發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及陽離子脂質(zhì)化合物和包含這些化合物的組合物。本發(fā)明還涉及制備這些化合物和組合物的方法，以及這些化合物和組合物的方法和用途，例如將生物活性劑如rna劑遞送至細胞和組織的方法和用途。發(fā)明背景生物活性劑(包括治療相關(guān)化合物)向受試者的遞送通常受阻于難以到達靶細胞或組織的化合物。特別地，許多生物活性劑向活細胞中的運輸受到復雜的細胞膜系統(tǒng)的很大限制。這些限制可導致需要使用比達到結(jié)果所需要的高得多的生物活性劑的濃度，這增加了毒性作用和副作用的風險。該問題的一個解決方案是利用允許選擇性進入細胞的特定載體分子和載體組合物。可以使用脂質(zhì)載體，可生物降解聚合物和各種綴合系統(tǒng)來改善生物活性劑向細胞的遞送。一類特別難以遞送至細胞的生物活性劑是生物治療劑(包括核苷、核苷酸、多核苷酸、核酸和衍生物如rna劑)。通常，核酸在細胞或血漿中僅在有限時間內(nèi)是穩(wěn)定的。rna干擾、rnai治療、mrna治療、rna藥物、反義療法、基因療法和基于核酸的疫苗(例如rna疫苗)等的發(fā)展增加了將活性核酸活性劑引入細胞的有效方式的需求。由于這些原因，可以穩(wěn)定基于核酸的活性劑并將其遞送到細胞中的組合物是特別有意義的。用于改善外來核酸至細胞中的轉(zhuǎn)運的最為廣泛研究的方法包括使用病毒載體或陽離子脂質(zhì)的配制物。病毒載體可用于將基因有效轉(zhuǎn)運至某些細胞類型中，但是它們通常不能用于將化學合成的分子引入細胞。一種替代方法是使用含有陽離子脂質(zhì)的遞送組合物，所述脂質(zhì)一部分與生物活性劑相互作用且另一部分與膜系統(tǒng)相互作用。據(jù)報道此類組合物提供了脂質(zhì)體、微囊(miscelles)、脂質(zhì)體復合物(lipoplexes)或脂質(zhì)納米顆粒(根據(jù)組合物和制備方法)(綜述參見felgner，1990，advanceddrugdeliveryreviews，5,162-187；felgner，1993，j.liposomeres.,3,3-16；gallas，2013，chem.soc.rev.,42,7983-7997；falsini，2013，j.med.chem.dx.doi.org/10.1021/jm400791q；及其中的參考文獻)。自從1957年由bangham(j.mol.biol.13,238-252)首次描述脂質(zhì)體以來，在開發(fā)用于遞送生物活性劑的基于脂質(zhì)的載體系統(tǒng)方面已經(jīng)有持續(xù)的興趣和努力(allen，2013，advanceddrugdeliveryreviews，65,36-48)。philipfelgner等人,proc.natl.acad.sci.,usa,84,7413-7417(1987)首先描述了通過使用帶正電荷的脂質(zhì)體將功能性核酸引入培養(yǎng)細胞的方法。隨后在k.l.bbrigham等人,am.j.med.sci.,298,278-281(1989)中該方法在體內(nèi)得到證實。最近，脂質(zhì)納米顆粒配制物已經(jīng)在體外和體內(nèi)被證明有效。(falsini,2013,j.med.chem.dx.doi.org/10.1021/jm400791q；morrissey,2005,nat.biotech.,23,1002-1007；zimmerman,2006,nature,441,111-114.；jayaraman,2012,angew.chem.int.ed.,51,8529-8533.)脂質(zhì)配制物是有吸引力的載體，因為它們可以保護生物分子免于降解，同時改善其細胞攝取。在各種類型的脂質(zhì)配制物中，含有陽離子脂質(zhì)的配制物通常用于遞送聚陰離子(例如核酸)。這種配制物可以單獨使用陽離子脂質(zhì)形成，并任選地包括其它脂質(zhì)和兩親物如磷脂酰乙醇胺。本領(lǐng)域眾所周知，脂質(zhì)配制物的組成以及其制備方法均影響所得聚合體的結(jié)構(gòu)和尺寸(leung,2012,j.physchem.c,116,18440-18450)。使用陽離子脂質(zhì)包封陰離子化合物，由于靜電相互作用基本上是定量的。此外，據(jù)信陽離子脂質(zhì)與啟動細胞膜轉(zhuǎn)運的帶負電荷的細胞膜相互作用(akhtar等人,1992,trendscellbio.,2,139；xu等人,1996,biochemistry35,5616)。此外，據(jù)信陽離子脂質(zhì)的分子形狀、構(gòu)型和性質(zhì)提供了從內(nèi)體區(qū)室至細胞液的增強的遞送效率(semple，2010，nat.biotech，28,172-176；zhang，2011,27,9473-9483)盡管使用陽離子脂質(zhì)用于細胞遞送生物活性劑已被證明具有若干優(yōu)點，但仍然需要進一步的陽離子脂質(zhì)，其促進生物活性劑如mrna和rnai劑向細胞的全身和局部遞送。還需要陽離子脂質(zhì)，相對于本領(lǐng)域已知的那些陽離子脂質(zhì)，改善生物活性劑向細胞的全身和局部遞送。還需要具有優(yōu)化的物理特性的脂質(zhì)配制物，以改進生物活性劑至特定器官和腫瘤、特別是肝外腫瘤的全身和局部遞送。此外，相對于本領(lǐng)域已知的那些陽離子脂質(zhì)，需要提供減小的毒性(或改善的治療指數(shù))的另外的陽離子脂質(zhì)。傳統(tǒng)的陽離子脂質(zhì)已經(jīng)用于將rna和dna遞送到肝臟或腫瘤，但是在較高劑量下會受到非最佳遞送效率以及組織和器官毒性的影響。一種減少陽離子脂質(zhì)的暴露和增加生物相容性的方法是引入化學或生化學可降解的官能團(如酯、酰胺、縮醛、亞胺等)，這能使得體內(nèi)清除率提高(maier,2013,21,1570-1578)。發(fā)明概述本發(fā)明提供一種陽離子脂質(zhì)骨架，由于在相關(guān)組織中持續(xù)的較低的脂質(zhì)水平其顯示出增強的效力以及更低的毒性(改善的治療指數(shù))，并用于局部遞送應用(眼睛、耳朵、皮膚、肺)；遞送至肌肉(i.m.)、脂肪或皮下細胞(s.c.給藥)。在一個方面中，本發(fā)明提供了式(i)的化合物:或其可藥用鹽，其中ra、rb、r2和r4如本文所定義。式(i)的化合物及其可藥用鹽是可用于將生物活性劑遞送至細胞和組織的陽離子脂質(zhì)。在第二個方面中，本發(fā)明提供了包含式(i)的化合物(即本發(fā)明的脂質(zhì)組合物)或其可藥用鹽的脂質(zhì)組合物。在一個實施方案中，脂質(zhì)組合物還包含至少一種其它脂質(zhì)組分。在另一個實施方案中，所述脂質(zhì)組合物還包含生物活性劑，任選地還有一種或多種其它脂質(zhì)組分。在另一個實施方案中，脂質(zhì)組合物是脂質(zhì)體的形式。在另一個實施方案中，脂質(zhì)組合物為脂質(zhì)納米顆粒(lnp)的形式。在另一個實施方案中，脂質(zhì)組合物適于遞送至肝臟。在另一個實施方案中，脂質(zhì)組合物適于遞送至腫瘤。在另一個實施方案中，脂質(zhì)組合物適用于免疫目的。在另一個實施方案中，脂質(zhì)組合物適用于局部遞送應用(眼、耳、皮膚、肺)；遞送到肌肉(i.m.)、脂肪或皮下細胞(s.c.給藥)。在第三個方面中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的脂質(zhì)組合物和可藥用載體或賦形劑的藥物組合物(即配制物)。在一個實施方案中，藥物組合物包含在脂質(zhì)組合物中的至少一種其它脂質(zhì)組分。在另一個實施方案中，脂質(zhì)組合物是脂質(zhì)體的形式。在另一個實施方案中，脂質(zhì)組合物是脂質(zhì)納米顆粒的形式。在另一個實施方案中，脂質(zhì)組合物適于遞送至肝臟。在另一個實施方案中，脂質(zhì)組合物適于遞送至腫瘤。在另一個實施方案中，脂質(zhì)組合物適用于局部遞送應用(眼、耳、皮膚、肺)；遞送到肌肉(i.m.)、脂肪或皮下細胞(s.c.給藥)。在另一個實施方案中，生物活性劑是rna或dna。在另一個實施方案中，脂質(zhì)組合物適用于免疫目的，生物活性劑是編碼免疫原的rna或dna。在第四個方面中，本發(fā)明提供了治療疾病或病癥的方法，其包括將治療有效量的本發(fā)明的脂質(zhì)組合物施用于需要所述治療的患者的步驟。在一個實施方案中，所述疾病或病癥可以通過施用rna或dna劑治療。在另一個實施方案中，脂質(zhì)組合物適用于免疫目的，且生物活性劑是編碼免疫原的rna或dna。在第五個方面中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的脂質(zhì)組合物在治療患者的疾病或病癥中的用途。在一個實施方案中，可以通過施用rna或dna劑治療疾病或病癥。在第六個方面中，本發(fā)明提供了一種針對感興趣的免疫原在受試者中誘導免疫應答的方法，包括向受試者施用免疫有效量的本發(fā)明的脂質(zhì)組合物及編碼免疫原的rna或dna。在第七個方面中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的脂質(zhì)組合物在受試者中針對感興趣的免疫原誘導免疫應答的用途。所述脂質(zhì)與編碼免疫原的rna或dna組合使用。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的脂質(zhì)組合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于在受試者中針對感興趣的免疫原誘導免疫應答。發(fā)明詳述在第一個實施方案中，本發(fā)明是式(i)的化合物或其鹽:其中ra和rb中的任一個是–o-r3，且另一個是–ch2-o-c(o)-r1；r1是c1-6-亞烷基-nr’r”、c1-6-烷氧基-nr’r”、雜環(huán)基、雜環(huán)基-c1-8-烷基或雜環(huán)基-c1-8-烷氧基，其各自可任選地被1、2或3個獨立地選自以下的基團所取代：鹵素、c1-8-烷基和c3-7-環(huán)烷基；r’和r”各自獨立地是氫或-c1-8-烷基；r2和r3各自獨立地是c12-22烷基、c12-22鏈烯基、r4選自氫、鹵素和c1-4烷基。在第二個實施方案中，本發(fā)明是根據(jù)第一個實施方案的化合物或其鹽，其中該化合物具有式(ii)的結(jié)構(gòu)：在第三個實施方案中，本發(fā)明是根據(jù)第一個實施方案的化合物或其鹽，其中所述化合物具有式(iii)的結(jié)構(gòu):在第四個實施方案中，本發(fā)明是根據(jù)第一至三個實施方案中任一項的化合物或其鹽，其中r4是氫。在第五個實施方案中，本發(fā)明是根據(jù)第一至四個實施方案中任一項的化合物或其鹽，其中r1選自:在第六個實施方案中，本發(fā)明是根據(jù)第一至五個實施方案中任一項的化合物或其鹽，其中r1是在第七個實施方案中，本發(fā)明是根據(jù)第一至六個實施方案中任一項的化合物或其鹽，其中r2選自:在第八個實施方案中，本發(fā)明是根據(jù)第一至七個實施方案中任一項的化合物或其鹽，其中r2選自:在第九個實施方案中，本發(fā)明是根據(jù)第一至八個實施方案中任一項的化合物或其鹽，其中r3選自在第十個實施方案中，本發(fā)明是根據(jù)第一至九個實施方案中任一項的化合物或其鹽，其中r3選自:在另一個實施方案中，本發(fā)明是根據(jù)第一至十個實施方案中任一項的化合物或其鹽，其中r2和r3是相同的。在第十一個實施方案中，本發(fā)明是根據(jù)第一至十個實施方案中任一項的化合物或其鹽，其中化合物選自:4-(二甲基氨基)丁酸2,5-雙((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基)芐基酯；雙癸酸((2-(((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(辛烷-8,1-二基)酯；雙癸酸((2-(((3-(二甲基氨基)丙酰基)氧基)甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(辛烷-8,1-二基)酯；雙癸酸((2-(((1-甲基哌啶-4-羰基)氧基)甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(辛烷-8,1-二基)酯；雙癸酸((2-((((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(辛烷-8,1-二基)酯；雙癸酸((2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(辛烷-8,1-二基)酯；碳酸3-(二甲基氨基)丙基酯4-甲基-2,5-雙((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基)芐基酯；4-(二甲基氨基)丁酸4-甲基-2,5-雙((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基)芐基酯；(9z,9’z,12z,12’z)-雙-十八碳-9,12-二烯酸((2-(((4-(二甲基氨基)丁?；?氧基)甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(丁烷-4,1-二基)酯；碳酸4-(二甲基氨基)丁基酯4-甲基-2,5-雙((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基)芐基酯；雙癸酸((2-(((1-乙基哌啶-4-羰基)氧基)甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(辛烷-8,1-二基)酯；雙癸酸((2-(((1-異丙基哌啶-4-羰基)氧基)甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(辛烷-8,1-二基)酯；雙癸酸((2-((2-(1-甲基哌啶-4-基)乙酸基)甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(辛烷-8,1-二基)酯；雙癸酸((2-(((4-(吡咯烷-1-基)丁?；?氧基)甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(辛烷-8,1-二基)酯；碳酸2,5-雙((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基)芐基酯(3-(二甲基氨基)丙基)酯；(9z,9’z,12z,12’z)-雙-十八碳-9,12-二烯酸((2-(((4-(二甲基氨基)丁?；?氧基)甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(乙烷-2,1-二基)酯；3-(二甲基氨基)丙酸2,5-雙((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基)芐基酯；碳酸2,5-雙((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基)芐基酯(3-(二乙基氨基)丙基)酯；雙癸酸((4-(((4-(二甲基氨基)丁?；?氧基)甲基)-1,3-亞苯基)雙(氧基))雙(辛烷-8,1-二基)酯；雙癸酸((4-(((4-(二乙基氨基)丁?；?氧基)甲基)-1,3-亞苯基)雙(氧基))雙(辛烷-8,1-二基)酯；雙4,4-雙(辛基氧基)丁酸((2-(((4-(二乙基氨基)丁?；?氧基)甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(戊烷-5,1-二基)酯；癸酸8-(4-((5-((4,4-雙(辛基氧基)丁酰基)氧基)戊基)氧基)-3-(((4-(二甲基氨基)丁?；?氧基)甲基)苯氧基)辛基酯；癸酸8-(4-((5-((4,4-雙(辛基氧基)丁?；?氧基)戊基)氧基)-2-(((4-(二甲基氨基)丁?；?氧基)甲基)苯氧基)辛基酯；雙4,4-雙(辛基氧基)丁酸((2-(((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(丙烷-3,1-二基)酯；雙癸酸((4-(((1,4-二甲基哌啶-4-羰基)氧基)甲基)-1,3-亞苯基)雙(氧基))雙(辛烷-8,1-二基)酯；雙4,4-雙(辛基氧基)丁酸((2-(((4-(二甲基氨基)丁?；?氧基)甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(戊烷-5,1-二基)酯；雙4,4-雙(辛基氧基)丁酸((2-(((1,4-二甲基哌啶-4-羰基)氧基)甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(戊烷-5,1-二基)酯；和4-(二甲基氨基)丁酸2,4-雙((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基)芐基酯。在第十二個實施方案中，本發(fā)明是包含根據(jù)第一至第十一個實施方案中任一項的化合物或其可藥用鹽的脂質(zhì)組合物。在第十三個實施方案中，本發(fā)明是根據(jù)第十二個實施方案的脂質(zhì)組合物，其還包含生物活性劑。在第十四個實施方案中，本發(fā)明是根據(jù)第十三個實施方案的脂質(zhì)組合物，其中生物活性劑是核酸。在第十五個實施方案中，本發(fā)明是根據(jù)第十三至第十四個實施方案中任一項的脂質(zhì)組合物，其中所述生物活性劑是dna、sirna或mrna。在第十六個實施方案中，本發(fā)明是根據(jù)第十三至第十五個實施方案中任一項的脂質(zhì)組合物，其中所述生物活性劑是mrna。在第十七個實施方案中，本發(fā)明是根據(jù)第十三至第十五個實施方案中任一項的脂質(zhì)組合物，其中所述生物活性劑是sirna。在第十八個實施方案中，本發(fā)明是根據(jù)第十二至第十七個實施方案中任一項的脂質(zhì)組合物，其還包含輔助脂質(zhì)。在第十九個實施方案中，本發(fā)明是根據(jù)第十二至第十八個實施方案中任一項的脂質(zhì)組合物，還包含中性脂質(zhì)。在第二十個實施方案中，本發(fā)明是根據(jù)第十二至第十九個實施方案中任一項的脂質(zhì)組合物，其還包含隱形脂質(zhì)(stealthlipid)。在第二十一個實施方案中，本發(fā)明是根據(jù)第十二至第二十個實施方案中任一項的脂質(zhì)組合物，其中輔助脂質(zhì)是膽固醇，中性脂質(zhì)是dspc，隱形脂質(zhì)是s010、s024、s027、s031或s033。在第二十二個實施方案中，本發(fā)明是根據(jù)第十二至第二十一個實施方案中任一項的脂質(zhì)組合物，其中所述脂質(zhì)組合物為脂質(zhì)納米顆粒的形式。在第二十三個實施方案中，本發(fā)明是根據(jù)第十二至第二十二個實施方案中任一項的脂質(zhì)組合物，其具有30-60％的式(i)的化合物，5-10％膽固醇/30-60％的dspc，以及.1-5％的s010、s024、s027、s031或s033。在第二十四個實施方案中，本發(fā)明是根據(jù)第十二至第二十三個實施方案中任一項的脂質(zhì)組合物，其中所述脂質(zhì)組合物的ph在包封和/或配制時為4-8。在第二十五個實施方案中，本發(fā)明是根據(jù)第十二至第二十四個實施方案中任一項的脂質(zhì)組合物，其中所述脂質(zhì)組合物的ph在包封和/或配制時為5-7。在第二十六個實施方案中，本發(fā)明是根據(jù)第十二至第二十五個實施方案中任一項的脂質(zhì)組合物，其中所述脂質(zhì)組合物的ph在包封和/或配制時為5.9-6.5。在一個實施方案中，本發(fā)明是根據(jù)第十二至第二十五個實施方案中任一項的脂質(zhì)組合物，其中所述脂質(zhì)組合物的ph在包封和/或配制時為5.9。在另一個實施方案中，本發(fā)明是根據(jù)第十二至第二十五個實施方案中任一項的脂質(zhì)組合物，其中所述脂質(zhì)組合物的ph在包封和/或配制時為6.0。在又一個實施方案中，本發(fā)明是根據(jù)第十二至第二十五個實施方案中任一項的脂質(zhì)組合物，其中所述脂質(zhì)組合物的ph在包封和/或配制時為6.1。在另一個實施方案中，本發(fā)明是根據(jù)第十二至第二十五個實施方案中任一項的脂質(zhì)組合物，其中所述脂質(zhì)組合物的ph在包封和/或配制時為6.2。在又一個實施方案中，本發(fā)明是根據(jù)第十二至第二十五個實施方案中任一項的脂質(zhì)組合物，其中所述脂質(zhì)組合物的ph在包封和/或配制時為6.3。在另一個實施方案中，本發(fā)明是根據(jù)第十二至第二十五個實施方案中任一項的脂質(zhì)組合物，其中所述脂質(zhì)組合物的ph在包封和/或配制時為6.4。在又一個實施方案中，本發(fā)明是根據(jù)第十二至第二十五個實施方案中任一項的脂質(zhì)組合物，其中所述脂質(zhì)組合物的ph在包封和/或配制時為6.5。在第二十七個實施方案中，本發(fā)明是包含根據(jù)第十二至第二十六個實施方案中任一項的脂質(zhì)組合物以及可藥用載體或賦形劑的藥物組合物。在第二十八個實施方案中，本發(fā)明是一種治療疾病或病癥的方法，所述方法包括將治療有效量的根據(jù)第十二至第二十七個實施方案中任一項的脂質(zhì)組合物施用于需要所述治療的患者的步驟。在第二十九個實施方案中，本發(fā)明提供了包含實施方案1-11中任一項的化合物的脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體包封有編碼免疫原的rna分子。在第三十個實施方案中，本發(fā)明提供了包含實施方案1-11中任一項的化合物的脂質(zhì)納米顆粒(lnp)，其中所述lnp(i)包封有編碼免疫原的rna分子，或(ii)與編碼免疫原的rna分子復合。在第三十一個實施方案中，本發(fā)明提供了實施方案29的脂質(zhì)體或?qū)嵤┓桨?0的lnp，其中所述脂質(zhì)體的直徑在80-160nm的范圍內(nèi)。在第三十二個實施方案中，本發(fā)明提供了實施方案29-31中任一項的脂質(zhì)體或lnp，其中所述脂質(zhì)體還包含含有兩性離子頭基的脂質(zhì)。在第三十三個實施方案中，本發(fā)明提供了實施方案29-32中任一項的脂質(zhì)體或lnp，其中所述脂質(zhì)體還包含dlindma(1,2-二亞油基氧基-n,n-二甲基-3-氨基丙烷)、dspc(1,2-雙硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿)、膽固醇、聚乙二醇化脂質(zhì)或其組合。在第三十四個實施方案中，本發(fā)明提供包含實施方案29-33中任一項的脂質(zhì)體或lnp的藥物組合物。在第三十五個實施方案中，本發(fā)明提供了包含脂質(zhì)體群和免疫原編碼rna分子群的藥物組合物，其中所述脂質(zhì)體包含實施方案1-11中任一項的化合物，且其中rna分子群的至少一半被包封在脂質(zhì)體中。在第三十六個實施方案中，本發(fā)明提供包含納米顆粒(lnp)群和編碼免疫原的rna分子群的藥物組合物，其中所述lnp包含權(quán)利要求1-11中任一項的化合物，且其中rna分子群的至少一半(i)被包封在lnp中；或(ii)與lnp復合。在第三十七個實施方案中，本發(fā)明提供了一種實施方案35或36的藥物組合物，其中(i)至少80％數(shù)量的脂質(zhì)體或lnp具有60-180nm范圍內(nèi)的直徑，(ii)所述群體的平均直徑在60-180nm的范圍內(nèi)，或(iii)脂質(zhì)體或lnp的直徑具有<0.2的多分散指數(shù)。在第三十八個實施方案中，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含(i)根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項所述的化合物或其可藥用鹽；(ii)編碼免疫原的rna分子。在又一個實施方案中，本發(fā)明提供了實施方案38的藥物組合物，其還包含含有兩性離子頭基的脂質(zhì)。在又一個實施方案中，本發(fā)明提供了實施方案38的藥物組合物，其還包含dlindma(1,2-二亞油基氧基-n,n-二甲基-3-氨基丙烷)，dspc(1,2-雙硬脂?；?sn-甘油基-3-磷酸膽堿)、膽固醇、聚乙二醇化脂質(zhì)或其組合。在第三十九個實施方案中，本發(fā)明提供了實施方案29-33中任一項的脂質(zhì)體或lnp或?qū)嵤┓桨?4-38中任一項的藥物組合物，其中所述rna是自我復制的rna。在第四十個實施方案中，本發(fā)明提供實施方案39的脂質(zhì)體、lnp或藥物組合物，其中所述自復制rna編碼rna依賴性rna聚合酶。在第四十一個實施方案中，本發(fā)明提供實施方案39或40的脂質(zhì)體、lnp或藥物組合物，其中所述自復制rna包含兩個可讀框，其中第一個編碼甲病毒屬復制酶，其中第二個編碼免疫原。在第四十二個實施方案中，本發(fā)明提供了實施方案39-41中任一項的脂質(zhì)體、lnp或藥物組合物，其中所述自復制rna為9000-12000個核苷酸長。在第四十三個實施方案中，本發(fā)明提供了實施方案29-42中任一項的脂質(zhì)體、lnp或藥物組合物，其中所述免疫原可在體內(nèi)引起針對細菌、病毒、真菌或寄生蟲的免疫應答。在第四十四個實施方案中，本發(fā)明提供了一種在脊椎動物中誘導免疫應答的方法，其包括向所述脊椎動物施用有效量的實施方案29-43中任一項的脂質(zhì)體、lnp或藥物組合物。本文中使用的術(shù)語“烷基”是指具有規(guī)定數(shù)目碳原子的完全飽和的支鏈或非支鏈烴鏈。例如，c1-6烷基是指具有1-6個碳原子的烷基。例如，c2-6烷基是指具有2-6個碳原子的烷基。例如，c1-8烷基是指具有1至8個碳原子的烷基。例如，c4-22烷基是指具有4至22個碳原子的烷基。例如，c6-10烷基是指具有6至10個碳原子的烷基。例如，c12-22烷基是指具有12至22個碳原子的烷基。烷基的代表性示例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、新戊基、正己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一烷基、正十二烷基、正十三烷基、9-甲基十七烷基、1-庚基癸基、2-辛基癸基、6-己基十二烷基、4-庚基十一烷基等。本文中使用的術(shù)語“亞烷基”是指上文中所定義的二價烷基。亞烷基的代表性示例包括但不限于亞甲基、亞乙基、正亞丙基、異亞丙基、正亞丁基、仲亞丁基、異亞丁基、叔亞丁基、正亞戊基、異亞戊基、新亞戊基、正-亞己基、3-甲基亞己基、2,2-二甲基亞戊基、2,3-二甲基亞戊基、正亞庚基、正亞辛基、正亞壬基、正亞癸基等。例如，c1-6亞烷基是指具有1至6個碳原子的亞烷基。本文中使用的術(shù)語“鏈烯基”是指具有規(guī)定數(shù)目碳原子并且在鏈中具有一或多個碳-碳雙鍵的不飽和的支鏈或非支鏈烴鏈。例如，c12-22鏈烯基是指具有12至22個碳原子并且在鏈中具有一或多個碳-碳雙鍵的鏈烯基。在某些實施方案中，鏈烯基在鏈中具有一個碳-碳雙鍵。在其它實施方案中，鏈烯基在鏈中具有一個以上的碳-碳雙鍵。鏈烯基可以任選被一或多個式(i)中所定義的取代基取代。鏈烯基的代表性示例包括但不限于乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基等。鏈烯基的其它示例包括但不限于：z-十八碳-9-烯基、z-十一碳-7-烯基、z-十七-8-烯基、(9z,12z)-十八碳-9,12-二烯基、(8z,11z)-十七-8,11-二烯基、(8z，11z，14z)-十七-8,11,14-三烯基、亞麻基(linolenyl)、2-辛基癸-1-烯基、亞油基(linoleyl)和油基(olelyl)。本文中使用的術(shù)語“烷氧基”是指通過氧橋連接的任何烷基部分(即–o-c1-3烷基基團，其中c1-3烷基如本文所定義)。此類基團的示例包括但不限于甲氧基、乙氧基和丙氧基。例如，c1-6烷氧基是指具有1至6個碳原子的烷氧基。本文中使用的術(shù)語“環(huán)烷基”是指具有指定數(shù)目碳原子的飽和的單環(huán)、雙環(huán)或三環(huán)烴環(huán)。例如，c3-7環(huán)烷基是指具有3-7個碳原子的環(huán)烷基環(huán)。環(huán)烷基可以任選被一或多個式(i)中所定義的取代基取代。環(huán)烷基的代表性示例包括但不限于環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、雙環(huán)[2.1.1]己基、雙環(huán)[2.2.1]庚基、金剛烷基等。本文中使用的術(shù)語“鹵素”是指氟、氯、溴和碘。本文中使用的術(shù)語“雜環(huán)”是指含有1-4個雜原子的4-12元飽和的或不飽和的單環(huán)或雙環(huán)。雜環(huán)環(huán)系不為芳族。含有多于一個雜原子的雜環(huán)基團可能含有不同的雜原子。雜環(huán)基團可以是單環(huán)、螺環(huán)或稠合的或橋連的雙環(huán)環(huán)系。單環(huán)雜環(huán)基團的示例包括四氫呋喃基、二氫呋喃基、1,4-二噁烷基、嗎啉基、1,4-二噻烷基、氮雜環(huán)丁基、哌嗪基、哌啶基、1,3-二氧戊環(huán)基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡咯啉基、吡咯烷基、四氫吡喃基、二氫吡喃基、1,2,3,6-四氫吡啶基、氧硫雜環(huán)戊烷基、二硫雜環(huán)戊烷基、1,3-二噁烷基、1,3-二噻烷基、氧雜噻烷基、硫代嗎啉基、1,4,7-三氧雜-10-氮雜環(huán)十二烷基、氮雜環(huán)庚基(azapanyl)等。螺雜環(huán)的示例包括但不限于1,5-二氧雜-9-氮雜螺[5.5]十一烷基、1,4-二氧雜-8-氮雜螺[4.5]癸基、2-氮雜-7-氮雜螺[3.5]壬基等。稠合的雜環(huán)環(huán)系具有8-11個環(huán)原子，包括如下基團：其中雜環(huán)與苯環(huán)稠合。稠合雜環(huán)的示例包括但不限于十氫喹啉基(decahydroqunilinyl)、(4as,8ar)-十氫異喹啉基、(4as,8as)-十氫異喹啉基、八氫環(huán)戊二烯并[c]吡咯基、異吲哚啉基(isoinolinyl)、(3ar,7as)-六氫-[1,3]二氧雜環(huán)戊烯并(dioxolo)[4.5-c]吡啶基、八氫-1h-吡咯并[3,4-b]吡啶基、四氫異喹啉基等。本文中使用的術(shù)語“雜環(huán)基c1-8烷基”是指如上定義的雜環(huán)，其通過單鍵或如上所定義的c1-8烷基連接到分子的其余部分。本文中使用的術(shù)語“雜環(huán)基c1-8烷氧基”是指如上定義的雜環(huán)，其通過單鍵或如上所定義的c1-8烷氧基連接至分子的其余部分。本文中使用的術(shù)語“光學異構(gòu)體”或“立體異構(gòu)體”是指本發(fā)明指定化合物可能存在的任何各種立體異構(gòu)構(gòu)型，包括幾何異構(gòu)體。應當理解，取代基可以與碳原子的手性中心連接。術(shù)語“手性”是指與其鏡像分子對具有非重疊性特征的分子，而術(shù)語“非手性”是指與其鏡像分子對能夠重疊的分子。因此，本發(fā)明包括化合物的對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體或外消旋體?！皩τ钞悩?gòu)體”是彼此鏡像不重疊的一對立體異構(gòu)體。一對對映異構(gòu)體的1:1混合物為“外消旋”混合物。在適當?shù)臅r候，該術(shù)語用于命名外消旋混合物?！胺菍τ钞悩?gòu)體”為具有至少兩個不對稱原子的立體異構(gòu)體，但是它們不是彼此的鏡像。絕對立體化學根據(jù)cahn-lngold-prelogr-s系統(tǒng)說明。當化合物為純對映體時，每個手性碳的立體化學可以指定為r或s。根據(jù)它們在鈉d線波長處旋轉(zhuǎn)平面偏振光的方向(右旋或左旋)，可以將絕對構(gòu)型未知的拆分化合物指定為(+)或(-)。本文中所述的某些化合物含有一或多個不對稱中心或軸，因此可以產(chǎn)生對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體和其它立體異構(gòu)形式，它們可以根據(jù)絕對立體化學指定為(r)-或(s)-。根據(jù)選擇的原料和工藝方法，化合物可以是可能存在的異構(gòu)體形式之一，或者是其混合物的形式，例如根據(jù)不對稱碳原子的數(shù)目，可以是純光學異構(gòu)體或異構(gòu)體混合物，例如外消旋體和非對映異構(gòu)體混合物，或者幾何(順式或反式)異構(gòu)體。本發(fā)明應當包括所有此類可能的異構(gòu)體，包括外消旋混合物、非對映異構(gòu)體混合物和光學純形式。光學活性的(r)-和(s)-異構(gòu)體可以采用手性合成子或手性試劑制備，或者采用常規(guī)技術(shù)拆分。如果化合物含有雙鍵，則取代基可以是e或z構(gòu)型。如果化合物含有二取代的環(huán)烷基，則該環(huán)烷基取代基可以具有順式-或反式-構(gòu)型。還應當包括所有的互變異構(gòu)形式。本發(fā)明化合物的任何不對稱原子(例如碳原子等)可以存在外消旋或?qū)τ丑w富集，例如(r)-、(s)-或(r,s)-構(gòu)型。在某些實施方案中，在(r)-或(s)-構(gòu)型中每個不對稱原子具有至少50％的對映體過量、至少60％的對映體過量、至少70％的對映體過量、至少80％的對映體過量、至少90％的對映體過量、至少95％的對映體過量或至少99％的對映體過量。如果可能的話，具有不飽和雙鍵的原子的取代基可以存在順式-(z)-或反式-(e)-形式。因此，本文中使用的本發(fā)明化合物可以是下列可能存在的形式之一：異構(gòu)體、旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體、阻轉(zhuǎn)異構(gòu)體、互變異構(gòu)體或其混合物，例如基本上純的幾何(順式或反式)異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、光學異構(gòu)體(對映體)、外消旋體或其混合物。任何獲得的異構(gòu)體混合物可以根據(jù)其組成成分的物理化學性質(zhì)的不同分離為純的或基本上純的幾何或光學異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、外消旋體，例如通過色譜方法和/或分步結(jié)晶的方法分離。任何獲得的終產(chǎn)物或中間體的外消旋物根據(jù)已知的方法拆分為光學異構(gòu)體，例如通過分離采用光學活性的酸或堿獲得的其非對映體鹽，釋放出光學活性的酸性或堿性化合物。因此，尤為特別的是，堿性部分可以用于將本發(fā)明化合物拆分為其光學對映體，例如通過鹽的分步結(jié)晶方法拆分，所述鹽采用光學活性的酸形成，例如酒石酸、二苯甲?；剖?、二乙?；剖?、二-o,o'-對-苯甲?；剖?、扁桃酸、蘋果酸或樟腦-10-磺酸。外消旋產(chǎn)物也可以通過手性色譜方法拆分，例如采用手性吸附劑的高效液相色譜(hplc)方法。本文中使用的術(shù)語“鹽”是指本發(fā)明化合物的酸加成鹽。“鹽”特別包括可藥用的鹽。術(shù)語“可藥用的鹽”是指能夠保持本發(fā)明化合物的生物學效能和特性的鹽，其通常不具有生物學上或其它方面的不希望的特性。在多種情況下，由于氨基和/或羧基基團或于其相似基團的存在，本發(fā)明化合物能夠形成酸和/或堿鹽?？伤幱玫乃峒映甥}可以采用無機酸和有機酸形成，例如乙酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、溴化物/氫溴酸鹽、碳酸氫鹽/碳酸鹽、硫酸氫鹽/硫酸鹽、樟腦磺酸鹽、氯化物/鹽酸鹽、chlortheophyllonate、檸檬酸鹽、乙二磺酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽、葡糖酸鹽、葡糖醛酸鹽、馬尿酸鹽、氫碘酸鹽/碘化物、羥乙基磺酸鹽、乳酸鹽、乳糖酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽、甲基硫酸鹽、萘甲酸鹽、萘磺酸鹽、煙酸鹽、硝酸鹽、十八酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、磷酸鹽/磷酸氫鹽/磷酸二氫鹽、聚半乳糖醛酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、磺基水楊酸鹽、酒石酸鹽、甲苯磺酸鹽和三氟乙酸鹽。用于鹽衍生的無機酸包括例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。用于鹽衍生的有機酸包括例如乙酸、丙酸、乙醇酸、草酸、馬來酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、磺基水楊酸等?？伤幱玫膲A加成鹽可以用無機堿或有機堿形成。用于鹽衍生的無機堿包括例如銨鹽和來自周期表i-xii族的金屬。在某些實施方案中，鹽可以衍生自鈉、鉀、銨、鈣、鎂、鐵、銀、鋅和銅；特別適合的鹽包括銨鹽、鉀鹽、鈉鹽、鈣鹽和鎂鹽。用于鹽衍生的有機堿包括例如伯、仲和叔胺、取代的胺(包括天然存在的取代的胺)、環(huán)狀胺、堿性離子交換樹脂等。某些有機胺包括異丙胺、雙芐基乙二胺(benzathine)、膽堿酸鹽(cholinate)、二乙醇胺、二乙胺、賴氨酸、葡甲胺、哌嗪和氨丁三醇。本發(fā)明的可藥用的鹽可以通過常規(guī)化學方法由堿性或酸性部分合成。一般而言，此類鹽可以通過使這些化合物的游離酸形式與化學計量的適宜的堿(例如na、ca、mg或k的氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽等)反應制備，或者通過使這些化合物的游離堿形式與化學計量的適宜的酸反應來制備。此類反應通常在水中或在有機溶劑中或在兩者的混合物中進行。一般而言，如果可行，使用非水性介質(zhì)如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈是合乎需要的。其它適合的鹽的列表可見于例如“remington'spharmaceuticalsciences(雷明頓藥物科學)”，第20版，mackpublishingcompany，easton，pa.,(1985)以及stahl和wermuth的“handbookofpharmaceuticalsalts:properties，selection，anduse(藥用鹽手冊：性質(zhì)、選擇和用途)”(wiley-vch，weinheim，德國，2002)。脂質(zhì)組合物本發(fā)明提供了包含至少一種式(i)的化合物的脂質(zhì)組合物，即本發(fā)明的脂質(zhì)組合物。在一個實施方案中，存在至少一種其它脂質(zhì)組分。這樣的組合物還可以含有生物活性劑，任選地還有一種或多種其它脂質(zhì)組分。本發(fā)明的一個實施方案提供了包含式(i)的化合物和另外的脂質(zhì)組分的脂質(zhì)組合物。所述其它脂質(zhì)組分包括但不限于陽離子脂質(zhì)、中性脂質(zhì)、陰離子脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)和隱形脂質(zhì)。適用于本發(fā)明的脂質(zhì)組合物的陽離子脂質(zhì)包括但不限于n,n-二油基-n,n-二甲基氯化銨(dodac)、n,n-二硬脂基-n,n-二甲基溴化銨(ddab)、n-(1-(2,3-二油?；趸?丙基)-n,n,n-三甲基氯化銨(dotap)、1,2-二油?；?3-二甲基銨-丙烷(dodap)、n-(1-(2,3-二油基氧基)丙基)-n,n,n-三甲基氯化銨(dotma)，1,2-二油?；奔柞；?3-二甲基銨-丙烷(docdap)、1,2-二亞油?；?3-二甲基銨-丙烷(dlindap)、二月桂基(c12:0)三甲基銨丙烷(dltap)、雙十八烷基酰胺基甘氨?；?dogs)、dc-chol、二油酰基氧基-n-[2-精胺甲酰胺基)乙基}-n,n-二甲基-1-丙銨三氟乙酸鹽(dospa)、1,2-二豆蔻基氧基丙基-3-二甲基-羥基乙基溴化銨(dmrie)、3-二甲基氨基-2-(膽甾-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-1-(順式,順式-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(clindma)、n,n-二甲基-2,3-二油基氧基)丙基胺(dodma)、2-[5’-(膽甾-5-烯-3[β]-氧基)-3’-氧雜戊氧基)-3-二甲基-1-(順式,順式-9’,12’-十八碳二烯氧基)丙烷(cplindma)和n,n-二甲基-3,4-二油基氧基芐基胺(dmoba)和1,2-n,n’-二油基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(docarbdap)。在一個實施方案中，所述陽離子脂質(zhì)為dotap或dltap。適用于本發(fā)明的脂質(zhì)組合物的中性脂質(zhì)包括例如各種中性的、不帶電荷的或兩性離子脂質(zhì)。適用于本發(fā)明的中性磷脂的示例包括但不限于：5-十七烷基苯-1,3-二醇(間苯二酚)、二棕櫚?；字Ｄ憠A(dppc)、二硬脂?；字Ｄ憠A(dspc)、磷酸膽堿(dopc)、二豆蔻?；字Ｄ憠A(dmpc)、磷脂酰膽堿(plpc)、1,2-二硬脂?；?sn-甘油基-3-磷酸膽堿(dapc)、磷脂酰乙醇胺(pe)、卵磷脂酰膽堿(epc)、二月桂酰基磷脂酰膽堿(dlpc)、二豆蔻酰基磷脂酰膽堿(dmpc)、1-豆蔻?；?2-棕櫚?；字Ｄ憠A(mppc)、1-棕櫚?；?2-豆蔻?；字Ｄ憠A(pmpc)、1-棕櫚酰基-2-硬脂酰基磷脂酰膽堿(pspc)、1,2-二花生四烯?；?diarachidoyl)-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(dbpc)、1-硬脂酰基-2-棕櫚?；字Ｄ憠A(sppc)、1,2-雙二十碳烯?；?dieicosenoyl)-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(depc)、棕櫚?；王；字Ｄ憠A(popc)、溶血磷脂酰膽堿、二油?；字Ｒ掖及?dope)、二亞油?；字Ｄ憠A二硬脂?；字Ｒ掖及?dspe)、二豆蔻?；字Ｒ掖及?dmpe)、二棕櫚?；字Ｒ掖及?dppe)、棕櫚?；王；字Ｒ掖及?pope)、溶血磷脂酰乙醇胺以及它們的組合。在一個實施方案中，中性磷脂選自二硬脂?；字Ｄ憠A(dspc)和二豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(dmpe)。適用于本發(fā)明的陰離子脂質(zhì)包括但不限于磷脂酰甘油、心磷脂、二?；字＝z氨酸、二?；字?、n-十二?；字Ｒ掖及贰-琥珀?；字Ｒ掖及?、n-戊二酰基磷脂酰乙醇胺膽固醇半琥珀酸酯(chems)和賴氨?；字８视汀＿m當?shù)闹行院完庪x子脂質(zhì)還包括描述于us2009/0048197中的那些。輔助脂質(zhì)是能夠?qū)⑥D(zhuǎn)染(例如包括生物活性劑的納米顆粒的轉(zhuǎn)染)提高至一定程度的脂質(zhì)。輔助脂質(zhì)提高轉(zhuǎn)染的機制可能包括例如提高粒子的穩(wěn)定性和/或改善膜的融合性(fusogenicity)。輔助脂質(zhì)包括甾體類和烷基間苯二酚類。適用于本發(fā)明的輔助脂質(zhì)包括但不限于膽固醇、5-十七烷基間苯二酚和膽固醇半琥珀酸酯。隱形脂質(zhì)是能夠增加納米顆粒在體內(nèi)(例如在血液中)存在的時間長度的脂質(zhì)。適用于本發(fā)明的脂質(zhì)組合物的隱形脂質(zhì)包括但不限于具有與脂質(zhì)部分連接的親水性頭基的隱形脂質(zhì)。此類隱形脂質(zhì)的示例包括如wo2011/076807中描述的式(xi)化合物或其鹽或可藥用衍生物，其中:[z]n是親水性聚合物基團，其選自peg(聚(環(huán)氧乙烷))或基于聚(噁唑啉)、聚(乙烯醇)、聚(丙三醇)、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)、聚[n-(2-羥基丙基)甲基丙烯酰胺]、多糖和聚(氨基酸)的聚合物或上述任一項的組合，其中所述聚合物可以是直鏈或支鏈的，且其中z各自獨立地任選被取代；其中z為n個亞基的聚合；n為數(shù)均聚合度，為10-200個z單元，其中n為對不同聚合物類型的優(yōu)化；l1為任選取代的c1-10亞烷基或c1-10雜亞烷基連接基，其包含0、1、2或多個醚(例如-o-)、酯(例如-c(o)o-)、琥珀酸酯(例如-o(o)c-ch2-ch2-c(o)o-))、氨基甲酸酯(例如-oc(o)-nr’-)、碳酸酯(例如-oc(o)o-)、酮(例如-c-c(o)-c-)、羰基(例如-c(o)-)、脲(例如-nrc(o)nr’-)、胺(例如-nr’-)、酰胺(例如-c(o)nr’-)、亞胺(例如-c(nr’)-)、硫醚(例如-s-)、黃原酸酯(例如-oc(s)s-)和磷酸二酯(例如-op(o)2o-)；其任何一種可以被0、1或多個z基團取代；其中r’獨立選自-h、–nh-、-nh2、-o-、-s-、磷酸酯或任選取代的c1-10亞烷基；x1和x2獨立選自碳或雜原子，所述雜原子選自-nh-、-o-、-s-或磷酸酯；a1和a2獨立選自c6-30烷基、c6-30鏈烯基和c6-30炔基，其中a1和a2可以是相同或不同的，或者其中a1和a2與它們所連接的碳原子一起形成任選取代的甾體。具體的隱形脂質(zhì)包括但不限于表1中所示。表1.隱形脂質(zhì)適用于本發(fā)明的脂質(zhì)組合物的其它隱形脂質(zhì)和此類脂質(zhì)的生化信息可以參見romberg等，pharmaceuticalresearch，第25卷，第1期，2008，第55-71頁和hoekstra等，biochimicaetbiophysicaacta1660(2004)41-52。在一個實施方案中，適當?shù)碾[形脂質(zhì)含有選自下列的基團：peg(有時被稱為聚(環(huán)氧乙烷)和基于聚(噁唑啉)、聚(乙烯醇)、聚(丙三醇)、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)、聚氨基酸和聚[n-(2-羥基丙基)甲基丙烯酰胺]的聚合物。其它適當?shù)膒eg脂質(zhì)公開于例如wo2006/007712。具體的適當?shù)碾[形脂質(zhì)包括聚乙二醇-二?；视突蚓垡叶?二?；溥蚨０?diacylglycamide)(peg-dag)綴合物，包括那些含有二烷基甘油或二烷基咪唑二酰胺(dialkylglycamide)基團的綴合物，其烷基鏈長度獨立含有約c4至約c40飽和的或不飽和的碳原子。二烷基甘油或二烷基咪唑二酰胺還可以含有一或多個取代的烷基。在本文所述的任何實施方案中，peg綴合物可以選自peg-二月桂基甘油、peg-二豆蔻基甘油(peg-dmg)(目錄號gm-020，源自nof，東京，日本)、peg-二棕櫚?；视汀eg-二甾醇基甘油、peg-二月桂基咪唑二酰胺、peg-二豆蔻基咪唑二酰胺、peg-二棕櫚?；溥蚨０泛蚿eg-二甾醇基咪唑二酰胺、peg-膽固醇(1-[8’-(膽甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰胺基-3’,6’-二氧雜辛基]氨基甲?；?[ω]-甲基-聚(乙二醇)、peg-dmb(3,4-雙十四烷基(tetradecoxyl)芐基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)、1,2-二豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](目錄號880150p源自avantipolarlipids，alabaster，alabama，usa)。在一個實施方案中，隱形脂質(zhì)為s010、s024、s027、s031或s033。在另一個實施方案中，隱形脂質(zhì)為s024。除非另有說明，本文中使用的術(shù)語“peg”是指任何聚乙二醇或其它聚亞烷基醚聚合物。在一個實施方案中，peg為乙二醇或環(huán)氧乙烷的任選取代的直鏈或支鏈聚合物。在一個實施方案中，peg為未取代的。在一個實施方案中，peg為取代的，例如被一或多個烷基、烷氧基、?；⒘u基或芳基取代。在一個實施方案中，該術(shù)語包括peg共聚合物,例如peg-聚氨酯或peg-聚丙烯(參見例如j.miltonharris，poly(glycol)chemistry：biotechnicalandbiomedicalapplications(1992))；在另一個實施方案中，該術(shù)語不包括peg共聚物。在一個實施方案中，peg的分子量為約130至約50,000，在一個子實施方案中為約150至約30,000，在一個子實施方案中為約150至約20,000，在一個子實施方案中為約150至約15,000，在一個子實施方案中為約150至約10,000，在一個子實施方案中為約150至約6000，在一個子實施方案中為約150至約5000，在一個子實施方案中為約150至約4000，在一個子實施方案中為約150至約3000，在一個子實施方案中為約300至約3000，在一個子實施方案中為約1000至約3000，在一個子實施方案中為約1500至約2500。在某些實施方案中，peg為“peg-2k”，也稱為“peg2000”，其平均分子量為約2000道爾頓。peg-2k在本文中由下面式(xiia)表示，其中n為45，也就是說，數(shù)均聚合度包括約45個亞基。然而，也可以采用本領(lǐng)域中已知的其它peg實施方案，包括例如其中數(shù)均聚合度含有約23個亞基(n＝23)和/或68個亞基(n＝68)的那些。本發(fā)明的脂質(zhì)組合物也可以包含一或多種生物活性劑、包括但不限于抗體(例如單克隆的、嵌合的、人源化的納米抗體及其片段等)、膽固醇、激素、肽、蛋白質(zhì)、化療劑和其它類型的抗腫瘤藥物、低分子量藥物、維生素、輔助因子、核苷、核苷酸、寡核苷酸、酶的核酸、反義核酸、三鏈形成寡核苷酸、反義dna或rna的組合物、嵌合的dna:rna的組合物、異型酶、適體、核酶、誘餌及其類似物、質(zhì)粒和其它類型的表達載體以及小核酸分子、rnai劑、短干擾核酸(sina)、信使核糖核酸(信使rna，mrna)、短干擾rna(sirna)、雙鏈rna(dsrna)、微-rna(mirna)、短發(fā)夾rna(shrna)、分子肽核酸(pna)、鎖核酸核糖核苷酸(lna)、嗎啉代核苷酸、蘇糖核酸(tna)、乙二醇核酸(gna)、sisirna(小內(nèi)部分段干擾rna)、airna(不對稱干擾rna)和具有1、2個或多個有義和反義鏈之間錯配到相關(guān)細胞和/或組織的sirna，如在細胞培養(yǎng)、個體或有機體中錯配。此類化合物可以是純化的或部分純化的，可以是天然存在的或合成的，可以是化學修飾的。在一個實施方案中，生物活性劑為rnai成分、短干擾核酸(sina)、短干擾rna(sirna)、雙鏈rna(dsrna)、微-rna(mirna)或短發(fā)夾rna(shrna)分子。在一個實施方案中，生物活性劑為rnai活性劑，用于介導rna干擾(rnai)。在另一個實施方案中，生物活性劑為mrna。mrna分子通常具有能夠被本發(fā)明脂質(zhì)納米顆粒包封的大小。而mrna分子的大小實質(zhì)上取決于編碼特定蛋白質(zhì)的mrna種類的身份，mrna分子的平均大小是500-10,000個堿基的平均mrna大小。在一些實施方案中，生物學活性劑是編碼免疫原的rna。所述編碼免疫原的rna可以是自我復制rna。在一些實施方案中，生物學活性劑是dna。所述dna分子應當具有能包封在本發(fā)明的脂質(zhì)納米顆粒中的大小。這些較短形式的dna中的一些可以具有有用地編碼蛋白質(zhì)的大小。這些第二種，較短，有用的dna形式的實例包括質(zhì)粒和其他載體。更詳細的描述參見，albertsb等人(2007)molecularbiologyofthecell,第五版,garlandscience。在本領(lǐng)域中有可利用的將生物活性劑加載到脂質(zhì)組合物(例如脂質(zhì)體和脂質(zhì)納米顆粒)中的各種方法，包括被動和主動加載方法。使用的精確方法可以基于多種因素進行選擇，包括但不限于例如待加載的生物活性劑、加載后使用的儲存方法、獲得的粒子的大小以及計劃的劑量方案。方法包括例如：將藥物和脂質(zhì)機械混合，在脂質(zhì)體形成或重構(gòu)時，將所有成分溶于有機溶劑，將它們濃縮為干膜，形成ph或離子梯度，使得活性成分進入脂質(zhì)體的內(nèi)部，產(chǎn)生跨膜電位和離子載體介導的加載。參見，例如，pct公開號wo95/08986、美國專利號5,837,282、美國專利號5,837,282和美國專利號7,811,602?！爸|(zhì)納米顆?！笔侵负卸鄠€(即多于一個)脂質(zhì)分子的顆粒，所述脂質(zhì)分子通過分子間力彼此物理結(jié)合。脂質(zhì)納米顆?？梢允抢缥⑶?包括單層和多層囊泡，例如脂質(zhì)體)、乳劑中的分散相、混懸液中的膠束或內(nèi)相。脂質(zhì)納米顆粒的大小為約1至約2,500nm，約1至約1,500nm，約1至約1,000nm，在一個子實施方案中為約50至約600nm，在一個子實施方案中為約50至約400nm，在一個子實施方案中為約50至約250nm，在一個子實施方案中為約50至約150nm。除非另有說明，本文中所述的所有大小是完整成形的納米顆粒的平均大小(直徑)，通過malvernzetasizer的動態(tài)光散射測定。將納米顆粒樣品在磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中稀釋至計數(shù)率為約200-400kcts。該數(shù)據(jù)表示為強度測定的加權(quán)平均值。本發(fā)明的一個實施方案提供了脂質(zhì)組合物，其含有式(i)化合物和其它脂質(zhì)成分。另一個實施方案提供了脂質(zhì)組合物，其包含式(i)化合物和輔助脂質(zhì)例如膽固醇。另一個實施方案提供了脂質(zhì)組合物，其包含式(i)化合物、輔助脂質(zhì)例如膽固醇和中性脂質(zhì)例如dspc。本發(fā)明的另一個實施方案提供了脂質(zhì)組合物，其包含式(i)的化合物、輔助脂質(zhì)例如膽固醇、中性脂質(zhì)例如dspc和隱形脂質(zhì)例如s010、s024、s027、s031或s033。本發(fā)明的另一個實施方案提供了脂質(zhì)組合物，其包含式(i)的化合物、輔助脂質(zhì)例如膽固醇、中性脂質(zhì)例如dspc、隱形脂質(zhì)例如s010、s024、s027、s031或s033和生物學活性劑、例如rna或dna。本發(fā)明的另一個實施方案提供了脂質(zhì)納米顆粒，其包含式(i)的化合物、輔助脂質(zhì)例如膽固醇、中性脂質(zhì)例如dspc和隱形脂質(zhì)例如s010、s024、s027、s031或s033，以及生物學活性劑、例如mrna、sirna或dna。本發(fā)明的實施方案還提供了根據(jù)配制物中脂質(zhì)組分的各自的摩爾比描述的脂質(zhì)組合物，其中斜線(“/”)表示本文中提供的各個組分。本發(fā)明的另一個實施方案為脂質(zhì)組合物，其含有式(i)化合物和輔助脂質(zhì)(例如膽固醇)，其中脂質(zhì)摩爾比為55-40式(i)化合物/55-40輔助脂質(zhì)。另一個實施方案提供了脂質(zhì)組合物，其含有式(i)化合物、輔助脂質(zhì)(例如膽固醇)和中性脂質(zhì)(例如dpsc)，其中脂質(zhì)摩爾比為55-40式(i)化合物/55-40輔助脂質(zhì)/15-5中性脂質(zhì)。另一個實施方案提供了脂質(zhì)組合物，其含有式(i)化合物、輔助脂質(zhì)(例如膽固醇)、中性脂質(zhì)(例如dpsc)和隱形脂質(zhì)(例如s010、s024、s027、s031或s033)，其中脂質(zhì)摩爾比為55-40式(i)化合物/55-40輔助脂質(zhì)/15-5中性脂質(zhì)/10-1隱形脂質(zhì)。本發(fā)明的另一個實施方案為脂質(zhì)組合物，其含有式(i)化合物和輔助脂質(zhì)(例如膽固醇)，其中脂質(zhì)摩爾比為50-40式(i)化合物/50-40輔助脂質(zhì)。另一個實施方案提供了脂質(zhì)組合物，其含有式(i)化合物、輔助脂質(zhì)(例如膽固醇)和中性脂質(zhì)(例如dpsc)，其中脂質(zhì)摩爾比為50-40式(i)化合物/50-40輔助脂質(zhì)/15-5中性脂質(zhì)。另一個實施方案提供了脂質(zhì)組合物，其含有式(i)化合物、輔助脂質(zhì)(例如膽固醇)、中性脂質(zhì)(例如dpsc)和隱形脂質(zhì)(例如s010、s024、s027、s031或s033)，其中脂質(zhì)摩爾比為50-40式(i)化合物/50-40輔助脂質(zhì)/15-5中性脂質(zhì)/5-1隱形脂質(zhì)。本發(fā)明的另一個實施方案為脂質(zhì)組合物，其含有式(i)化合物和輔助脂質(zhì)(例如膽固醇)，其中脂質(zhì)摩爾比為47-43式(i)化合物/47-43輔助脂質(zhì)。另一個實施方案提供了脂質(zhì)組合物，其含有式(i)化合物、輔助脂質(zhì)(例如膽固醇)和中性脂質(zhì)(例如dpsc)，其中脂質(zhì)摩爾比為47-43式(i)化合物/47-43輔助脂質(zhì)/12-7中性脂質(zhì)。另一個實施方案提供了脂質(zhì)組合物，其含有式(i)化合物、輔助脂質(zhì)(例如膽固醇)、中性脂質(zhì)(例如dpsc)和隱形脂質(zhì)(例如s010、s024、s027、s031或s033)，其中脂質(zhì)摩爾比為47-43式(i)化合物/47-43輔助脂質(zhì)/12-7中性脂質(zhì)/4-1隱形脂質(zhì)。本發(fā)明的另一個實施方案為脂質(zhì)組合物，其含有式(i)化合物和輔助脂質(zhì)(例如膽固醇)，其中脂質(zhì)摩爾比為約45式(i)化合物/約44輔助脂質(zhì)。另一個實施方案提供了脂質(zhì)組合物，其含有式(i)化合物、輔助脂質(zhì)(例如膽固醇)和中性脂質(zhì)(例如dpsc)，其中脂質(zhì)摩爾比為約45式(i)化合物/約44輔助脂質(zhì)/約9中性脂質(zhì)。另一個實施方案提供了脂質(zhì)組合物，其含有式(i)化合物、輔助脂質(zhì)(例如膽固醇)、中性脂質(zhì)(例如dpsc)和隱形脂質(zhì)(例如s010、s024、s027、s031或s033)，其中脂質(zhì)摩爾比為約45式(i)化合物/約44輔助脂質(zhì)/約9中性脂質(zhì)/約2隱形脂質(zhì)(例如s010、s024、s027、s031或s033)。用于上述脂質(zhì)組合物的優(yōu)選的式(i)的化合物在實施例1-36中給出。特別優(yōu)選的化合物在實施例1和80中給出。優(yōu)選的生物學活性劑是rna’s和dna’s。本發(fā)明的脂質(zhì)組合物還可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過將具有需要的pka范圍的陽離子脂質(zhì)，隱形脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)和中性脂質(zhì)在配制物中組合而進一步優(yōu)化，所述配制物包括例如脂質(zhì)體配制物、脂質(zhì)納米顆粒(lnp)配制物等，用于在體內(nèi)遞送至特定的細胞和組織。在一個實施方案中，進一步優(yōu)化可以通過調(diào)節(jié)這些各種類型的脂質(zhì)的脂質(zhì)摩爾比而完成。在一個實施方案中，進一步優(yōu)化可以通過調(diào)節(jié)下列一或多種因素而完成：需要的粒子大小、n/p比例、配制方法和/或給藥方案(例如一段時間內(nèi)施用的劑量數(shù)目、準確的劑量mg/kg、施用的時間、與其它治療方法的組合等)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的與上述實施方案相關(guān)的各種優(yōu)化技術(shù)應當被視為是本發(fā)明的一部分。制備脂質(zhì)納米顆粒的一般方法下面的方法可以用于制備本發(fā)明的脂質(zhì)納米顆粒。為了使得顆粒的尺寸減小和/或均勻度增加，技術(shù)人員可以采用下面所列示的方法步驟，試用不同的組合。另外，技術(shù)人員可以采用脂質(zhì)體配制中使用的超聲、過濾或其它分選(sizing)技術(shù)。本發(fā)明組合物的制備方法通常包括：提供在第一個容器中的含有生物活性劑的水溶液(例如檸檬酸鹽緩沖液)，提供含有脂質(zhì)的有機溶液(例如有機醇，如乙醇)的第二個容器，然后將水溶液與有機脂質(zhì)溶液混合。第一個容器任選與第二個容器之間以流體連通。所述混合步驟任選隨后是溫育步驟、過濾或透析步驟以及稀釋步驟和/或濃縮步驟。溫育步驟包括使得獲自混合步驟的溶液于約室溫下在容器中靜置約0至約100小時(優(yōu)選約0至約24小時)并任選避光保護。在一個實施方案中，溫育步驟后是稀釋步驟。稀釋步驟包括采用緩沖水溶液(例如檸檬酸鹽緩沖液或純水)稀釋，例如采用泵裝置(如蠕動泵)。過濾步驟為超濾或透析。超濾包括濃縮稀釋液，隨后是滲濾，例如采用適當?shù)谋孟到y(tǒng)(例如泵裝置，如蠕動泵或類似裝置)以及超濾膜(例如ge中空纖維濾芯或等同物)。透析包括通過合適的膜(例如10,000mwc蛇皮膜)的溶劑(緩沖劑)交換。在一個實施方案中，混合步驟提供了澄清的單相。在一個實施方案中，混合步驟后，除去有機溶劑提供了顆粒的混懸液，其中生物活性劑被脂質(zhì)包封。有機溶劑的選擇通常包括考慮溶劑的極性以及在顆粒形成的后期該溶劑是否易于除去。有機溶劑也可以用作增溶劑，優(yōu)選使用的量足以提供生物活性劑和脂質(zhì)的澄清的單相混合物。有機溶劑可以選自下列一或多種(例如兩種)：氯仿、二氯甲烷、乙醚、環(huán)己烷、環(huán)戊烷、苯、甲苯、甲醇和其它脂肪醇類(例如c1-c8)，例如乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、叔-丁醇、異丁醇、戊醇和己醇。混合步驟可以通過多方法進行，例如通過機械設(shè)備，如渦旋混合器。用于除去有機溶劑的方法通常包括滲濾(diafilitration)或透析或減壓蒸發(fā)或者吹入惰性氣體流(例如氮氣或氬氣)穿過混合物。在其它實施方案中，該方法該包括加入非脂質(zhì)聚合陽離子，其可以用于促進使用本發(fā)明組合物對細胞的轉(zhuǎn)化。適當?shù)姆侵|(zhì)聚合陽離子包括但不限于海美溴銨(hexadimethrinebromide)(銷售商品名polybrene(r)，源自aldrichchemicalco.，milwaukee，wis.，usa)或海地美胺的其它鹽。其它適當?shù)木酆详栯x子包括例如聚-l-鳥氨酸、聚-l-精氨酸、聚-l-賴氨酸、聚-d-賴氨酸、聚烯丙基胺和聚乙烯亞胺的鹽。在某些實施方案中，脂質(zhì)納米顆粒的形成可以在單相系統(tǒng)(例如bligh和dyer單相或水溶液和有機溶劑的類似混合物)或兩相系統(tǒng)中通過適當?shù)幕旌线M行。脂質(zhì)納米顆?？梢栽趩蜗嗷騼上嘞到y(tǒng)中形成。在單相系統(tǒng)中，陽離子脂質(zhì)和生物活性劑各自溶于大量的單相混合物中。將兩種溶液混合可以獲得單一混合物，其中形成復合體。在兩相系統(tǒng)中，陽離子脂質(zhì)與生物活性劑(存在于水相中)結(jié)合，將其“拉”入有機相。在一個實施方案中，脂質(zhì)納米顆粒通過包括下列步驟的方法制備：(a)使得生物活性劑與包含非陽離子脂質(zhì)和去垢劑的溶液接觸，形成化合物-脂質(zhì)混合物；(b)使得陽離子脂質(zhì)與化合物-脂質(zhì)混合物接觸以中和生物活性劑的部分負電荷，形成生物活性劑和脂質(zhì)的電荷被中和的混合物；和(c)自電荷被中和的混合物除去除垢劑。在一組實施方案中，中性脂質(zhì)和去垢劑的溶液為水溶液。使得生物活性劑與中性脂質(zhì)和去垢劑的溶液接觸通常可以通過將生物活性劑的第一種溶液與脂質(zhì)和去垢劑的第二種溶液一起混合而完成。優(yōu)選生物活性劑溶液也是去垢劑溶液。本方法中使用的中性脂質(zhì)的量通常根據(jù)使用的陽離子脂質(zhì)的量確定，一般為約0.2-5倍的陽離子脂質(zhì)的量，優(yōu)選約0.5至約2倍的使用的陽離子脂質(zhì)的量。將如此形成的生物活性劑-脂質(zhì)混合物與陽離子脂質(zhì)接觸以中和存在的相關(guān)分子(或者其它聚陰離子材料)攜帶的部分負電荷。使用的陽離子脂質(zhì)的量通常比計算的負電荷(磷酸鹽)的摩爾比高3-8倍。用于除去去垢劑的方法通常包括滲析。當有機溶劑存在時，除去通?？梢酝ㄟ^減壓下的滲濾或蒸發(fā)，或者吹入惰性氣體流(例如氮氣或氬氣)穿過混合物。本文公開了制備本發(fā)明組合物的裝置。該裝置通常包括用于盛放含有生物活性劑水溶液的第一個容器以及用于盛放有機脂質(zhì)溶液的第二個容器。該裝置還通常包括裝配的機械泵，用于將水溶液和有機脂質(zhì)溶液以基本上相同的流速泵入混合區(qū)或混合室。在一個實施方案中，混合區(qū)或混合室包含t形連接器或其等同物，它使得水液流和有機液流在輸入t形連接器時混合，獲得的混合的水溶液和有機溶液自t形連接器輸出進入收集容器或其等同物。遞送生物活性劑和治療疾病的方法式(i)的陽離子脂質(zhì)及其脂質(zhì)組合物可以用于藥用組合物或配制物，用于遞送生物活性劑。因此，含有式(i)的陽離子脂質(zhì)或其脂質(zhì)組合物的配制物可以是各種形式，包括但不限于顆粒形成遞送劑(particleformingdeliveryagents)，包括微粒、納米顆粒和轉(zhuǎn)染劑，它們用于將各種分子遞送至細胞。特定的配制物可以有效地轉(zhuǎn)染或遞送生物活性劑，例如抗體(例如單克隆的、嵌合的、人源化的納米抗體及其片段等)、膽固醇、激素、肽、蛋白質(zhì)、化療劑和其它類型的抗腫瘤藥物、低分子量藥物、維生素、輔助因子、核苷、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸(例如rna或dna)、酶的核酸、反義核酸、三鏈形成寡核苷酸、反義dna或rna的組合物、嵌合的dna:rna的組合物、異型酶、適體、核酶、誘餌及其類似物、質(zhì)粒和其它類型的表達載體以及小核酸分子、mrna、rnai劑、短干擾核酸(sina)、短干擾rna(sirna)、雙鏈rna(dsrna)、微-rna(mirna)、短發(fā)夾rna(shrna)、分子肽核酸(pna)、鎖核酸核糖核苷酸(lna)、嗎啉代核苷酸、蘇糖核酸(tna)、乙二醇核酸(gna)、sisirna(小內(nèi)部分段干擾rna)、airna(不對稱干擾rna)和具有1、2個或多個有義和反義鏈之間錯配到相關(guān)細胞和/或組織的sirna，例如在細胞培養(yǎng)、個體或有機體中錯配。上述生物活性劑僅是典型示例，并非是加以限定。此類化合物可以純化或者部分純化，可以是天然存在的或合成，可以是化學修飾的。此類含有生物活性劑的配制物可以用于例如提供組合物以預防、抑制或治療細胞、患者或有機體中的疾病、病癥或癥狀(traits)。所述疾病、病癥或癥狀包括但不限于增生性疾病，包括癌癥、炎性疾病、移植和/或組織排斥、自身免疫性疾病或病癥、與年齡相關(guān)的疾病、神經(jīng)或神經(jīng)變性疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、心血管疾病、眼部疾病、代謝疾病、皮膚病、聽覺疾病、肝臟疾病、腎臟或腎功能疾病等。每次施用活性成分的量高于最小治療量但低于中毒量。每次施用的實際量可以由醫(yī)師根據(jù)多種因素而確定，例如患者的病史、其它治療方法的使用、提供的生物活性劑以及疾病的性質(zhì)。施用的生物活性劑的量可以在治療期間調(diào)整，取決于患者對治療的響應以及任何與治療有關(guān)的副作用的存在與否或嚴重程度。由適當?shù)墓芾頇C構(gòu)批準的化合物的典型劑量和治療方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的和可用的。參見，例如，physician'sdeskreference(醫(yī)師案頭手冊)，第64版，physician'sdeskreferenceinc.(2010)；remington'spharmaceuticalsciences(雷明頓藥物科學)，mackpublishingcompany，philadelphia，pa.(1985)；remingtonthescienceandpracticeofpharmacy(雷明頓藥學和實踐)，第21版，lippincottwilliams&williamspublishers(2005)。在一個實施方案中，可以向有需要的患者施用單次劑量的生物活性劑。在一個實施方案中，可以施用多劑量，其中多劑量可以同時、順序或交替施用。在一個實施方案中，相同配制物可以多劑量施用。在一個實施方案中，配制物可以以不同的多劑量施用。在多個實施方案中，所述劑量可以每天施用一次，或者以1、2、3、4或更多連續(xù)天施用。在一個實施方案中，所述劑量可以每周施用一次。在一個實施方案中，所述劑量可以每隔一周施用一次。在一個實施方案中，患者接受至少兩個療程的治療方案，有時可能為更多療程，這取決于患者對治療的響應。在單一成分的方案中，治療的總療程由患者和醫(yī)師根據(jù)觀察到的響應和毒性決定。上述治療方案應當被視為非限定性示例。其它治療方案也應當包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)并取決于預期的治療效果。本發(fā)明還提供了治療疾病或病癥的方法，該方法包括向有需要的患者施用治療有效量的本發(fā)明的脂質(zhì)組合物。在一個實施方案中，所述疾病或病癥通過施用rna藥物如sirna或mrna藥物可以治療。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的脂質(zhì)組合物在患者中治療疾病或病癥的方法。在一個實施方案中，所述疾病或病癥通過施用sirna或mrna藥物可以治療。在一個實施方案中，施用的組合物中脂質(zhì)的總量為約5至約30mg脂質(zhì)/mg生物活性劑(例如mrna、sirna、rna復制子等)，在另一個實施方案中，為約5至約25mg脂質(zhì)/mg生物活性劑(例如mrna、sirna、rna復制子等)，在另一個實施方案中，為約7至約25mg脂質(zhì)/mg生物活性劑(例如mrna、sirna、rna復制子等)，在一個實施方案中，為約7至約15mg脂質(zhì)/mg生物活性劑(例如mrna、sirna、rna復制子等)。本文中使用的“治療”包括改善、治愈和預防性治療。本文中使用的“患者”是指需要治療的動物，優(yōu)選哺乳動物，優(yōu)選人類。術(shù)語“治療有效量”是指用于治療或改善目標疾病或病癥的本發(fā)明化合物和生物活性劑(例如治療性化合物)的量。術(shù)語“免疫有效量”是指本發(fā)明化合物和rna的量，其能夠編碼誘發(fā)免疫應答所需要的免疫原，所述應答能夠識別免疫原(例如在病原體的情況下)。術(shù)語“免疫原”是指當被引入機體時能夠引發(fā)免疫應答的任何物質(zhì)或生物體。本文中使用的“增生性疾病”是指任何疾病、病癥、癥狀、基因型或表型，其特征在于本領(lǐng)域中公知的不受調(diào)節(jié)的細胞生長或復制。在一個實施方案中，所述增生性疾病為癌癥。在一個實施方案中，所述增生性疾病為腫瘤。在一個實施方案中，所述增生性疾病包括但不限于例如液體腫瘤，如白血病，例如急性骨髓性白血病(aml)、慢性髓細胞性白血病(cml)、急性淋巴細胞性白血病(all)、多發(fā)性骨髓瘤和慢性淋巴細胞白血?。粚嶓w瘤，例如aids相關(guān)癌癥，如卡波濟氏肉瘤；乳腺癌、骨癌、腦癌、頭頸癌、非霍奇金淋巴瘤、腺瘤、鱗狀細胞癌、喉癌、膽囊癌和膽管癌、視網(wǎng)膜癌、食道癌、胃腸癌、卵巢癌、子宮癌、甲狀腺癌、睪丸癌、子宮內(nèi)膜癌、黑素瘤、結(jié)腸直腸癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌(包括非小細胞肺癌)、胰腺癌、肉瘤、腎母細胞瘤、子宮頸癌、頭頸癌、皮膚癌、鼻咽癌、脂肪肉瘤、上皮癌、腎細胞癌、膽囊腺癌、子宮內(nèi)膜肉瘤、多重耐藥癌癥。在一個實施方案中，所述增生性疾病包括與腫瘤血管生成相關(guān)的新血管形成、黃斑變性(例如濕/干性年齡相關(guān)性黃斑變性)、角膜新血管形成、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、新生血管性青光眼、近視變性。在一個實施方案中，所述增生性疾病包括再狹窄和多囊腎病。本文中使用的“自身免疫性疾病”是指任何疾病、病癥、癥狀、基因型或表型，其特征在于本領(lǐng)域已知的自身免疫性。自身免疫性疾病包括但不限于例如多發(fā)性硬化、糖尿病、狼瘡、硬皮、纖維肌痛、移植排斥(例如預防同種異體移植物排斥)、惡性貧血、類風濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、皮肌炎、重癥肌無力、紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥和格雷病(grave’sdiseases)。“傳染病”是指與感染原(如病毒、細菌、真菌、朊病毒或寄生蟲)相關(guān)的任何疾病、障礙或病癥。本發(fā)明可以用于免疫對抗導致感染性疾病的病原體。此類病原體在下面列出?！吧窠?jīng)性疾病”是指影響中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)的任何疾病、病癥或病狀。神經(jīng)性疾病包括但不限于外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病或病癥，包括例如阿爾茨海默氏病、動脈瘤、腦損傷、腕管綜合征、腦動脈瘤、慢性疼痛、克雅氏病、癲癇、亨廷頓氏病、腦膜炎、癲癇癥和其它神經(jīng)性疾病、病癥和綜合征。“呼吸系統(tǒng)疾病”是指影響呼吸道的任何疾病或病癥。呼吸系統(tǒng)疾病包括但不限于例如哮喘、慢性阻塞性肺病(copd)、過敏性鼻炎、鼻竇炎、過敏癥、呼吸不暢、呼吸窘迫綜合征、囊性纖維化、肺動脈高血壓或血管收縮和肺氣腫。“心血管疾病”是指影響心臟和血管的疾病或病癥。心血管疾病包括但不限于例如冠狀動脈心臟病(chd)、腦血管疾病(cvd)、主動脈瓣狹窄、外周血管病、心肌梗死(心臟病發(fā)作)、心律不齊、缺血、充血性心臟衰竭。本文中使用的“眼病”是指眼及相關(guān)結(jié)構(gòu)的任何疾病、病癥、癥狀、基因型或表型。眼部疾病包括但不限于例如囊樣黃斑水腫、糖尿病性視網(wǎng)膜病、格子樣變性、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、視網(wǎng)膜動脈阻塞、黃斑變性(例如年齡相關(guān)的黃斑變性，如濕性amd或干性amd)、弓形體病、色素性視網(wǎng)膜炎、結(jié)膜裂傷、角膜裂傷、青光眼等?！按x性疾病”是指影響代謝途徑的任何疾病或病癥。代謝性疾病可以導致異常代謝過程，無論是由于遺傳酶異常(先天性代謝缺陷)導致的先天性疾病或者由于內(nèi)分泌器官疾病或重要的代謝器官如肝臟衰竭所導致的獲得性疾病。在一個實施方案中，代謝疾病包括肥胖、胰島素抵抗和糖尿病(例如i型和/或ii型糖尿病)?！捌つw病”是指皮膚、真皮或其中的任何亞結(jié)構(gòu)(例如頭發(fā)、毛囊等)的任何疾病或病癥。皮膚病學的疾病、病癥或癥狀可以包括牛皮癬、異位性皮炎、皮膚癌如黑色素瘤和基底細胞癌、脫發(fā)、脫毛和色素沉著改變?！奥犛X病”是指聽覺系統(tǒng)的任何疾病或病癥，包括耳如內(nèi)耳、中耳、外耳、聽神經(jīng)和其中的任何子結(jié)構(gòu)。聽覺疾病、病癥、狀況和癥狀包括聽力喪失、耳聾、耳鳴、眩暈、平衡和運動失調(diào)。“再生疾病”是指其中在損傷之前或之后體內(nèi)或體外細胞或組織生成或再生不足妨礙了適當器官功能的建立或恢復、妨礙或減緩傷口愈合或潰瘍性病損的消除、加速老化或妨礙有效的基于細胞的治療的任何疾病或病癥。術(shù)語“信使核糖核酸”(信使rna，mrna)是指介導遺傳信息傳遞到細胞質(zhì)中核糖體的核糖核酸(rna)分子，其作用為蛋白質(zhì)合成的模板。其在轉(zhuǎn)錄過程中由dna模板合成。參見theamericandictionaryoftheenglishlanguage，第4版(2009更新)。houghtonmifflincompany。質(zhì)粒是與細胞內(nèi)的染色體dna物理分離且可獨立復制的小dna分子。質(zhì)粒大小可以從1到超過25千堿基對。重組質(zhì)粒可重組制成其可以包封在本發(fā)明的脂質(zhì)納米顆粒中的尺寸。載體是用作人工將遺傳物質(zhì)從一個細胞或從體外生物化學反應攜帶至另一個細胞中的媒介物的dna分子，其中dna可被復制和/或表達。含有外來dna的載體稱為重組體。有用的載體的種類有質(zhì)粒和病毒載體。病毒載體通常是攜帶已經(jīng)變?yōu)榉歉腥拘缘?、但仍包含病毒啟動子和轉(zhuǎn)基因的經(jīng)修飾的病毒dna或rna的重組病毒，從而允許通過病毒啟動子翻譯轉(zhuǎn)基因。病毒載體可被重組制成具有可以包封在本發(fā)明的脂質(zhì)納米顆粒中的尺寸。本文所用的術(shù)語“短干擾核酸”(sina)是指能夠通過以序列特異性方式介導rna干擾(rnai)或基因沉默而抑制或向下調(diào)節(jié)基因表達或病毒復制的任何核酸分子。它包括短干擾rna(sirna)、微rna(mirna)、短干擾寡核苷酸和化學修飾的短干擾核酸分子。sirna負責rna干擾，這是在動物和植物的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默的過程。通過對沉默基因靶的同源的或特定的更長的雙鏈rna(dsrna)的核糖核酸酶iii切割產(chǎn)生sirna。術(shù)語“rna干擾”(rnai)技術(shù)是轉(zhuǎn)錄后、靶向的基因沉默技術(shù)，其使用rnai劑降解含有與rnai劑相同或非常相似序列的信使rna(mrna)。參見：zamore和haley，2005，science，309，1519-1524；zamore等，2000，cell，101，25-33；elbashir等，2001，nature，411，494-498；和kreutzer等，pct公開wo00/44895；fire，pct公開wo99/32619；mello和fire，pct公開wo01/29058等。本文中使用的rnai與其它用于描述序列特異性rna干擾的術(shù)語相同，例如轉(zhuǎn)錄后基因沉默、翻譯抑制、轉(zhuǎn)錄抑制或表觀遺傳。例如，含有本發(fā)明脂質(zhì)的配制物可以與sina分子組合使用，同時在轉(zhuǎn)錄后水平和/或轉(zhuǎn)錄前水平在表觀遺傳學上沉默基因。在一個非限制性的示例中，通過sina分子調(diào)節(jié)的基因表達可以通過risc或者選擇如本領(lǐng)域中已知的的翻譯抑制導致sina介導的rna(編碼或非編碼rna)的裂解。在另一個實施方案中，通過sina調(diào)節(jié)的基因表達可以導致轉(zhuǎn)錄抑制，例如janowski等，2005，naturechemicalbiology，1，216-222所報道。術(shù)語“rnai抑制劑”是可以在細胞或患者中向下調(diào)節(jié)(例如降低或抑制)rna干擾的功能或活性的任何分子。通過與rnai通路的任何成分的相互作用或干擾其功能，rnai抑制劑可以下調(diào)、降低或抑制rnai(例如rnai介導的靶多核苷酸裂解、翻譯抑制或轉(zhuǎn)錄沉默)，所述任何成分包括蛋白質(zhì)成分(例如risc)或核酸成分(例如mirna或sirna)。rnai抑制劑可以是sina分子、反義分子、適體或小分子，它們可以與細胞或患者中rnai通路的risc、mirna或sirna或任何其它成分相互作用或干擾其功能。通過抑制rnai(例如rnai介導的靶多核苷酸裂解、翻譯抑制或轉(zhuǎn)錄沉默)，rnai抑制劑可以用于調(diào)節(jié)(例如上調(diào)或下調(diào))靶基因的表達。在一個實施方案中，通過翻譯抑制、轉(zhuǎn)錄沉默或risc介導的多核苷酸(例如mrna)裂解而干擾(例如降低或防止)基因表達的內(nèi)源性下調(diào)或抑制，rna抑制劑可以用于上調(diào)基因表達。因此，通過干擾基因表達的內(nèi)源性抑制、沉默或抑制機制，本發(fā)明的rnai抑制劑可以用于上調(diào)基因表達，用于治療功能缺失導致的疾病或病癥。在本文的各個實施方案中，術(shù)語“rnai抑制劑”可以與術(shù)語“sina”相互交換使用。本文中使用的術(shù)語“酶性核酸”是指在底物結(jié)合域中其能夠與特定的靶基因具有互補性的核酸分子，其還具有酶活性，作用是特異性地裂解靶rna，從而使得靶rna分子失活。互補性域能夠使得酶性核酸分子充分地雜交到靶rna上，因此使其裂解。優(yōu)選100％互補，但是互補性低至50-75％也可以用于本發(fā)明(參見，例如，werner和uhlenbeck，1995，nucleicacidsresearch，23，2092-2096；hammann等，1999，antisenseandnucleicacidsdrugdev.，9，25-31)。核酸可以在堿、糖和/或磷酸酯基團上進行修飾。術(shù)語酶性核酸可以與下列短語互換使用：例如核酶、催化性rna、酶性rna、催化性dna、適配酶或適體結(jié)合核酶、可調(diào)節(jié)性核酶、催化性寡核苷酸、核酶(nucleozyme)、dna酶、rna酶、內(nèi)切核糖核酸酶、核酸內(nèi)切酶、小核酶(minizyme)、先導酶(leadzyme)、寡酶(oligozyme)或dna酶。所有這些術(shù)語描述了具有酶活性的核酸分子。酶性核酸分子的關(guān)鍵特性是其具有能夠與一或多個靶核酸域互補的特異性底物結(jié)合部位，其具有位于所述底物結(jié)合域中或者環(huán)繞該域的核苷酸序列，其能夠使得核酸裂解和/或具有與所述分子連接的活性(參見，例如，cech等，美國專利4,987,071；cech等，1988，260jama3030)。本發(fā)明的核酶和酶性核酸分子可以是化學修飾的，例如如本領(lǐng)域中和本文中其它部分所述。本文中使用的術(shù)語“反義核酸”是指非酶性核酸分子，其能夠通過rna-rna或rna-dna或rna-pna(蛋白質(zhì)核酸；egholm等，1993nature365，566)相互作用與靶rna結(jié)合，從而改變了靶rna活性(綜述參見stein和cheng，1993science261，1004；woolf等，美國專利5,849,902)。反義dna可以化學合成，或者通過使用單鏈dna表達載體或其等同物表達。本發(fā)明的反義分子可以是化學修飾的，例如如本領(lǐng)域中所述。本文中使用的術(shù)語“rnaseh激活域”是指能夠與靶rna結(jié)合形成非共價復合物的核酸分子的域(長度通常大于或等于4-25個核苷酸，優(yōu)選長度為5-11個核苷酸)，其可以被細胞rnaseh酶識別(參見，例如，arrow等，美國專利5,849,902；arrow等，美國專利5,989,912)。rnaseh酶可以與核酸分子-靶rna復合物結(jié)合并裂解靶rna序列。本文中使用的術(shù)語“2-5a反義嵌合體”是指含有5’-磷酸化的2’-5’-連接的腺苷酸殘基的反義寡核苷酸。這些嵌合體與靶rna以序列特異性的方式結(jié)合并激活細胞2-5a-依賴性核糖核酸酶，其隨后裂解靶rna(torrence等，1993proc.natl.acad.sci.usa90，1300；silverman等，2000，methodsenzymol.，313，522-533；player和torrence，1998，pharmacol.ther.，78，55-113)。2-5a反義嵌合體分子可以是化學修飾的，例如如本領(lǐng)域中所述。本文中使用的術(shù)語“三螺旋形成寡核苷酸”是指能夠與雙鏈dna以序列特異性的方式結(jié)合形成三螺旋鏈的寡核苷酸。此類三螺旋結(jié)構(gòu)的形成已經(jīng)被證明能夠抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄(duval-valentin等，1992proc.natl.acad.sci.usa89，504；fox，2000，curr.med.chem.，7，17-37；praseuth等，2000，biochim.biophys.acta，1489，181-206)。本發(fā)明的三螺旋形成寡核苷酸可以是化學修飾的，例如如本領(lǐng)域中所述。本文中使用的術(shù)語“誘餌rna”是指rna分子或適配子，其目的旨在優(yōu)先與預定的配體結(jié)合。此類結(jié)合可以導致靶分子的抑制或激活。誘餌rna或適配子可以與天然存在的用于結(jié)合特異性配體的結(jié)合靶競爭。同樣，誘餌rna目的旨在與受體結(jié)合并阻斷效應分子的結(jié)合，或者目的旨在與相關(guān)受體結(jié)合并阻止與受體的相互作用。本發(fā)明的誘餌分子可以是化學修飾的，例如如本領(lǐng)域中所述。本文中使用的術(shù)語“dna”(ssdna)是指含有線性單鏈的天然存在的或合成的脫氧核糖核酸分子，例如ssdna可以是有義或反義基因序列或est(表達的序列標記(expressedsequencetag))。本文中使用的術(shù)語“等位酶”是指變構(gòu)酶性核酸分子，包括例如美國專利號5,834,186、5,741,679、5,589,332、5,871,914和pct專利號wo00/24931、wo00/26226、wo98/27104和wo99/29842。本文中使用的術(shù)語“適配子”是指能夠與靶分子特異性結(jié)合的多核苷酸組合物，其中所述多核苷酸的序列不同于細胞中靶分子所正常識別的序列。或者，適配子可以是能夠與靶分子結(jié)合的核酸分子，其中靶分子不會天然地與核酸結(jié)合。靶分子可以為任何相關(guān)分子。本發(fā)明的適配子分子可以是化學修飾的，例如如本領(lǐng)域中所述。脂質(zhì)組合物的配制物對于藥物使用而言，本發(fā)明的脂質(zhì)組合物可以通過腸內(nèi)或腸胃外途徑施用，包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、經(jīng)皮、呼吸道(氣霧劑)、口服、鼻內(nèi)、直腸、陰道、頰腔、鼻咽(nasopharangeal)、胃腸道或舌下施用。所述施用可以是全身性或局部性的。局部施用包括例如導管插入、植入、滲透泵、直接注入、真皮/經(jīng)皮應用、支架、滴耳液/滴眼液或門靜脈施用?？梢詫κ?i)化合物的生物制藥特性進行評價，例如溶解度和溶液穩(wěn)定性(一定的ph范圍內(nèi)(acrossph))、滲透性等，從而選擇治療建議的適應癥的最適當?shù)膭┬秃褪┯猛緩健１景l(fā)明的組合物通常但是不是必須作為與一或多種可藥用的賦形劑組合的配制物施用。術(shù)語“賦形劑”包括除了本發(fā)明化合物、其它脂質(zhì)成分和生物活性劑之外的任何成分。賦形劑可以賦予配制物功能性(例如藥物釋放速度控制)和/或非功能性(例如加工輔助或稀釋)特征。賦形劑的選擇在很大程度上取決于下列因素：例如具體的施用方式、賦形劑對溶解度和穩(wěn)定性的影響以及劑型的性質(zhì)。典型的可藥用的賦形劑包括：·稀釋劑，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纖維素和/或甘氨酸；·潤滑劑，例如二氧化硅、滑石粉、硬脂酸及其鎂鹽或鈣鹽和/或聚乙二醇；·粘合劑，例如硅酸鋁鎂、淀粉糊、明膠、黃芪膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮；·崩解劑，例如淀粉、瓊脂、海藻酸或其鈉鹽或泡騰混合物；和/或·吸收劑、著色劑、矯味劑和/或甜味劑。賦形劑可以是水溶液載體，其可以任選含有緩沖劑(例如pbs緩沖劑)和/或糖?？伤幱玫馁x形劑的充分討論可以參見gennaro，remington：thescienceandpracticeofpharmacy2000，第20版(isbn：0683306472)。本發(fā)明的組合物可以口服施用。口服施用可以包括吞咽施用以便于化合物進入胃腸道和/或包括通過頰腔、舌(lingual)或舌下施用從而使得化合物能夠自口腔直接進入血液循環(huán)。本發(fā)明的組合物可以通過胃腸外施用。本發(fā)明的化合物和組合物可以施用直接進入血流、進入皮下組織、進入肌肉或進入內(nèi)臟器官。適當?shù)氖┯梅绞桨o脈內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、尿道內(nèi)、胸骨內(nèi)、顱內(nèi)、肌肉內(nèi)、滑膜內(nèi)和皮下。適當?shù)氖┯闷骶甙ㄡ?包括微針)注射器、無針頭注射器和輸液裝置。腸胃外配制物通常為水溶液或油溶液。當溶液為水溶液時，賦形劑例如糖類(包括但不限于葡萄糖、甘露醇、山梨醇等)、鹽、碳水合物和緩沖劑(優(yōu)選對于ph3-9而言)，但是對于某些應用而言，它們可以更為適當?shù)嘏渲茷闊o菌的非水溶液或者干燥形式，其可以與適當?shù)剌d體例如無菌、無熱原水(wfi)組合使用。腸胃外配制物可以包括來源于可降解聚合物的埋植劑，所述聚合物例如聚酯類(例如聚乳酸、聚丙交酯、聚交酯-共-乙交酯、聚己內(nèi)酯、聚丁酸羥基酯)、聚原酸酯類和聚酐類。這些配制物可以通過手術(shù)切口施用至皮下組織、肌肉組織或者直接進入特定的器官。無菌條件下例如通過冷凍干燥法制備胃腸外配制物可以采用技術(shù)人員熟知的標準制藥技術(shù)完成。制備胃腸外溶液劑中使用的化合物和組合物的溶解度可以通過使用適當?shù)闹苿┘夹g(shù)得以增加，所述技術(shù)例如組合使用共溶劑和/或增溶劑例如表面活性劑、膠束結(jié)構(gòu)和環(huán)糊精。本發(fā)明的組合物可經(jīng)鼻內(nèi)或通過吸入施用，通常為干粉吸入器中的干粉形式(單獨的形式；作為混合物的形式，例如與乳糖的干燥共混物；或作為混合組分的顆粒，例如與磷脂如磷脂酰膽堿混合)、來自加壓容器、泵、噴射器、霧化器(優(yōu)選使用電流產(chǎn)生細霧的霧化器)或噴霧器的氣溶膠噴霧(使用或不使用適當?shù)膾伾鋭┤?,1,1,2-四氟乙烷或1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷)或作為滴鼻劑。對于鼻內(nèi)使用而言，所述粉劑可以含有生物粘附劑，例如殼聚糖或環(huán)糊精。加壓容器、泵、噴射器、霧化器或噴霧器含有本發(fā)明化合物的溶液或混懸液，包含例如乙醇、乙醇水溶液或適當?shù)挠糜诒景l(fā)明組合物的分散、溶解或延遲釋放的替代成分、作為溶劑的拋射劑和任選的表面活性劑，例如脫水山梨醇三油酸酯、油酸或寡聚乳酸。在使用干粉或混懸液配制物之前，應當將組合物微粉化至適合于吸入遞送的大小(通常小于5微米)。這可以通過任何適當?shù)姆鬯榉椒▽崿F(xiàn)，例如螺旋噴射研磨、流化床噴射研磨、形成納米顆粒的超臨界流體加工、高壓均化或噴霧干燥。用于吸入器或吹入器中的膠囊(例如由明膠或羥丙基甲基纖維素制備)、泡罩和藥筒可以配制成含有本發(fā)明化合物或組合物的粉末混合物、適當?shù)姆勰┗|(zhì)(如乳糖或淀粉)和性能改良劑(如異亮氨酸、甘露醇或硬脂酸鎂)。乳糖可以為無水形式或單水合物形式，優(yōu)選后者。其它的適當?shù)馁x形劑包括葡聚糖、葡萄糖、麥芽糖、山梨醇、木糖醇、果糖、蔗糖和海藻糖。用于吸入/鼻腔施用的配制物可以采用例如pgla制成速釋和/或改性釋放配制物。改性釋放配制物包括延緩、持續(xù)、脈沖、受控、靶向和按程序釋放。適合于透皮應用的適當?shù)呐渲莆锇委熡行Я康谋景l(fā)明的化合物或組合物以及載體。有益的載體包括可吸收的藥理學上可接受的溶劑以有助于通過宿主的皮膚。典型的透皮裝置為繃帶形式，它包括被膜、含有化合物以及任選的載體的儲庫、任選的能夠以受控和預定的速度在持續(xù)較長的時間內(nèi)將化合物遞送通過宿主皮膚的控速屏障以及將該裝置固定的皮膚上的工具。本發(fā)明的脂質(zhì)組合物可以通過多種方式中的任意一種施用，包括腸胃外、靜脈內(nèi)、全身性、局部、口服、腫瘤內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、吸入或任何此類遞送方法。在一個實施方案中，所述組合物可以通過胃腸外施用，即關(guān)節(jié)內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下或肌內(nèi)施用。在一個具體的實施方案中，所述脂質(zhì)體組合物可以通過靜脈內(nèi)輸注或腹膜內(nèi)推注施用。本發(fā)明的脂質(zhì)組合物可以配制成適于遞送給受試者的藥用組合物。本發(fā)明的藥用組合物通常還可以含有一或多種緩沖劑(例如中性緩沖的生理鹽水或磷酸鹽緩沖的生理鹽水)、碳水化合物(例如葡萄糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖或葡聚糖)、甘露醇、蛋白質(zhì)、多肽或氨基酸例如甘氨酸、抗氧化劑、抑菌劑、螯合劑例如edta或谷胱甘肽、輔助劑(例如氫氧化鋁)、使得該配制物與接受者血液等滲、低滲或弱高滲的溶質(zhì)、助懸劑、增稠劑和/或防腐劑。或者，本發(fā)明的組合物可以制成冷凍干燥物。本發(fā)明中使用的適當?shù)呐渲莆锟梢詤⒖祭鐁emington'spharmaceuticalsciences(雷明頓藥物科學)，mackpublishingcompany，philadelphia，pa.，17.sup.thed.(1985)。通常，組合物可以包括懸浮于可接受的載體例如水性載體中的脂質(zhì)納米顆粒的溶液。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了藥用組合物(即配制物)，其包含本發(fā)明的脂質(zhì)組合物和可藥用的載體或賦形劑。在另一個實施方案中，在脂質(zhì)組合物中存在至少一種其它脂質(zhì)成分。在另一個實施方案中，所述脂質(zhì)組合物為脂質(zhì)體形式。在另一個實施方案中，所述脂質(zhì)組合物為脂質(zhì)納米顆粒形式。在另一個實施方案中，所述脂質(zhì)組合物適合于遞送至肝臟。在另一個實施方案中，所述脂質(zhì)組合物適合于遞送至腫瘤。在另一個實施方案中，所述脂質(zhì)組合物適于局部遞送應(眼睛、耳朵、皮膚、肺)；遞送至肌肉(i.m.)、脂肪或皮下細胞(s.c.給藥)。在另一個實施方案中，所述生物學活性劑是rna或dna。為了免疫的目的，組合物通?？梢灾苽錇榭勺⑸涞?，可以通過注射施用(例如通過肌肉內(nèi)注射)。本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明組合物的遞送裝置(例如注射器、噴霧器、吸入器、皮膚貼劑等)。該裝置可以用于將藥用組合物施用于個體例如脊椎動物(例如哺乳動物，如人)用于免疫治療。本發(fā)明靶向的細胞和器官本發(fā)明的化合物、組合物、方法和用途可以用于將生物活性劑遞送至患者中的下列一或多種：肝臟或肝臟細胞(例如肝細胞)；腎臟或腎臟細胞；腫瘤或腫瘤細胞；cns或cns細胞(中樞神經(jīng)系統(tǒng)，例如腦和/或脊髓)；pns或pns細胞(外周神經(jīng)系統(tǒng))；肺或肺細胞；血管或血管細胞；皮膚或皮膚細胞(例如真皮細胞和/或濾泡細胞)；眼或眼細胞(例如黃斑、中央凹、角膜、視網(wǎng)膜)；和耳或耳細胞(例如內(nèi)耳、中耳和/或外耳細胞)。本發(fā)明的化合物、組合物、方法和用途還可以用于將生物活性劑(例如編碼免疫原的rna)遞送至免疫系統(tǒng)的細胞。在一個實施方案中，本發(fā)明的化合物、組合物、方法和用途可以將生物活性劑遞送至肝臟細胞(例如肝細胞)。在一個實施方案中，本發(fā)明的化合物、組合物、方法和用途可以將生物活性劑遞送至腫瘤或腫瘤細胞(例如原發(fā)性腫瘤細胞或轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞)。在另一個實施方案中，所述化合物、組合物、方法和用途用于將生物學活性劑遞送至皮膚脂肪、肌肉和淋巴結(jié)(即sc給藥)。為了將生物活性劑遞送至肝臟或肝細胞，在一個實施方案中，根據(jù)本領(lǐng)域中公知的方法，使得本發(fā)明的組合物與患者的肝臟或肝細胞接觸，通過例如胃腸外施用(例如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下施用)或局部施用(例如直接注入、導管插入、支架)以促進遞送。為了將生物活性劑遞送至腎臟或腎細胞，在一個實施方案中，根據(jù)本領(lǐng)域中公知的方法，使得本發(fā)明的組合物與患者的腎臟或腎細胞接觸，通過例如胃腸外施用(例如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下施用)或局部施用(例如直接注入、導管插入、支架)以促進遞送。為了將生物活性劑遞送至腫瘤或腫瘤細胞，在一個實施方案中，根據(jù)本領(lǐng)域中公知的方法，使得本發(fā)明的組合物與患者的腫瘤或腫瘤細胞接觸，通過例如胃腸外施用(例如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下施用)或局部施用(例如直接注入、門靜脈注射、導管插入、支架)以促進遞送。為了將生物活性劑遞送至cns或cns細胞(例如腦細胞和/或脊髓細胞)，在一個實施方案中，根據(jù)本領(lǐng)域中公知的方法，使得本發(fā)明的組合物與患者的cns或cns細胞(例如腦細胞和/或脊髓細胞)接觸，通過例如胃腸外施用(例如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下施用)或局部施用(例如直接注入、導管插入、支架、滲透泵施用(例如鞘內(nèi)或心室))以促進遞送。為了將生物活性劑遞送至pns或pns細胞，在一個實施方案中，根據(jù)本領(lǐng)域中公知的方法，使得本發(fā)明的組合物與患者的pns或pns細胞接觸，通過例如胃腸外施用(例如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下施用)或局部施用(例如直接注射)以促進遞送。為了將生物活性劑遞送至肺或肺細胞，在一個實施方案中，根據(jù)本領(lǐng)域中公知的方法，使得本發(fā)明的組合物與患者的肺或肺細胞接觸，通過例如胃腸外施用(例如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下施用)或局部施用(例如肺部直接施用于肺組織和細胞)以促進遞送。為了將生物活性劑遞送至血管或血管細胞，在一個實施方案中，根據(jù)本領(lǐng)域中公知的方法，使得本發(fā)明的組合物與患者的血管或血管細胞接觸，通過例如胃腸外施用(例如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下施用)或局部施用(例如夾緊、導管插入、支架)以促進遞送。為了將生物活性劑遞送至皮膚或皮膚細胞(如皮膚細胞和/或卵泡細胞)，在一個實施方案中，根據(jù)本領(lǐng)域中公知的方法，使得本發(fā)明的組合物與患者的皮膚或皮膚細胞接觸，通過例如胃腸外施用(例如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下施用)或局部施用(例如直接皮膚施用、離子電滲療法)以促進遞送。為了將生物活性劑遞送至眼或眼細胞(例如黃斑、中央凹、角膜、視網(wǎng)膜)，在一個實施方案中，根據(jù)本領(lǐng)域中公知的方法，使得本發(fā)明的組合物與患者的眼或眼細胞(例如黃斑、中央凹、角膜、視網(wǎng)膜)接觸，通過例如胃腸外施用(例如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下施用)或局部施用(例如直接注入、眼內(nèi)注射、眼周注射、視網(wǎng)膜下注射、離子透入療法、使用眼藥水、埋植劑)以促進遞送。為了將生物活性劑遞送至耳或耳細胞(例如內(nèi)耳、中耳和/或外耳的細胞)，在一個實施方案中，根據(jù)本領(lǐng)域中公知的方法，使得本發(fā)明的組合物與患者的耳或耳細胞(例如內(nèi)耳、中耳和/或外耳的細胞)接觸，通過例如胃腸外施用(例如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下施用)或局部施用(例如直接注射)以促進遞送。為了將生物活性劑(例如編碼免疫原的rna)遞送至免疫系統(tǒng)細胞(例如抗原呈遞細胞，包括轉(zhuǎn)職性抗原呈遞細胞)，在一個實施方案中，本發(fā)明的組合物可以通過肌肉注射遞送，然后免疫細胞可以滲透到遞送部位并處理遞送的rna。此類免疫細胞包括巨噬細胞(例如骨髓來源的巨噬細胞)、樹突細胞(例如骨髓來源的漿細胞樣樹突細胞和/或骨髓來源的骨髓樣樹突細胞)、單核細胞(例如人末梢血單核細胞)等(例如，參見wo2012/006372)。本發(fā)明的免疫作用為了免疫的目的，本發(fā)明包括遞送能夠編碼免疫原的rna。免疫原可以引起能夠辨識免疫原的免疫應答，所以可以用于提供對抗病原體或者對抗過敏原或?qū)鼓[瘤抗原的免疫力。優(yōu)選對抗由病原體導致的疾病和/或感染的免疫。rna可以通過本發(fā)明的脂質(zhì)組合物(例如配制為脂質(zhì)體或lnp)遞送。本發(fā)明通常使用其中包封編碼免疫原的rna的脂質(zhì)體。脂質(zhì)體中的包封可以保護rna避免被核糖核酸酶消化。封裝效率不必須是100％。存在外部rna分子(例如在脂質(zhì)體外表面)或“裸”rna分子(與脂質(zhì)體無關(guān)的rna分子)是可接受的。優(yōu)選地，對于包含脂質(zhì)體群和rna分子群的組合物，rna分子群的至少一半(例如、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的rna分子)被包封在脂質(zhì)體中。rna分子也可能與lnp復合。例如，脂質(zhì)不必僅形成脂質(zhì)體(具有水性核心)。一些脂質(zhì)納米顆粒可以包含脂質(zhì)核心(例如，該組合物可包含脂質(zhì)體和具有脂質(zhì)核心的納米顆粒的混合物)。在這種情況下，rna分子可以被具有水性核心的lnp包封，并且通過非共價相互作用(例如，帶負電荷的rna和陽離子脂質(zhì)之間的離子相互作用)與具有脂質(zhì)核心的lnp復合。lnp包封和與lnp的復合可以保護rna免受核糖核酸酶的消化。包封/復合效率不必須是100％。存在“裸”rna分子(與脂質(zhì)體無關(guān)的rna分子)是可接受的。優(yōu)選地，對于包含lnp群和rna分子群的組合物，rna分子群的至少一半(例如，至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％,或至少95％的rna分子)被包封在lnp中，或與lnp復合。脂質(zhì)體和lnp脂質(zhì)體通常分為三組：多層脂質(zhì)體(mlv)；小單層脂質(zhì)體(suv)；和大單層脂質(zhì)體(luv)。mlv在每個脂囊中具有多個雙層，形成若干分開的水性隔室。suv和luv具有包封水性核心的單個雙層；suv通常具有<50nm的直徑，且luv具有>50nm的直徑。對于編碼免疫原的rna的遞送，優(yōu)選的直徑范圍在60-180nm的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在80-160nm的范圍內(nèi)。脂質(zhì)組合物也可以是lnp。組合物可以包含具有水性核心的納米顆粒和具有脂質(zhì)核心的納米顆粒的混合物。對于編碼免疫原的rna的遞送，優(yōu)選的直徑范圍在60-180nm的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在80-160nm的范圍內(nèi)。脂質(zhì)體或lnp可以是包含脂質(zhì)體或lnp群的組合物的一部分，且群內(nèi)的脂質(zhì)體或lnp可以具有一定范圍的直徑。對于包含具有不同直徑的脂質(zhì)體或lnp群的組合物，優(yōu)選(i)以數(shù)量計至少80％的脂質(zhì)體或lnp具有在60-180nm范圍內(nèi)的直徑，優(yōu)選在80-160nm的范圍內(nèi)，(ii)群的平均直徑(通過強度例如z平均值)理想地在60-180nm的范圍內(nèi)，優(yōu)選在80-160nm的范圍內(nèi)；和/或(iii)大多數(shù)(theplurality)的直徑具有<0.2的多分散性指數(shù)。為了獲得具有所需直徑的脂質(zhì)體或lnp，可以使用其中將rna水溶液的兩個進料流在單個混合區(qū)中與一個乙醇脂質(zhì)溶液流(全部以相同的流速，例如在微流體通道中)合并的方法進行混合。用于形成免疫用途的脂質(zhì)組合物(例如，脂質(zhì)體或lnp)的有用的脂質(zhì)混合物包括：式(i)的脂質(zhì)；膽固醇；和聚乙二醇化脂質(zhì)，如peg-dmg，即peg綴合的1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇))。該混合物還可以包括中性兩性離子脂質(zhì)，如dspc(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿)或dpype。這些(和其他)混合物用于實施例中。rna分子體內(nèi)施用免疫組合物后，所遞送的rna被釋放并翻譯到細胞內(nèi)以在原位提供免疫原。在一些實施方案中，rna為正(“+”)鏈(plusstranded)，所以其可以被細胞翻譯而無需任何中間復制步驟(interveningreplicationsteps)，例如逆轉(zhuǎn)錄。其也可以與免疫細胞表達的tlr7受體結(jié)合，從而啟動輔助作用。在一些實施方案中，rna是自我復制rna。當遞送至脊椎動物細胞時，即使沒有任何蛋白質(zhì)存在，自我復制rna分子(復制子)也可以通過自身轉(zhuǎn)錄導致多個子代rna的產(chǎn)生(通過其自身產(chǎn)生的反義復制)。因此，自我復制rna分子通常為+鏈分子，遞送至細胞后其可以直接翻譯，該翻譯提供了rna-依賴性rna聚合酶，然后其通過所遞送的rna產(chǎn)生反義和正義轉(zhuǎn)錄本。因此，所遞送的rna導致多個子代rna的產(chǎn)生。這些子代rna以及共線的(collinear)亞基因組轉(zhuǎn)錄本可以自身翻譯從而在原位提供被編碼的免疫原的表達，或者可以被轉(zhuǎn)錄從而進一步提供與所遞送的rna(其被翻譯以提供免疫原的原位表達)具有相同意義的轉(zhuǎn)錄本。這種順序的轉(zhuǎn)錄的最終結(jié)果是被引入的復制子rna數(shù)量的擴增，所以被編碼的免疫原成為宿主細胞的主要多肽產(chǎn)物。一種實現(xiàn)自我復制的適當?shù)南到y(tǒng)是使用基于甲病毒屬的rna復制子。當遞送至細胞后，這些(+)鏈復制子被翻譯以獲得復制酶(或復制酶-轉(zhuǎn)錄酶)。該復制酶被翻譯為多聚蛋白，其可以自動裂解以提供復制復合物，其能夠創(chuàng)建(+)鏈被遞送rna的基因組(–)鏈副本。這些(–)鏈轉(zhuǎn)錄本可以自身被轉(zhuǎn)錄以進一步產(chǎn)生(+)鏈母本rna的副本，還可以產(chǎn)生能夠編碼免疫原的亞基因組轉(zhuǎn)錄，因此，亞基因組轉(zhuǎn)錄的翻譯通過感染細胞導致免疫原的原位表達。適當?shù)募撞《緦購椭谱涌梢圆捎迷醋韵铝胁《镜膹椭泼福盒恋庐吽共《?sindbisvirus)、森林腦炎病毒(semlikiforestvirus)、東部馬腦炎病毒(easternequineencephalitisvirus)、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(venezuelanequineencephalitisvirus)等。可以使用突變型或野生型病毒序列，例如veev的減毒tc83突變型已經(jīng)被用于復制子中。因此，優(yōu)選的自我復制rna分子可以編碼：(i)rna-依賴性rna聚合酶，其可以從自我復制rna分子轉(zhuǎn)錄rna和(ii)免疫原。所述聚合酶可以是甲病毒屬復制酶，其可以例如包含一或多種甲病毒屬蛋白nsp1、nsp2、nsp3和nsp4。鑒于天然甲病毒屬基因組除了非結(jié)構(gòu)性復制酶多聚蛋白之外，還能夠編碼結(jié)構(gòu)性病毒體蛋白，因此優(yōu)選本發(fā)明的自我復制rna分子不能編碼甲病毒屬結(jié)構(gòu)蛋白。因此，優(yōu)選的自我復制rna可以導致其自身的基因組rna副本在細胞中的產(chǎn)生，但是不會產(chǎn)生含有rna的病毒體。沒有產(chǎn)生這些病毒體的能力意味著自我復制rna分子不像野生型甲病毒屬，自身不能持久保持感染形式。野生型病毒持久保持所必需的甲病毒屬結(jié)構(gòu)蛋白不存在于本發(fā)明的自我復制rna中，它們的位置被編碼相關(guān)免疫原的基因所代替，因此所述亞基因組轉(zhuǎn)錄本能夠編碼免疫原而非結(jié)構(gòu)性甲病毒屬病毒體蛋白。所以，本發(fā)明中使用的自我復制rna可以具有兩個開放閱讀框。第一個(5')開放閱讀框編碼復制酶；第二個(3')開放閱讀框編碼免疫原。在某些實施方案中，rna可以具有另外的(例如下游)開放閱讀框，例如編碼其它免疫原(見下文)或者編碼輔助多肽。自我復制rna分子具有5'序列，其與被編碼的復制酶相容。自我復制rna分子具有各種長度，但它們通常為5000-25000個核苷酸長度，例如8000-15000個核苷酸長度或9000-12000個核苷酸長度。因此rna長于sirna遞送中所見到的。rna分子具有5'頂端(例如7-甲基鳥苷)。該頂端能夠增強rna的體內(nèi)翻譯。本發(fā)明中使用的rna分子的5'核苷酸可以具有5'三磷酸酯基團。在封端(capped)rna中，其可以通過5'-至-5'的橋與7-甲基鳥苷連接。5'三磷酸酯可以增強rig-i結(jié)合，因此可以促進輔助劑作用。rna分子可以具有3'聚a尾端。其也可以包含臨近其3'末端的聚a聚合酶識別序列(例如aauaaa)。本發(fā)明中使用的用于免疫目的的rna分子通常為單鏈。通過與tlr7、tlr8、rna解旋酶和/或pkr結(jié)合，單鏈rna通常能夠引發(fā)輔助劑的作用。以雙鏈形式遞送的rna(dsrna)可以與tlr3結(jié)合，該受體也可以通過dsrna觸發(fā)，它是在單鏈rna復制期間或者單鏈rna二級結(jié)構(gòu)中形成的。用于免疫目的的rna分子可以方便地通過體外轉(zhuǎn)錄(ivt)制備。ivt可以使用(cdna)模板創(chuàng)建并在細菌的質(zhì)粒形式中繁殖或者合成方法創(chuàng)建(例如通過基因合成和/或聚合酶鏈-反應(pcr)的工程方法)。例如，dna-依賴性rna聚合酶(例如噬菌體t7、t3或sp6rna聚合酶)可以用于自dna模板轉(zhuǎn)錄rna?？梢愿鶕?jù)需要使用適當?shù)姆舛撕途踑加合反應(盡管復制子的聚-a通常在dna模板中編碼)。這些rna聚合酶對于轉(zhuǎn)錄的5'核苷酸具有嚴格的要求，在某些實施方案中，這些要求必須與被編碼的復制酶的要求相匹配，從而保證ivt轉(zhuǎn)錄的rna有效地作為用于其自我編碼的復制酶的底物。根據(jù)wo2011/005799中所討論的，自我復制rna可以包含(除了任何5'頂端結(jié)構(gòu)外)一或多個具有被修飾的核堿基的核苷酸。例如，自我復制rna可以包含一或多個被修飾的嘧啶核堿基，例如假尿苷和/或5-甲基胞嘧啶殘基。然而，在某些實施方案中，rna不含有被修飾的核堿基，也不包含被修飾的核苷酸，即rna中所有的核苷酸均為標準的a、c、g和u核糖核苷酸(除了任何5'頂端結(jié)構(gòu)外，其可以包含7'-甲基鳥苷)。在其它實施方案中，rna可以包含含有7'甲基鳥苷的5'頂端，第1、2或3個5'核糖核苷酸可以在核糖的2'位被甲基化。本發(fā)明中使用的用于免疫目的的rna理想上僅包含核苷酸之間的磷酸二酯連接基，但是在某些實施方案中，其可以包含氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和/或甲基膦酸酯連接基。免疫原本發(fā)明中使用的用于免疫目的的rna分子能夠編碼多肽免疫原。施用后rna在體內(nèi)被翻譯，該免疫原可以激發(fā)接受者的免疫響應。免疫原能夠激發(fā)對抗病原體(例如細菌、病毒、真菌或寄生蟲)的免疫響應，但是，在某些實施方案中，其能夠激發(fā)對抗過敏原或腫瘤抗原的免疫響應。免疫響應包括抗體響應(通常包括igg)和/或細胞介導的免疫響應。多肽免疫原通常能夠激發(fā)識別相應的病原體(或過敏原或腫瘤)多肽的免疫響應，但是，在某些實施方案中，多肽作為模擬抗原(mimotope)能夠激發(fā)識別糖類的免疫響應。免疫原通常為表面多肽，例如粘附素、血凝素、包絡(luò)糖蛋白、刺突糖蛋白等。rna分子能夠編碼單一多肽免疫原或多種多肽。多種免疫原可以呈現(xiàn)為單一多肽免疫原(融合多肽)或各自不同的多肽。如果免疫原被表示為源自復制子的各自不同的多肽，則其中一或多種可以獲自上游的ires或其它病毒啟動子元素?；蛘撸喾N免疫原可以用多聚蛋白表達，所述多聚蛋白能夠編碼與短的自催化蛋白酶(例如手足口病病毒2a蛋白)融合的各個免疫原或者作為內(nèi)含肽。在某些實施方案中，免疫原能夠激發(fā)對抗下列這些細菌之一的免疫響應：腦膜炎奈瑟氏球菌(neisseriameningitidis)：有用的免疫原，包括但不限于膜蛋白，例如粘附素、自動轉(zhuǎn)運蛋白、毒素、鐵采集蛋白和因子h結(jié)合蛋白。三個有用的多肽的組合公開于giuliani等(2006)procnatlacadsciusa103(29):10834-9。肺炎鏈球菌(streptococcuspneumoniae)：公開于wo2009/016515的有用的多肽免疫原。它們包括但不限于rrgb菌毛亞單位、β-n-乙?；?氨基己糖苷酶前體(spr0057)、spr0096、一般應激蛋白、gsp-781(spr2021，sp2216)、絲氨酸/蘇氨酸激酶stkp(sp1732)和肺炎鏈球菌表面黏附素psaa。釀膿鏈球菌(streptococcuspyogenes)：有用的免疫原，包括但不限于在wo02/34771和wo2005/032582中公開的多肽。卡他莫拉菌(moraxellacatarrhalis)。百日咳桿菌(bordetellapertussis)：有用的百日咳免疫原，包括但不限于百日咳毒素或類毒素(pt)、絲狀血凝素(fha)、百日咳桿菌粘附素和凝集原2和3。金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)：有用的免疫原包括但不限于在wo2010/119343中公開的多肽，例如溶血素、esxa、esxb、高鐵色素結(jié)合蛋白(sta006)和/或sta011脂蛋白。破傷風桿菌(clostridiumtetani)：典型的免疫原為破傷風類毒素。白喉棒桿菌(cornynebacteriumdiphtheriae)：典型的免疫原為白喉類毒素。流感嗜血桿菌(haemophilusinfluenzae)：有用的免疫原包括但不限于在wo2006/110413和wo2005/111066中公開的多肽。銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)無乳鏈球菌(streptococcusagalactiae)：有用的免疫原包括但不限于在wo02/34771中公開的多肽。沙眼衣原體(chlamydiatrachomatis)：有用的免疫原包括但不限于pepa、lcre、artj、dnak、ct398、omph-like、l7/l12、omca、atos、ct547、eno、htra和murg(例如wo2005/002619公開的)。lcre(wo2006/138004)和htra(wo2009/109860)為兩種優(yōu)選的免疫原。肺炎衣原體(chlamydiapneumoniae)：有用的免疫原包括但不限于在wo02/02606中公開的多肽。幽門螺桿菌(helicobacterpylori)：有用的免疫原包括但不限于caga、vaca、nap和/或脲酶(wo03/018054)。大腸桿菌(escherichiacoli)：有用的免疫原包括但不限于源自下列的免疫原：產(chǎn)腸毒素的大腸桿菌(etec)、腸聚集大腸桿菌(eaggec)、彌散粘附性大腸桿菌(daec)、致腸病性大腸桿菌(epec)、腸外致病性大腸桿菌(expec)和/或致腸出血性大腸桿菌(ehec)。expec菌株包括腎盂腎炎性大腸桿菌(upec)和腦膜炎/膿毒癥相關(guān)的大腸桿菌(mnec)。有用的upec免疫原公開于wo2006/091517和wo2008/020330。有用的mnec免疫原公開于wo2006/089264。多個大腸桿菌類型的有用的免疫原為acfd(wo2009/104092)。炭疽桿菌(bacillusanthracis)鼠疫耶爾森氏菌(yersiniapestis)：有用的免疫原包括但不限于那些在wo2007/049155和wo2009/031043中公開的。表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermis)產(chǎn)氣莢膜桿菌(clostridiumperfringens)或肉毒梭菌(clostridiumbotulinums)嗜肺軍團菌(legionellapneumophila)貝氏柯克斯體(coxiellaburnetii)布魯氏菌(brucella)，例如牛布魯氏菌(b.abortus)、犬種布魯氏菌(b.canis)、羊布魯氏菌(b.melitensis)、沙林鼠布魯氏菌(b.neotomae)、綿羊布魯氏菌(b.ovis)、豬布魯氏菌(b.suis)、海豹布魯氏菌(b.pinnipediae)。弗朗西斯氏菌，例如新兇手弗朗西斯菌(f.novicida)、唇樓弗朗西斯菌(f.philomiragia)、f.tularensis。淋球菌(neisseriagonorrhoeae)梅毒螺旋體(treponemapallidum)杜克雷嗜血桿菌(haemophilusducreyi)糞腸球菌(enterococcusfaecalis)或屎腸球菌(enterococcusfaecium)腐生葡萄球菌(staphylococcussaprophyticus)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(yersiniaenterocolitica)結(jié)核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis)立克次體(rickettsia)單核細胞增多性李斯特菌(listeriamonocytogenes)霍亂弧菌(vibriocholerae)傷寒沙門氏菌(salmonellatyphi)伯氏疏螺旋體(borreliaburgdorferi)牙齦卟啉單胞菌(porphyromonasgingivalis)克雷伯氏桿菌(klebsiella)。在一些實施方案中，免疫原能夠激發(fā)下列這些病毒之一的免疫響應：正粘病毒(orthomyxovirus)：有用的免疫原可以源自流感a、b或c病毒，例如血細胞凝聚素、神經(jīng)氨酸酶或基質(zhì)m2蛋白質(zhì)。其中免疫原是流感a病毒血凝素，其可以是任何亞型，例如h1、h2、h3、h4、h5、h6、h7、h8、h9、h10、h11、h12、h13、h14、h15或h16。副粘病毒科病毒(paramyxoviridaeviruses)：免疫原包括但不限于那些源自下列的病毒：肺病毒(例如呼吸道合胞病毒，rsv)、德國麻疹病毒(rubulaviruses)(如腮腺炎病毒)、副粘病毒(例如副流感病毒)、偏肺病毒(metapneumoviruses)和麻疹病毒(morbilliviruses)(如麻疹病毒)。痘病毒科(poxviridae)：免疫原包括但不限于那些源自正痘病毒的病毒，例如天花病毒，包括但不限于主要天花和次要天花。微小rna核糖核酸病毒(picornavirus)：免疫原包括但不限于那些源自細小核糖核酸病毒的病毒，例如腸病毒、鼻病毒、嗜肝rna病毒(heparnavirus)、心臟病毒(cardioviruses)和口蹄疫病毒(aphthoviruses)。在一個實施方案中，腸病毒是脊髓灰質(zhì)炎病毒，例如1型、2型和/或3型脊髓灰質(zhì)炎病毒。在另一個實施方案中，腸病毒是ev71腸病毒。在另一個實施方案中，腸病毒是柯薩奇a或b病毒。布尼亞病毒(bunyavirus)：免疫原包括但不限于那些源自下列的病毒：正布尼亞病毒(orthobunyavirus)(例如加利福尼亞腦炎病毒)、白蛉病毒屬(如裂谷熱病毒)或內(nèi)羅病毒屬(如克里米亞-剛果出血熱病毒)。嗜肝rna病毒(heparnavirus)：免疫原包括但不限于那些源自嗜肝rna病毒的病毒，例如甲型肝炎病毒(hav)。纖維病毒(filovirus)：免疫原包括但不限于那些源自纖維病毒的病毒，例如埃博拉病毒(包括扎伊爾、象牙海岸、雷斯頓或蘇丹埃博拉病毒)或馬爾堡病毒。囊膜病毒(togavirus)：免疫原包括但不限于那些源自囊膜病毒的病毒，例如風疹病毒、甲病毒或動脈炎病毒。其包括風疹病毒。黃病毒(flavivirus)：免疫原包括但不限于那些由黃病毒衍生的病毒、如蜱傳腦炎(tbe)病毒、登革熱(1、2、3或4型)病毒、黃熱病病毒、日本腦炎病毒、科薩努爾森林病毒、西尼羅河腦炎病毒、圣路易斯腦炎病毒、俄羅斯春夏腦炎病毒、玻瓦森腦炎病毒。瘟病毒(pestivirus)：免疫原包括但不限于那些源自瘟病毒的病毒，例如牛病毒性腹瀉(bvdv)、經(jīng)典豬瘟(csfv)或邊界病(bdv)。嗜肝dna病毒(hepadnavirus)：免疫原包括但不限于那些源自嗜肝dna病毒的病毒，例如乙肝病毒。組合物包括乙肝病毒表面抗原(hbsag)。其它肝炎病毒：組合物可以包括源自下列的免疫原：丙型肝炎病毒、三角洲肝炎病毒、戊型肝炎病毒或庚型肝炎病毒。棒狀病毒(rhabdovirus)：免疫原包括但不限于那些源自棒狀病毒的病毒，例如狂犬病病毒屬(例如狂犬病病毒)和水泡性病毒(vsv)。杯狀病毒科(caliciviridae)：免疫原包括但不限于那些源自杯狀病毒的病毒，例如諾瓦克病毒(諾沃克病毒)和諾沃克樣病毒，如夏威夷病毒和雪山病毒。冠狀病毒(coronavirus)：免疫原包括但不限于那些源自下列的病毒：sars冠狀病毒、禽傳染性支氣管炎(ibv)、小鼠肝炎病毒(mhv)和豬傳染性胃腸炎病毒(tgev)。冠狀病毒免疫原可以是尖多肽。逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)：免疫原包括但不限于那些源自下列的病毒：腫瘤病毒、慢病毒(如hiv-1或hiv-2)或泡沫病毒。呼腸孤病毒(reovirus)：免疫原包括但不限于那些下列病毒：正呼腸孤病毒、輪狀病毒、環(huán)狀病毒或科蜱病毒。細小病毒(parvovirus)：免疫原包括但不限于那些源自細小病毒b19的病毒。皰疹病毒(herpesvirus)：免疫原包括但不限于那些源自人皰疹病毒的病毒，例如，僅舉例說明，單純皰疹病毒(hsv)(例如hsv1和2型)、水痘-帶狀皰疹病毒(vzv)，愛潑斯坦-巴爾病毒(ebv)、巨細胞病毒(cmv)、人皰疹病毒6(hhv6)、人皰疹病毒7(hhv7)和人皰疹病毒8(hhv8)。乳多空病毒(papovaviruses)：免疫原包括但不限于那些源自乳頭狀瘤病毒和多瘤病毒的病毒。(人)乳頭狀瘤病毒可能是血清型1、2、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63或65，例如源自血清型6、11、16和/或18的一或多種。腺病毒(adenovirus)：免疫原包括源自血清型36(ad-36)的那些。某些實施方案中，免疫原能夠激發(fā)對抗感染魚的病毒的免疫響應、例如：傳染性鮭魚貧血病毒(isav)、鮭魚胰腺疾病病毒(spdv)、傳染性胰腺壞死病病毒(ipnv)、斑點叉尾鮰病毒(ccv)、魚類淋巴囊腫病病毒(fldv)、傳染性造血器官壞死病毒(ihnv)、錦鯉皰疹病、鮭魚類核糖核酸病毒(也稱為大西洋鮭魚的小核糖核酸樣病毒)、淡水鮭魚病毒(lsv)、大西洋鮭魚輪狀病毒(asr)、鱒魚草莓病病毒(tsd)、銀鮭腫瘤病毒(cstv)或病毒性出血性敗血癥病毒(vhsv)。真菌免疫原可以源自皮膚癬菌(dermatophytres)，包括：絮狀表皮癬菌(epidermophytonfloccusum)、奧杜安氏小孢子菌(microsporumaudouini)、犬小孢子菌(microsporumcanis)、扭曲小孢子菌(microsporumdistortum)、馬小孢子菌(microsporumequinum)、石膏樣孢子菌(microsporumgypsum)、矮小孢子菌(microsporumnanum)、同心性毛癬菌(trichophytonconcentricum)、馬毛癬菌(trichophytonequinum)、雞毛癬菌(trichophytongallinae)、石膏樣毛癬菌(trichophytongypseum)、麥格毛癬菌(trichophytonmegnini)、須毛癬菌(trichophytonmentagrophytes)、昆克努毛癬菌(trichophytonquinckeanum)、紅色毛癬菌(trichophytonrubrum)、許蘭毛癬菌(trichophytonschoenleini)、斷發(fā)毛癬菌(trichophytontonsurans)、疣狀毛癬菌(trichophytonverrucosum)、疣狀毛癬菌的白變種、盤變種、黃褐變種(t.verrucosumvar.album，var.discoides，var.ochraceum)、紫色毛癬菌(trichophytonviolaceum)和/或蜜塊狀毛癬菌(trichophytonfaviforme)；或者可以源自：煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、構(gòu)巢曲霉、土曲霉、薩氏曲霉、黃曲霉、灰綠曲霉、芽生裂殖菌(blastoschizomycescapitatus)、白色念珠菌、烯醇化酶念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、星狀假念珠菌、克魯斯念珠菌、帕拉克斯念珠菌、葡萄牙念珠菌、偽熱帶念珠菌、吉利蒙念珠菌、卡氏枝孢霉、粗球孢子菌、皮炎芽生菌、新型隱球菌、棒地霉、組織胞漿菌、肺炎克雷伯氏菌、微孢子蟲、腦胞內(nèi)原蟲屬、腸有膈微孢蟲(septataintestinalis)和比氏腸胞蟲(enterocytozoonbieneusi)；不太常見的是brachiolaspp.、微孢子蟲屬(microsporidiumspp.)、小孢子蟲屬(nosemaspp.)、匹里蟲屬(pleistophoraspp.)、人氣管普孢蟲(trachipleistophoraspp.)、條抱蟲屬(vittaformaspp.)、巴西副球孢子菌(paracoccidioidesbrasiliensis)、卡氏肺孢子菌(pneumocystiscarinii)、苜猜腐酶(pythiumninsidiosum)、糠疹癬菌屬(pityrosporumovale)、釀酒酵母菌(sacharomycescerevisae)、鮑氏酵母菌(saccharomycesboulardii)、粟酒酵母(saccharomycespombe)、尖端賽多孢子菌(scedosporiumapiosperum)、申克孢子絲菌(sporothrixschenckii)、白吉利毛孢子菌(trichosporonbeigelii)、剛地弓形蟲(toxoplasmagondii)、馬爾尼菲青霉菌(penicilliummarneffei)、馬拉色菌屬(malasseziaspp.)、著色真菌屬(fonsecaeaspp.)、王氏霉菌屬(wangiellaspp.)、孢子絲菌屬(sporothrixspp.)、蛙糞霉屬(basidiobolusspp.)、耳霉屬(conidiobolusspp.)、根霉屬(rhizopusspp.)、毛霉屬(mucorspp.)、犁頭霉屬(absidiaspp.)、被孢霉屬(mortierellaspp.)、小克銀漢霉屬(cunninghamellaspp.)、瓶霉屬(saksenaeaspp.)、鏈格孢屬(alternariaspp.)、彎孢霉屬(curvulariaspp.)、長蠕孢霉屬(helminthosporiumspp.)、鐮刀菌屬(fusariumspp.)、曲霉屬(aspergillusspp.)、青霉屬(penicilliumspp.)、鏈核菌屬(monoliniaspp.)、絲核菌屬(rhizoctoniaspp.)、擬青霉屬(paecilomycesspp.)、皮司霉屬(pithomycesspp.)和枝孢菌屬(cladosporiumspp.)。在某些實施方案中，免疫原能夠激發(fā)對抗源自瘧原蟲屬的寄生蟲的免疫響應，例如惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲或卵形瘧原蟲。因此，本發(fā)明可以用于免疫對抗瘧疾。在某些實施方案中，免疫原能夠激發(fā)對抗源自魚虱科(caligidae)家族的寄生蟲的免疫響應，特別是源自瘡痂魚虱(lepeophtheirus)和魚虱屬(caligusgenera)的寄生蟲，例如海虱，如鮭瘡痂魚虱(lepeophtheirussalmonis)或智利魚虱(caligusrogercresseyi)。在某些實施方案中，免疫原能夠激發(fā)對抗下列的免疫響應：花粉過敏原(樹-、藥草-、野草-和草坪花粉過敏原)；昆蟲或蜘蛛過敏原(吸入、唾液和毒液過敏原，例如螨過敏原，蟑螂和蚊蠓過敏原，膜翅類毒液過敏原)；動物毛發(fā)和皮屑過敏原(源自例如狗、貓、馬、大鼠、小鼠等)；食物過敏原(如麥醇溶蛋白)。源自樹、草和草藥的重要花粉過敏原為例如源自分類學的下列目：殼斗目、木犀目、松柏目和懸鈴木科，包括但不限于樺樹(樺木屬)、榿木(榿木屬)、榛(榛屬)、角樹(鵝耳櫪屬)和橄欖樹(木犀欖屬)、雪松(柳杉屬和刺柏屬)、梧桐(懸鈴木屬)；禾本目，包括下列屬的草：黑麥草、梯牧草、早熟禾、狗牙根、鴨茅、絨毛草、虉草、黑麥和高粱；菊目和蕁麻目，包括下列屬的藥草：豚草、蒿和墻草。其它重要的吸入過敏原為那些源自下列的屬：屋塵螨，表皮螨屬(dermatophagoides)和嗜霉螨屬(euroglyphus)；儲糧塵螨(storagemite)，例如害嗜鱗螨屬(lepidoglyphys)、嗜甜螨屬(glycyphagus)和腐食螨屬(tyrophagus)；源自蟑螂、蚊和跳蚤的過敏原，例如小蠊屬(blatella)、大蠊屬(periplaneta)、搖蚊屬(chironomus)和柿頭圣屬(ctenocepphalides)，源自哺乳動物的過敏原，例如貓、狗和馬；毒液過敏原，包括源自昆蟲的刺蟄或叮咬，例如源自下列分類學的目：膜翅目，包括蜜蜂(蜜蜂科)、黃蜂(胡蜂科)和螞蟻(蟻科)。在某些實施方案中，免疫原為選自下列的腫瘤抗原：(a)癌癥-睪丸抗原，例如ny-eso-1、ssx2、scp1以及rage、bage、gage和mage家族多肽類，例如gage-1、gage-2、mage-1、mage-2、mage-3、mage-4、mage-5、mage-6和mage-12(其可以用于例如治療黑素瘤、肺、頭頸、nsclc、乳腺、胃腸道和膀胱腫瘤)；(b)突變的抗原，例如p53(與各種實體瘤有關(guān)，例如結(jié)直腸癌、肺癌、頭頸癌)、p21/ras(與例如黑素瘤、胰腺癌和結(jié)直腸癌有關(guān))、cdk4(與例如黑素瘤有關(guān))、mum1(與例如黑素瘤有關(guān))、半胱天冬酶-8(與例如頭頸癌有關(guān))、cia0205(與例如膀胱癌有關(guān))、hla-a2-r1701、β連環(huán)蛋白(與例如黑素瘤有關(guān))、tcr(與例如t-細胞非霍奇金淋巴瘤有關(guān))、bcr-abl(與例如慢性髓性白血病有關(guān))、磷酸丙糖異構(gòu)酶、kia0205、cdc-27和ldlr-fut；(c)過度表達的抗原，例如半乳凝素4(與例如結(jié)直腸癌有關(guān))、半乳凝素9(與例如霍奇金病有關(guān))、蛋白酶3(與例如慢性髓性白血病有關(guān))、wt1(與例如各種白血病有關(guān))、碳酸酐酶(與例如腎癌有關(guān))、醛縮酶a(與例如肺癌有關(guān))、prame(與例如黑素瘤有關(guān))、her-2/neu(與例如乳癌、結(jié)腸癌、肺癌和卵巢癌有關(guān))、乳腺珠蛋白、α-甲胎蛋白(與例如肝細胞瘤有關(guān))、ksa(與例如結(jié)直腸癌有關(guān))、胃泌素(與例如胰腺癌和胃癌有關(guān))、端粒酶催化蛋白、muc-1(與例如乳癌和卵巢癌有關(guān))、g-250(與例如腎細胞癌有關(guān))、p53(與例如乳癌、結(jié)腸癌有關(guān))和癌胚抗原(與例如乳癌、肺癌以及胃腸道癌癥如結(jié)直腸癌有關(guān))；(d)共享抗原(sharedantigens)，例如黑素瘤-黑素細胞分化抗原，促黑激素例如mart-1/melana、gp100、mc1r、促黑激素受體、酪氨酸酶、酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1/trp1和酪氨酸酶相關(guān)蛋白-2/trp2(與例如黑素瘤有關(guān))；(e)前列腺相關(guān)抗原，例如pap、psa、psma、psh-p1、psm-p1、psm-p2，它們與例如前列腺癌有關(guān)；(f)免疫球蛋白個體基因型(與例如骨髓瘤和b細胞淋巴瘤有關(guān))。在某些實施方案中，腫瘤免疫原包括但不限于p15、hom/mel-40、h-ras、e2a-prl、h4-ret、igh-igk、myl-rar、epsteinbarr病毒抗原、ebna、人乳頭瘤病毒(hpv)抗原(包括e6和e7)、乙型肝炎和丙型肝炎病毒抗原、人t-細胞嗜淋巴細胞病毒抗原、tsp-180、p185erbb2、p180erbb-3、c-met、mn-23h1、tag-72-4、ca19-9、ca72-4、cam17.1、numa、k-ras、p16、tage、psca、ct7、43-9f、5t4、791tgp72、β-hcg、bca225、btaa、ca125、ca15-3(ca27.29\bcaa)、ca195、ca242、ca-50、cam43、cd68\kp1、co-029、fgf-5、ga733(epcam)、htgp-175、m344、ma-50、mg7-ag、mov18、nb/70k、ny-co-1、rcas1、sdccag16、ta-90(mac-2結(jié)合蛋白/親環(huán)蛋白c-相關(guān)蛋白)、taal6、tag72、tlp、tps等。藥物組合物本發(fā)明的藥用組合物，特別是用于免疫的組合物，可以包含一或多種小分子免疫增強劑。例如，組合物可以包含tlr2激動劑(例如pam3csk4)、tlr4激動劑(例如氨烷基氨基葡萄糖苷磷酸酯，例如e6020)、tlr7激動劑(例如咪喹莫特)、tlr8激動劑(例如瑞奎莫特)和/或tlr9激動劑(例如ic31)。任何此類激動劑理想的分子量<2000da。在一些實施方案中，此類激動劑可以被內(nèi)含rna的脂質(zhì)體包封，或者被lnp包封或與lnp復合，但在其它實施方案中，它們可以是未包封的或未復合的。本發(fā)明的藥物組合物可以具有200mosm/kg至400mosm/kg、例如240-360mosm/kg，或290-310mosm/kg的滲透壓。本發(fā)明的藥物組合物可包括一種或多種防腐劑，例如硫柳汞或2-苯氧基乙醇。優(yōu)選無汞組合物，且可以制備無防腐劑的疫苗。根據(jù)需要，組合物包含本文所述的免疫有效量的脂質(zhì)組合物(例如脂質(zhì)體和lnp)以及任何其它組分。免疫學有效量是指以單一劑量或作為系列的一部分施用給個體的對治療(例如對病原體的預防性免疫應答)有效的量。該量根據(jù)待治療個體的健康和身體狀況、年齡、待治療個體的分類群(例如非人靈長類、靈長類動物等)、個體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所需的保護程度、疫苗的配制、治療醫(yī)生對醫(yī)療狀況的評估以及其他相關(guān)因素而變化。預計該量將落在相對較寬的范圍內(nèi)，可以通過常規(guī)試驗確定。本發(fā)明的組合物通常以每劑量的rna的量表示。優(yōu)選的劑量具有≤100μg的rna(例如10-100μg、如約10μg、25μg、50μg、75μg或100μg)，但在低得多的水平可見表達，例如<1μg/劑量、<100ng/劑量、<10ng/劑量、<1ng/劑量等。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的藥物組合物的遞送裝置(例如注射器、霧化器、噴霧器、吸入器、皮膚貼劑等)。該裝置可用于將組合物施用于脊椎動物受試者。本發(fā)明的脂質(zhì)體或lnp不包含核糖體。治療方法和醫(yī)療用途本文所述的脂質(zhì)體配制的或lnp配制的rna和藥物組合物用于誘導針對感興趣的免疫原的免疫應答的體內(nèi)應用。本發(fā)明提供了在脊椎動物中誘導免疫應答的方法，其包括施用有效量的如本文所述的脂質(zhì)體的配制或lnp配制的rna或藥物組合物。免疫應答優(yōu)選是保護性的，優(yōu)選地涉及抗體和/或細胞介導的免疫。所述組合物可以用于啟動和促進的目的。或者，初始-加強免疫方案可以是rna和相應的多肽抗原的混合物(例如，rna初始，蛋白質(zhì)增強)。本發(fā)明還提供了用于在脊椎動物中誘導免疫應答的脂質(zhì)體、lnp或藥物組合物。本發(fā)明還提供了脂質(zhì)體、lnp或藥物組合物在制備用于在脊椎動物中誘導免疫應答的藥物中的應用。通過這些應用和方法在脊椎動物中誘導免疫應答，脊椎動物可被保護免受各種疾病和/或感染，例如如上所述的細菌和/或病毒性疾病。脂質(zhì)體、lnp和組合物是免疫原性的，更優(yōu)選是疫苗組合物。根據(jù)本發(fā)明的疫苗可以是預防性的(即預防感染)或治療性的(即治療感染)，但通常是預防性的。脊椎動物優(yōu)選為哺乳動物，如人或大型獸醫(yī)哺乳動物(例如馬、牛、鹿、山羊、豬)。如本文所用，“大型哺乳動物”是指具有至少5kg、優(yōu)選至少7kg的典型或平均成年體重的哺乳動物。這樣的大型哺乳動物可以包括例如人、非人靈長類動物、狗、豬、牛、鹿、山羊，并且意在排除小型哺乳動物、例如小鼠、大鼠、豚鼠和其他嚙齒動物。當疫苗用于預防性使用時，人類優(yōu)選是兒童(例如幼兒或嬰兒)或青少年；在疫苗用于治療用途的情況下，人類優(yōu)選是青少年或成年人。用于兒童的疫苗也可以施用于成人以例如評估安全性、劑量、免疫原性等。根據(jù)本發(fā)明制備的疫苗可用于治療兒童和成人。因此、人類患者可不到1歲、5歲以下、1-5歲、5-15歲、15-55歲或至少55歲。接種疫苗的首選患者是老年人(例如≥50歲、≥60歲且優(yōu)選≥65歲)、年幼者(例如<5歲)、住院患者、醫(yī)護人員、武裝部隊和軍事人員、孕婦、長期病患者或免疫缺陷患者。然而，疫苗不僅僅適用于這些群體，而是可以更普遍地在群體中使用。本發(fā)明的組合物通常直接施用于患者?？梢酝ㄟ^胃腸道外注射(例如，皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)或遞送至組織間隙完成直接遞送；舌內(nèi)注射通常不用于免疫目的。替代的遞送途徑包括直腸、口服(例如片劑、噴霧劑)、口頰、舌下、陰道、局部、透皮或經(jīng)皮、鼻內(nèi)、眼、耳、肺或其它粘膜施用。兩種優(yōu)選的途徑是皮內(nèi)和肌內(nèi)施用。注射可以通過針頭(例如皮下針頭)進行，但可選擇采用無針注射。肌內(nèi)劑量通常為0.5ml。本發(fā)明可用于引起全身和/或粘膜免疫，優(yōu)選引起增強的全身和/或粘膜免疫?？梢酝ㄟ^單劑量方案或多劑量方案進行施用。多劑量可以用于初次免疫方案和/或加強免疫方案。在多劑量方案中，可通過相同或不同途徑施用各種劑量，例如采用胃腸外初次免疫和粘膜加強免疫、粘膜初次免疫和胃腸外加強免疫等。一般以至少1周(例如約2周、約3周、約4周、約6周、約8周、約10周、約12周、約16周等)的間隔施用多個劑量。在一個實施方案中，可在出生后約6周、10周和14周(例如在6周齡、10周齡和14周齡時，如常用于世界衛(wèi)生組織的擴大免疫規(guī)劃(“epi”))施用多劑量。在備選實施方案中，間隔約兩個月施用兩個初次劑量，例如間隔約7、8或9周，在施用第二個初次劑量后約6個月至1年(例如第二個初次劑量后約6、8、10或12個月)施用一個或多個加強劑量。在另一個實施方案中，間隔約兩個月施用三個初次劑量，例如間隔約7、8或9周，在施用第三個初次劑量后約6個月至1年(例如第三個初次劑量后約6、8、10或12個月)施用一個或多個加強劑量。實施例式(i)的陽離子脂質(zhì)下面的實施例旨在闡明本發(fā)明，不應當被視為對其加以限定。溫度均為攝氏度。如果沒有另外說明，所有的蒸發(fā)濃縮均在減壓下進行，優(yōu)選在約15mmhg至100mmhg(＝20-133mbar)。終產(chǎn)物、中間體和原料的結(jié)構(gòu)通過標準分析方法確證，例如微量元素分析或光譜特征分析，例如ms、ir或nmr。使用的縮寫是本領(lǐng)域中的常規(guī)縮寫，其中一些如下文所定義。快速柱純化優(yōu)選在硅膠柱上進行，采用適當?shù)牡榷然蛱荻冉M合洗脫液。除非另有說明，hplc分析采用watersatlantisdc18柱(4.6×150mm，3mm)，梯度洗脫(0.1％v/v三氟乙酸改性的0％-95％的乙腈水溶液，洗脫20min，流速為1.4ml/min)。1hnmr譜采用brukeravanceii400mhz光譜儀進行。所有的化學位移均以相當于四甲基硅烷的百萬分之幾(δ)報告。下列縮寫用于表述信號模式：s＝單峰，d＝雙峰，t＝三重峰，q＝四重峰，m＝多重峰，br＝寬峰。es-ms數(shù)據(jù)采用watersltcpremier質(zhì)譜儀記錄，配備雙電噴霧離子化源，agilent1100液相色譜。磺胺二甲氧嘧啶[sigma，m/z＝311.0814(m+1)]用作通過lockspraytm通道每第三掃描獲取的對照基準。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)的質(zhì)量精度(massaccuracy)<5ppm?？s寫:acoh乙酸aq含水a(chǎn)r芳基atm大氣壓boc叔丁基-碳酸酯基br.s.,bs寬單峰℃攝氏溫度cd2cl2氘代二氯甲烷cdcl3氘代氯仿ch2cl2,dcm二氯甲烷ch3cn,mecn乙腈d雙峰dd雙雙峰ddd雙雙雙峰diea,dipean-乙基二異丙胺dme1,4-二甲氧基乙烷dmfn,n-二甲基甲酰胺dmap二甲基氨基吡啶dmso二甲基亞砜dt雙三重峰edc1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺etoac乙酸乙酯etoh乙醇fcc快速柱色譜g厚度/號(gauge)h小時hbtu(2-(1h-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽hcl鹽酸hmpa六甲基磷酰胺hplc高壓液相色譜ht高流通量ibx2-碘酰基苯甲酸i-proh異丙醇h2o水k開爾文koh氫氧化鉀lc液相色譜m摩爾m多重峰，質(zhì)量meoh甲醇mgso4硫酸鎂mhz兆赫ml,ml毫升mm毫米mmol毫摩爾min.分鐘mrna信使核糖核酸ms質(zhì)譜mw微波nah氫化鈉nahmds六甲基二硅烷重氮鈉naoet乙醇鈉naoh氫氧化鈉na2so4硫酸鈉net3三乙胺ng納克nh3氨nmr核磁共振quint.五重峰pd/c鈀碳ppt沉淀rbf圓底燒瓶rf阻滯因數(shù)rt室溫rt保留時間s單峰sat.飽和的sirna短干擾核糖核酸sm原料t三重峰tfa三氟乙酸t(yī)hf四氫呋喃tlc薄層色譜uplc超高效液相色譜wt重量μg微克μl微升所有化合物都使用autonom命名。lc特征：lc方法1：在具有inersilc83.0μm，3.0x53mm柱的watersacquitysds系統(tǒng)上獲得保留時間(rt)。在50℃的烘箱溫度，歷經(jīng)1.0分鐘應用h2o(+0.1％甲酸)/ch3cn(+0.1％甲酸)40/60至5/95的梯度，然后保持2.1分鐘。(1.0ml/分鐘，作為溶劑流)。lc方法2:在具有acquitybeh1.7μm2.1x50mm柱的watersacquitysds系統(tǒng)上得到保留時間(rt)。在50℃的烘箱溫度，歷經(jīng)1.4分鐘應用h2o(+0.1％甲酸)/ch3cn(+0.1％甲酸)45/55至1/99的梯度，然后保持3.6min。(1.0ml/分鐘，作為溶劑流)。lc方法3:在具有acquitybeh1.7μm2.1x50mm柱的watersacquitysds系統(tǒng)上得到保留時間(rt)。在50℃的烘箱溫度，歷經(jīng)0.7分鐘應用h2o(+0.1％甲酸)/ch3cn(+0.1％甲酸)45/55至1/99的梯度，然后保持1.3min。(1.0ml/分鐘，作為溶劑流)。lc方法4:在具有acquitybeh1.7μm2.1x50mm柱的watersacquitysds系統(tǒng)上得到保留時間(rt)。在50℃的烘箱溫度，歷經(jīng)3.6分鐘應用h2o(+0.1％甲酸)/ch3cn(+0.1％甲酸)45/55至0.1/99.9的梯度，然后保持1.4min。(1.0ml/分鐘，作為溶劑流)。lc方法5:在具有acquityuplcbehc181.7μm2.1mmx50mm柱的watersacquitysds系統(tǒng)上得到保留時間(rt)。在50℃的烘箱溫度，歷經(jīng)3.40分鐘應用h2o(+0.1％甲酸)/ch3cn(+0.1％甲酸)60/40至2/98的梯度，然后保持1.40min。(1.0ml/分鐘，作為溶劑流)。lc方法6:在具有acquitybeh1.7μm2.1x50mm柱的watersacquitysds系統(tǒng)上得到保留時間(rt)。在50℃的烘箱溫度，歷經(jīng)1.4min應用h2o(+0.1％甲酸)/ch3cn(+0.1％甲酸)45/55至1/99的梯度，隨后增加至0/100，3.75min，降至45/55，0.04min(1.0ml/分鐘，作為溶劑流)。合成策略流程1實施例1的合成:4-(二甲基氨基)丁酸2,5-雙((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基)芐基酯中間體1a:2,5-雙((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基)苯甲醛向2,5-二羥基苯甲醛(0.551g，3.99mmol)在dmf(35ml)中的溶液中加入(9z,12z)-甲磺酸十八碳-9,12-二烯基酯(2.75g，7.98mmol)，隨后加入k2co3(4.41g，31.9mmol)，并加熱至80℃達16h。將該反應混合液用100ml乙酸乙酯和100ml水稀釋。將有機層分離，用2x50ml水洗滌，經(jīng)na2so4干燥，并減壓濃縮，得到粗制產(chǎn)物。將粗制產(chǎn)物經(jīng)硅膠色譜用10-90％乙酸乙酯:庚烷洗脫純化，得到所需產(chǎn)物，為無色油狀物(1.3g，26％收率)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:10.48(s,1h),7.31(d,j＝3.5hz,1h),7.12(dd,j＝9.0,3.5hz,1h),6.93(d,j＝9.0hz,1h),5.29-5.46(m,8h),4.03(t,j＝6.5hz,2h),3.94(t,j＝6.5hz,2h),2.78(t,j＝6.3hz,4h),2.01-2.13(m,8h),1.72-1.87(m,4h),1.46(dt,j＝14.1,7.0hz,4h),1.24-1.41(m,28h),0.89(t,j＝7.0hz,6h)。13cnmr(400mhz,cdcl3)δ:189.7,156.3,153.0,130.2,130.1,130.0,128.0,128.0,127.9,127.9,125.0,124.1,114.3,110.7,69.1,68.6,31.5,29.6,29.4,29.3,29.2,29.2,27.2,26.0,26.0,25.6,22.6,14.1。中間體1b:(2,5-雙((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基)苯基)甲醇向中間體1a(1.165g，1.835mmol)在thf(10ml)和甲醇(5ml)中的溶液中加入nabh4(0.090g，2.385mmol)，并在室溫攪拌16h。將該反應混合液用100ml乙酸乙酯和100ml水稀釋。將有機層分離，用2x50ml水洗滌，經(jīng)na2so4干燥，并減壓濃縮，得到粗制產(chǎn)物。將粗制產(chǎn)物經(jīng)硅膠色譜用10-90％乙酸乙酯:庚烷洗脫純化，得到所需產(chǎn)物，為無色油狀物(0.75g,64％收率)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:6.86(d,j＝2.0hz,1h),6.76-6.80(m,2h),5.27-5.48(m,8h),4.66(s,2h),3.96(t,j＝6.5hz,2h),3.91(t,j＝6.8hz,2h),2.79(t,j＝6.5hz,4h),2.06(q,j＝6.9hz,8h),1.77(dquin,j＝14.2,7.0hz,4h),1.41-1.54(m,j＝7.5,5.5hz,4h),1.23-1.41(m,28h),0.90(t,j＝7.0hz,6h)。13cnmr(400mhz,cdcl3)δ:153.0,150.9,130.2,130.1,130.1,130.1,128.0,128.0,127.9,115.4,113.7,112.0,68.6,68.5,62.5,31.5,29.6,29.5,29.4,29.3,29.2,27.2,27.2,26.1,26.0,25.6,22.6,14.1。實施例1:4-(二甲基氨基)丁酸2,5-雙((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基)芐基酯向4-(二甲基氨基)丁酸(26.3mg，0.157mmol)在dcm(25ml)中的溶液中加入edc.hcl(45.1mg，0.235mmol)和dmap(1.918mg，0.016mmol)，隨后加入net3(0.087ml，0.628mmol)，并在室溫攪拌30min。向該混合物中加入中間體1b(100mg，0.157mmol)，并攪拌16h。將該反應混合液用100ml二氯甲烷和100ml水稀釋。將有機層分離，用2x50ml水洗滌，經(jīng)mgso4干燥，并減壓濃縮，得到粗制產(chǎn)物。將粗制產(chǎn)物在biotage純化系統(tǒng)上經(jīng)硅膠色譜用10-90％乙酸乙酯:庚烷洗脫純化，得到所需產(chǎn)物，為無色油狀物(84mg，71％收率)。1hnmr(400mhz,二氯甲烷-d2)δ:6.90(d,j＝2.5hz,1h),6.78-6.85(m,2h),5.28-5.54(m,8h),5.14(s,2h),3.85-4.01(m,4h),2.82(t,j＝6.5hz,4h),2.42(t,j＝7.3hz,2h),2.30(t,j＝7.0hz,2h),2.21(s,6h),2.01-2.15(m,8h),1.69-1.88(m,6h),1.44-1.57(m,4h),1.26-1.44(m,28h),0.93(t,j＝7.0hz,6h)。13cnmr(400mhz,二氯甲烷-d2)δ:173.8,153.4,151.4,130.6,130.6,128.5,128.4,126.3,116.4,114.6,113.0,69.4,69.0,61.9,59.2,45.7,32.5,32.1,30.2,30.1,30.0,30.0,29.9,29.8,29.8,27.7,27.7,26.6,26.6,26.1,23.5,23.1,14.4。以下實施例能使用與實施例1的合成所使用的那些類似的偶聯(lián)方法制備。實施例2:3-(二甲基氨基)丙酸2,5-雙((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基)芐基酯分離所需產(chǎn)物，為無色油狀物(120mg，69％收率)。1hnmr(400mhz,二氯甲烷-d2)δ:6.92(d,j＝2.5hz,1h),6.81-6.84(m,2h),5.32-5.48(m,9h),5.15(s,2h),3.84-4.03(m,4h),2.82(t,j＝6.5hz,4h),2.61-2.70(m,2h),2.50-2.61(m,2h),2.25(s,6h),2.09(q,j＝6.9hz,7h),1.72-1.84(m,4h),1.44-1.56(m,4h),1.26-1.44(m,28h),0.93(t,j＝7.0hz,6h)。13cnmr(400mhz,二氯甲烷-d2)δ:172.8,153.5,151.4,130.6,130.6,128.5,128.4,126.2,116.3,114.6,113.0,69.4,69.0,62.0,55.4,45.6,33.6,32.1,30.2,30.2,30.1,30.0,29.9,29.9,29.8,29.8,27.7,27.7,26.6,26.6,26.1,23.1,14.4。流程2:實施例3的合成:碳酸2,5-雙((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯基氧基)芐基酯3-(二甲基氨基)丙基酯向中間體1b(150mg，0.235mmol)在干燥的cdcl3(2ml)中的溶液中加入氯甲酸對-硝基苯基酯(61.7mg，0.306mmol)，隨后加入吡啶(23.1μl，0.286mmol)。將該反應混合液在50℃攪拌。4h后將該反應混合液減壓濃縮，并再溶于2mldcm中。加入n,n-二甲基氨基丙醇(121mg，1.18mmol)，隨后加入dmap(5.75mg，0.047mmol)。將該反應混合液在室溫攪拌。18h后用2ml水將該反應淬滅，并萃取至另外的3x5mldcm中。將合并的有機層減壓濃縮和在isco純化系統(tǒng)上經(jīng)硅膠色譜用meoh/dcm(0至3％)洗脫純化，得到141.3mg(78％)所需產(chǎn)物，為澄清的油狀物。1hnmr(400mhz,氯仿-d)δ:6.95(d,j＝2.0hz,1h),6.78-6.83(m,2h),5.29-5.48(m,8h),5.22(s,2h),4.24(t,j＝6.6hz,2h),3.94(dt,j＝9.6,6.6hz,4h),2.81(t,j＝6.3hz,4h),2.38(t,j＝7.3hz,2h),2.24(s,6h),2.08(q,j＝6.6hz,8h),1.87(quin,j＝6.9hz,2h),1.78(m,4h),1.28-1.52(m,32h),0.92(t,j＝6.6hz,6h)。ms(m+1)＝766.5,rt＝1.22min(lc方法1)。以下實施例能使用與實施例3的合成所使用的那些類似的偶聯(lián)方法制備實施例4:碳酸2,5-雙((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯基氧基)芐基酯3-(二乙基氨基)丙基酯1hnmr(400mhz,氯仿-d)δ:6.95(d,j＝2.0hz,1h),6.77-6.84(m,2h),5.30-5.48(m,8h),5.22(s,2h),4.24(t,j＝6.6hz,2h),3.94(dt,j＝9.1,6.6hz,4h),2.81(t,j＝6.3hz,4h),2.53(q,j＝7.1hz,6h),2.08(q,j＝6.6hz,8h),1.71-1.91(m,6h),1.44-1.53(m,4h),1.26-1.44(m,28h),1.03(t,j＝7.1hz,6h),0.92(t,j＝7.1hz,6h)。ms(m+1)＝794.5,rt＝1.38min(lc方法1)。流程3:實施例5的合成:4-(二甲基氨基)丁酸2,5-雙((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基)芐基酯中間體5a:2,5-雙((8-羥基辛基)氧基)苯甲醛向2,5-二羥基苯甲醛(1g，7.24mmol)在dmf(15ml)中的溶液中加入8-溴辛-1-醇(3.03g，14.48mmol)、k2co3(5.00g，36.2mmol)和ki(0.012g，0.072mmol)，并加熱至80℃達16h。將該反應混合液用100ml乙酸乙酯和100ml水稀釋。將有機層分離，用2x50ml水洗滌，經(jīng)na2so4干燥，并減壓濃縮，得到粗制產(chǎn)物。將粗制產(chǎn)物經(jīng)制備型-hplc色譜用10-90％乙腈:水和0.1％tfa洗脫純化，得到所需產(chǎn)物(550mg，19％收率)。1hnmr(400mhz,氯仿-d)δ:10.47(s,1h),7.31(d,j＝3.0hz,1h),7.11(dd,j＝9.0,3.3hz,1h),6.92(d,j＝9.0hz,1h),4.03(t,j＝6.4hz,2h),3.94(t,j＝6.5hz,2h),3.65(t,j＝6.7hz,4h),1.69-1.79(m,4h),1.52-1.65(m,4h),1.43-1.50(m,4h),1.30-1.40(m,12h)。13cnmr(400mhz,氯仿-d)δ:189.9,156.3,152.9,124.9,124.2,114.3,110.7,69.1,68.6,63.0,63.0,32.7,32.7,29.3,29.1,26.0,25.9,25.6。中間體5b:雙癸酸((2-甲?；?1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(辛烷-8,1-二基)酯向中間體5a(455mg，1.153mmol)在dcm(11.5ml)中的溶液中加入癸酰氯(484mg，2.54mmol)，隨后在室溫加入diea(1.01ml，5.77mmol)，并攪拌16h。將該反應混合液用100ml二氯甲烷和100ml水稀釋。將有機層分離，用50ml水洗滌，經(jīng)mgso4干燥，并減壓濃縮，得到粗制產(chǎn)物。將粗制產(chǎn)物在isco純化系統(tǒng)上經(jīng)硅膠色譜用10-90％乙酸乙酯:庚烷洗脫純化，得到所需產(chǎn)物(591mg，73％收率)。1hnmr(400mhz,氯仿-d)δ:10.47(s,1h),7.31(d,j＝3.3hz,1h),7.12(dd,j＝9.0,3.3hz,1h),6.93(d,j＝9.0hz,1h),3.99-4.12(m,6h),3.94(t,j＝6.5hz,2h),2.30(t,j＝7.5hz,4h),1.72-1.95(m,4h),1.11-1.54(m,48h),0.81-0.96(m,6h)。13cnmr(400mhz,氯仿-d)δ:189.8,179.0,174.1,156.3,152.9,125.0,124.2,114.3,69.1,68.6,64.3,34.4,31.8,29.5,29.4,29.4,29.2,29.2,28.6,26.0,25.9,25.9,25.0,24.7,22.7,14.1。中間體5c:雙癸酸((2-(羥基甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(辛烷-8,1-二基)酯在0℃向中間體5b(590mg，0.839mmol)在四氫呋喃(4.2ml)和甲醇(4.2ml)中的溶液中加入硼氫化鈉(31.7mg，0.839mmol)，并攪拌1h。將該反應混合液用100ml乙酸乙酯和50ml水稀釋。將有機層分離，用50ml水洗滌，經(jīng)na2so4干燥，并減壓濃縮，得到粗制產(chǎn)物。將粗制產(chǎn)物在isco純化系統(tǒng)上經(jīng)硅膠色譜用10-90％乙酸乙酯:庚烷洗脫純化，得到所需產(chǎn)物(450mg，76％收率)。1hnmr(400mhz,氯仿-d)δ:6.87(d,j＝2.5hz,1h),6.76-6.79(m,2h),4.66(s,2h),4.06(t,j＝6.8hz,4h),3.96(t,j＝6.5hz,2h),3.91(t,j＝6.5hz,2h),2.30(t,j＝7.5hz,4h),1.70-1.86(m,4h),1.62(t,j＝7.0hz,8h),1.41-1.52(m,4h),1.14-1.40(m,36h),0.80-0.95(m,6h)。13cnmr(400mhz,氯仿-d)δ:174.1,153.0,150.9,130.1,115.3,113.7,112.0,68.5,68.4,64.3,64.3,62.4,34.4,31.8,29.4,29.4,29.3,29.3,29.2,29.1,28.6,26.1,26.0,25.8,25.0,24.7,22.7,14.1。實施例5:雙癸酸((2-(((3-(二甲基氨基)丙?；?氧基)甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(辛烷-8,1-二基)酯將中間體5c(65mg，0.092mmol)、3-(二甲基氨基)丙酸(16mg、0.138mmol)、edc.hcl(35。mg、0.184mmol)和diea(32.2μl，0.184mmol)在dcm(體積:922μl)中的混合物在0℃攪拌16h，同時將其溫至室溫。將該反應混合液用20ml二氯甲烷和20ml水稀釋。將有機層分離，用2x20ml水洗滌，經(jīng)mgso4干燥，并減壓濃縮，得到粗制產(chǎn)物。將粗制產(chǎn)物在isco純化系統(tǒng)上經(jīng)硅膠色譜用10-90％乙酸乙酯:庚烷洗脫純化，得到所需產(chǎn)物，為無色油狀物(40mg，51％收率)。1hnmr(400mhz,氯仿-d)δ:6.91(s,1h),6.79(d,j＝1.5hz,2h),5.17(s,2h),4.06(t,j＝6.7hz,4h),3.91(q,j＝6.8hz,4h),2.61-2.73(m,2h),2.50-2.60(m,2h),2.30(t,j＝7.5hz,4h),2.26(s,6h),1.70-1.83(m,4h),1.52-1.69(m,8h),1.42-1.48(m,4h),1.18-1.35(m,36h),0.79-0.95(m,6h)。13cnmr(400mhz,氯仿-d)δ:174.0,172.3,152.8,150.9,125.4,116.0,114.3,112.5,68.8,68.5,64.3,61.7,54.7,45.2,34.4,32.9,31.8,29.4,29.3,29.3,29.2,29.2,29.1,28.6,26.0,26.0,25.9,25.9,25.0,22.7,14.1?？梢允褂门c實施例5的合成所使用的那些類似的偶聯(lián)方法制備以下實施例。實施例6:雙癸酸((2-(((1-甲基哌啶-4-羰基)氧基)甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(辛烷-8,1-二基)酯分離所需產(chǎn)物，為無色油狀物(72mg，77％收率)。1hnmr(400mhz,氯仿-d)δ:6.87(s,1h),6.78(s,2h),5.14(s,2h),4.06(t,j＝6.7hz,4h),3.90(q,j＝6.3hz,4h),2.85(d,j＝11.3hz,2h),2.19-2.44(m,8h),2.03-2.15(m,2h),1.99(d,j＝11.8hz,2h),1.81-1.91(m,2h),1.70-1.80(m,4h),1.58-1.66(m,8h),1.40-1.52(m,4h),1.14-1.39(m,36h),0.88(t,j＝6.5hz,6h)。13cnmr(400mhz,氯仿-d)δ:174.7,174.0,152.8,150.9,125.5,115.9,114.2,112.4,68.7,68.5,64.3,61.7,54.8,46.2,34.4,31.8,29.7,29.4,29.3,29.2,29.2,29.1,28.6,28.0,26.0,25.9,25.0,22.6,14.1。實施例7:雙癸酸((2-(((4-(二甲基氨基)丁?；?氧基)甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(辛烷-8,1-二基)酯分離所需產(chǎn)物，為無色油狀物(40mg，50％收率)。1hnmr(400mhz,氯仿-d)δ:6.90(s,1h),6.78(d,j＝1.5hz,2h),5.15(s,2h),4.06(t,j＝6.7hz,4h),3.91(q,j＝6.5hz,4h),2.42(t,j＝7.4hz,2h),2.28-2.34(m,6h),2.24(s,6h),1.84(quin,j＝7.5hz,2h),1.70-1.80(m,4h),1.53-1.69(m,8h),1.42-1.48(m,4h),1.15-1.40(m,36h),0.79-0.94(m,6h)。13cnmr(400mhz,氯仿-d)δ:174.0,173.4,152.8,150.9,125.5,115.9,114.2,112.5,68.8,68.5,64.3,61.6,58.8,45.3,34.4,32.1,31.8,29.4,29.3,29.3,29.2,29.1,28.6,26.0,26.0,25.9,25.9,25.0,22.9,22.7,14.1。實施例8:雙癸酸((2-(((1-乙基哌啶-4-羰基)氧基)甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(辛烷-8,1-二基)酯分離所需產(chǎn)物，為無色油狀物(65mg，73％)。1hnmr(400mhz,氯仿-d)δ:6.87(s,1h),6.78(d,j＝1.5hz,2h),5.14(s,2h),4.06(t,j＝6.7hz,4h),3.90(q,j＝6.4hz,4h),2.92(d,j＝10.8hz,2h),2.41(dt,j＝13.9,6.8hz,3h),2.29(t,j＝7.7hz,4h),1.98(d,j＝12.0hz,4h),1.80-1.91(m,2h),1.69-1.80(m,4h),1.53-1.68(m,8h),1.40-1.50(m,4h),1.16-1.39(m,36h),1.10(t,j＝7.2hz,3h),0.79-0.94(m,6h)。13cnmr(400mhz,氯仿-d)δ:174.8,174.0,152.8,150.8,125.5,115.8,114.1,112.4,68.7,68.5,64.3,61.6,52.5,34.4,31.8,29.4,29.3,29.2,29.2,29.2,29.1,28.6,28.1,26.0,26.0,25.9,25.8,25.0,22.6,14.1,11.9。實施例9:雙癸酸((2-(((1-異丙基哌啶-4-羰基)氧基)甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(辛烷-8,1-二基)酯分離所需產(chǎn)物，為無色油狀物(62mg，69％)。1hnmr(400mhz,氯仿-d)δ:6.87(s,1h),6.78(d,j＝1.5hz,2h),5.14(s,2h),4.06(t,j＝6.7hz,4h),3.90(q,j＝6.4hz,4h),2.88(d,j＝11.3hz,2h),2.72-2.77(m,1h),2.20-2.38(m,7h),1.98(br。s.,2h),1.84(br。s.,1h),1.69-1.79(m,5h),1.54-1.68(m,8h),1.42-1.46(m,4h),1.16-1.39(m,36h),1.06(d,j＝5.3hz,6h),0.81-0.93(m,6h)。13cnmr(400mhz,氯仿-d)δ:174.0,152.8,150.8,125.5,115.9,114.1,112.4,68.7,68.5,64.3,61.6,48.0,34.4,31.8,29.4,29.3,29.2,29.2,29.2,29.1,28.6,26.0,26.0,25.9,25.9,25.0,22.6,18.2,14.1。實施例10:雙癸酸((2-(((4-(吡咯烷-1-基)丁?；?氧基)甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(辛烷-8,1-二基)酯分離所需產(chǎn)物，為無色油狀物(50mg，56％)。1hnmr(400mhz,氯仿-d)δ:6.86(s,1h),6.79(s,2h),5.14(s,2h),4.05(t,j＝6.7hz,4h),3.85-3.96(m,4h),3.76-3.84(m,2h),3.10-3.18(m,2h),2.74-2.84(m,2h),2.48(t,j＝6.3hz,2h),2.29(t,j＝7.5hz,4h),1.94-2.19(m,6h),1.74(quin,j＝6.8hz,4h),1.61(d,j＝5.0hz,8h),1.42(d,j＝7.3hz,4h),1.15-1.39(m,36h),0.76-0.94(m,6h)。13cnmr(400mhz,氯仿-d)δ:174.2,174.2,172.1,152.8,150.9,124.8,116.2,114.6,112.6,68.8,68.5,64.3,62.2,54.4,53.6,34.4,31.8,30.5,29.4,29.3,29.2,29.2,29.1,28.5,25.9,25.8,25.8,25.0,23.2,22.6,20.7,14.1。實施例11:雙癸酸((2-((2-(1-甲基哌啶-4-基)乙酸基)甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(辛烷-8,1-二基)酯分離所需產(chǎn)物，為無色油狀物(62mg，70％)。1hnmr(400mhz,氯仿-d)δ:6.88(s,1h),6.78(d,j＝1.3hz,2h),5.13(s,2h),4.06(t,j＝6.8hz,4h),3.90(q,j＝6.5hz,4h),2.87(d,j＝11.3hz,2h),2.22-2.35(m,8h),2.00(t,j＝11.4hz,2h),1.69-1.88(m,6h),1.53-1.68(m,8h),1.44(d,j＝4.3hz,4h),1.18-1.41(m,40h),0.80-0.95(m,6h)。13cnmr(400mhz,氯仿-d)δ:174.0,172.5,152.8,150.9,125.3,116.0,114.4,112.4,68.7,68.5,64.3,61.6,55.5,46.2,41.0,34.4,32.2,31.8,29.4,29.3,29.2,29.2,29.2,29.2,29.1,28.6,26.0,25.9,25.9,25.0,22.6,14.1。流程4:實施例12的合成:雙癸酸((2-((((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(辛烷-8,1-二基)酯向中間體5c(83mg，0.118mmol)在dcm(0.5ml)中的溶液中加入氯甲酸4-硝基苯基酯(35.6mg，0.177mmol)，隨后加入吡啶(38.1μl，0.471mmol)，并在室溫攪拌16h。將該反應混合液減壓濃縮。將固體溶于dcm(0.5ml)中，并加入3-(二甲基氨基)丙-1-醇(36.4mg，0.353mmol)，隨后加入diea(123μl，0.706mmol)和dmap(1.438mg，0.012mmol)，并在室溫攪拌16h。將該反應混合液用20ml二氯甲烷和20ml水稀釋。將有機層分離，用2x20ml水洗滌，經(jīng)mgso4干燥，并減壓濃縮，得到粗制產(chǎn)物。將粗品在isco純化系統(tǒng)上經(jīng)硅膠色譜用10-90％乙酸乙酯:庚烷洗脫純化，但分離出不純的產(chǎn)物。經(jīng)超臨界流體色譜法用甲醇和co2洗脫純化將產(chǎn)物再-純化，得到所需產(chǎn)物，為無色油狀物(30mg，29％收率)。1hnmr(400mhz,氯仿-d)δ:6.93(d,j＝2.3hz,1h),6.75-6.86(m,2h),5.20(s,2h),4.23(t,j＝6.4hz,2h),4.06(t,j＝6.7hz,4h),3.83-3.97(m,4h),2.50(br。s.,2h),2.33(s,6h),2.30(t,j＝7.7hz,4h),1.94(quin,j＝6.7hz,2h),1.69-1.84(m,4h),1.53-1.69(m,8h),1.40-1.52(m,4h),1.15-1.40(m,36h),0.88(t,j＝6.8hz,6h)。13cnmr(400mhz,氯仿-d)δ:174.0,155.1,152.8,150.9,124.6,116.0,114.8,112.5,68.7,68.5,66.1,65.0,64.3,55.9,45.0,34.4,31.8,29.4,29.3,29.3,29.2,29.1,28.6,26.0,25.9,25.0,22.7,14.1。以下實施例能使用與實施例12的合成所使用的那些類似的偶聯(lián)方制備法。實施例13:雙癸酸((2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(辛烷-8,1-二基)酯分離所需化合物，為無色油狀物(35mg，27％)。1hnmr(400mhz,氯仿-d)δ:6.93(d,j＝2.0hz,1h),6.75-6.84(m,2h),5.20(s,2h),4.22(t,j＝6.4hz,2h),4.06(t,j＝6.8hz,4h),3.83-3.96(m,4h),2.61(br。s.,6h),2.30(t,j＝7.5hz,4h),1.83-2.03(m,2h),1.76(dq,j＝13.3,6.5hz,4h),1.52-1.68(m,8h),1.40-1.51(m,4h),1.19-1.40(m,38h),1.0-1.12(m,4h),0.88(t,j＝6.8hz,6h)。13cnmr(400mhz,氯仿-d)δ:174.0,155.2,152.8,150.9,124.7,116.0,114.8,112.5,68.8,68.5,65.0,64.3,49.1,46.8,34.4,31.8,29.4,29.3,29.3,29.2,29.1,28.6,26.0,25.9,25.0,22.7,14.1。流程5:實施例14的合成:碳酸3-(二甲基氨基)丙基酯4-甲基-2,5-雙((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基)芐基酯中間體14a:2,5-二甲氧基-4-甲基苯甲醛將三磷酰氯(12.5ml)加入在10mldmf中的2,5-二甲氧基-甲苯(5g，3.3mmol)中。將該反應混合液在室溫攪拌4h，然后加熱至80℃達4h。然后將該反應傾入冰水中，并過濾。收集濾液，經(jīng)硫酸鈉干燥，并減壓濃縮，得到5.1g(85.9％)所需產(chǎn)物，為淺黃色固體。tlc:rf＝0.4(etoac:己烷,1:9),uv活性。中間體14b:2,5-二羥基-4-甲基苯甲醛在圓底燒瓶中將中間體14a(1.2g，6.6mmol)溶于8mldcm中。將該溶液冷卻至-78℃，并加入1m在dcm中的三溴化硼(33.3ml，33.3mmol)，并在相同的溫度攪拌8h。然后將該反應混合液用5ml水淬滅，并用乙酸乙酯萃取。將合并的有機層經(jīng)硫酸鈉干燥，并蒸發(fā)至干燥，得到1.0g(99％)所需物質(zhì)，為固體。tlc:rf＝0.3(etoac:己烷,1:90),uv活性。中間體14c:4-甲基-2,5-雙((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基)苯甲醛可以使用與用于中間體1a的合成類似的方法從中間體14b制備中間體14c。tlc:rf＝0.8(etoac:己烷,2:8),uv活性。中間體14d:(4-甲基-2,5-雙((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基)苯基)甲醇在圓底燒瓶中將中間體14c(2.8g，4.3mmol)溶于25ml甲醇中。在室溫分批加入硼氫化鈉(328mg，8.6mmol)，并將其攪拌。1小時后將反應用10ml水淬滅，并用乙酸乙酯萃取(3x)。將合并的有機層經(jīng)硫酸鈉干燥，并減壓濃縮。將粗制的殘余物經(jīng)硅膠使用etoac/己烷(30％)作為洗脫劑純化，得到2.3g(82.1％)所需產(chǎn)物。1hnmr(400mhz,氯仿-d)δ:6.76(s,1h),6.69(s,1h),5.30-5.39(m,8h),4.63(d,j＝5.9hz,2h),3.95(dd,j＝6.4,6.3hz,2h),3.90(dd,j＝6.4,6.3hz,2h),2.76(dd,j＝6.4,6.4hz,2h),2.21(s,3h),2.08–2.03(m,8h),1.80–1.74(m,4h),1.45–1.25(m,34h),0.88(t,j＝6.4,6.4hz,6h)?？梢允褂门c實施例3的合成所使用的那些類似的偶聯(lián)方法從中間體14d制備以下實施例。實施例14:碳酸3-(二甲基氨基)丙基酯4-甲基-2,5-雙((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基)芐基酯1hnmr(400mhz,氯仿-d)δ:6.85(s,1h),6.71(s,1h),5.39(tq,j＝11.0,5.5,4.4hz,8h),5.20(s,2h),4.23(t,j＝6.5hz,2h),3.93(td,j＝6.4,4.7hz,4h),2.80(t,j＝6.5hz,4h),2.28(br。s,6h),2.23(s,3h),2.15–2.02(m,8h),1.90(d,j＝4.1hz,2h),1.78(ddt,j＝11.2,6.1,2.9hz,4h),1.53–1.43(m,4h),1.43–1.21(m,30h),0.99–0.87(m,6h)。ms(m+1)＝780.8,rt＝1.38min(lc方法2)。實施例15:碳酸4-(二甲基氨基)丁基酯4-甲基-2,5-雙((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯基氧基)芐基酯1hnmr(400mhz,氯仿-d)δ:6.83(s,1h),6.70(s,1h),5.48-5.26(m,8h),5.18(s,2h),4.17(t,j＝6.5hz,2h),3.91(dt,j＝4.3,6.4hz,4h),2.78(t,j＝6.5hz,4h),2.28(t,j＝6.8hz,2h),2.21(s,9h),2.06(q,j＝6.7hz,8h),1.83-1.65(m,6h),1.55(s,2h),1.45(d,j＝5.5hz,4h),1.41-1.25(m,28h),0.89(t,j＝6.8hz,6h).。實施例16:4-(二甲基氨基)丁酸4-甲基-2,5-雙((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基)芐基酯1hnmr(400mhz,氯仿-d)δ:6.81(s,1h),6.72(s,1h),5.47-5.28(m,8h),5.15(s,2h),3.93(q,j＝6.3hz,4h),2.80(t,j＝6.5hz,4h),2.53(br。s,6h),2.44(t,j＝7.2hz,4h),2.23(s,3h),2.07(q,j＝7.0hz,8h),1.98(br。s,2h),1.77(td,j＝8.8,4.4hz,4h),1.47(t,j＝6.9hz,4h),1.43-1.20(m,28h),0.91(t,j＝6.7hz,6h)。ms(m+1)＝765.0,rt＝1.38min(lc方法3)實施例17的合成:(9z,9’z,12z,12’z)-雙-十八碳9,12-二烯酸-2,2’-(2-((4-(二甲基氨基)丁?；趸?甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基)雙(乙烷-2,1-二基)酯中間體17a:(9z,12z)-十八碳-9,12-二烯酸3-羥基丙基酯在圓底燒瓶中將亞油酸(3.0g，10.7mmol)溶于乙二醇(15ml)中。加入hobt(2.5,16.1mmol)和edc(3.1g,16.1mmol)，隨后加入tea(4.5ml，32.1mmol)和dmap(653mg，5.4mmol)，并將該反應混合液在室溫攪拌。18小時后將該反應混合液用dcm和水稀釋。將有機層分離，用鹽水洗滌，并經(jīng)硫酸鈉干燥，并減壓濃縮，得到所需產(chǎn)物2.46g(67.8％)，為無色油狀物。1hnmr(400mhz,氯仿-d)δ:5.41–5.23(m,4h),4.18(t,j＝6.2hz,2h),3.64(t,j＝6.1hz,2h),2.72(t,j＝6.2hz,2h),2.25(t,j＝7.5hz,2h),2.00(q,j＝6.7hz,4h),1.88–1.75(m,2h),1.58(t,j＝7.4hz,2h),1.39–1.15(m,14h),0.84(td,j＝6.9,3.5hz,3h)。中間體17b:(9z,9'z,12z,12'z)-雙-十八碳-9,12-二烯酸2,2'-(5-甲?；?1,3-亞苯基)雙(氧基)雙(乙烷-2,1-二基)酯在圓底燒瓶中將中間體17a(1.0g，3.08mmol)、2,5-二羥基苯甲醛(213mg，1.54mmol)和三苯基膦(0.849g，3.24mmol)溶于12.5mlthf中。然后加入diad(0.849ml，3.24mmol)。將該反應混合液在室溫攪拌3天，在減壓下在celite上直接濃縮，隨后在isco純化系統(tǒng)上經(jīng)硅膠柱色譜使用etoac/庚烷(10至20％)作為洗脫劑純化，得到71.4mg(3.1％)所需產(chǎn)物，為淺黃色油狀物。中間體17c:(9z,9'z,12z,12'z)-雙-十八碳-9,12-二烯酸2,2'-(2-(羥基甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基)雙(乙烷-2,1-二基)酯在圓底燒瓶中將中間體17b(71.4mg，0.095mmol)在氮氣下溶于2ml乙醇中。一次性加入硼氫化鈉(5.39mg，0.143mmol)，并在室溫攪拌。30分鐘后將反應用乙酸淬滅，用水稀釋，并萃取至dcm中(3x)。將有機層合并，經(jīng)硫酸鈉干燥，并減壓濃縮，得到57.1mg(80％)所需產(chǎn)物，為澄清的油狀物。實施例17:(9z,9’z,12z,12’z)-雙-十八碳9,12-二烯酸-2,2’-(2-((4-(二甲基氨基)丁?；趸?甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基)雙(乙烷-2,1-二基)酯在反應小瓶中，將中間體17c溶于dcm中。加入hatu和二甲胺，隨后加入tea和dmap。將該反應混合液在室溫攪拌。18小時后，將該反應混合液用dcm和水稀釋。將有機層分離，用鹽水洗滌，并經(jīng)硫酸鈉干燥，并減壓濃縮。將粗制的殘余物經(jīng)制備型hplc純化,(tfa改性劑)。然后將純度富集產(chǎn)物在isco純化系統(tǒng)上經(jīng)硅膠色譜用meoh/dcm(0至10％)洗脫純化。將回收物質(zhì)在isco純化系統(tǒng)上經(jīng)硅膠色譜用meoh/dcm(0％至3％、然后至8％)洗脫再次純化，得到11.6mg(17.6％)分離的所需產(chǎn)物，為澄清的油狀物。1hnmr(400mhz,氯仿-d)δ:6.94(s,1h),6.83(d,j＝1.5hz,2h),5.31-5.45(m,8h),5.17(s,2h),4.40(t,j＝4.8hz,4h),4.09-4.23(m,4h),2.79(t,j＝6.1hz,4h),2.61(s,2h),2.44-2.51(m,2h),2.30-2.39(m,4h),2.18(s,6h),2.01-2.12(m,8h),1.92(quin,j＝7.2hz,2h),1.57-1.73(m,6h),1.23-1.45(m,26h),0.91(t,j＝6.8hz,6h)。ms(m+1)＝866.5,rt＝1.22min(lc方法1)。實施例18的合成:(9z,9’z,12z,12’z)-雙-十八碳9,12-二烯酸2,2’-(2-((4-(二甲基氨基)丁?；趸?甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基)雙(乙烷-2,1-二基)酯中間體18a:(9z,12z)-十六碳-9,12-二烯酸4-羥基丁基酯在圓底燒瓶中，將亞油酸(5.0g，17.83mmol)、丁二醇(64.3g，713mmol)、edc(3.42g，17.83mmol)、dipea(3.11ml，17.83mmol)和dmap(0.163g，1.337mmol)的混合物在40℃攪拌過夜(維持丁二醇為液體所需要的高溫)。18小時后，將該反應冷卻至室溫，并用dcm和水稀釋。將有機層分離，用鹽水洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥，并減壓濃縮。將粗制的混合物干加載至celite上，并在isco純化系統(tǒng)上經(jīng)硅膠色譜用etoac/庚烷(20％至50％)洗脫純化，得到所需物質(zhì)3.37g(58.3％)，為澄清的油狀物。中間體18b:(9z,9'z,12z,12'z)-雙-十八碳-9,12-二烯酸((2-甲?；?1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(丁烷-4,1-二基)酯在圓底燒瓶中將2,5-二羥基苯甲醛(100mg，0.724mmol)、中間體18a(517mg，1.593mmol)和pph3(399mg，1.520mmol)溶于10.5mlthf中。加入diad(0.296ml，1.520mmol)，并將該反應在室溫攪拌。18小時后，將該粗制的反應混合液在減壓下在celite上濃縮，用于在isco純化系統(tǒng)上經(jīng)硅膠色譜用(etoac/庚烷(0至40％))洗脫純化，得到86.4mg(14.8％)所需產(chǎn)物，為黃色油狀物。中間體18c:(9z,9’z,12z,12’z)-雙-十八碳-9,12-二烯酸((2-(羥基甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(丁烷-4,1-二基)酯在反應小瓶中將中間體18b(86.4mg，0.107mmol)溶于0.5mlmeoh中。加入硼氫化鈉(4.86mg，0.128mmol)，并將該反應混合液在室溫攪拌。1小時后，將反應通過加入乙酸淬滅并減壓濃縮。將粗制的物質(zhì)再溶于dcm中，然后過濾，并減壓濃縮，得到85mg(98％)所需產(chǎn)物，為無色油狀物。以下實施例能使用與實施例17的合成所使用的那些類似的偶聯(lián)方法用中間體18c制備。實施例18:(9z,9’z,12z,12’z)-雙-十八碳9,12-二烯酸-2,2’-(2-((4-(二甲基氨基)丁?；趸?甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基)雙(乙烷-2,1-二基)酯1hnmr(400mhz,氯仿-d)δ:6.88(t,j＝1.6hz,1h),6.77(d,j＝1.7hz,2h),5.46-5.25(m,8h),5.14(s,2h),4.13(h,j＝2.4hz,4h),3.94(dt,j＝9.2,5.3hz,4h),2.77(t,j＝6.5hz,4h),2.44(t,j＝7.3hz,2h),2.35(s,6h),2.32-2.25(m,4h),2.04(q,j＝6.9hz,8h),1.91(s,2h),1.81(dq,j＝8.3,5.0,4.1hz,8h),1.67-1.56(m,4h),1.40-1.23(m,30h),0.89(t,j＝6.7hz,6h)。ms(m+1)＝922.9,rt＝1.29min(lc方法3)。實施例19的合成:4-(二甲基氨基)丁酸2,4-雙((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯基氧基)芐基酯中間體19a:2,4-雙((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基)苯甲醛可以使用類似于中間體1a的方法使用2,4-二羥基苯甲醛作為原料制備。tlc:rf＝0.8(etoac:己烷,2:8),uv活性。中間體19b:(2,4-雙((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基)苯基)甲醇可以使用與中間體1b類似的方法使用中間體19a作為原料制備。tlc:rf＝0.5(etoac:己烷,2:8),uv活性。實施例19:4-(二甲基氨基)丁酸2,4-雙((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯基氧基)芐基酯在圓底燒瓶中將中間體19b(2.2g，3.5mmol)溶于30mldcm中。滴加edci.hcl(1.98g，10.38mmol)，隨后依次滴加4-(二甲基氨基)丁酸(1.74g，10.4mmol)、dipea(2.7g，20.75mmol)和dmap(84mg，0.70mmol)。將該反應混合液在室溫攪拌14h。然后將該反應混合液萃取至etoac中。將有機層減壓濃縮，并將粗制的殘余物經(jīng)硅膠柱色譜用meoh/dcm(5％)梯度洗脫純化，得到所需產(chǎn)物0.90g(34.3％)，為黃色油狀物。1hnmr(400mhz,氯仿-d)δ:7.20(d,j＝8.6hz,1h),6.40-6.50(m,2h),5.29-5.47(m,8h),5.12(s,2h),3.96(td,j＝6.4,2.8hz,4h),2.80(t,j＝6.3hz,4h),2.32-2.45(m,4h),2.20-2.31(m,6h),2.07(q,j＝6.6hz,8h),1.68-1.92(m,6h),1.43-1.57(m,4h),1.19-1.43(m,28h),0.91(t,j＝7.1hz,6h)。ms(m+1)＝750.5,rt＝1.19min(lc方法1)。實施例20的合成:雙4,4-雙(辛基氧基)丁酸((2-(((4-(二甲基氨基)丁?；?氧基)甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(丙烷-3,1-二基)酯中間體20a:甲磺酸3-((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)丙基酯在0℃向3-((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)丙-1-醇(2g，10.51mmol)和三乙胺(2.2ml，15.77mmol)在30mldcm中的溶液中緩慢滴加甲磺酰氯(1ml，12.62mmol)。使該反應混合液在30℃攪拌30min。通過tlc監(jiān)測反應過程。將該反應混合液用50ml水淬滅，并用dcm(2x50ml)萃取。將合并的有機層經(jīng)硫酸鈉干燥，并蒸發(fā)至干燥，得到2.7g(96％收率)淡棕色液體。tlc:etoac:己烷(2:8):rf＝0.5。中間體20b:2,5-雙(3-((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)丙氧基)苯甲醛向k2co3(1.67g，12.08mmol)在20mldmf中的混懸液中加入2,5-二羥基苯甲醛(556mg，4.02mmol)和中間體20a(2.7g，10.07mmol)，隨后加入四丁基碘化銨(200mg，催化)。將該反應混合液加熱至100℃達3h。通過tlc監(jiān)測反應過程。將該反應混合液用50ml水淬滅，并用(3x50ml)etoac萃取。將合并的有機層用鹽水洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥，并蒸發(fā)至干燥，得到淡棕色液體。將產(chǎn)物經(jīng)快速色譜(硅膠(230-400目))純化。將產(chǎn)物在5％在己烷中的etoac洗脫，得到1.6g(82％收率)淡棕色液體。tlc:etoac:己烷(2:8):rf＝0.9。中間體20c:2,5-雙(3-羥基丙氧基)苯甲醛在0℃向中間體20b(500mg，1.03mmol)在5ml干燥的thf中的溶液中加入1m在thf中的tbaf(4.1ml，4.14mmol)，并在相同的溫度攪拌1h，然后使其在30℃攪拌1h。通過tlc監(jiān)測反應過程。將該反應混合液用20ml水淬滅，并用etoac(3x50ml)萃取。將合并的有機層用鹽水洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥，并蒸發(fā)至干燥，得到250mg淺黃色液體。tlc:etoac:己烷(2:8):rf＝0.3。中間體20d:雙4,4-雙(辛基氧基)丁酸((2-甲?；?1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(丙烷-3,1-二基)酯向中間體20c(250mg，0.98mmol)和4,4-雙(辛基氧基)丁酸(746mg，2.16mmol)在10mldmf中的溶液中加入dipea(0.7ml，3.92mmol),dmap(60mg，0.49mmol)，隨后加入hatu(930mg，2.45mmol)，并在30℃攪拌24h。通過tlc監(jiān)測反應過程。將該反應混合液用50ml水淬滅，并用etoac萃取(3x50ml)。將合并的有機層用鹽水洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥，并蒸發(fā)至干燥，得到淺黃色色液體。將產(chǎn)物經(jīng)快速色譜(硅膠230-400目)純化。將產(chǎn)物在20％在己烷中的etoac洗脫，得到500mg(56％收率)淺黃色液體。tlc:etoac:己烷(2:8):rf＝0.4。中間體20e:雙4,4-雙(辛基氧基)丁酸((2-(羥基甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(丙烷-3,1-二基)酯在0℃向中間體20d(500mg，0.551mmol)在5.5ml甲醇和2mlthf中的溶液中加入硼氫化鈉(13mg，0.341mmol)，并攪拌5min。通過tlc監(jiān)測反應過程。將該反應混合液用10ml水淬滅，并用etoac(3x30ml)萃取。將合并的有機層用30ml鹽水溶液洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥，并蒸發(fā)至干燥，得到所需產(chǎn)物，450mg(89％收率)，為無色液體。tlc:etoac:己烷(2:8):rf＝0.3。實施例20:雙4,4-雙(辛基氧基)丁酸((2-(((4-(二甲基氨基)丁?；?氧基)甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(丙烷-3,1-二基)酯向中間體20e(190mg，0.20mmol)、4-二甲基氨基丁酸鹽酸鹽(70mg，0.41mmol)和dipea(0.12ml，0.83mmol)在dcm(7ml)中的溶液中加入edc.hcl(80mg，0.41mmol)，隨后加入dmap(51mg，0.41mmol)。將該反應混合物在30℃攪拌20h。通過tlc監(jiān)測反應過程。將該反應混合液用20ml水淬滅，并用dcm萃取(3x50ml)。將合并的有機層經(jīng)硫酸鈉干燥，并蒸發(fā)至干燥，得到粗制的固體。將產(chǎn)物經(jīng)快速色譜(硅膠(230-400目))純化。將產(chǎn)物在4％在dcm中的甲醇洗脫，得到140mg(65％收率)，為黃色的粘稠液體。1hnmr(400mhz,cdcl3):δ＝6.89(s,1h),6.77(s,2h),5.13(s,2h),4.48(t,j＝5.6hz,2h),4.28(t,j＝6.4hz,4h),4.00(q,j＝6.0hz,4h),3.57(q,j＝6.8hz,4h),3.40(q,j＝6.4hz,4h),2.43–1.81(m,26h),1.56-1.49(m,12h),1.49-1.26(m,34h),0.87(t,j＝6.4hz,12h)ppm。ms(m+1)＝1022.5,rt＝1.17min(lc方法4)。實施例21的合成:雙4,4-雙(辛基氧基)丁酸((2-(((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(戊烷-5,1-二基)酯中間體21a:2,5-雙((5-((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)戊基)氧基)苯甲醛可以使用與中間體20b的合成所使用的類似的方法從2,5-二羥基苯甲醛和甲磺酸5-((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)戊基酯制備。tlc:etoac:己烷(2:8):rf＝0.9。中間體21b:2,5-雙((5-羥基戊基)氧基)苯甲醛可以使用與中間體20c的合成所使用的類似的方法從2,5-雙((5-((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)戊基)氧基)苯甲醛(中間體21a)制備。tlc:etoac:己烷(8:2):rf＝0.1。中間體21c:雙4,4-雙(辛基氧基)丁酸((2-甲?；?1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(戊烷-5,1-二基)酯可以使用與中間體20d的合成所使用的類似的方法從2,5-雙((5-羥基戊基)氧基)苯甲醛(中間體21b)和4-二甲基氨基丁酸制備。tlc:etoac:己烷(2:8):rf＝0.4。中間體21d:雙4,4-雙(辛基氧基)丁酸((2-(羥基甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(戊烷-5,1-二基)酯可以使用與中間體20e的合成所使用的類似的方法從中間體21c制備。tlc:etoac:己烷(2:8):rf＝0.3。實施例21:雙4,4-雙(辛基氧基)丁酸((2-(((4-(二甲基氨基)丁?；?氧基)甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(戊烷-5,1-二基)酯向中間體21d、4-二甲基氨基丁酸鹽酸鹽(104mg，0.62mmol)和dipea(0.2ml，1.24mmol)在dcm(10ml)中的溶液中加入edc.hcl(119mg，0.62mmol)，隨后加入dmap(76mg，0.62mmol)。將該反應混合液在30℃攪拌16h。通過tlc監(jiān)測反應過程。將該反應混合液用20ml水淬滅，并用dcm萃取(3x50ml)。將合并的有機層經(jīng)硫酸鈉干燥，并蒸發(fā)至干燥，得到粗制的固體。將產(chǎn)物經(jīng)快速色譜(硅膠(230-400目))純化。將產(chǎn)物在4％在dcm中的甲醇洗脫，得到180mg(54％收率)淺黃色粘稠液體。1hnmr(400mhz,cdcl3):δ＝6.89(s,1h),6.77(s,2h),5.13(s,2h),4.49(t,j＝5.6hz,2h),4.09(t,j＝6hz,4h),3.90(q,j＝4hz,4h),3.57(q,j＝6.8hz,4h),3.41(q,j＝6.4hz,4h),2.40–2.22(m,8h),2.00(s,6h),1.95-1.66(m,30h),1.50-1.27(m,37h),0.87(t,j＝6.4hz,11h)ppm。ms(m+1)＝1078.6,rt＝1.20min(lc方法4)。實施例22的合成:雙4,4-雙(辛基氧基)丁酸((2-(((4-(二乙基氨基)丁?；?氧基)甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(戊烷-5,1-二基)酯中間體22a:4-(二乙基氨基)丁酸甲酯在500ml密封管中將4-溴丁酸甲酯(30.0g，165.7mmol)溶于干燥的thf(200ml)中。加入二乙胺(86ml，828.7mmol)。將得到的混合液在70℃攪拌16h，并通過tlc監(jiān)測。然后將該反應混合液用水(200ml)稀釋，用etoac萃取(2x500ml)。將合并的有機層用鹽水(500ml)洗滌，經(jīng)na2so4干燥，并減壓濃縮，得到25g(87％收率)所需產(chǎn)物，為淡棕色液體。tlc:etoac:己烷(3:7),rf＝0.2,碘&pma染色活性。中間體22b:2:4-(二乙基氨基)丁酸在圓底燒瓶中將中間體22a(25.0g，144.4mmol)和6nhcl(200ml)的混合液加熱，并回流7h。通過tlc監(jiān)測反應。然后將該反應混合液蒸發(fā)，并干燥，得到26g(92％收率)所需產(chǎn)物，為白色固體。tlc:甲醇:二氯甲烷(1:9),rf＝0.13,碘&pma染色活性。實施例22:雙4,4-雙(辛基氧基)丁酸((2-(((4-(二乙基氨基)丁?；?氧基)甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(戊烷-5,1-二基)酯在圓底燒瓶中，將中間體21d(190mg，0.196mmol)、中間體22b(0.581g，4.75mmol)和dipea(0.15ml，0.784mmol)溶于二氯甲烷(10ml)中。一次性加入edc(75mg，0.393mmol)，隨后加入dmap(48mg，0.393mmol)。將該反應混合液在環(huán)境溫度攪拌16h，并通過tlc監(jiān)測。將該反應混合液用20ml水淬滅，并用dcm萃取(3x50ml)。將合并的有機層經(jīng)硫酸鈉干燥，并蒸發(fā)至干燥，得到固體粗品。將產(chǎn)物經(jīng)快速色譜(硅膠，230-400目)使用甲醇/二氯甲烷(4％)作為洗脫劑純化，得到140mg(64％收率)所需產(chǎn)物，為淺黃色粘稠液體。1hnmr(400mhz,cdcl3):δ＝0.82(t,j＝7.10hz,12h)0.85-1.00(m,6h)1.09-1.32(m,40h)1.37-1.55(m,12h)1.58-1.67(m,4h)1.67-1.78(m,6h)1.79-1.93(m,4h)2.24-2.52(m,12h)3.33(dt,j＝9.26,6.68hz,4h)3.50(dt,j＝9.05,6.72hz,4h)3.78-3.91(m,4h)3.95-4.07(m,4h)4.42(t,j＝5.62hz,2h)5.07(s,2h)6.70(d,j＝1.71hz,2h)6.82(s,1h)。ms(m+1)＝1107.9,rt＝2.98min(lc方法5)。實施例23:雙4,4-雙(辛基氧基)丁酸((2-(((1,4-二甲基哌啶-4-羰基)氧基)甲基)-1,4-亞苯基)雙(氧基))雙(戊烷-5,1-二基)酯在30℃向1,4-二甲基哌啶-4-甲酸(120mg，0.76mmol)和net3(0.3ml，2.03mmol)在dcm(10ml)中的溶液中緩慢加入2,4,6-三氯苯甲酰氯(185mg，0.76mmol)，并攪拌4h。該時間后，加入在dcm(5ml)中的中間體21d(490mg，0.51mmol)和dmap(124mg，1.01mmol)，并將該反應混合液攪拌20h。通過tlc監(jiān)測反應過程。將該反應混合液用h2o(20ml)淬滅，并用dcm萃取(3x50ml)。將合并的有機層經(jīng)硫酸鈉干燥，并蒸發(fā)至干燥，得到固體粗品。將產(chǎn)物經(jīng)快速色譜純化(硅膠(230–400目))。將產(chǎn)物在4％在dcm中的甲醇洗脫，得到430mg(77％收率)標題化合物，為淺黃色粘稠液體。1hnmr(400mhz,cd2cl2):δ＝6.86(d,j＝2.3hz,1h),6.75–6.83(m,2h),5.12(s,2h),4.45(t,j＝5.6hz,2h),4.07(t,j＝6.7hz,4h),3.87–3.96(m,4h),3.54(dt,j＝9.3,6.7hz,4h),3.38(dt,j＝9.3,6.7hz,4h),2.59(brs,2h),2.35(t,j＝7.6hz,4h),2.03–2.29(m,7h),1.83–1.92(m,4h),1.73–1.83(m,4h),1.64–1.74(m,4h),1.44–1.60(m,13h),1.18–1.38(m,41h),1.21(s,3h),0.84–0.93(m,12h)。ms(m+1)＝1105.2,rt＝1.34min(lc方法6)。實施例24的合成:癸酸8-(4-((5-((4,4-雙(辛基氧基)丁?；?氧基)戊基)氧基)-2-(((4(二甲基氨基)丁?；?氧基)甲基)苯氧基)辛基酯中間體24a:癸酸8-(2-甲酰基-4-羥基苯氧基)辛基酯可以使用與中間體20b的合成所使用的類似的方法從2,5-二羥基苯甲醛和癸酸8-((甲基磺酰基)氧基)辛基酯制備。tlc:etoac:己烷(2:8):rf＝0.9。中間體24b:癸酸8-(4-((5-((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)戊基)氧基)-2-甲?；窖趸?辛基酯可以使用與中間體20b的合成所使用的類似的方法從中間體24a和甲磺酸5-((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)戊基酯制備。tlc:etoac:己烷(2:8):rf＝0.6。中間體24c:癸酸8-(2-甲?；?4-((5-羥基戊基)氧基)苯氧基)辛基酯可以使用與中間體20c的合成所使用的類似的方法從中間體24b制備。tlc:etoac:己烷(8:2):rf＝0.2。中間體24d:癸酸8-(4-((5-((4,4-雙(辛基氧基)丁?；?氧基)戊基)氧基)-2-甲酰基苯氧基)辛基酯可以使用與中間體20d的合成所使用的類似的方法從中間體24c制備。tlc:甲醇:dcm(1:9):rf＝0.5。中間體24e:癸酸8-(4-((5-((4,4-雙(辛基氧基)丁酰基)氧基)戊基)氧基)-2-(羥基甲基)苯氧基)辛基酯可以使用與中間體20e的合成所使用的類似的方法從中間體24d制備。tlc:etoac:己烷(2:8):rf＝0.4。實施例24:癸酸8-(4-((5-((4,4-雙(辛基氧基)丁?；?氧基)戊基)氧基)-2-(((4(二甲基氨基)丁酰基)氧基)甲基)苯氧基)辛基酯向中間體24e(1.2g，1.43mmol)在dcm(30ml)中的溶液中加入edc.hcl(550mg，2.87mmol)、dipea(0.75ml，4.31mmol)、dmap(175mg，1.43mmol)和n,n-二甲基氨基丁酸.hcl(361mg，2.15mmol)。在氮氣氣氛下將該混合液在25℃攪拌18h。通過tlc監(jiān)測反應過程。將該反應混合液用水(200ml)稀釋，用dcm(2x150ml)萃取，將合并的有機層用鹽水(100ml)洗滌，經(jīng)na2so4干燥，并減壓濃縮，得到淺綠色液體。將產(chǎn)物經(jīng)快速色譜純化(硅膠230-400目)。將產(chǎn)物在5％在dcm中的甲醇洗脫，得到550mg(42％收率)淺綠色液體。1hnmr(400mhz,cdcl3):δ＝6.88(s,1h),6.77(s,2h),5.14(s,2h),4.49(t,j＝4hz,1h),4.11-4.04(m,4h),3.92-3.89(m,4h),3.57(q,j＝6.8hz,2h),3.41(q,j＝6.4hz,2h),2.40(q,j＝8hz,4h),2.30(m,4h),2.17(s,6h),1.95-1.41(m,24h),1.48-1.26(m,37h),0.87(t,j＝6.4hz,8h)ppm。ms(m+1)＝948.4,rt＝1.10min(lc方法4)。實施例25的合成:癸酸8-(4-((5-((4,4-雙(辛基氧基)丁酰基)氧基)戊基)氧基)-3-(((4-(二甲基氨基)丁?；?氧基)甲基)苯氧基)辛基酯中間體25a:2-((5-((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)戊基)氧基)-5-羥基苯甲醛可以使用與中間體20b的合成所使用的類似的方法從2,5-二羥基苯甲醛和甲磺酸5-((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)戊基酯制備。tlc:etoac:己烷(2:8):rf＝0.9。中間體25b:癸酸8-(3-甲?；?4-((5-羥基戊基)氧基)苯氧基)辛基酯向中間體25a在dmf(40ml)中的溶液中加入癸酸8-((甲基磺?；?氧基)辛基酯(3.3g，8.86mmol)和k2co3(1.6g，11.81mmol)，隨后加入tbai(500mg，0.74mmol)，并在氮氣氣氛下加熱至100℃達3h。通過tlc監(jiān)測反應過程。將該反應混合液用水(100ml)稀釋，用etoac萃取(2x150ml)，將合并的有機層用鹽水(200ml)洗滌，經(jīng)na2so4干燥，并減壓濃縮，得到淡棕色液體。將產(chǎn)物經(jīng)快速色譜純化(硅膠100-200目)。將產(chǎn)物在20％在己烷中的etoac洗脫，得到1.2g(41％收率)米白色固體。tlc:etoac:己烷(2:8):rf＝0.6。中間體25c:癸酸8-(4-((5-((4,4-雙(辛基氧基)丁?；?氧基)戊基)氧基)-3-甲?；窖趸?辛基酯向中間體25b(300mg，0.59mmol)在dcm(20ml)中的溶液中加入4,4-雙(辛基氧基)丁酸(305mg，0.88mmol)、edc.hcl(227mg，1.18mmol)、dipea(0.31ml，1.77mmol)，隨后加入dmap(72mg，0.59mmol)，并在25℃在氮氣氣氛下攪拌18h。通過tlc監(jiān)測反應過程。將反應混合液用水(100ml)稀釋，用dcm萃取(2x50ml)，將合并的有機層用鹽水(100ml)洗滌，經(jīng)na2so4干燥，并減壓濃縮，得到淺綠色液體。將產(chǎn)物經(jīng)快速色譜純化(硅膠230-400目)。將產(chǎn)物在5％在dcm中的甲醇洗脫，得到300mg(61％收率)淺綠色液體。tlc:meoh:dcm(1:9):rf＝0.5。中間體25d:癸酸8-(4-((5-((4,4-雙(辛基氧基)丁酰基)氧基)戊基)氧基)-3-(羥基甲基)苯氧基)辛基酯可以使用與中間體20e的合成所使用的類似的方法從中間體25c制備。tlc:etoac:己烷(2:8):rf＝0.4。實施例25:癸酸8-(4-((5-((4,4-雙(辛基氧基)丁?；?氧基)戊基)氧基)-3-(((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)甲基)苯氧基)辛基酯向中間體25d(0.3g，0.359mmol)在dcm(10ml)中的溶液中加入edc.hcl(137.7mg，0.718mmol)、dipea(0.18ml，1.07mmol)、dmap(43.8mg，0.359mmol)和n,n-二甲基氨基丁酸.hcl(90.3mg，0.538mmol)。將該混合液在25℃攪拌18h。在氮氣氣氛下。通過tlc監(jiān)測反應過程。將該反應混合液用水(200ml)稀釋，用dcm萃取(2x150ml)，將合并的有機層用鹽水(100ml)洗滌，經(jīng)na2so4干燥，并減壓濃縮，得到淺綠色液體。將產(chǎn)物經(jīng)快速色譜純化(硅膠230-400目)。將產(chǎn)物用5％在dcm中的甲醇洗脫，得到150mg(44％收率)淺綠色液體。1hnmr(400mhz,cdcl3):δ6.89(s,1h),6.77(s,2h),5.14(s,2h),4.48(t,j＝4hz,1h),4.10-4.04(m,4h),3.94-3.87(m,4h),3.55(q,j＝6.4hz,2h),3.41(q,j＝6.8hz,2h),2.40(q,j＝7.6hz,4h),2.29(m,4h),2.21(s,6h),1.95-1.43(m,24h),1.49-1.26(m,37h),0.86(t,j＝6.4hz,8h)ppm。ms(m+1)＝948.4,rt＝1.09min(lc方法4)。實施例26的合成:雙癸酸((4-(((1,4-二甲基哌啶-4-羰基)氧基)甲基)-1,3-亞苯基)雙(氧基))雙(辛烷-8,1-二基)酯中間體26a:癸酸8-羥基辛基酯中間體26a可以使用與中間體17a的合成所使用的類似的方法從癸酸和1,8-辛二醇制備。tlc:etoac:己烷(4:6):rf＝0.6。中間體26b:癸酸8-((甲基磺?；?氧基)辛基酯中間體26b可以使用與中間體20a的合成所使用的類似的方法從中間體26a制備。tlc:etoac:己烷(2:8):rf＝0.5。中間體26c:雙癸酸((4-甲?；?1,3-亞苯基)雙(氧基))雙(辛烷-8,1-二基)酯中間體26c可以使用與中間體20b的合成所使用的類似的方法從中間體26b制備。tlc:etoac:己烷(2:8):rf＝0.6。中間體26d:雙癸酸((4-(羥基甲基)-1,3-亞苯基)雙(氧基))雙(辛烷-8,1-二基)酯中間體26d可以使用與中間體20e的合成所使用的類似的方法用中間體26c制備。tlc:etoac:己烷(2:8):rf＝0.4。實施例26:雙癸酸((4-(((1,4-二甲基哌啶-4-羰基)氧基)甲基)-1,3-亞苯基)雙(氧基))雙(辛烷-8,1-二基)酯向1,4-二甲基哌啶-4-甲酸(167mg，1.06mmol)在dcm(15ml)中的冷的溶液中加入三乙胺(0.40ml，2.83mmol)，隨后加入2,4,6-三氟苯甲酰氯(0.17ml，1.06mmol)，并在25℃在氮氣氣氛下攪拌2h。該時間后，加入在dcm(5ml)中的中間體26d(500mg，0.70mmol)，并將得到的反應混合液在25℃再攪拌2h。通過tlc監(jiān)測反應過程。將該反應混合液用水(100ml)稀釋，用dcm萃取(2x50ml)，將合并的有機層用鹽水(100ml)洗滌，經(jīng)na2so4干燥，并減壓濃縮,，得到淺綠色液體。將產(chǎn)物經(jīng)快速色譜純化(硅膠230-400目)。將產(chǎn)物在5％在dcm中的甲醇洗脫，得到510mg(85％收率)淺綠色液體。1hnmr(400mhz,cdcl3):δ＝7.17(d,j＝8.4hz,1h),6.41(d,j＝6.8hz,2h),5.07(s,2h),4.03(t,j＝7.2hz,4h),3.91(t,j＝6hz,4h),2.62(bs,2h),2.282-2.231(m,7h),2.18-2.06(m,4h),1.78-1.11(m,57h),0.84(t,j＝6.8hz,6h)ppm。ms(m+1)＝844.3,rt＝1.02min(lc方法4)。實施例27和實施例28可以使用與實施例26的合成所使用的那些類似的偶聯(lián)方法用適合的羧酸偶聯(lián)搭檔來制備:實施例27:雙癸酸((4-(((4-(二甲基氨基)丁?；?氧基)甲基)-1,3-亞苯基)雙(氧基))雙(辛烷-8,1-二基)酯1hnmr(400mhz,cdcl3):δ＝7.21(d,j＝8.9hz,1h),6.41–6.47(m,2h),5.10(s,2h),4.07(td,j＝6.7,0.9hz,4h),3.95(t,j＝6.5hz,4h),2.36(t,j＝7.5hz,2h),2.30(t,j＝7.6hz,6h),2.22(s,6h),1.73–1.86(m,6h),1.58–1.69(m,8h),1.41–1.51(m,4h),1.33–1.41(m,12h),1.19–1.33(m,24h),0.85–0.92(m,6h)。ms(m+1)＝818.6,rt＝1.02min(lc方法6)。實施例28:雙癸酸((4-(((4-(二乙基氨基)丁?；?氧基)甲基)-1,3-亞苯基)雙(氧基))雙(辛烷-8,1-二基)酯1hnmr(400mhz,cdcl3):δ＝7.17–7.24(m,1h),6.40–6.47(m,2h),5.10(s,2h),4.07(td,j＝6.7,1.2hz,4h),3.94(td,j＝6.5,1.1hz,4h),2.33–2.87(brs,6h),2.37(t,j＝7.2hz,2h),2.30(t,j＝7.5hz,4h),1.71–1.93(m,6h),1.55–1.70(m,8h),1.41–1.52(m,4h),1.33–1.41(m,12h),1.19–1.33(m,24h),0.96–1.19(brs,6h),0.83–0.93(m,6h)。ms(m+1)＝846.6,rt＝1.03min(lc方法6)。mrna’smrna轉(zhuǎn)錄方案簡述構(gòu)建環(huán)形質(zhì)粒dna模板，其包含由下列特征構(gòu)成的mrna轉(zhuǎn)錄盒(transcriptioncassette)：共有的t7噬菌體dna-依賴性rna聚合酶啟動子，5’未翻譯區(qū)(utr)，kozak序列和開放閱讀框，3’utr和120個核苷酸長度的多聚腺苷(polya120)尾。將該質(zhì)粒dna模板在大腸桿菌中繁殖、分離并通過限制性酶就在對poly120尾的3’端消化而線性化(linearized)。將質(zhì)粒dna與t7rna聚合酶、核糖核苷酸、三磷酸鹽、rnase抑制劑、焦磷酸酶、二硫蘇糖醇、亞精胺和酶反應緩沖液混合，于37℃溫育1小時。加入dnasei酶以消化質(zhì)粒dna模板，于37℃溫育0.5小時。按順序通過氯化鋰沉淀、將沉淀在70％乙醇中洗滌、再將mrna懸浮于水中、用異丙醇和乙酸鈉再沉淀并將沉淀在70％乙醇中再次洗滌，分離mrna。將最終的mrna沉淀再次懸浮于水中。tev-hleptin-gaopt-2xhbg-120a(序列號：5)序列特征：煙草蝕紋病毒(tobaccoetchvirus)(tev)5’utr：14-154最佳kozak序列：155-163蛋白登記號np_000221的編碼人瘦蛋白的氨基酸1-167，通過geneart優(yōu)化的序列密碼子：164-6642終止密碼子：665-670人β-球蛋白3’utr的2個副本：689-954120個核苷酸的polya尾端：961-1080gggagacgcguguuaaauaacaaaucucaacacaacauauacaaaacaaacgaaucucaagcaaucaagcauucuacuucuauugcagcaauuuaaaucauuucuuuuaaagcaaaagcaauuuucugaaaauuuucaccauuuacgaacgauagccgccaccaugcacuggggaacccugugcggauuccuguggcuguggcccuaccuguucuaugugcaagccgugcccauccagaaggugcaggacgacaccaagacccugaucaagaccaucgugacccggaucaacgacaucagccacacccagagcguguccagcaagcagaaagugaccggccuggacuucauccccggccugcacccuauccugacccuguccaagauggaccagacccuggccguguaccagcagauccugaccagcaugcccagccggaacgugauccagaucagcaacgaccuggaaaaccugcgggaccugcugcacgugcuggccuucagcaagagcugccaucugccuugggccagcggccuggaaacccuggauucucugggcggagugcuggaagccagcggcuacucuacagaggugguggcccugagcagacugcagggcagccugcaggauaugcuguggcagcuggaucugagccccggcugcuaauagcggaccggcgauagaugaagcucgcuuucuugcuguccaauuucuauuaaagguuccuuuguucccuaaguccaacuacuaaacugggggauauuaugaagggccuugagcaucuggauucugccuaauaaaaaacauuuauuuucauugcagcucgcuuucuugcuguccaauuucuauuaaagguuccuuuguucccuaaguccaacuacuaaacugggggauauuaugaagggccuugagcaucuggauucugccuaauaaaaaacauuuauuuucauugcggccgcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa生物學評價mrna的包裝：所有的設(shè)備和一次性用品均由生產(chǎn)商證明無rnase活性，或者通過使用rnasezap試劑(lifetechnologies)使其無rnase。mrna以陽離子脂質(zhì)胺與mrna磷酸鹽(n∶p)摩爾比為4∶1包封。將脂質(zhì)(陽離子脂質(zhì)、dspc、膽固醇和脂質(zhì)化(lipidated)peg或隱形脂質(zhì))溶于乙醇。摩爾比分別為40∶10∶38∶2。將混合物簡單超聲，然后輕輕攪拌5分鐘，隨后于37℃保存直到使用。采用amiconultra-15離心濃縮器將mrna交換到檸檬酸鹽緩沖液(ph5.8-6.0)中，將終濃度調(diào)節(jié)至0.5mg/ml，于37℃保存直到使用。將等體積的在乙醇中的脂質(zhì)、在檸檬酸鹽緩沖液中的mrna和單獨的檸檬酸鹽緩沖液抽取到各一次性注射器中。將從含有脂質(zhì)和mrna的注射器連接的管子與t型三頭接頭連接，將從僅含有檸檬酸鹽緩沖液的注射器連接的管子與t型接頭的出口管相匹配(paired)，下面連接有含有攪拌棒的收集容器，置于活動攪拌盤上。將注射器置于注射泵中，設(shè)定為以每分鐘1ml的流速泵出內(nèi)容物。將泵啟動，將收集的脂質(zhì)納米顆粒中的mrna轉(zhuǎn)移至snakeskin透析管(10,000mwco，thermoscientific)中。于4℃將物質(zhì)對無rnase和無熱原的1×磷酸鹽緩沖的生理鹽水透析過夜。sirna的包裝通過沖擊射流工藝，將等體積的溶于醇的脂質(zhì)和溶于檸檬酸緩沖液的sirna混合，形成脂質(zhì)納米顆粒(lnp)。脂質(zhì)溶液含有本發(fā)明的陽離子脂質(zhì)化合物、輔助脂質(zhì)(膽固醇)、任選的中性脂質(zhì)(dspc)和隱形脂質(zhì)(s010、s024、s027或s031)，其濃度為8-16mg/ml醇，優(yōu)選12mg/ml醇。sirna與總脂質(zhì)的比例約為0.05(wt/wt)。當lnp配制物含有四種脂質(zhì)成分時，脂質(zhì)的摩爾比的范圍為：陽離子脂質(zhì)的摩爾百分濃度范圍為20-70，優(yōu)選40-60；輔助脂質(zhì)的摩爾百分濃度范圍為20-70，優(yōu)選30-50；中性脂質(zhì)摩爾百分濃度范圍為0-30；peg脂質(zhì)的摩爾百分濃度范圍為1-6，優(yōu)選2-5。sirna溶液在檸檬酸鈉:氯化鈉緩沖液中的濃度范圍為0.7-1.0mg/ml，優(yōu)選為0.8-0.9mg/ml，緩沖液的ph為4-6，優(yōu)選為4.5-5.5。通過沖擊射流工藝，采用id范圍為0.25-2.0mm、流速為10-640ml/min的混合設(shè)備，將等體積的脂質(zhì)乙醇溶液和溶于檸檬酸緩沖液的sirna混合，形成lnp。將混合的lnp溶液置于室溫下0-24小時，隨后進行稀釋步驟。然后將溶液濃縮，采用超濾工藝，采用mw截留(cutoff)為30-500kd的膜，與適當?shù)木彌_液一起滲濾。將終產(chǎn)物無菌過濾并于4℃儲存。mrna包封的測定：采用quant-itribogreenrna分析試劑盒(lifetechnologies)測定mrna在脂質(zhì)納米顆粒中的包封百分率。將lnp-mrna懸浮液在緩沖液(顆粒外mrna)和緩沖液加tritonx-100去垢劑(總mrna)中進行試驗。計算的差即為顆粒內(nèi)mrna。通過試劑盒中提供的rna制備1000ng/ml儲備液，并用其建立te和te+0.75％tritonx-100中的標準曲線(分別為0ng/ml、15.63-1000ng/ml)。以適當?shù)南♂尪戎苽鋞e緩沖液和te緩沖液+0.75％tritonx-100中的lnp-mrna樣品，該稀釋度應當使得讀數(shù)位于標準曲線的范圍內(nèi)(400-2,000倍)。在384孔板(未經(jīng)處理的costar#3573)中，每個孔中加入0.04ml標準(一式二份)或樣品(一式三份)。將ribogreen試劑在te緩沖液中稀釋240倍，每個孔中加入0.06ml。將各個孔的內(nèi)容物混合，測定熒光(激發(fā)光＝480nm，發(fā)射光＝520nm)。從標準和測試樣品值中扣除背景值(沒有rna)，采用標準曲線測定樣品中rna的濃度。通過(樣品+triton的濃度與樣品在單獨緩沖液中的濃度的差)除以(樣品+triton濃度)測定樣品的包封百分比。包封數(shù)據(jù)表2:mrna的體外包封數(shù)據(jù)免疫數(shù)據(jù)1.材料和方法rna復制子以下采用多種復制子。總體上它們基于以委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(veev)為基礎(chǔ)的嵌合復制子(vcr)，其是雜交甲病毒屬基因組，具有來自veev的非結(jié)構(gòu)蛋白、來自辛德畢斯病毒的包裝信號和來自辛德畢斯病毒3'utr。此外，我們使用基于vee活減毒疫苗病毒tc-83的復制子。所述復制子長度約10kb，并有poly-a尾。將編碼甲病毒屬復制子的質(zhì)粒dna(稱為:va375(tc83r-flfpd.rsvf-runoff)或va803[vcr(ro)-x179a(td)_ha])作為模板來體外合成rna。該復制子包含rna復制所需的甲病毒屬遺傳元件但缺少編碼顆粒組裝所需的基因產(chǎn)物的序列；結(jié)構(gòu)蛋白被感興趣的蛋白質(zhì)(例如，免疫原，如全長rsvf蛋白)取代，因此該復制子不能誘導感染顆粒的產(chǎn)生。甲病毒屬cdna上游的噬菌體t7啟動子促進該復制子rna體外合成。質(zhì)粒dna用合適的限制性內(nèi)切核酸酶線性化后，用t7噬菌體來源的dna依賴性rna聚合酶體外合成失控轉(zhuǎn)錄物。按照生產(chǎn)商(安碧公司(ambion))提供的說明書，在7.5mm的各個三磷酸核苷(atp、ctp、gtp和utp)的存在下在37℃進行2小時的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄后，用turbodna酶(ambion)消化模板dna。用licl沉淀所述復制子rna并在無核酸酶的水中重新配制。如用戶手冊所述，未加帽的rna在轉(zhuǎn)錄后通過牛痘加帽酶(vce)使用scriptcapm7g加帽系統(tǒng)(scriptcapm7gcappingsystem)(epicentrebiotechnologies)加帽；以這種方式加帽的復制子加上前綴“v”，例如va317是由vce加帽的a317復制子。轉(zhuǎn)錄后加帽的rna用licl沉淀并在無核酸酶的水中重新配制。通過測量od260nm來測定rna樣品濃度。體外轉(zhuǎn)錄本的完整性通過變性瓊脂糖凝膠電泳證實。基于dlindma的lnp的制備將rna包封于通過jeffs等人(2005)pharmaceuticalresearch22(3):362-372和maurer等人(2001)biophysicaljournal,80:2310-2326的方法所制備的lnp中。所述lnp由10％dspc(兩性離子)、40％陽離子脂質(zhì)、48％膽固醇和2％與peg偶聯(lián)的dmg(2kdapeg)構(gòu)成。這些比例指總lnp中的％摩爾。dspc(1,2-雙硬脂?；?sn-甘油基-3-磷酸膽堿)購自genzyme。膽固醇購自sigma-aldrich。peg綴合的dmg(1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)，銨鹽)、dotap(1,2-二油?；?3-三甲基銨-丙烷，鹽酸鹽)和dc-chol(3β-[n-(n',n'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲?；鵠膽固醇鹽酸鹽來自avantipolarlipids。簡言之，將脂質(zhì)溶于乙醇(2ml)中，將rna復制子溶于緩沖液(2ml，100mm檸檬酸鈉，ph6)，將這些與2ml緩沖液混合，隨后平衡1小時。然后將該混合液用1xpbs透析(dialized)過夜。所得的產(chǎn)物含有脂質(zhì)體，包封效率～70-95％。對于雪貂中的免疫，通過將22.5mg實施例1、5.9mgdspc、13.9mg膽固醇和4.0mgpeg2000綴合的dmpe(cat#880150p,avantipolarlipids,inc.)溶于10ml乙醇中制備新鮮工作溶液。還以在100mm檸檬酸鹽緩沖液(ph6)中0.125mg/ml的濃度制備10ml的rna工作溶液。將工作脂質(zhì)和rna溶液在37℃下加熱5分鐘，然后裝入兩個10cc魯爾注射器中。隨后，使用fep管(氟化乙烯-丙烯；使用的所有fep管具有2mm內(nèi)徑和3mm外徑；從idexhealthscience獲得)將兩個注射器連接到tee混合器(peektm500μmid接頭)。來自t混合器的出口也單獨是fep管，將10ml檸檬酸鹽緩沖液(ph6)裝載在第三個10cc注射器中，該注射器連接到一個單獨的管上。將所有三個注射器裝載在注射泵上并以1.0ml/min驅(qū)動。安置管出口，以將混合物收集在20ml玻璃小瓶中，使用攪拌棒輕輕攪拌。將所有玻璃小瓶在250℃下烘烤12小時，然后進行實驗以完全滅活任何rnase污染物。在混合結(jié)束時，取出攪拌棒，使該乙醇/水溶液平衡至室溫達1小時。孵育后，將該乙醇/水溶液裝入注射器中，并使用上述tee連接方法與等體積的100mm檸檬酸緩沖液(ph6)混合。接下來，將lnp濃縮至20ml，并通過切向流過濾在10-15體積的1xpbs中透析，然后回收最終產(chǎn)物。tff系統(tǒng)和中空纖維過濾膜購自spectrumlabs(ranchodominguez)，并根據(jù)制造商指南使用。使用具有100kd截留孔徑和8cm2表面積的聚砜中空纖維過濾膜。對于體外和體內(nèi)實驗，將配制物用1xpbs稀釋至所需的rna濃度。rna復制子的包封效率被包封的rna百分比及rna濃度用quant-itribogreenrna試劑盒(invitrogen)來確定，按生產(chǎn)商的說明進行操作。用試劑盒中提供的核糖體rna標準品制作標準曲線。將lnp用1xte緩沖液(試劑盒中提供)稀釋10倍或100倍，隨后加入染料。加入染料前，另行將脂質(zhì)體用含有0.5％tritonx的1xte緩沖液稀釋10倍或100倍(以破碎lnp，分析總rna量)。此后每份溶液中加入等量的染料，加好染料的溶液每份取約180μl加載到96孔組織培養(yǎng)板中，每個樣做兩個平行孔。在微孔讀板器上讀取熒光(ex485nm,em528nm)。所有l(wèi)np配制物根據(jù)rna的包封量進行體內(nèi)施用。2.脂質(zhì)納米顆粒(lnp)配制物的表征z平均粒徑和多分散指數(shù)見表3：表3化合物zav(nm)多分散性1135.30.117100.70.0969182.60.3691297.30.11614127.70.10215138.80.21016115.50.10819133.20.0743.小鼠模型中的免疫原性(rsv)在第0天和第21天通過雙側(cè)肌肉內(nèi)接種疫苗(每腿50μl)，將編碼rsvf蛋白的va375自我復制型復制子施用于balb/c小鼠，每組8只動物，復制子(1ng)被配制為具有脂質(zhì)的如下文所述的lnp。測試的所有l(wèi)np由的40％陽離子脂質(zhì)、10％dspc、48％膽固醇和2％peg-dmg組成，具有相似的rna量。所有l(wèi)np都使用相同的技術(shù)制備。制備lnp配制物并在4℃下儲存用于初始和加強免疫。在第14、36和49天收集血清用于抗體分析。如表4所示，如通過增加的f特異性igg滴度測定，用僅僅1ng的自我復制rna，測試的lnp配制物產(chǎn)生免疫應答。表44.雪貂模型中的免疫原性(流感)本研究共使用7組實驗組，每組6只動物(42只動物)；每個rna配制物的兩種疫苗劑量(組2-5)，兩組用非佐劑(h1n1亞單位)或佐劑(mf59/h1n1亞單位)的商購的h1n1流感亞單位疫苗接種的組(組6和7)和模擬接種組(組1)。rna測試疫苗來自攜帶甲病毒屬基因組的重組dna質(zhì)粒(pdna)，其中結(jié)構(gòu)基因被來自h1n1流感a菌株cal07的ha基因替代。然后將rna配制在陽離子水包油乳劑(cne)或lnp中，用于通過肌內(nèi)(im)注射遞送至宿主細胞。各配制物研究組的rna濃度分別為15和45mcg(用于cne)，5和15mcg(用于lnp)。h1n1亞單位疫苗以15mcg的ha亞單位蛋白質(zhì)濃度使用。未接種疫苗的動物用rna測試疫苗的介質(zhì)對照來模擬疫苗接種。所有測試疫苗通過im注射在第0研究日(sd)施用，隨后在第56研究日(第1次免疫后8周)進行加強免疫接種。表5總結(jié)了流感微量中和(microneutralization)數(shù)據(jù)，表6為血凝抑制(hai)滴度。如通過增加的ha特異性中和及hai滴度所測定，用僅僅5μg的自擴增rna，測試的lnp配制物產(chǎn)生免疫應答。表5表6總結(jié)了基于雪貂模型的流感hai數(shù)據(jù):表6附錄:用于lnp配制物的有用的磷脂ddpc1,2-二癸酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿depa1,2-二芥?；?sn-甘油基-3-磷酸鹽depc1,2-芥酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿depe1,2-二芥?；?sn-甘油基-3-磷脂?；掖及穌epg1,2-二芥酰基-sn-甘油基-3[磷脂?；?rac-(1-丙三醇...)dlopc1,2-亞油?；?sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿dlpa1,2-二月硅酰基-sn-甘油基-3-磷酸鹽dlpc1,2-二月硅?；?sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿dlpe1,2-二月硅?；?sn-甘油基-3-磷脂酰基乙醇胺dlpg1,2-二月硅?；?sn-甘油基-3[磷脂?；?rac-(1-丙三醇...)dlps1,2-二月硅酰基-sn-甘油基-3-磷脂?；z氨酸dmg1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺dmpa1,2-二肉豆蔻?；?sn-甘油基-3-磷酸鹽dmpc1,2-二肉豆蔻?；?sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿dmpe1,2-二肉豆蔻?；?sn-甘油基-3-磷脂酰基乙醇胺dmpg1,2-肉豆蔻?；?sn-甘油基-3[磷脂酰基-rac-(1-丙三醇...)dmps1,2-二肉豆蔻?；?sn-甘油基-3-磷脂酰基絲氨酸dopa1,2-二油?；?sn-甘油基-3-磷酸鹽dopc1,2-二油?；?sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿dope1,2-二油?；?sn-甘油基-3-磷脂?；掖及穌opg1,2-二油?；?sn-甘油基-3[磷脂酰基-rac-(1-丙三醇...)dops1,2-二油?；?sn-甘油基-3-磷脂?；z氨酸dppa1,2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷酸鹽dppc1,2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿dppe1,2-二棕櫚酰基-sn-甘油基-3-磷脂?；掖及穌ppg1,2-二棕櫚酰基-sn-甘油基-3[磷脂?；?外消旋-(1-丙三醇...)dpps1,2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷脂?；z氨酸dpype1,2-二植烷?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺dspa1,2-二硬脂?；?sn-甘油基-3-磷酸鹽dspc1,2-二硬脂?；?sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿dspe1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂?；掖及穌spg1,2-二硬脂?；?sn-甘油基-3[磷脂?；?外消旋-(1-丙三醇...)dsps1,2-二硬脂?；?sn-甘油基-3-磷脂酰基絲氨酸epc卵-pchepc氫化卵pchspc高純度氫化大豆pchspc氫化大豆pclysopcmyristic1-肉豆蔻?；?sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿lysopcpalmitic1-棕櫚酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿lysopcstearic1-硬脂?；?sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿乳鞘髓磷脂mppc1-肉豆蔻酰基,2-棕櫚?；?sn-甘油基3-磷脂酰膽堿mspc1-肉豆蔻?；?2-硬脂?；?sn-甘油基-3–磷脂酰膽堿pmpc1-棕櫚酰基,2-肉豆蔻?；?sn-甘油基-3–磷脂酰膽堿popc1-棕櫚?；?2-油?；?sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿pope1-棕櫚?；?2-油?；?sn-甘油基-3-磷脂酰基乙醇胺popg1,2-二油?；?sn-甘油基-3[磷脂酰基-外消旋-(1-甘油基)...]pspc1-棕櫚?；?2-硬脂?；?sn-甘油基-3–磷脂酰膽堿smpc1-硬脂?；?2-肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3–磷脂酰膽堿sopc1-硬脂?；?2-油?；?sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿sppc1-硬脂酰基,2-棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿當前第1頁12