本發(fā)明涉及基質(zhì)金屬蛋白酶產(chǎn)生抑制劑。
背景技術(shù)：
細(xì)胞外基質(zhì)(ecm：extracellularmatrix)為形成于動(dòng)物細(xì)胞周?chē)慕Y(jié)構(gòu)體，不僅填充細(xì)胞外間隙還具有固定、粘接各細(xì)胞的支架的作用。另外已知，細(xì)胞外基質(zhì)還參與生物體的日常性維持，還已知調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、移動(dòng)、細(xì)胞死亡等。作為主要的細(xì)胞外基質(zhì)，已知有膠原蛋白、纖連蛋白、蛋白多糖、層粘連蛋白等。
作為分解這些細(xì)胞外基質(zhì)的酶，有基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases以下稱為mmp)。mmp為在結(jié)構(gòu)和功能具有共通性的金屬要求性的中性蛋白酶，在細(xì)胞外和細(xì)胞膜上發(fā)揮功能。mmp由結(jié)構(gòu)上被良好保存的幾個(gè)域結(jié)構(gòu)構(gòu)成，以信號(hào)序列、活性中心區(qū)域和作為其控制區(qū)域的前肽區(qū)域?yàn)榛窘Y(jié)構(gòu)(非專利文獻(xiàn)1、非專利文獻(xiàn)2)
mmp中，mmp-1、mmp-8、mmp-13和mmp-18屬于膠原酶組，分解細(xì)胞外基質(zhì)中的i、ii和iii型膠原蛋白。已知的是，mmp-2和mmp-9屬于明膠酶組，除分解i、ii和iii型膠原蛋白之外，進(jìn)一步分解利用膠原酶等分解的膠原蛋白(變性膠原蛋白)，還參與作為基底膜的主要成分的iv型膠原蛋白的分解、彈性蛋白的分解。另外，mmp-3、10和11屬于溶基質(zhì)素組，分解層粘連蛋白、纖連蛋白、蛋白多糖等基質(zhì)蛋白質(zhì)。另外，存在具有與它們類似的結(jié)構(gòu)的具有彈性蛋白分解活性的金屬?gòu)椥缘鞍酌讣磎mp-12、屬于基質(zhì)溶解因子組的mmp-7、mmp-26等。另外已知，作為膜型mmp(mmt-mp)組的mmp-14、15、16和mmp-17、24、25具有跨膜區(qū)，均參與細(xì)胞外基質(zhì)分解。(非專利文獻(xiàn)1、非專利文獻(xiàn)2)
分解細(xì)胞外基質(zhì)成分的mmp的功能在生物體內(nèi)被非常嚴(yán)格地控制，以1)基因表達(dá)、2)前體向活性型的轉(zhuǎn)化、3)抑制因子對(duì)活性型mmp的結(jié)合等多階段進(jìn)行控制(非專利文獻(xiàn)1)。已知的是，mmp通過(guò)破壞細(xì)胞外基質(zhì)而在胚胎的產(chǎn)生和組織的分化、血管新生等中發(fā)揮作用，此外，還參與癌的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、關(guān)節(jié)炎、牙周病、組織的潰瘍形成(角膜潰瘍、胃潰瘍、或者表皮性潰瘍)(非專利文獻(xiàn)1、非專利文獻(xiàn)2)。
作為具有mmp的抑制效果的藥物，已知有cgs27023a(非專利文獻(xiàn)3)、膠原蛋白三肽(非專利文獻(xiàn)4)、黃酮類化合物(專利文獻(xiàn)1)、兒茶素化合物(專利文獻(xiàn)2)等。另外，作為具有mmp的產(chǎn)生抑制效果的物質(zhì)，已知有四棱豆提取物(專利文獻(xiàn)3)、四烯甲萘醌(專利文獻(xiàn)4)等。
然而，發(fā)現(xiàn)了，植物甾醇中具有環(huán)羊毛甾烷骨架的化合物、具有4-甲基-7-烯膽甾烷醇骨架的化合物中在動(dòng)脈硬化模型動(dòng)物中，有降低血中過(guò)氧化脂質(zhì)量的作用、有抑制胸部大動(dòng)脈的斑塊形成數(shù)量的作用，提出了作為抗氧化劑的用途(專利文獻(xiàn)5)。然而，對(duì)于這些化合物，與mmp的關(guān)系尚未知。
現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
非專利文獻(xiàn)
非專利文獻(xiàn)1：化學(xué)與生物，vol.35，no.12，p.816-818，1997
非專利文獻(xiàn)2：生物物理化學(xué)，vol.47，p.111-116，2003
非專利文獻(xiàn)3：journalofmedicinalchemistry,vol.40,p.2525-2532,1997
非專利文獻(xiàn)4：prevnutrfoodsci,vol.17,p.245-253,2012
專利文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)1：日本特開(kāi)平8-104628號(hào)公報(bào)
專利文獻(xiàn)2：日本特開(kāi)2000-226329號(hào)公報(bào)
專利文獻(xiàn)3：日本特開(kāi)2012-206984號(hào)公報(bào)
專利文獻(xiàn)4：國(guó)際公開(kāi)第2004/093858號(hào)
專利文獻(xiàn)5：國(guó)際公開(kāi)第2010/058795號(hào)
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
發(fā)明要解決的問(wèn)題
如專利文獻(xiàn)1～4中所記載那樣，提出了顯示出mmp抑制作用的原材料時(shí)，進(jìn)一步要求開(kāi)發(fā)出能夠安全攝取的原材料。
因此，本發(fā)明的課題在于，提供日常能夠安全攝取、能夠抑制mmp產(chǎn)生的功能性原材料；以及利用其的藥劑。
用于解決問(wèn)題的方案
解決前述課題的第一發(fā)明為一種基質(zhì)金屬蛋白酶產(chǎn)生抑制劑(以下，稱為“本發(fā)明的抑制劑”)，其含有選自由4-甲基-7-烯膽甾烷醇化合物和環(huán)羊毛甾烷化合物組成的組中的化合物作為有效成分。
本發(fā)明的優(yōu)選方案中，前述抑制劑包含總量為0.00001質(zhì)量％以上的前述化合物。
本發(fā)明的優(yōu)選方案中，前述化合物選自由4-甲基膽甾-7-烯-3-醇、4-甲基麥角甾-7-烯-3-醇、4-甲基豆甾-7-烯-3-醇、9,19-環(huán)羊毛甾烷-3-醇和24-亞甲基-9,19-環(huán)羊毛甾烷-3-醇組成的組中。
本發(fā)明的抑制劑對(duì)選自由基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、基質(zhì)金屬蛋白酶-12和基質(zhì)金屬蛋白酶-13組成的組中的基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生抑制是特別有效的。
另外，解決前述課題的第二發(fā)明為：選自由4-甲基-7-烯膽甾烷醇化合物和環(huán)羊毛甾烷化合物組成的組中的化合物在制造基質(zhì)金屬蛋白酶產(chǎn)生抑制劑中的應(yīng)用，前述化合物的優(yōu)選方案如前述。
另外，第二發(fā)明中包括以下方案。
包含總量為0.00001質(zhì)量％以上的選自由4-甲基-7-烯膽甾烷醇化合物和環(huán)羊毛甾烷化合物組成的組中的化合物的組合物在制造基質(zhì)金屬蛋白酶產(chǎn)生抑制劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明的優(yōu)選方案中，基質(zhì)金屬蛋白酶產(chǎn)生抑制劑為選自由基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、基質(zhì)金屬蛋白酶-12和基質(zhì)金屬蛋白酶-13組成的組中的基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生抑制劑。
第二發(fā)明包括如下方案：選自由4-甲基-7-烯膽甾烷醇化合物和環(huán)羊毛甾烷化合物組成的組中的化合物在制造用于預(yù)防或改善細(xì)胞外基質(zhì)的分解所引起的癥狀的藥物中的應(yīng)用。
另外，該方案中還包括以下方案。
組合物在制造用于預(yù)防或改善細(xì)胞外基質(zhì)的分解所引起的癥狀的藥物中的應(yīng)用，所述組合物含有總量為0.00001質(zhì)量％以上的選自由4-甲基-7-烯膽甾烷醇化合物和環(huán)羊毛甾烷化合物組成的組中的化合物。
另外，解決前述課題的第三發(fā)明為：選自由4-甲基-7-烯膽甾烷醇化合物和環(huán)羊毛甾烷化合物組成的組中的化合物用于抑制基質(zhì)金屬蛋白酶產(chǎn)生，前述化合物的優(yōu)選方案如前述。
本發(fā)明的優(yōu)選方案中，前述化合物用于抑制選自由基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、基質(zhì)金屬蛋白酶-12和基質(zhì)金屬蛋白酶-13組成的組中的基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生。
另外，前述化合物優(yōu)選用于預(yù)防或改善細(xì)胞外基質(zhì)的分解所引起的癥狀。
另外，解決前述課題的第四發(fā)明為含有總量為0.00001質(zhì)量％以上的選自由4-甲基-7-烯膽甾烷醇化合物和環(huán)羊毛甾烷化合物組成的組中的化合物的組合物用于抑制基質(zhì)金屬蛋白酶產(chǎn)生，前述化合物的優(yōu)選方案如前述。
第四發(fā)明中，前述組合物優(yōu)選為飲食品。
本發(fā)明的優(yōu)選方案中，前述組合物用于抑制選自由基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、基質(zhì)金屬蛋白酶-12和基質(zhì)金屬蛋白酶-13組成的組中的基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生。
另外，前述組合物優(yōu)選用于預(yù)防或改善細(xì)胞外基質(zhì)的分解所引起的癥狀。
另外，解決前述課題的第五發(fā)明為一種抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生的方法，其包括：將選自由4-甲基-7-烯膽甾烷醇化合物和環(huán)羊毛甾烷化合物組成的組中的化合物給予至需要抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生的對(duì)象，前述化合物的優(yōu)選方案如前述。
本發(fā)明的優(yōu)選方案中，基質(zhì)金屬蛋白酶選自由基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、基質(zhì)金屬蛋白酶-12和基質(zhì)金屬蛋白酶-13組成的組中。
另外，該方案中包括以下。
一種細(xì)胞外基質(zhì)的分解所引起的疾病或癥狀的改善或預(yù)防方法，其包括：將選自由4-甲基-7-烯膽甾烷醇化合物和環(huán)羊毛甾烷化合物組成的組中的化合物給予至具有細(xì)胞外基質(zhì)的分解所引起的疾病或癥狀的對(duì)象。
另外，第五發(fā)明以以下為優(yōu)選方案。
給予含有總量為0.00001質(zhì)量％以上的選自由4-甲基-7-烯膽甾烷醇化合物和環(huán)羊毛甾烷化合物組成的組中的化合物的組合物。
作為細(xì)胞外基質(zhì)的分解所引起的疾病或癥狀，可以舉出炎癥性疾病。另外，作為該疾病或癥狀，可以舉出：牙齦炎或牙周炎、組織潰瘍、皮膚疾病、關(guān)節(jié)炎、癌的浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移、子宮內(nèi)膜異位，前述化合物或包含該化合物的前述組合物對(duì)這些癥狀的預(yù)防或改善是特別有效的。
發(fā)明的效果
本發(fā)明的抑制劑可以安全服用，有效地抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生。本發(fā)明的抑制劑對(duì)關(guān)節(jié)炎、炎癥性疾病、牙周病、骨疾病、癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移、動(dòng)脈瘤疾病、角化不良癥、紫外線等所導(dǎo)致的皮膚炎癥疾病、皮膚老化等的預(yù)防或改善、治療是有用的。
附圖說(shuō)明
圖1為實(shí)施例1中的各組小鼠的細(xì)胞外基質(zhì)組織切片的光學(xué)顯微鏡照片。圖中，箭頭表示可見(jiàn)纖維斷裂的部位。
具體實(shí)施方式
接著，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選方案進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。但是，本發(fā)明不限定于以下的優(yōu)選方案，可以在本發(fā)明的范圍內(nèi)自由變更。需要說(shuō)明的是，本說(shuō)明書(shū)中，百分率只要沒(méi)有特別說(shuō)明，是基于質(zhì)量的表示。
本發(fā)明的抑制劑含有選自由4-甲基-7-烯膽甾烷醇化合物(化合物1)和環(huán)羊毛甾烷化合物(化合物2)組成的組中的化合物作為有效成分。化合物1和化合物2分別用以下的通式(1)和通式(2)表示。
化合物1
通式(1)中，r1為碳數(shù)5～16的直鏈狀或支鏈狀的烷基、或包含1個(gè)或2個(gè)雙鍵的烯基。另外，前述烷基或烯基可以為1個(gè)或2個(gè)氫原子被羥基和/或羰基所取代的取代烷基或取代烯基。
另外，r2、r3分別獨(dú)立地為氫原子或碳數(shù)1～3的烷基。此處，作為前述碳數(shù)1～3的烷基，優(yōu)選甲基、乙基等，特別優(yōu)選甲基。另外，前述烷基可以為至少1個(gè)氫原子被羥基和/或羰基所取代的取代烷基。
-ch2-oh
-ch2-cooh
-ch2-ch2-oh
-ch2-ch2-cooh
-ch(oh)-ch3
-ch(cooh)-ch3
另外，r4與構(gòu)成環(huán)的碳原子一起形成c＝o、或?yàn)?oh、-ococh3中的任一者。
前述通式(1)中，r1優(yōu)選為下述式所示的基團(tuán)中的任一者。
-ch2-ch2-ch(ch2-ch3)-ch(ch3)2
-ch2-ch2-ch＝c(ch3)2
-ch2-ch＝c(ch3)-ch(ch3)2
-ch2-ch2-c(＝ch-ch3)-ch(ch3)2
-ch2-ch2-ch(ra)＝c(ch3)rb
(其中，ra、rb為氫原子、羥基或甲基中的任一者)
-ch2-ch2-ch(rc)-ch(ch3)rd
(其中，rc、rd為氫原子、羥基或甲基中的任一者)
另外，前述通式(1)中，優(yōu)選r2和r3中的一者為氫原子、另一者為甲基，優(yōu)選r4為羥基。
作為化合物1，優(yōu)選可以舉出：4-甲基膽甾-7-烯-3-醇、4-甲基麥角甾-7-烯-3-醇和4-甲基豆甾-7-烯-3-醇。各化合物分別具有以下式所示的結(jié)構(gòu)。
4-甲基膽甾-7-烯-3-醇
4-甲基麥角甾-7-烯-3-醇
4-甲基豆甾-7-烯-3-醇
化合物1可以依據(jù)公知的制造方法以化學(xué)的方式制造。
例如，可以依據(jù)vitalimatyashetal.,plosbiology,volume2,issue10,e280,2004中記載的補(bǔ)充數(shù)據(jù)，進(jìn)行合成。
另外，公知的是，化合物1包含于植物，可以依據(jù)公知的4-甲基-7-烯膽甾烷醇的制造方法而制造(生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)法24、脂肪脂質(zhì)代謝實(shí)驗(yàn)法、山田晃弘著、學(xué)會(huì)出版中心、第174頁(yè)、1989年)。
例如，化合物1可以由已知包含化合物1的植物利用熱水提取法、有機(jī)溶劑提取法、超臨界提取法或亞臨界提取法等方法而進(jìn)行提取(例如參照日本專利第3905913號(hào)公報(bào))?；衔?例如可以從百合科、豆科、禾本科、茄科和芭蕉科的植物中提取。
前述那樣制造的化合物1例如可以通過(guò)質(zhì)譜(ms)法、和核磁共振光譜(nmr)法等而對(duì)其分子量、結(jié)構(gòu)等進(jìn)行鑒定或確認(rèn)。
另外，化合物1可以為藥物上允許的鹽。作為藥物上允許的鹽，包括金屬鹽(無(wú)機(jī)鹽)和有機(jī)鹽這兩者，它們的名單可以舉出：記載于“雷明頓藥學(xué)大全(remington'spharmaceuticalsciences)、第17版、1985年、第1418頁(yè)”中的物質(zhì)。
具體而言，非限定性地包括：鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、二磷酸鹽和氫溴酸鹽等無(wú)機(jī)酸鹽；蘋(píng)果酸鹽、馬來(lái)酸鹽、富馬酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、甲磺酸鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽、雙羥萘酸鹽、水楊酸鹽和硬脂酸鹽等有機(jī)酸鹽。
另外，也可以為鈉、鉀、鈣、鎂、鋁等金屬的鹽、與賴氨酸等氨基酸的鹽。另外，也可以使用前述化合物或其藥物上允許的鹽的水合物等溶劑化物。
化合物2
通式(2)中，r5為碳數(shù)6～8的直鏈狀或支鏈狀的烷基、包含1個(gè)或2個(gè)雙鍵的烯基。另外，前述烷基或烯基可以為1個(gè)或2個(gè)氫原子被羥基和/或羰基所取代的取代烷基或取代烯基。
另外，r6、r7分別獨(dú)立地為氫原子或甲基。另外，r8與構(gòu)成環(huán)的碳原子一起形成c＝o、或?yàn)橄率鍪街械娜我徽摺?/p>
ho——
前述通式(2)中，r5優(yōu)選為下述式所示的基團(tuán)中的任一者。
-ch2-ch2-ch2-ch(ch3)2
-ch2-ch2-chre-c(ch3)2rf
(re為氫原子、羥基或甲基，rf為氫原子或羥基)
-ch2-ch2-ch(ch2-ch3)-ch(ch3)2
-ch2-ch2-chrg-c(ch3)＝ch2
(rg為氫原子、羥基或甲基)
-ch2-ch2-c(＝o)-ch(ch3)＝ch2
-ch2-ch2-c(=ch2)-ch(ch3)2
-ch2-ch2-ch＝c(ch3)2
-ch3-ch2＝c(ch3)-ch(ch3)2
-ch2-ch2-c(＝ch-ch3)-ch(ch3)2
另外，前述通式(2)中，優(yōu)選r6和r7中的一者為氫原子、另一者為甲基，優(yōu)選r8為羥基。
作為化合物2，優(yōu)選可以舉出：9，19-環(huán)羊毛甾烷-3-醇和24-亞甲基-9，19-環(huán)羊毛甾烷-3-醇。各化合物分別具有以下式所示的結(jié)構(gòu)。
9,19-環(huán)羊毛甾烷-3-醇
24-亞甲基-9,19-環(huán)羊毛甾烷-3-醇
化合物2可以依據(jù)公知的制造方法以化學(xué)的方式制造。例如，24-亞甲基-9,19-環(huán)羊毛甾烷-3-醇(慣用名：24-亞甲基環(huán)木菠蘿烷醇)可以利用日本特開(kāi)昭57-018617號(hào)公報(bào)、國(guó)際公開(kāi)第2012/023599號(hào)(由γ-谷維素合成的方法)中公開(kāi)的方法而制造。另外，化合物2可以利用日本特開(kāi)2003-277269號(hào)公報(bào)中公開(kāi)的方法，以環(huán)木菠蘿烯醇阿魏酸酯的水解物為起始物質(zhì)而制造。
環(huán)木菠蘿烯醇阿魏酸酯
另外，已知化合物2也包含于百合科、豆科、禾本科、茄科和芭蕉科等植物(參照〔植物化學(xué)(phytochemistry)、美國(guó)、1977年、第16卷、第140～141頁(yè)〕、〔handbookofphytochemicalconstituentsofgrasherbsandothereconomicplants、1992年、美國(guó)、crcpress〕、或〔hager'shandbuchderpharmazeutischenpraxis、第2～6卷、1969～1979年、deutschland,springerverlag,berlin〕)。由此，化合物2可以由這些植物利用有機(jī)溶劑提取法或熱水提取法等公知的方法而提取(例如參照日本專利第3924310號(hào)公報(bào))。
前述那樣制造的化合物例如可以通過(guò)質(zhì)譜(ms)法和核磁共振光譜(nmr)法等而對(duì)其分子量、結(jié)構(gòu)等進(jìn)行鑒定或確認(rèn)。
另外，化合物2可以為藥物上允許的鹽。這樣的鹽如對(duì)于化合物1所示例。
本發(fā)明的抑制劑含有選自由化合物1和化合物2組成的組中的化合物作為有效成分。該化合物可以為1種也可以為多種。
作為單獨(dú)使用化合物1或化合物2的情況，優(yōu)選為化合物1(主要為4-甲基膽甾-7-烯-3-醇、4-甲基麥角甾-7-烯-3-醇、或4-甲基豆甾-7-烯-3-醇)、或化合物2(主要為9,19-環(huán)羊毛甾烷-3-醇或24-亞甲基-9,19-環(huán)羊毛甾烷-3-醇)中的任一者。
其中，從作為藥劑的有效成分使用的情況下考慮的溶解性等物性的方面出發(fā)，作為化合物1，特別優(yōu)選4-甲基膽甾-7-烯-3-醇；作為化合物2，特別優(yōu)選9,19-環(huán)羊毛甾烷-3-醇。
另外，將化合物1與化合物2對(duì)比時(shí)，更優(yōu)選為化合物1(主要為4-甲基膽甾-7-烯-3-醇、4-甲基麥角甾-7-烯-3-醇或4-甲基豆甾-7-烯-3-醇)。
另外，化合物1或化合物2各自中，可以使用1種化合物，也可以將多種化合物混合而使用。
本發(fā)明的抑制劑優(yōu)選含有選自由4-甲基膽甾-7-烯-3-醇、4-甲基麥角甾-7-烯-3-醇、4-甲基豆甾-7-烯-3-醇、9,19-環(huán)羊毛甾烷-3-醇和24-亞甲基-9,19-環(huán)羊毛甾烷-3-醇組成的組中的化合物作為有效成分。
本發(fā)明的抑制劑中的前述化合物的含量可以根據(jù)癥狀等而適當(dāng)選擇，總量?jī)?yōu)選為至少0.00001質(zhì)量％、更優(yōu)選為至少0.0001質(zhì)量％、進(jìn)一步優(yōu)選為至少0.0005質(zhì)量％、特別優(yōu)選為至少0.001質(zhì)量％。另外，本發(fā)明的抑制劑中的該量的上限沒(méi)有特別限制，可以舉出：總量為90質(zhì)量％以下、優(yōu)選為70質(zhì)量％以下、更優(yōu)選為50質(zhì)量％以下。
另外，本發(fā)明的抑制劑含有包含選自由化合物1和化合物2組成的組中的化合物的組合物作為有效成分。該化合物可以為1種也可以為多種。
作為這樣的組合物，例如可以舉出：由包含前述化合物1的植物得到的提取物、由包含化合物2的植物得到的提取物、和由包含化合物1和化合物2這兩者的植物得到的提取物、以及它們的混合物。
本發(fā)明的抑制劑優(yōu)選組合含有化合物1和化合物2這兩者。化合物1和化合物2分別為1種也可以為多種。這樣的方案中，可以使用包含化合物1和化合物2這兩者的組合物作為有效成分。作為該組合物，可以優(yōu)選舉出：由包含化合物1和化合物2這兩者的植物得到的提取物。
將化合物1和化合物2這兩者組合時(shí)，化合物1和化合物2的質(zhì)量比的范圍例如可以舉出以下。
化合物1：化合物2優(yōu)選為5：1～1：5、進(jìn)一步優(yōu)選為3：1～1：3、特別優(yōu)選為2：1～1：2。
本發(fā)明的抑制劑可以以藥物的形式使用。
本發(fā)明的抑制劑可以以口服的、或非口服的形式給予至包括人的哺乳動(dòng)物。
本發(fā)明的抑制劑對(duì)預(yù)防或改善由mmp的活性所產(chǎn)生的、細(xì)胞外基質(zhì)的分解所引起的癥狀是有效的。
本發(fā)明中，作為細(xì)胞外基質(zhì)的分解所引起的癥狀、疾病，可以舉出：關(guān)節(jié)炎、退化性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性關(guān)節(jié)炎、牙周病、異域性脈管形成、癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移、子宮內(nèi)膜異位、潰瘍形成、骨疾病、血管再閉塞、血管再狹窄、hiv感染癥、糖尿病并發(fā)癥、動(dòng)脈硬化、動(dòng)脈瘤疾病、急性大動(dòng)脈瘤解離、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊解剖、心肌梗塞、心力衰竭、組織潰瘍、創(chuàng)傷、皮膚病、水皰癥中的水皰形成、角化不良癥、紫外線等所導(dǎo)致的皮膚炎等皮膚障礙、皮膚表皮的肥厚·皺紋形成·發(fā)暗等皮膚老化、皮膚彈力性的降低、皮膚基底膜的破壞、腫瘤脈管形成、年齡所導(dǎo)致的黃斑變性、纖維癥、依賴于移動(dòng)性炎癥細(xì)胞的炎癥性疾病、炎癥性腸疾病、角膜潰瘍、蛋白尿、水皰癥、營(yíng)養(yǎng)障礙型表皮水皰癥、炎癥性應(yīng)答中導(dǎo)入的癥狀、mmp活性所導(dǎo)致的骨減少癥、骨質(zhì)疏松癥、下頜關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘病、伴隨著腫瘤轉(zhuǎn)移或外傷性關(guān)節(jié)傷害的退行性軟骨損失、來(lái)自于粥狀硬化性斑塊破碎的冠狀動(dòng)脈血栓癥、避孕、肺氣腫、或慢性閉塞性肺疾病、褥瘡、術(shù)后創(chuàng)傷治愈期間的延遲、慢性創(chuàng)傷、肥胖者的皮膚炎癥·真皮的結(jié)構(gòu)變化。
本發(fā)明的抑制劑對(duì)預(yù)防或改善前述癥狀中的一個(gè)或多個(gè)癥狀是有效的。
本發(fā)明的抑制劑對(duì)預(yù)防或改善選自由屬于明膠酶組的mmp即mmp-2、mmp-9、金屬?gòu)椥缘鞍酌讣磎mp-12、和屬于膠原酶組的mmp-13組成的組中的任一者的mmp的活性所引起的癥狀是特別有效的。
例如，作為mmp-2的活性所引起的癥狀，特別是可以舉出：癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移、子宮內(nèi)膜異位、炎癥性腸疾病、表皮基底膜的破壞、褥瘡等。
作為mmp-9的活性引起的癥狀，特別是可以舉出：皮膚表皮的肥厚和皺紋的形成、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急性大動(dòng)脈解離、水皰癥等。
作為mmp-12的活性所引起的癥狀，特別是可以舉出：關(guān)節(jié)炎、肺氣腫、動(dòng)脈瘤、動(dòng)脈硬化、慢性閉塞性肺疾病等。
另外，作為mmp-13的活性所引起的癥狀，特別是可以舉出：退化性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、牙周炎、多發(fā)性硬化癥、牙齦炎、角膜表皮性潰瘍、褥瘡、胃潰瘍、動(dòng)脈粥樣硬化、動(dòng)脈硬化性閉塞處理后的血管再狹窄或缺血性心力衰竭等。
本發(fā)明的抑制劑對(duì)炎癥性疾病的改善或預(yù)防是特別有用的。作為炎癥性疾病，例如可以舉出：牙齦炎或牙周炎、組織潰瘍、皮膚炎、關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸疾病等。
作為組織潰瘍，可以舉出：角膜潰瘍、表皮性潰瘍、胃潰瘍、潰瘍性大腸炎等。
另外，對(duì)皮膚疾病的改善或預(yù)防也是有用的。作為皮膚疾病，可以舉出：皮膚炎、皮膚表皮的肥厚、創(chuàng)傷、角化不良癥、水皰癥、褥瘡、術(shù)后創(chuàng)傷治愈期間的延遲、慢性創(chuàng)傷、肥胖者的皮膚炎癥·真皮的結(jié)構(gòu)變化等。
本發(fā)明的抑制劑對(duì)預(yù)防或改善mmp-2的活性所引起的癥狀是特別有效的。
本發(fā)明的抑制劑的形態(tài)沒(méi)有特別限定，可以根據(jù)用法而適當(dāng)選擇。具體而言，可以舉出：片劑、丸劑、散劑、溶液劑、懸浮劑、乳劑、顆粒劑、膠囊劑、糖漿劑、栓劑、注射劑、軟膏劑、貼劑、滴眼劑、滴鼻劑等。
本發(fā)明的抑制劑的給予時(shí)期沒(méi)有特別限定，可以根據(jù)對(duì)象疾病而適當(dāng)選擇。另外，給予量?jī)?yōu)選根據(jù)制劑形態(tài)、用法、患者的年齡、性別、其他條件、癥狀的程度等而確定。
本發(fā)明的抑制劑的給予量根據(jù)用法、患者的年齡、性別、疾病的程度、其他條件等而適當(dāng)選擇。通常，換算為有效成分的量，以優(yōu)選0.0001～100mg/天、更優(yōu)選0.001～50mg/天、特別優(yōu)選0.01～10mg/天的范圍為目標(biāo)。
本發(fā)明的抑制劑可以含有藥物中通用的添加劑。作為添加劑，可以舉出：賦型劑、粘合劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、穩(wěn)定劑、矯味矯臭劑、稀釋劑、表面活性劑、注射劑用溶劑等。
本發(fā)明的抑制劑可以通過(guò)以前述化合物為有效成分配合于藥物用載體而制造。本發(fā)明的抑制劑例如可以通過(guò)將前述化合物與前述添加劑一起進(jìn)行制劑化而制造。
另外，本發(fā)明的抑制劑也可以如下制造：以包含前述化合物的公知的植物等為原料，將通過(guò)利用熱水、各種溶劑的提取、超臨界提取、亞臨界提取而得到的提取物與前述添加劑一起進(jìn)行制劑化，從而制造。
特別是，以前述特定的質(zhì)量比的范圍包含化合物1和化合物2的本發(fā)明的抑制劑可以通過(guò)以前述質(zhì)量比的范圍混合各化合物而制造。另外，這樣的藥物也可以如下制造：以包含化合物1和化合物2的公知的植物等為原料，利用使用各種溶劑的提取、超臨界提取、亞臨界提取等方法而制造。
本發(fā)明的抑制劑例如可以由百合科、豆科、禾本科、茄科和芭蕉等的植物得到。
本發(fā)明的抑制劑以前述化合物作為有效成分發(fā)揮功能，具有基于mmp的活性的細(xì)胞外基質(zhì)的分解所引起的癥狀的預(yù)防或改善作用。特別是，對(duì)基于選自由mmp-2、mmp-9、mmp-12和mmp-13組成的組中的任一者的mmp的活性的細(xì)胞外基質(zhì)的分解所引起的癥狀的預(yù)防或改善是有效的。
本發(fā)明的抑制劑對(duì)基于mmp-2的活性的細(xì)胞外基質(zhì)的分解所引起的癥狀的預(yù)防或改善是特別有效的。
本發(fā)明的抑制劑通過(guò)與飲食品中能夠使用的原料混合，從而也可以加工為飲食品。本發(fā)明中，“飲食品”中，除了人攝取的飲食品之外，還包括除人之外的動(dòng)物攝取的飼料。
制造飲食品時(shí)，這些中的前述化合物的量以總量計(jì)優(yōu)選為至少0.00001質(zhì)量％、更優(yōu)選為至少0.0001質(zhì)量％、進(jìn)一步優(yōu)選為至少0.0005質(zhì)量％、特別優(yōu)選為至少0.001質(zhì)量％。另外，本發(fā)明的飲食品中的該量的上限沒(méi)有特別限制，可以舉出：以總量計(jì)為90質(zhì)量％以下、優(yōu)選為70質(zhì)量％以下、更優(yōu)選為50質(zhì)量％以下。
另外，飲食品中的前述化合物的量可以根據(jù)其形態(tài)，設(shè)為適于以總量計(jì)優(yōu)選為0.0001～100mg/天、更優(yōu)選為0.001～50mg/天、特別優(yōu)選為0.01～10mg/天的范圍攝取前述化合物的量。因此，本發(fā)明的飲食品的優(yōu)選方案之一為，以總量?jī)?yōu)選0.0001～100mg/天、更優(yōu)選0.001～50mg/天、特別優(yōu)選0.01～10mg/天攝取前述化合物的方式使用的飲食品。
前述飲食品優(yōu)選為保健功能食品?！氨＝」δ苁称贰笔侵?，直接或間接表示疾病的預(yù)防效果、或疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的降低效果的食品；和，作為以企業(yè)家的責(zé)任基于科學(xué)根據(jù)在商品包裝上表示功能性的產(chǎn)品，向消費(fèi)者事務(wù)機(jī)構(gòu)(consumeraffairsagency)申報(bào)的食品。例如，目前日本，可以舉出：以特定保健用食品、功能性表示食品、健康輔助食品等的形式銷售的食品。
作為前述飲食品的形態(tài)，沒(méi)有特別限制，從效率良好地?cái)z取前述化合物的觀點(diǎn)出發(fā)，特別優(yōu)選清涼飲料、碳酸飲料、營(yíng)養(yǎng)飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料等飲料(包括這些飲料的濃縮原液和調(diào)制用粉末)。
另外，作為功能性飲食品的形態(tài)，從攝取者容易把握有效成分的攝取量的方面出發(fā)，優(yōu)選顆粒狀、片狀或液態(tài)的補(bǔ)充物。
另外，還優(yōu)選為這樣的功能性飲食品上帶有“用于抑制基質(zhì)金屬蛋白酶產(chǎn)生”、“用于細(xì)胞外基質(zhì)保護(hù)”的用途的表示的形態(tài)。即，本發(fā)明的飲食品例如優(yōu)選以帶有“用于細(xì)胞外基質(zhì)保護(hù)”的用途的、含有選自由化合物1和化合物2組成的組中的化合物作為有效成分的、用于預(yù)防或改善基質(zhì)金屬蛋白酶活性所引起的癥狀的飲食品的形式被銷售。
前述“表示”包括：具有使需要者已知前述用途的功能的全部表示。即，只要為能夠想起·類推前述用途的表示即可，不限定于表示的目的、表示的內(nèi)容、表示的對(duì)象物·介質(zhì)等如何，全部屬于前述“表示”。
另外，前述“帶有表示”是指，存在前述表示、和想要使飲食品(制品)建立相關(guān)性而認(rèn)識(shí)的表示行為。
表示行為優(yōu)選需要者能夠直接認(rèn)識(shí)前述用途。具體而言，可以舉出：本發(fā)明的飲食品的商品或商品的包裝上的前述用途的記載行為、關(guān)于商品的廣告、價(jià)格表或交易文件(包括利用電磁方法而提供的交易文件)上的前述用途的記載行為。
另一方面，作為所表示的內(nèi)容(表示內(nèi)容)，優(yōu)選為由行政等認(rèn)可的表示(例如，基于行政規(guī)定的各種制度受到認(rèn)可、以基于這樣的認(rèn)可的形式進(jìn)行的表示)。
例如可以舉出：健康食品、功能性飲食品、經(jīng)腸營(yíng)養(yǎng)食品、特別用途食品、保健功能食品、特定保健用食品、營(yíng)養(yǎng)功能食品、功能性表示食品、藥物用部外品等的表示。特別是，由消費(fèi)者事務(wù)機(jī)構(gòu)認(rèn)可的表示，例如可以舉出：特定保健用食品制度、與其類似的制度中認(rèn)可的表示。作為后者的例子，可以舉出：作為特定保健用食品的表示、作為帶條件的特定保健用食品的表示、對(duì)身體的結(jié)構(gòu)、功能有影響的意思的表示、疾病風(fēng)險(xiǎn)降低表示等，詳細(xì)而言，可以舉出：作為健康增進(jìn)法施行規(guī)則(平成15年4月30日日本國(guó)厚生勞動(dòng)省令第86號(hào))中規(guī)定的特定保健用食品的表示(特別是保健的用途的表示)、和與其類似的表示作為典型的例子。
表示前述用途的語(yǔ)句不限定于“用于抑制基質(zhì)金屬蛋白酶產(chǎn)生”、“用于細(xì)胞外基質(zhì)保護(hù)”的語(yǔ)句，即使為除此之外的語(yǔ)句，只要為表現(xiàn)預(yù)防、改善細(xì)胞外基質(zhì)的分解所引起的癥狀的作用或效果的語(yǔ)句，就當(dāng)然包含于本發(fā)明的范圍。
另外，本發(fā)明的飲食品在前述用途的表示的基礎(chǔ)上，還優(yōu)選包含前述有效成分的表示、進(jìn)而表示前述用途與前述有效成分的相關(guān)性的表示。
前述飲食品可以通過(guò)配合選自化合物1和化合物2中的化合物作為有效成分而制造。本發(fā)明的飲食品例如可以通過(guò)將前述化合物混合至飲食品原料并加工而制造。
另外，前述飲食品也可以如下制造：以包含前述化合物的公知的植物等為原料，將利用熱水、各種溶劑的提取、超臨界提取、亞臨界提取而得到的提取物與飲食品原料一起進(jìn)行加工，從而制造。
另外，使前述飲食品的形態(tài)為顆粒狀、片狀或液態(tài)的補(bǔ)充物時(shí)，還優(yōu)選的是，將作為有效成分的前述化合物與例如乳果糖、麥芽糖醇、和乳糖醇等糖類、和除此之外的糖類、例如糊精、淀粉等；明膠、大豆蛋白、玉米蛋白等蛋白質(zhì)；丙氨酸、谷氨酰胺、異亮氨酸等氨基酸類；纖維素、阿拉伯膠等多糖類；大豆油、中鏈脂肪酸三甘油酯等油脂類等一起進(jìn)行制劑化。
實(shí)施例
接著，示出實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明不限定于以下的實(shí)施例。
[制造例1]
(4-甲基-7-烯膽甾烷醇化合物(化合物1)的制造)
使用均化器，將蘆薈的葉肉(透明凝膠部分)100kg進(jìn)行液態(tài)化，向其中添加100l的乙酸乙酯/丁醇(3：1)混合液并攪拌。放置一晩后，分液為乙酸乙酯/丁醇混合液與水層，將乙酸乙酯/丁醇混合液回收。將該乙酸乙酯/丁醇混合液在減壓下濃縮。回收的乙酸乙酯/丁醇混合液提取物的質(zhì)量為13.5g。
在填充有硅膠60(merck&co.,inc.制)400g的柱中，使1ml的氯仿/甲醇(1：1)混合液中溶解有該提取物13g的溶液通液，吸附于柱后，使用氯仿/甲醇混合液(氯仿：甲醇＝100：1、25：1、10：1、5：1和1：1的各混合比)，通過(guò)使甲醇濃度階段性上升的逐步梯度法(tepwisegradientmethod)進(jìn)行洗脫，根據(jù)每個(gè)前述混合液的混合比分級(jí)洗脫液。這些餾分中，用正相和反相薄層色譜法(merck&co.,inc.制、硅膠60f254和rp-18f2543)確認(rèn)了用氯仿：甲醇＝25：1洗脫的餾分中存在本發(fā)明的4-甲基-7-烯膽甾烷醇化合物。
去除該餾分的溶劑后，溶解于1ml的氯仿/甲醇(1：1)混合液，向填充有100g硅膠60的柱中通液，吸附于柱后，用己烷/乙酸乙酯(4：1)混合液1100ml洗脫。將洗脫餾分依次分取各300ml(餾分a)、300ml(餾分b)、500ml(餾分c)。
用正相和反相薄層色譜法確認(rèn)到本發(fā)明的化合物1即4-甲基-7-烯膽甾烷醇化合物濃縮于餾分a，進(jìn)而，使用安裝有cosmosilc18(nacalaitesque,inc.制)的hplc，用氯仿/己烷(85：15)混合液分離，分別得到1.3mg、1.2mg、1mg的4-甲基膽甾-7-烯-3-醇、4-甲基麥角甾-7-烯-3-醇和4-甲基豆甾-7-烯-3-醇。各化合物的結(jié)構(gòu)用質(zhì)譜(ms)分析和nmr確認(rèn)。
[制造例2]
(環(huán)羊毛甾烷化合物(化合物2)的制造)
向γ-谷維素(oryzaoil&fatchemicalco.,ltd.制)8.0g中加入蒸餾水250ml、氫氧化鈉50g、異丙醇150ml、乙醇150ml、甲醇150ml，使用夾套式電阻加熱器進(jìn)行2小時(shí)加熱回流。反應(yīng)后，向1300ml的水中添加反應(yīng)液，將生成的白色析出物抽濾，得到固體物。為了清洗殘留的堿，使所得殘?jiān)鼞腋∮?000ml的水中后，再次進(jìn)行抽濾。重復(fù)該操作2次，使最終殘?jiān)鋬鰷p壓干燥，從而得到谷維素水解物5.91g。對(duì)該水解物利用hplc進(jìn)行純化，得到2435mg的環(huán)阿屯醇、和1543mg的24-亞甲基-9,19-環(huán)羊毛甾烷-3-醇(化合物2)。
接著，使用所得環(huán)阿屯醇，進(jìn)行9,19-環(huán)羊毛甾烷-3-醇(化合物2)的合成。
投入環(huán)阿屯醇302mg、異丙醇150ml、和粉末狀的5％鈀負(fù)載碳催化劑1.0g，將其在高壓釜內(nèi)密閉，用氮?dú)庵脫Q后，邊施加3kg/cm2的壓力邊導(dǎo)入氫氣。邊攪拌邊加熱，在達(dá)到50℃時(shí)，使氫氣的壓力為5kg/cm2，補(bǔ)充吸收的氫氣，從而邊保持壓力邊使其反應(yīng)6小時(shí)。對(duì)于反應(yīng)液，通過(guò)過(guò)濾去除催化劑，濃縮后，通過(guò)硅膠柱色譜法(展開(kāi)溶劑：氯仿100％)進(jìn)行純化，得到9,19-環(huán)羊毛甾烷-3-醇275mg。
[制造例3]
(添加有4-甲基-7-烯膽甾烷醇化合物與環(huán)羊毛甾烷化合物的混合物的試樣的調(diào)制)
使用由上述制造例1得到的、4-甲基膽甾-7-烯-3-醇、4-甲基麥角甾-7-烯-3-醇和4-甲基豆甾-7-烯-3-醇、以及由制造例2得到的、9,19-環(huán)羊毛甾烷-3-醇和24-亞甲基-9,19-環(huán)羊毛甾烷-3-醇，得到4-甲基-7-烯膽甾烷醇化合物和環(huán)羊毛甾烷化合物的質(zhì)量比成為4-甲基-7-烯膽甾烷醇化合物(化合物1)：環(huán)羊毛甾烷化合物(化合物2)＝1：1的混合物。
使用羧甲基纖維素(cmc：第一工業(yè)制藥株式會(huì)社制)，使4-甲基-7-烯膽甾烷醇化合物與環(huán)羊毛甾烷化合物的混合物分散，制作10000倍稀釋的粉末。將這些粉末2％添加至ain93g飼料，調(diào)制試驗(yàn)試樣。
即，制造含有總量為0.00002質(zhì)量％的化合物1(4-甲基-7-烯膽甾烷醇化合物)和化合物2(環(huán)羊毛甾烷化合物)的試驗(yàn)試樣。
[實(shí)施例1]
本實(shí)施例中，對(duì)相對(duì)于基于紫外線照射的mmp表達(dá)量的增加的、含有化合物1和化合物2的組合物對(duì)mmp表達(dá)的變化帶來(lái)的影響進(jìn)行了解析。
(1)試樣的調(diào)制
本實(shí)施例中，使用前述制造例3中調(diào)制的試驗(yàn)試樣。需要說(shuō)明的是，作為對(duì)照試樣(對(duì)照)，使用動(dòng)物用飼料ain93g。
(2)試驗(yàn)方法
將8周齡無(wú)毛小鼠(hr-1小鼠)每6只設(shè)為1組，邊對(duì)共計(jì)2組分別給予對(duì)照試樣或試驗(yàn)試樣邊飼養(yǎng)共計(jì)8周。
自飼養(yǎng)開(kāi)始2周后，向紫外線照射裝置中投入無(wú)毛小鼠，以3次/周的頻率照射uvb。每1次的照射量自48mj/cm2開(kāi)始，階段性地增加至200mj/cm2，最終的總照射量設(shè)為合計(jì)2.3j/cm2。uvb照射開(kāi)始第6周，將各組的無(wú)毛小鼠解剖，采集背部皮膚組織，制作細(xì)胞外基質(zhì)組織切片。使用光學(xué)顯微鏡(olympus株式會(huì)社)觀察該組織切片，確認(rèn)真皮層的細(xì)胞外基質(zhì)(彈性纖維)的片段化、取向。另外，對(duì)于不進(jìn)行uvb的照射的用對(duì)照試樣飼養(yǎng)的uvb非照射小鼠也同樣地觀察組織切片。
(3)試驗(yàn)結(jié)果
將光學(xué)顯微鏡照片示于圖1。由圖1表明，對(duì)照試樣組中，觀察到真皮層的彈性纖維的顯著的片段化，但試驗(yàn)試樣組中，真皮層的彈性纖維片段化被抑制。由此表明，利用紫外線照射而真皮層的彈性纖維被片段化的狀態(tài)下，通過(guò)攝取包含化合物1和化合物2的組合物，可以抑制真皮層的彈性纖維片段化(皮膚組織的細(xì)胞外基質(zhì)片段化抑制)。
[實(shí)施例2]
本試驗(yàn)中，對(duì)基于包含化合物1和化合物2的組合物的mmp-2、和mmp-9的產(chǎn)生抑制效果進(jìn)行了確認(rèn)。
(1)試驗(yàn)方法
將自japanslc,inc.購(gòu)入的8周齡雌無(wú)毛小鼠每6只設(shè)為1組，分為共計(jì)3組，邊對(duì)各組給予作為陰性對(duì)照試樣(ain93gorientalyeastco.,ltd.)、陽(yáng)性對(duì)照試樣的在動(dòng)物用飼料ain93g中添加有0.6質(zhì)量％的膠原蛋白的膠原蛋白試樣、和試驗(yàn)試樣，邊飼養(yǎng)共計(jì)8周。另外，給予與它們不同的陰性對(duì)照試樣，設(shè)置未進(jìn)行紫外線照射的uvb非對(duì)照組1組，作為比較對(duì)象。
自飼養(yǎng)開(kāi)始2周后，向紫外線照射裝置中投入無(wú)毛小鼠，以3次/周的頻率進(jìn)行照射。每1次的照射量自48mj/cm2開(kāi)始，階段性地增加至200mj/cm2，最終的照射量設(shè)為合計(jì)2.3j/cm2。
在uvb的照射開(kāi)始第6周解剖，采集背部皮膚組織，在液氮中冷凍后，用multibeadsshocker(安井器械)搗碎，使用cellyticmt(sigma-aldrich公司)提取蛋白質(zhì)。使用mmp-2檢測(cè)試劑盒(raybio公司)和mmp-9檢測(cè)試劑盒(r&dsystems公司)檢測(cè)提取的蛋白質(zhì)中的mmp-2和mmp-9蛋白表達(dá)量。
(2)試驗(yàn)結(jié)果
將結(jié)果示于表1和表2。表中的mmp蛋白質(zhì)表達(dá)相關(guān)的數(shù)值是基于檢測(cè)試劑盒的通過(guò)elisa法測(cè)定的實(shí)測(cè)值。另外，表中的p值表示基于dunnett法的顯著性概率。由表表明，照射了uvb的對(duì)照試樣組中，mmp-2(表1)和mmp-9(表2)的表達(dá)量均大于uvb非照射組。另一方面，試驗(yàn)試樣組中，與對(duì)照試樣組相比，其表達(dá)量被顯著抑制。另一方面，作為陽(yáng)性對(duì)照的膠原蛋白試樣組中，沒(méi)有確認(rèn)到mmp-2和mmp-9表達(dá)增加的顯著的抑制效果。
[表1]
(表1)
[表2]
(表2)
另外，對(duì)于單獨(dú)含有0.00002質(zhì)量％的上述化合物1的試驗(yàn)試樣、和單獨(dú)含有0.00002質(zhì)量％的化合物2的試驗(yàn)試樣也同樣地確認(rèn)了效果，結(jié)果，任意試驗(yàn)試樣分別對(duì)mmp-2、mmp-9均顯示出與上述試驗(yàn)試樣同樣的抑制效果。
由此表明，化合物1或化合物2分別單獨(dú)對(duì)mmp-2和mmp-9顯示出抑制作用。
另外，制造例3中，對(duì)含有總量0.00001質(zhì)量％的化合物1和化合物2的試驗(yàn)試樣、單獨(dú)含有0.00001質(zhì)量％的化合物1的試驗(yàn)試樣、和單獨(dú)含有0.00001質(zhì)量％的化合物2的試驗(yàn)試樣也同樣地確認(rèn)了效果，結(jié)果任意試驗(yàn)試樣分別對(duì)mmp-2、mmp-9顯示出與上述試驗(yàn)試樣同樣的抑制效果。
[實(shí)施例3]
本試驗(yàn)中，對(duì)基于包含化合物1和化合物2的組合物的mmp-12、和mmp-13的產(chǎn)生抑制效果進(jìn)行了確認(rèn)。
(1)試驗(yàn)方法
將自japanslc,inc.購(gòu)入的8周齡雌無(wú)毛小鼠每6只設(shè)為1組，分為共計(jì)2組，邊對(duì)各組給予陰性的對(duì)照試樣(ain93gorientalyeastco.,ltd.)、和試驗(yàn)試樣，邊飼養(yǎng)共計(jì)8周。另外，給予與它們不同的陰性的對(duì)照試樣，設(shè)置未進(jìn)行紫外線照射的uvb非對(duì)照組1組，作為比較對(duì)象。
自飼養(yǎng)開(kāi)始2周后，向紫外線照射裝置中投入無(wú)毛小鼠，以3次/周的頻率進(jìn)行照射。每1次的照射量自50mj/cm2開(kāi)始，階段性地增加至200mj/cm2，最終的照射量設(shè)為合計(jì)3.1j/cm2。
在uvb的照射開(kāi)始第6周解剖，采集背部皮膚組織，在液氮中冷凍后，用multibeadsshocker(安井器械)搗碎，使用cellyticmt(sigma-aldrich公司)提取蛋白質(zhì)。使用mmp-12檢測(cè)試劑盒(cloud-clone公司)和mmp-13檢測(cè)試劑盒(cloud-clone公司)檢測(cè)提取的蛋白質(zhì)中的mmp-12和mmp-13蛋白表達(dá)量。
(2)試驗(yàn)結(jié)果
將結(jié)果示于表3和表4。表中的mmp蛋白質(zhì)表達(dá)相關(guān)的數(shù)值是基于檢測(cè)試劑盒的通過(guò)elisa法測(cè)定的實(shí)測(cè)值。另外，表中的p值表示基于dunnett法的顯著性概率。其結(jié)果，由表表明，照射了uvb的陰性對(duì)照試樣組中，mmp-12(表3)、mmp-13(表4)的表達(dá)量均相對(duì)于uvb非照射組顯著增加。另一方面，試驗(yàn)試樣組中，與對(duì)照試樣相比，特別是mmp-12中，表達(dá)量被顯著抑制。
另外，對(duì)于單獨(dú)含有0.00002質(zhì)量％的上述化合物1的試驗(yàn)試樣、和單獨(dú)含有0.00002質(zhì)量％的化合物2的試驗(yàn)試樣也同樣地確認(rèn)了效果，結(jié)果，任意試驗(yàn)試樣分別對(duì)mmp-12mmp-13均顯示出與上述試驗(yàn)試樣同樣的抑制效果。
由此表明，化合物1或化合物2分別單獨(dú)對(duì)mmp-12和mmp-13顯示出抑制作用。
另外，制造例3中，對(duì)含有總量0.00001質(zhì)量％的化合物1和化合物2的試驗(yàn)試樣、單獨(dú)含有0.00001質(zhì)量％的化合物1的試驗(yàn)試樣、和單獨(dú)含有0.00001質(zhì)量％的化合物2的試驗(yàn)試樣也同樣地確認(rèn)了效果，結(jié)果任意試驗(yàn)試樣分別對(duì)mmp-12、mmp-13均顯示出與上述試驗(yàn)試樣同樣的抑制效果。
[表3]
(表3)
[表4]
(表4)
如前述實(shí)施例2、3那樣，可以判定，通過(guò)單獨(dú)或組合化合物1和化合物2，顯著顯示出對(duì)mmp-2、mmp-9、mmp-12和mmp-13的抑制作用。特別是，令人驚奇的是，化合物1和化合物2對(duì)屬于明膠酶組的mmp-2和mmp-9、作為金屬?gòu)椥缘鞍酌傅膍mp-12、以及作為膠原酶的mmp-13全部顯示抑制作用。特別是，對(duì)mmp-2的抑制作用在以往作為具有mmp抑制作用的安全性較高的成分中，可以說(shuō)是顯著的。前述化合物1和化合物2確認(rèn)到對(duì)生物體的安全性，因此對(duì)前述mmp的產(chǎn)生所導(dǎo)致的癥狀的改善極其有用。
[比較例]
本試驗(yàn)中，對(duì)于前述實(shí)施例2、3中確認(rèn)到的與mmp不同的mmp-3，對(duì)基于包含化合物1和化合物2的組合物的mmp-3的產(chǎn)生抑制效果進(jìn)行了確認(rèn)。
(1)試驗(yàn)方法
將自japanslc,inc.購(gòu)入的8周齡雌無(wú)毛小鼠每6只設(shè)為1組，分為共計(jì)2組，邊對(duì)各組給予陰性的對(duì)照試樣(ain93gorientalyeastco.,ltd.)、和試驗(yàn)試樣，邊飼養(yǎng)共計(jì)8周。另外，給予與它們不同的陰性的對(duì)照試樣，設(shè)置未進(jìn)行紫外線照射的uvb非對(duì)照組1組，作為比較對(duì)象。
自飼養(yǎng)開(kāi)始2周后，向紫外線照射裝置中投入無(wú)毛小鼠，以3次/周的頻率進(jìn)行照射。每1次的照射量自50mj/cm2開(kāi)始，階段性地增加至200mj/cm2，最終的照射量設(shè)為合計(jì)3.1j/cm2。
在uvb的照射開(kāi)始第6周解剖，采集背部皮膚組織，在液氮中冷凍后，用multibeadsshocker(安井器械)搗碎，使用cellyticmt(sigma-aldrich公司)提取蛋白質(zhì)。使用mmp-3檢測(cè)試劑盒(biosource公司)檢測(cè)提取的蛋白質(zhì)中的mmp-3蛋白表達(dá)量。
(2)試驗(yàn)結(jié)果
將結(jié)果示于表5。表中的mmp蛋白質(zhì)表達(dá)相關(guān)的數(shù)值是基于檢測(cè)試劑盒的通過(guò)elisa法測(cè)定的實(shí)測(cè)值。另外，表中的p值表示基于dunnett法的顯著性概率。其結(jié)果，由表表明，mmp-3(表5)中，未確認(rèn)到基于試驗(yàn)試樣的mmp-3表達(dá)抑制效果。
[表5]
(表5)
[實(shí)施例4]
通過(guò)以下方法制造由如下組成構(gòu)成的具有基質(zhì)金屬蛋白酶產(chǎn)生抑制效果的藥物。
向以4-甲基-7-烯膽甾烷醇化合物：環(huán)羊毛甾烷化合物＝2：3的比例含有制造例1中制造的4-甲基-7-烯膽甾烷醇化合物、和制造例2中制造的環(huán)羊毛甾烷化合物的混合物中，添加羧甲基纖維素(cmc：第一工業(yè)制藥株式會(huì)社制)并使其分散，制成混合物；添加含有0.001質(zhì)量％的前述混合物的組合物2質(zhì)量％、中鏈脂肪酸(mct：rikenvitaminco.,ltd.)2質(zhì)量％、甘油脂肪酸酯(rikenvitaminco.,ltd.制)4質(zhì)量％、皂苷(丸善制藥株式會(huì)社制)0.5質(zhì)量％、乙醇(japanalcoholcorporation制)0.2％、麥芽糖醇(hayashibaraco.,ltd.制)1.3質(zhì)量％、甘油(nofcorporation制)78％、進(jìn)而添加水，以使總量成為100質(zhì)量％的方式進(jìn)行混合，制造含有4-甲基-7-烯膽甾烷醇化合物(化合物1)和環(huán)羊毛甾烷化合物(化合物2)的混合物的最終濃度為0.00002質(zhì)量％的糖漿狀的制劑。
本實(shí)施例的抑制劑對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的分解所引起的癥狀的改善·治療是有效的。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性
本發(fā)明可以用于基質(zhì)金屬蛋白酶產(chǎn)生、和基于其的細(xì)胞外基質(zhì)的分解所引起的癥狀的預(yù)防或改善、治療。