本發(fā)明涉及用于治療慢性阻塞性肺疾病急性加重的方法和藥物組合物。

背景技術(shù)：

慢性阻塞性肺疾病(copd)是嚴(yán)重且日益增加的全球健康問(wèn)題。直至2020年，copd將從全球最常見(jiàn)的死因第6位(目前是)上升至第3位。在美國(guó)，據(jù)信copd造成每年高達(dá)120,000例死亡。copd的臨床進(jìn)程在特征在于慢性致殘、具有間歇性、可由多種刺激因素(包括暴露于病原體、吸入刺激物(如香煙煙霧)、過(guò)敏原，或污染物)引發(fā)的急性加重。“急性加重”是指從受試者的通常狀態(tài)開(kāi)始的他或她的copd癥狀的惡化超過(guò)了正常的逐日變化，并且發(fā)作是急性的。copd急性加重極大地影響患有copd的受試者的健康和生活質(zhì)量。copd急性加重是與該疾病相關(guān)的重要社會(huì)經(jīng)濟(jì)成本的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)力。很多研究也表明，之前的加重是copd未來(lái)住院的獨(dú)立危險(xiǎn)因素?？傊琧opd加重在其對(duì)受試者的有害作用的延長(zhǎng)、疾病進(jìn)展的加快和高的護(hù)理成本方面非常重要。然而，至今沒(méi)有用于治療copd急性加重的方法。

根據(jù)基因和蛋白結(jié)構(gòu)，il-19、il-20和il-24在il-10細(xì)胞因子家族中形成亞組：il-20細(xì)胞因子與il-22非常接近。il-19和il-20通過(guò)位于上皮細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞上的由il-20r1和il-20r2鏈組成的受體復(fù)合物起作用。il-20和il-24還能夠通過(guò)第二個(gè)受體復(fù)合物(il-22r1/il-20r2)傳遞信號(hào)。最近的報(bào)道表明，il-20細(xì)胞因子作為參與炎性疾病(例如銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、缺血性中風(fēng)和腎功能衰竭)的促炎性細(xì)胞因子發(fā)揮功能。該細(xì)胞因子家族影響上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，但也誘導(dǎo)大量的趨化因子、抗菌肽和生長(zhǎng)因子。鑒于其來(lái)源和其性質(zhì)，這些細(xì)胞因子可能在粘膜免疫和傷口愈合中控制免疫細(xì)胞和固有細(xì)胞之間的相互溝通。然而，從未研究il-20細(xì)胞因子在copd急性加重中的作用。

發(fā)明簡(jiǎn)述

本發(fā)明涉及用于治療慢性阻塞性肺疾病的急性發(fā)作的方法和藥物組合物。具體地，本發(fā)明由權(quán)利要求所定義。

發(fā)明詳述

細(xì)菌感染是在肺部炎性疾病(包括慢性阻塞性肺疾病(copd))中疾病加重的主要原因。在該疾病中，當(dāng)il-20細(xì)胞因子在肺中過(guò)表達(dá)時(shí)，細(xì)菌易感性與th17細(xì)胞因子的缺陷相關(guān)。平行地，已經(jīng)鑒定了在感染中il-20細(xì)胞因子的免疫抑制作用，其可以治療性靶向以改變對(duì)感染的易感性。

因此，本發(fā)明涉及用于治療需要的受試者的治療慢性阻塞性肺疾病的急性發(fā)作的方法，包括向該受試者施用治療有效量的il-20細(xì)胞因子的拮抗劑。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“急性加重”具有其在本領(lǐng)域的普通含義，是指從受試者的通常狀態(tài)開(kāi)始的他或她的copd癥狀的惡化超過(guò)了正常的逐日變化，并且發(fā)作是急性的。通常，copd急性加重表現(xiàn)為一種或多種選自以下的癥狀：呼吸困難加重、痰量增多、膿痰增加、痰顏色變化、咳嗽增多、上呼吸道癥狀(包括感冒和喉嚨痛)、喘息增加、胸悶、運(yùn)動(dòng)耐量降低、疲勞、液體潴留和急性精神錯(cuò)亂，所述方法包括降低一種或多種所述癥狀的頻率、嚴(yán)重度或持續(xù)時(shí)間。急性加重可能具有各種病因，但一般可能是由病毒感染、細(xì)菌感染或空氣污染引起。例如，約50％的急性加重主要是由streptococcuspneumoniae(肺炎鏈球菌)、haemophilusinfluenzae(流感嗜血桿菌)和moraxellacatarrhalis(卡他莫拉菌)引起(它們均引起肺炎)。與患有copd的受試者的急性加重相關(guān)的病毒病原體包括鼻病毒、流感病毒、副流感病毒、冠狀病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒。

在一些實(shí)施方案中，copd急性加重由細(xì)菌感染引起。在一些實(shí)施方案中，copd急性加重由病毒感染引起。在一些實(shí)施方案中，copd急性加重由空氣污染引起。

在一些實(shí)施方案中，受試者經(jīng)歷過(guò)copd急性加重或具有經(jīng)歷copd急性加重的風(fēng)險(xiǎn)。在一些實(shí)施方案中，受試者在過(guò)去24個(gè)月中至少經(jīng)歷一次copd急性加重。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，受試者在過(guò)去12個(gè)月中至少經(jīng)歷一次copd急性加重。在一些實(shí)施方案中，受試者是頻繁加重者。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“頻繁加重者”是指患有copd或正在進(jìn)行copd治療并且在12個(gè)月期間經(jīng)歷至少2次、更通常3次或更多次急性加重的受試者。

在一些實(shí)施方案中，“治療”是指治療人的copd急性加重，降低人的copd急性加重的頻率、持續(xù)時(shí)間或嚴(yán)重度，治療人的copd急性加重的一種或多種癥狀、降低人的copd急性加重的一種或多種癥狀的頻率、持續(xù)時(shí)間或嚴(yán)重度，預(yù)防人的copd急性加重的發(fā)病率，或預(yù)防人的copd急性加重的一種或多種癥狀的發(fā)病率。頻率、持續(xù)時(shí)間或嚴(yán)重度的降低與沒(méi)有進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的方法治療的同一個(gè)人的急性加重或癥狀的頻率、持續(xù)時(shí)間或嚴(yán)重度有關(guān)。急性加重或急性加重的一種或多種癥狀的頻率、持續(xù)時(shí)間或嚴(yán)重度的降低可以通過(guò)具有治療copd受試者經(jīng)驗(yàn)的普通的熟練臨床醫(yī)生的臨床觀察或通過(guò)正在進(jìn)行治療的受試者的主觀自我評(píng)估來(lái)測(cè)量。普通的熟練臨床醫(yī)生的臨床觀察可以包括客觀測(cè)量以下：肺功能、維持受試者在其最穩(wěn)定狀態(tài)所需的干預(yù)的頻率和維持受試者在其最穩(wěn)定狀態(tài)所需的住院頻率和住院時(shí)間。通常，用工業(yè)上認(rèn)可的和/或fda認(rèn)可的主觀報(bào)告結(jié)果(pro)工具來(lái)收集主觀自我評(píng)估。這種工具允許受試者評(píng)估具體的癥狀或生活質(zhì)量的其他主觀度量。主觀報(bào)告結(jié)果工具的一個(gè)實(shí)例是肺部疾病加重工具(exact-pro)，其目前正被unitedbiosourcecorporation和與fda協(xié)商的制藥行業(yè)贊助商聯(lián)盟開(kāi)發(fā)用于評(píng)估急性細(xì)菌加重的臨床反應(yīng)。

在一些實(shí)施方案中，治療是預(yù)防性治療。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“預(yù)防性治療”是指其目的在于預(yù)防疾病的任何醫(yī)學(xué)或公共健康方案。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“預(yù)防”是指在還沒(méi)有生病但已經(jīng)或可能接近患有疾病的受試者中，降低獲得或發(fā)展給定病癥的風(fēng)險(xiǎn)，或降低或抑制所述病癥的復(fù)發(fā)。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“il-20細(xì)胞因子”具有本領(lǐng)域的通常含義，是指il-10細(xì)胞因子家族的亞組，包含il-19(示例性人ncbi參考序列：np_715639.1)、il-20(示例性人ncbi參考序列：np_061194.2)和il-24(示例性人ncbi參考序列：np_006841.1)。il-20細(xì)胞因子與il-22非常接近。il-19和il-20通過(guò)位于上皮細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞上的由il-20r1和il-20r2鏈組成的受體復(fù)合物起作用。il-20和il-24還能夠通過(guò)第二個(gè)受體復(fù)合物(il-22r1/il-20r2)傳遞信號(hào)。il-20細(xì)胞因子的人受體的實(shí)例包括：hil-20r1(也稱為crf2-8；il-20ra；il-20r-α)(示例性人ncbi參考序列：np_055247.3)、hil-20r2(也稱為il-20rb；il-20r-β)(示例性人ncbi參考序列：np_653318.2)和hil-22r1(示例性人ncbi參考序列：np_067081.2)。更具體地，il-20細(xì)胞因子的人受體序列已經(jīng)描述于例如美國(guó)專利號(hào)6,610,286；7,122,632；7,393,684和7,537,761；和美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2006/0263850a1；2006/0263851a1；2008/0247945a1和2009/0074661a1。

在本文所述的方法中所用的“il-20細(xì)胞因子拮抗劑”是阻斷、抑制或降低(包括顯著地)il-20細(xì)胞因子的生物活性的分子，包括由il-20細(xì)胞因子信號(hào)介導(dǎo)的下游通路，例如受體結(jié)合和/或引起細(xì)胞對(duì)il-20細(xì)胞因子的反應(yīng)。因此，術(shù)語(yǔ)“il-20細(xì)胞因子拮抗劑”并不暗示生物作用的具體機(jī)制，且被視為明確地包括和涵蓋直接或間接的所有可能的與il-20細(xì)胞因子和受體的藥學(xué)的、生理的和生物化學(xué)的相互作用。為本公開(kāi)的目的，將明確理解術(shù)語(yǔ)“il-20細(xì)胞因子拮抗劑”涵蓋所有之前鑒定的術(shù)語(yǔ)、標(biāo)題和功能性描述和特征，其中il-20細(xì)胞因子本身、il-20細(xì)胞因子的生物活性(包括但不限于它在copd急性加重期間控制il-17和il-22細(xì)胞因子表達(dá)的能力)或該生物活性的結(jié)果以任何有意義的程度，例如至少20％、50％、70％、85％、90％、100％、150％、200％、300％或500％，或10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍、10⁴倍被基本上抵消、降低或中和。

il-20細(xì)胞因子拮抗劑的實(shí)例包括但不限于：針對(duì)il-20細(xì)胞因子的抗體、針對(duì)il-20細(xì)胞因子的反義核酸分子(包括針對(duì)編碼il-20的核酸的反義核酸)、針對(duì)編碼il-20細(xì)胞因子的核酸的小干擾rna(sirna)、針對(duì)編碼il-20細(xì)胞因子的核酸的microrna、針對(duì)il-20細(xì)胞因子受體的抗-抗體(例如，特異性結(jié)合il-20r1、il-20r2、il-22ri或由其形成的二聚體復(fù)合物的抗體)、針對(duì)il-20細(xì)胞因子受體亞單元的反義核酸分子、針對(duì)編碼il-20細(xì)胞因子受體亞單元的核酸的sirna或microrna。在一些實(shí)施方案中，il-20細(xì)胞因子拮抗劑結(jié)合il-20細(xì)胞因其或受體，并阻止受體和細(xì)胞因子之間形成復(fù)合物，從而抑制信號(hào)通路。在一些實(shí)施方案中，il-20細(xì)胞因子拮抗劑抑制或降低il-20細(xì)胞因子的合成和/或產(chǎn)生(釋放)。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的il-20細(xì)胞因子拮抗劑不是針對(duì)il-22r1受體的抗體、針對(duì)編碼il-22r1的核酸的反義核酸分子、針對(duì)編碼il-22r1受體的核酸的小干擾rna(sirna)、針對(duì)編碼il-22r1受體的核酸的microrna。這樣，il-22的信號(hào)通路不被干擾。

在一些實(shí)施方案中，il-20細(xì)胞因子拮抗劑是抗體。例如，本文所述的抗體特異性結(jié)合靶標(biāo)抗原，例如人il-20細(xì)胞因子或il-20細(xì)胞因子的人受體的亞單元之一(例如il-20r1)。在一些實(shí)施方案中，il-20細(xì)胞因子拮抗劑選自抗il-19抗體、抗il-20抗體、抗il-24抗體、抗il20r1抗體和抗il20r2抗體。

“特異性結(jié)合”靶標(biāo)或表位(在本文中可交替使用)的抗體是本領(lǐng)域熟知的術(shù)語(yǔ)，用于確定這種特異性結(jié)合的方法也是本領(lǐng)域熟知的。如果與其他靶標(biāo)相比，分子與特定的靶標(biāo)抗原反應(yīng)或結(jié)合更頻繁、更快、結(jié)合更長(zhǎng)時(shí)間和/或具有更大親和性，則認(rèn)為該分子顯示“特異性結(jié)合”。如果與結(jié)合其他物質(zhì)相比，抗體以更大親和性、親合力、更容易和/或更長(zhǎng)時(shí)間結(jié)合，則該抗體“特異性結(jié)合”靶標(biāo)抗原。例如，特異性(或優(yōu)先)結(jié)合表位的抗體是與il-20細(xì)胞因子(或其受體亞單元)中存在的其他表位或不存在于il-20細(xì)胞因子(或其受體亞單元)中的表位相比，與所述表位的結(jié)合具有更大親和性、親合力、更容易和/或更長(zhǎng)時(shí)間的抗體。通過(guò)閱讀該定義也可以理解，例如，特異性結(jié)合第一靶標(biāo)抗原的抗體可以或不可以特異性或優(yōu)先結(jié)合第二靶標(biāo)抗原。因此，“特異性結(jié)合”或“優(yōu)先結(jié)合”不一定需要(盡管可以包括)專一的結(jié)合。通常，但不是必要的，結(jié)合是指優(yōu)先結(jié)合。

因此，術(shù)語(yǔ)“抗體”是指具有抗原結(jié)合區(qū)域的任何抗體樣分子，且該術(shù)語(yǔ)包括含有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體片段，例如fab′、fab、f(ab′)2、單結(jié)構(gòu)域抗體(dab)、tandabs二聚體、fv、scfv(單鏈fv)、dsfv、ds-scfv、fd、線性抗體、微抗體、雙體(diabody)、雙特異性抗體片段、二體(bibody)、三體(scfv-fab融合、分別為雙特異性或三特異性)；sc-雙體；κ(λ)抗體(scfv-cl融合)；bite(雙特異性t細(xì)胞銜接器、吸引t細(xì)胞的scfv-scfv串聯(lián))；dvd-ig(雙可變結(jié)構(gòu)域抗體、雙特異性形式)；sip(小免疫蛋白，一種微抗體)；smip(″小模塊免疫藥物″scfv-fc二聚體；dart(ds-穩(wěn)定的雙體″雙親和重定向″)；包含一個(gè)或多個(gè)cdr的小抗體類似物等。用于制備和使用各基于抗體的構(gòu)建體和片段的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的(參見(jiàn)kabat等，1991，特別通過(guò)引用并入本文)。雙體尤其進(jìn)一步描述于ep404,097和wo93/11161；而線性抗體進(jìn)一步描述于zapata等(1995)?？贵w可以用常規(guī)技術(shù)片段化。例如，可以用胃蛋白酶處理抗體產(chǎn)生f(ab′)2片段?？梢蕴幚硭胒(ab′)2片段以降低二硫橋，從而制備fab′片段。胃蛋白酶消化可以導(dǎo)致形成fab片段。fab、fab′和f(ab′)2、scfv、fv、dsfv、fd、dabs、tandabs、ds-scfv、二聚體、微抗體、雙體、雙特異性抗體片段和其他片段也可以通過(guò)重組技術(shù)合成或可以化學(xué)合成。用于生產(chǎn)抗體片段的技術(shù)是熟知的，且在現(xiàn)有技術(shù)中有描述。例如，beckman等，2006；holliger&hudson，2005；legall等，2004；reff&heard，2001；reiter等，1996；和young等，1995的每一個(gè)均描述并允許產(chǎn)生有效的抗體片段。

在中性抗體中，兩條重鏈通過(guò)二硫鍵彼此連接，并且各重鏈通過(guò)二硫鍵與輕鏈連接。有兩種輕鏈：λ(l)和κ(k)。決定抗體分子的功能活性的重鏈主要有五種類型(或同種型)：igm、igd、igg、iga和ige。各條鏈包含不同的序列結(jié)構(gòu)域。輕鏈包括兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域(vl)和一個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域(cl)。重鏈包括四個(gè)結(jié)構(gòu)域：一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域(vh)和三個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域(ch1、ch2和ch3，合起來(lái)稱為ch)。輕鏈(vl)和重鏈(vh)的可變區(qū)決定與抗原的結(jié)合識(shí)別和特異性。輕鏈(cl)和重鏈(ch)的恒定區(qū)賦予重要的生物性質(zhì)，例如抗體鏈結(jié)合、分泌、經(jīng)胎盤(pán)的流動(dòng)性、補(bǔ)體結(jié)合和結(jié)合fc受體(fcr)。fv片段是免疫球蛋白的fab片段的n末端部分，由一條輕鏈和一條重鏈的可變部分組成?？贵w的特異性在于抗體結(jié)合位點(diǎn)和抗原決定簇之間的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性?？贵w結(jié)合位點(diǎn)由主要來(lái)自高變的或互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)的殘基組成。偶爾，來(lái)自非高變區(qū)或框架區(qū)(fr)的殘基影響整個(gè)結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)，從而影響結(jié)合位點(diǎn)。互補(bǔ)決定區(qū)或cdr是指一起定義天然免疫球蛋白結(jié)合位點(diǎn)的天然fv區(qū)的結(jié)合親和性和特異性的氨基酸序列。免疫球蛋白的輕鏈和重鏈各自具有三個(gè)cdr，分別為l-cdr1、l-cdr2、l-cdr3和h-cdr1、h-cdr2、h-cdr3。因此，抗原結(jié)合位點(diǎn)包括六個(gè)cdr，包含各自來(lái)自重鏈和輕鏈v區(qū)的cdr組?？蚣軈^(qū)(fr)是指插入cdr之間的氨基酸序列。此外，確定抗體的cdr區(qū)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。至少有兩種確定cdr的技術(shù)：(1)基于跨物種序列可變性的方法(即，kabat等sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，(5thed.，1991，nationalinstitutesofhealth，bethesdamd.))；和(2)基于抗原-抗體復(fù)合物的晶體學(xué)研究的方法(chothia等(1989)nature342：877；al-lazikani等(1997)j.molec.biol.273：927-948))。如本文所用，cdr可以是指由任一種方法或由兩種方法的組合定義的cdr。

術(shù)語(yǔ)“fab”是指分子量約為50,000且具有抗原結(jié)合活性的抗體片段，其中在用蛋白酶(胃蛋白酶)處理igg所得的片段中，約一半的h鏈n末端側(cè)和整個(gè)l鏈通過(guò)二硫鍵結(jié)合在一起。

術(shù)語(yǔ)“f(ab′)2”是指分子量約為100,000且具有抗原結(jié)合活性的抗體片段，其中在用蛋白酶(胃蛋白酶)處理igg所得的片段中，其比通過(guò)鉸鏈區(qū)的二硫鍵連接的fab稍大。

術(shù)語(yǔ)“fab′”是指分子量約為50,000且具有抗原結(jié)合活性的抗體片段，通過(guò)切割f(ab′)2的鉸鏈區(qū)的二硫鍵獲得。

單鏈fv(“scfv”)多肽是共價(jià)連接的vh：：vl異二聚體，其通常從包含由編碼肽的接頭連接的vh和vl編碼基因的融合基因表達(dá)?！癲sfv”是用二硫鍵穩(wěn)定的vh：：vl異二聚體。二價(jià)或多價(jià)抗體片段可以通過(guò)單價(jià)scfv的連接自發(fā)形成，或通過(guò)用肽接頭連接單價(jià)scfv產(chǎn)生，例如二價(jià)sc(fv)2。

術(shù)語(yǔ)“雙體”是指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小抗體片段，所述片段包含在同一肽鏈(vh-vl)中與輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl)連接的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)。通過(guò)使用太短而不允許同一條鏈上兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間配對(duì)的接頭，結(jié)構(gòu)域被迫與另一條鏈上的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，從而產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。

可以用kohler和milstein的方法(nature，256：495，1975)制備單克隆抗體。為制備本發(fā)明可用的單克隆抗體，用相關(guān)的抗原形式(例如il-20細(xì)胞因子或受體)以合適的間隔(例如每周兩次、每周一次、每月兩次或每月一次)免疫接種小鼠或其他合適的宿主動(dòng)物。在處死前一周內(nèi)，可向動(dòng)物施用最后的抗原“增強(qiáng)劑(boost)”。在免疫接種期間通常期望使用免疫佐劑。合適的免疫佐劑包括弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、明礬、ribi佐劑、hunter′stitermax、皂苷佐劑例如qs21或quila、或含有cpg的免疫刺激性寡核苷酸。其他合適佐劑是本領(lǐng)域熟知的。可以通過(guò)皮下、腹腔內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈、鼻內(nèi)或其他途徑免疫接種動(dòng)物。可以通過(guò)多種途徑用多種形式的抗原免疫接種給定動(dòng)物。

簡(jiǎn)言之，重組抗原(例如il-20細(xì)胞因子或受體)可以通過(guò)用重組細(xì)胞系表達(dá)來(lái)提供。例如，受體(例如il-20r1或il-20r2)可以以在其表面表達(dá)受體的人細(xì)胞的形式提供。細(xì)胞因子或受體的重組形式可以用任何之前描述的方法提供。按照免疫接種方案，從動(dòng)物的脾、淋巴結(jié)或其他器官分離淋巴細(xì)胞，并用試劑例如聚乙二醇將其與合適的骨髓瘤細(xì)胞系融合以形成雜交瘤。融合后，如所述的用標(biāo)準(zhǔn)方法將細(xì)胞置于允許雜交瘤而不是融合組分生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中(coding，monoclonalantibodies：principlesandpractice：productionandapplicationofmonoclonalantibodiesincellbiology，biochemistryandimmunology，3rdedition，academicpress，newyork，1996)。培養(yǎng)雜交瘤之后，分析細(xì)胞上清液中具有期望特異性(即選擇性結(jié)合抗原)的抗體的存在。合適的分析技術(shù)包括elisa、流式細(xì)胞儀、免疫沉淀和蛋白質(zhì)印跡。其他篩選技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。優(yōu)選技術(shù)是證實(shí)抗體結(jié)合至構(gòu)象上完整的天然折疊抗原的那些，例如非變性elisa、流式細(xì)胞儀和免疫沉淀。

明顯地，如本領(lǐng)域已知，抗體分子中僅有一小部分(抗體決定簇(paratope))參與抗體與其表位的結(jié)合(總體上參見(jiàn)clark，w.r.(1986)theexperimentalfoundationsofmodernimmunologywiley&sons，inc.，newyork；roitt，i.(1991)essentialimmunology，7thed.，blackwellscientificpublications，oxford)。例如，fc′和fc區(qū)是互補(bǔ)盒的效應(yīng)子，但并不參與抗原結(jié)合。其中pfc′區(qū)被酶促切割或其中制備時(shí)沒(méi)有pfc′區(qū)的抗體(稱為f(ab′)2片段)保留完整抗體的兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。類似地，其中fc區(qū)被酶促切割或其中制備時(shí)沒(méi)有fc區(qū)的抗體(稱為fab片段)保留完整抗體分子的抗原結(jié)合位點(diǎn)之一。更進(jìn)一步，fab片段由共價(jià)結(jié)合的抗體輕鏈和稱為fd的一部分抗體重鏈組成。fd片段是抗體特異性的主要決定因素(單個(gè)fd片段可以與多達(dá)10個(gè)不同輕鏈連接而不改變抗體特異性)，且分離的fd片段保留表位結(jié)合能力。

如本領(lǐng)域熟知的，在抗體的抗原結(jié)合部分內(nèi)存在直接與抗原的表位相互作用的互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)和維持抗體決定簇三級(jí)結(jié)構(gòu)的框架區(qū)(fr)(總體上參見(jiàn)clark，1986；roitt，1991)。igg免疫球蛋白的重鏈fd片段和輕鏈中，均存在四個(gè)框架區(qū)(fr1至fr4)，其分別被三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(cdr1至cdr3)隔開(kāi)?？贵w特異性大部分由cdr，尤其是cdrs區(qū)，更具體地重鏈cdrs決定。

目前本領(lǐng)域已經(jīng)廣泛接受，哺乳動(dòng)物抗體的非cdr區(qū)可以用特·異性或異種特異性抗體的相似區(qū)域替換，同時(shí)保留原始抗體的表位特異性。這在“人源化”抗體(其中非人cdr與人fr和/或fc/pfc′區(qū)共價(jià)結(jié)合以產(chǎn)生功能性抗體)的發(fā)展和使用中體現(xiàn)得最為清楚。

在一些實(shí)施方案中，抗體是人源化抗體。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“人源化”描述其中cdr區(qū)之外的一些、大多數(shù)或全部氨基酸被來(lái)自人免疫球蛋白分子的對(duì)應(yīng)氨基酸替換的抗體。人源化的方法包括但不限于描述于通過(guò)引用并入本文的美國(guó)專利號(hào)4,816,567、5,225,539、5,585,089、5,693,761、5,693,762和5,859,205中的那些。上述美國(guó)專利號(hào)5,585,089和5,693,761，以及wo90/07861還提出可以用于設(shè)計(jì)人源化抗體的四個(gè)可能的標(biāo)準(zhǔn)。第一個(gè)提議是，對(duì)于接受者，使用來(lái)自與待人源化的供體免疫球蛋白非常同源的特定人免疫球蛋白的框架，或使用來(lái)自很多人抗體的保守框架。第二個(gè)提議是，如果在人免疫球蛋白的框架中的氨基酸是獨(dú)特的，且該位置的供體氨基酸對(duì)于人序列是普通的，則選擇供體氨基酸而不是接受者。第三個(gè)提議是，在與人源化免疫球蛋白鏈的3個(gè)cdr緊緊相鄰的位置中，選擇供體氨基酸而不是接受者的氨基酸。第四個(gè)提議是，使用位于框架位置的供體氨基酸，其中氨基酸預(yù)期在抗體的三維模型的cdr的3a內(nèi)具有側(cè)鏈原子，并預(yù)期能夠與cdr相互作用。以上方法僅僅說(shuō)明本領(lǐng)域技術(shù)人員可以用來(lái)制備人源化抗體的一些方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知用于抗體人源化的其他方法。

在一些實(shí)施方案中，cdr區(qū)之外的一些、大多數(shù)或全部氨基酸已經(jīng)被來(lái)自人免疫球蛋白分子的氨基酸替換，但一個(gè)或多個(gè)cdr區(qū)內(nèi)的一些、大多數(shù)或全部氨基酸不變。允許小小的添加、缺失、插入、替換或修飾氨基酸，只要它們不消除抗體結(jié)合給定抗原的能力。合適的人免疫球蛋白分子包括iggl1、igg2、igg3、igg4、iga和igm分子?！叭嗽椿笨贵w保留與原始抗體相似的抗原特異性。然而，如其內(nèi)容通過(guò)引用并入本文的wu等/.mol.biol.294：151，1999所述，使用某些人源化方法，可以使用“定向進(jìn)化”方法提高抗體的結(jié)合親和性和/或特異性。

完全人單克隆抗體也可以通過(guò)免疫接種具有大部分人免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因座的小鼠來(lái)制備。參見(jiàn)例如其內(nèi)容通過(guò)引用并入本文的美國(guó)專利號(hào)5,591,669、5,598,369、5,545,806、5,545,807、6,150,584和其引用的參考文獻(xiàn)。這些動(dòng)物已經(jīng)被遺傳改造，使其產(chǎn)生內(nèi)源性(例如鼠科)抗體存在功能性缺失。動(dòng)物被進(jìn)一步改造以包含全部或一部分人胚系免疫球蛋白基因座，使得免疫接種這些動(dòng)物將導(dǎo)致產(chǎn)生目標(biāo)抗原的完全人抗體。免疫接種這些小鼠(例如xenomouse(abgenix)，humab小鼠(medarex/genpharm))后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤技術(shù)可以制備單克隆抗體。這些單克隆抗體將具有人免疫球蛋白氨基酸序列，因此當(dāng)向人施用時(shí)不會(huì)引起人抗鼠抗體(kama)反應(yīng)。也存在用于產(chǎn)生人抗體的體外方法。這些包括噬菌體展示技術(shù)(美國(guó)專利號(hào)5,565,332和5,573,905)和體外刺激人b細(xì)胞(美國(guó)專利號(hào)5,229,275和5,567,610)。這些專利的內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。

因此，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，本發(fā)明也提供f(ab′)2、fab、fv和fd片段；其中fc和/或fr和/或cdr1和/或cdr2和/或輕鏈cdr3區(qū)已經(jīng)被同源的人或非人序列替換的嵌合抗體；其中fr和/或cdr1和/或cdr2和/或輕鏈cdr3區(qū)已經(jīng)被同源的人或非人序列替換的嵌合f(ab′)2片段抗體；其中fr和/或cdr1和/或cdr2和/或輕鏈cdr3區(qū)已經(jīng)被同源的人或非人序列替換的嵌合fab片段抗體；和其中fr和/或cdr1和/或cdr2和/或輕鏈cdr3區(qū)已經(jīng)被同源的人或非人序列替換的嵌合fd片段抗體。本發(fā)明也包括所謂的單鏈抗體。

各種抗體分子和片段可以來(lái)自任何常規(guī)已知的免疫球蛋白類型，包括但不限于iga、分泌性iga、ige、igg和igm。igg子類也是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括但不限于人igg1、igg2、igg3和igg4。

抗體的結(jié)合親和性可以少于約100nm、約50nm、約10nm、約1nm、約500pm、約100pm、或約50pm至約2pm。結(jié)合親和性可以表示為kd或解離常數(shù)，增加的結(jié)合親和性對(duì)應(yīng)降低的kd。測(cè)定抗體結(jié)合親和性的一種方法是測(cè)量抗體的單功能fab片段的結(jié)合親和性。為獲得單功能fab片段，可以用胃蛋白酶切割抗體(例如igg)或重組表達(dá)抗體。抗體的抗il-20fab片段的親和性可以用表面等離子共振(biacore3000^tmsurfaceplasmonresonance(spr)system，blacore，inc，piscawayn.j.)來(lái)測(cè)定。獲得動(dòng)力學(xué)結(jié)合速率(kon)和解離速率(koff)(一般在25℃測(cè)量)，且平衡解離常數(shù)(kd)值計(jì)算為koff/kon。

抗il-20抗體的實(shí)例包括但不限于描述于美國(guó)專利號(hào)7,435,800；7,115,714；7,119,175；7,151,166和7,393,684；以及pct公開(kāi)wo2007/081465；wo99/27103；wo2004/085475和wo2005052000中的那些。在一些實(shí)施方案中，本文所述的抗il-20抗體是抗il-20抗體7e，其是指單克隆抗體mab7e及其功能性變體。mab7e是由保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏所，10801universityboulevard，manassas，va.20110-2209，u.s.a.，保藏號(hào)為pta-8687的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生。該雜交瘤細(xì)胞系將在本申請(qǐng)美國(guó)專利授權(quán)時(shí)向公眾不能撤銷且沒(méi)有限制/條件地公布，且為專利的有效期將從保藏日起在atcc保留至少30年或在最接近日期后保留5年。mab7e的功能性變體(等效物)與mab7e具有基本上相同的表位結(jié)合特異性，且顯示相對(duì)于mab7e的至少20％(例如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高)的中和由il-20介導(dǎo)的信號(hào)通路的活性。在一些實(shí)施方案中，mab7e的功能性變體包含與mab7e相同的抗原結(jié)合所需的區(qū)域/殘基，例如cdr中相同的決定特異性的殘基或整個(gè)cdr。決定抗原結(jié)合的區(qū)域/殘基可以用本領(lǐng)域已知的方法從mab7gw或mab51d(如上所示)的重鏈/輕鏈序列的氨基酸序列鑒定。參見(jiàn)例如www.bioinf.org.uk/abs；almagro，j.mol.recognit.17：132-143(2004)；和chothia等，j.mol.biol.227：799-817(1987)。

在一些實(shí)施方案中，本文所述的方法所用的抗il20r1抗體是具有與單克隆抗體mab7gw或mab51d相同的重鏈和輕鏈可變區(qū)(vh和vl)的抗體、單克隆抗體、其抗原結(jié)合片段或us2011/0256093(其全文通過(guò)引用并入本文)公開(kāi)的mab7gw或mab51d的功能性等效物。mab7gw或mab51d的功能性等效物具有與mab7gw或mab51d相同的表位結(jié)合特異性，且顯示相對(duì)于mab7gw或mab51d的至少20％(例如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高)的中和由il-20r1介導(dǎo)的信號(hào)通路的活性。在一些實(shí)施方案中，mab7gw或mab51d的功能性等效物包含與mab7gw或mab51d相同的抗原結(jié)合所需的區(qū)域/殘基，例如cdr中相同的決定特異性的殘基或整個(gè)cdr。決定抗原結(jié)合的區(qū)域/殘基可以用本領(lǐng)域已知的方法從mab7gw或mab51d(如上所示)的重鏈/輕鏈序列的氨基酸序列鑒定。參見(jiàn)例如www.bioinf.org.uk/abs；almagro，j.mol.recognit.17：132-143(2004)；和chothia等，j.mol.biol.227：799-817(1987)。

在一些實(shí)施方案中，il-20細(xì)胞因子拮抗劑是多肽。在一些實(shí)施方案中，多肽包含il-20受體(即il-20r1，il-20r2和il-22ri)的功能性等效物。如本文所用，“il-20受體的功能性等效物”是能夠結(jié)合il-20細(xì)胞因子從而阻止其與il-20受體相互作用的多肽。術(shù)語(yǔ)“功能性等效物”包括il-20受體的片段、突變體和突變蛋白。因此，術(shù)語(yǔ)“功能性等效物”包括通過(guò)改變氨基酸序列獲得的il-20受體的任何等效物，例如通過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、替換或添加從而使蛋白類似物保留與il-20細(xì)胞因子結(jié)合的能力。氨基酸替換例如可以通過(guò)編碼氨基酸序列的dna的點(diǎn)突變來(lái)進(jìn)行。功能性等效物包括結(jié)合il-20細(xì)胞因子且包含il-20受體的胞外域的全部或一部分以形成能夠捕獲il-20細(xì)胞因子的可溶性受體的分子。因此，功能性等效物包括il-20受體的可溶形式。這些蛋白質(zhì)或其功能性等效物的合適的可溶形式可以包括例如其中跨膜結(jié)構(gòu)域已經(jīng)通過(guò)化學(xué)、酶促或重組方法移除的蛋白的截短形式。通常，功能性等效物與對(duì)應(yīng)的蛋白至少80％同源。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)任何常規(guī)分析算法評(píng)估的功能性等效物為至少90％同源。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“功能性等效片段”也可以是指結(jié)合il-20細(xì)胞因子的il-20受體的任何片段或片段組配物。因此，本發(fā)明提供能夠抑制il-20受體與il-20細(xì)胞因子結(jié)合的多肽，所述多肽包含序列與il-20受體的胞外域的至少一部分序列相對(duì)應(yīng)的連續(xù)氨基酸，所述部分結(jié)合il-20細(xì)胞因子。在一些實(shí)施方案中，多肽對(duì)應(yīng)于il-20受體的胞外域。在一些實(shí)施方案中，多肽不包含il-22ri的功能性等效物。

在一些實(shí)施方案中，多肽包含il-20受體的功能性等效物，其與免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域(fc區(qū))融合以形成免疫粘合素。免疫粘合素可以具有很多人抗體中有價(jià)值的化學(xué)和生物性質(zhì)。因?yàn)榭梢詮木哂衅谕禺愋缘娜说鞍仔蛄袠?gòu)建免疫粘合素，所述人蛋白序列與合適的人免疫球蛋白鉸鏈和恒定結(jié)構(gòu)域(fc)序列連接，可以完全使用人的組分來(lái)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)的結(jié)合特異性。這種免疫粘合素對(duì)患者的免疫原性最小，且對(duì)慢性或重復(fù)使用是安全的。在一些實(shí)施方案中，fc區(qū)是天然序列fc區(qū)。在一些實(shí)施方案中，fc區(qū)是變體fc區(qū)。還在另一個(gè)實(shí)施方案中，fc區(qū)是功能性fc區(qū)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“fc區(qū)”用來(lái)定義免疫球蛋白重鏈的c末端區(qū)域，包括天然序列fc區(qū)和變體fc區(qū)。盡管免疫球蛋白重鏈的fc區(qū)的邊界可能變化，人工gg重鏈的fc區(qū)通常定義為從位置cys226的氨基酸殘基或從pro230延伸至其羧基末端。免疫粘合素的粘合部分和免疫球蛋白序列部分可以通過(guò)最小接頭連接。免疫球蛋白序列通常是，但不必然是免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明嵌合體中的免疫球蛋白部分可以獲得自igg1、igg2、igg3或igg4亞型、iga、ige、igd或igm，但通常獲得自igg1或igg3。在一些實(shí)施方案中，il-20受體的功能性等效物和免疫粘合素的免疫球蛋白序列部分通過(guò)最小接頭連接。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“接頭”是指至少一個(gè)氨基酸的連接本發(fā)明的多肽和免疫球蛋白序列部分的序列。這種接頭有助于防止空間阻礙。在一些實(shí)施方案中，接頭具有4；5；6；7；8；9；10；11；12；13；14；15；16；17；18；19；20；21；22；23；24；25；26；27；28；29；30個(gè)氨基酸殘基。然而，上限并不重要，但出于例如這種多肽的生物醫(yī)藥生產(chǎn)的方便來(lái)選擇。接頭自序列可以是天然存在的序列或非天然存在的序列。如果用于治療目的，接頭通常是在施用免疫粘合素的受試者中非免疫原性的。一組有用的接頭序列是衍生自重鏈抗體的鉸鏈區(qū)的接頭，如wo96/34103和wo94/04678所述。其他實(shí)例有聚丙氨酸接頭序列。

在一些實(shí)施方案中，多肽包含共價(jià)連接的il-20r1多肽的胞外域和il-20rii的胞外域。在一些實(shí)施方案中，一個(gè)胞外域的羧基末端與免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)融合，且另一個(gè)胞外域的羧基末端與免疫球蛋白(ig)的恒定輕鏈融合，這樣兩個(gè)多肽結(jié)合在一起形成可溶性受體，且在重鏈和輕鏈ig之間形成二硫鍵。在一些實(shí)施方案中，肽接頭可以與胞外域的兩個(gè)羧基末端融合以形成共價(jià)結(jié)合的可溶性受體。

本發(fā)明的多肽可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何合適的方式產(chǎn)生。為產(chǎn)生足夠量的用于本發(fā)明的il-20受體或其功能性等效物，可以通過(guò)在合適條件下培養(yǎng)含有本發(fā)明多肽的重組宿主細(xì)胞來(lái)方便地實(shí)現(xiàn)表達(dá)。通常，多肽通過(guò)重組方式，通過(guò)從編碼核酸分子表達(dá)來(lái)產(chǎn)生。用于在各種不同宿主細(xì)胞中克隆和表達(dá)多肽的系統(tǒng)是已知的。當(dāng)以重組形式表達(dá)時(shí)，通常通過(guò)在宿主細(xì)胞中從編碼核酸表達(dá)來(lái)制備多肽。根據(jù)具體系統(tǒng)的個(gè)體需求，可以使用任何宿主細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、酵母和桿狀病毒系統(tǒng)。用于表達(dá)異源多肽的本領(lǐng)域可用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、hela細(xì)胞、幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞和其他。細(xì)菌也是用于生產(chǎn)重組蛋白的優(yōu)選宿主，因?yàn)榧?xì)菌便于操作和生長(zhǎng)。常用的優(yōu)選的細(xì)菌宿主是大腸桿菌(e.coli)。

在一些實(shí)施方案中，預(yù)期可以修飾用于本發(fā)明治療方法的多肽以改進(jìn)其療效。這種治療化合物的修飾可以用于降低毒性、增加循環(huán)時(shí)間或改變生物分布。例如，通過(guò)與改變生物分布的各種藥物載體介質(zhì)聯(lián)合可以顯著降低潛在重要的治療化合物的毒性。例如，添加二肽可以改進(jìn)眼中的循環(huán)劑通過(guò)利用內(nèi)源性轉(zhuǎn)運(yùn)予穿透血-視網(wǎng)膜屏障。提高藥物活性的一個(gè)策略是使用水溶性聚合物。已經(jīng)表明多種水溶性聚合物能夠改變生物分布、改進(jìn)細(xì)胞攝取模式、改變通過(guò)生理屏障的滲透性和改變機(jī)體的清除率。為獲得靶向或延遲釋放效果，已經(jīng)合成了含有藥物部分作為末端基團(tuán)、作為骨架部分或作為聚合物鏈上的垂懸基團(tuán)的水溶性聚合物。由于高度的生物相容性和便于修飾，聚乙二醇(peg)已經(jīng)廣泛用作藥物載體。已經(jīng)表明與各種藥物、蛋白和脂質(zhì)體連接能夠提高停留時(shí)間并降低毒性。peg可以通過(guò)鏈末端的羥基和通過(guò)其他化學(xué)方法與活性劑偶聯(lián)，然而，peg本身限制為每個(gè)分子最多兩個(gè)活性劑。在一種不同的方法中，開(kāi)發(fā)了作為新生物材料的peg和氨基酸的共聚物，其保留了peg的生物相容性質(zhì)，但也具有每個(gè)分子大量連接點(diǎn)的額外優(yōu)勢(shì)(提供更大的載藥量)，其可以合成設(shè)計(jì)以適于各種應(yīng)用。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于有效修飾藥物的peg化技術(shù)。例如，vectramed(plainsboro，n.j.)已經(jīng)使用由peg和三官能單體(如賴氨酸)的交替聚合物組成的藥物遞送聚合物。peg鏈(通常2000道爾頓或更低)通過(guò)穩(wěn)定的氨基甲酸酯鍵與賴氨酸的a-和e-氨基連接。這種共聚物保留peg的期望性質(zhì)，同時(shí)在聚合物鏈上以嚴(yán)格控制和預(yù)定的間隔提供活性垂懸基團(tuán)(賴氨酸的羧酸基團(tuán))。活性垂懸基團(tuán)可以用于衍生、交聯(lián)或與其他分子偶聯(lián)。通過(guò)改變聚合物的分子量、peg片段的分子量以及藥物和聚合物之間的可斷裂鍵，這些聚合物可用于生產(chǎn)穩(wěn)定的長(zhǎng)循環(huán)的前藥。peg片段的分子量影響藥物/連接基團(tuán)復(fù)合物的空間和每分子量偶聯(lián)物的藥物量(更小的peg片段提供更大的載藥量)。總之，增加嵌段共聚物偶聯(lián)物的整體分子量將增加偶聯(lián)物的循環(huán)半衰期。然而，偶聯(lián)物必須是容易降解的，或其分子量低于閾值限制的腎小球過(guò)濾(例如，低于60kda)。此外，由于聚合物骨架對(duì)于維持循環(huán)半衰期和生物分布而言很重要，可以使用接頭將治療劑維持在前藥形式直至通過(guò)特定觸發(fā)劑(通常是靶組織中的酶活性)將其從骨架聚合物釋放。例如，當(dāng)需要遞送至特定的生物分布位點(diǎn)且治療劑在病理位點(diǎn)或其附近釋放時(shí)，這種組織激活的藥物遞送尤其有用。用于激活的藥物遞送的接頭基團(tuán)文庫(kù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，且可以基于酶動(dòng)力學(xué)、活性酶的普遍性和選擇的疾病特異性酶的切割特異性。這種接頭可用于修飾用于治療性遞送的本文所述的蛋白或蛋白片段。

在一些實(shí)施方案中，il-20細(xì)胞因子拮抗劑是表達(dá)抑制劑?！氨磉_(dá)抑制劑”是指具有抑制基因(例如il-19、il-20、il、24、il-20r1或il-20r2)表達(dá)的生物作用的天然或合成化合物。在一些實(shí)施方案中，所述基因表達(dá)抑制劑是sirna、反義寡核苷酸或核酶。例如，反義寡核苷酸(包括反義rna分子和反義dna分子)可以通過(guò)與其結(jié)合直接阻斷rip2mrna的翻譯，從而阻止蛋白翻譯或增加mrna降解，從而降低細(xì)胞中il-20細(xì)胞因子或其受體亞單元的水平進(jìn)而降低活性。例如，至少約15個(gè)堿基且與編碼rip2的mrna轉(zhuǎn)錄序列的獨(dú)特區(qū)域互補(bǔ)的反義寡核苷酸可以通過(guò)例如常規(guī)的磷酸二酯技術(shù)合成。使用用于特異性抑制序列已知的基因的基因表達(dá)的反義技術(shù)的方法是本領(lǐng)域已知的(例如參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)6,566,135；6,566,131；6,365,354；6,410,323；6,107,091；6,046,321和5,981,732)。小抑制性rna(sirna)也可以作為表達(dá)抑制劑用于本發(fā)明?？梢酝ㄟ^(guò)將受試者或細(xì)胞與小雙鏈rna(dsrna)或?qū)е庐a(chǎn)生小雙鏈rna的載體或構(gòu)建體接觸來(lái)降低基因表達(dá)，從而特異性抑制基因表達(dá)(即rna干擾或rnai)。本發(fā)明的反義寡核苷酸、sirna、shrna和核酶可以在體內(nèi)單獨(dú)遞送或與載體聯(lián)合遞送。在其最廣泛的含義上，“載體”是能夠促進(jìn)反義寡核苷酸、sirna、shrna或核酶核酸轉(zhuǎn)移入細(xì)胞，通常是表達(dá)rip2的細(xì)胞的任何介質(zhì)。通常，相對(duì)于缺少載體造成的降解程度，載體以降低的降解將核酸運(yùn)輸至細(xì)胞?？傊?，本發(fā)明可用的載體包括但不限于質(zhì)粒、噬菌粒、病毒、已經(jīng)通過(guò)插入或整合反義寡核苷酸、sirna、shrna或核酶核酸序列操作的源自病毒或細(xì)菌來(lái)源的其他介質(zhì)。病毒載體是優(yōu)選的載體類型，包括但不限于來(lái)自以下病毒的核酸序列：逆轉(zhuǎn)錄病毒，例如莫洛尼鼠白血病病毒、哈維小鼠肉瘤病毒、小鼠乳腺腫瘤病毒和勞氏肉瘤病毒；腺病毒、腺相關(guān)病毒；sv40型病毒；多瘤病毒；epstein-barr病毒；乳頭狀瘤病毒；皰疹病毒；痘苗病毒；脊髓灰質(zhì)炎病毒和rna病毒例如逆轉(zhuǎn)錄病毒?？梢匀菀椎乩脹](méi)有提及但本領(lǐng)域已知的其他載體。

“治療有效量”是指以適用于任何醫(yī)學(xué)治療的合理收益/風(fēng)險(xiǎn)比用于治療copd急性加重的方法的多肽(或編碼多肽的核酸)的足夠量。將理解，本發(fā)明的化合物和組合物的總的每日用量將由主治醫(yī)師在正確的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)決定。任何具體受試者的特定治療有效劑量水平將取決于各種因素，包括受試者的年齡、體重、總體健康、性別和飲食；施用次數(shù)、施用途徑和所用的特定化合物的排泄率；治療持續(xù)時(shí)間；與所用的特定多肽聯(lián)合使用或同時(shí)使用的藥物；以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域熟知的類似因素。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，以低于所需劑量的水平開(kāi)始使用化合物以獲得期望的治療效果，并逐漸增加劑量直至獲得期望效果。然而，產(chǎn)品的每日劑量可以在0.01-1000mg/成人/天的寬范圍內(nèi)變化。通常，組合物包含0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100、250和500mg的活性成分用于對(duì)待治療受試者的劑量對(duì)癥調(diào)整。藥物通常包含約0.01至約500mg活性成分，通常1mg至約100mg活性成分。藥物有效量一般以0.0002mg/kg至約20mg/kg體重/天，尤其約0.001mg/kg至7mg/kg體重/天的劑量水平提供。

通常，本發(fā)明的活性成分(即，il-20細(xì)胞因子拮抗劑)與藥學(xué)上可接受的賦形劑和任選的延遲釋放基質(zhì)(例如生物可降解的聚合物)組合以形成藥物組合物。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上”或“藥學(xué)上可接受的”是指當(dāng)向哺乳動(dòng)物尤其是人適當(dāng)?shù)厥┯脮r(shí)，不產(chǎn)生有害的、過(guò)敏的或其他不良反應(yīng)的分子實(shí)體和組合物。藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑是指任何類型的無(wú)毒固體、半固體或液體填充劑、稀釋劑、包封材料或制劑輔助劑。載體也可以是包含以下的溶劑或分散體介質(zhì)：例如水、乙醇、多醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)、它們的合適混合物、和植物油?？梢酝ㄟ^(guò)例如使用涂層(例如卵磷脂)、在分散體的情況下維持所需的粒徑和使用表面活性劑來(lái)維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。可以通過(guò)各種殺細(xì)菌劑和殺真菌劑，例如對(duì)羥基苯甲酸酯、異丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等來(lái)預(yù)防微生物的作用。在許多情況下，優(yōu)選包括等滲劑，例如，糖或氯化鈉?？梢酝ㄟ^(guò)在組合物中使用延遲吸收的試劑，例如硬脂酸鋁和明膠來(lái)延長(zhǎng)可注射組合物的吸收。在本發(fā)明的藥物組合物中，本發(fā)明的活性成分可以作為與常規(guī)藥物支持物的混合物以單位施用形式施用。合適的單位施用形式包括口服途徑形式，例如片劑、凝膠膠囊、粉末、顆粒和口服懸浮液或溶液、舌下和經(jīng)頰(buccal)施用形式、噴霧劑、移植物、皮下、透皮、局部、腹腔內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、真皮下、透皮、鞘內(nèi)和鼻內(nèi)施用形式以及直腸施用形式。

在一些實(shí)施方案中，il-20細(xì)胞因子拮抗劑與抗細(xì)菌劑(例如抗生素或抗病毒劑)一起向受試者施用。可以與拮抗劑共施用的合適的抗生素包括但不限于選自以下的至少一種抗生素：頭孢曲松、頭孢噻肟、萬(wàn)古霉素、美羅培南、頭孢吡肟、頭孢他啶、頭孢呋辛鈉、萘夫西林，苯唑西林、氨芐西林、替卡西林、替卡西林/克拉維酸(特美汀)、氨芐西林/舒巴坦(優(yōu)立新)、阿奇霉素、甲氧芐氨嘧啶-磺胺甲惡唑、克林霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、共殺素、阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸(力百汀)、頭孢呋辛、甲氧芐氨嘧啶/磺胺甲惡唑、阿奇霉素、克林霉素、雙氯西林、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、頭孢克肟、頭孢泊肟、洛拉卡比、頭孢羥氨芐、利福布丁、頭孢地尼和頭孢拉定。抗病毒劑的實(shí)例包括但不限于：阿昔洛韋、泛昔洛韋、伐昔洛韋、更昔洛韋、西多福韋；金剛烷胺、金剛乙胺；利巴韋林；扎那米韋和/或神經(jīng)氨酸酶抑制劑；蛋白酶抑制劑，例如茚地那韋、奈非那韋、利托那韋和/或沙奎那韋；核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，例如地丹諾辛、拉米夫定、司他夫定、扎西他賓、齊多夫定；非核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，例如奈韋拉平、依法韋侖。

聯(lián)合治療還可以包括呼吸興奮劑。糖皮質(zhì)激素在copd急性加重中可能是有益的?？梢耘c本發(fā)明的拮抗劑一起使用的糖皮質(zhì)激素的實(shí)例有：潑尼松龍、甲基潑尼松龍、地塞米松、萘非可特、地夫可特、鹵潑尼松醋酸酯、布地奈德、二丙酸倍氯米松、氫化可的松、曲安奈德、膚輕松、醋酸氟輕松、克羅科托龍戊酸、甲潑尼龍醋丙酯、地塞米松棕櫚酯、替潑尼旦、醋丙氫可的松、潑尼卡酯、二丙酸阿氯米松、鹵米松、甲潑尼龍磺庚酯、糠酸莫米松、瑞美松龍、法尼潑尼松龍、環(huán)索奈德、地潑羅酮丙酸酯、丙酸氟替卡松、丙酸鹵倍他索、氯替潑諾碳酸乙酯、丁酸丙酸倍他米松、氟尼縮松、潑尼松、地塞米松磷酸鈉、曲安奈德、倍他米松17-戊酸酯、倍他米松、二丙酸倍他米松、醋酸氫化可的松、氫化可的松琥珀酸鈉、潑尼松龍磷酸鈉和丁酸丙酸氫化可的松。本發(fā)明尤其優(yōu)選的糖皮質(zhì)激素有：地塞米松、布地奈德、倍氯米松、倍氯米松、曲安奈德、莫米松、環(huán)索奈德、氟替卡松、氟尼縮松、地塞米松磷酸鈉及其酯類，以及6α，9α-二氟-17α-[(2-呋喃羰基)氧]-11β-羥基-16α-甲基-3-氧代雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羧酸(s)-氟甲基酯。本發(fā)明更優(yōu)選的糖皮質(zhì)激素有：任選以其外消旋物、其對(duì)映異構(gòu)體、其非對(duì)映異構(gòu)體形式的布地奈德、二丙酸倍氯米松、糠酸莫米松、環(huán)索奈德、曲安奈德、醋酸曲安奈德、己曲安奈德和丙酸氟替卡松以及它們的混合物，以及任選的它們藥學(xué)上相容的酸加成鹽。甚至更優(yōu)選的是：布地奈德、二丙酸倍氯米松、糠酸莫米松、環(huán)索奈德和丙酸氟替卡松。本發(fā)明最優(yōu)選的糖皮質(zhì)激素是布地奈德和二丙酸倍氯米松。

急性加重期間可以增加支氣管擴(kuò)張劑的劑量以降低急性支氣管痙攣。支氣管擴(kuò)張劑的實(shí)例包括但不限于：β2-激動(dòng)劑(例如沙丁胺醇、雙甲苯喘定甲磺酸鹽、福莫特羅、異丙腎上腺素、左旋沙丁胺醇、奧西那林、沙美特羅、特布他林和非諾特羅)、抗膽堿能藥物(例如噻托溴銨或異丙托溴銨)、甲基黃嘌呤和酸二酯酶抑制劑。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的拮抗劑與疫苗一起向受試者施用，所述疫苗包含能夠針對(duì)病毒或細(xì)菌引起免疫反應(yīng)的抗原或抗原性組合物。通常，疫苗組合物用于針對(duì)至少一種選自以下的細(xì)菌引起免疫反應(yīng)：肺炎鏈球菌(streptococcuspneumoniae)、金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、伯克氏菌亞種(burkholderisssp.)、無(wú)乳鏈球菌(streptococcusagalactiae)、流感嗜血桿菌(haemophilusinfluenzae)、副流感嗜血桿菌(haemophilusparainfluenzae)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapneumoniae)、大腸桿菌(escherichiacoli)、銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)、卡他莫拉菌(moraxellacatarrhalis)、肺炎衣原體(chlamydophilapneumoniae)、肺炎支原體(mycoplasmapneumoniae)、嗜肺軍團(tuán)菌(legionellapneumophila)、粘質(zhì)沙雷氏菌(serratiamarcescens)、結(jié)核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis)、百日咳桿菌(bordetellapertussis)。具體地，疫苗組合物針對(duì)肺炎鏈球菌或流感嗜血桿菌。更具體地，疫苗組合物針對(duì)非典型流感嗜血桿菌(nthi)。通常，疫苗組合物一般包含全殺死或滅活(例如減毒)的細(xì)菌分離物。然而，包含外細(xì)胞膜和/或表明抗原或由外細(xì)胞膜和/或表明抗原組成的可溶或顆?？乖部梢赃m用，或替代全殺死微生物。在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，使用所選分離物的外細(xì)胞膜部分或膜蛋白。例如，nthiompp6是高度保守的16-kda脂蛋白(nelson，1988)，其是人殺菌性抗體的靶標(biāo)并在人和動(dòng)物模型中均誘導(dǎo)保護(hù)。在慢性阻塞性肺疾病(copd)中，已經(jīng)表明ompp6引起與不受nthi感染的相關(guān)保護(hù)有關(guān)的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)(abe，2002)。因此，ompp6或任何其他合適的外膜nthi蛋白、多肽(例如p2、p4和p26)或這種蛋白或多肽的抗原性片段可以應(yīng)用于nthi疫苗?？扇芎?或顆?？乖梢酝ㄟ^(guò)破壞殺死的或活的所選分離物來(lái)制備。然后可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的離心、過(guò)濾和/或其他合適的技術(shù)來(lái)制備用于疫苗的部分。可以使用實(shí)現(xiàn)所需的細(xì)胞破壞水平的任何方法，包括超聲處理或采用合適表面活性劑的溶解和攪拌，以及這些技術(shù)的組合。當(dāng)使用超聲處理時(shí)，可以使分離物經(jīng)歷大量超聲步驟以獲得所需程度的細(xì)胞破壞或產(chǎn)生特定大小或大小范圍的可溶和/或顆粒物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，疫苗組合物包括佐劑，尤其是tlr激動(dòng)劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，tlr激動(dòng)劑選自tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、tlr11、tlr12或tlr13激動(dòng)劑。

在一些實(shí)施方案中，氧需求可能增加，可以提供補(bǔ)充氧。

本發(fā)明將通過(guò)以下附圖和實(shí)施例進(jìn)一步闡述。然而，這些實(shí)施例和附圖不應(yīng)當(dāng)以任何方式理解為限制本發(fā)明的范圍。

附圖說(shuō)明

圖1.copd患者對(duì)肺炎鏈球菌(sp)具有不良反應(yīng)。通過(guò)elisa評(píng)估來(lái)自不吸煙健康受試者(對(duì)照)、吸煙健康受試者和copd患者的單核細(xì)胞的上清液中il-17和il-22的產(chǎn)生。結(jié)果以平均值±sem表示。*：p＜0.05vs對(duì)照。

圖2.il-19、il-20和il-24的表達(dá)被暴露至香煙煙霧(cs)和肺炎鏈球菌(sp)感染誘導(dǎo)，氣罩在野生型小鼠的肺中，這兩種刺激之間具有疊加效果。

圖3.人氣道上皮細(xì)胞(aec)beas-2b細(xì)胞中il-19和il-24的mrna表達(dá)被暴露至cs提取物(cse)誘導(dǎo)，而不被肺炎鏈球菌(sp1)感染誘導(dǎo)。以1/30或1/60稀釋添加ces(cse30vscse60)。

圖4.測(cè)量來(lái)自感染肺炎鏈球菌(sp1)并用同種型對(duì)照(igg)或抗il-20rβ抗體處理的copd小鼠的支氣管肺泡灌洗液(bal)和肺裂解物中的細(xì)菌負(fù)荷。在感染后3天收集bal和肺。

圖5.測(cè)量來(lái)自感染非典型流感嗜血桿菌(nthi)并用同種型對(duì)照(igg)或抗il-20rβ抗體處理的copd小鼠的支氣管肺泡灌洗液(bal)和肺裂解物中的細(xì)菌負(fù)荷。在感染后1天收集bal和肺。**：分別與暴露于空氣或cs(copd)的感染小鼠相比p＜0.01。

圖6.測(cè)量來(lái)自感染非典型流感嗜血桿菌(nthi)并用同種型對(duì)照(nthi+pbs)或抗il-20rβ抗體處理的copd小鼠的肺細(xì)胞中的il-22分泌。在感染后1天和2天收集肺細(xì)胞，并將其單獨(dú)在培養(yǎng)基中或在熱殺死細(xì)菌(hk)存在下于37℃孵育3天。

圖7.來(lái)自感染肺炎鏈球菌(sp1)并用同種型對(duì)照(igg)或抗il-20rβ抗體處理的copd小鼠的肺組織中編碼抗菌肽s100a8和reg3g的mrna表達(dá)。在感染后3天收集肺。

圖8.il-20細(xì)胞因子和抗il-20rβ抗體處理以不同方式調(diào)控單核細(xì)胞衍生的樹(shù)突狀細(xì)胞(mddc)響應(yīng)于肺炎鏈球菌活化(sp1)而引起t細(xì)胞產(chǎn)生il-17和il-22的能力。

具體實(shí)施方式

引言：細(xì)菌性并發(fā)癥是多種肺炎癥性疾病如copd中的常見(jiàn)特征。在copd患者中，急性加重主要與經(jīng)常由流感嗜血桿菌和肺炎鏈球菌引起的細(xì)菌感染相關(guān)。這些感染引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，其特征在于嗜中性粒細(xì)胞募集、增加促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生并加速疾病的進(jìn)展。需要適當(dāng)?shù)哪Ｐ蛠?lái)更好地確定在copd加重期間負(fù)責(zé)細(xì)菌易感性的機(jī)制。我們已經(jīng)通過(guò)在12周內(nèi)慢性暴露于香煙煙霧(cs)開(kāi)發(fā)了一種copd的鼠模型。這種暴露強(qiáng)烈地改變肺中的先天免疫應(yīng)答和不變的自然殺傷t(inkt)細(xì)胞的激活(pichavantm等，mucosalimmunol，2014)。為了更好地定義負(fù)責(zé)細(xì)菌易感性的機(jī)制，我們現(xiàn)在c57/bl6小鼠中開(kāi)發(fā)了copd加重的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，所述小鼠慢性暴露于cs，然后通過(guò)局部施用次致死劑量的流感嗜血桿菌和肺炎鏈球菌感染。

在copd小鼠中il-17和il-22對(duì)細(xì)菌感染的反應(yīng)改變：感染的copd小鼠患上強(qiáng)烈的sp肺部感染(與增加的炎癥反應(yīng)相關(guān))，而未處理小鼠能夠在24小時(shí)內(nèi)清除細(xì)菌。這種細(xì)菌清除的缺陷與bal中il-17和il-22的較低產(chǎn)生以及肺細(xì)胞的再刺激相關(guān)。il-17和il-22的缺陷與感染的copd小鼠的肺中比感染的空氣暴露小鼠降低的nk、nkt細(xì)胞和這些細(xì)胞因子陽(yáng)性的先天性淋巴樣細(xì)胞(ilc)的百分比有關(guān)。并且，補(bǔ)充重組il-22允許在copd小鼠中加速細(xì)菌清除并限制肺炎鏈球菌感染的后果。在copd小鼠中，流感嗜血桿菌感染與il-22生產(chǎn)缺陷有關(guān)，其涉及對(duì)sp觀察到的相同細(xì)胞(ilc、nk和nkt細(xì)胞)。由于il-22在流感嗜血桿菌感染中的作用未知，我們觀察到il-22-/-小鼠重現(xiàn)與copd小鼠接近的表現(xiàn)型(易感性增加、炎癥反應(yīng)更高和肺重塑)。這些數(shù)據(jù)表明，copd小鼠比對(duì)照小鼠易感染流感嗜血桿菌和肺炎鏈球菌，il-17和/或il-22的生產(chǎn)缺陷可能有利于細(xì)菌誘導(dǎo)的copd加重的發(fā)展。

在來(lái)自copd患者的單核細(xì)胞中il-17和il-22對(duì)細(xì)菌感染的反應(yīng)改變：盡管il-17和il-22的生產(chǎn)缺陷可能在copd期間對(duì)細(xì)菌感染的易感性起作用，沒(méi)有數(shù)據(jù)報(bào)道這些細(xì)胞因子在ae-copd患者的肺中的濃度。為預(yù)估copd患者對(duì)細(xì)菌反應(yīng)產(chǎn)生th17細(xì)胞因子的能力，我們首先分析了與健康吸煙者和非吸煙者相比，copd患者的血液?jiǎn)魏思?xì)胞(mnc)對(duì)肺炎鏈球菌的反應(yīng)。還通過(guò)添加植物血凝素(pha)包括mnc活化的陽(yáng)性對(duì)照。未刺激細(xì)胞中的細(xì)胞因子濃度在3個(gè)組中沒(méi)有明顯差異(圖1)。而兩種刺激均明顯增加非吸煙者(對(duì)照)和吸煙者中的il-17和il-22水平，暴露至sp沒(méi)有顯著增加copd患者中這些細(xì)胞因子的分泌。在copd患者中對(duì)pha的反應(yīng)也部分改變，主要是il-17和il-22。為鑒定對(duì)肺炎鏈球菌反應(yīng)的這些細(xì)胞因子的細(xì)胞來(lái)源，我們分析了這些mnc中il-17和il-22的細(xì)胞內(nèi)染色。與吸煙者和非吸煙者相比，il-17和il-22的生產(chǎn)在copd患者的lin-(潛在的ilc)、inkt和nk細(xì)胞中改變，而在tγδ細(xì)胞中不變(數(shù)據(jù)未顯示)。.

暴露至香煙煙霧之后和對(duì)細(xì)菌感染反應(yīng)的il-20細(xì)胞因子的生產(chǎn)：因?yàn)閕l-20細(xì)胞因子與il-22相關(guān)且它們的生產(chǎn)由一些細(xì)菌(金黃色葡萄球菌)誘導(dǎo)，我們?cè)谖覀兊膶?shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭性u(píng)估了這些細(xì)胞因子的表達(dá)。慢性暴露于cs之后，與對(duì)照(空氣暴露的動(dòng)物)相比，il-19和il-20的mrna表達(dá)在copd小鼠的肺中增加(圖2)。此外，用肺炎鏈球菌感染的空氣小鼠沒(méi)有產(chǎn)生il-19和il-24，而il-20mrna表達(dá)上調(diào)。即使我們將結(jié)果與未感染的copd小鼠相比，在copd小鼠中，肺炎鏈球菌感染顯著地增強(qiáng)了il-19、il-20和il-24的表達(dá)。

用非典型流感嗜血桿菌(nthi)感染后獲得類似結(jié)果，即，cs暴露和細(xì)菌感染對(duì)這些細(xì)胞因子的表達(dá)有疊加作用。

我們還分析了這些細(xì)胞因子在通過(guò)cs提取物(cse)和/或細(xì)菌體外活化的人樹(shù)突狀細(xì)胞(dc)和氣道上皮細(xì)胞(aec)中的表達(dá)。如圖3所示，sp1感染沒(méi)有顯著增加il-19和il-24的表達(dá)。相反，暴露至cse對(duì)單獨(dú)的兩種細(xì)胞因子或在肺炎鏈球菌存在下的兩種細(xì)胞因子具有強(qiáng)烈作用。用單細(xì)胞衍生的dc獲得類似結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。

copd期間對(duì)細(xì)菌感染反應(yīng)的il-20細(xì)胞因子的功能：因?yàn)閙ylesla等(natimmunol.2013)報(bào)道了經(jīng)由il-20受體的信號(hào)抑制il-17和il-22的產(chǎn)生以促進(jìn)皮膚感染，我們假設(shè)這些受體涉及在copd小鼠的細(xì)菌感染中觀察到的il-17和il-22反應(yīng)的缺陷。為證明這一點(diǎn)，我們使用了識(shí)別il-20rβ亞單元的中和抗體。該受體對(duì)于結(jié)合il-19、il-20或il-24的兩個(gè)受體(il-20rα/il-20rβ、il-22rα/il-20rβ)都是共同的。在感染前一天和后一天腹膜內(nèi)施用(50μg/注射/小鼠)該可商購(gòu)的抗體抗il-20rβ(識(shí)別人和小鼠的克隆20rntc)。對(duì)于這些初步實(shí)驗(yàn)，我們分析了細(xì)菌負(fù)荷和th17細(xì)胞因子的表達(dá)。

如圖4所示，阻斷抗il-20rβ抗體處理強(qiáng)烈降低了肺炎鏈球菌感染后bal和肺組織中的細(xì)菌負(fù)荷。流感嗜血桿菌感染后也獲得類似結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。相反，該處理對(duì)空氣感染的小鼠有中度作用或沒(méi)有作用，表明該抗體的活性與il-20r配體的表達(dá)水平相關(guān)。

平行地，我們?cè)u(píng)估了th17細(xì)胞因子在感染的copd小鼠的肺中的表達(dá)。如圖5所示，在用nthi感染后第1天和第2天，與接受同種型對(duì)照的小鼠相比，用抗il-20rb抗體處理的copd小鼠的肺細(xì)胞中檢測(cè)到il-22分泌增加。

結(jié)論：總之，這些數(shù)據(jù)突顯了對(duì)il20細(xì)胞因子拮抗劑(例如阻斷抗il-20rβ抗體)潛在地通過(guò)增加il-22的產(chǎn)生來(lái)限制copd小鼠對(duì)感染的易感性的興趣。

參考文獻(xiàn)

在本申請(qǐng)中，各種參考文獻(xiàn)描述了涉及本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域的現(xiàn)狀。這些參考文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容在此通過(guò)引用結(jié)合至本公開(kāi)。

pichavantm.，remy，g.，bakaert，s.，lerouzic，o.，kervoaze，g.，vilain，e.，tillie-leblond.，trottein，f.，gosset，p.2014.oxydative-stressedmediatedinktcellactivationisinvolvedincopdpathogenesis.mucosalimmunol，7(3)：568-78.

patent#ep13305916.2(28/062013).″methodsandpharmaceuticalcompositionsforthetreatmentofacuteexacerbationsofchronicobstructivepulmonarydisease″

davidtorres，audreydieudonné，bernhardryffel，mustaphasi-tahar，evavilain，murielpichavant，philippelassalle，trottein，andphilippegosset.doublestrandedrnaexacerbatespulmonaryallergicreactionthroughtoll-likereceptor3：implicationofairwayepitheliumanddendriticcells.jimmunol：2010；185(1)：451-9.

pichavant，m.，s.taront，p.jeannin，l.breuilh，a.s.charbonnier，c.sprier，c.fourneau，n.corvaia，l.heliot，a.brichet，a.b.tonnel，y.delneste，andp.gosset.2006.impactofbronchialepitheliumondendriticcellmigrationandfunction：modulationbythebacterialmotifkpompa.jimmunol177：5912-5919.

engelmanni.，mordacqc.，tillie-leblondi.，gossetp.，dewildea.，pouesselg，deschildrea.rhinovirusandasthma：re-infection，notpersistence.2013.amjrespircritcaremed，2013nov1；188(9)：1165-7.

mearjb，gossetp，kipnise，fauree，desseinr，jawharas，fradinc，faurek，poulaind，sendidb，gueryb.candidaalbicansairwayexposureprimesthelunginnateimmuneresponseagainstpseudomonasaeruginosainfectionthroughinnatelymphoidcellrecruitmentandil-22associatedmucosalresponse.infectimmun.2014jan；82(1)：306-15.

fauree，mearjb，faurek，normands，couturier-maillarda，grandjeant，balloyv，ryffelb，desseinr，chignardm，uyttenhovec，gueryb，gossetp，chamaillardm，kipnise.pseudomonasaeruginosatype-3secretionsystemdampenshostdefensebyexploitingthenlrc4-coupledinflammasome.amjrespircritcaremed，2014；i89：799-811.