相關(guān)申請(qǐng)

本申請(qǐng)要求于2014年9月5日提交的標(biāo)題為“methodfortreatmentandpreventionofvasculardisease”的澳大利亞臨時(shí)專利申請(qǐng)第2014903547號(hào)的優(yōu)先權(quán)，該澳大利亞臨時(shí)專利申請(qǐng)的內(nèi)容通過引用并入。

本發(fā)明涉及治療和或預(yù)防血管疾病(vasculardisease)的方法。本發(fā)明還涉及用于植入接受脈管系統(tǒng)(vasculature)治療的患者中的醫(yī)療裝置，所述裝置包含治療量的fxyd1或其能夠與內(nèi)皮型一氧化氮合酶相互作用的衍生物。本發(fā)明還涉及fxyd1及其能夠與內(nèi)皮型一氧化氮合酶相互作用的衍生物和變體用于治療或預(yù)防血管疾病的用途。

背景技術(shù)：

異常的血管功能是高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病和衰老的關(guān)鍵特征，因此是發(fā)病和死亡的主要促成因素。驅(qū)動(dòng)這些疾病狀態(tài)中的血管功能障礙的常見因素是活性氧類(ros)的過量產(chǎn)生。超氧陰離子(o2^.-)和相關(guān)的ros不僅淬滅一氧化氮(no)，而且它們還通過氧化翻譯后修飾直接損害細(xì)胞蛋白質(zhì)的功能，驅(qū)動(dòng)炎癥、細(xì)胞增殖、纖維化、動(dòng)脈粥樣硬化和膜運(yùn)輸中的損害。血管疾病中該升高的ros的主要促成因素是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的活化，其產(chǎn)生血管緊張素ii(angii)-活化nadph氧化酶，以及內(nèi)皮型一氧化氮合酶(enos)的解偶聯(lián)。

仍然需要用于預(yù)防或減少異常血管功能以及用于治療或預(yù)防與異常血管功能相關(guān)的醫(yī)學(xué)病況的新的或改善的方法和藥劑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明人已令人吃驚地鑒別出fxyd1是內(nèi)皮型一氧化氮合酶(enos)對(duì)抗氧化還原誘導(dǎo)的解偶聯(lián)的內(nèi)源性保護(hù)劑，其導(dǎo)致一氧化氮(no)生物利用度的快速改善、氧化還原應(yīng)激的降低以及內(nèi)膜肥厚和血管周纖維化的慢性no依賴性表型的改善。例如通過重組蛋白質(zhì)施用(天然fxyd1或工程化衍生物)或基因轉(zhuǎn)移來補(bǔ)充fxyd1是一種新的療法，其將保護(hù)動(dòng)脈免于在特征為氧化應(yīng)激的寬范圍的血管疾病狀態(tài)中發(fā)生氧化還原誘導(dǎo)的功能障礙(匯總在圖1中)。

因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防脈管系統(tǒng)的氧化還原誘導(dǎo)的功能障礙的方法，所述方法包括向具有脈管系統(tǒng)的氧化還原誘導(dǎo)的功能障礙或有脈管系統(tǒng)的氧化還原誘導(dǎo)的功能障礙的風(fēng)險(xiǎn)的患者施用治療有效量的fxyd1或其能夠與內(nèi)皮型一氧化氮合酶相互作用的衍生物或變體。

在一個(gè)實(shí)施方案中，施用fxyd1或其能夠與內(nèi)皮型一氧化氮合酶相互作用的衍生物包括向所述患者的所選脈管系統(tǒng)遞送編碼fxyd1或其能夠與內(nèi)皮型一氧化氮合酶相互作用的衍生物的核酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用fxyd1或其能夠與內(nèi)皮型一氧化氮合酶相互作用的衍生物包括向所述患者的所選脈管系統(tǒng)遞送病毒載體，所述病毒載體編碼fxyd1或其能夠與內(nèi)皮型一氧化氮合酶相互作用的衍生物。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括在對(duì)所述患者的外科手術(shù)或介入手術(shù)期間向血管施用所述fxyd1或其能夠與內(nèi)皮型一氧化氮合酶相互作用的衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，向所述患者的施用包括在手術(shù)期間的吻合之前，在包含fxyd1或其能夠與內(nèi)皮型一氧化氮合酶相互作用的衍生物或變體的組合物中孵育冠狀動(dòng)脈旁路移植物。在一個(gè)實(shí)施方案中，向所述患者的施用包括在所述患者中植入涂覆的血管或涂覆的支架，所述涂層包含fxyd1或其能夠與內(nèi)皮型一氧化氮合酶(enos)相互作用的衍生物。

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于植入接受脈管系統(tǒng)治療的患者中的醫(yī)療裝置，所述裝置包含治療量的fxyd1或其能夠與內(nèi)皮型一氧化氮合酶相互作用的衍生物。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于植入接受脈管系統(tǒng)治療的患者中的醫(yī)療裝置，所述裝置包含編碼fxyd1或其能夠與內(nèi)皮型一氧化氮合酶相互作用的衍生物的核酸序列。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述裝置是支架。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述裝置是涂覆的支架，所述涂層包含fxyd1或其能夠與內(nèi)皮型一氧化氮合酶相互作用的衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述裝置是涂覆的血管支架，如冠狀動(dòng)脈支架。醫(yī)療裝置可包含天然存在的組分(如血管組織或血管)、合成組分(如制造的支架)或其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述裝置是血管移植物，其可包含天然存在的材料、合成材料或其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述裝置可包含藥物洗脫支架或移植物。

在一個(gè)實(shí)施方案中，患者患有與內(nèi)皮功能障礙相關(guān)的病況(condition)。在一個(gè)實(shí)施方案中，患者患有選自以下病況組成的組的病況：心肌梗塞、糖尿病(如糖尿病性外周血管疾病)、冠狀動(dòng)脈疾病、在冠狀動(dòng)脈、外周或腦循環(huán)中的功能障礙、慢性腎衰竭(如有動(dòng)脈-靜脈瘺)、急性腦血管意外(中風(fēng))、缺血-再灌注損傷、慢性血管疾病、肺動(dòng)脈高壓、神經(jīng)肌肉疾病。

在又一方面，本發(fā)明提供了fxyd1或其能夠與內(nèi)皮型一氧化氮合酶相互作用的衍生物，其用于治療或預(yù)防脈管系統(tǒng)的氧化還原介導(dǎo)的功能障礙。

在又一方面，本發(fā)明提供了fxyd1或其能夠與內(nèi)皮型一氧化氮合酶相互作用的衍生物，其用于制備用于治療或預(yù)防脈管系統(tǒng)的氧化還原介導(dǎo)的功能障礙的藥物。

上述本發(fā)明內(nèi)容并非限制性的并且從優(yōu)選實(shí)施方案的以下的具體實(shí)施方式以及從權(quán)利要求將顯而易見本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)。

附圖簡單說明

現(xiàn)在將參照附圖僅通過示例來描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，其中：

圖1.fxyd1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞中enos解偶聯(lián)的保護(hù)作用的示意性圖示。angii在內(nèi)皮細(xì)胞中通過谷胱甘肽化誘導(dǎo)nadph氧化酶依賴性enos解偶聯(lián)(galougahi等，2014)。在angii1型受體(at1r)偶聯(lián)的活化下，nadph氧化酶(nox)來源的o2^.-通過還原酶結(jié)構(gòu)域(顯示為g)中關(guān)鍵cys殘基(c689和c908)的谷胱甘肽化起始enos解偶聯(lián)，從而導(dǎo)致no的降低和o2^.-產(chǎn)生的放大(上圖)。這支持nox來源的o2^.-充當(dāng)“引發(fā)物(kindling)”和解偶聯(lián)的enos充當(dāng)“篝火(bonfire)”以及enos谷胱甘肽化作為關(guān)鍵分子開關(guān)的范式。fxyd1在內(nèi)皮中保護(hù)enos免于發(fā)生谷胱甘肽化(下圖)以及所導(dǎo)致的解偶聯(lián)，從而顯著改善no生物利用度，并降低內(nèi)皮細(xì)胞中的細(xì)胞氧化應(yīng)激。

圖2.fxyd1在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(huvec-見于總?cè)芙猱a(chǎn)物-tl中)中表達(dá)，并與enos共免疫沉淀。ip＝免疫沉淀劑。陰性igg為ip的情況被顯示為對(duì)照。

圖3.當(dāng)fxyd1的內(nèi)源性表達(dá)被沉默時(shí)，enos谷胱甘肽化增加。

圖4.fxyd1表達(dá)對(duì)enos活化至關(guān)重要。當(dāng)fxyd1被沉默或“敲低”(kd)時(shí)，通過no-敏感熒光劑daf-2da所評(píng)估的huvec的no產(chǎn)生顯著降低。

圖5.直方圖,其顯示用sirna使fxyd1表達(dá)沉默對(duì)暴露于angii(500nm)的細(xì)胞中超氧化物敏感性二氫乙錠(dhe)熒光的影響。

圖6.fxyd1敲除(小鼠模型)導(dǎo)致體內(nèi)血管緊張素ii誘導(dǎo)的enos-谷胱甘肽化的增強(qiáng)(1mg/kg/天的angii輸注1周)。使用gsh表位ip和enos免疫印跡(ib)確定enos谷胱甘肽化。這在心臟(a)和主動(dòng)脈(b)兩者中都被觀察到。圖6a左側(cè)所示的大小標(biāo)志表示10kda、15kda、20kda、25kda、37kda、50kda、75kda、100kda、150kda和250kda。

圖7.fxyd1的敲除(fxydko)導(dǎo)致增加的中膜厚度，這在施用血管緊張素ii的情況下被加劇。

圖8.fxyd1敲除導(dǎo)致增加的血管周纖維化，以及血管緊張素ii誘導(dǎo)的血管周纖維化的顯著增強(qiáng)。

圖9.fxyd1敲除(小鼠模型)在心臟中導(dǎo)致增加的基底間質(zhì)纖維化并增強(qiáng)血管緊張素ii誘導(dǎo)的間質(zhì)纖維化。使用米利根三色染色(milliganstrichromestaining)在固定的心肌組織上顯現(xiàn)纖維化。**反映了p<0.01的顯著性。

圖10.fxyd1敲除(小鼠模型)導(dǎo)致通過超聲心動(dòng)圖顯像(肺加速時(shí)間)所測量的肺動(dòng)脈壓升高。**反映了p<0.01的顯著性。

定義

如本文所用的術(shù)語“包括”意指主要但不一定只包括。此外，詞語“包括(comprising)”的變化形式(如“包括(comprise)”和“包括(comprises)”)具有相應(yīng)變化的含義。

術(shù)語“受試者”和“患者”在本文中可互換使用，且包括人和具有社會(huì)、經(jīng)濟(jì)或研究重要性的任何物種的個(gè)體，包括但不限于以下屬的成員：羊、牛、馬、豬、貓、犬、靈長類動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物。

如本文所用的術(shù)語“治療(treating)”和“治療(treatment)”包括施用療法以預(yù)防、治愈、緩解、改善或預(yù)防與病癥、疾病、損傷或病況相關(guān)的癥狀。

在本說明書的上下文中，術(shù)語“多肽”意指由通過肽鍵連接在一起的氨基酸組成的聚合物。多肽可具有任何長度。除非上下文另有指示，否則應(yīng)當(dāng)理解術(shù)語多肽還包括肽和蛋白質(zhì)。

當(dāng)在一組可選要素的背景下使用時(shí)，術(shù)語“至少一個(gè)”包括單獨(dú)選擇的組中的任何一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)、多至所有成員，并且包括該組成員的任何組合。類似地，當(dāng)在一組可選要素的背景中使用時(shí)，術(shù)語“至少兩個(gè)”包括任何組合中的組中的兩個(gè)或更多個(gè)成員的任何選擇。

在本說明書的上下文中，術(shù)語“氧化還原誘導(dǎo)的功能障礙”和“氧化還原介導(dǎo)的功能障礙”應(yīng)被理解為具有相同的含義。

在允許的范圍內(nèi)，本文中所引用的所有參考文獻(xiàn)均以引用方式整體并入。

詳細(xì)說明和實(shí)施例

本發(fā)明人已令人吃驚地鑒別出fxyd1與內(nèi)皮中的內(nèi)皮型一氧化氮合酶(enos)的新的相互作用，該酶是血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中的關(guān)鍵酶，對(duì)寬范圍的急性和慢性血管疾病狀態(tài)具有顯著的治療意義。

fxyd蛋白質(zhì)是小i型膜蛋白質(zhì)家族，其以細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中不變的fxyd標(biāo)識(shí)序列被命名。以組織特異性方式表達(dá)的哺乳動(dòng)物fxyd(“fixit”)蛋白質(zhì)(sweadner和rael，2000)是根據(jù)它們被克隆的日期按時(shí)間順序編號(hào)的。fxyd1(也被稱為磷肌纖維蛋白(phospholemman))是在內(nèi)皮和血管平滑肌中表達(dá)的小膜蛋白質(zhì)。已知其與心臟中的na+-k+泵功能相關(guān)，其中先前已證實(shí)其具有對(duì)抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的對(duì)na+-k+泵的抑制的保護(hù)作用(bibert等，2011)。fxyd1也已被證實(shí)在血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)，并且在na+-k+泵以及響應(yīng)氧化應(yīng)激的收縮張力的急性調(diào)控中起作用(liu等，2013)。

人fxyd1的示例性氨基酸序列(palmer等，1991)以u(píng)niprotkb/swiss-prot保藏號(hào)o00168(seqidno：1))被提供。編碼人fxyd1的示例性核酸序列是embl-ebi保藏號(hào)u72245(seqidno.2)。

enos在內(nèi)皮生理學(xué)中是關(guān)鍵性的，調(diào)控血管張力以及減弱血小板聚集和嗜中性粒細(xì)胞-內(nèi)皮相互作用(brunner等，2003)。然而，在氧化應(yīng)激條件下，enos變得“解偶聯(lián)”，優(yōu)先產(chǎn)生o2^.-和onoo^-，這擴(kuò)大了氧化應(yīng)激并加劇了損傷(burgoyne等，2005)。在病理生理損害(例如糖尿病、高血壓)期間保護(hù)enos免于解偶聯(lián)可終止放大過程并保護(hù)對(duì)于動(dòng)脈健康至關(guān)重要的關(guān)鍵膜蛋白質(zhì)。enos還原酶結(jié)構(gòu)域的這種解偶聯(lián)由谷胱甘肽化介導(dǎo)的發(fā)現(xiàn)(chen等，2010)導(dǎo)致我們對(duì)enos調(diào)控的理解的范式轉(zhuǎn)變，并為限制心血管疾病中的氧化應(yīng)激的新的治療策略鋪平了道路。

如本文所述的，本發(fā)明人現(xiàn)已令人吃驚地鑒別出，fxyd1和enos存在功能相互作用。這得到由本發(fā)明人獲得并在本文中描述的以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持。

方法

細(xì)胞培養(yǎng)和sirna敲低：在內(nèi)皮生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(huvec)。使用針對(duì)fxyd1的sirna或亂序?qū)φ?qiagen)；和fxyd1表達(dá)質(zhì)粒來檢查fxyd1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能和enos活性以及其谷胱甘肽化的作用。使用熒光素標(biāo)記的dsrna低聚物來顯現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率。

谷胱甘肽化蛋白質(zhì)的免疫檢測和蛋白質(zhì)共免疫沉淀。為了在共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中檢測enos的谷胱甘肽化，使用市售的針對(duì)谷胱甘肽化蛋白質(zhì)的抗體(抗gsh抗體-virogen)來檢測谷胱甘肽化。將主動(dòng)脈在含有150mmol/lnacl、50mmol/ltris-hcl(ph8.0)、1％tritonx-100、2mmedta和蛋白酶抑制劑(完全無egta的，rochediagnostics)的冰冷溶解緩沖液中均質(zhì)化，隨后以16,000g離心20min。將上清液(0.5-1mg蛋白質(zhì))與適當(dāng)抗體以1mg蛋白質(zhì)和2.5μg抗enos抗體(sigma-aldrich):1mg蛋白質(zhì)的比例在4℃孵育1小時(shí)，然后與蛋白質(zhì)a/g-plus瓊脂糖珠粒孵育。將與收集的珠粒相結(jié)合的蛋白質(zhì)在laemmli緩沖液中洗脫，進(jìn)行sds-page并用抗gsh抗體探測。通過las-4000圖像讀取器讀取蛋白質(zhì)印跡化學(xué)發(fā)光，并使用multigauge3.1軟件(fujifilmlifescience，tokyo，japan)通過密度測定法加以定量。調(diào)節(jié)暴露時(shí)間以確保信號(hào)強(qiáng)度的變化在線性動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)。使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)印跡技術(shù)來評(píng)估fxyd1和enos表達(dá)。

通過共聚焦熒光顯微鏡術(shù)檢測no。在固定前不與乙酰膽堿預(yù)孵育的情況下，通過使用4-氨基-5-甲基氨基-2',7'-二氟熒光素二乙酸酯(daf-fm二乙酸酯)(10μm,30分鐘37℃)檢測huvec中的細(xì)胞內(nèi)no。用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi,1μm)將核染色。分別使用495nm和515nm的激發(fā)波長和發(fā)射波長來檢測no熒光，并通過imagej軟件進(jìn)行分析。

通過共聚焦熒光顯微鏡術(shù)檢測超氧化物。在固定之前，在加載有o2^.--敏感性染料二氫乙錠(dhe)的huvec中檢查細(xì)胞內(nèi)o2^.-的變化30分鐘。用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi,1μm)將核染色，并用vectashield封固劑將細(xì)胞封固在載玻片上，并且用共聚焦顯微鏡(leicatcssp5)觀察。

fxyd1ko和wt小鼠的超聲心動(dòng)圖顯像：使用30-mhz換能器(vevo770；visualsonics,toronto,ontario,canada)在自發(fā)呼吸的輕度鎮(zhèn)靜小鼠(異氟烷1％)中獲得經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖顯像。我們測量了肺動(dòng)脈加速時(shí)間(pat)，以非侵害性地估計(jì)在小鼠暴露于缺氧環(huán)境3周和6周之前(基線)和之后的肺動(dòng)脈壓。

如在人內(nèi)皮細(xì)胞(huvec；圖2)中的共免疫沉淀測定所證實(shí)的，fxyd1被表達(dá)并與enos物理相互作用。

人內(nèi)皮細(xì)胞中內(nèi)源性fxyd1表達(dá)的沉默導(dǎo)致enos的谷胱甘肽化增加(圖3)。由于這是enos的氧化還原解偶聯(lián)的分子機(jī)制，因此預(yù)測這會(huì)降低no生物利用度，并增加超氧化物產(chǎn)生。

人內(nèi)皮細(xì)胞中內(nèi)源性fxyd1表達(dá)的沉默導(dǎo)致no生物利用度在以下情況的顯著降低：基線處；當(dāng)被乙酰膽堿刺激時(shí)(圖4和圖5)；以及在由暴露于神經(jīng)激素血管緊張素ii驅(qū)動(dòng)的更高氧化應(yīng)激的條件下。

fxyd1的敲除(體內(nèi)敲除小鼠)導(dǎo)致在基線條件下enos的谷胱甘肽化增加，并且增強(qiáng)enos對(duì)心臟(圖6a)和主動(dòng)脈(圖6b)中血管緊張素ii誘導(dǎo)的谷胱甘肽化的敏感性。這進(jìn)一步支持fxyd1針對(duì)心血管系統(tǒng)中對(duì)關(guān)鍵膜蛋白質(zhì)的氧化還原損害的保護(hù)作用。

fxyd1的敲除(體內(nèi)敲除小鼠)導(dǎo)致中膜肥厚和血管周纖維化的慢性血管變化，這與enos解偶聯(lián)和過量的ros產(chǎn)生一致。血管緊張素ii的施用加劇這些表型(圖7和圖8)。

fxyd1的敲除(體內(nèi)敲除小鼠)導(dǎo)致心肌間質(zhì)纖維化和血管緊張素ii誘導(dǎo)的心肌纖維化的加劇(圖9)。本發(fā)明人認(rèn)為其機(jī)制可能涉及繼于改善的enos偶聯(lián)之后的改變的心肌ros產(chǎn)生。

fxyd1針對(duì)enos解偶聯(lián)的內(nèi)源性保護(hù)作用指向其在調(diào)控肺動(dòng)脈血管舒縮張力以及肺血管系統(tǒng)中的血管重塑中的潛在作用。敲除小鼠中的體內(nèi)研究證實(shí)如通過肺加速時(shí)間(pat，如圖10中所示，n＝7/小鼠)的超聲心動(dòng)圖測量所反映的升高的肺動(dòng)脈壓。

因此，這些新數(shù)據(jù)表明fxyd1在血管細(xì)胞中的作用不限于維持na⁺泵功能，而且還包括保護(hù)enos對(duì)抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的谷胱甘肽化和解偶聯(lián)。這對(duì)血管健康有重要的急性和慢性意義。這種功能相互作用的鑒別對(duì)寬范圍的血管疾病狀態(tài)具有治療意義。fxyd1沉默還導(dǎo)致增加的心肌纖維化的發(fā)現(xiàn)指向靶向療法在特征在于ros依賴性心肌纖維化的心肌疾病狀態(tài)中的可能有益作用。

基于本文所公開的發(fā)現(xiàn)，預(yù)測向內(nèi)皮遞送fxyd1提供針對(duì)氧化還原誘導(dǎo)的解偶聯(lián)的保護(hù)，從而終止或改善活性氧類誘導(dǎo)的活性氧類產(chǎn)生的“篝火”正反饋(如圖1中所示)。這是血管疾病病理生理學(xué)中關(guān)鍵的起整合作用的步驟。

對(duì)如下不同臨床情況具有可變的適合性的三種遞送方法是顯而易見的。

重組fxyd1或工程化衍生物的遞送。如下公開的發(fā)現(xiàn)支持實(shí)現(xiàn)重組親脂蛋白質(zhì)的自發(fā)膜插入的可行性：(1)rfxyd蛋白質(zhì)在人工膜中以正確的取向自發(fā)插入(通過核磁共振評(píng)估；teriete等，2007)；fxyd蛋白質(zhì)與na⁺泵亞單位締合(crambert等，2004)；(2)外源的純化fxyd1分隔進(jìn)入到膜片段中，并在5min內(nèi)與na⁺泵締合，如通過其與α亞單位的共免疫沉淀和半胱氨酸交聯(lián)所示(mahmmoud等，2000；cornelius等，2005)；和(3)在含有rfxyd3蛋白質(zhì)(用于免疫檢測的目的，因?yàn)椴皇切呐K內(nèi)源的)的溶液中孵育心肌細(xì)胞導(dǎo)致rfxyd3蛋白質(zhì)與na⁺泵的功能締合(bibert等，2011)。

重組fxyd1蛋白質(zhì)的施用最適合于其中內(nèi)皮氧化應(yīng)激的急性逆轉(zhuǎn)是有益的情況，以及理想地，在可直接遞送至血管的情況，諸如在外科手術(shù)或介入手術(shù)中。

示例包括在手術(shù)期間的吻合之前孵育冠狀動(dòng)脈旁路移植物；涂覆血管支架，包括冠狀動(dòng)脈支架；遞送到外周血管旁路移植物，特別是在缺血性糖尿病足的情況下；在初始手術(shù)時(shí)或在閉塞瘺的手術(shù)矯正期間遞送到慢性腎衰竭患者中的動(dòng)脈-靜脈瘺；和動(dòng)脈內(nèi)遞送以在急性心肌梗塞或中風(fēng)的情況下保護(hù)冠狀動(dòng)脈循環(huán)或腦循環(huán)免于缺血-再灌注損傷。

基因轉(zhuǎn)移。fxyd1的病毒載體的遞送對(duì)于上述應(yīng)用是可行的。

轉(zhuǎn)錄調(diào)控。鑒別出參與fxyd1表達(dá)的因子將允許開發(fā)更適于糖尿病或高血壓患者或吸煙患者的慢性血管疾病諸如全身動(dòng)脈疾病的療法。

在fxyd1或其衍生物的每種治療應(yīng)用中，通常將向受試者施用治療有效量的fxyd1或其衍生物。如本文所用的術(shù)語“治療有效量”在其含義內(nèi)包括足以提供期望的治療效果的化合物或組合物的量。所需的確切的量將根據(jù)受試者不同而不同，這取決于諸如治療的物種、受試者的年齡和總體狀況、并發(fā)癥、被治療的病況的嚴(yán)重性、施用的具體試劑和施用方式等因素。因此，對(duì)于任何給定的情況，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員僅使用常規(guī)方法即可確定適當(dāng)?shù)摹爸委熡行Я俊?。類似地，?dāng)療法包括施用活性劑的前體，如施用意在表達(dá)治療劑(例如fxyd1或其衍生物)的遺傳構(gòu)建體時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解，如此遞送的遺傳構(gòu)建體將能夠提供治療有效量的活性物質(zhì)。

用根據(jù)本發(fā)明的fxyd1或其能夠與enos相互作用的衍生物治療受試者可以是給予所述受試者的唯一治療，或者可以是用于所述受試者的組合方案治療的一個(gè)組成部分，在所述組合方案治療中將基于fxyd1的治療與用于所述病況的其它治療組合。如本文中關(guān)于治療方案所用的術(shù)語“與……組合”和類似術(shù)語如“聯(lián)合”意指藥物和其它治療劑中的每一種均被用于治療受試者，并且意指“組合”治療方案中的藥物和其它治療劑中的每一種均可與所述治療方案中的一種或多種其它藥劑同時(shí)被施與所述受試者，或者可在不同于所述治療方案中的一種或多種其它藥劑的時(shí)間被施與所述受試者。

應(yīng)當(dāng)理解，如本文中關(guān)于治療方案所用的術(shù)語“與……組合”和類似術(shù)語如“聯(lián)合”在它們的含義內(nèi)涵蓋通過不同的模式施用所述藥物和其它治療劑中的每一種(例如一種可口服施用，并且另一種可通過注射施用)。當(dāng)關(guān)于治療方案使用時(shí)，術(shù)語“與……組合”和類似術(shù)語如“結(jié)合”可意指藥物或其它試劑中的任何一種或多種可在被施與受試者之前物理組合，并且應(yīng)當(dāng)理解，該術(shù)語還包括將一種或多種藥物和其它治療劑作為不在先前物理組合中的單獨(dú)藥劑施用。

基于本文中對(duì)于fxyd1在氧化應(yīng)激條件下保護(hù)內(nèi)皮免于enos解偶聯(lián)的公開，本發(fā)明向患有動(dòng)脈疾病的患者提供新的治療策略，例如通過向此類患者遞送fxyd1或其工程化的或天然存在的衍生物或變體。

當(dāng)與本發(fā)明的fxyd1蛋白質(zhì)相關(guān)聯(lián)使用時(shí)，術(shù)語“衍生物”包括任何功能等同的fxyd1蛋白質(zhì)，包括整體產(chǎn)生(例如通過重組手段)或在合成后添加(例如通過化學(xué)方法)的任何融合分子。此類融合物可包括與多肽(例如嘌呤霉素或其它多肽)、小分子(例如補(bǔ)骨脂素)或抗體綴合的本發(fā)明的fxyd1蛋白質(zhì)。如本文所述的，發(fā)明人已證實(shí)fxyd1與enos相互作用，并且通過這樣在保護(hù)enos免于氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的谷胱甘肽化和解偶聯(lián)中起作用。

在本上下文中，應(yīng)當(dāng)理解，融合蛋白質(zhì)或多肽可包含本發(fā)明的多種fxyd蛋白質(zhì)，諸如其中兩種或更多種fxyd蛋白質(zhì)存在于單一多肽上的多肽。

包含本發(fā)明的一種或多種fxyd1蛋白質(zhì)的融合蛋白或多肽可另外包含一個(gè)或多個(gè)不相關(guān)的序列。在融合蛋白質(zhì)或多肽的背景下，此類序列在本文中通常將被稱為“融合配偶體”。通常，融合配偶體是氨基酸序列，并且可以是多肽。例如，可選擇融合配偶體以輔助肽或多肽的產(chǎn)生。此類融合配偶體的示例包括能夠增強(qiáng)肽或包含所述肽的多肽的重組表達(dá)的那些；能夠促進(jìn)或輔助肽或包含所述肽的多肽如親和標(biāo)簽的純化的那些?；蛘呋蛄硗猓蛇x擇融合配偶體以增加肽或包含所述肽的多肽的溶解度，以增加所述肽的免疫原性，使肽或包含所述肽的多肽能夠靶向特定的或期望的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室。

用于制備融合蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域已知的。通常，融合蛋白質(zhì)可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如化學(xué)綴合、肽合成或重組手段制備。融合蛋白質(zhì)可在蛋白質(zhì)的組成部分之間，如在一種或多種組成肽之間，和/或在一種或多種融合配偶體和/或組成肽之間，包含一個(gè)或多個(gè)接頭，如肽接頭?？蛇x擇此類肽接頭以允許融合蛋白質(zhì)的組成部分維持或獲得適當(dāng)?shù)亩?jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明的fxyd蛋白質(zhì)可通過任何適合的手段制備，如通過從天然存在的形式分離，通過化學(xué)合成或通過重組手段。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知曉用于此類制備的標(biāo)準(zhǔn)方法，如通過酶切割從天然存在的較長氨基酸序列分離，如通過化學(xué)合成，如通過重組dna技術(shù)。

本發(fā)明的fxyd蛋白質(zhì)、或包含本發(fā)明的fxyd蛋白質(zhì)作為其組成部分的融合蛋白質(zhì)或多肽可以是可溶性的肽、融合蛋白質(zhì)或多肽。

本發(fā)明還涵蓋fxyd1的“變體”的使用。當(dāng)與本發(fā)明的fxyd1蛋白質(zhì)相關(guān)聯(lián)使用時(shí)，術(shù)語“變體”包括任何功能等同的fxyd1蛋白質(zhì)。術(shù)語“變體”還涵蓋fxyd1蛋白質(zhì)或多肽或寡肽的功能片段，并且還涵蓋功能同系物。例如，盡管本文參照特定的fxyd1氨基酸序列或多核苷酸序列(諸如seqidno:1和seqidno：2中所示)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但是應(yīng)當(dāng)理解，可以存在或合成fxyd1多肽或多核苷酸，該多核苷酸具有或編碼以類似于fxyd1的方式與enos相互作用的能力，以實(shí)現(xiàn)使得enos對(duì)抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的谷胱甘肽化和解偶聯(lián)的一定程度的保護(hù)。

變體或同系物可在氨基酸序列中具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失、添加和/或插入。本發(fā)明的fxyd1蛋白質(zhì)的變體或同系物優(yōu)選展現(xiàn)出與天然fxyd1蛋白質(zhì)具有至少約70％、至少約80％、至少約85％或至少約90％的同一性，更優(yōu)選在所述變體或同系物的長度內(nèi)與天然fxyd1蛋白質(zhì)具有至少約92％或至少約94％的同一性、或至少約95％的同一性、或至少約96％的同一性、或至少約97％的同一性、或至少約98％的同一性、或至少約99％的同一性。

fxyd1蛋白質(zhì)或變體可通過例如氨基酸的缺失或添加來修飾。氨基酸取代包括但不必限于本領(lǐng)域被稱為“保守”的氨基酸取代?！氨Ｊ亍比〈瞧渲幸粋€(gè)氨基酸取代具有相似性質(zhì)的另一氨基酸的取代，使得肽化學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員將預(yù)期多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)和親水性質(zhì)基本上不變。氨基酸取代通?？苫跉埢臉O性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或兩親性質(zhì)的相似性進(jìn)行。例如，帶負(fù)電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；親水性值相似的具有不帶電荷的極性頭部基團(tuán)的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；以及絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸?？纱肀Ｊ刈兓钠渌被峤M包括：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。變體還可以或者可選擇地含有非保守改變。

通常，變體fxyd1蛋白質(zhì)與天然fxyd1蛋白質(zhì)的不同之處在于五個(gè)氨基酸或更少個(gè)(諸如四個(gè)、三個(gè)、或兩個(gè)或一個(gè))氨基酸的取代、缺失或添加。

通常，本發(fā)明的fxyd1蛋白質(zhì)是分離的蛋白質(zhì)。應(yīng)當(dāng)理解，在本上下文中，術(shù)語“分離的”意指所述蛋白質(zhì)已從與其在天然系統(tǒng)中一起被發(fā)現(xiàn)的一些或所有其它成分中去除或不與這些成分締合。例如，“分離的”肽可從fxyd1多肽序列內(nèi)的其它氨基酸序列中被去除，或者可從天然組分如不相關(guān)的蛋白質(zhì)中被去除。為了清楚起見，“分離的”fxyd1蛋白質(zhì)包括已化學(xué)合成的fxyd1蛋白質(zhì)，并且包括通過重組方法制備的多肽或寡肽。如本文所述的，本發(fā)明的分離的fxyd1蛋白質(zhì)可作為較長多肽或融合蛋白質(zhì)的組成部分被包含。

因此，如本文所用的fxyd1的“衍生物”或“變體”體現(xiàn)以下功能要求：其能夠與enos相互作用，從而在保護(hù)enos免于氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的谷胱甘肽化和解偶聯(lián)方面起作用。應(yīng)當(dāng)理解，在“衍生物”和“變體”的背景下，“功能等同”不要求如對(duì)于fxyd1可見到的相同的定量結(jié)果。與參考fxyd1相比，衍生物或變體在實(shí)現(xiàn)期望的結(jié)果方面可能具有較高活性或可能具有較低活性。

應(yīng)當(dāng)理解，在本說明書通篇中，對(duì)于fxyd1在治療方法中的用途或在此類用途的背景中(例如提及用于治療的fxyd1的藥物組合物)的提及，不僅是指fxyd1，而且是指其衍生物、變體、片段等?？墒褂眯g(shù)語fxyd1的情況將僅僅是為了語言而不是意義的簡潔。

本發(fā)明提供編碼本發(fā)明的一種或多種fxyd1蛋白質(zhì)的多核苷酸以及編碼一種或多種包含本發(fā)明fxyd1蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)或多肽的多核苷酸，如本文所述的。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明的肽或其融合蛋白質(zhì)或功能等同物的多核苷酸序列或其片段可用于重組dna分子中以指導(dǎo)多肽在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中的表達(dá)。由于遺傳密碼的固有簡并性，因此可產(chǎn)生編碼基本上相同或功能等同的氨基酸序列的其它dna序列，并且這些序列可用于克隆和表達(dá)給定的多肽。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)識(shí)到的，多核苷酸可以是單鏈(編碼或反義)或雙鏈的，并且可以是dna(基因組的、cdna或合成的)或rna分子。rna分子包括hnrna分子，其含有內(nèi)含子并且以一對(duì)一的方式對(duì)應(yīng)于dna分子；和mrna分子，其不含有內(nèi)含子。另外的編碼或非編碼序列可以但不必存在于本發(fā)明的多核苷酸內(nèi)，并且多核苷酸可以但不必連接到其它分子和/或支撐材料。多核苷酸可包含天然序列(即，編碼fxyd1蛋白質(zhì)或其部分的內(nèi)源序列)，或可包含該序列的變體或生物或抗原功能等同物。多核苷酸變體可含有一個(gè)或多個(gè)如下文進(jìn)一步描述的取代、添加、缺失和/或插入，優(yōu)選使得所編碼的多肽的免疫原性相對(duì)于天然fxyd1蛋白質(zhì)不降低。通?？扇绫疚乃鰜碓u(píng)估對(duì)所編碼的多肽的免疫原性的影響。術(shù)語“變體”還涵蓋異種來源的同源基因。

為了表達(dá)期望的多肽，可將編碼所述肽、融合蛋白質(zhì)或多肽或功能等同物的核苷酸序列插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，即含有用于所插入的編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯的必需元件的載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法可用于構(gòu)建含有編碼目標(biāo)多肽的序列以及適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯控制元件的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組dna技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)基因重組。此類技術(shù)描述于sambrook，j.(1989)molecularcloning，alaboratorymanual，coldspringharborpress，plainview，n.y.和ausubel，f.m.等(1989)currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork.n.y.及其更新版本中。

因此，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的多核苷酸序列的載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，載體可以是表達(dá)載體。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的多核苷酸或載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供了用于制備本發(fā)明的肽的方法，所述方法包括在有助于所編碼的肽的表達(dá)的條件下培養(yǎng)包含本發(fā)明的多核苷酸或表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括純化所表達(dá)的肽。

在進(jìn)行本發(fā)明的方法時(shí)，通常使fxyd1與enos接觸或?qū)е缕渑cenos接觸以實(shí)現(xiàn)使得enos對(duì)抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的谷胱甘肽化和解偶聯(lián)的一定程度的保護(hù)?；蛘呋蛄硗?，可通過施用能夠增加或降低內(nèi)源fxyd1的表達(dá)的一種或多種試劑來改變細(xì)胞或組織內(nèi)源的fxyd1，使得例如導(dǎo)致另外的fxyd1與enos接觸。如本文所用的“接觸(contact)”或“接觸(contacting)”是指將組織、器官或細(xì)胞暴露于本發(fā)明的fxyd1蛋白質(zhì)或前藥，使得其可與enos相互作用。接觸可以是體外的，例如通過將fxyd1蛋白質(zhì)或前藥添加到培養(yǎng)的組織或細(xì)胞或血管組織或移植物中，用于診斷或研究目的或測試所述組織或細(xì)胞或血管組織或移植物對(duì)fxyd1蛋白質(zhì)或前藥的敏感性。接觸可以是體內(nèi)的，例如向受試者施用fxyd1蛋白質(zhì)或前藥，諸如用于治療或預(yù)防不期望的病況。接觸可以是離體的，諸如通過將血管移植物暴露于包含fxyd1的組合物。

如本文所述的，向受試者施用fxyd1可以是任何適當(dāng)?shù)男问交蚍绞?，諸如通過施用包含fxyd1的藥物組合物，施用諸如通過將血管移植物浸泡在包含fxyd1的組合物中而已暴露于fxyd1的所述移植物，施用fxyd1蛋白質(zhì)的前體諸如前藥或能夠表達(dá)fxyd1的載體中的編碼fxyd1的核酸序列，施用能夠遞送fxyd1的醫(yī)療裝置諸如支架。

用于將治療物質(zhì)遞送到脈管系統(tǒng)的裝置如支架是本領(lǐng)域已知的。因此，可通過任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄖ苽淠軌蜻f送fxyd1的醫(yī)療裝置如支架。適合的方法可參見例如標(biāo)題為“drug-elutingstent”的美國專利第5,697,967號(hào)；t.cooperwoods和andrewr.marks,drug-elutingstents,annualreviewofmedicine，第55卷:169-178；標(biāo)題為“drugelutingstent”的美國專利第7,135,038號(hào)；這些文獻(xiàn)中的每一個(gè)的內(nèi)容均以引用方式并入本文。

fxyd蛋白質(zhì)是脂溶性的且因此是膜溶性的。因此，在急性缺血性損傷的情況下施用fxyd1蛋白質(zhì)可用于例如fxyd1治療如梗塞和缺血再灌注損傷。所述蛋白質(zhì)可被靜脈內(nèi)施用或直接輸注到梗塞相關(guān)的動(dòng)脈中，例如在利用血管成形術(shù)進(jìn)行急性干預(yù)的情況下。在其它實(shí)施方案中，fxyd1蛋白質(zhì)的輸注可以數(shù)分鐘到數(shù)小時(shí)的時(shí)間尺度被施用。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的fxyd1蛋白質(zhì)可用蛋白質(zhì)、多肽、寡肽、抗體或其片段、放射性粒子、納米粒子或微粒產(chǎn)生或與其綴合。

如本文所述的，本發(fā)明的方法包括使用一種或多種試劑，所述試劑能夠增加細(xì)胞中功能性fxyd1的水平，從而影響可能導(dǎo)致與enos相互作用的功能性fxyd1的量。本發(fā)明的方法還涵蓋使用小分子來改善fxyd1和enos的功能相互作用。本領(lǐng)域已知使用例如影響靶基因表達(dá)的小分子的方法，使得所述靶基因的表達(dá)根據(jù)期望的情況增加或降低。通常，在本發(fā)明的方法中，靶基因編碼fxyd1或fxyd1表達(dá)的內(nèi)源調(diào)控物。通常，本發(fā)明包括增加靶細(xì)胞或靶組織中fxyd1的表達(dá)。靶基因產(chǎn)物的量的調(diào)控還可在轉(zhuǎn)錄后加工或翻譯的水平上受到影響。本發(fā)明的方法還涵蓋使用可能影響fxyd1表達(dá)的調(diào)控的微小rna(microrna)。已知mirna還與心臟和心血管疾病有關(guān)，因此本發(fā)明的方法還設(shè)想使用microrna、sirna、反義rna、核酶或shrna構(gòu)建體。

本發(fā)明的方法可以是體內(nèi)方法、離體方法或體外方法。體外方法的一個(gè)示例是用于研究或開發(fā)目的的方法。體內(nèi)方法的一個(gè)示例是治療或預(yù)防需要所述治療或預(yù)防的患者的疾病的方法。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括治療糖尿病性外周血管疾病(其中可通過浸泡外科處理的血管或移植物，以及通過動(dòng)脈內(nèi)注射到相關(guān)區(qū)域來直接施用治療)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括治療接受冠狀動(dòng)脈旁路手術(shù)的患者(其中可直接孵育移植物)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括治療接受例如用于冠狀動(dòng)脈循環(huán)、外周循環(huán)或腦循環(huán)的動(dòng)脈支架的患者，其中支架可用fxyd1遞送劑涂覆。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括治療具有透析所需的動(dòng)脈靜脈(也被稱為動(dòng)靜脈)瘺的慢性腎衰竭患者，其中瘺的失效是主要的臨床問題。如果在造瘺時(shí)或在對(duì)閉塞進(jìn)行外科干預(yù)時(shí)遞送，則預(yù)測fxyd1遞送是有益的。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括治療罹患急性心肌梗塞的患者，從而降低部分由內(nèi)皮功能障礙驅(qū)動(dòng)的心肌缺血-再灌注損傷。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括治療罹患急性腦血管意外(中風(fēng))的患者，其中缺血-再灌注損傷由內(nèi)皮功能障礙驅(qū)動(dòng)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括治療患有慢性血管疾病的患者，其中預(yù)測增加fxyd1在脈管系統(tǒng)中的表達(dá)的治療將減少血管事件。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括治療患有特征在于enos解偶聯(lián)、血管周纖維化和中膜肥厚的肺動(dòng)脈高壓(如特發(fā)型、或繼發(fā)于硬皮病或相關(guān)結(jié)締組織疾病狀態(tài))的患者。在這種情況下，吸入式基因療法是所選的遞送方法，該方法在其它肺疾病狀態(tài)中是成功的。

用于任何具體患者的最適當(dāng)?shù)闹委煼桨缚捎芍委熱t(yī)生確定并且將取決于多種因素，包括：正在治療的病癥和所述病癥的嚴(yán)重程度；所采用的化合物或試劑的活性；所采用的組合物；患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食；施用時(shí)間；施用途徑；試劑或化合物的螯合(sequestration)速率；治療的持續(xù)時(shí)間；與治療組合或同時(shí)使用的藥物，以及醫(yī)學(xué)中熟知的其它相關(guān)因素。

在本發(fā)明的一個(gè)方面，fxyd1的施用可作為“附加物”，其中可用常規(guī)藥物治療患者。例如，fxyd1可在用例如更常規(guī)的用于血管疾病的治療藥物或方案治療之前、期間或之后被施用。因此，應(yīng)當(dāng)了解，在本上下文中，術(shù)語“附加物”是指另外的治療整體(therapeuticinteger)(fxyd1)；這并不意味著fxyd1必須作為最后的藥物添加。組合療法中特定藥物和藥物類別的順序和組成可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定，并且可包括例如在治療方案涉及施用多種藥物類別的情況下，可在所述方案期間的任何階段施用fxyd1。

作為本發(fā)明方法的治療方案的又一示例，可在施用fxyd1之前使罹患心肌梗塞的患者的病況至少部分地穩(wěn)定。此外，可在開始本發(fā)明的方法之前使患者的病況至少部分地穩(wěn)定。此類治療方案中的任一種均可被稱為首先使患者穩(wěn)定。

作為治療方案的又一示例，fxyd1可以是在沒有任何預(yù)先藥物治療或穩(wěn)定化的情況下在血管疾病的治療中施用的第一種藥物。針對(duì)本發(fā)明提出的fxyd1蛋白質(zhì)可作為組合物被治療性地或預(yù)防性地施用。在治療性應(yīng)用中，以足以有效治療患者的量向該患者施用組合物，該患者已患有特征在于脈管系統(tǒng)的氧化還原誘導(dǎo)的功能障礙的病況。

用于任何具體患者的治療有效劑量水平將取決于多種因素，包括：正在治療的病癥和所述病癥的嚴(yán)重程度；所采用的化合物或試劑的活性；所采用的組合物；患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食；施用時(shí)間；施用途徑；試劑或化合物的螯合速率；治療的持續(xù)時(shí)間；與治療組合或同時(shí)使用的藥物，以及醫(yī)學(xué)中熟知的其它相關(guān)因素。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)來確定fyxd1蛋白質(zhì)的有效量，以及治療該病況所需的其它適當(dāng)藥劑。

此外，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將顯而易見的是，單個(gè)劑量的最佳量和間隔，以及在使用組合療法的情況下，施用所述組合療法的各種試劑的最佳量和間隔，將由正在治療的疾病狀況或狀態(tài)的性質(zhì)和程度、施用的形式、途徑和部位以及正在治療的具體個(gè)體的性質(zhì)來確定。此外，此類最佳條件可通過常規(guī)技術(shù)確定。

通常，包含fxyd1的適合的組合物可根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法制備，且因此可包含藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑和/或佐劑。

這些組合物可通過標(biāo)準(zhǔn)途徑被施用。通常，所述組合物可通過胃腸外(例如靜脈內(nèi)、脊柱內(nèi)、皮下或肌內(nèi))途徑被施用。所述組合物可通過動(dòng)脈內(nèi)注射到相關(guān)區(qū)域來施用。所述組合物可通過例如將脈管系統(tǒng)暴露于包含fxyd1的組合物來施用，諸如通過將血管移植物浸泡在包含fxyd1的組合物中。fxyd1可通過使用醫(yī)療裝置諸如包含fxyd1的支架來施用，所述支架可以是涂覆的支架，其中所述涂層包含fxyd1，在這種情況下，所述組合物可用于制備所述醫(yī)療裝置。因此，包含fxyd1的組合物可以是適于例如涂覆到支架之上或之中的形式，或適于諸如通過在植入之前浸泡或輸注到血管移植物中而接觸脈管系統(tǒng)的形式。

就與組合物的其它成分相容來說，載體、稀釋劑、賦形劑和佐劑必須是“可接受的”，并且對(duì)其接受者無害。藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑的示例是脫礦質(zhì)水或蒸餾水；鹽水溶液；基于植物的油，如花生油(peanutoil)、紅花油、橄欖油、棉籽油、玉米油、芝麻油、花生油(arachisoil)或椰子油；硅酮油，包括聚硅氧烷，如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷和甲苯基聚硅氧烷(methylphenylpolysolpoxane)；揮發(fā)性硅酮；礦物油，如液體石蠟、軟石蠟或角鯊?fù)?；纖維素衍生物，如甲基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉或羥丙基甲基纖維素；dmso、n,n-二甲基乙酰胺(dma)、低級(jí)烷醇例如乙醇或異丙醇；低級(jí)芳烷醇；低級(jí)聚亞烷基二醇或低級(jí)亞烷基二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯，諸如棕櫚酸異丙酯、肉豆蔻酸異丙酯或油酸乙酯；聚乙烯基吡咯烷酮(polyvinylpyrridone)；瓊脂；角叉菜膠；黃芪膠或阿拉伯膠，和礦油凝膠。通常，所述一種或多種載體將構(gòu)成所述組合物重量的10％到99.9％。

所述組合物可包含增加一種或多種活性化合物的生物利用度或治療持續(xù)時(shí)間的試劑。

本發(fā)明的組合物可以是適于腸胃外(諸如經(jīng)皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射或輸注)施用的形式。

對(duì)于作為可注射溶液或懸浮液施用來說，無毒的腸胃外可接受的稀釋劑或載體可包括林格氏溶液(ringer'ssolution)、等滲鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、乙醇和1,2丙二醇。

佐劑通常包括潤膚劑、乳化劑、增稠劑、防腐劑、殺菌劑和緩沖劑。

由于fxyd1蛋白質(zhì)是脂溶性的，因此所述組合物還可以脂質(zhì)體的形式被施用。脂質(zhì)體通常衍生自磷脂或其它脂質(zhì)物質(zhì)，并且通過分散在水性介質(zhì)中的單層或多層水合液體晶體形成?？墒褂媚軌蛐纬芍|(zhì)體的任何無毒的、生理上可接受的且可代謝的脂質(zhì)。脂質(zhì)體形式的組合物可含有穩(wěn)定劑、防腐劑、賦形劑等。優(yōu)選的脂質(zhì)是天然的和合成的磷脂和磷脂酰膽堿(卵磷脂)。形成脂質(zhì)體的方法是本領(lǐng)域已知的，并且關(guān)于這一點(diǎn)具體參考：prescott編輯，methodsincellbiology，第xiv卷，academicpress，newyork，n.y.(1976)第33頁及后面頁，其內(nèi)容以引用方式并入本文。

本文已參考實(shí)驗(yàn)結(jié)果描述了本發(fā)明。實(shí)驗(yàn)意在用于說明本發(fā)明，并且不應(yīng)被解釋為限制本說明書通篇的說明的公開內(nèi)容的一般性。

在允許的范圍內(nèi)，本文中所引用的所有參考文獻(xiàn)均以引用方式整體并入。

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