政府權利相關聲明

本發(fā)明是由政府資助在國立衛(wèi)生研究院簽署的合同號為no.hhsn261201300030c下完成的。因此，政府對本發(fā)明有一定權利。

序列表

本申請包含序列表，其已經以ascii格式通過電子提交，并且通過引用以其整體并入本文。所述ascii副本創(chuàng)建于2015年9月1日，命名為0269.13pct_sl.txt，大小為9,822字節(jié)。

背景

向細胞、組織、器官和生物體中有效遞送感興趣的制劑在生物醫(yī)藥、成像和其他期望向預定的目標遞送不同大小和尺寸的分子的領域已成為挑戰(zhàn)。無論是用于病理檢查、治療性治療還是基礎生物學研究，幾種方法是已知的并且用于遞送各種類別的生物材料和生物分子，其通常與感興趣的生物學和/或化學活性相關。隨著適合用作化學或生物制劑(例如藥物、生物制劑、治療劑或成像劑)的分子數目的增加，已經證明適合與不同復雜性、尺寸和化學性質的化合物一起使用的遞送系統(tǒng)的開發(fā)特別具有挑戰(zhàn)性。

納米顆粒是用作通過各種遞送方法遞送制劑的載體的結構。存在幾種納米顆粒遞送系統(tǒng)，其利用一系列不同策略將制劑包裝、運輸和遞送至特定靶標。然而，需要能夠將治療水平的藥物遞送至細胞和分子靶標以改善疾病治療的納米顆粒治療劑(和制備此類納米顆粒的方法)。

多核苷酸在醫(yī)學中具有重要的治療應用。多核苷酸可用于調節(jié)(增加或減少)負責特定疾病的基因的表達。基因沉默技術使用與靶核酸雜交并調節(jié)基因表達活性或功能例如轉錄或翻譯的多核苷酸。重要的是，基因沉默劑是抑制與疾病相關的蛋白質的功能的傳統(tǒng)小有機化合物的有希望的替代物。rnaseh、小干擾rna(sirna)、微小rna(mirna)和小發(fā)夾rna(shrna)是基因沉默化合物和通過基因沉默阻止蛋白形成的機制的實例。

持續(xù)需要能夠特異性調節(jié)基因表達以改善疾病治療的遞送系統(tǒng)和治療劑。

發(fā)明概述

本文提供了非病毒納米顆粒和相關的組合物、方法和系統(tǒng)，其可用于攜帶和遞送具有多種大小、尺寸和化學性質的范圍廣泛的分子，包括至預定的靶標。本領域技術人員一旦具有本公開內容，將能夠在無需過度實驗的情況下鑒定、制備和開發(fā)用于這些和其他用途的非病毒納米顆粒。

在一個方面，本發(fā)明提供了用于將治療劑、疫苗和/或診斷劑遞送至期望的靶標的系統(tǒng)。當納米顆粒用無菌水(例如在開發(fā)或制造藥學上可接受的治療性納米顆粒的過程中)和用銫預處理的鋰摻雜劑配制時，實現了顯著的益處和意想不到的優(yōu)點。這種顯著的益處和意想不到的優(yōu)點包括但不限于，納米顆粒更穩(wěn)定，包括增強納米顆粒的可靠運輸能力，在藥物開發(fā)中使用所公開的納米顆粒更靈活和高效，例如在多個地點制造，以及本領域技術人員顯而易見的其它優(yōu)點。

本文公開的組合物和方法證明了本發(fā)明的納米顆粒成功容納所選擇的配體和載荷的靈活性。在一個實施方案中，納米顆粒包含含有生物活性劑和任選的縮合劑的核心，所述生物活性劑包括例如藥物、疫苗和/或診斷劑；基本上圍繞所述核以形成表面活性劑包被的復合物的表面活性劑，其中所述表面活性劑具有小于約6.0單位的親水親油平衡(hlb)值；和非共價地粘附至并基本上圍繞所述表面活性劑包被的復合物的殼，其中所述殼包含靶向部分(配體)，其中所述殼由包含用銫預處理的鋰的陽離子劑形成。納米顆粒的平均直徑小于約50納米(即亞50nm的顆粒)。

本文還公開了長度達約50個核苷酸并能夠與酪蛋白激酶2(ck2)α的相應rna核酸序列特異性雜交的dna/rna嵌合單鏈多核苷酸以及長度達約50個核苷酸并且能夠與ck2α’的相應rna序列特異性雜交的dna/rna嵌合單鏈多核苷酸，以及制備和使用包含不同序列的所述多核苷酸的組合(“混合物”)以減少或抑制ck2α和ck2α’的表達并抑制實體瘤的生長的方法。此類多核苷酸的非限制性實例包括針對ck2α的seqidno:8和針對ck2α’的seqidno:9。

本文還公開ck2靶向多核苷酸，其主鏈被修飾為將5’端起的2號位置取代為2’o-甲基化(2’o-me)的rna核苷酸。此類主鏈修飾的多核苷酸的非限制性實例提供于下表2中。

在本發(fā)明的另一方面，在腫瘤靶向亞50納米膠囊中組合和摻入如此修飾的ck2靶向多核苷酸的混合物產生納米顆粒的治療組合物，其在施用于對象后顯著減少或抑制腫瘤生長、腫瘤細胞增殖和/或炎癥。

因此，在一方面，本發(fā)明提供了包含納米顆粒的組合物，其中所述納米顆粒包含：至少一種生物活性劑、hlb值小于6.0單位的表面活性劑、配體以及l(fā)i⁺和cs⁺，其中：i)所述至少一種生物活性劑和表面活性劑形成表面活性劑膠束核心，ii)所述配體形成殼，和iii)所述納米顆粒具有小于50納米的平均直徑。在一實施方案中，所述配體形成外殼。在另一實施方案中，使用無菌水制備所述納米顆粒。

在仍另一實施方案中，所述至少一種生物活性劑是多核苷酸。在仍另一實施方案中，所述至少一種生物活性劑是質粒dna。在仍然另一實施方案中，所述li⁺用cs⁺預處理。

在另一方面，本發(fā)明提供了用于將至少一種生物活性劑遞送至靶的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含被組裝在納米顆粒中以用于將至少一種生物活性劑遞送至靶的至少一種生物活性劑、hlb值小于6.0單位的表面活性劑、配體和用cs⁺預處理的li⁺。在一實施方案中，所述生物活性劑是多核苷酸。在另一實施方案中，所述靶是哺乳動物體內的細胞。

在另一方面，本發(fā)明提供了向對象施用至少一種生物活性劑的方法，所述方法包括向對象施用包含根據本發(fā)明的納米顆粒的組合物。

還是在另一方面，本發(fā)明提供了用于向對象施用至少一種生物活性劑的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含組裝在待施用至所述對象的納米顆粒中的至少一種生物活性劑、hlb值小于6.0單位的表面活性劑、配體和用cs⁺預處理的li⁺。

在根據本發(fā)明的組合物的一實施方案中，i)：所述納米顆粒包含多個多核苷酸，每個包含3’rna部分和5’主要是dna的部分，其中從每個多核苷酸的5’末端起的2號位置是2’-ome修飾的rna，其中所述多個多核苷酸對于所述納米顆粒組合物平均大于約45％且小于約55％、大于約40％且小于約60％、或大于約30％且小于約70％的序列包含seqidno：8，并且所述多個多核苷酸的其余部分的序列包含seqidno：9，和ii)所述配體是靶向腱生蛋白受體的蛋白質。在另一個實施方案中，所述靶向腱生蛋白受體的配體是tenfibgen。

本文使用的短語“包含納米顆粒的組合物”或類似短語是指，但不限于，劑量、樣品、制劑、制造批次和包含本發(fā)明納米顆粒的其它物質組合物。

在一方面，本發(fā)明提供包含3’rna部分和5’主要是dna的部分的多核苷酸，其中從5’端起的2號位置是2’-ome修飾的rna，其中所述多核苷酸包含seqidno：11的多達約50個連續(xù)核苷酸，并且包含seqidno:8的至少8個連續(xù)核苷酸的一個部分。在另一實施方案中，所述多核苷酸長度為約20個核苷酸并且包含seqidno：8。

在另一方面，本發(fā)明提供包含3’rna部分和5’主要是dna的部分的多核苷酸，其中從5’端起的2號位置是2’-ome修飾的rna，其中所述多核苷酸包含seqidno：12的多達約至少50個連續(xù)核苷酸，并且包含seqidno：9的至少8個連續(xù)核苷酸的一個部分。在另一個實施方案中，所述多核苷酸長度為約20個核苷酸并且包含seqidno：9。

在一方面，本發(fā)明提供用于治療患者的方法，包括向對象施用治療有效量的根據本發(fā)明的組合物，其中所述患者已被診斷患有實體瘤癌癥。

在另一方面，本發(fā)明提供了用于治療診斷為患有實體瘤癌癥的患者的方法，包括向所述患者施用治療有效量的根據本發(fā)明的組合物，其中所述納米顆粒包含多個多核苷酸，其中所述多個多核苷酸中每個包含3’rna部分和5’主要是dna的部分，其中所述多個多核苷酸中每個的5’端起的2號位置是2’-ome修飾的rna，其中所述多個多核苷酸的序列包含seqidno：8或seqidno:9，其中包含含有seqidno：8的多核苷酸的納米顆粒的百分比為至少約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％或約90％，并且其余的納米顆粒包含含有seqidno:9的多核苷酸，其中所述配體是靶向腱生蛋白受體的蛋白質。

在一實施方案中，基于來自一個或多個對象的腫瘤組織中測量的ck2α酶和ck2α’酶的相對水平來確定所述百分比，任選地與參考組織和/或細胞培養(yǎng)物中的ck2α和ck2α’酶的相對水平進行比較。在另一實施方案中，所述百分比為約50％的納米顆粒包含seqidno：8而約50％包含seqidno：9。

在一方面，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明的組合物的方法，所述方法包括：i)使生物活性劑與縮合劑復合以形成縮合的生物活性劑；ii)將所述縮合的生物活性劑分散至包含hlb小于6.0的表面活性劑的水混溶性溶劑中以形成表面活性劑膠束；iii)將配體吸附到所述表面活性劑膠束的外表面以形成配體穩(wěn)定的顆粒(也稱為配體顆粒)；和iv)將所述配體顆粒與用cs⁺預處理的li⁺和無菌水混合并溫育以形成所述組合物。

除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同的含義。雖然下面提供了實施或測試本發(fā)明的合適方法和材料，但是本領域技術人員將認識到，與本文所述的那些類似或等同的其他方法和材料可被用于本發(fā)明的實踐或測試。此外，本文所述的材料、方法和實施例僅是說明性的，而不意在限制。

發(fā)明詳述

納米顆粒

在一方面，本發(fā)明提供用于將生物活性劑靶向遞送至特定組織和細胞的穩(wěn)定的納米顆粒。本發(fā)明的納米顆粒具有配體涂層或殼和小于50納米的平均直徑，使得能夠遞送生物活性劑載荷穿過身體的生物屏障和/或到達并且進入感興趣的細胞或組織。

如本文所使用的，“亞50nm納米顆?！蓖ǔＴ诩{米顆粒組合物的上下文中提及，其中所述納米顆粒包含(i)包含生物活性劑和疏水表面活性劑的表面活性劑膠束，和(ii)包含配體且具有小于約50納米的平均直徑的殼。在某些實施方案中，根據本發(fā)明的組合物的納米顆粒具有約5至約50納米、約5至約40納米、約5至約30納米、約5至約20納米、約10至40納米、約10至30納米或約10至20納米的平均直徑。

如本文所使用的，術語“殼”通常是指納米顆粒的表殼或外殼，并且包括圍繞核心表面活性劑膠束的外表面的至少一部分的層或涂層或冠(corona)。在一實施方案中，所述殼包含一個或多個配體。對于納米顆粒的給定制劑或組合物(本文可互換使用)，摻入不足重量的配體一般將導致不均勻顆粒，例如表現為不規(guī)則藥物聚集體或融合的膠束，而過量的配體一般將導致大團塊或失去球形或立方形狀，例如表現為通過例如tem或afm顯微照片分析所確定的細長結構。本領域技術人員一旦獲得本公開內容，就能夠在不進行過度實驗的情況下鑒定、制備和探索摻入本發(fā)明的納米顆粒中的配體的用途。

在一方面，本發(fā)明提供包含納米顆粒的組合物，所述納米顆粒包含生物活性劑。技術人員將理解短語“包含納米顆粒的組合物，所述納米顆粒包含(某一特征、性質等)”表示組合物中的多個納米顆粒包含所述特征、性質等。

在一實施方案中，使用無菌水制備所述納米顆粒。術語“制備”、“合成”、“制作”、“制造”等諸如此類在本文中可互換使用。本文使用的短語“使用無菌水制備的納米顆?！笔侵赣脽o菌水制備用于合成本發(fā)明納米顆粒的鹽接收溶液。技術人員將理解，在最終鹽接收溶液的制備中的任何一個步驟或多個步驟中添加的無菌水的總體積占最終鹽接收溶液的總水體積的至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％。在本文中，“最終鹽接收溶液”是指在添加配體穩(wěn)定的(ligand-stabilized)納米顆粒之前的溶液。在該框架內，可以使用其它等級的水，例如作為添加到鹽接收溶液中的賦形劑的儲液。應當理解，短語“使用無菌水制備的納米顆?！焙汀鞍瑹o菌水的鹽接收溶液”考慮無菌水占最終鹽接收溶液的總水體積的約80％至100％。在“使用無菌水制備的納米顆?！焙汀鞍瑹o菌水的鹽接收溶液”的上下文中使用的“無菌水”是指其中以下金屬的水平總和不超過約0.2ppm的水：鋁、砷、鋇、鎘、鉻、銅、鐵、鉛、錳、鎳、銣、硫、釩和鋅。在一實施方案中，“無菌水”是指其中以下金屬的含量總和不超過約0.1ppm的水：鋁、砷、鋇、鎘、鉻、銅、鐵、鉛、錳、鎳、銣、硫、釩和鋅。在該框架中，每種金屬的水平和金屬的總和基于低至方法檢測限(mdl)報告的結果。金屬測試可根據可用的方法進行，例如美國環(huán)境保護局方法6010和6020。

在一些實施方案中，必須使用高純度的水，例如無菌水，以滿足藥物產品的監(jiān)管標準。在一些實施方案中，期望使用無菌水，以通過降低可以改變納米顆粒特征的污染物水平來改善對納米顆粒制造的控制，所述特征例如尺寸、形狀、穩(wěn)定性和功能性，如通過例如透射電子顯微鏡(tem)或原子力顯微鏡(afm)確定。在一些實施方案中，期望使用無菌水，以通過提供一致的基質來改善對納米顆粒制造的控制，所述基質中可以添加例如賦形劑的成分以改善納米顆粒特性，例如尺寸、形狀、穩(wěn)定性和功能性。普通技術人員還將理解，關于藥物研究、開發(fā)和制造中的水的測試、分級和用途，例如由美國藥典和類似組織制定的那些的方法和準則是可用的。

在一實施方案中，使用的無菌水是藥物級水。在另一實施方案中，使用無菌水制備藥學上可接受的治療性納米顆粒。在本文中的短語“藥學上可接受的”是指在合理的醫(yī)學判斷范圍內適用于與對象的組織接觸而沒有過度毒性、刺激性、過敏反應或其它問題或并發(fā)癥，與合理的利益/風險比相稱的那些化合物、材料、組合物和/或劑型。在一實施方案中，無菌水也用于納米顆粒制備過程中的其它步驟，例如用于組裝鹽接收溶液的任何試劑的溶液制備或所述納米顆粒的一或多種組分在它們被加入鹽接收溶液之前的制備。

在一實施方案中，納米顆粒包含鋰(li⁺)和銫(cs⁺)離子。在另一實施方案中，納米顆粒包含已經用cs⁺預處理的li⁺。本文使用的短語“用cs⁺預處理的li⁺”和類似短語是指在將預混合或接觸的li⁺和cs⁺離子與已經或將要用于制備鹽接收溶液的無菌水體積接觸之前使li⁺和cs⁺離子預混合或接觸。預處理步驟中的li⁺的濃度一般應為至少1m。在一實施方案中，濃度為2m。在一實施方案中，濃度為3m。在一實施方案中，濃度在3m和5m之間。在一實施方案中，濃度為4m。在一實施方案中，濃度為5m。在一實施方案中，在將li⁺添加到用于形成納米顆粒的鹽接收液bath)之前用離子對li⁺的預處理限于離子cs⁺。在所述實施方案中，應理解，將預處理離子限制為cs⁺預期特別排除添加到預混物中的其它離子，但不打算排除可能存在于用于用cs⁺預處理li⁺的水源中的其它離子。出于本文公開和預期的目的，li⁺和cs⁺離子的預混合或接觸可容易地根據本領域技術人員已知的用于組合離子和類似分子的方法進行，包括簡單地將期望濃度的離子在水中，例如，無菌水中混合。在一實施方案中，在50ml管中的無菌水中將約0.1μg/1ml的cs⁺加入到約4mli⁺，以重量計約2.5ppbcs⁺：li⁺，并旋轉約2分鐘。本領域技術人員將理解，可以常規(guī)地改變使用的cs⁺：li⁺的比例和/或在例如50ml管中的無菌水中的合并的離子的濃度，以操縱納米顆粒的形態(tài)或穩(wěn)定性或一些其他隨后產生的特性。

在另一個實施方案中，cs⁺與li⁺以約0.1至約100十億分率(ppb)之間的比例預混合。在另一個實施方案中，預混合比例為約0.1至約5ppb之間。在另一個實施方案中，預混合比例為約1至約4ppb之間。這些范圍中的每一個包括那個范圍內的子范圍。例如，約1至約4ppb之間的范圍包括：約1.2至約2.5ppb之間，以及約2至約4ppb之間等諸如此類。令人驚奇的是，對于使用無菌水制備的納米顆粒，用與li⁺預混合的cs⁺配制的那些顆粒形成了期望的球形、長方體或橢圓形亞50納米的納米顆粒，而用在鹽接收溶液中簡單混合并且不預混合的cs⁺和li⁺配制的那些顆粒通常形成未卷繞的長棒狀的不適合使用的組合物。本領域技術人員一旦獲得本公開內容，將能夠通過常規(guī)實驗鑒定、制備和開發(fā)cs⁺和li⁺預混物用于靶向納米顆粒的用途。

所公開的納米顆粒提供模塊化靶向組分，其可容易地針對給定靶例如給定組織或細胞靶被合成，而無需將靶向部分螯合、綴合或共價連接到納米顆粒上的步驟。本領域技術人員將理解，通過基于預期靶合理選擇靶向部分和本領域已知的方法和組合物，本發(fā)明的納米顆粒能夠將生物活性劑遞送至預定的靶組織和細胞。

在一實施方案中，所述殼包含配體。本文使用的術語“配體”是指結合靶受體的物質。在一些實施方案中，配體包括蛋白質、肽、多肽、碳水化合物、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、抗體或生物相容性聚合物，或其片段，或小分子。在一實施方案中，用至少一種組織或細胞特異性配體包被亞50nm納米顆粒?！鞍坏募{米顆?！笔侵钙渲信潴w通過非共價締合與核心表面活性劑膠束結合的納米顆粒。本發(fā)明的納米顆粒的配體選擇的靈活性部分地通過不存在例如通過螯合、共軛或共價連接將配體連接到納米顆粒的復雜步驟來實現，相反，采用直接吸附步驟將配體吸附到疏水膠束表面，隨后在鹽結晶溶液中穩(wěn)定靶向顆粒。因此，例如，將配體吸附到核心表面活性劑膠束允許比其中配體與核心顆粒綴合或螯合的納米顆粒更有效地摻入更大的配體。包括例如tenfibgen、透明質酸和合成聚合物例如pvp的多種配體可用作制備本發(fā)明的cs⁺處理的納米顆粒的配體。例如，包含pvp的顆粒將以類似于針對5.5kb質粒的配方j(下文實施例)制備，除了使用4μl的25kdpei作為縮合劑，3.3μg的10kdpvp作為吸附到核心膠束的配體，并將接收液修改為1.5nmmg²⁺和1.88nmsr²⁺之外，所有其他離子相同。

在一實施方案中，配體靶向具有腱生蛋白受體的細胞。在另一實施方案中，配體是tenfibgen。

在仍然另一實施方案中，配體是透明質酸。

在一方面，本發(fā)明提供了將生物活性劑遞送至靶或給對象施用生物活性劑的系統(tǒng)。在一實施方案中，所述系統(tǒng)包含至少一種生物活性劑例如多聚核苷酸、hlb值小于6.0單位的表面活性劑、配體以及l(fā)i⁺和cs⁺，其待組裝于亞50納米納米顆粒中，用于將至少一種生物活性劑遞送至靶或給對象施用至少一種生物活性劑。本文所用的術語“系統(tǒng)”是指能將生物活性劑導入對象體內并改善其功效或性能的制劑或組合物。

在一實施方案中，本發(fā)明的納米顆粒摻入一或多種用于調節(jié)基因表達的生物活性劑，以增加或減少特定基因產物(例如蛋白質或rna)的產生。在另一實施方案中，所述一或多種生物活性劑參與例如rnaseh、rnai和dsrna酶作用機制，以及基于靶降解或靶占位的其它調節(jié)機制。

生物活性劑

本發(fā)明的cs-處理的納米顆?？杀挥糜跀y帶和遞送生物活性劑至靶組織和細胞。本文所用的短語“生物活性劑”是指當施用或遞送至細胞、組織或生物體時模擬、改變或調節(jié)細胞、組織或生物體的一或多種生理學、生物化學、或病理過程的一或多種物質。優(yōu)選地，改變或調節(jié)是醫(yī)學上期望的改變或調節(jié)。更具體地講，生物活性劑可以是目的為包括成像或監(jiān)測或治療或預防的用途的許多不同化合物或分子中的任何一種或多種，包括但不限于生物活性劑，例如寡核苷酸、多核苷酸、質粒dna、任何基于核酸的分子包括但不限于dna、rna、sirna、mrna、mirna、shrna、適體、反義分子、或核酶以及蛋白質、多肽、肽、碳水化合物、抗體或小分子。

不希望受理論束縛，生物活性劑選擇的靈活性部分地通過形成納米顆粒的核心的疏水-表面活性劑包被的膠束的分配和縮合特征來實現。技術人員可認識到這些特征對使用寡核苷酸、多核苷酸、質粒dna、任何基于核酸的分子包括dna、rna、sirna、mirna、shrna、適體、反義分子、核糖核酸酶、蛋白質、多肽、肽、碳水化合物、抗體或其它載荷，更優(yōu)選但不排他地，親水性和/或負性或近中性電荷的載荷制備本發(fā)明的納米顆粒是合適的和有功能的。本發(fā)明的納米顆粒用于在不同制劑中摻入一系列生物活性劑的這種靈活性被展示，例如配制10.5kb質粒dna和透明質酸納米顆粒殼，獲得22.7納米平均直徑和-6.4mev電荷，和配制6800道爾頓單鏈寡核苷酸和tenfibgen納米顆粒殼，獲得直徑19.5納米，電荷-5.8mev(參見實施例)。

因此，可以通過常規(guī)實驗將其它不同的生物活性劑摻入銫預處理的納米顆粒中。例如，小分子赤蘚糖醇(mw，122)可通過類似于配方a(實施例)進行制備，除了無任何縮合劑的500μg的赤蘚糖醇用8.75μg表面活性劑膠束化，用5.5mcgtbg包被，并霧化至用6.25nmmg²⁺和9.38nmsr²⁺修飾的接收液中外，所有其它離子相同。所得納米顆粒的直徑約為25nm，表面電荷約為-12mev。

本文所用的短語“疏水性表面活性劑包被的”是指用于形成表面活性劑膠束的疏水性表面活性劑的包被或層，其包圍至少一部分生物活性劑和任選的縮合劑。對于給定的制劑，不足的表面活性劑的摻入一般將導致不規(guī)則的藥物聚合物，而過量的表面活性劑一般將導致表面活性劑球粒，如通過例如tem或afm顯微照片分析所確定的。在某些實施方案中，生物活性劑是單鏈嵌合寡核苷酸。包括寡核苷酸的生物活性劑通?？捎帽绢I域熟知的技術制備，但也可從商業(yè)制造商那里獲得。

在一實施方案中，生物活性劑是針對分子靶的多種生物活性劑。在另一實施方案中，生物活性劑包括具有不同分子靶和/或作用機制的兩種或更多種生物活性劑的混合物。

在一些實施方案中，生物活性劑與陽離子縮合劑縮合，所述陽離子縮合劑包含聚乙烯亞胺、聚鳥氨酸、聚精氨酸、精胺或本領域公知的其它一或多種陽離子縮合劑。

“特異性雜交”和“互補”是用于指足夠程度的互補性使得在本發(fā)明的多核苷酸和靶rna分子之間發(fā)生穩(wěn)定和特異性結合的術語。在本領域中應理解，多核苷酸的序列不需要與其可特異性雜交的靶rna分子的序列100％互補。本領域普通技術人員將認識到，本文提供的化合物與靶核酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互補。如果(a)多核苷酸與靶rna分子的結合干擾靶rna分子的正常功能，和(b)具有足夠的互補性使得多核苷酸與靶rna分子的結合具有高選擇性并且在期望的特異性結合條件下(即在進行體外測定的條件下或在用于體內測定或治療用途的生理條件下)在很大程度上避免多核苷酸與非靶序列的非特異性結合，多核苷酸特異性雜交。設計充分互補以在本發(fā)明中有用的寡核苷酸的方法的實例和這樣的設計技能在本領域技術人員的能力范圍內。

術語“rna”或“rna分子”或“核糖核酸分子”是指核糖核苷酸的聚合物?！鞍衦na”是指可與本發(fā)明的充分互補的多核苷酸雜交的任何rna。靶rna可包括但不限于mrna前體、mirna前體、初級mirna、mrna、mirna、小核或胞質非編碼調節(jié)rna、核糖體rna、轉移rna、mrna加工途徑中任何階段的hnrna或線粒體rna。“mrna”或“信使rna”是指編碼一條或多條多肽鏈的氨基酸序列的單鏈rna。在一實施方案中，本發(fā)明的靶mrna指定細胞蛋白(例如核、細胞質、線粒體、跨膜或膜相關蛋白)的氨基酸序列。在另一實施方案中，本發(fā)明的靶mrna指定細胞外蛋白(例如細胞外基質蛋白或分泌蛋白)的氨基酸序列。術語“dna”或“dna分子”或“脫氧核糖核酸分子”是指脫氧核糖核苷酸的聚合物。

術語“核酸分子”或“多核苷酸”是指任何含核酸的分子，包括但不限于單鏈、雙鏈體或多鏈形式的超過1個核苷酸的dna和/或rna。該術語涵蓋包括任何已知的dna和rna的堿基類似物的序列。術語“多核苷酸”還意在包括含有2’-脫氧-d-核糖或其修飾形式的多脫氧核糖核苷酸、rna以及是嘌呤或嘧啶堿基、或修飾的嘌呤或嘧啶堿基或堿性核苷酸的n-糖苷或c-糖苷的任何其它類型的多核苷酸。在一些實施方案中，多核苷酸可編碼調節(jié)或修飾染色質或其它多核苷酸的啟動子區(qū)、操縱子區(qū)、結構區(qū)、終止區(qū)、其組合、或任何其它遺傳相關材料。類似地，本文使用的術語“遺傳(genetic)”是指能夠修飾基因表達的任何材料。

術語“寡核苷酸”是指短長度的單鏈多核苷酸鏈。寡核苷酸長度一般小于200個殘基(例如，在約8和100之間)。術語“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本文中可互換使用。

如本文所用，“基因沉默”、“基因沉默分子”、“基因沉默化合物”以及諸如此類是指多核苷酸，其至少一部分和與其雜交的靶核酸至少部分互補。在某些實施方案中，基因沉默化合物調節(jié)(例如降低)靶核酸的表達或量。在某些實施方案中，基因沉默化合物改變靶前體mrna的剪接，導致不同的剪接變體。在某些實施方案中，反義化合物調節(jié)一或多種不同靶蛋白的表達。本文考慮的基因沉默機制包括但不限于核糖核酸酶h機制、rnai機制、剪接調節(jié)、翻譯阻滯、改變rna加工、抑制微小rna功能和模擬微小rna功能，以及閱讀當前公開內容后技術人員可識別的其他機制。

術語“小干擾rna”(“sirna”)(本領域中也稱為“短干擾rna”)是指包含約10-50個核苷酸(或核苷酸類似物)的能夠指導或介導rna干擾的rna(或rna類似物)。如本文所用，術語“rna干擾”(“rnai”)是指rna的選擇性細胞內降解。在一些實施方案中，生物活性劑是雙鏈sirna多核苷酸。

如本文所用，“表達”是指基因最終導致蛋白質的過程。表達包括但不限于轉錄、剪接、轉錄后修飾和翻譯。

術語“基因”是指包含產生多肽、前體或rna(例如rrna、trna和其他ncrna)所必需的編碼序列的核酸(例如dna)序列。多肽可由全長編碼序列或通過編碼序列的任何部分編碼，只要全長編碼序列或片段的期望活性或功能特性(例如酶活性、配體結合、信號轉導、免疫原性等)被保留。

術語“基因表達”指的是通過基因的“轉錄”(即通過rna聚合酶的酶促作用)將基因里編碼的遺傳信息轉換為rna(例如mrna、rrna基因、trna的或snrna)的過程，并且對于編碼蛋白質的基因，通過mrna的“翻譯”成為蛋白質?；虮磉_可在該過程的許多階段被調節(jié)?！吧险{”或“活化”是指增加基因表達產物(即rna或蛋白質)產生的調節(jié)，而“下調”或“抑制”是指減少產生的調節(jié)。涉及上調或下調的分子(例如轉錄因子)通常分別被稱為“激活子”和“抑制子”。

術語“基因表達的抑制”是指本發(fā)明的多核苷酸與靶rna雜交并提供所述基因的部分或完全功能喪失的條件。應當理解，多核苷酸不需要與其可特異性雜交的靶rna序列100％互補。在某些實施方案中，，相對于不存在本發(fā)明的雙功能嵌合單鏈多核苷酸時的基因表達水平，靶基因表達期待降低至少約10％、25％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。本發(fā)明不限于抑制特定基因的表達。

術語“核苷”是指具有共價連接到核糖或脫氧核糖的嘌呤或嘧啶堿基的分子。示例性核苷包括腺苷、鳥苷、胞苷、尿苷和胸苷。術語“核苷酸”是指具有一或多個以酯鍵連接到糖基的磷酸基團的核苷。示例性核苷酸包括核苷單磷酸、二磷酸和三磷酸。術語“多核苷酸”和“核酸分子”在本文中可互換使用，是指核苷酸的聚合物，并且在本發(fā)明的一個實施方案中，通過在糖基的5’和3’碳原子之間的磷酸二酯鍵連接在一起。

術語“核苷酸類似物”或“改變的核苷酸”或“修飾的核苷酸”是指較不常見的核苷酸，包括天然和非天然存在的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。核苷酸類似物可在任何位置被修飾，以便改變核苷酸的某些化學性質，但保留核苷酸類似物執(zhí)行其預期功能的能力。核苷酸類似物還可包含對核苷酸的糖部分的修飾。還可修飾核苷酸的磷酸基團，例如通過用硫(例如硫代磷酸酯)取代磷酸基團的一個或多個氧，或通過允許核苷酸執(zhí)行其預期功能的其它取代。

為了用于制備本發(fā)明化合物的核苷結構亞單元，用于在這些核苷亞單元中摻入合適的核堿基包括嘌呤和嘧啶，例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿苷和胸腺嘧啶，以及其它合成和天然核堿基，例如黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-鹵代、氨基、巰基、硫代烷基、羥基和其它8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤。另外的嘌呤和嘧啶包括在美國專利號3,687,808，在conciseencyclopediaofpolymerscienceandengineering，pages858-859，kroschwitz，j.i.，ed。johnwiley&sons，1990，以及englisch，etal.1991angewandtechemie，internationaledition30：613，均通過引用并入本文。

“磷酸二酯”是指具有連接連續(xù)核苷酸的氧原子的多核苷酸?！傲虼姿狨ァ笔侵高@樣的多核苷酸，其中通常連接兩個連續(xù)核苷酸的氧原子已經被硫替代并且其抗細胞酶的降解。本發(fā)明的多核苷酸的核苷亞基通過來自包括磷酸二酯、硫代磷酸酯、3’-(或-5’)脫氧-3-(或-5’)硫代-硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、‘-(或-5’)脫氧次膦酸鹽、硼烷磷酸鹽、3’-(或-5’)脫氧-3’-(或5’-)氨基磷酸酯、氫膦酸酯、硼烷磷酸酯、氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯磷鍵的磷鍵連接。已經報道了核苷鍵的硫代磷酸酯修飾用于增加穩(wěn)定性最低限度地影響沉默活性(2007natrevmolcellbiol8：23-6)。在一個實施方案中，包含ps/2-o-me的主鏈在po/2-o-me似乎有限的情況下可能是有價值的。

術語“磷酸化”是指至少一個磷酸基團連接到化學(例如有機)化合物上。磷酸基團可通過例如以下反應連接到蛋白質或糖基上：游離羥基+磷酸→供體磷酸酯鍵。還旨在包括在本發(fā)明范圍內的是磷酸基類似物，其與在自然界中發(fā)現的單磷酸，二磷酸或三磷酸基以相同或相似的方式起作用。在一個實施方案中，本文公開的嵌合多核苷酸包含外源5’磷酸化。在另一個實施方案中，本文公開的嵌合多核苷酸不包含外源5’磷酸化。術語“外源5’磷酸化”通常是指通過合成方法而不是天然生物過程進行的磷酸化。

“嵌合”是指但不限于這樣的分子，其包含天然存在的rna和dna部分，或通過磷酸二酯、硫代磷酸酯和/或任何其它天然存在或合成的允許核苷酸或類似物保持他們的預期功能的連接相連的核苷酸類似物。所述寡核苷酸或多核苷酸可被稱為具有至少兩個片段。一個片段定義為從多核苷酸的3’末端開始的部分，并且是核糖核酸片段，并且應當包括至少約三個連續(xù)核糖核苷酸，并且第二片段被定義為在多核苷酸的5’末端結束的部分，并且是脫氧核糖核酸為主的部分，并且包含至少約6、7、8、9或10個脫氧核糖核苷酸，其中總共0、1、2或3個核糖核苷酸可被置于所述的至少約6、7、8、9或10個脫氧核糖核苷酸之間。在一個實施方案中，第二部分包含至少5個連續(xù)的脫氧核糖核苷酸。在一個實施方案中，從5’端開始的2號位置是2’-ome修飾的rna。

根據本發(fā)明的優(yōu)選的單鏈嵌合多核苷酸優(yōu)選包含約8至約50個核苷亞單位。在本發(fā)明的上下文中，應當理解，這包括具有8至50個核苷亞基的如上所述的非天然存在的寡聚體。更優(yōu)選地，本發(fā)明的單鏈嵌合多核苷酸包含約15至約25個核苷亞基。因此，單鏈嵌合多核苷酸可長度為8個核苷酸，長度為9個核苷酸，長度為10個核苷酸，長度為11個核苷酸，長度為12個核苷酸，長度為13個核苷酸，長度為14個核苷酸，長度為15個核苷酸，長度為16個核苷酸，長度為17個核苷酸，長度為18個核苷酸，長度為19個核苷酸，長度為20個核苷酸，長度為21個核苷酸，長度為22個核苷酸，長度為23個核苷酸，長度為24個核苷酸，長度為25個核苷酸，長度為27個核苷酸，長度為28個核苷酸，長度為29個核苷酸，長度為30個核苷酸，長度為31個核苷酸，長度為32個核苷酸，長度為33個核苷酸，長度為34個核苷酸，長度為35個核苷酸，36個核苷酸長度為37個核苷酸，長度為38個核苷酸，長度為39個核苷酸，長度為40個核苷酸，長度為41個核苷酸，長度為42個核苷酸，長度為43個核苷酸，長度為44個核苷酸，長度為45個核苷酸，46個核苷酸長度為47個核苷酸，長度為48個核苷酸，長度為49個核苷酸，或長度為50個核苷酸。如將會被理解的，“核苷亞基”是通過寡核糖核苷酸中的磷鍵和通過寡核糖核苷中的非磷鍵合適地結合到相鄰亞基上的核堿基和糖或糖替代物的組合。在本文中，術語“核苷亞基”與術語“核苷單元”或“核苷”互換使用。更優(yōu)選地，本發(fā)明的嵌合寡聚核苷酸將具有通過天然存在的磷酸二酯鍵連接的核苷。

在某些實施方案中，生物活性劑是單鏈多核苷酸，并且多核苷酸是從標準優(yōu)化sirna技術獲得的引導鏈。本文包括對常規(guī)sirna序列選擇的討論。

由sirna引導的靶rna切割反應是高度序列特異性的。通常，含有與靶基因的核苷酸序列或核苷酸序列的一部分相同的核苷酸序列的sirna對于抑制是優(yōu)選的。然而，sirna和靶基因之間的100％序列相同性不是實施本發(fā)明所必需的。因此，本發(fā)明具有能夠耐受可能預期由于基因突變、株系多態(tài)性或進化分期的序列變異的優(yōu)點。例如，還發(fā)現相對于靶序列具有插入、缺失和單點突變的sirna序列對于抑制是有效的?；蛘?，具有核苷酸類似物取代或插入的sirna序列可有效抑制。

此外，并非sirna的所有位置均等地貢獻于靶識別。sirna中心的錯配是最關鍵的，基本上消除了靶rna切割。相比之下，sirna的3’核苷酸不顯著地貢獻于靶識別的特異性。特別是sirna序列3’的殘基，其與靶rna互補(例如引導序列)，對于靶rna切割不是關鍵的。

可通過本領域已知的序列比較和比對算法確定序列相同性。為了確定兩個核酸序列(或兩個氨基酸序列)的百分比相同性，為了最佳比較目的，對序列進行比對(例如可在第一序列或第二序列中引入缺口以優(yōu)化比對)。然后比較相應核苷酸(或氨基酸)位置處的核苷酸(或氨基酸殘基)。當第一序列中的位置由與第二序列中的相應位置相同的殘基占據時，則分子在該位置是相同的。兩個序列之間的相同性百分比是序列共有的相同位置的數目的函數(即％同源性＝相同位置數目#/位置的總數#x100)，任選地對所引入缺口數目和/或引入缺口的長度進行罰分。

序列的比較和兩個序列之間百分比相同性的確定可使用數學算法來完成。在一實施方案中，在比對具有足夠相同性而不是具有低相同性程度的部分的序列的某一部分上產生比對(即局部比對)。用于比較序列的局部比對算法的優(yōu)選的非限制性實例是karlin和altschul((1990)proc.natl.acad.sci.usa87:2264-68,modifiedasinkarlinandaltschul(1993)proc.natl.acad.sci.usa90:5873-77，通過引用并入本文。這樣的算法被并入altschul等人的blast程序(版本2.0)(1990)j.mol.biol.215:403-10)，通過引用并入本文。

在另一實施方案中，通過引入適當的缺口來優(yōu)化比對，并且在比對序列的長度上確定相同性百分比(即缺口比對)。為了獲得用于比較目的的空缺比對，可使用gappedblast，如altschul等((1997)nucleicacidsres.25(17)：3389-3402)所描述的。在仍然另一實施方案中，通過引入適當的缺口來優(yōu)化比對，并且在比對的序列的整個長度上測定相同性百分比(即全局比對)。用于序列的全局比對的數學算法的優(yōu)選的非限制性實例是myers和miller，cabios(1989)的算法。這樣的算法被并入align程序(版本2.0)中，其是gcg序列比對軟件包的一部分。當利用align程序比較氨基酸序列時，可使用pam120權重殘基表、缺口長度罰分12和缺口罰分4。

優(yōu)選在sirna和靶基因的一部分之間有至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％或約100％的序列相同性?；蛘撸瑂irna可在功能上被定義為能夠與靶基因轉錄物的一部分雜交的核苷酸序列(或寡核苷酸序列)(例如400mmnacl，40mmpipesph6.4,1mmedta，50℃或70℃雜交12-16小時；然后洗滌)。其它示例性雜交條件包括在70℃下在1×ssc或50℃下在1xssc，50％甲酰胺中雜交，隨后在70℃下在0.3xssc中洗滌或在70℃下在4xssc或50℃下在4xssc，50％甲酰胺中雜交，然后在1×ssc中在67℃洗滌。預期長度小于50個堿基對的雜交體的雜交溫度應該比雜交體的解鏈溫度(tm)低5-10℃，其中根據以下等式確定tm。對于長度小于18個堿基對的雜交體，tm(℃)＝2(a+t個堿基的#)+4(g+c個堿基的#)。對于在18和49個堿基對長度之間的雜交體，tm((℃)＝81.5+16.6(log10[na+])+0.41(％g+c)-(600/n)，其中n是雜交體中的堿基數，[na+]是雜交緩沖液中的鈉離子濃度(1xssc的[na+]＝0.165m)。多核苷酸雜交的嚴格條件的其它示例提供于sambrook，j.，e.f.fritsch和t.maniatis，1989，molecularcloning：alaboratorymanual，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，ny，chapters9and11,andcurrentprotocolsinmolecularbiology，1995，fmausubeletal.,eds.,johnwiley&sons，inc.，sections2.10and6.3-6.4，通過引用并入本文。相同核苷酸序列的長度可是至少約10、12、15、17、20、22、25、27、30、32、35、37、40、42、45、47或50個堿基。

治療方法

在一方面，本發(fā)明提供了抑制實體瘤中酪蛋白激酶2表達的方法。本發(fā)明的方法包括施用靶向納米顆粒遞送多核苷酸至腫瘤，其中多核苷酸與酪蛋白激酶2核酸序列雜交并減少或抑制其表達。

在一方面，本發(fā)明提供調節(jié)實體瘤中酪蛋白激酶2的下游靶活性的方法。在一些實施方案中，酪蛋白激酶2的下游靶包括但不限于nf-κbp65、cdc37和akt。本發(fā)明的方法包括施用靶向納米顆粒遞送多核苷酸至腫瘤，其中多核苷酸與酪蛋白激酶2核酸序列雜交，并降低或抑制下游靶的活性和/或酪蛋白激酶2活性的下游標記，包括例如ki-67。

在另一方面，本發(fā)明提供減少實體瘤的大小或抑制或穩(wěn)定對象中實體腫瘤生長的方法。本發(fā)明的方法包括施用靶向納米顆粒遞送多核苷酸至腫瘤，其中多核苷酸與酪蛋白激酶2核酸序列雜交并減少或抑制其表達。在某些實施方案中，將多核苷酸遞送至腫瘤的靶向納米顆粒導致實體瘤大小減小或實體瘤生長的穩(wěn)定或抑制。

如本文所用，術語“對象”是指任何動物(例如哺乳動物)，包括但不限于人、非人靈長類動物、脊椎動物、嚙齒動物等諸如此類，其將是特定治療的接受體。術語“對象”、“患者”和“個體”在本文中可互換使用。

在一些實施方案中，所述靶是體外生物系統(tǒng)，例如體外組織或細胞，并且所述方法包括使靶與本文所述的納米顆粒接觸。

在一實施方案中，用于結合到酪蛋白激酶2的寡核苷酸具有seqidno：8(對于靶向酪蛋白激酶2α)或seqidno：9(對于靶向酪蛋白激酶2α’)所示的序列。在根據本發(fā)明的納米顆粒的組合物的一實施方案中，納米顆粒包含多個多核苷酸，其中所述多個多核苷酸中包含seqidno：8的百分比為平均大于約1％且小于約100％，大于約30％且小于70％，大于約40％且小于約60％，大于約45％且小于約55％，大于約48％且小于約52％，大于約49％且小于約51％，或為約50％，且所述多個多核苷酸的其余部分包含seqidno：9。影響每種多核苷酸序列的百分比的因素包括，例如在制備納米顆粒時摻入的每種多核苷酸的相對體積，或每種多核苷酸的相對包封百分比。組成組合物的多核苷酸可使用本領域已知的取樣方法確定，例如雜交測定和功能性細胞測定。

在根據本發(fā)明的納米顆粒的組合物的一實施方案中，納米顆粒的混合物包含多核苷酸，其包含seqidno：8或seqidno：9。在根據本發(fā)明的納米顆粒組合物的另一實施方案中，包含含有seqidno：8的多核苷酸的納米顆粒的百分比為大約10％、大約20％、大約30％、大約40％、大約50％、大約60％、大約70％、大約80％或大約90％，且包含多核苷酸的組合物的納米顆粒的其余部分包含seqidno：9。

預期通過本發(fā)明的方法治療的代表性腫瘤包括與某些癌癥相關的腫瘤，包括但不限于乳腺癌、肺癌(包括非小細胞肺癌)、前列腺癌、結腸直腸癌、腦癌、食管癌、腎癌、膀胱癌、胰腺癌、宮頸癌、頭頸癌、皮膚癌、鼻咽癌、脂肪肉瘤、上皮癌、腎細胞癌、膽囊腺癌、腮腺癌、卵巢癌、黑素瘤、淋巴瘤、神經膠質瘤和子宮內膜肉瘤。

在一實施方案中，通過本發(fā)明的方法的治療包括向診斷為患有實體瘤癌癥的患者施用。本文所用的“實體瘤”是指由細胞增殖產生的異常大量的組織。實體瘤可在身體的任何部分產生，并且可以是良性的(非癌性)或惡性的(癌性)。除白血病之外的大多數類型的癌癥可形成實體瘤。實體瘤包括但不限于腺癌、癌、血管瘤、脂肪肉瘤、淋巴瘤、黑素瘤和肉瘤。短語“實體瘤”也可用于指諸如子宮內膜異位癥的病癥，即由細胞的不受控增殖引起的病癥。

腱生蛋白(tenascin)是一種大的糖蛋白，顯示出在實體瘤的微環(huán)境中過表達(brellier，etal.2011jcellmolecmed16:32-40)。在腫瘤細胞上發(fā)現腱生蛋白的受體，為通過使用具有腱生蛋白-定向的配體的治療性納米顆粒治療實體瘤癌癥的有吸引力的靶。在腫瘤細胞上發(fā)現的腱生蛋白受體的非限制性實例包括整聯(lián)蛋白αv、α2、β1和β3。本領域技術人員，一旦獲得本公開內容，將能夠在無需過多的實驗的情況下鑒定、制備和開發(fā)至實體腫瘤的腱生蛋白定向的配體納米顆粒，用于將生物活性劑靶向和遞送到實體腫瘤。這種腱生蛋白定向的配體的非限制性實例包括腱生蛋白-c、腱生蛋白-w及其片段，包括但不限于tenfibgen。

在一實施方案中，本發(fā)明的納米顆粒組合物可用于治療任何病癥，其中抑制靶基因的表達可能有用。在另一實施方案中，組合物可用于治療患有增殖性疾病的對象。“增殖性疾病”是指影響器官、腔或身體部分的任何一種或任何組合的任何人或動物疾病或紊亂，其特征在于細胞、細胞群或組織的單個或多個局部異常增殖，無論良性還是惡性。

術語“治療(treatment)”、“治療(treating)”等諸如此類意在表示在一個或多個場合施用治療劑、疫苗或診斷劑，目的是獲得或評估在對象中期待的藥理學和/或生理學效果。就完全或部分地預防疾病或其癥狀而言，效果可是預防性的，和/或就完全治愈疾病和/或歸因于疾病的不良反應(癥狀)而言，效果可是治療性的。本文所用的“治療”涵蓋對對象的疾病的任何治療，包括但不限于：(a)在可能易患但尚未診斷為患有疾病或病癥的個體中預防疾病或病癥的發(fā)生；(b)消除或抑制疾病(例如阻止其發(fā)展)；或(c)緩解疾病(例如減少或消除與疾病相關的癥狀)。

在另一方面，本發(fā)明提供長度最多約50個核苷酸的單鏈(ss)寡核苷酸，其包括seqidno：8的至少8個連續(xù)核苷酸的一部分，其中所述ss寡核苷酸抑制人酪蛋白激酶2α的表達。在另一方面，本發(fā)明提供長度最多約50個核苷酸的ss寡核苷酸，其包括seqidno：9的至少8個連續(xù)核苷酸的一部分，其中所述ss寡核苷酸抑制人酪蛋白激酶2α’基因的表達。

施用

本文描述了本發(fā)明的治療性組合物的制劑及其隨后的施用，并且可由本領域普通技術人員實施。一般而言，對于治療，向需要治療的患者提供根據本發(fā)明的組合物，劑量和新方案策略如本文別處所述。在本發(fā)明的一些實施方案中，基于患者的體重或表面積、年齡和所治療的疾病或病癥的嚴重程度中的一或多種來確定施用。

在一實施方案中，用納米顆粒組合物治療對象，所述納米顆粒組合物例如包含多核苷酸，以相對于合適的對照而言足以減少、穩(wěn)定或抑制靶基因表達的劑量/量治療。在另一實施方案中，用單鏈多核苷酸以足以相對于合適的對照減少、穩(wěn)定或抑制靶病變的劑量/量治療對象。在另一實施方案中，生物活性劑(例如多核苷酸)的劑量等于或小于約20mg/kg體重，小于約10mg/kg體重，或小于約5mg/kg體重。在其它實施方案中，生物活性劑，例如單鏈嵌合多核苷酸，以小于約4mg/kg體重，小于約3mg/kg體重，小于約2mg/kg體重，小于約1mg/kg體重，小于約100μg/kg體重，小于約100納克(ng)/kg體重，小于約10ng/kg體重，小于約1ng/kg體重，小于約100皮克/kg體重，小于約10pg/kg體重，小于約1pg/kg體重，小于約100飛克(fg)/kg體重，小于約10fg/kg體重，小于約1fg/kg體重，小于約100阿克(attogram，ag)/kg體重，小于約10ag/kg體重，或小于約1μg/kg體重進行遞送?？苫诶鐚ο蟮捏w表面積開發(fā)和使用類似的劑量范圍。

治療方案可持續(xù)一段時間，該時間段將根據特定疾病的性質、其嚴重程度和患者的總體狀況而變化，并且可從每日一次延長至每30年一次。在治療之后，可以監(jiān)測患者他/她體內的狀況的變化和疾病或紊亂狀態(tài)的癥狀的緩解。生物活性劑的劑量可在患者對當前劑量水平沒有顯著反應的情況下增加，或者如果觀察到疾病或紊亂的癥狀減輕，或者如果疾病或紊亂已被消融，則劑量可降低。

給藥取決于待治療的疾病病情的嚴重性和反應性，治療過程持續(xù)數天至數月，或直到實現治愈或實現疾病或紊亂的減輕。最佳給藥方案可例如根據患者體內生物活性劑累積的測量來計算。普通技術人員可容易地確定最佳劑量、給藥方法和重復率。最佳劑量可根據單個化合物的相對功效而變化，并且通?？苫诶缭隗w外和體內動物模型中發(fā)現的有效的ec50來估計?？衫缑刻?、每周、每月或每年一次或多次，或甚至每2-30年一次給予劑量。

在一些實施方案中，本發(fā)明的方法包括涉及將值、水平、特征、特性、性質等與“合適的對照”，在本文中可互換地稱為“適當的對照”，進行比較的步驟。“合適的對照”或“適當的對照”是本領域普通技術人員熟悉的用于比較目的的任何對照或標準。在一個實施方案中，“合適的對照”或“適當的對照”是在施用本文所述的納米顆粒組合物之前確定的值、水平、特征、特性、性質等。例如，可在將本發(fā)明的納米顆粒的組合物引入細胞或生物體之前確定轉錄速率、mrna水平、翻譯速率、蛋白質水平、生物活性、病變尺寸、細胞特征或性質、基因型、表型等。在另一個實施方案中，“合適的對照”或“適當的對照”是在細胞或生物體例如對照或正常細胞或表現正常性狀的生物體中確定的值、水平、特征、特性、性質等。在另一個實施方案中，“合適的對照”或“適當的對照”是預定義的值、水平、特征、特性、性質等。

在另一方面，本發(fā)明提供了治療方法，其包括向有需要的對象中施用治療有效量的根據本發(fā)明的納米顆粒的制備的組合物中的生物活性劑。術語“治療有效量”，例如生物活性劑，是指能夠獲得理想表型或進行理想治療功能的量，例如穩(wěn)定、減緩、減少、消除或預防疾病或紊亂(或這種疾病或紊亂的癥狀)。所需的確切量將根據已知的變量而變化，例如所用的生物活性劑、對象的狀況和治療方案的參數。因此，既不可能也不要求指定精確的“治療有效量”。相反，適當的有效量可由本領域普通技術人員使用常規(guī)實驗確定。

本發(fā)明的組合物可通過多種途徑施用，這取決于是否期待局部或全身治療以及待治療的區(qū)域。施用可是局部(包括眼的、陰道、直腸、鼻內、經皮)、口服或胃腸外。腸胃外施用包括但不限于靜脈內、皮下、腹膜內或肌內注射、腫瘤內、或鞘內或心室內施用。不希望受理論束縛，顆粒(組合物)施用選擇的靈活性部分地通過本發(fā)明組合物的高度穩(wěn)定性的納米顆粒的小尺寸和低表面電荷來實現，從而允許顆粒及其藥物載荷穿越生物屏障和限制尺寸的結構，例如血流壁、淋巴管道和皮膚，以到達細胞和分子靶標。

本發(fā)明組合物的納米顆粒的“低表面電荷”通常是指在約-20和約+4毫電子伏特(mev)之間的平均表面電荷，不過本領域技術人員將理解本發(fā)明的納米顆粒具有平均在該范圍之外的表面電荷仍然可以用于治療目的，如果納米顆粒保持其球形或橢圓形狀、亞50納米尺寸和結晶形式。

在一實施方案中，本發(fā)明提供了治療對象中的疾病或紊亂的方法，其目的是獲得期待的表型或進行期待的功能，例如穩(wěn)定、減緩、減少或消除這種疾病或紊亂(或疾病或紊亂的癥狀)，例如但不限于增殖性疾病，例如但不限于癌癥，包括在適于治療疾病或紊亂的條件下向對象施用治療有效量的納米顆粒組合物，其中所述納米顆粒包含膠束核心，所述膠束核心包含生物活性劑，所述生物活性劑包含seqidno：8和seqidno:9的混合物、hlb值小于或等于約6.0的表面活性劑、吸附到所述膠束核心并包含tenfibgen、li⁺和cs⁺并且具有小于約50納米的平均直徑的殼，其中所述納米顆粒通過一種或多種上述途徑施用。在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括用cs⁺預處理li⁺。在一個實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸被引入的量可允許遞送至少約1、5、10、50、100、500或5000個多核苷酸每靶細胞。

基于下面實施例中描述的工作，下面舉例說明本發(fā)明的一些益處和優(yōu)點。用無菌水和預先與li⁺混合的cs⁺制備的穩(wěn)定的tenfibgen-殼亞50納米納米顆粒，并且包封寡核苷酸的混合物，其包含2r-修飾的抗ck2seqidno：8和seqidno:9，在30天時間內顯著抑制小鼠中的腫瘤生長(下表3)。分析用混合物處理后的腫瘤還顯示對ki-67(細胞增殖的標志物)和nf-kb(炎癥的標志物)的顯著抑制。在相似的實驗條件下，僅用納米包封的2r-修飾的seqidno：8處理的小鼠顯示腫瘤重量和nf-kb相對于對照的降低，但是變化不顯著，并且治療組的ki-67指數相對于對照增加。類似地，僅用納米包封的未修飾的寡核苷酸混合物(seqidno：5和seqidno:6)處理的小鼠顯示腫瘤重量增加，ki-67和nf-kb的變化很小。

納米顆粒的制備

可用于制備靶向亞50納米顆粒的方法的以下描述僅意味著是代表性的，而不意味著限制。美國專利no.6,632,671、美國專利no.7,741,304和美國專利公開號no.2013/0267577，通過引用并入本文，公開了未修飾的納米顆粒的制備。簡言之，帶負電荷的生物活性劑，例如待靶向和遞送到例如腫瘤細胞的核酸，可與聚陽離子聚合物復合，以將其尺寸縮小或降低至約50nm或更小。許多不同的聚陽離子聚合物(也稱為“縮合”試劑或蛋白質)可被使用并且是本領域公知的(rolland1998,crit.rev.therapeuticdrugcarr.syst.,15:143-198)。例如，足夠的聚陽離子縮合蛋白可與帶負電荷的載荷部分復合，以中和至少約75％(例如約80％、85％、90％、95％、99％或100％)的帶負電荷的載荷部分，其對于核酸而言，可通過乙錠染料排除(示例見(1998，j.controlledrelease，53：289-99))來測量。簡單地作為示例，125μg的10kd聚鳥氨酸可被用于縮合500μg的20-mer寡聚核苷酸，或87.5μg的精胺可被用于縮合250μg的14kdsirna寡核苷酸。對于缺少負電荷或帶正電荷的載荷部分，可能不需要縮合聚陽離子聚合物。

可通過首先使用適合于制備反相或反膠束的生物相容的、水不溶性表面活性劑體系將所述載荷部分分散到生物相容的、水混溶性溶劑中來包封復合或未復合的載荷部分的水溶液。合適的表面活性劑體系在制劑領域中是眾所周知的兩親性材料，其實質上是疏水的，并且其特征在于親水親油平衡(hlb)小于約6，臨界膠束濃度(cmc)小于約200μm，或臨界填充直徑大于1。在一些實施方案中，hlb小于約5。適用于制備反膠束的疏水表面活性劑和疏水性、水混溶性溶劑描述于pashley&karaman(2004，inappliedcolloidandsurfacechemistry，johnwiley，pp.60-85)，rosen(2004，insurfactantsandinterfacialphenomena，johnwiley)，thehandbookofindustrialsurfactants(1993，ash，ed.，gowerpub)和perry’schemicalengineer’shandbook(1997，perry&green，7thed.，mcgraw-hillprofessional)，通過引用并入本文。

在一些實施方案中，表面活性劑組分可是2,4,7,9-四甲基-5-癸炔-4,7-二醇(tm-二醇)、2,4,7,9-四甲基-5-癸炔-4,7-二醇(tm-二醇)，具有一個或多個炔二醇基團、鯨蠟醇或任何這些的任何組合的分子。在一些實施方案中，可使用包含食品或usp級油的水混溶性溶劑，例如dmso、dmf、蓖麻油或其任何組合。在一個實施方案中，疏水性表面活性劑可是2,4,7,9-四甲基-5-癸炔-4,7-二醇(tm-二醇)或其制劑，例如se-30(airproducts)，用于濃度高達表面活性劑膠束量的約0.5重量％，水混溶性溶劑可是dmso。所選擇的表面活性劑的濃度應當足以制備光學透明的納米乳液，但是不會多到誘導聚集，因為聚集可以導致過大的納米顆粒。

攜帶載荷部分的膠束(即表面活性劑膠束)可通過將一或多個靶向部分與納米顆粒的水性稀釋液混合而用腫瘤靶向部分(例如tenfibgen)包被。在一些實施方案中，靶向部分可以約1:500至約1:0.1的靶向部分與生物活性劑的比例(以重量計)與納米顆?；旌?，這取決于包括靶向部分以及納米顆粒期待溶解或分解的速率因素。在一實施方案中，靶向部分與生物活性劑的重量比約為1:90(即1/90^th)。在一實施方案中，靶向部分與生物活性劑的重量比約為1:40。

納米粒子配體可通過設計以增強最終納米粒子功能的方法被修飾。作為非限制性示例，通過在用已知水平的重金屬制備的飽和硫酸銨溶液中再沉淀蛋白質，包被配體可容易地用藥學上可接受的重金屬修飾。在通過離心回收金屬修飾的包被配體之前，最快速地將大約0.1-1mg/ml的蛋白質配體溶液與飽和硫酸銨溶液以1:1的比例溫育約4-36小時。超純硫酸銨中的金屬濃度范圍可為例如1份/千-1份/1萬億。作為另一個非限制性示例，可使用含金屬的硫酸銨從細胞培養(yǎng)物上清液中沉淀腱生蛋白多肽，使已知促進氧化應激反應的金屬在納米顆粒制備之前被吸附到包被配體上。

為了穩(wěn)定配體吸附的納米顆粒，包被有一或多種配體的納米顆粒的水性懸浮液能夠被混合到能與包被的納米顆粒沉淀、結晶或離子電滲交換的金屬離子的水溶液(即“穩(wěn)定溶液”)中。可用于形成包被的納米顆粒的溶質的代表性非限制性示例包括衍生自周期表中所列元素的離子物質。離子可被包括在水性穩(wěn)定化組合物中，其范圍為約例如0.1份/兆-約1摩爾(m)。應包括足夠量的離子，使得包被的納米顆粒與離子充分接觸，但不會太多以致發(fā)生聚集，這可導致過大的納米顆粒。

在一個實施方案中，穩(wěn)定(或結晶或接收)溶液可包含約10毫摩爾(mm)ca²⁺和約126mmli⁺。如果在穩(wěn)定溶液中使用超純試劑，可加入非常少量(例如小于約1mm)的離子如ba、fe、mg、sr、pb和zn以優(yōu)化包被的納米顆粒的穩(wěn)定性。在一個實施方案中，當用無菌水制備納米顆粒時，用2.5ppb的cs⁺預處理126mm的li⁺以提高穩(wěn)定性。在一個實施方案中，穩(wěn)定溶液包括10mmca²⁺、126mmli⁺(與2.5ppbcs⁺預混合)、0.042mmba²⁺與14nmsr²⁺、6.25nmmg²⁺(全部超純，全部使用無菌水制備成儲備溶液，除了sr²⁺和mg²⁺是用實驗室級水制備的，所有金屬作為氯化物鹽使用，總液體積約30ml)。系統(tǒng)的靈活性由顯示高水平的細胞攝取的納米顆粒證實，其在比本文所述的低約10倍鋰水平下合成(數據未顯示)。技術人員將理解，多種抗衡離子可與穩(wěn)定溶液中的這些金屬一起使用，例如氯化物、硫酸鹽和硝酸鹽。

關于鹽和金屬所使用的術語“超純”是指大約或大于99％純度或可獲得的最高純度的鹽和金屬。技術人員將理解，超純鹽和金屬通常是可商購的，并且如果需要，改變這種超純材料中的含量對納米顆粒制劑的改變影響可在沒有過度實驗的情況下解決，例如通過調節(jié)在之前使用的制劑中的其他鹽和金屬的底線水平。降低制劑中鋇的水平可例如抵消氯化鈣二水合物中雜質水平的增加，以保持配制的納米顆粒的尺寸、形狀和/或功能。如本文所用，“實驗室級”鹽和金屬是指不是超純的鹽和金屬。為了保持給定制劑線系列的納米顆粒尺寸、形狀和/或功能的一致性，建議使實驗室級鹽和金屬的使用最小化，例如小于25％、20％、15％、10％、或5％加入到最終的鹽接收溶液中的鹽和金屬的總重量。

在一個實施方案中，銫(cs)-預處理的鋰納米顆粒包括與未用cs預處理的納米顆粒不同的多晶型形式。這種不同通過例如下表1中呈現的cs和非cs納米顆粒的熔點和ftir光譜的實質性差異來證明。如本文所用，術語“多晶型物”和“多晶型形式”是指化合物或復合物的固體晶體有序形式。

可通過結晶產生感興趣的化合物例如納米顆粒的一或多種固體形式。一或多種固態(tài)形式也可通過化學物質與不同客體分子(即不是晶格的主要組分的組分)共結晶而產生。一或多種固體形式也可通過將元素或元素-組合物包含在超分子組裝中或添加新元素或元素-組合物以產生新的超分子組裝。

在結晶的現象中是成核和生長的過程。晶體成核是從液體、過飽和溶液、飽和蒸氣或非晶相形成有序固相。生長是由分子在現有表面上的沉積引起的晶體的增大。成核可通過“種子”晶體的存在來誘導。存在一些固體顆粒以提供催化效果并降低形成新相的能量勢壘。晶體可起源于例如作為成核位點的異物(例如容器壁上的雜質或劃痕)的微小痕跡。成核也可通過外部或非化學手段促進，例如攪拌結晶環(huán)境，或通過施加起始表面和物理能，例如可以通過將超小納米級膠束霧化成鹽溶液的過程觀察。

實際上，化合物(例如納米顆粒)的多晶型和新型形式在制藥領域中是已知的影響例如化合物的溶解度、穩(wěn)定性、流動性、斷裂性和壓縮性(knapman,k.2000moderndrugdiscovery3：53-58)。因此，發(fā)現納米顆粒藥物的新的多晶型物或高度相關的結構形式可提供多種優(yōu)勢。

可使用熟知的技術來檢測、辨識、分類和表征多晶型物，例如但不限于差示掃描量熱法(dsc)、熱重量分析法(tga)、x射線粉末衍射法(xrpd)、單晶x射線粉末衍射法、振動光譜法、溶解量熱法、固體核磁共振(nmr)、紅外(ir)光譜、傅里葉變換紅外光譜(ftir)、拉曼光譜、熱臺光學顯微鏡、掃描電子顯微鏡(sem)、透射電子顯微鏡(tem)、電子晶體學和定量分析、粒度分析(psa)、表面積分析、溶解度和溶解速率。

如本文所用，關于最初以圖形形式(例如xrpd、ir、ftir、拉曼和nmr光譜)產生的光譜或數據，并且除非另有說明，術語“峰”是指峰或其它特殊特征，本領域技術人員將認識到不歸因于背景噪聲。由于峰值檢測中的機器和/或算法變化性，可能發(fā)生解釋或讀取峰定位的一些有限差異。

雖然不希望受理論束縛，但下表1中給出的材料科學數據表明添加痕量的銫(以元素組合物的形式，即銫處理的鋰)，與非銫納米顆粒相比令人驚訝地引起本發(fā)明的納米顆粒的熔點和ftir光譜的顯著變化。熔點的變化暗示與物理狀態(tài)變化相對應的新的多晶型形式。表1中呈現的數據將測量的熔點變化與納米顆粒穩(wěn)定性的增加聯(lián)系起來，通過改進的運輸性能和延長的伯頓衍生的體外釋放時間體現。

如本文其他地方所討論的，用銫處理的鋰制備的納米顆粒在尺寸和形狀(低于50nm球體、立方體或橢球體)方面形成合適的納米顆粒，而與在鹽接收液中與鋰簡單混合的用銫配制的納米顆粒。這支持了引入元素組合物即銫處理的鋰而不是簡單地添加銫的觀察，其誘導上述熔點的顯著變化和伴隨的改進的穩(wěn)定性。

在一個實施方案中，具有疏水膠束核、配體殼和包封的生物活性劑的經cs預處理的鋰亞50納米納米顆粒包含超分子組裝的新型多晶型形式(在本文中稱為cs多晶型納米顆粒)，其表觀分子重量大于10,000道爾頓、大于20,000道爾頓或大于30,000道爾頓。技術人員可通過標準方法，例如超高分辨率水性尺寸排阻色譜法(ultrahighresolutionaqueoussizeexclusionchromatography)，使用例如yarra3usec-2000，30cm×7.8mm柱和uv檢測以及0.3mnacl在0.1m磷酸鹽緩沖液(ph7)中的流動相來確定表觀分子重量。

在一個實施方案中，銫和鋰的元素組合產生可以在水性環(huán)境中形成、使用和/或儲存的cs多晶型納米顆粒。

在另一個實施方案中，cs多晶型納米顆粒的配體殼包含tenfibgen。仍然在另一個實施方案中，cs多晶型納米顆粒的配體殼包含透明質酸。

具有低表面電荷，優(yōu)選盡可能接近中性或甚至微負性電荷和/或具有緊湊或大致球形、長方體或橢球形形狀的納米顆粒例證了優(yōu)化的穩(wěn)定性。另外，可包括能夠提高納米顆粒的穩(wěn)定性的任何其它組分作為穩(wěn)定溶液的一部分，使得納米顆粒的最終平均直徑在約例如5-50nm的范圍內。在某些實施方案中，根據本發(fā)明的組合物的納米顆粒具有約5至約50納米、約5至約40納米、約5至約30納米或約5至約20納米的平均直徑。

可通過參數的常規(guī)變化來操作顆粒尺寸，包括例如在鹽接收溶液中結晶后的溫育時間的長度。在一實施方案中，通過原子力顯微鏡(afm)測量納米顆粒。在另一實施方案中，通過透射電子顯微鏡(tem)測量納米顆粒。在另一實施方案中，通過動態(tài)光散射(dls)測量納米顆粒。在另一實施方案中，通過尺寸排阻色譜法(sec)測量納米顆粒。在另一實施方案中，通過本領域已知的方法在干燥狀態(tài)下測量納米顆粒。除非另有說明，平均直徑在本文中表示為在干燥狀態(tài)下測量的納米顆粒的長軸和短軸的平均值。通常，具有大于約約10：1、約5：1或約3：1的平均長-短-尺寸比的納米顆粒的制劑或組合物不適用于本文預期的用途。

對于尺寸更一致的納米顆粒，納米顆?？扇芜x地通過噴嘴霧化成接收溶液。霧化應當足以施加剪切力，該剪切力能夠分解絮凝聚集體而沒有如此大的力以誘導硬聚集體。本領域技術人員將理解，特定的噴嘴直徑將導致適于將納米顆粒霧化成合適且一致尺寸的進料壓力范圍。在一實施方案中，當進料壓力小于約10psi時，約250微米或更小的噴嘴直徑產生合適的納米顆粒。

穩(wěn)定的納米顆?？稍诓煌臅r間和溫度下溫育，這取決于終端使用中顆粒溶解或拆解所需或期望的時間。溫育時間可為約8小時至約7天。在一些實施方案中，將納米顆粒在圓底管中在4℃下標稱旋轉溫育36至48小時。不希望受理論束縛，較長的溫育時間導致較高的結晶，其增加顆粒的尺寸和穩(wěn)定性。在穩(wěn)定溶液中霧化和/或溫育納米顆粒之后，可過濾、離心和/或干燥納米顆粒以獲得包含單個的和離散的亞50nm納米顆粒的組合物。在一個實施方案中，將納米顆粒在20,000xg、4℃下離心2小時，并通過0.2μm過濾器無菌過濾。所得納米顆?？稍诩s-20℃下冷凍或干燥并重新配制用于以后使用。被制備為嵌合多核苷酸的序列任選地丙基封閉3’末端。

在一個實施方案中，在沒有聚乙二醇(peg)和一般用于穩(wěn)定納米顆粒的類似物質的情況下制備納米顆粒。在另一個實施方案中，可使用本領域已知的標準方法將納米顆粒凍干并以較低、相同或較高的濃度重懸。

盡管已經參照多個實施方案具體展示和描述了本發(fā)明，但是本領域技術人員應當理解，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可對本文公開的各種實施方案進行形式和細節(jié)的改變，并且本文公開的各種實施方案不旨在限制權利要求的范圍。

將在以下實施例中進一步描述本發(fā)明，這些實施例同樣不旨在限制權利要求中描述的本發(fā)明的范圍。

實施例

實施例1-靶向治療性納米顆粒的制劑。

包含不同載荷和靶向部分的示例性納米顆粒如下產生。

配方a：在2ml錐形管中，加入500μg針對ck2的嵌合寡聚(seqidno：5)多核苷酸(磷酸二酯3’和丙基封端的2’-omerna嵌合體、“l(fā)ck-6”(美國專利號7,741304，通過引用整體并入本文))到無菌水中(hplc級，fisher)以1mg/ml的濃度短暫渦旋，然后與200μg的10kd聚鳥氨酸(sigma)復合，并使用水不溶性表面活性劑體系(tm-二醇共混物(se-30，airproduct)將其分散在150μl的無菌水中，10μg在10μgdmso中。在用水混溶性溶劑(dmso)乳化之后，通過加入150μl的dmso，渦旋，隨后置于浴超聲發(fā)生器(bathsonicator)中5分鐘，然后倒置復合物并通過加入700μl的pbs稀釋。

通過加入5.5μg通過aukhill等(j.biol.chem.，268：2542-53(1993))方法制備的腱生蛋白的重組纖維蛋白原片段(tbg)來包被(非共價地)所得的疏水膠束，將其如本文所述進行修改，置于浴超聲發(fā)生器中15分鐘，轉移至5ml聚丙烯管中，用pbs稀釋至3ml，然后使用具有小于約10psi的進料壓力的約250μm直徑孔口的手動致動器，將其霧化入主要含有l(wèi)i⁺(126mmli⁺(將li⁺與2.5ppbcs⁺預混合)、10mmca²⁺、0.042mmba²⁺具有14nmsr²⁺、6.25nmmg²⁺(全部超純，全部使用無菌水制備成儲備溶液，除了用實驗室級水制備的sr²⁺和mg²⁺，所有金屬都用作氯化物鹽，總浴體積約30ml)的無菌水的鹽接收溶液中。總反應體積為36ml。在用于制備穩(wěn)定溶液的無菌水中測試的以下金屬的水平被確定為總和小于百萬分之0.1：鋁、砷、鋇、鎘、鉻、銅、鐵、鉛、錳、鎳、銣、硫、釩和鋅。

預混合步驟包括在50ml管中的無菌水中加入約0.1μg/1ml的cs⁺到約4mli中，約重量計2.5ppmcs⁺到li⁺，并旋轉約2分鐘。在冷室溫育(4℃)在40ml圓底管中標稱旋轉48小時后，其進一步穩(wěn)定在鹽溶液中包被的膠束，通過在4℃下以20,000xg離心2h回收亞50nm的納米顆粒并在pbs+10％乳糖醇(濃度為1μg/μl)中重懸，轉移到2ml錐形中，并在4℃下以最大速度離心5分鐘，將沉淀重懸在pbs/10％乳糖醇進行洗滌，通過0.2μm過濾器除菌，并在-20℃下冷凍。

在本實施例中描述的所有制劑中，將少量(1％的包被重量)的敘利亞倉鼠igg“摻入”配體包被，以能夠通過抗敘利亞倉鼠抗體對納米顆粒的攝取進行免疫檢測。平均顆粒尺寸小于50nm，通過輕敲式原子力顯微鏡(tappingmodeatomicforcemicroscopy)，使用在云母片上干燥的1e^(-27)g/ml樣品的橢圓直徑進行測量。平均顆粒尺寸表示為測量的納米顆粒的長軸和短軸的平均值。afm測量進一步由tem負染色支持，其中將1ng/ml懸浮液點在碳網上。nihimagej用于計算平均粒徑。最典型地，平均顆粒尺寸的范圍為約8納米至約30納米。配方a通過tem測量具有16±2.3nm的平均粒徑，通過zetasizer4動態(tài)光散射裝置在20伏的電勢下測量的表面電荷為-2.4±2.3mev，在1mmkcl，2μg/ml中測量之間具有2分鐘暫停。

基于腱生蛋白的配體：腱生蛋白與癌癥活動有關也特別與平滑肌細胞有關；此外，已經鑒定了腱生蛋白的肽結構域，例如在美國專利號no.6,124,260中，并且是本領域已知的。在一實施方案中，適用于本發(fā)明的腱生蛋白是智人(h.sapiens)腱生蛋白c，genbank登錄號nm_002160。此外，腱生蛋白肽和用于與特定細胞類型粘附的結構域以及腱生蛋白的功能和結構方面，已經被公開并且是本領域已知的，例如aukhill等1993jbiolchem268:2542-2553。腱生蛋白和/或其任何結構域適合作為本發(fā)明的配體。在一個實施例中，腱生蛋白的纖維蛋白原片段(在本文中也被稱作腱生蛋白c或tenfibgen或tbg的fbg-l域；在本發(fā)明的一個實施例中使用tenfibgen的核苷酸序列如下(atgattggactcctgtaccccttccccaaggactgctcccaagcaatgctgaatggagacacgacctctggcctctacaccatttatctgaatggtgataaggctcaggcgctggaagtcttctgtgacatgacctctgatgggggtggatggattgtgttcctgagacgcaaaaacggacgcgagaacttctaccaaaactggaaggcatatgctgctggatttggggaccgcagagaagaattctggcttgggctggacaacctgaacaaaatcacagcccaggggcagtacgagctccgggtggacctgcgggaccatggggagacagcctttgctgtctatgacaagttcagcgtgggagatgccaagactcgctacaagctgaaggtggaggggtacagtgggacagcaggtgactccatggcctaccacaatggcagatccttctccacctttgacaaggacacagattcagccatcaccaactgtgctctgtcctacaaaggggctttctggtacaggaactgtcaccgtgtcaacctgatggggagatatggggacaataaccacagtcagggcgttaactggttccactggaagggccacgaacactcaatccagtttgctgagatgaagctgagaccaagcaacttcagaaatcttgaaggcaggcgtaagcgggcataa)(seqidno：10))用作配體。腱生蛋白，其亞結構域或任何其他生物相容性聚合物配體可通過本領域已知的方法或技術人員可以容易地適應的方法表達或產生。為說明目的，下面提供生產tbg的方法。

tenfibgen(tbg)制備：對于所有tbg配方，除非另有說明，tbg通過修改后的aukhil的方法制備(jbiolchem(268)：2542-2553(1993))，即通過用裂解緩沖液(50mmtris-hcl、1.0mmedta、0.1mnacl、0.2mg/ml溶菌酶、0.1％tritonx-100、0.1mmpmsf，ph8.0)洗滌不溶性沉淀一次，從細菌裂解物中被分離并重折疊從細菌裂解物中分離并重折疊tbg，所述裂解緩沖液包含2m尿素，并重懸浮于4mgucl、5mmdtt的0.02mtris-hcl，ph8.0中。進一步離心后，將澄清的tbg溶液用2m胍-hcl、20mmtris-hcl，ph8.0稀釋，使最終的od280為約1，并逐滴滴入約10倍稀釋在n2鼓泡的20mmtris-hcl、0.2mnacl、0.5m精氨酸-hcl在室溫攪拌過夜溫育(4℃)。在用20mmtris-hcl，ph8.0透析滲濾后，濃度降低約4-5倍，并用0.45μm過濾，在20mmtris-hcl，ph8.0的肝素瓊脂糖凝膠上進行最后純化，通過洗脫使nacl濃度至0.6m。通過將ph10.5tenfibgen施加至用20mmnah2co³、0.2mnacl，ph＝10.5平衡的qfastflow樹脂，在陰離子交換層析步驟中去除內毒素，然后在最終0.2um過濾之前用h3po4再調節(jié)ph至7。在治療性腫瘤靶向制劑中，tbg在含有250ppbas⁺³、25ppmse⁺⁴、2.5ppmhg⁺²和25ppmmo⁺⁵的超純40％硫酸銨中再沉淀約16小時。

配方b：如配方a所述產生包被有tbg的亞50nm的納米顆粒，除了將6.3mcg的tbg加入到500mcg的2r-修飾的嵌合寡核苷酸(seqidno：8)中，與125mcg的10kd聚鳥氨酸(sigma)縮合。當產生這些納米顆粒時，將tbg包被的膠束霧化到配方a的鹽接收溶液中，除了以下改變的濃度：4.5nmsr²⁺，2.25nmmg²⁺。平均粒徑小于50nm(17.8±3.1nm)，通過使用點樣到碳網格上的1ng/ml樣品的橢圓直徑的負染色tem測量的，表面電荷為-7.7±4.2mev，通過在20伏電位下的zetasizer4動態(tài)光散射裝置在2μg/ml的1mmkcl中、測量之間具有2分鐘的暫停測量的。

配方c：如配方a所述產生包被有tbg的亞50nm的納米顆粒，除了將2.6mcg的tbg加入250mcg的嵌段寡核苷酸(seqidno：5和6，重量1：1)中并使用7.5μg表面活性劑膠束化。當產生這些納米顆粒時，將tbg包被的膠束霧化到以下改變了濃度的配方a的鹽接收溶液中：3.75nmsr²⁺，4.68nmmg²⁺。平均粒徑小于50nm(17.8±1.5nm)，通過使用點樣到碳網格上的1ng/ml樣品的橢圓直徑的負染色tem測量的，表面電荷為-12.3±3.5mev，通過在20伏電位下的zetasizer4動態(tài)光散射裝置在2μg/ml的1mmkcl中、測量之間具有2分鐘的暫停測量的。

配方d：如配方c所述產生用tbg包被的亞50nm的納米顆粒，除了寡核苷酸混合物由seqidno：5和7(重量1:1)組成。平均粒徑小于50nm(17±1.6nm)，通過使用點樣到碳網格上的1ng/ml樣品的橢圓直徑的負染色tem測量的，表面電荷為-7.1±5.4mev，通過在20伏電位下的zetasizer4動態(tài)光散射裝置在2μg/ml的1mmkcl中、測量之間具有2分鐘的暫停測量的。

配方e：如配方a所述產生包被tbg的亞50nm的納米顆粒，除了將3.1mcg的tbg加入到250mcg的2r-修飾的嵌合寡核苷酸(seqidno：8和9，重量1:1)中，與62.5mcg的10kd聚鳥氨酸(sigma)縮合并使用7.5μgtm-二醇進行膠束化。當產生這些納米顆粒時，將tbg包被的膠束霧化到以下改變了濃度的配方a的鹽接收溶液中：2.5nmsr²⁺，0.25nmmg²⁺。平均粒徑小于50nm(19.5±1.5nm)，通過使用點樣到碳網格上的1ng/ml樣品的橢圓直徑的負染色tem測量的，表面電荷為-5.8±3.9mev，通過在20伏電位下的zetasizer4動態(tài)光散射裝置在2μg/ml的1mmkcl中、測量之間具有2分鐘的暫停測量的。通過icp-aes評估鋰含量為5.39ngli⁺/μg寡核苷酸。(注意，對于類似的制劑，通過更敏感的icp-ms方法測量292pg/μg寡核苷酸的鋰含量)。

配方f：如配方a所述產生包被有tbg的亞50nm的對照納米顆粒，除了將6.3mcg的tbg加入到500mcg的2r-修飾的嵌合寡核苷酸(抗凝血因子vii，如akinc，etal.2008natbiotechnol26：5(561-9))，與125mcg的10kd多聚鳥氨酸(polyornthine)(sigma)縮合，并使用5μgtm-二醇進行膠束化。當產生這些納米顆粒時，將tbg包被的膠束霧化到以下改變了濃度的配方a的鹽接收溶液中：1.17nmsr²⁺，4.68nmmg²⁺。平均粒徑小于50nm(24.7±3nm)，通過使用點樣到碳網格上的1ng/ml樣品的橢圓直徑的負染色tem測量的，表面電荷為-7.6±2.4mev，通過在20伏電位下的zetasizer4動態(tài)光散射裝置在2mm/ml的1mmkcl中、測量之間具有2分鐘的暫停測量的。

配方g：如配方a所述產生包被有tbg的亞50nm的納米納米顆粒，除了穩(wěn)定溶液包含非無菌的實驗室級水并且氯化鋰原料沒有用銫或任何其它離子預處理。在用于制備穩(wěn)定溶液的水中測試的以下金屬的含量總計為約0.9ppm：鋁、砷、鋇、鎘、鉻、銅、鐵、鉛、錳、鎳、銣、硫、釩和鋅。在pbs+10％乳糖醇中離心后，將納米顆粒重懸。平均粒徑小于50nm(21.8±4nm)，通過使用點樣到碳網格上的1ng/ml樣品的橢圓直徑的負染色tem測量，表面電荷為-9.6±3.8mev，通過在20伏電位下的zetasizer4動態(tài)光散射裝置在2μg/ml的1mmkcl中、測量之間具有2分鐘的暫停測量的。

配方h：使用相同的lck寡核苷酸，如配方a中所述產生用tbg包被的亞50nm的納米顆粒。當產生這些納米顆粒時，將tbg包被的膠束霧化到基于硝酸鋰而不是氯化鋰的配方a的鹽接收溶液中，并且改變下列濃度：7.5nmsr²⁺，5.0nmmg²⁺。平均粒徑小于50nm(21.5±2nm)，通過使用點樣到的碳網格上的1ng/ml樣品的橢圓直徑的負染色tem測量的，表面電荷為-12.4±4mev，通過在20伏的電位下的zetasizer4動態(tài)光散射裝置在2μg/ml的1mmkcl中、測量之間具有2分鐘的暫停測量的。

配方i：如配方g中所述產生20kdmw透明質酸(重懸于hplc水中的透明質酸鈉粉末，lifecorebiomedical，lha，低分子量透明質酸)包被的亞50nm的納米顆粒，除了使用3.1mcg的ha(代替tbg)加入到首先與19.4μg的25kda聚乙烯亞胺(一種分枝的陽離子聚合物)(pei；sigmachemicalco.，st.louis，mo)復合的125mcg的質粒dna(pvivoβgal，invivogencorp.，10.5kb)(取代寡核苷酸)，然后用6.25ug的tm-二醇膠束化。當產生這些納米顆粒時，將lha包被的膠束霧化到配方g的鹽接收溶液中，改變以下濃度和添加量：2nmsr²⁺、0.5nmmg²⁺、0.54μmbi²⁺并加入0.40mmni²⁺(超純，基于40ml總體積)。平均粒徑小于50nm(20.4±2)，通過使用點樣到的碳網格上的1ng/ml樣品的橢圓直徑的負染色tem測量，平均表面電荷為-8.1±4.7mev，通過在20伏的電位下的zetasizer4動態(tài)光散射裝置在2μg/ml的1mmkcl中、測量之間具有2分鐘的暫停測量的。

配方j：如配方a所述產生用20kdmw透明質酸(重懸于hplc水中的透明質酸鈉粉末，lifecorebiomedical，lha，低分子量透明質酸)包被的亞50nm的納米顆粒，除了使用3.1mcg的ha(代替tbg)加入到首先與19.4μg的25kda聚乙烯亞胺(一種分枝的陽離子聚合物)(pei；sigmachemicalco.，st.louis，mo)復合的125mcg的質粒dna(pvivoβgal，invivogencorp.，10.5kb)(取代寡核苷酸)，然后用6.25μg的tm-二醇膠束化。當產生這些納米顆粒時，將lha包被的膠束霧化到配方a的鹽接收溶液中，改變以下列濃度和添加量：2nmsr²⁺、0.5nmmg²⁺、0.54umbi²⁺并加入0.40mmni²⁺(超純，基于40ml總體積)。平均粒徑小于50nm(22.7±5nm)，通過使用點樣到碳網格上的1ng/ml樣品的橢圓直徑的負染色tem測量的，平均表面電荷-6.4±4.2mev，通過在20伏電位下的zetasizer4動態(tài)光散射裝置在2mm/ml的1mmkcl中、測量之間具有2分鐘的暫停測量的。已經通過icp在相似的制劑中測量了8.1-13.1ng/μg的質粒的li⁺含量(數據未顯示)。

通過常規(guī)表征和tem，發(fā)現配方i和j的質粒s50顆粒在物理性質和可比較的tem方面與配方a-h的tbg包被的寡核苷酸顆粒相似。例如，不管核酸載荷，通過改進的burton方法(kren，etal.2009jci119：2086-99)確定的本文所述的配方的納米顆粒包封產率大于95％(數據未顯示)。包含寡核苷酸生物活性劑和蛋白質外殼的納米顆粒與包含質粒dna生物活性劑和碳水化合物外殼的納米顆粒之間的性質的相似性證明了納米顆粒制劑工藝的靈活性和所得納米顆粒組合物容納不同的生物活性劑、聚合物和配體部分。

實施例2-銫修飾的鋰離子在納米顆粒合成中提高穩(wěn)定性。

除了有效之外，納米顆粒劑型必須符合來自監(jiān)管的和其他部門的藥物制造和產品要求的要求。例如，納米顆粒的物理穩(wěn)定性是其監(jiān)管批準、影響配方、制造和儲存流程的關鍵組成部分。已經令人驚訝地發(fā)現，當在無菌水中操作時，將銫痕量添加入納米顆粒合成中導致改善的物理穩(wěn)定性，通過提高的運輸性能和伯頓衍生的穩(wěn)定性測量表明。

非常意外地，已經發(fā)現，在將接收溶液組裝成配體穩(wěn)定的膠束前，加入銫預處理的2.5ppb的鋰，其濃度四倍于攜帶寡核苷酸或質粒dna的納米顆粒，可作為液體制劑-4℃的空運運輸。這些觀察結果總結在表1中。在這些空運測試中，通過凍干、運輸來濃縮納米顆粒懸浮液，并且隨后在空運挑戰(zhàn)后通過tem顯微鏡檢查返回后的顆粒直徑的變化。在tem中，本發(fā)明的納米顆粒表現為包圍在可見但較差折射電暈中的立方或分形超分子組裝體，其包含靶向配體(數據未顯示)。例如，需要20mg/ml的懸浮液濃度以在低功率(1mw)動態(tài)光散射(dls)中獲得納米顆粒(直徑大小為約25納米)的光散射數據(即檢測)。相比之下，在相似dls條件下，在銫處理的鋰鹽接收溶液中溫育之前，當在尺寸上類似地小(直徑28nm，表1)時，配體包被的膠束在濃度約為1mg/ml時容易被檢測到，表明在溫育/穩(wěn)定步驟期間發(fā)生了納米顆粒超分子組裝的顯著變化(數據未顯示)。

在運輸和對照樣品中，通過在nih圖像j中的圖像分析來定量粒徑，作為擬合到來自tem顯微照片的粒子的橢圓形軸的平均值。結果總結在表1中以顯示對于攜帶寡核苷酸的未修飾的銫制劑(配方g)，平均粒徑從對照制劑到以3mg/ml空運的相同制劑增加了161％。運輸后還觀察到圍繞著小平面雙折射顆粒的蛋白質電暈的伴隨的損失(數據未顯示)。相比之下，類似的銫修飾制劑(配方a)在4mg/ml保持形狀和電暈(表1，數據未顯示)。

對攜帶市售的報道基因質粒并用透明質酸包被的一對制劑進行相同的分析，得到相似的結果。對于配方j，在接收浴中用銫預處理的鋰制備的顆?？梢栽黾?倍的濃度(2對0.25mg/ml)運輸，相對于不用銫預處理制備的配方i顆粒直徑增加小于15％。在具有增加的運輸濃度的非銫預處理的顆粒中也觀察到配體電暈的損失(數據未顯示)。用硝酸鋰而不是氯化鋰制備的配方h所示的運輸濃度的改進表明，可在納米顆粒合成中使用多種鋰鹽。在將銫和鋰加入到鹽接收溶液中之前預混合產生了合適的球體或立方體超小(lte50nm干直徑)形態(tài)的納米顆粒，銫和鋰未混合加入鹽接收溶液中不產生(數據未示出)。

表1.有+無銫修飾的粒子和運輸穩(wěn)定性

注釋：*＝p<0.5，1)在0.1ng/ml下通過負染色tem在x271,000下干燥后測量粒徑作為平均橢圓直徑。表示為平均值±se，每次分析15-20次測量。在運輸研究中使用之前，證實批次具有大量體外細胞攝取進入在3-d培養(yǎng)物中生長的腫瘤細胞。2)通過使用比色、改進的burton測定獲得的標準曲線結合dna摻入測量體外釋放。釋放被報告為從稍后的時間點插入的時間點，其中平均burton產率圍繞100％。3)從由差示掃描量熱法(dsc)產生的熱分析圖鑒定熱轉變。將懸浮液干燥以產生用于分析的粉末，并且在卷曲的鋁盤中以20℃/min從室溫掃描1-2mg至約400℃?？s寫，gt，玻璃化轉變；et吸熱；vs，非常小。4)tm-二醇是未配制的疏水性表面活性劑，并提供用于分析參考。配體包被的膠束是根據配方e配制的膠束，但在鹽接收溶液中溫育之前進行掃描。5)透明質酸包被的配體顆粒是與運輸樣品類似的制劑，但包含8.5kb報告基因質粒而不是10.5kb報告質粒。6)在這種形式的測定中約120小時后，在標準曲線中顏色開始降解，這里迫使測定過早終止。7)使用配備有atr附件、中紅外源作為激發(fā)源和dtgs檢測器的perkinelmerspectrum65記錄ftir光譜。以4cm^-1的分辨率在32次掃描中獲取光譜。懸浮液樣品在4℃下用3:1(v/v)的異丁基：異戊醇提取以除去殘留的表面活性劑并蒸發(fā)，干燥的粉末遞送用于分析?？s寫，v，非常；s，小；md，中等；str，強；brd，寬。

在接收溶液組裝之前用銫預處理鋰對顆粒穩(wěn)定性的影響通過檢查用于體外釋放的制劑進一步研究。體外釋放與顆粒降解基于修改的比色burton測定法(kren，etal。2009jci119:2086-99)相結合進行評估。在該測定中，將顆粒在56℃下在1mnaoh中溫育過夜，而不是6mnaoh。然后中和納米顆粒，并加入burton試劑以在與釋放的dna反應時產生藍色信號。百分產率相對于來自標準曲線的理論值表示，使得接近100％產率，因為納米顆粒被完全降解以釋放其內含物。然后將體外釋放表示為從圍繞100％產率的時間點內插的終點。因此，體外釋放時間是納米顆粒對降解的抗性的量度，并且其在cs-預處理后的增加對應于觀察到的針對寡核苷酸和質粒系列cs-處理的與非cs-處理的納米顆粒的運輸穩(wěn)定性的增加(表1體外釋放時間；csvs.非cs寡核苷酸，104小時vs.62小時；csvs.非cs質粒dna，>120小時vs.117小時)。

為了研究納米顆粒組合物的差異如何可在物理(釋放)和功能(運輸)水平上影響本發(fā)明的納米顆粒，對具有寡核苷酸和質粒的納米顆粒的干燥和粉碎的粉末的熱曲線通過在約25℃至約400℃的范圍內以10℃/分鐘的差示掃描量熱法(總結于上表1中)測量其可能的特征轉變的變化。在多次運行中，在非c修飾的配方g中觀察到在158℃有小轉變，隨后強的寬的吸熱(172-200℃)在180℃具有最低點，而觀察到c修飾的配方a僅有一個在275℃下的強吸熱，表明形態(tài)狀態(tài)的變化。類似地，對于具有8.5kb報道基因質粒的透明質酸納米顆粒，在非c修飾的化合物(代表配方i)中，在158℃下有小轉變，隨后強且寬的吸熱(172-227)在178℃具有最低點，與c修飾的化合物相比，其中觀察到在150℃下具有非常小的轉變(代表配方j)，在193℃、206℃和227℃觀察到強烈、非常尖銳的吸熱，再次表明形態(tài)狀態(tài)的變化。相比之下，稀釋劑(pbs+10％乳糖醇，非還原糖)的掃描在約160℃顯示非常小的轉變，在186℃顯示強的尖銳吸熱，其中以約310℃的中心附近降解吸熱。所有納米顆?；衔镲@示這種吸熱以307-313℃為中心。在霧化和隨后在主要鋰鹽溶液(“配體包被的膠束”)中溫育之前，tbg包被的膠束的熱掃描顯示具有以約100℃為中心的峰(98,105℃)的寬吸熱。觀察到該熱譜圖與在銫處理的鋰溶液中溫育后的納米顆粒顯著不同，這支持了銫處理的鋰溶液隨時間賦予穩(wěn)定的膠束和納米顆粒順序和重排以產生獨特的超分子組裝的說法。

通過ftir光譜進一步研究了將銫預處理的鋰引入穩(wěn)定浴中的化合物差異。從600-4000cm^-1讀取非c配方g和含c配方a的ftir光譜?；趶慕M分和文庫掃描得到的峰分配，膠囊掃描通常表征為在3300附近的寬的密集帶，代表水在3390cm^-1的o-h伸縮振動，帶的集合歸因于表面活性劑(4：在約2956-2832cm^-1，3：在約1449-1260cm^-1)，以及在約1100-1100cm^-1處的強的密集帶歸因于的li-o和li-oh的振動。銫預處理的穩(wěn)定浴觀察到的主要峰差異(配方gvs.配方a)為：1)在約1647cm^-1處的寬峰變窄成在約1740、1640處的峰；2)在約2952-2839將可能的表面活性劑衍生的四聯(lián)體改編成約2952-2853的三聯(lián)體；和3)水振動帶從約3329變化到3377cm^-1。

就吸光度變化而言，銫預處理導致吸水率的大小降低大于50％，這與在重組的膠囊組裝內捕獲的水量的可能的減少一致。值得注意的是，疏水性表面活性劑在該區(qū)域中沒有吸光度。在最接近鋰區(qū)域的約1260和795cm^-1處，可歸因于表面活性劑的帶的吸光度增加也大于50％，表明組裝的這些關鍵成分之間的相互作用可能的變化。在將配體包被的膠束霧化到包含銫處理的鋰的接收浴中之后，在停止反應之前，這些組分緊密接觸數小時。

熱轉變和ir光譜的顯著變化是結晶化合物、藥物化合物和納米級超分子組裝體的多晶型變化的重要指標，已知它們以不同的形態(tài)狀態(tài)經歷重要的物理和功能的變化。不希望受理論束縛，與未修飾的納米顆粒相比，c修飾的納米顆粒的形態(tài)狀態(tài)的指示差異(表1)潛在地提供了改善的運輸穩(wěn)定性和擴展的伯頓衍生觀察c-修飾納米顆粒的的體外穩(wěn)定性的重要機制。

該實施例顯示本發(fā)明的納米顆粒實質上增加了不同的載荷和納米顆粒多晶型物的運輸濃度和伯頓衍生的穩(wěn)定性。

實施例3-修飾的嵌合多核苷酸混合物在小鼠腫瘤模型中表現出令人驚訝的功效。

包含tbg配體和抗ck2嵌合多核苷酸生物活性劑的銫修飾的納米顆粒涉及操縱腫瘤和腫瘤間質細胞中的酪蛋白激酶2alpha(csnk2a1)和酪蛋白激酶2alpha’(csnk2a2)蛋白的水平，由于在納米顆粒遞送系統(tǒng)中的tbg配體將顆粒和寡核苷酸載荷導向兩種組織類型。酪蛋白激酶2(ck2)是由腫瘤細胞過度驅動以促進多個途徑的存活的普遍存在的酶，并且在應激和腫瘤的條件下在細胞核中積累。在細胞凋亡之前ck2從核區(qū)間穿出，并且在腫瘤死亡之前腫瘤細胞不能維持核ck2。通常在免疫受損小鼠(異種移植模型)中生長的人腫瘤中評價腫瘤治療劑。如下表2中概述的，在用結合ago2和rnaseh的雙功能寡核苷酸靶向的基因區(qū)域中(美國專利公開號2013/0267577，通過引用整體并入本文)，在人類和小鼠之間可以存在多達3個錯配(hucsnk2a1和mucsnk2a2之間3個)。與陰影不匹配的hucsnk2a1通過陰影和粗體下劃線、輪廓字型或超大字母顯示。

當將單核苷酸修飾摻入本文所述的單鏈寡核苷酸設計(seqidno：8)，以及涉及針對csnk2a2的新型單鏈寡核苷酸設計(seqidno：9)，并且將這些單鏈寡核苷酸結合在tbg包被的s50顆粒中以形成ck2抗癌治療性混合物，在荷瘤小鼠中實現了腫瘤生長、細胞增殖和炎癥的抑制方面的效果顯著。2r主鏈修飾由將單核苷酸--2位的dna核苷酸從5’-末端改變?yōu)?’-o-甲基修飾的rna核苷酸組成。這些寡核苷酸中的所有主鏈鍵是磷酸二酯。在該實驗中，還進行了努力以評估錯配的類似鼠靶區(qū)域的影響。下表2描述了本實施例中使用或提及的序列：

表2序列

注釋：1)所有核苷酸鍵是磷酸二酯。2)dna靶序列中的斜體＝相應的嵌合藥物寡核苷酸的3’末端中的2’o-甲基rna區(qū)。3)與hucsnk2a1的錯配用陰影標記，包含帶陰影的下劃線、方框或超大下劃線字母。4)對于寡核苷酸和修飾的寡核苷酸，大寫表示dna，小寫表示rna，所有rna核苷酸都是2’o-me修飾的。

使用兩種裸鼠系(foxn、balb/cancr(bn))和一種腫瘤系(fadu，下咽部)，在小鼠中皮內接種在50％基底膠(matrigel)中的2e⁶(foxn)或2e⁵(bn)腫瘤細胞，7天后開始皮下治療。開始治療時的平均腫瘤大小為約69-86cumm。5只小鼠的組以10μg/kg每周兩次進行處理。在一些情況下，在治療約10天后，處死來自處理組的2只小鼠。在處理30天后(d30)，處死每組剩余的3-5只動物，稱重殘余的活腫瘤。

為了評估分子變化，通過顯微鏡檢查從每只小鼠的活腫瘤區(qū)域的冷凍切片測定ki-67和p65nf-kb水平，并且使用nihimagej將其定量為針對背景對照閾值的信號面積分數。從活腫瘤切片收集重復的代表性區(qū)域代表所有d30小鼠。ki-67是腫瘤增殖速率的常見臨床指標，表示為活細胞核面積的分數或百分比，p65nf-kb是炎癥中的主要信號傳導和調節(jié)蛋白，是ck2的重要下游靶標。nf-kb異?；罨琻f-kb的抑制誘導細胞死亡，抑制頭頸部鱗狀細胞癌(hnscc)的腫瘤發(fā)生(yu，etal.2006cancerresearch66:6722-6731)。因此，本領域技術人員了解腫瘤模型中的抗ck2策略的效力，并且許多結果可根據抗nf-kb活性來理解。在細胞生物學方面，p65nf-kb(類似于ck2)在炎癥條件和脅迫條件下定位于細胞核，并且隨著炎癥的減少而細胞質的或較少可檢測的。表3總結了三種分析的處理和結果。

表3在小鼠fadu腫瘤模型中開始處理后30天的結果

注釋：1)n＝每組3只小鼠，除了具有5只的humix。2)數值報告為平均值±se。3)*＝p<0.05，student’st檢驗。4)#＝p<0.05，studentt檢驗，對整個bn對照池顯著，0.66±0.11g。5)如實施例1中所列且描述的tbg納米包封序列的配方編號。

值得注意的是，盡管實驗組的寡核苷酸組分之間存在有限的差異，但tbg包封的2rhumix寡核苷酸是唯一在所有三類腫瘤重量、細胞增殖(ki-67)和炎癥指數(nf-kb)相對于對照，在開始處理后30天(表2、e3實驗、配方e)均顯著降低的。包封的單核苷酸2r修飾(e1實驗，配方b)和包封的humix方法(e2實驗，配方c)在處理后30天都不顯示腫瘤重量的顯著降低。實際上，相對于對照，humix處理組(配方c)顯示腫瘤重量顯著增加34％。相反，用納米包封的2rhumix(配方e)處理的小鼠的腫瘤顯示相對于合并的bn對照腫瘤的腫瘤重量顯著降低56％，這對應于細胞增殖和炎癥指數(約73％ki-67指數、-99.7％p65nf-kb信號分數、p<0.05)的大幅度和顯著降低。沒有其他處理組顯示細胞增殖指數和p65nf-kb信號相對于對照的顯著降低，遠小于那兩種測量和腫瘤重量。e2實驗中的mumix處理顯示nf-kb信號面積分數與對照相比顯著降低59.7％，但是伴隨著腫瘤重量相對于對照的26.2％的增加，這是明顯不期望的結果。另外值得注意的是，在e3實驗中，在2rhumix群組相對于對照中p65nf-kb信號顯著減少(99.7％)，而在e2實驗中的humix群組中p65nf-kb信號幾乎沒有變化，其中與鼠序列的錯配等于2rhumix的那些(上表2)。

通過顯微鏡評估e3實驗中小鼠的ck2α和ck2α’蛋白水平的變化。與收縮、增殖和炎癥指數的顯著降低一致，在處理的小鼠的活腫瘤切片中觀察到ck2α和ck2α’信號水平(分別為-52％和-45％)相對于對照的顯著減少(p<0.05)(數據未示出)。在實驗e1和e2中的所有其他處理中沒有觀察到ck2α和ck2α’信號分數的顯著變化。

應注意，e3實驗中的處理小鼠在30天觀察期期間沒有顯示顯著的體重減輕或不良反應(數據未顯示)?？傊?，觀察到的結果顯示，寡核苷酸主鏈和序列中有限修飾的組合導致荷瘤小鼠中表型和分子標記物的顯著和令人驚訝的變化。

實施例4-修飾的嵌合多核苷酸混合物在侵略性異種移植小鼠腫瘤模型中顯示出令人驚訝的功效。

調查在寡核苷酸主鏈和序列有限的修改，以及納米顆粒的銫修改的效果，在另一種模型，檢查包括人腫瘤細胞系(um-scc-47，來自hpv-(+)舌組織)的異種移植腫瘤模型和nih遠交無胸腺裸鼠。在該實驗中，裸鼠皮下接種2e⁶細胞并保持兩周，在開始每日100μg/kgsq處理之前腫瘤生長至60-80cu.mm.。在處理14天后收集腫瘤，并以類似于上述fadu實驗進行檢查。結果總結于下表4中。

在該實施例中，類似于實施例3并使用相同的方法，cs-修飾的、tbg包被的2rhumix寡核苷酸在所有三類的腫瘤重量、細胞增殖(ki-67)和炎癥指數(p65nf-kb)與對照在開始處理后14天(而不是30天)相比大幅降低(表4，配方e)。另外的對照，即具有對照寡核苷酸和糖類載體的cs-修飾的納米顆粒，被引入以說明非特異性介入應激對腫瘤生長應答的負面影響。在小鼠和細胞系的這種組合中，觀察到腫瘤立即轉移到淋巴結，并且在每只小鼠中嚴重侵襲腹膜腔，除去用配方e處理的那些(數據未顯示)。因此，腫瘤重量報告為原發(fā)性腫瘤與腹膜延伸和主要淋巴結的組合?？傊?，實施例3和4顯示了2r修飾和csnk2a1和csnk2a2序列的新組合跨越不同腫瘤系和小鼠模型的有利功效。

表4.在異種移植物um-scc-47腫瘤模型中開始治療14天后的結果

注釋：1)n＝每組3只小鼠。2)數值報告為平均值±se。3)*＝p<0.05，studentt檢驗，4)在實施例1中所列和所述的納米包被序列的配方編號。5)腫瘤負荷報道為原發(fā)性腫瘤與腹膜延伸、臂、下頜和腹股溝淋巴結的累積重量。均勻地對原發(fā)和gi腫瘤取樣進行顯微鏡檢查。6)另外的納米包被的對照寡核苷酸的序列是抗凝血因子vii，來自akinc，等2008natbiotechnol26(5):561-9。7)含有赤蘚糖醇的c-修飾的納米顆粒制劑被包括并且類似于配方a被制備，除了沒有任何縮合劑的500μg赤蘚糖醇用8.75μg的表面活性劑膠束化，用5.5mcg的tbg包被并霧化到用6.25nm的mg²⁺和9.38nm的sr²⁺修飾的接收浴中，所有其他離子相同。粒徑為24±2nm，表面電荷為-12±7.8mev。

序列

ck2α(智人染色體20，grch38初級組裝；ncbi參考序列：nc_000020.11；70.52kb區(qū)域從堿基473322到543838；intlhugenomeseqconsort；2004nature431(7011):931-945)

ck2α’基因(智人染色體16，grch38初級組裝；ncbi參考序列：nc_000016.10；39.97kb區(qū)域，從堿基58157907到58197878；martin，etal.2004nature432(7011):988-994)

nm_001896；ck2α’基因mrna序列的cdna序列；智人酪蛋白激酶2，α’多肽(csnk2a2)，mrna(2008年3月17日)(seqidno：11)

nm_177560；ck2α的mrna序列的cdna序列；智人酪蛋白激酶2，α1多肽(csnk2a1)，轉錄變體3，mrna(2008年3月12日)(seqidno：12)

序列表

<110>吉倪塞思公司

<120>治療性納米粒子和相關的組合物、方法和系統(tǒng)

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