本發(fā)明涉及一種由包含生物相容性高分子塊體和細胞的細胞結構體構成的管狀結構物。本發(fā)明還涉及一種用于制造上述管狀結構物的裝置及上述管狀結構物的制造方法。

背景技術：

在生物內，血管、消化管、尿道管及淋巴管等管狀(軟管狀)結構的組織作為重要的組織而發(fā)揮功能。尤其作為重要的管狀結構可舉出血管，根據在疾病和手術中的替代需要性而開發(fā)了多種人造血管。作為取得進展臨床應用的人造血管，可舉出使用了四氟乙烯(eptfe)等非生物降解性合成高分子的人造血管。

并且，自古以來還嘗試了開發(fā)通過細胞而使包括合成高分子的人造血管內皮化的混合型人造血管。通過細胞使人造血管內皮化，由此顯示了能夠賦予非血栓形成性，并能夠期待維持血管通暢的效果。

然而，報道有血管移植物與生物動脈的吻合部分的順應性不匹配(非專利文獻1)。并且，已知在人造血管與生物動脈的吻合部分產生血流分離部、血流滯留部，且吻合部中的應力集中引起吻合部閉塞(非專利文獻2及非專利文獻3)。

另一方面，專利文獻1中記載有一種包含具有生物相容性的高分子塊體和細胞，并在上述多個細胞之間的間隙配置有多個上述高分子塊體的細胞結構體。專利文獻1中所記載的細胞結構體中，能夠從外部向細胞結構體的內部輸送營養(yǎng)，具有充分的厚度，并且細胞均勻地存在于結構體中。專利文獻1的實施例中，使用包括重組明膠和天然明膠材料的高分子塊體證實了較高的細胞生存活性。

以往技術文獻

專利文獻

專利文獻1：國際公開wo2011/108517號

非專利文獻

非專利文獻1：abbot，w.m.；megerman，j.；hasson，j.e.；l'italien，g.；warnock，o.f.,j.vasc.surg.5(2)：376-382；1987

非專利文獻2：weston，m.w.；rhee，k.,tarbell，j.m.,j.biomech.29(2)：187-198；1996

非專利文獻3：rhee，k.；tarbell，j.m.,j.biomech.27(3)：329-338；1994

技術實現(xiàn)要素：

發(fā)明要解決的技術課題

關于包括合成高分子的人造血管，已知尤其在設為小口徑時，由于因形成于材料表面的血栓而引起的閉塞及狹窄等而容易堵塞。并且，當對象為兒童等處于成長過程時，不適用非自我成長型血管。作為用于解決上述課題的嘗試，還報道有通過細胞使包括合成高分子材料的人造血管進行內皮化的混合型人造血管，但存在人造血管與生物動脈的吻合部的中的吻合部閉塞的問題。從這一觀點考慮，要求相對于兒童等處于成長過程中的對象的尺寸變化的必要性以及不包含非生物吸收性材料并容易被生物組織取代的含有細胞的生物人造血管。

另一方面，已知通常的動脈及大動脈的壁厚為1～2mm左右。當形成僅細胞就具有1～2mm的壁厚的管狀結構物時，導致作為血管等生物內管狀結構物的重要作用的分子滲透性受損。針對人造血管，要求具有使適當的分子從管狀結構物的壁面滲透的能力。從這一觀點考慮，僅由細胞制成的管狀結構物中，連低分子也無法滲透壁面，因此不適合在生物內使用。另外，僅由eptfe等合成高分子構成的非生物吸收性人造血管的分子滲透性也較低，因此無法提供所需功能。

專利文獻1中記載了一種包含生物相容性高分子塊體和細胞的細胞結構體，但未提及形成人造血管等管狀結構物。

本發(fā)明的應解決課題在于提供一種具有分子滲透能力，并含有細胞的生物吸收性管狀結構物。本發(fā)明的應解決課題還在于提供一種用于制造上述管狀結構物的裝置及上述管狀結構物的制造方法。

用于解決技術課題的手段

本發(fā)明人等為了解決上述課題而進行深入研究的結果，發(fā)現(xiàn)通過在具有用于制造管狀結構物的模具的裝置內培養(yǎng)包含生物相容性高分子塊體和細胞，并在多個上述細胞之間的間隙配置有多個上述高分子塊體的細胞結構體，能夠制造從管狀結構物內壁滲透的分子滲透能力較高，并具有維持形狀的性能的管狀結構物。本發(fā)明是基于這些見解而完成的。

即，根據本發(fā)明，可提供以下發(fā)明。

(1)一種管狀結構物，其由細胞結構體構成，該細胞結構體包含生物相容性高分子塊體和細胞，并在多個所述細胞之間的間隙配置有多個上述高分子塊體。

(2)根據權利要求1所述的管狀結構物，其為人造血管。

(3)根據(1)或(2)所述的管狀結構物，其中，

上述細胞結構體在每一個細胞中包含0.0000001μg以上且1μg以下的生物相容性高分子塊體。

(4)根據(1)至(3)中任一個所述的管狀結構物，其中，

上述生物相容性高分子塊體的一個大小為10μm以上且300μm以下。

(5)根據(1)至(4)中任一個所述的管狀結構物，其中，

上述管狀結構物具有1mm以上且小于6mm的內徑、3mm以上且10mm以下的外徑及5mm以上且300mm以下的長度。

(6)根據(1)至(5)中任一個所述的管狀結構物，其中，

上述生物相容性高分子塊體包括重組肽。

(7)根據(6)所述的管狀結構物，其中，

上述重組肽為如下肽中的任一個：

包括序列編號1中所記載的氨基酸序列的肽；

包括在序列編號1中所記載的氨基酸序列中缺失、取代或添加一個或多個氨基酸的氨基酸序列，且具有生物相容性的肽；或

包括與序列編號1中所記載的氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的氨基酸序列，且具有生物相容性的肽。

(8)根據(1)至(7)中任一個所述的管狀結構物，其中，

上述生物相容性高分子塊體中，上述生物相容性高分子通過熱、紫外線或酶而交聯(lián)。

(9)根據(1)至(8)中任一個所述的管狀結構物，其中，

上述生物相容性高分子塊體處于通過粉碎生物相容性高分子的多孔體而得到的顆粒形態(tài)。

(10)一種裝置，其用于制造權利要求1至9中任一個所述的管狀結構物，該裝置具有：

基座部，具有用于形成由細胞結構體構成的管狀結構物的外側側面的圓柱狀中空區(qū)域；

核心接收部，存在于上述中空區(qū)域的內部；及

圓柱狀核心部，用于形成上述管狀結構物的內側側面，所述裝置中，

上述基座部的上表面為平面，上述中空區(qū)域從上述基座部的上表面相對于上述基座部的上表面的平面沿垂直方向設置，

上述核心部被保持于上述核心接收，上述核心部的至少一部分在上述中空區(qū)域內相對于上述基座部的平面方向沿垂直方向設置，

上述中空區(qū)域的圓柱狀直徑的中心與上述核心部的圓柱狀直徑的中心相同，

上述核心部的圓柱狀直徑比上述中空區(qū)域的圓柱狀直徑小，

上述核心接收部在中心部具有用于保持核心部的貫穿孔，而且在周邊部具有從上述核心接收部的上表面貫穿至底面的一個以上的貫穿區(qū)域，且

上述基座部的底面具有如下結構，即在包含培養(yǎng)基的容器內設置上述基座部時，培養(yǎng)基中所包含的培養(yǎng)基成分能夠從上述核心接收部的貫穿區(qū)域的底面?zhèn)热肟谶M入上述中空區(qū)域的內部的結構。

(11)根據(10)所述的裝置，其中，

上述基座部的底面具有如下形狀，即將上述基座部設置于設置面時具有與上述設置面接觸的區(qū)域和不與上述設置面接觸的區(qū)域的形狀，且上述核心接收部的貫穿區(qū)域的底面?zhèn)热肟谠O置于不與上述設置面接觸的區(qū)域。

(12)根據(10)或(11)所述的裝置，其中，

上述核心部的圓柱狀直徑為1mm以上且小于6mm，上述中空區(qū)域的圓柱狀直徑為3mm以上且10mm以下。

(13)根據(10)至(12)中任一個所述的裝置，其中，

形成核心部和/或中空區(qū)域的部為中空網狀。

(14)一種(1)至(9)中任一個所述的管狀結構物的制造方法，其包括融合在多個細胞的間隙配置有生物相容性高分子塊體的多個細胞結構體的工序。

(15)根據(14)所述的方法，其中，

在具有用于形成管狀結構物的模具的裝置中培養(yǎng)在多個細胞的間隙配置有生物相容性高分子塊體的多個細胞結構體，由此融合細胞結構體。

(16)根據(14)或(15)所述的方法，其中，

具有用于形成管狀結構物的模具的裝置為(10)至(13)中任一個所述的裝置。

發(fā)明效果

本發(fā)明的管狀結構物具有從管狀結構物內壁滲透的分子滲透能力，并具有維持形狀的性能。本發(fā)明的裝置在制造本發(fā)明的管狀結構物的方面有用。根據本發(fā)明的制造方法，能夠制造從管狀結構物內壁滲透的分子滲透能力較高，并具有維持形狀的性能的管狀結構物。

附圖說明

圖1表示基座部的結構的一例。

圖2表示基座部的結構的另一例。

圖3表示核心接收部的結構的一例。

圖4表示核心部的結構的一例。

圖5表示管狀結構物的結構的一例。

圖6表示實施例中的冷凍溶劑時的溫度分布。

圖7表示從裝置拆除的管狀結構物。

圖8表示將管狀結構物培養(yǎng)3周并從核心部拆除的狀態(tài)。

圖9表示對本發(fā)明的管狀結構物(左圖)與僅由細胞制成的管狀結構物(右圖)的壁部的分子滲透性能進行比較的結果。

圖10表示僅由細胞制成的管狀結構體被破壞的狀態(tài)。

圖11表示將管狀結構物移植在裸大鼠頸靜脈而確認到作為血管發(fā)揮功能的結果。

具體實施方式

以下，對本發(fā)明的實施方式進行詳細說明。

[管狀結構物]

本發(fā)明的管狀結構物由細胞結構體構成，該細胞結構體包含生物相容性高分子塊體和細胞，并在多個上述細胞之間的間隙配置有多個上述高分子塊體。另外，在本說明書中，有時將用于本發(fā)明的細胞結構體稱為鑲嵌細胞團(呈鑲嵌狀的細胞團)。

本發(fā)明的管狀結構物為具有分子滲透能力，且還具有維持在形成管狀結構物之后其形狀不易改變的形狀的性能的結構物，例如，能夠用作人造血管。包含生物相容性高分子塊體和細胞，并在多個上述細胞之間的間隙配置有多個上述高分子塊體的細胞結構體具有上述性能，尤其具有較高的分子滲透能力是完全預料之外的顯著效果。另外，專利文獻1中記載有包含具有生物相容性的高分子塊體和細胞，并在上述多個細胞之間的間隙配置有多個上述高分子塊體的細胞結構體，但未記載有關于形成管狀結構物的內容，且也未記載有關于從管狀結構物內壁滲透的分子滲透能力的內容。

(1)生物相容性高分子塊體

用于本發(fā)明的細胞結構體包含生物相容性高分子塊體。以下對生物相容性高分子塊體進行說明。

(1-1)生物相容性高分子

生物相容性是指，與生物接觸時，不引起如長期且慢性炎癥反應等顯著的有害反應。若用于本發(fā)明的生物相容性高分子為對生物具有相容性的高分子，則對于是否在生物內進行分解并無特別限定，優(yōu)選為生物降解性高分子。作為非生物降解性材料，具體而言可舉出聚四氟乙烯(ptfe)、聚氨酯、聚丙烯、聚酯、氯乙烯、聚碳酸酯、丙烯、不銹鋼、鈦、硅酮及mpc(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿)等。作為生物降解性材料，具體而言可舉出重組肽等多肽(例如，以下說明的明膠等)、聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共聚物(plga)、透明質酸、糖胺聚糖、蛋白聚糖、軟骨素、纖維素、瓊脂糖、羧甲基纖維素、甲殼素及殼聚糖等。上述中，尤其優(yōu)選重組肽。這些生物相容性高分子可以被設計成提高細胞粘附性。具體而言，能夠使用如下方法，即“基于相對于基材表面的細胞粘附基質(纖連蛋白、玻連蛋白、層連蛋白)或細胞粘附序列(以氨基酸單字母代碼表示的、rgd序列、ldv序列、redv序列、yigsr序列、pdsgr序列、ryvvlpr序列、lgtipg序列、rniaeiikdi序列、ikvav序列、lre序列、dgea序列及hav序列)肽的涂布”、“基材表面的氨基化、陽離子化”或“基材表面的等離子處理、基于電暈放電的親水性處理”。

若包含重組肽的多肽的種類具有生物相容性，則并無特別限定，例如，優(yōu)選明膠、膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白、pronectin、層連蛋白、腱生蛋白、纖維蛋白、絲蛋白、巢蛋白、血小板反應蛋白、retronectin，最優(yōu)選為明膠、膠原蛋白、去端肽膠原。作為用于本發(fā)明的明膠，優(yōu)選為天然明膠或重組明膠，更優(yōu)選為重組明膠。在此所述的天然明膠是指，通過來源于天然的膠原蛋白制成的明膠。關于重組明膠，本說明書中在后面進行敘述。

用于本發(fā)明的生物相容性高分子的親水性值“1/iob”值優(yōu)選0～1.0。更優(yōu)選為0～0.6，進一步優(yōu)選為0～0.4。iob是指，由藤田穆提出的基于表示有機化合物的極性/非極性的有機概念圖的親水性和疏水性的指標，其詳細內容記載在例如，“pharmaceuticalbulletin”，vol.2，2，pp.163-173(1954)、“化學領域”vol.11，10，pp.719-725(1957)、“fragrancejournal”，vol.50,pp.79-82(1981)等。簡單而言，將所有的有機化合物的根源設為甲烷(ch4)，將其他化合物全都視為甲烷的衍生物，并將其碳原子數、取代基、相變部、環(huán)等分別設定為恒定數值，相加其得分之后求出有機性值(ov)、無機性值(iv)，并將該值繪制在以有機性值為x軸、無機性值為y軸的圖上。有機概念圖中的iob是指，有機概念圖中的無機性值(iv)與有機性值(ov)之比、即為“無機性值(iv)/有機性值(ov)”。關于有機概念圖的詳細內容可參考《新版有機概念圖-基礎與應用-》(甲田善生等著、三共出版、2008)。本說明書中，以求出iob的倒數的“1/iob”值表示親水性和疏水性。該符號表示“1/iob”越小(接近0)，越親水。

通過將用于本發(fā)明的高分子的“1/iob”值設定在上述范圍內，親水性變高并且吸水性變高，由此該高分子有效地作用于營養(yǎng)物的保持，其結果，推測為有助于本發(fā)明的細胞結構體(鑲嵌細胞團)中的細胞的穩(wěn)定性和易生存力。

當用于本發(fā)明的生物相容性高分子為多肽時，以grandaverageofhydropathicity(gravy)值表示的親水性和疏水性指標優(yōu)選為0.3以下且-9.0以上，更優(yōu)選為0.0以下且-7.0以上。grandaverageofhydropathicity(gravy)值能夠通過“gasteigere.,hooglandc.,gattikera.,duvauds.,wilkinsm.r.,appelr.d.,bairocha.；proteinidentificationandanalysistoolsontheexpasyserver；(in)johnm.walker(ed)：theproteomicsprotocolshandbook,humanapress(2005).pp.571-607”及“gasteigere.,gattikera.,hooglandc.,ivanyii.,appelr.d.,bairocha.；expasy：theproteomicsserverforin-depthproteinknowledgeandanalysis.；nucleicacidsres.31：3784-3788(2003).”的方法得到。

通過將用于本發(fā)明的高分子的gravy值設定在上述范圍內，親水性變高并且吸水性變高，由此該高分子有效地作用于營養(yǎng)成分的保持，其結果，推測為有助于本發(fā)明的細胞結構體(鑲嵌細胞團)中的細胞的穩(wěn)定性和易生存力。

(1-2)交聯(lián)

用于本發(fā)明的生物相容性高分子可以交聯(lián)也可以不交聯(lián)，優(yōu)選交聯(lián)。通過使用經交聯(lián)的生物相容性高分子，可得到防止在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時及移植在生物時瞬間分解的效果。作為通常的交聯(lián)方法，已知有熱交聯(lián)、基于醛類(例如，甲醛、戊二醛等)的交聯(lián)、基于縮合劑(碳化二亞胺、氨腈(cyanamide)等)的交聯(lián)、酶交聯(lián)、光交聯(lián)、紫外線交聯(lián)、疎水性相互作用、氫鍵、離子性相互作用等。本發(fā)明中，優(yōu)選使用不使用戊二醛的交聯(lián)方法。本發(fā)明中，更優(yōu)選使用不使用醛類或縮合劑的交聯(lián)方法。即，本發(fā)明中的生物相容性高分子塊體優(yōu)選為不包含戊二醛的生物相容性高分子塊體，更優(yōu)選不包含醛類或縮合劑的生物相容性高分子塊體。作為使用于本發(fā)明的交聯(lián)方法，更優(yōu)選為熱交聯(lián)、紫外線交聯(lián)或酶交聯(lián)，尤其優(yōu)選為熱交聯(lián)。

當進行基于酶的交聯(lián)時，作為酶，若具有高分子材料之間的交聯(lián)作用，則并無特別限定，優(yōu)選能夠使用谷氨酰胺轉氨酶及漆酶谷氨酰胺轉氨酶進行交聯(lián)，最優(yōu)選能夠使用谷氨酰胺轉氨酶進行交聯(lián)。作為使用谷氨酰胺轉氨酶進行酶交聯(lián)的蛋白質的具體例，若為具有賴氨酸殘基及谷氨酰胺殘基的蛋白質，則并無特別限制。谷氨酰胺轉氨酶可以來源于哺乳類，也可以來源于微生物，具體而言，可舉出作為ajinomotoco.,inc.制activa系列、作為試劑販賣的來源于哺乳類的谷氨酰胺轉氨酶、例如，orientalyeastco.,ltd.制、upstateusainc.制、biodesigninternational制等來源于豚鼠肝臟的谷氨酰胺轉氨酶、來源于山羊的谷氨酰胺轉氨酶、來源于兔子的谷氨酰胺轉氨酶等、來源于人類的凝血因子(factorxiiia、haematologictechnologies,inc.)等。

若能夠進行交聯(lián)，則進行交聯(lián)(例如，熱交聯(lián))時的反應溫度并無特別限定，優(yōu)選為-100℃～500℃，更優(yōu)選為0℃～300℃，進一步優(yōu)選為50℃～300℃，進一步優(yōu)選為100℃～250℃，進一步優(yōu)選為120℃～200℃。

(1-3)重組明膠

本發(fā)明中所述的重組明膠是指，具有通過基因重組技術制成的類似明膠的氨基酸序列的多肽或蛋白樣物質。能夠用于本發(fā)明的重組明膠優(yōu)選為具有以特征性gly-x-y表示膠原蛋白的重復序列(x及y分別獨立地表示氨基酸的任一個)。在此，多個gly-x-y可以分別相同也可以不同。優(yōu)選在一分子中包含兩個序列以上的細胞粘附信號。作為用于本發(fā)明的重組明膠，能夠使用具有來源于膠原蛋白的部分氨基酸序列的氨基酸序列的重組明膠。例如，能夠使用ep1014176、us專利6992172號、國際公開wo2004/85473、國際公開wo2008/103041等中所記載的重組明膠，但并不限定于此。作為用于本發(fā)明的重組明膠，優(yōu)選為以下方式的重組明膠。

重組明膠由于天然明膠的固有性能而生物相容性優(yōu)異，并且并非來源于天然，因此無需擔心牛海綿狀腦病(bse)等，從而非感染性優(yōu)異。并且，與天然明膠相比，重組明膠均勻，且序列已被確定，因此在強度及分解性方面也能夠通過交聯(lián)等而減少模糊并精密地設計。

重組明膠的分子量并無特別限定，優(yōu)選為2kda以上且100kda以下，更優(yōu)選為2.5kda以上且95kda以下，進一步優(yōu)選為5kda以上且90kda以下，最優(yōu)選10kda以上且90kda以下。

重組明膠優(yōu)選具有以特征性gly-x-y表示膠原蛋白的序列的重復。在此，多個gly-x-y可以分別相同也可以不同。在gly-x-y中，gly表示甘氨酸，x及y表示任意氨基酸(優(yōu)選甘氨酸以外的任意氨基酸)。以特征性gly-x-y表示膠原蛋白的序列是指，與明膠，膠原蛋白的氨基酸成分及序列中的其他蛋白質相比，為非常特殊的部分結構。在該部分中，甘氨酸占總體的約3分之1，在氨基酸序列中是每3個中一個的重復。甘氨酸為最簡單的氨基酸，針對分子鏈的配置的束縛也較少，對凝膠化時的螺旋結構的再生貢獻較大。以x及y表示的氨基酸包含較多的亞氨酸(脯氨酸、羥脯氨酸)，優(yōu)選占總體的10％～45％。優(yōu)選重組明膠的序列的80％以上，更優(yōu)選95％以上，最優(yōu)選99％以上的氨基酸為gly-x-y的重復結構。

通常的明膠中，極性氨基酸中具有電荷的氨基酸與無電荷氨基酸以1:1的比率存在。在此，極性氨基酸是指，具體而言，半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸及精氨酸，這些中的極性無電荷氨基酸是指，半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸及酪氨酸。在用于本發(fā)明的重組明膠中，所構成的所有氨基酸中，極性氨基酸的比例為10～40％，優(yōu)選為20～30％。并且，上述極性氨基酸中的無電荷氨基酸的比例為5％以上且小于20％，優(yōu)選為小于10％。而且，優(yōu)選在序列上不包含絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、酪氨酸及半胱氨酸中的任一個氨基酸，優(yōu)選兩個以上的氨基酸。

在通常的多肽中，已知有作為細胞粘附信號而起作用的最小氨基酸序列(例如，nagaishotenco.,ltd.出版發(fā)行的“病態(tài)生理”vol.9、no.7(1990年)527頁)。用于本發(fā)明的重組明膠優(yōu)選在一分子中具有兩個以上的這些細胞粘附信號。作為具體的序列，從粘附的細胞的種類較多的方面考慮，優(yōu)選以氨基酸單字母代碼表示的rgd序列、ldv序列、redv序列、yigsr序列、pdsgr序列、ryvvlpr序列、lgtipg序列、rniaeiikdi序列、ikvav序列、lre序列、dgea序列及hav序列的序列。更優(yōu)選rgd序列、yigsr序列、pdsgr序列、lgtipg序列、ikvav序列及hav序列，尤其優(yōu)選為rgd序列。rgd序列中，優(yōu)選為ergd序列。通過使用具有細胞粘附信號的重組明膠，能夠提高細胞的基質生產量。例如，作為細胞，在使用了間充質干細胞的軟骨分化的情況下，能夠提高糖胺聚糖(gag)的生產。

作為用于本發(fā)明的重組明膠中的rgd序列的配置，優(yōu)選rgd之間的氨基酸數在0～100之間，優(yōu)選在25～60之間不均勻。

從細胞粘附、增值性的觀點考慮，該最小氨基酸序列的含量優(yōu)選在蛋白質1分子中為3～50個，進一步優(yōu)選為4～30個，尤其優(yōu)選為5～20個。最優(yōu)選為12個。

用于本發(fā)明的重組明膠中，rgd基序相對于氨基酸總數的比例優(yōu)選至少為0.4％。當重組明膠包括350個以上的氨基酸時，優(yōu)選350個氨基酸的每一段至少包含一個rgd基序。rgd基序相對于氨基酸總數的比例進一步優(yōu)選至少為0.6％，進一步優(yōu)選至少為0.8％，進一步優(yōu)選至少為1.0％，進一步優(yōu)選至少為1.2％，最優(yōu)選至少為1.5％。關于重組肽內的rgd基序的數量，每250個氨基酸優(yōu)選至少為4個，進一步優(yōu)選為6個，進一步優(yōu)選為8個，進一步優(yōu)選為12個以上且16個以下。rgd基序的0.4％的比例中，每250個氨基酸對應于至少一個rgd序列。rgd基序的數量為整數，因此為了滿足0.4％的特征而包括251個氨基酸的明膠應包含至少兩個rgd序列。關于本發(fā)明的重組明膠，優(yōu)選每250個氨基酸包含至少兩個rgd序列，更優(yōu)選每250個氨基酸至少包含3個rgd序列，進一步優(yōu)選每250個氨基酸包含至少4個rgd序列。作為本發(fā)明的重組明膠的另一方式，包含至少4個rgd基序，優(yōu)選包含6個，更優(yōu)選包含8個，進一步優(yōu)選包含12個以上且16個以下的rgd基序。

重組明膠可以局部性水解。

優(yōu)選用于本發(fā)明的重組明膠由式：a-[(gly-x-y)n]m-b表示。n個x分別獨立地表示氨基酸的任一個，n個y分別獨立地表示氨基酸的任一個。作為m優(yōu)選為2～10，優(yōu)選為3～5。n優(yōu)選3～100，進一步優(yōu)選15～70，最優(yōu)選50～65。a表示任意氨基酸或氨基酸序列，b表示任意氨基酸或氨基酸序列，n個x分別獨立地表示氨基酸的任一個，n個y分別獨立地表示氨基酸的任一個。

更優(yōu)選用于本發(fā)明的重組明膠由式：gly-ala-pro-[(gly-x-y)63]3-gly(式中，63個x分別獨立地表示氨基酸的任一個，63個y分別獨立地表示氨基酸的任一個。另外，63個gly-x-y可以分別相同也可以不同。)表示。

重復單元中優(yōu)選鍵合多個天然存在的膠原蛋白的序列單元。在此所述的天然存在的膠原蛋白是指，若天然存在則可以為任一個，優(yōu)選為i型、ii型、iii型、iv型或v型膠原蛋白。更優(yōu)選為i型、ii型或iii型膠原蛋白。根據另一方式，上述膠原蛋白的來源優(yōu)選為人、牛、豬、小鼠或大鼠，更優(yōu)選來源于人。

用于本發(fā)明的重組明膠的等電點優(yōu)選為5～10，更優(yōu)選為6～10，進一步優(yōu)選為7～9.5。

優(yōu)選重組明膠未被去胺基化。

優(yōu)選重組明膠不具有端肽。

優(yōu)選重組明膠為通過對氨基酸序列進行編碼的核酸而制備的實質上純多肽。

作為用于本發(fā)明的重組明膠尤其優(yōu)選為如下肽：

(1)包括序列編號1中所記載的氨基酸序列的肽；

(2)包括序列編號1中所記載的氨基酸序列中缺失、取代或添加一個或多個氨基酸的氨基酸序列，且具有生物相容性的肽；或

(3)包括與序列編號1中所記載的氨基酸序列具有80％以上(更優(yōu)選90％以上，尤其優(yōu)選95％以上，最優(yōu)選98％以上)的序列同源性的氨基酸序列，且具有生物相容性的肽。

“缺失、取代或添加一個或多個氨基酸的氨基酸序列”中的“一個或多個”是指，優(yōu)選為1～20個，更優(yōu)選為1～10個，進一步優(yōu)選為1～5個，尤其優(yōu)選為1～3個。

關于用于本發(fā)明的重組明膠，本領域技術人員能夠通過公知的基因重組技術來制造，例如能夠依照ep1014176a2號公報、美國專利第6992172號公報、國際公開wo2004/85473號、國際公開wo2008/103041號等中所記載的方法來制造。具體而言，獲取對規(guī)定的重組明膠的氨基酸序列進行編碼的基因，并將其編入表達載體而制作重組表達載體，將其導入適當的宿主而制作轉化體。以適當的培養(yǎng)基培養(yǎng)所得到的轉化體，由此產生重組明膠，因此通過從培養(yǎng)物回收所產生的重組明膠，能夠制備用于本發(fā)明的重組明膠。

(1-4)生物相容性高分子塊體

本發(fā)明中，使用包括上述生物相容性高分子的塊體(block)。

本發(fā)明中的生物相容性高分子塊體的形狀并無特別限定。例如，為無規(guī)則形、球狀、粒狀(顆粒)、粉末狀、多孔狀、纖維狀、紡錘狀、扁平狀及片狀，優(yōu)選無規(guī)則形、球狀、粒狀(顆粒)、粉末狀及多孔狀。無規(guī)則形表示表面形狀不均勻，例如，表示如巖石具有凹凸。

本發(fā)明中的一個生物相容性高分子塊體的大小并無特別限定，優(yōu)選為1μm以上且1000μm以下，更優(yōu)選為10μm以上且1000μm以下，更優(yōu)選為10μm以上且700μm以下，進一步優(yōu)選為10μm以上且300μm以下，進一步優(yōu)選為10μm以上且200μm以下，進一步優(yōu)選為20μm以上且200μm以下，進一步優(yōu)選為20μm以上且150μm以下，進一步優(yōu)選為50μm以上且110μm以下。從管狀結構物具有更高的分子滲透能力的觀點考慮，優(yōu)選將一個生物相容性高分子塊體的大小設定在上述范圍內。另外，一個生物相容性高分子塊體的大小并非是指多個生物相容性高分子塊體的大小的平均值在上述范圍內，而是指將多個生物相容性高分子塊體過篩之后得到的一個一個的生物相容性高分子塊體的尺寸。

一個塊體的大小能夠通過分離塊體時所使用的篩的大小來定義。例如，能夠將以180μm的篩進行過篩，并以106μm的篩對所通過的塊體進行過篩時殘留于篩上的塊體設為大小為106～180μm的塊體。接著，能夠將以106μm的篩進行過篩，并以53μm的篩對所通過的塊體進行過篩時殘留于篩上的塊體設為大小為53～106μm的塊體。接著，能夠將以53μm的篩進行過篩，并以25μm的篩對所通過的塊體進行過篩時殘留于篩上的塊體設為大小為25～53μm的塊體。

(1-5)生物相容性高分子塊體的制造方法

生物相容性高分子塊體的制造方法并無特別限定，例如，通過使用粉碎機(newpowermill)粉碎生物相容性高分子的多孔體，能夠得到顆粒形態(tài)的生物相容性高分子塊體。

制造生物相容性高分子的多孔體時，包括在未冷凍的狀態(tài)下，溶液內液溫最高的部分的液溫(內部最高液溫)成為“溶劑融點-3℃”以下的冷凍工序，由此所形成的冰成為球狀。經過該工序之后，冰被干燥，由此可得到具有球狀的各向同性的空孔(球孔)的多孔體。不包括在未冷凍的狀態(tài)下，溶液內液溫最高的部分的液溫(內部最高液溫)成為“溶劑融點-3℃”以上的冷凍工序而冷凍，由此所形成的冰成為柱/平板狀。經過該工序之后，若冰被干燥，則可得到在單軸或雙軸上較長且具有柱狀或平板狀空孔(柱/平板孔)的多孔體。

本發(fā)明中，優(yōu)選通過如下方法制造生物相容性高分子塊體，該方法包括：

工序a，通過在未冷凍狀態(tài)下，溶液內液溫最高的部分的液溫即內部最高液溫成為比溶劑融點低3℃的溫度(“溶劑融點-3℃”)以下的冷凍處理冷凍生物相容性高分子的溶液；及

工序b，冷凍干燥在上述工序a中得到的已冷凍的生物相容性高分子。

本發(fā)明中，進一步優(yōu)選通過粉碎在上述工序b中得到的多孔體，能夠制造顆粒形態(tài)的生物相容性高分子塊體。

更優(yōu)選在上述工序a中，能夠通過在未冷凍狀態(tài)下，溶液內液溫最高的部分的液溫即內部最高液溫成為比溶劑融點低7℃的溫度(“溶劑融點-7℃”)以下的冷凍處理冷凍生物相容性高分子的溶液。

(2)細胞

關于用于本發(fā)明的細胞，若可進行細胞移植，則能夠使用任意細胞，其種類并無特別限定，能夠根據管狀結構物的用途而選擇。所使用的細胞可以為一種，也可以組合使用多種細胞。并且，作為所使用的細胞，優(yōu)選為動物細胞，更優(yōu)選為來源于脊椎動物的細胞，尤其優(yōu)選為來源于人類的細胞。來源于脊椎動物的細胞(尤其，來源于人類的細胞)的種類可以為多能細胞、體干細胞、前體細胞或成熟細胞的任一個。作為多能細胞，例如能夠使用胚胎干(es)細胞、生殖干(gs)細胞或誘導性多能干(ips)細胞。作為體干細胞，例如能夠使用間充質干細胞(msc)、造血干細胞、羊膜細胞、臍帶血細胞、來源于骨髓的細胞、心肌干細胞、來源于脂肪的干細胞或神經干細胞。作為前體細胞及成熟細胞，例如能夠使用來源于皮膚、真皮、表皮、肌肉、心肌、神經、骨、軟骨、內皮、腦、上皮、心臟、腎臟、肝臟、胰臟、脾臟、口腔內、角膜、骨髓、臍帶血、羊膜或毛發(fā)的細胞。作為來源于人類的細胞，例如能夠使用es細胞、ips細胞、msc、軟骨細胞、成骨細胞、骨原細胞、間充質細胞、成肌細胞、心肌細胞、心臟成肌細胞、神經細胞、肝細胞、β細胞、成纖維細胞、角膜內皮細胞、血管內皮細胞、角膜上皮細胞、羊膜細胞、臍帶血細胞、來源于骨髓的細胞或造血干細胞。并且，細胞的來源可以是自體細胞或異體細胞中的任一個。

本發(fā)明中，優(yōu)選能夠使用血管系統(tǒng)細胞。本說明書中，血管系統(tǒng)細胞是指與血管形成有關的細胞，且為構成血管和血液的細胞及能夠分化為該細胞的前體細胞、體干細胞。在此，血管系統(tǒng)細胞中不包含不會自然分化為es細胞、gs細胞、或ips細胞等多能細胞、如間充質干細胞(msc)那樣構成血管及血液的細胞的細胞。作為血管系統(tǒng)細胞，優(yōu)選為構成血管的細胞。來源于脊椎動物的細胞(尤其，來源于人類的細胞)中，作為構成血管的細胞的具體例，能夠舉出血管內皮細胞及血管平滑肌細胞。血管內皮細胞可以為靜脈內皮細胞及動脈內皮細胞中的任一個。作為血管內皮細胞的前體細胞，能夠使用血管內皮前體細胞。優(yōu)選為血管內皮細胞及血管內皮前體細胞。作為構成血液的細胞，能夠使用血細胞，并能夠使用淋巴細胞或嗜中粒細胞性等白細胞、單核細胞、它們的干細胞即造血干細胞。

本說明書中，非血管系統(tǒng)細胞是指上述血管系統(tǒng)細胞以外的細胞。例如能夠使用es細胞、ips細胞、間充質干細胞(msc)、心肌干細胞、心肌細胞、成纖維細胞、成肌細胞、軟骨細胞、成肌細胞、肝細胞或神經細胞。優(yōu)選能夠使用msc、軟骨細胞、成肌細胞、心肌干細胞、心肌細胞、肝細胞或ips細胞。更優(yōu)選為msc、心肌干細胞、心肌細胞或成肌細胞。

本發(fā)明的細胞結構體可以包含非血管系統(tǒng)細胞。并且，構成本發(fā)明的細胞結構體的細胞，可以僅為非血管系統(tǒng)細胞。作為本發(fā)明的細胞結構體，包含兩種以上的細胞，且可以包含非血管系統(tǒng)細胞及血管系統(tǒng)細胞這兩者。

(3)細胞結構體

本發(fā)明中，使用生物相容性高分子塊體和細胞，在多個細胞之間的間隙將多個生物相容性高分子塊體三維配置成鑲嵌狀，由此制作細胞結構體。將生物相容性高分子塊體和細胞三維配置成鑲嵌狀，由此在結構體中形成細胞均勻存在的細胞結構體，從而能夠從外部向細胞結構體內部供給培養(yǎng)基成分等營養(yǎng)。

用于本發(fā)明的細胞結構體中，在多個細胞之間的間隙配置有多個生物相容性高分子塊體，在此，“細胞之間的間隙”是指，無需為被所構成的細胞封閉的空間，而被細胞夾持即可。另外，無需在所有的細胞之間存在間隙，也可以存在細胞彼此相接觸的部位。夾著生物相容性高分子塊體的細胞之間的間隙的距離、即選擇某一細胞和存在于距離該細胞最短距離內的細胞時的間隙距離并無特別限制，優(yōu)選為生物相容性高分子塊體的大小，優(yōu)選的距離也在生物相容性高分子塊體的優(yōu)選的大小的范圍內。

并且，生物相容性高分子塊體構成為被細胞夾持，但無需在所有的生物相容性高分子塊體之間存在細胞，也可以存在生物相容性高分子塊體彼此相接觸的部位。夾著細胞的生物相容性高分子塊體之間的距離、即選擇生物相容性高分子塊體和存在于距離該生物相容性高分子塊體最短距離內的生物相容性高分子塊體時的距離并無特別限制，優(yōu)選為所使用的細胞聚集一個～多個時的細胞的塊體的大小，例如為10μm以上且1000μm以下，優(yōu)選為10μm以上且100μm以下，更優(yōu)選為10μm以上且50μm以下。

另外，本說明書中，使用了“在結構體中細胞均勻存在的細胞結構體”等、“均勻存在”的表達方式，但并不指完全均勻，是指能夠從外部向細胞結構體內部傳輸培養(yǎng)基成分等營養(yǎng)。

細胞結構體的厚度或直徑能夠設為所希望的厚度，但作為下限，優(yōu)選為215μm以上，更優(yōu)選400μm以上，最優(yōu)選730μm以上。厚度或直徑的上限并無特別限定，但作為使用上的通常范圍，優(yōu)選3cm以下，更優(yōu)選2cm以下，進一步優(yōu)選1cm以下。并且，作為細胞結構體的厚度或直徑的范圍，優(yōu)選400μm以上且3cm以下，更優(yōu)選500μm以上且2cm以下，進一步優(yōu)選720μm以上且1cm以下。將細胞結構體的厚度或直徑設定在上述范圍內，由此容易制作使用了上述細胞結構體的管狀結構物。

細胞結構體中，優(yōu)選包括生物相容性高分子塊體的區(qū)域和包括細胞的區(qū)域被配置成鑲嵌狀。另外，本說明書中的“細胞結構體的厚度或直徑”表示以下。選擇細胞結構體中的某一點a時，在通過該點a的直線內，以距離細胞結構體外界的距離成為最短距離的方式將分割細胞結構體的線段的長度設為線段a。在細胞結構體中選擇該線段a成為最長的點a，將此時的線段a的長度作為“細胞結構體的厚度或直徑”。

細胞結構體中的細胞與生物相容性高分子塊體的比率并無特別限定，優(yōu)選如下，即優(yōu)選每一個細胞的生物相容性高分子塊體的比率為0.0000001μg以上且1μg以下，更優(yōu)選為0.000001μg以上且0.1μg以下，進一步優(yōu)選為0.00001μg以上且0.01μg以下，最優(yōu)選為0.00002μg以上且0.006μg以下。將細胞與生物相容性高分子塊體的的比率設定在上述范圍內，由此能夠使細胞進一步均勻地存在，并且能夠將生物相容性高分子塊體的體積相對于細胞結構體的體積的比例及細胞的體積相對于細胞結構體的體積的比例設定在本發(fā)明中規(guī)定的范圍內。將下限設定在上述范圍內，由此能夠在使用于上述用途時發(fā)揮細胞的效果，并將上限設定在上述范圍內，由此能夠向細胞供給任意存在的生物相容性高分子塊體中的成分。在此，生物相容性高分子塊體中的成分并無特別限制，可舉出后述培養(yǎng)基中所含有的成分。

本發(fā)明的細胞結構體可以包含血管生成因子。在此，作為血管生成因子，能夠優(yōu)選舉出堿性成纖維細胞生長因子(bfgf)、血管內皮生長因子(vegf)、肝細胞生長因子(hgf)等。包含血管生成因子的細胞結構體的制造方法并無特別限制，例如能夠通過使用含浸血管生成因子的生物相容性高分子塊體而制造。從促進血管生成的觀點考慮，本發(fā)明的細胞結構體優(yōu)選包含血管生成因子。

(4)細胞結構體的制造方法

細胞結構體能夠通過混合生物相容性高分子塊體和至少一種細胞而制造。更具體而言，細胞結構體能夠通過交替配置生物相容性高分子塊體和細胞而制造。制造方法并無特別限定，優(yōu)選為在形成生物相容性高分子塊體之后，播種細胞的方法。具體而言，能夠通過孵化生物相容性高分子塊體與含細胞培養(yǎng)液的混合物而能夠制造細胞結構體。例如，在容器中、保持于容器的液體中，將細胞和預先制作的生物相容性高分子塊體配置成鑲嵌狀。作為配置方法，優(yōu)選通過使用自然凝聚、自然下落、離心、攪拌來促進或控制包括細胞和生物相容性基材的鑲嵌狀序列的形成。

作為所使用的容器，優(yōu)選包括細胞低粘附性材料或細胞非粘附性材料的容器，更優(yōu)選為包括聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、玻璃、聚碳酸酯、聚對苯二甲酸乙二酯的容器。容器底面的形狀優(yōu)選為平底型、u字型、v字型。

(5)管狀結構體

關于本發(fā)明的管狀結構物的制造方法在后面進行敘述。

將本發(fā)明的管狀結構物的典型例的示意圖示于圖5。圖5中，示出管狀結構物的內徑21、外徑22及長度23。本發(fā)明的管狀結構物具有如下結構，即在形狀為大致圓柱狀的結構體的內部具有大致圓柱狀空腔。但是，截面的形狀并不限定于精密圓形，為橢圓等類似圓的形狀即可。

本發(fā)明的管狀結構物的大小并無特別限定，能夠根據用途設計所希望的大小的管狀結構物。

在考慮到作為人造血管的用途的情況下，本發(fā)明的管狀結構物的內徑優(yōu)選1mm以上且小于6mm，更優(yōu)選1mm以上且5mm以下，進一步優(yōu)選1mm以上且3mm以下。

在考慮到作為人造血管的用途的情況下，本發(fā)明的管狀結構物的外徑優(yōu)選3mm以上且10mm以下，更優(yōu)選3mm以上且8mm以下，進一步優(yōu)選3mm以上且5mm以下。

從管狀結構物的強度等觀點考慮，內徑與外徑之差優(yōu)選1mm以上且9mm以下，更優(yōu)選2mm以上且5mm以下。

在考慮到作為人造血管的用途的情況下，本發(fā)明的管狀結構物的長度優(yōu)選5mm以上且300mm以下，更優(yōu)選5mm以上且150mm以下。

在此，內徑及外徑是指，當使本發(fā)明的管狀結構物的截面類似圓時的內徑及外徑。

(6)管狀結構物的用途

本發(fā)明的管狀結構物能夠用作人造血管、人造輸尿管或人造消化道等，優(yōu)選能夠用作人造血管。具體而言，本發(fā)明的細胞結構體例如能夠以向需要移植人造血管、人造尿管或人造消化道的部位移植的目的而使用。

作為移植方法，能夠使用切割具、內窺鏡等。

根據本發(fā)明，可提供一種包括向需要移植人造血管的患者移植管狀結構物的工序的移植方法。本發(fā)明的移植方法中，使用上述本發(fā)明的管狀結構物。細胞結構體及管狀結構物的優(yōu)選范圍與上述內容相同。

并且，根據本發(fā)明，可提供用于制造人造血管的本發(fā)明的管狀結構物的用途。細胞結構體及管狀結構物的優(yōu)選范圍與上述內容相同。

[管狀結構物的制造方法]

通過上述(4)細胞結構體的制造方法而得到的細胞結構體(鑲嵌細胞團)例如能夠通過如下情況等方法制造所希望的大小的本發(fā)明的管狀結構物，該方法中，

(a)使細胞結構體(鑲嵌細胞團)彼此融合、或

(b)在分化培養(yǎng)基或生長培養(yǎng)基下增大體積。

融合的方法、增大容積的方法并無特別限定，優(yōu)選通過在具有用于形成管狀結構物的模具的裝置中培養(yǎng)在多個細胞的間隙配置有生物相容性高分子塊體的多個細胞結構體來時細胞結構體融合的方法。關于具有用于形成管狀結構物的模具的裝置在后面進行敘述。

當使細胞結構體融合時，例如能夠使多個細胞結構體融合，該多個細胞結構體包含多個生物相容性高分子塊體和多個細胞，并在通過上述多個細胞形成的多個間隙的一部分或全部配置有一個或多個上述生物相容性高分子塊體。

本發(fā)明的管狀結構物的制造方法所涉及的“生物相容性高分子塊體(種類、大小等)”、“細胞”、“細胞之間的間隙”、“所得到的細胞結構體(大小等)”、“細胞與生物相容性高分子塊體的比率”等的優(yōu)選范圍與本說明書中的上述內容相同。

上述融合前的各細胞結構體的厚度或直徑優(yōu)選為10μm以上且1cm以下，更優(yōu)選為10μm以上且2000μm以下，進一步優(yōu)選為15μm以上且1500μm以下，最優(yōu)選為20μm以上且1300μm以下。融合后的厚度或直徑優(yōu)選為400μm以上且3cm以下，更優(yōu)選為500μm以上且2cm以下，進一步優(yōu)選為720μm以上且1cm以下。

[用于制造管狀結構物的裝置]

本發(fā)明還涉及一種上述用于制造本發(fā)明的管狀結構物的裝置，該裝置具有：基座部，具有用于形成由細胞結構體構成的管狀結構物的外側側面的圓柱狀中空區(qū)域；核心接收部，存在于上述中空區(qū)域的內部；及圓柱狀核心部，用于形成上述管狀結構物的內側側面。

本說明書中所述的圓柱狀、平面及垂直方向并非分別指精密圓形、平面、垂直方向，而包含大致圓柱狀、大致平面及大致垂直方向。大致圓柱狀是指圓柱狀形狀可以變形，還包括上表面或底面為橢圓的形狀。大致平面是指包括在平面上存在較小的凹凸或彎曲的情況。大致垂直方向是指在將垂直方向上的角度設為90度的情況下，包括±10度，優(yōu)選±5度，更優(yōu)選±2度的誤差。

以下，參考圖1～圖4，對本發(fā)明的裝置進行說明。

圖1及圖2表示基座部1的結構的例。圖1a及圖2a表示頂視圖，圖1b及圖2b表示主視圖，圖1c及圖2c表示側視圖，圖1d及圖2d表示仰視圖，圖1e及圖2e表示立體圖。

基座部1具有用于形成由細胞結構體構成的管狀結構物的外側側面的圓柱狀中空區(qū)域2。

基座部1的上表面5為平面，中空區(qū)域2從基座部的上表面5相對于基座部的上表面的平面沿垂直的方向設置。

圖1所示的基座部與圖2所示的基座部的不同點在于中空區(qū)域的直徑，圖2所示的基座部的中空區(qū)域的直徑比圖1所示的基座部的中空區(qū)域的直徑大。

中空區(qū)域的圓柱狀直徑相當于管狀結構物的外徑。能夠根據所制造的管狀結構物的外徑設定中空區(qū)域的圓柱狀直徑。例如，中空區(qū)域的圓柱狀直徑能夠設為3mm以上且10mm以下，優(yōu)選能夠設為3mm以上且8mm以下，進一步優(yōu)選能夠設為3mm以上且5mm以下，而并無特別限定。

基座部整體的大小若相當于能夠設置上述大小的中空區(qū)域的大小，則并無特別限定，作為上表面的大小，例如，縱向長度為5mm以上且300mm以下，優(yōu)選為10mm以上且200mm以下，更優(yōu)選為10mm以上且100mm以下，橫向長度為5mm以上且300mm以下，優(yōu)選為10mm以上且200mm以下，更優(yōu)選為10mm以上且100mm以下。基座部的高度并無特別限定，例如為5mm以上且300mm以下，優(yōu)選為10mm以上且300mm以下，更優(yōu)選為10mm以上且200mm以下。

中空區(qū)域的圓柱狀直徑比后述核心部的圓柱狀直徑大。這是因為核心部的至少一部分存在于中空區(qū)域內。

圖1及圖2所示的基座部1中，中空區(qū)域2從基座部的上表面5貫穿至底面。

基座部的底面具有如下結構，即在包括培養(yǎng)基的容器內設置有基座部時，培養(yǎng)基中所包含的培養(yǎng)基成分能夠從后述核心接收部的貫穿區(qū)域的底面?zhèn)热肟谶M入到基座部的中空區(qū)域的內部。作為上述結構的具體例，能夠舉出基座部的底面具有在設置面設置有基座部時具有與上述設置面接觸的區(qū)域8和不與上述設置面接觸的區(qū)域9的形狀的情況。另外，不與設置面接觸的區(qū)域是指在與接地面之間具有空間的區(qū)域。

圖1及圖2所示的實施方式中，當從正面觀察時(參考圖1b及圖1c)，基座部的底面具有凹型形狀。通過將底面設為凹型形狀，底面具有與設置面接觸的區(qū)域8和不與設置面接觸的區(qū)域9，但只要能夠設置與設置面接觸的區(qū)域8和不與設置面接觸的區(qū)域9，則底面的形狀并不限定于凹型形狀。

圖3表示核心接收部3的結構的一例。圖3a表示頂視圖，圖3b表示主視圖，圖3c表示側視圖，圖3d表示立體圖。

核心接收部3設置于基座1的中空區(qū)域2的內部。圖1和圖2中，分別圖示基座部1和核心接收部3，但在設置在核心接收部3、基座部1的中空區(qū)域2的內部的狀態(tài)下，基座部1和核心接收部3可以一體形成。或者，可以在分別制作基座部1和核心接收部3之后，在基座部1的中空區(qū)域2的內部設置核心接收部3而使用。

在核心接收部3設置在中空區(qū)域2的內部的情況下，通過被核心接收部的上表面和中空區(qū)域2的壁面包圍的空間而形成管狀結構物。優(yōu)選核心接收部3設置于中空區(qū)域的下端10或中空區(qū)域的下端10附近。

關于核心接收部3的形狀，若能夠保持核心部4，為設置于基座部1的中空區(qū)域2的內部的形狀，則并無特別限定。優(yōu)選核心接收部3為在中心部具有用于保持核心部的貫穿孔6，而且在周邊部具有從核心接收部的上表面貫穿至底面的一個以上的貫穿區(qū)域7的圓柱狀。

從保持核心部的觀點考慮，貫穿孔6的形狀優(yōu)選與核心部的形狀大致相同，優(yōu)選為圓柱狀。關于圓柱的直徑，例如能夠設為1mm以上且小于6mm，優(yōu)選能夠設為1mm以上且5mm以下，更優(yōu)選能夠設為1mm以上且3mm以下，而并無特別限定。

并且，核心接收部3整體的大小及形狀優(yōu)選能夠設置于中空區(qū)域2的內部的大小及形狀。

圖2所示的核心接收部3具有4個貫穿區(qū)域7，但貫穿區(qū)域7的個數并無特別限定，若為一個以上則能夠設為任意個，通常為1～8個左右，優(yōu)選為2～6個左右。通過設置上述貫穿區(qū)域7，在包括培養(yǎng)基的容器內設置基座部時，培養(yǎng)基中所包含的培養(yǎng)基成分能夠從核心接收部的貫穿區(qū)域的底面?zhèn)热肟谶M入到基座部的中空區(qū)域的內部。為了上述上述目的，優(yōu)選核心接收部的貫穿區(qū)域7的底面?zhèn)热肟谀軌蛟O置于基座部的底面中的不與設置面接觸的區(qū)域9。

用于在中心部保持核心部的貫穿孔6的直徑與核心部的直徑大致相同，由此核心接收部3能夠保持核心部4。

圖4表示核心部4的結構的一例。圖4a表示頂視圖，圖4b表示主視圖，圖4c表示立體圖。核心部4優(yōu)選具有圓柱狀形狀。核心部4用于形成細胞結構體的管狀結構物的空腔(即，管狀結構物的內壁)，通過將核心部4的形狀設為圓柱狀，能夠制造(通常具有圓柱狀空腔)管狀結構物。

核心部4被核心接收部3保持，核心部4的至少一部分在中空區(qū)域2內相對于基座部的平面方向沿垂直的方向設置。

圖3和圖4中，分別圖示核心接收部3和核心部4，但也可以作為核心部4插入于核心接收部3的貫穿孔6的狀態(tài)而核心接收部3核核心部4一體形成?；蛘?，可以在分別制作核心接收部3和核心部4之后，將核心部4插入核心接收部3的貫穿孔6而使用。

如上述，基座部1和核心接收部3也可以一體形成，且也可以分別制作。

從而，作為本發(fā)明的裝置的形態(tài)，可舉出以下形態(tài)。

(1)一體形成有基座部、核心接收部及核心部的形態(tài)；

(2)基座部及核心接收部一體形成，且核心部單獨形成，使核心部保持于一體形成的基座部及核心接收部中的核心接收部而使用的形態(tài)；

(3)分別形成基座部、核心接收部及核心部，通過如本說明書中的上述內容那樣組合上述3個部件而使用的形態(tài)。

(4)作為其他形態(tài)，能夠以兩個以上的部件構成基座部1。例如，圖1e及圖2e所示的基座部1的立體圖中，能夠在分別形成基座部的上段部分和下段部分之后，層疊兩者而使用。

中空區(qū)域2的圓柱狀直徑的中心與核心部4的圓柱狀直徑的中心大致相同。

核心部4的圓柱狀直徑比中空區(qū)域2的圓柱狀直徑小。

核心部的圓柱狀直徑相當于管狀結構物的內徑。能夠根據所制造的管狀結構物的內徑設定核心部的圓柱狀直徑。核心部的圓柱狀直徑例如能夠設為1mm以上且小于6mm，優(yōu)選能夠設為1mm以上且5mm以下，更優(yōu)選能夠設為1mm以上且3mm以下，而并無特別限定。

并且，核心部的長度并無特別限定，通常為10mm以上且300mm以下左右，優(yōu)選為10mm以上且150mm以下。

包括上述基座部、核心接收部及核心部的本發(fā)明的裝置能夠由任意材料制造，例如，能夠使用如下來制造：硅酮、氟樹脂、聚四氟乙烯(ptfe)、全氟烷氧基烷烴(四氟乙烯-全氟烷基乙烯基醚共聚物)(pfa)、全氟乙烯丙烯共聚物(四氟乙烯-六氟丙烯共聚物)(fep)、特氟龍(注冊商標)、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、玻璃、聚碳酸酯、聚對苯二甲酸乙二酯、金屬、不銹鋼、鋁等。上述中，最優(yōu)選細胞低粘附性材料或細胞非粘附性材料。

優(yōu)選能夠將核心部和/或形成中空區(qū)域的部設為中空網狀。核心部和/或形成中空區(qū)域的部與細胞結構體的管狀結構物相接觸，通過將核心部和/或形成中空區(qū)域的部設為中空網狀，能夠包含培養(yǎng)基成分，由此在培養(yǎng)細胞結構體而制造管狀結構物時，能夠通過細胞輕松地供給培養(yǎng)基成分。作為中空網狀的結構，例如能夠舉出以中空線束制作核心部的情況等。

通過以下的實施例對本發(fā)明進行進一步具體的說明，但本發(fā)明并不限定于實施例。

實施例

[實施例1]重組肽(重組明膠)

作為重組肽(重組明膠)準備以下cbe3(記載于國際公開wo2008/103041號公報)。

cbe3：

分子量：51.6kd

結構：gap[(gxy)63]3g

氨基酸數：571個

rgd序列：12個

亞氨基酸含量：33％

大致100％的氨基酸為gxy的重復結構。cbe3的氨基酸序列中并不包含絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、酪氨酸及半胱氨酸。cbe3具有ergd序列。

等電點：9.34

gravy值：-0.682

1/iob值：0.323

氨基酸序列(序列表的序列編號1)(與國際公開wo2008/103041號公報的序列編號3相同。但將末尾的x修正為“p”)

gap

(gapglqgapglqgmpgergaaglpgpkgergdagpkgadgapgapglqgmpgergaaglpgpkgergdagpkgadgapgkdgvrglagpigppgergaaglpgpkgergdagpkgadgapgkdgvrglagpigppgpagapgapglqgmpgergaaglpgpkgergdagpkgadgapgkdgvrglagpp)3g

[實施例2]重組肽多孔體的制作

[ptfe厚度·圓筒形容器]

準備了底面厚度3mm、直徑51mm、側面厚度8mm、高度25mm的聚四氟乙烯(ptfe)制圓筒杯狀容器。ptfe制圓筒杯狀容器中，將曲面作為側面時，側面被8mm的ptfe封閉，底面(平板圓形狀)也被3mm的ptfe封閉。另一方面，上表面呈開放形狀。由此，圓筒杯狀容器的內徑成為43mm。以下，將該容器稱為ptfe厚度·圓筒形容器。

向ptfe厚度·圓筒形容器流入cbe3水溶液，在真空冷凍干燥機(tf5-85atnnn：takara.co.ltd制)內使用冷卻擱板從底面冷卻cbe3水溶液。cbe3水溶液的最終濃度為4質量％，水溶液量為8ml。關于擱板溫度的設定，冷卻至-10℃，在-10℃下冷凍1小時，之后在-20℃下冷凍2小時，而且在-40℃下冷凍3小時，最后在-50℃下冷凍1小時。所得到的冷凍物在之后將擱板溫度恢復到-20℃設定之后在-20℃下真空干燥24小時，24小時之后在直接繼續(xù)真空干燥的狀態(tài)下將擱板溫度上升至20℃，直至真空度充分下降(1.9×10⁵pa)，進一步在20℃下實施48小時的真空干燥之后，從真空冷凍機取出。如上述那樣得到了多孔體。

制作多孔體時，從底面冷卻各自的水溶液，因此圓中心部的水表面溫度最難冷卻。從而，圓中心部的水表面部分在溶液內成為溫度最高的液溫，因此測定了圓中心部的水表面部分的液溫。以下，將圓中心部的水表面部分的液溫稱為內部最高液溫。

[實施例3]冷凍工序中的內部最高液溫的測定

將冷凍溶劑時的溫度分布示于圖6。在融點以下的溫度下經過未冷凍狀態(tài)之后，產生凝固熱且溫度開始上升，在該階段開始實際形成冰。之后，溫度在0℃附近逗留一定時間，該階段中，成為存在水和冰的混合物的狀態(tài)。最后，溫度再次從0℃開始下降，在該階段中，液體部分消失而成為冰。所測定的溫度成為冰內部的固體溫度，而不存在液溫。如上述，若觀察產生凝固熱的瞬間的內部最高液溫，則可知內部最高液溫在未冷凍狀態(tài)下經過“溶劑融點-3℃”之后被冷凍。

產生凝固熱的瞬間的未冷凍狀態(tài)下的內部最高液溫為-8.8℃。若觀察產生凝固熱的瞬間的內部最高液溫，則可知內部最高液溫在未冷凍狀態(tài)下為“溶劑融點-3℃”。

[實施例4]重組肽塊體的制作(多孔體的粉碎和交聯(lián))

使用新功率粉碎機(osakachemicalco.,ltd.制、新功率粉碎機pm-2005)粉碎在實施例2中所得到的cbe3多孔體。關于粉碎，以最大轉速并以1分鐘×5次的方式合計進行5分鐘的粉碎。針對所得到的粉碎物，利用不銹鋼制篩區(qū)分尺寸，從而得到了25～53μm、53～106μm、106μm～180μm的顆粒形態(tài)的cbe3塊體。之后，在氮氣下以160℃實施熱交聯(lián)(交聯(lián)時間為8～48小時)，從而得到了重組肽塊體。以下，全都使用了53～106μm的塊體。

[實施例5]使用了重組肽塊體的細胞結構體的制作(來源于人類骨髓的間充質干細胞(hmsc))

將來源于人類骨髓的間充質干細胞(hmsc)通過生長培養(yǎng)基(takarabioinc.：mscgmbulletkit(注冊商標))調整為10萬cells/ml，并添加在實施例4中制作的cbe3塊體(53～106μm)直至成為0.1mg/ml。將所得到的混合物100μl播種于sumiloncelltightx96u微孔板(sumitomobakeliteco.,ltd.，底部呈u字型)，并以臺式微孔板離心機離心(600g、5分鐘)，靜置24小時，從而制作了包括cbe3塊體和hmsc細胞的直徑大小為0.75mm的球狀細胞結構體(每一個細胞具有0.001μg的塊體)。另外，在u字型微孔板中制作，因此本細胞結構體為球狀。

[實施例6]使用了細胞結構體的管狀結構物的制作

將在實施例5中所制作的細胞結構體放入特殊的模具裝置中，由此制作了包括多個細胞結構體的管狀結構物。

制作了由圖1、圖3及圖4所示的部件構成的硅酮制模具裝置a(內徑1mm、外徑3mm用)和由圖2、圖3及圖4所示的部件構成的硅酮制模具裝置b(內徑3mm、外徑5mm用)。

模具裝置a的基座部(圖1)的中空區(qū)域的直徑為3mm。模具裝置a的基座部的上表面(圖1a)為長15mm、寬15mm的正方形。上述基座部的高度(圖1b的8的部分的高度)為13mm，圖1b的9的部分的高度為12mm。

模具裝置a的核心接收部(圖3)的上表面(圖3a)的形狀為在直徑3mm的圓的中心挖去直徑1mm的圓，而且在直徑3mm的圓的周邊部的4個部位挖去直徑1mm的半圓的形狀。核心接收部的高度為3mm。

模具裝置a的核心部(圖4)為直徑1mm、長度17mm的圓柱。

模具裝置b的基座部(圖2)的中空區(qū)域的直徑為5mm。模具裝置a的基座部的上表面(圖1a)為長15mm、寬15mm的正方形。上述基座部的高度(圖1b的8的部分的高度)為13mm，圖1b的9的部分的高度為12mm。

模具裝置b的核心接收部(圖3)的上表面(圖3a)的形狀為在直徑5mm的圓的中心挖去直徑3mm的圓，而且在直徑5mm的圓的周邊部的4個部位挖去直徑1mm的半圓的形狀。核心接收部的高度為3mm。

模具裝置b的核心部(圖4)為直徑3mm、長度17mm的圓柱。

模具裝置通過分為基座部(圖1及圖2)、核心接收部(圖3)、核心部(圖4)這三個并從硅酮塊切取加工而制作，使用時將這些合為一體而使用。尤其為了提高制造管狀結構物時的液體擴撒性而提高細胞的生存，在下部基座部的核心接收部中開設有排液孔(核心接收部有4處凹陷部)。合為一體時，將核心接收部插入基座部的貫穿孔部分，以使基座部的下面與核心接收部的下面形成同一平面。而且，在該核心接收部的中心部的孔中設置了核心。由此，在核心接收部的上部產生通過核心、基座部的貫穿孔的內壁、核心接收部的上表面形成的空間。能夠在該部位設置細胞結構體。在本裝置中分別以如下方式設置在實施例5中所制作的細胞結構體，即在內徑1mm外徑3mm用模具裝置設置384個(最終長度為8mm)，在內徑3mm外徑5mm用模具裝置設置600個(最終長度為7mm)，設置結束的模具裝置在浸漬于培養(yǎng)基(takarabioinc.：mscgmbulletkit(注冊商標))中的狀態(tài)下，培養(yǎng)3天。

之后，從裝置外框拆卸模具裝置的核心和細胞結構體，由此作為帶有核心的狀態(tài)，得到了由細胞結構體構成的管狀結構物(作為例，內徑1mm、外徑3mm、長度8mm、內徑3mm、外徑5mm、長度7mm)(參考圖7)。通過將這些管狀結構物培養(yǎng)3周而得到了更堅固的管狀結構物(參考圖8)。

[實施例7]細胞結構體的管狀結構物的壁部的分子滲透性能

通過粘附色素的情況、色素退色的情況對在實施例6所制作的細胞結構體的管狀結構物的壁部的分子滲透性進行評價。細胞結構體管狀結構物中，能夠使管狀結構物的壁部很好地滲透培養(yǎng)基中的酚紅(分子量354.38)成分，因此從培養(yǎng)基取出時管狀結構物的壁部呈紅色(參考圖8的第一段)。而且，若移到pbs等透明的液中，則壁部中的酚紅瞬間擴散而紅色褪色(參考圖8的第二段)。這表示管狀結構物的壁部的分子滲透性能明顯高。

另一方面，當僅以細胞制作相同的管狀結構物時，管狀結構物中，管狀結構物的壁部從一開始就無法滲透培養(yǎng)基中的酚紅，因此就連壁部也不會呈紅色(圖9中的右圖)。表示分子滲透性能明顯較低。

從而，證實了在實施例6中所制作的本發(fā)明的細胞結構體管狀結構物的壁部比僅包括細胞的管狀結構物具有非常高的分子滲透性能。

[比較例1]

使用了重組肽塊體，除此以外，以與實施例5及實施例6相同的方式，嘗試制作僅包括細胞的管狀結構物。其結果，很難以僅包括細胞的結構體維持形狀，并觀察到即使在培養(yǎng)過程中也被破壞(參考圖10)

[實施例8]

向大鼠的頸靜脈移植由細胞結構體構成的管狀結構物

向裸大鼠的頸靜脈吻合移植在實施例6中所制作的細胞結構體管狀結構物。利用裸大鼠(雄9周齡)在麻醉處置(異氟烷)下進行處置。首先將大鼠的頸部從胸側切割皮膚，露出左右頸靜脈之后，剝離粘連組織而露出頸靜脈。在中樞側及末梢側這兩處夾住頸靜脈而止血，并切斷血流停止的血管，從而剝離血管周圍的外膜。在顯微鏡下，使用10-0縫合線將在實施例6中所制作的細胞結構體的管狀結構物縫合移植于切斷部血管。之后，卸下末梢側的夾鉗，確認血流再通的同時卸下中樞側的夾鉗。在出血停止的情況下確認血管的通暢，結果能夠確認到所移植的細胞結構體管狀結構物的通暢(圖11)。

從上述內容驚奇地發(fā)現(xiàn)基于本發(fā)明的細胞結構體的管狀結構物具有能夠縫合的強度及柔軟性。并且，得知基于本發(fā)明的細胞結構體的管狀結構物能夠與來源于生物的血管吻合，且血液不會從吻合部泄漏，還能夠使血液在管狀結構物內流動。

如上述，能夠確認到本發(fā)明的管狀結構物能夠作為生物組織中所需要的管狀結構而發(fā)揮功能。

符號說明

1-基座部，2-中空區(qū)域，3-核心接收部，4-核心部，5-上表面，6-貫穿孔，7-貫穿區(qū)域，8-與設置面接觸的區(qū)域，9-不與設置面接觸的區(qū)域，10-中空區(qū)域的下端，11-管狀結構物，21-內徑，22-外徑，23-長度。

sequencelisting

<110>富士膠片株式會社

<120>管狀結構物、用于制造管狀結構物的裝置及管狀結構物的制造方法a

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<212>prt

<213>重組體

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述:粘附序列

<400>2

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1

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<213>人工序列

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<223>人工序列的描述:粘附序列

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<213>人工序列

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<223>人工序列的描述:粘附序列

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<213>人工序列

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<223>人工序列的描述:粘附序列

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15

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<213>人工序列

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<223>人工序列的描述:粘附序列

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15

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述:粘附序列

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述:粘附序列

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15

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<213>人工序列

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<223>人工序列的描述:粘附序列

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1

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<213>人工序列

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<223>人工序列的描述:粘附序列

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1