<210>58<211>18<212>prt<213>西紅柿<400>58alavalglnserlysproproserlysargaspproprolysmetgln151015thrasp<210>59<211>11<212>prt<213>人工序列<220><223>內(nèi)標準品<400>59proalaalaalatyrileglyalaargalatyr1510<210>60<211>22<212>prt<213>人工序列<220><223>flg22<400>60glnargleuserthrglyserargileasnseralalysaspaspala151015alaglyleuglnileala20<210>61<211>4<212>prt<213>人工序列<220><223>野生型連接序列<400>61cysasntyrasp1<210>62<211>4<212>prt<213>人工序列<220><223>經(jīng)突變之連接序列<400>62cysasnalaasp1<210>63<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>ed-1a引子f<400>63ctccgtcttccacttcagg19<210>64<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>ef-1a引子r<400>64tcagttgtcaaaccagtaggg21<210>65<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>ubi3正向引子<400>65actcttgccgactacaacatcc22<210>66<211>22<212>prt<213>人工序列<220><223>ubi3反向引子<400>66ctccttacgaagcctctgaacc22<210>67<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>pi-1正向引子<400>67cttcttccaacttcctttg19<210>68<211>18<212>dna<213>pi-1反向引子<400>68tgttttccttcgcacatc18<210>69<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>pi-2正向引子<400>69aattatccatcatggctgttcac23<210>70<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>pi-2反向引子<400>70cctttttggatcagattctcctt23<210>71<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>adi3正向引子<400>71aggcagtttcctataggggcta22<210>72<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>adi3反向引子<400>72tcgaccatcaggtcttcttcc21<210>73<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>erf5正向引子<400>73atgggttctccacaagagac20<210>74<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>erf5反向引子<400>74gaagcttgcgatgtcatcaa20<210>75<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>pr-1b正向引子<400>75ctcatatgagacgtcgagaag21<210>76<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>pr-1b反向引子<400>76ggaaacaagaagatgcagtacttaa25<210>77<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>pr-2正向引子<400>77caaataacaggagcgcagcc20<210>78<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>pr-2反向引子<400>78gttacttcctttgagggcat20<210>79<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>pr-7正向引子<400>79tcagcacctctggaccttt19<210>80<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>pr-7反向引子<400>80gctcctgaaggctctgtta19<210>81<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>chi2正向引子<400>81ttttggtcgaggtcctatcc20<210>82<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>chi2反向引子<400>82gtaatgacatcgtgtgccga20<210>83<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>wrky53正向引子<400>83aaatggattgtgcatcaaactggga25<210>84<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>wrky53反向引子<400>84agccaccccagttgagaatcaaca24當前第1頁12當前第1頁12