相關申請本申請要求2014年11月7日提交的美國臨時申請?zhí)?2/077,105；2014年12月4日提交的美國臨時申請?zhí)?2/087,448；和在2015年10月28日提交的美國臨時申請?zhí)?2/247,705的優(yōu)先權。這些申請的每一個的全部內容通過引用并入本文。發(fā)明領域本發(fā)明領域涉及il-6。更具體地，所述領域涉及il-6的調節(jié)劑及其在治療疾病如眼病中的用途。發(fā)明背景il-6是一種在炎癥、造血(hematopoiesis)、血管生成、細胞分化和神經元存活中具有報導作用的多效性細胞因子。本發(fā)明涉及改進的il-6抗體及其用途。發(fā)明概述本發(fā)明涉及il-6抗體及其片段(例如抗原結合片段)或衍生物，以及編碼il-6抗體和片段的核酸。本發(fā)明還涉及此類抗體，片段或衍生物的用途?？贵w及其片段或衍生物可用于例如il-6相關疾病的治療。在實施方案中，抗體，其片段或衍生物可結合(例如，特異性結合)至il-6，例如，人il-6。在實施方案中，抗體，其片段或衍生物可結合(例如，特異性結合)至il-6的位點ii(例如，人il-6的位點ii)。本文提供的一個方面是包含重鏈可變區(qū)的分離的抗體或抗原結合片段，所述重鏈可變區(qū)包含(i)vhcdr1，其包含gyx1lx2nylie的序列(seqidno：45)，(ii)vhcdr2，其包含vx3tpgx4gtin的序列(seqidno：46)和(ii)vhcdr3，其中以下的一個或多個(例如，1,2,3或全部)是真實的：x1不是a，x2不是s，x3不是i，和x4不是s。在實施方案中，x1不是a，x2不是s，x3不是i和x4不是s。在實施方案中，x1是v或v的保守取代。在實施方案中，x2是p或p的保守取代。在實施方案中，x3是t或t的保守取代。在實施方案中，x4是g或g的保守取代。在實施方案中，以下一個，兩個，三個或全部是真實的：x1是v或v的保守取代，x2是p或p的保守取代，x3的保守取代是t或t的保守取代，和x4是g或g的保守取代。在實施方案中，x1是v或v的保守取代，x2是p或p的保守取代，x3是t或t的保守取代，和x4是g或g的保守取代。在實施方案中，x1選自v，i，l和m。在實施方案中，x1選自v，i和l。在實施方案中，x2選自p，g和a。在實施方案中，x2選自p和g。在實施方案中，x3選自t和s。在實施方案中，x4選自g和p。在實施方案中，以下的一個或多個(例如，1、2、3個或全部)是真實的：x1是v，x2是p，x3是t，和x4是g。在實施方案中，x1是v，x2是p，x3是t，和x4是g.在實施方案中，vhcdr3包含seqidno:33的序列。在實施方案中，抗體或抗原結合片段具有對人il-6增加的親和力和/或增加的效力。在實施方案中，與包含序列，其中以下的一個或多個(例如1、2、3個或全部)是真實的：x1是a，x2是s，x3是i和x4是s的抗體或抗原結合片段(例如，其他方面相同的抗體或抗原結合片段)相比，抗體或抗原結合片段具有對人il-6增加的親和力和/或增加的效力。在一些實施方案中，分離的抗體或其抗原結合片段包含含有seqidno：31的序列的vhcdr1，含有seqidno：32的序列的vhcdr2和任選地含有seqidno：no：33的序列的vhcdr3。在實施方案中，重鏈可變區(qū)包含與seqidno：17至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的序列。在實施方案中，重鏈可變區(qū)由以下序列組成，所述序列與seqidno：17至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的序列或者與seqidno：17差別不超過5個，4個，3個，2個或1個氨基酸。在實施方案中，重鏈可變區(qū)與seqidno：17差別不超過5個，4個，3個，2個或1個氨基酸。在實施方案中，重鏈可變區(qū)與seqidno：17差別1-5個氨基酸。在實施方案中，重鏈可變區(qū)包含與seqidno：37至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的序列。在實施方案中，重鏈可變區(qū)由與seqidno：37至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的序列組成。在實施方案中，重鏈可變區(qū)與seqidno：37差別不超過5、4、3、2或1個氨基酸。在實施方案中，抗體或抗原結合片段包含含有seqidno：37的重鏈可變區(qū)序列。在實施方案中，抗體或抗原結合片段包含由seqidno：37組成的重鏈可變區(qū)序列。在實施方案中，抗體或抗原結合片段包含與seqidno：39至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的序列。在實施方案中，抗體或抗原結合片段包含與seqidno：39差別不超過5、4、3、2或1個氨基酸的序列。在實施方案中，抗體或抗原結合片段包含seqidno：39。在實施方案中，抗體或抗原結合片段是fab。在實施方案中，抗體或抗原結合片段包含與seqidno：54至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的序列。在實施方案中，抗體或抗原結合片段包含與seqidno：54差別不超過5、4、3、2或1個氨基酸的序列。在實施方案中，抗體或抗原結合片段包含seqidno：54。在實施方案中，抗體或抗原結合片段是fab。在實施方案中，抗體或抗原結合片段是scfv。在實施方案中，抗體或抗原結合包含下列scfv序列或由下列scfv序列組成：qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgyvlpnyliewvrqapgqglewmgvttpgggtinyaqkfqgrvtitadeststaymelsslrsedtavyycarsrwdplyyyaleywgqgttvtvssggggsggggsggggsdivmtqspdslavslgeratincrasesvdnygipfmnwyqqkpgqppklliyaasnrgsgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqseevpltfgqgtkleikrtv(seqidno:52)或divmtqspdslavslgeratincrasesvdnygipfmnwyqqkpgqppklliyaasnrgsgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqseevpltfgqgtkleikrtvggggsggggsggggsqvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgyvlpnyliewvrqapgqglewmgvttpgggtinyaqkfqgrvtitadeststaymelsslrsedtavyycarsrwdplyyyaleywgqgttvtvss(seqidno:53)。在實施方案中，抗體或抗原結合片段包含與seqidno：52或seqidno：53至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的序列。在實施方案中，抗體或抗原結合片段包含seqidno：52或seqidno：53。在實施方案中，抗體或抗原結合片段是scfv。在實施方案中，抗體或抗原結合片段包含與seqidno：41至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的重鏈序列。在實施方案中，抗體或抗原結合片段包含與seqidno：41差別不超過5、4、3、2或1個氨基酸的重鏈序列。在實施方案中，抗體或抗原結合片段包含含有seqidno：41的重鏈序列。在實施方案中，抗體或抗原結合片段包含由seqidno：41組成的重鏈序列。在實施方案中，抗體或抗原結合片段與ebi-029或其片段相比具有增加的對人il-6的親和力和/或增加的效力。在實施方案中，與包含含有seqidno：4的序列的vhcdr1，含有seqidno：5的序列的vhcdr2，以及任選地含有seqidno：6的序列的vhcdr3的抗體或抗原結合片段相比，抗體或抗原結合片段具有增加的對人il-6的親和力和/或增加的效力。在實施方案中，與包含含有seqidno：17的重鏈可變區(qū)序列或由seqidno：17組成的重鏈可變區(qū)序列的抗體或抗原結合片段相比，抗體或抗原結合片段具有增加的對人il-6的親和力和/或增加的效力。在實施方案中，與包含seqidno：24的抗體或抗原結合片段相比，抗體或抗原結合片段具有增加的對人il-6的親和力和/或增加的效力。在實施方案中，與包含含有seqidno：11的重鏈序列或由seqidno：11組成的重鏈序列的抗體或抗原結合片段相比，抗體或抗原結合片段具有增加的對人il-6的親和力和/或增加的效力。在實施方案中，抗體或抗原結合片段包含表4中所提供的ebi-030或ebi-031的一個或多個序列。在實施方案中，抗體或抗原結合片段包含如圖15所示的ebi-030或ebi-031的一個或多個結構域(例如，重鏈序列的fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4、ch1、鉸鏈、ch2和ch3和/或輕鏈序列的fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4和ck中的一個或多個)。在實施方案中，抗體或抗原結合片段包含重鏈和輕鏈。在實施方案中，重鏈和輕鏈通過一個或多個二硫鍵連接。在實施方案中，抗體或抗原結合片段是fab。在實施方案中，抗體或抗原結合片段是scfv。在實施方案中，抗體或抗原結合片段是fab、fab’、f(ab’)2、scfv或fv片段。在實施方案中，與包含ebi-029的一個或多個相應序列或在wo2014/074905(將其全部內容通過引用并入本文)中描述的抗體的序列的抗體或抗原結合片段相比，抗體或抗原結合片段具有增加的對人il-6的親和力和/或增加的效力。在實施方案中，與托珠單抗(tocilizumab)相比，抗體或抗原結合片段具有增加的對人il-6的親和力和/或增加的效力。表4：ebi-029、ebi-030和ebi-031序列的概述aa＝氨基酸；na＝核酸；hc＝重鏈；lc＝輕鏈；vh＝重鏈可變區(qū)；vl＝輕鏈可變區(qū)可以使用本文所述的方法和/或本領域已知的方法評估增加的親和力和/或增加的效力。在實施方案中，使用表面等離子體共振(spr)評估親和力。在實施方案中，親和力增加至少1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3或4倍。在實施方案中，效力增加。在實施方案中，如ic50的降低和/或ic90的降低所指明的，效力增加。在實施方案中，ic50降低至少5、10、20、30、40或50倍。在實施方案中，ic50降低至少約50倍。在實施方案中，ic90降低至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400或500倍。在實施方案中，ic90降低至少約100倍。在實施方案中，例如通過使用hek-bluetm測定法或t1165增殖測定法來評價效力。在實施方案中，例如，如基于使用本文所述的hek-bluetm測定法，例如用20pm游離il-6獲得的ic50值或ic90值評估的，抗體或抗原結合片段抑制順式-il-6信號傳遞。在實施方案中，抗體或抗原結合片段具有小于47pm的ic50和/或小于4350pm的ic90。在實施方案中，ic50小于47pm，例如小于40、30、20、10、5、4、3、2或1pm。在實施方案中，ic90小于4350pm，例如小于4000、2000、1000、100、50、40、30、20、15、10或5pm。在實施方案中，在用20pmil-6進行的hek-bluetm測定中評估ic50和/或ic90。在實施方案中，例如，如基于使用hek-bluetm測定用20pmil-6獲得的ic50值評估的，抗體或抗原結合片段相比于托珠單抗以更高效力阻斷游離il-6。在實施方案中，抗體或抗原結合片段與托珠單抗相比以超過900倍的效力抑制il-6。在實施方案中，抗體或抗原結合片段是ebi-031或其抗原結合片段。在實施方案中，對于抑制il-6，抗體或抗原結合片段具有小于15pm的ic50，例如14.2pm的ic50。在實施方案中，例如，如基于使用本文所述的hek-bluetm測定法，例如用200pm超(hyper)il-6評估的，抗體或抗原結合片段抑制反式-il-6信號傳遞。在實施方案中，抗體或抗原結合片段抑制超il-6的信號傳遞。在實施方案中，抗體或抗原結合片段以比托珠單抗更高的效力，例如以與托珠單抗相比超過900倍的效力抑制超il-6的信號傳遞。在實施方案中，抗體或抗原結合片段以小于1μm的ic50抑制超il-6的信號傳遞。在實施方案中，抗體或抗原結合片段以小于1nm的ic50抑制超il-6的信號傳遞。在實施方案中，抗體或抗原結合片段以小于100pm或小于50pm的ic50，例如以約14-15pm的ic50抑制超il-6的信號傳遞。在實施方案中，抗體或抗原結合片段是ebi-031或其抗原結合片段。在實施方案中，抗體或抗原結合片段抑制順式-il-6信號傳遞和反式il-6信號傳遞。在實施方案中，例如在玻璃體內施用后，抗體或抗原結合片段持續(xù)至少1個月，2個月，3個月，4個月，5個月或6個月有效阻斷眼睛中il-6信號傳遞。在實施方案中，例如在玻璃體內施用后，抗體或抗原結合片段持續(xù)至少1個月，2個月，3個月，4個月，5個月或6個月有效阻斷眼睛中95％的il-6信號傳遞。在實施方案中，抗體或抗原結合片段持續(xù)約150天阻斷眼中95％的il-6信號傳遞。在另一個方面，本文提供的是分離的抗體或抗原結合片段，其包含與seqidno：37至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的重鏈可變區(qū)序列，其中所述重鏈序列包含選自v28，p30，t51和g55的一個或多個(例如，1、2、3或4個)氨基酸(氨基酸編號根據seqidno：41進行)。在另一個方面，本文提供的是分離的抗體或抗原結合片段，其包含與seqidno：39至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的序列，其中所述序列包含選自v28，p30，t51和g55的一個或多個(例如，1、2、3或4個)氨基酸(氨基酸編號根據seqidno：41進行)。在另一個方面，本文提供的是分離的抗體或抗原結合片段，其包含與seqidno：54至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的序列，其中所述序列包含選自v28，p30，t51和g55的一個或多個(例如，1、2、3或4個)氨基酸(氨基酸編號根據seqidno：41進行)。本文還提供的是分離的抗體或抗原結合片段，其包含與seqidno：41至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的重鏈序列，其中所述重鏈序列包含選自v28，p30，t51和g55的一個或多個(例如，1、2、3或4個)氨基酸(氨基酸編號根據seqidno：41進行)。在實施方案中，相對于對照抗體,例如相對于ebi-029或其片段，抗體或抗原結合片段具有對人il-6的增加的親和力。在實施方案中，相對于除了其不包含選自v28，p30，t51和/g55的一種或多種氨基酸，并且替代地包含選自a28,s30，i51和s55的一種或多種(例如，1、2、3或4種)氨基酸其他方面相同的抗體或抗原結合片段，抗體或抗原結合片段具有增加的對人il-6的親和力。在實施方案中，親和力增加至少1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3或4倍。在實施方案中，使用表面等離子體共振(spr)評估親和力。在實施方案中，相對于對照抗體，例如相對于ebi-029或其片段，抗體或抗原結合片段具有增加的效力。在實施方案中，相對于除了其不包含選自v28，p30，t51和/g55的所述一種或多種氨基酸，并且替代地包含選自a28,s30，i51和s55的一種或多種(例如，1、2、3或4種)氨基酸其他方面相同的抗體或抗原結合片段，抗體或抗原結合片段具有增加的效力。在實施方案中，如ic50降低和/或ic90降低所指示的，效力增加。在實施方案中，ic50降低至少5、10、20、30、40或50倍。在實施方案中，ic50降低至少約50倍。在實施方案中，ic90降低至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400或500倍。在實施方案中，ic90降低至少約100倍。在實施方案中，使用hek-bluetm測定或t1165增殖測定來評估效力。在實施方案中，抗體或抗原結合片段具有小于47pm的ic50和/或小于4350pm的ic90。在實施方案中，ic50小于47pm，例如小于40、30、20、10、5、4、3、2或1pm。在實施方案中，ic90小于4350pm，例如小于4000、2000、1000、100、50、40、30、20、15、10或5pm。在實施方案中，在使用20pmil-6的hek-bluetm測定中評估ic50和/或ic90。在一些實施方案中，與除了其包含a28，s30，i51和s55在其他方面相同的抗體或抗原結合片段相比，包含v28，p30，t51和g55的抗體或抗原結合片段顯示出對人il-6的改善的親和力和/或改善的效力。在實施方案中，本文所述的抗體或抗原結合片段進一步包含輕鏈可變區(qū)或其抗原結合片段，其包含vlcdr1，vlcdr2和vlcdr3。在實施方案中，vlcdr1包含seqidno：34的序列，vlcdr2包含seqidno：35的序列，并且vlcdr3包含seqidno：36的序列。在實施方案中，抗體或抗原結合片段進一步包含與seqidno：38至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的輕鏈可變區(qū)序列。在實施方案中，抗體或抗原結合片段進一步包含輕鏈可變區(qū)序列，其包含seqidno：38或與seqidno：38差別不超過5、4、3、2或1個氨基酸。在實施方案中，抗體或抗原結合片段進一步包含含有seqidno：38的輕鏈可變區(qū)序列。在實施方案中，輕鏈可變區(qū)序列由seqidno：38組成。在實施方案中，抗體或抗原結合片段進一步包含與seqidno：42至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的輕鏈序列。在實施方案中，抗體或抗原結合片段進一步包含與seqidno：42差別不超過5、4、3、2或1個氨基酸的輕鏈序列。在實施方案中，抗體或抗原結合片段進一步包含含有seqidno:42的輕鏈序列。在實施方案中，抗體或抗原結合片段進一步包含含有seqidno:42或與seqidno：42差別不超過5、4、3、2或1個氨基酸的序列的輕鏈序列。在實施方案中，輕鏈序列由seqidno:42組成。在實施方案中，抗體或抗原結合片段包含(i)包含seqidno：31的序列的vhcdr1，包含seqidno：32的序列的vhcdr2和包含seqidno：33以及(ii)包含seqidno：34的序列的vlcdr1，包含seqidno：35的序列的vlcdr1和包含seqidno：36的序列的vlcdr3。在實施方案中，抗體或抗原結合片段除了其具有突變，例如，在所有六個cdr中總共至多1、2或3個突變外包含前述cdr。在實施方案中，突變不降低抗體或抗原結合片段的親和力和/或效力。在實施方案中，抗體或抗原結合片段是igg1，igg2，igg3或igg4抗體或其片段。在實施方案中，抗體或抗原結合片段是igg1或igg2抗體或其片段。在實施方案中，抗體或抗原結合片段是igg1fab或igg2fab。在實施方案中，抗體或抗原結合片段是igg2抗體或抗原結合片段。在實施方案中，將抗體或抗原結合片段工程化以減少或消除adcc活性。在實施方案中，抗體或抗原結合片段是單克隆抗體或其抗原結合片段。在實施方案中，抗體或抗原結合片段是人源化或人單克隆抗體或其抗原結合片段。在實施方案中，抗體或抗原結合片段包含含有seqidno：37或由seqidno：37組成的重鏈可變區(qū)，和包含含有seqidno：38或由seqidno：38組成的輕鏈可變區(qū)。在實施方案中，抗體或抗原結合片段除了它具有突變，例如總共至多1、2或3個突變包含前述重鏈和輕鏈可變區(qū)。在實施方案中，突變不降低抗體或抗原結合片段的親和力和/或效力。在實施方案中，抗體或抗原結合片段包含含有seqidno：41的重鏈序列和任選地包含seqidno：42的輕鏈序列。在實施方案中，抗體或抗原結合片段包含由seqidno：41組成的重鏈序列和任選地由seqidno：42組成的輕鏈序列。在實施方案中，抗體或抗原結合片段包含含有seqidno：47的重鏈序列和任選地含有seqidno：42的輕鏈序列。在實施方案中，除了抗體或抗原結合片段包含突變(例如相對于seqidno：41和/或seqidno：42的1、2、3、4或5個總突變)之外，所述抗體或抗原結合片段包含與seqidno：41相同的重鏈序列和與seqidno：42相同的輕鏈序列。在實施方案中，突變在框架區(qū)中。在實施方案中，相對于不包含所述突變的抗體或抗原結合片段，突變不降低所述抗體或抗原結合片段的親和力和/或效力。在實施方案中，除了抗體或抗原結合片段包含突變(例如相對于seqidno：47和/或seqidno：42的1、2、3、4或5個總突變)之外，所述抗體或抗原結合片段包含與seqidno：47相同的重鏈序列和與seqidno：42相同的輕鏈序列。在實施方案中，突變在框架區(qū)中。在實施方案中，相對于不包含所述突變的抗體或抗原結合片段，突變不降低抗體或抗原結合片段的親和力和/或效力。在一個實施方案中，抗體或抗原結合片段是fab。在一個實施方案中，抗體或抗原結合片段是igg1fab。在一個實施方案中，抗體或抗原結合片段是包含含有seqidno：39的重鏈序列和含有seqidno：42的輕鏈序列的分離的fab。在一個實施方案中，抗體或抗原結合片段是分離的fab，其包含由seqidno：39組成的重鏈序列和由seqidno：42組成的輕鏈序列。在一個實施方案中，抗體或抗原結合片段是igg2fab。在一個實施方案中，抗體或抗原結合片段是包含含有seqidno：54的重鏈序列和含有seqidno：42的輕鏈序列的分離的fab。在一個實施方案中，抗體或抗原結合片段是分離的fab，其包含由seqidno：54組成的重鏈序列和由seqidno：42組成的輕鏈序列。在實施方案中，除了抗體或抗原結合片段包含突變(例如相對于seqidno：39和/或seqidno：42的1、2、3、4或5個總突變)之外，所述抗體或抗原結合片段包含與seqidno：39相同的重鏈序列和與seqidno：42相同的輕鏈序列。在實施方案中，突變在框架區(qū)中。在實施方案中，相對于不包含所述突變的抗體或抗原結合片段，突變不降低抗體或抗原結合片段的親和力和/或效力。在實施方案中，除了抗體或抗原結合片段包含突變(例如相對于seqidno：54和/或seqidno：42的1、2、3、4或5個總突變)之外，所述抗體或抗原結合片段包含與seqidno：54相同的重鏈序列和與seqidno：42相同的輕鏈序列。在實施方案中，突變在框架區(qū)中。在實施方案中，相對于不包含所述突變的抗體或抗原結合片段，突變不降低抗體或抗原結合片段的親和力和/或效力。在一些實施方案中，抗體或抗原結合片段可以結合人il-6的r24、k27、y31、d34、s118或v121中的至少一個。在實施方案中，抗體或抗原結合片段可以結合人il-6的r24、k27、y31、d34、s118和v121。在實施方案中，抗體或抗原結合片段可以結合人il-6的r24、k27、y31、d34、s118和v121的至少1個，至少2個，至少3個，至少4個，或至少5個。在實施方案中，抗體或抗原結合片段可以結合(例如，可以特異性結合)至人il-6的位點ii。在實施方案中，抗體或其抗原結合片段可以以70℃或更高的tm結合il-6。在實施方案中，抗體或其抗原結合片段可以以80℃或更高的tm結合il-6。在實施方案中，抗體或其片段(例如其抗原結合片段)結合至人il-6的r24、k27、y31、d34、s118和v121中的至少一個。在實施方案中，抗體或其抗原結合片段結合至人il-6的r24、k27、y31、d34、s118和v121中的至少兩個。在實施方案中，抗體或其抗原結合片段結合至人il-6的r24、k27、y31、d34、s118和v121中的至少三個。在實施方案中，抗體或其抗原結合片段結合至人il-6的r24、k27、y31、d34、s118和v121中的至少四個。在實施方案中，抗體或其抗原結合片段結合至人il-6的r24、k27、y31、d34、s118和v121中的至少五個。在實施方案中，抗體或其抗原結合片段結合至人il-6的r24、k27、y31、d34、s118和v121。在實施方案中，抗體或抗原結合片段是單克隆抗體或其抗原結合片段。在實施方案中，抗體或抗原結合片段是人源化單克隆抗體。在實施方案中，抗體或抗原結合片段是人單克隆抗體。在實施方案中，在ph7.4的pbs中，抗體或抗原結合片段在100-150mg/ml的濃度，例如在約142mg/ml的濃度顯示<10％的聚集。在實施方案中，與另一種治療劑相比，例如與托珠單抗，貝伐單抗(bevacizumab)，蘭尼單抗(ranibizumab)和/或相比，抗體或抗原結合片段具有改善的藥代動力學性質。在實施方案中，當施用于眼時，例如，玻璃體內，例如通過玻璃體內注射施用時，所述抗體或抗原結合片段具有在眼睛中的改善的保留。在實施方案中，在眼中改善的保留通過眼中，例如在玻璃體，視網膜，眼房水，脈絡膜和/或鞏膜中增加的半衰期來指示。在實施方案中，抗體或抗原結合片段在玻璃體中具有至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天的半衰期。在實施方案中，玻璃體中的半衰期至少為10天。在實施方案中，玻璃體中的半衰期在動物中，例如在兔或猴中評估。在實施方案中，玻璃體中的半衰期在人中評估。在實施方案中，與另一種治療劑相比，例如與托珠單抗，貝伐單抗，蘭尼單抗和/或阿柏西普相比，本文所述的抗體或抗原結合片段具有降低的系統(tǒng)半衰期(例如，較低的t1/2β)和/或更快的系統(tǒng)清除。在實施方案中，系統(tǒng)半衰期(例如，t1/2β)低于托珠單抗和/或阿柏西普的系統(tǒng)半衰期。在實施方案中，抗體或抗原結合片段包含在對應于h311，d313，i254或h436(編號如seqidno：41)的一個或多個位置包含突變(例如，以1，2，3或4個突變)的fc域。在實施方案中，突變選自h311a，h311e，h311n，d313t，i254a，i254r和h436a中的一個或多個。在實施方案中，抗體或抗原結合片段包含含有對應于h311a的突變的fc域(編號如seqidno：41)。在實施方案中，fc域是igg1fc域。在實施方案中，fc域是igg2fc域。在實施方案中，fc域是具有seqidno：50的序列并且任選地在一個或多個加下劃線位置(h90，d92，i33和h215)包含突變的人igg1fc域：dkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno:50)。在實施方案中，igg1fc域包含對應于h90a，h90e，h90n，d92t，i33a，i33r和h215a中的一個或多個的突變(根據seqidno：50編號)。在實施方案中，fc域是具有seqidno：51的序列并且任選地在一個或多個加下劃線位置(h86，d88，i29和h211)包含突變的人igg2fc域：vecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno:51)。在實施方案中，igg2fc域包含對應于h86a，h86e，h86n，d88t，i29a，i29r和h211a(編號為seqidno：51)的一個或多個的突變。在實施方案中，fc突變減少了抗體或抗原結合片段的系統(tǒng)積累(例如增加抗體或抗原結合片段的清除或降低半衰期，例如t1/2β)。在實施方案中，與另一種治療劑(例如，托珠單抗，貝伐單抗，蘭尼單抗和/或阿柏西普)相比，系統(tǒng)累積減少。在實施方案中，與托珠單抗和/或阿柏西普相比，系統(tǒng)累積減少。在實施方案中，與不包含所述突變的相應抗體或抗原結合片段的系統(tǒng)累積相比，系統(tǒng)積累減少。在實施方案中，在玻璃體內施用抗體或抗原結合片段后評價系統(tǒng)累積。在另一方面本文提供了減少抑制受試者中il-6的系統(tǒng)效應的方法，所述方法包括向受試者施用包含如本文所述的突變fc域的抗體或其片段。在實施方案中，與具有野生型fc域的相應抗體或其片段相比，抗體或抗原結合片段可以抑制il-6的活性并具有減少的fc活性(例如減少的與fcrn的結合)。在一些情況下，減少抑制受試者中il-6的系統(tǒng)效應的方法包括向受試者施用包含如本文所述的突變fc域的il-6拮抗劑。在另一方面，本文提供的是包含編碼本文所述的抗體或抗原結合片段的序列的核酸。在實施方案中，核酸編碼本文公開的氨基酸序列。在實施方案中，核酸包含seqidno：40，seqidno：43或seqidno：48。在實施方案中，核酸編碼表4中公開的序列。本文還提供了包含核酸的載體。本文還提供了包含核酸或載體的細胞。在實施方案中，本文所述的il-6抗體或抗原結合片段用于治療患有il-6相關疾病的受試者(例如，人)。在實施方案中，疾病是眼部疾病，例如以il-6水平升高(例如在玻璃體中)為特征的眼部疾病。在實施方案中，抗體或抗原結合片段用于治療患有以下病癥的受試者(例如，人)：糖尿病黃斑水腫(dme)、糖尿病視網膜病、葡萄膜炎(、青光眼、干眼(例如，干眼病或干眼綜合征)、過敏性結膜炎、眼部疼痛、孔源性視網膜脫離(rrd)、年齡相關性黃斑變性(amd)、增生型糖尿病視網膜病變(pdr)、視網膜靜脈阻塞(rvo)、視神經脊髓炎(nmo)、角膜移植物、角膜擦傷或對眼的物理損傷。在實施方案中，抗體或抗原結合片段用于治療患有dme的受試者(例如，人)。對眼的物理損傷在實施方案中，本文所述的il-6抗體或抗原結合片段用于制備用于治療il-6相關疾病的藥物。在實施方案中，該疾病是眼部疾病，例如以玻璃體中升高的il-6水平為特征的眼部疾病。在實施方案中，il-6相關疾病是糖尿病黃斑水腫(dme),糖尿病視網膜病,葡萄膜炎,干眼(例如，干眼病或干眼綜合征),年齡相關性黃斑變性(amd),增生型糖尿病視網膜病變(pdr),孔源性視網膜脫離(rrd),視網膜靜脈阻塞(rvo),視神經脊髓炎(nmo),角膜移植物,角膜擦傷，或對眼的物理損傷。在實施方案中，il-6相關疾病是糖尿病黃斑水腫。在實施方案中，將藥物配制用于遞送至受試者眼的玻璃體(例如，用于玻璃體內注射)。本文還提供了包含本文所述的抗體或抗原結合片段的組合物。在實施方案中，組合物進一步包含藥學上可接受的載體和一種或多種藥學可接受的賦形劑。在實施方案中，組合物用于治療il-6相關疾病。在實施方案中，該疾病是眼部疾病，例如以玻璃體中升高的il-6水平為特征的眼部疾病。在實施方案中，該組合物用于治療以下病癥：糖尿病黃斑水腫(dme),糖尿病視網膜病,葡萄膜炎,干眼(例如，干眼病或干眼綜合征),年齡相關性黃斑變性(amd),增生型糖尿病視網膜病變(pdr),孔源性視網膜脫離(rrd),視網膜靜脈阻塞(rvo),視神經脊髓炎(nmo),角膜移植物,角膜擦傷,或對眼的物理損傷。本文還提供了治療il-6相關疾病的方法，所述方法包括向受試者施用治療有效量的本文所述的il-6抗體或片段。在實施方案中，il-6相關疾病是眼部疾病，例如以玻璃體中升高的il-6水平為特征的眼部疾病。在實施方案中，il-6相關疾病是以下病癥：糖尿病黃斑水腫(dme),糖尿病視網膜病,葡萄膜炎,干眼(例如，干眼病或干眼綜合征),年齡相關性黃斑變性(amd),增生型糖尿病視網膜病變(pdr),孔源性視網膜脫離(rrd),視網膜靜脈阻塞(rvo),視神經脊髓炎(nmo),角膜移植物,角膜擦傷,或對眼的物理損傷。在實施方案中，il-6相關疾病是糖尿病黃斑水腫。在實施方案中，將抗體或抗原結合片段或包含抗體或抗原結合片段的組合物遞送至受試者眼睛的玻璃體(例如，通過玻璃體內注射)。在實施方案中，抗體或抗原結合片段或包含抗體或抗原結合片段的組合物用于玻璃體內注射。在實施方案中，il-6相關疾病是糖尿病黃斑水腫，并且將抗體或片段或包含所述抗體或抗原結合片段的組合物遞送至受試者眼睛的玻璃體。本文還提供了抗體或其片段(例如，其抗原結合片段)(例如本文所述的il-6抗體或其片段)，或包含此類抗體或其片段的組合物，其用于治療il-6相關疾病(例如，用于治療受試者，例如具有il-6相關疾病的人受試者)。在實施方案中，所述疾病是以例如玻璃體中升高的il-6水平為特征的眼睛疾病。在實施方案中，所述疾病是糖尿病黃斑水腫(dme),糖尿病視網膜病,葡萄膜炎,干眼(例如，干眼癥或干眼病),過敏性結膜炎,年齡相關性黃斑變性(amd),增生型糖尿病視網膜病變(pdr),孔源性視網膜脫離(rrd),視網膜靜脈阻塞(rvo),視神經脊髓炎(nmo),角膜移植物,角膜擦傷,或對眼的物理損傷。在實施方案中，所述疾病是dme。在實施方案中，所述疾病是干眼病。在實施方案中，所述疾病是干眼綜合征。在實施方案中，所述疾病是葡萄膜炎。在實施方案中，所述疾病是amd。在實施方案中，所述疾病是pdr。在實施方案中，所述疾病是角膜移植物,角膜擦傷,或對眼的物理損傷。在實施方案中，抗體或其片段(如抗原結合片段)適合于遞送至眼睛的玻璃體。在實施方案中，將抗體或其片段(如抗原結合片段)遞送至眼睛的玻璃體。本發(fā)明還提供了治療il-6相關疾病的方法，所述方法包括向受試者施用il-6抗體或其片段(如其抗原結合片段)，例如本發(fā)明所描述的il-6抗體或其片段。在實施方案中，以治療有效量施用il-6抗體或其片段(如其抗原結合片段)。在實施方案中，il-6相關疾病是以玻璃體內升高的il-6水平為特征的眼部疾病。在實施方案中，所述疾病是糖尿病黃斑水腫(dme)、糖尿病視網膜病、葡萄膜炎、干眼綜合癥、干眼病、年齡相關性黃斑變性(amd)、增生型糖尿病視網膜病變(pdr)、視網膜靜脈阻塞(rvo)、視神經脊髓炎(nmo)、角膜移植物、角膜擦傷或對眼的物理損傷。在實施方案中，抗體或其片段(例如其抗原結合片段)適合于遞送至眼睛的玻璃體。在實施方案中，將抗體或其片段(例如其抗原結合片段)遞送至受試者眼睛的玻璃體。在實施方案中，il-6相關疾病是糖尿病黃斑水腫，并且將抗體或其片段遞送至受試者眼睛的玻璃體。本文還提供了包含本文公開的il-6抗體或組合物以及任選地用于使用的說明書的試劑盒。本文還提供了容器或裝置，例如藥物遞送裝置，其包含本文公開的il-6抗體或組合物。在實施方案中，將所述裝置配置為用于將抗體或組合物遞送至眼睛，例如玻璃體。本文還提供了包含所述容器或裝置的試劑盒。如本發(fā)明所用，術語“抗體”與免疫球蛋白含義相同，且在本領域中是公知的。術語抗體不受制備抗體的任何特定方法的限制。例如，術語抗體包括，特別是重組抗體、單克隆抗體和多克隆抗體。如本發(fā)明所用，抗體是一種四聚體，且除非另外公開，每個抗體均由兩對相同的多肽鏈組成，其中每對具有一個輕鏈和一個重鏈。每一條鏈的氨基端包含在抗原識別中起主要作用的約100到120或更多氨基酸的可變區(qū)。每一條鏈的羧基端包含在抗體效應子功能(antibodyeffectorfunction)中起主要作用的恒定區(qū)。人輕鏈的種類被稱為kappa和lambda輕鏈。重鏈種類為mu、delta、gamma、alpha或epsilon，并定義了抗體的同種型?？贵w的同種型分別為igm、igd、igg、iga和ige。在輕鏈和重鏈中，可變區(qū)和恒定區(qū)通過約12或更多個氨基酸的“j”區(qū)連接，重鏈還包括一個約3個或更多個氨基酸的“d”區(qū)。每一重鏈/輕鏈對(vh和vl)的可變區(qū)分別形成抗原結合位點。因此，例如完整的igg抗體具有兩個結合位點。除雙功能或雙特異性抗體外，所述的兩個結合位點是相同的?？贵w重鏈和輕鏈的可變區(qū)表現(xiàn)出通過3個高變區(qū)(也稱為互補決定區(qū)或cdr)連接的相對保守框架區(qū)(fr)的相同通用結構。術語“可變”指抗體間可變域的某些位點在序列上存在廣泛的差異，并且這些位點涉及每一特定抗體與其特定抗原的結合和特異性?？勺冃?variability)主要位于cdrs中，其被更加高度保守的框架區(qū)(frs)分開。根據kabatsequencesofproteinsofimmnunologicalinterest(nationalinstitutesofhealth，bethesda，md，1987和1991)或chothia和lesk，jmolbiol196:901-917(1987)；chothia等，nature342:878-883(1989)(其記載了本領域公知的方法)的定義進行每個結構域的氨基酸的分配?！耙吧汀笨芍敢粋€群體中最為普遍的等位基因或種類，或指來自于未經操作的動物的抗體，后者是與來自某種形式的操作的等位基因或多態(tài)性或變體或衍生物相較而言的，所述操作是例如誘變、使用重組方法等來改變該抗原結合分子的氨基酸。術語“抗體片段”是指完整或全長鏈或抗體的一部分，通常為靶結合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括但不限于fab、fab’、f(ab’)2和fv片段?！肮δ芷巍被颉翱?il-6的位點ii抗體的類似物”是可防止或實質降低il-6結合到受體的能力、降低il-6/il-6r復合物結合到gp130的能力或降低配體結合到gp130或起始信號(initialsignaling)的能力。如本文所用，“抗原結合片段”或“功能片段”通常與“抗體片段”含義相同，并且可指能防止或實質降低il-6結合到受體的能力、降低il-6/il-6r復合物結合到gp130的能力或降低配體結合到gp130或起始信號能力的片段，例如fv、fab、f(ab')2等。抗體的“衍生物”是包括本文公開的抗體的至少一個cdr的多肽。通常，該衍生物可以結合至il-6的位點ii?！案偁帯笔侵傅谝豢贵w或其片段能夠與第二抗體或其片段競爭結合，使得與第二抗體不存在時第一抗體的結合相比，在第二抗體存在下，可檢測到第一抗體與其表位結合的降低。在某些情況下，該術語也指在第一抗體存在下，第二抗體與其表位的結合是可檢測的降低。在非限制性的例子中，該競爭的機制可通過位阻、構象改變或與共同表位結合。核酸序列內容中的術語“序列同一性百分比”是指當比對以獲得最大對應時，兩序列中相同的殘基。序列同一性比較的長度可以超過至少約9個核苷酸，例如，至少約18個、至少約24個、至少約28個、至少約32個、至少約36個或至少約48個或更多個核苷酸?？梢允褂帽绢I域中已知的算法測量核苷酸序列的同一性。例如，可以使用fasta、gap或bestfit(wisconsinpackage10.0版本，geneticscomputergroup(gcg),madison,wi)比較多核苷酸序列。fasta，包括例如程序fasta2和fasta3，提供查詢和搜索序列之間最佳重疊區(qū)域的比對和序列同一性百分比(pearson,methodsenzymol183:63-98(1990)；pearson,methodsmolbiol132:185-219(2000)；pearson,methodsenzymol266:227-258(1996)；pearson,jmolbio1276:71-84(1998)；通過引用并入本文)。通常使用特定程序或算法的缺省參數(shù)。例如，可以使用fasta及其缺省參數(shù)(字長為6和用于計分矩陣的nopam系數(shù))確定核酸序列間序列同一性百分比，或使用gcg第6.1版提供的具有默認參數(shù)的gap來確定，通過引用并入本文。氨基酸序列中的術語“序列同一性百分比”是指當比對以獲得最大對應性時，兩序列中相同的殘基。序列同一性比對的長度可以超過至少5個氨基酸殘基，例如，至少20個氨基酸殘基、至少30個氨基酸殘基、至少50個氨基酸殘基、至少100個氨基酸殘基、至少150個氨基酸殘基或至少200個或更多個氨基酸殘基。通常使用序列分析軟件測量多肽的序列同一性。用于確定序列同一性百分比的算法是已知的。例如可以使用fasta、gap或bestfit(wisconsinpackage第10.0版，geneticscomputergroup(gcg),madison,wi)比較氨基酸序列。蛋白分析軟件使用比對多種取代、缺失以及包括保守性氨基酸置換的其他修飾的相似性的測量來匹配序列。例如，gcg含有諸如“gap”和“bestfit”程序，它們可以與默認參數(shù)一起用來決定密切相關的多肽(諸如來自不同物種之生物的同源性多肽)或野生型蛋白與其類似物之間的序列同源性或序列同一性。參見，例如gcg第6.1版(universityofwisconsin，madison，wi)。多肽序列也可以使用默認或建議參數(shù)的fasta(參見gcg第6.1版)來比對。fasta(例如fasta2和fasta3)提供查詢和搜索序列之間最佳重疊區(qū)域的比對和序列同一性百分比(pearson,methodsenzymoi183:63-98(1990)；pearson,methodsmolbioi132:185-219(2000))。當要將序列與含有大量來自不同生物的序列的數(shù)據庫比對時，可以使用的另一種算法是blast，例如blastp或tblastn，使用程序提供的默認參數(shù)。參見例如altschul等,jmolbioi215:403-410(1990)；altschul等人，,nucleicacidsres25:3389-402(1997)。當樣品的至少約60或75％顯示出單一種類的多肽時，蛋白或多肽是“基本純凈的，”“基本均質的，”或“基本純化的”。多肽或蛋白可以是單體或多聚體。基本純的多肽或蛋白可包含約50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％純品；例如，一個基本純的多肽或蛋白是50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％純的。蛋白的純度或均質性可通過任何適當?shù)姆椒ㄔu價，如蛋白樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳，接著通過觀察一條或多條與蛋白或多肽相關的條帶(如在染色的凝膠上)、大小排阻hplc、陽離子交換hplc、sds中的減壓毛細管電泳、肽圖譜或聚糖圖譜。例如可使用現(xiàn)有技術中的已知方法或其他純化方式實現(xiàn)高分辨率。當指核酸或其片段時，術語“基本相似性”是指當以適當核苷酸插入或缺失，與另一核酸(或其互補鏈)進行最佳比對時，通過任何已知的序列同一性算法，如fasta、blast或gap測量的核苷酸堿基的核苷酸序列的同一性為至少約85％、至少約90％，和至少約95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。當用在多肽上時，術語“基本同一性”或“基本相似性”是指當兩個多肽序列用如gap或bestfit程序使用默認空位權重進行最佳比對時，共享至少約70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性；例如，70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在某些實施方案中，不相同的殘基位置的差異在于保守氨基酸變化?！爸委熡行Я俊笔侵甘┯迷搫┝康闹委焺⒕徑馑委熂膊〉闹辽僖环N征兆或癥狀或增加或提高可用于治療il-6相關疾病的另一療法(如另一種治療劑)的預防和或治療效果。應當理解治療有效量可以在有限的時間內多劑量施用或作為長期治療?！爸委煛笔侵妇徑饧膊〉囊环N或多種體征或癥狀的方法。如本發(fā)明所用，術語“疾病”包括疾病和病癥。本發(fā)明所提到的每一個專利文件和科學文章的全部公開，以及在此所引用的這些專利文件和科學文章，出于所有的目的通過引用明確地并入本文中。本發(fā)明其他的特點和優(yōu)勢在下面詳細描述。附圖簡述圖1是說明實驗結果的圖表，該實驗在大鼠cnv模型中ivt施用抗il-6抗體?？箆egf抗體作為陽性對照被施用且陰性對照是載體本身?？?il-6對載體對照，第15天時p＝0.0054，第22天時p＝0.0005。圖2是說明測試鼠64抗體抑制il-6/il-6r結合gp130的能力的結合實驗結果的圖表。圖3a是說明實驗的圖表，該實驗中測試了020在缺乏過多的可溶性il-6rα的情況下阻斷il-6信號傳導的能力。實驗是在具有0.2ng/mlil-6和2μg/mlil6rα情況中在hek-blue-il-6細胞上進行。圖3b是說明實驗的圖表，該實驗中測試了020在過多的可溶性il-6rα存在的情況下阻斷il-6信號傳導的能力。實驗是在具有0.2ng/mlil-6和2μg/mlil6rα的情況中在hek-blue-il-6細胞上進行。圖4是說明在小鼠cnv模型中ivt施用單克隆抗il-6抗體(“il-6阻斷”)的實驗結果的圖。對照為無處理(對側眼)，玻璃體內注射抗vegf抗體(“vegf阻斷”)或玻璃體內注射抗hrp同種型對照抗體(“對照抗體”)。圖5顯示了相對于野生型抗體(ebi-029)，具有以下突變的抗體與il-6的結合：(1)i51t/s55g,(2)a28v/i51t/s55g,(3)s30p/i51t/s55g,和(4)a28v/s30p/i51t/s55g(也稱為ebi-030)。圖6顯示了用il-6和下列fab之一處理的hek-bluetmil6報告細胞中的信號傳遞分數(shù)(fractionalsignaling)：(1)wt(ebi-029),(2)a28v/i51t/s55g,(3)s30p/i51t/s55g,(4)a28v/s30p/i51t/s55g(ebi-030)。圖7顯示了用il-6和下列fab之一以顯示的濃度處理的t1165.85.2.1細胞中的發(fā)光(il-6誘導的增殖的量度)：(1)wt(ebi-029),(2)a28v/i51t/s55g,(3)s30p/i51t/s55g,(4)a28v/s30p/i51t/s55g(ebi-030)。圖8顯示了用20pmil-6和各種濃度的以下項處理的hek-bluetmil6報告細胞中產生的信號傳遞：(1)hek-6e細胞中產生的ebi-029igg2(ebi029),(2)hek-6e細胞中產生的ebi-030igg2(ebi030),和(3)hek-6e細胞中產生的ebi-030igg2-h311a(ebi030h311a)；(4)托珠單抗(toci)和(5)穩(wěn)定的cho池中產生的ebi-030igg2(ebi-030cho)。圖9描述了實施例20中描述的藥代動力學模型。圖10描述了使用實施例20中描述的藥代動力學模型模擬的增加抗體效力對眼睛中il-6抑制的持續(xù)時間的影響。圖11顯示玻璃體內施用后玻璃體中ebi-029，ebi-029-h311a，ebi-030，ebi-030-h311a，和托珠單抗(tcz)隨著時間的藥物濃度。圖12顯示玻璃體內施用后視網膜中ebi-029，ebi-029-h311a，ebi-030，ebi-030-h311a，和托珠單抗(tcz)隨著時間的藥物濃度。圖13顯示玻璃體內施用后眼房水中ebi-029，ebi-029-h311a，ebi-030，ebi-030-h311a，和托珠單抗(tcz)隨著時間的藥物濃度。圖14顯示玻璃體內施用后脈絡膜中ebi-029，ebi-029-h311a，ebi-030，ebi-030-h311a，和托珠單抗(tcz)隨著時間的藥物濃度。圖15a描繪了ebi-029(seqidno:11),ebi-030(seqidno:41),和ebi-031(ebi-031在本文中也稱為ebi-030-h311a)(seqidno：47)的重鏈序列中的fr1，cdr1，fr2，cdr2，fr3，cdr3，fr4，ch1，鉸鏈，ch2和ch3中的位置。圖15b描繪了輕鏈序列中的fr1，cdr1，fr2，cdr2，fr3，cdr3，fr4和ck的位置(ebi-029，ebi-030和ebi-031具有相同的輕鏈序列)(seqidno：12)。圖16a顯示用20pmil-6和各種濃度的ebi-031或托珠單抗處理的hek-bluetmil-6報告細胞中的信號傳遞分數(shù)。圖16b顯示用200pm超il-6和各種濃度的ebi-031或托珠單抗處理的hek-bluetmil-6報告細胞中的信號傳遞分數(shù)。圖17顯出了實施例24中描述的計算模擬的結果。圖18顯示了由于二硫鍵改組(shuffling)引起的igg2抗體的三種不同結構亞型的示意圖。圖19顯示ebi-031樣品的rp-hplc層析圖：未處理(頂圖)，5mmdtt(中間圖)，10mm半胱氨酸(底圖)。圖20顯示了從不同ebi-031細胞系收集的ebi-031樣品的rp-hplc層析圖：克隆細胞系的200l規(guī)模培養(yǎng)物(頂部圖)，來自親本細胞系的10l規(guī)模培養(yǎng)物(中間圖)，和穩(wěn)定轉染的細胞池(底圖)。圖21顯示了從克隆細胞系的200l規(guī)模培養(yǎng)物收集的ebi-031的rp-hplc層析圖，并指定和定量層析圖中每個峰表示的亞型。圖22a是顯示來自非洲綠猴(k797)的藥代動力學數(shù)據的圖，如實施例26所述。圖22b是顯示來自非洲綠猴(k679)的藥代動力學數(shù)據的圖，如實施例26所述。圖23是顯示來自兩種非洲綠猴(k797或k679)藥代動力學數(shù)據和擬合曲線的圖。圖24a顯示玻璃體內施用后玻璃體液中隨著時間的ebi-031的藥物濃度。圖24b顯示玻璃體內施用后眼房水中隨著時間的ebi-031的藥物濃度。圖24c顯示玻璃體內施用后脈絡膜中隨著時間的ebi-031的藥物濃度。圖24d顯示玻璃體內施用后結膜中隨著時間的ebi-031的藥物濃度。圖24e顯示玻璃體內施用后角膜中隨著時間的ebi-031的藥物濃度。圖24f顯示玻璃體內施用后虹膜睫狀體中隨著時間的ebi-031的藥物濃度。圖24g顯示玻璃體內施用后晶狀體中隨著時間的ebi-031的藥物濃度。圖24h顯示玻璃體內施用后視網膜中隨著時間的ebi-031的藥物濃度。圖24i顯示玻璃體內施用后鞏膜中隨著時間的ebi-031的藥物濃度。發(fā)明詳述已經暗示il-6在諸如類風濕性關節(jié)炎的多種疾病中起作用，且已經報道在包括眼部疾病在內的多種疾病中顯著上調。il-6可通過順式和反式機制起作用。在順式機制中，認為游離的il-6結合至膜結合型il-6受體(il-6r，也稱為il-6rα和cd126)，且然后，il-6/il-6r復合物與gp130(也稱作cd130、制瘤素m受體、il-6rbeta和il-6信號轉導物)相互作用，以激活含有所述復合物的細胞中的信號傳導。在反式機制中，游離的il-6結合可溶性il-6受體(sil-6r)。il-6/sil-6r復合物然后能夠結合存在于細胞膜上的gp130。這些機制間關鍵的不同之處在于表達gp130的細胞類型多于表達il-6r(其表達是更有限的)的細胞類型。因此在希望抑制il-6信號傳導的疾病中，例如在那些希望廣泛地抑制il-6信號傳導的疾病中，抑制順式和反式il-6信號兩者是有用的。申請人已經工程化了il-6拮抗劑，如抗il-6抗體、片段和衍生物，該拮抗劑能夠抑制il-6的順式和反式的信號傳導。此外，申請人已經工程化了這樣的il-6拮抗劑以實現(xiàn)更快速的系統(tǒng)清除。il-6拮抗劑，例如il-6抗體及其片段或衍生物，描述在wo2014/074905中，將其全部內容通過引用并入本文。本發(fā)明涉及改進的il-6抗體及其用途。除非上下文另有明確說明，如本文所使用的包括但不限于“一”，“一個”或“那個”的單數(shù)術語包括復數(shù)。il-6拮抗劑(il-6a)的特點一般而言，本發(fā)明描述的il-6拮抗劑(il-6a)特異地結合il-6的位點ii(位點2)，且對于il-6相關的眼病和某些其他疾病的治療是有用的。il-6相關的眼病是一種疾病，其中不希望的癥狀或疾病的生物學活性與il-6的表達或存在有關。在一些實施方案中il-6a對游離的和結合的il-6具有高親和力，在機體中是相對穩(wěn)定的，能夠抑制結合到il-6r的il-6(本發(fā)明中被稱為il-6/il-6r復合物或il-6/il-6r)與gp130的結合，并且能具有治療效果。一般來說，il-6a是抗體或衍生自抗體。例如，il-6a是高親和性的人源化fab，其能夠特異地結合il-6的位點ii并有效阻止順式和反式il-6信號傳導。在另一個例子中，il-6a是全長抗體，如igg1或igg2抗體。在一些實施方案中，fab也被設置為fc-工程化的序列或位于全長的抗體中。在一些實施方案中，fc-工程化的il-6a(如fc-工程化的fab)與適當?shù)膶φ障啾?，如與相應的不具有工程化的fc的抗體、其片段或衍生物相比，具有更快的全身清除。il-6a的這些和其他特點在本發(fā)明中被進一步描述。申請人已經設計出選擇地結合il-6的位點ii的il-6拮抗劑以提供il-6信號傳導的廣泛抑制，因為這類分子可以抑制gp130與il-6的結合，無論il-6是游離的，結合膜il-6r或結合sil-6r。此外，靶向配體(il-6)相對于il-6受體可以避免受體介導的清除和由adcc帶來的毒性(抗體依賴的細胞介導的細胞毒性)。由于il-6在疾病中起到病理和保護性作用，因此使用il-6拮抗劑(il-6a)治療與增加的il-6相關的疾病可以改善某些方面的狀況，但也可能造成顯著的副作用，如系統(tǒng)性效應。這種il-6通路的雙重性(如具有希望的和/或不希望的效應的能力)使其不適合作為全身性抑制劑治療il-6相關病癥。因此，本發(fā)明提供的組合物和方法對于治療是有用的，所述組合物抑制至少一種il-6的活性但對il-6的積極活性不具有不當?shù)挠绊懀糠忠驗樗鼋M合物能被配制為局部遞送，如配制為局部遞送至眼睛。例如，在某些方面，il-6a被設計為適合于遞送至特定位點的尺寸。在一些實施方案中，il-6a是全長抗體。在一些實施方案中，il-6a衍生自抗體且處于一種可在眼睛的玻璃體中具有更長的停留期和有限的系統(tǒng)性漏出(systemicleakage)的方式。在一些實施方案中，il-6a是修飾的抗體(如具有修飾的fc結構域的抗體)，與相應的未修飾的抗體相比，其在眼睛的玻璃體中具有更長的停留期和/或更為有限的全身性漏出。在一些實施方案中il-6a是igg2抗體。在一些方面，il-6a是相對小的il-6a，如抗體的片段或其他抗體衍生物即小于全長抗體，例如衍生自il-6抗體的fab。在一些情況下，il-6a處于一種能夠從一個組織的一部分傳遞到另一個組織并與相應的全長il-6抗體相比具有增加的動力學的形式。在一些實施方案中，il-6a是被工程化為更大分子的fab，其與fab單獨相比更可能在被遞送的區(qū)域中具有延長的停留，例如il-6a通過fc結構域二聚化。在某些實施方案中，fc結構域被工程化從而使fc部分具有消弱的(ablated)或減弱的fcrn結合，從而可以與包含野生型fc的相同的il-6結合體(il-6bindingentity)相比減少全身積累。工程化的fc域可以是，例如，igg1結構域或igg2結構域。通常，本發(fā)明所描述的il-6拮抗劑對其靶標il-6具有足夠高的親和性從而有效改善il-6的至少一個不希望的效應，并且還是足夠穩(wěn)定的以有助于其作為治療劑。一般而言，il-6a的pk，如適合用在眼睛中的il-6a在遞送的位點(如玻璃體)中具有提供治療效果的足夠長的半衰期。在非限定的例子中，所述pk可以是至少8天、10天、14天、21天、28天或30天的半衰期。結合到位點ii的il-6拮抗劑的鑒定一般來說，本領域中已知的任何方法都可用于生產能夠結合il-6的分子，例如，實驗中，多肽文庫或分子文庫可用于篩選具有結合到il-6的能力的多肽或化合物的候選化合物。一旦鑒定了該候選化合物，可以使用本領域中已知的方法確定化合物的結合位點。例如，可以測試分子結合到野生型il-6的能力并將該結合力與該分子與在位點i、位點ii或位點iii突變了的il-6的結合能力作比較。在實施方案中，本發(fā)明所述的il-6a保留結合到il-6/il-6rα復合物和結合到il-6的能力，并阻止il-6/il-6rα結合到gp130。在實施方案中，例如本發(fā)明所述的il-6a通過與il-6的位點ii的結合能夠與gp130競爭結合il-6/il-6rα復合物?？梢允褂帽绢I域已知的方法測定該結合能力。例如，可使用hek-bluetmil-6測定系統(tǒng)(invivogen,sandiego)測試il-6a候選物。hek-bluetmil-6細胞是穩(wěn)定轉染了人il-6r和stat3-可誘導seap報告基因的hek293細胞。在il-6存在下，stat3被激活且seap被分泌。例如可以使用quanti-bluetm(invivogen,sandiego)測定seap。向細胞加入il-6拮抗劑抑制了游離和可溶性受體與il-6的結合，從而阻止了seap的分泌或降低了seap的水平。kd指特定抗體-抗原相互作用或抗體片段-抗原相互作用的結合親和平衡常數(shù)。在實施方案中，本文描述的抗體或抗原結合片段以低于或等于250pm，如低于或等于225pm、220pm、210pm、205pm、150pm、100pm、50pm、20pm、10pm或1pm的kd與抗原(例如il-6)特異性結合?？墒褂矛F(xiàn)有技術中已知的方法確定kd，例如表面等離振子共振，如使用biacoretm系統(tǒng)確定kd。koff指特定抗體-抗原相互作用或抗體片段-抗原復合物的解離速率常數(shù)?？墒褂帽砻娴入x振子共振，例如使用biacoretm系統(tǒng)確定解離速率常數(shù)。一個相對慢的koff可產生治療所希望的特征，如允許以低頻率向需要該治療的個體施用抑制劑。特異性在一些實施方案中，本文所述的il-6a特異性結合靶物，例如il-6。通常，本文所用的“特異性結合”指示分子優(yōu)先結合選擇的分子并且展示對一種或多種其它分子的低得多的結合親和力。在實施方案中，對另一分子的結合親和力比對靶物的結合親和力低1、2、3或更多個數(shù)量級。如上文所討論，il-6可作為游離il-6和作為結合到可溶性il-6rα的il-6存在。申請人已經鑒定出，與結合il-6位點i的抑制劑相比，il-6的位點ii是il-6拮抗劑的最佳靶點。位點i的抑制劑可抑制游離il-6與il-6rα的結合。然而，該抑制劑不能阻止由事先存在的復合物所引起的活性，除非通過替換，其受限于il-6/il-6r復合物的koff。在另一個可選方案中，結合il-6rα的抑制劑是不太合適的，因為除非其以飽和濃度存在，該抑制劑具有有限的阻止il-6活性的能力。由于il-6受體的量較il-6的量通常是相當高的，因此這種方法可能需要施用不期望的大量的通過與受體結合來抑制il-6活性的化合物。在實施方案中，本發(fā)明所描述的il-6拮抗劑(如本發(fā)明所描述的抗體和片段及其衍生物)能夠甚至當il-6結合到il-6r時阻斷il-6的活性。因此，本發(fā)明所描述的il-6a的優(yōu)勢在于與靶向il-6受體的抑制劑相比，實現(xiàn)治療效果所需施用的化合物的量相對較小?？故荏w抗體已被報道通過受體介導的清除被快速清除，這顯著限制了抗體的pk，因此需要加大劑量、更高頻給藥或使用前述兩者。另外，抗受體抗體和抗位點iil-6抗體的問題在于它們通過阻斷配體的正常受體介導的清除途徑顯著地增加了il-6的組織濃度，從而使受試者處于組織中il-6的潛在不需要的水平。此外，使用靶向il-6rα的抑制劑可能使抑制劑必需存在于尋求抑制劑的位點和不希望的位點(如全身治療)附近。使用與位點ii(gp130結合該位點)結合的il-6a允許抑制游離的il-6以及結合了il-6r的il-6，但并不激活經過gp130的il-6途徑。因此，不受理論的限制，本發(fā)明所描述的il-6拮抗劑被設計為結合兩種形式的il-6(可溶的和結合到受體的)，特別是結合到il-6的位點ii的拮抗劑，該拮抗劑能夠結合兩種形式的il-6。本發(fā)明所描述的包含il-6a的組合物可通過il-6抑制順式和反式信號。在某些情況下，本發(fā)明所提供的化合物和方法被設計為提供一種有效的il-6阻斷劑，其足以治療至少一種il-6相關病癥的征兆或癥狀，如抑制血管發(fā)生和/或炎癥。本發(fā)明所描述的化合物還可用于治療以不期望的高水平il-6為特征的眼病，如在玻璃體中的疾病(參見yuuki等人，,jdiabetescompl15:257(2001)；funatsu等人，,ophthalmology110:1690,(2003)；oh等人，,curreyeres35:1116(2010)；noma等人，,eye22:42(2008)；kawashima等人，,jpnjophthalmol51:100(2007)；kauffman等人，,investophthalmolvissci35:900(1994)；miao等人，,molecvis18:574(2012))。通常，本發(fā)明所描述的il-6a是il-6信號傳導強效拮抗劑。在一些實施方案中，本文所述的il-6a對il-6具有高親和力，例如，在使用10pmil-6的hek-blueil-6試驗中ic50小于或等于100pm?？筛鶕l-6a的kd確定il-6a的高親和性，例如，小于或等于1nm的kd、小于或等于500pm的kd、小于或等于400pm的kd、小于或等于300pm的kd、小于或等于240pm的kd或小于或等于200pm的kd。為了制備可用于治療與增加的il-6表達或活性有關病癥的生物制劑il-6a(例如蛋白或多肽如抗體、片段或其衍生物)，通常最好是所述生物制劑il-6a具有高的產率。例如，合適的產率為高于或等于1g/l(如高于或等于2g/l、高于或等于5g/l或高于或等于10g/l)。為了有效地施用il-6拮抗劑，需要抑制劑具有與將要施用的濃度相匹配的溶解度。例如，在全長抗體的il-6a的情況下，其溶解度大于或等于20mg/ml、大于或等于10mg/ml、大于或等于5mg/ml或大于或等于1mg/ml。另外，抑制劑必須具有遞送的體溫下的高度穩(wěn)定性和活性位點及儲存穩(wěn)定性從而成為一種可行的治療。在實施方案中，抑制劑具有高于或等于60℃的tm(如高于或等于60℃、高于或等于62.5℃、高于或等于65℃、高于或等于70℃、高于或等于73℃、或高于或等于75℃)。在實施方案中，抑制劑具有高于或等于45℃的tonset，如高于或等于50℃、高于或等于51℃、高于或等于55℃或高于或等于60℃?？梢杂帽绢I域已知的方法確定tm和tonset的方法?？蓮谋绢I域中已知的分子的類型中選擇具有所需要的特性的拮抗劑，例如抗體，包括靶向il-6的位點ii的抗體的片段和衍生物，其一般保留或維持足夠的親本il-6抗體的特征(如需要的結合特性)。該拮抗劑包括fab片段、scfvs、工程化的含有fc部分的fab片段，以及工程化的具有不同于親本il-6的位點ii靶向抗體框架的全長抗體。在一些方面中，本發(fā)明所描述的il-6a包括人抗體抗原結合位點，該位點能夠競爭或交叉競爭能夠結合il-6的位點ii的抗體或其片段。例如，抗體或其片段可以由本發(fā)明中公開的vh結構域和vl結構域組成，且vh和vl結構域包含本發(fā)明中公開的il-6/位點ii結合抗體的一組cdrs?？墒褂萌魏魏线m的方法，例如通過突變il-6上的多種位點來確定與il-6a結合的結構域和/或表位。那些含有突變的表位阻止或降低il-6a的結合，且il-6配體直接參與與il-6a的結合或如通過影響il-6的構型間接影響結合位點?？梢允褂闷渌椒ù_定il-6a所結合的氨基酸。例如，可以使用肽-結合掃描，如基于pepscan的酶聯(lián)免疫試驗(elisa)。在這種類型的肽-結合掃描中，源自抗原的短重疊肽被系統(tǒng)地針對其與結合成員的結合進行篩選。所述肽可以共價地連接于支持物表面，以形成肽陣列。肽可以是線性的或受限的構象?？梢允褂迷诿恳浑男蛄械哪┒司哂邪腚装彼?cys)殘基的多肽產生受限的構象。可將cys殘基直接或間接共價偶聯(lián)到支持物表面從而使肽保持環(huán)形構象。因此，所述方法中所使用的肽可能具有一個添加在與抗原片段相關的肽的每一末端的cys殘基。還可使用雙環(huán)形肽，其中cys殘基額外地定位于或靠近肽序列的中間部位。可將cys殘基直接或間接共價偶聯(lián)到支持物表面從而使肽形成雙環(huán)的在中央cys殘基的每一側具有一個環(huán)的構象。可以合成產生肽，因而可以在需要的位置修飾cys殘基，盡管其不是在il-6的位點ii序列天然發(fā)生的。任選地，可在肽-結合試驗中篩選線性或構象受限的肽。肽-結合掃描可包括鑒定(如使用elisa)一組結合到結合成員的肽，其中所述肽具有與il-6a的片段相對應的氨基酸序列(如包括il-6a的約5、10或15個連續(xù)殘基的肽)，以及比對所述肽以確定結合成員所結合的殘基的足跡，其中該足跡包含重疊肽共同的殘基。可選地或額外地，可以使用肽-結合掃描方法以至少選定的信號：噪音比鑒定il-6a要結合的肽?？墒褂帽绢I域中已知的其他方法確定抗體所結合的殘基，和/或確認肽-結合掃描結果，包括例如，定點突變(如本發(fā)明所描述的)、氫氘交換、質譜、nmr和x-射線晶體法。一般地，本發(fā)明所描述的有用的il-6a是人抗體分子、人源化抗體分子或其結合片段。通常，抗體是單克隆抗體。該抗體的來源可以是人、小鼠、大鼠、駱駝、兔子、羊、豬或牛，且可按照那些本領域中已知的方法生產所述抗體。通常，il-6a至少包含抗體的cdr，所述cdr特異地結合至il-6(例如人il-6)，例如結合至il-6的位點ii。帶有本發(fā)明的cdr或一組cdrs的結構可以是抗體重鏈或輕鏈序列或其實質性部分，在重鏈和輕鏈中cdr或一組cdrs位于天然發(fā)生的由重排免疫球蛋白基因編碼的vh和vl抗體可變結構域的cdr或一組cdrs的對應位置。可通過參考kabat等人，1983(國立健康研究院)以及使用任何因特網搜索引擎在“kabat”下查找到的更新(updates)來確定免疫球蛋白可變結構域的結構和位置。如本文公開的il-6a通常是一般包含抗體vh結構域和/或vl結構域的抗體。vh結構域包含一組重鏈cdrs(vhcdrs)，以及vl結構域包含一組輕鏈cdrs(vlcdrs)。本文在實施例中提供了此類cdrs的例子。抗體分子可包含含有vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3和框架的抗體vh結構域。其可選地或還包含含有vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3和框架的抗體vl結構域。本發(fā)明所公開的il-6拮抗劑包含如那些在本發(fā)明中所公開的vhcdr1和/或vhcdr2和/或vhcdr3和/如那些在本發(fā)明中所公開的vlcdr1和/或vlcdr2和/或vlcdr3。il-6a可包含一個或多個本發(fā)明所描述的任何抗體、片段或衍生物的cdrs。il-6a可包含一組vhcdrs(如vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3)，且可選地其還可以包含一組vlcdrs(如vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3)。cdrs可源于一種或多種本發(fā)明所描述的抗體、片段或衍生物。例如，vlcdrs可源于與vhcdrs相同或不同的抗體。通常，vh結構域與vl結構域配對以提供一個抗體抗原結合位點。例如seqidno：1或seqidno：3的hc結構域與seqidno：2的lc結構域配對。在某些情況下，vh或vl結構域獨自可以用作il-6a。在某些方面，il-6a是抗體分子、片段或其衍生物，其包含(i)與本發(fā)明所描述的vh結構域(例如seqidno：37)具有至少60、70、80、85、90、95、98或99％氨基酸序列同一性的vh結構域序列，或(ii)來自vh域序列的一組vhcdrs(如，vhcdr1、vhcdr2和/或vhcdr3)。在實施方案中，抗體分子、片段或其衍生物包含seqidno：37的vhcdr1、vhcdr和vhcdr3。在實施方案中，抗體分子、片段或其衍生物包含整體上與seqidno：37的vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3的差異不超過1個、不超過2個、不超過3個、不超過4個或不超過5個氨基酸的vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3?？贵w分子、片段或其衍生物還可以任選地包含(i)與本發(fā)明所描述的vl結構域(例如seqidno：38的vl結構域)具有至少60、70、80、85、90、95、98或99％氨基酸序列同一性的vl結構域序列，或(ii)來自vl域的一組vlcdrs(如，vlcdr1、vlcdr2和/或vlcdr3)。在實施方案中，抗體分子、片段或其衍生物包含seqidno：38的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3。在實施方案中，抗體分子、片段或衍生物包含整體上與seqidno：38的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3的差異不超過1個、不超過2個、不超過3個、不超過4個或不超過5個氨基酸的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3。能夠用于計算兩氨基酸序列百分比同一性的算法包括例如blast、fasta，或smith-waterman算法，如采用缺省參數(shù)。本發(fā)明所描述的il-6a可包含抗體恒定區(qū)或其部分，如人抗體恒定區(qū)或其部分。例如，vl結構域可以在其c-末端附著包括人ck或cl鏈的抗體輕鏈恒定結構域。相似的，基于vh結構域的il-6a能夠在其c-末端附著免疫球蛋白重鏈的全部或部分(如ch1結構域)，該重鏈源于任何同種型抗體，如igg、iga、ige和igm以及任何的同種型亞類，特別是igg1、igg2、igg3和igg4。在實施方案中，將抗體或抗原結合片段工程化以減少或消除adcc活性。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體是igg2抗體。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體包含如本文所述的igg2框架，igg2恒定區(qū)或igg2fc區(qū)。igg2抗體可以作為三種主要結構亞型存在：igg2-a，igg2-b和igg2-a/b(wypychj.等人，journalofbiologicalchemistry.2008,383：16194-16205)。這種結構異質性是由于將fab臂連接到重鏈鉸鏈區(qū)的二硫鍵的不同構型。在igg2-a亞型中，沒有將fab臂連接到鉸鏈區(qū)的二硫鍵。在igg2-b亞型中，兩個fab臂具有將重鏈和輕鏈與鉸鏈區(qū)連接的二硫鍵。igg2-a/b亞型是igg2-a和igg2-b亞型之間的混雜，其中僅一個fab臂具有將fab臂的重鏈和輕鏈連接到鉸鏈區(qū)的二硫鍵。兩種或所有不同結構亞型之間的igg2抗體的轉化，也稱為二硫鍵改組，天然地發(fā)生于在體內和體外的天然存在和重組抗體中。因此，本領域中igg2抗體的制劑包含igg2-a，igg2-b和igg2-a/b亞型的異質混合物。不同的igg2亞型可以具有獨特和不同的功能性質，例如在穩(wěn)定性，聚集，粘度，fc受體結合或效力中的差異。igg2抗體制劑中多種亞型的存在或特定亞型增加的水平可以不利地影響穩(wěn)定性，聚集或效力。本發(fā)明提供了具有主要以igg2-a或igg2-a/b亞型存在的優(yōu)點的抗體。本發(fā)明的抗體不以igg2-b亞型存在，或者在大量的時間中不以igg2-b亞型存在。因此，包含本發(fā)明抗體的組合物和制劑與本領域已知的其它igg2抗體相比是較少的異質性的，并且因此更優(yōu)選地用于治療應用。包含本發(fā)明抗體的組合物主要包含抗體的igg2-a和/或igg2-a/b亞型。在一個實施方案中，包含本文所述抗體的組合物包含至少50、60、70、80、90、95、96、97、98或99％的igg2-a或igg2-a/b亞型的抗體。在一個實施方案中，包含本文所述的抗體的組合物總的來說包含至少60、70、80、90、95、96、97、98或99％的igg2-a和igg2-a/b亞型。在此類實施方案中，包含本文所述抗體的組合物不包含大量的igg2-b亞型的抗體。例如，組合物包含少于10％，5％，2％，1％，0.5％或0.1％的igg2-b亞型的抗體。在某些情況下，本發(fā)明的抗體被進一步使用本領域已知的方法修飾以制備具有特定同種異型(allotype)的序列，例如一種在具有特定地域起源的人群中占主導地位的同種異型。在某些情況下，修飾人類重鏈恒定區(qū)以達到該目的。il-6a可以是抗體分子、其結合片段或變體，其具有在抗體框架內的一個或多個cdrs，例如一組cdrs。例如，抗體(例如本發(fā)明所描述的抗體或其片段或衍生物)的一個或多個cdrs或一組cdrs可以被移植到框架中(如人框架)以提供抗體分子?？蚣軈^(qū)可以是源自人種系基因序列，或可以是非種系來源的。vh和/或vl框架殘基可以如所討論的那樣被修飾并在本發(fā)明中作為例子，如使用位點特異性突變?？梢栽谠醋园邢騣l-6的位點ii的抗體il-6a(本發(fā)明中定義為“參考il-6抗體”)的一個或多個框架區(qū)和/或一個或多個cdrs中使用本領域已知的方法和參數(shù)進行氨基酸改變。本發(fā)明中還包括所產生的il-6拮抗劑，其保留了與il-6的位點ii(如人il-6的位點ii)的結合且與參考il-6抗體相比通常具有至少相同的結合或提高的親和力。在一些情況下，為了改善諸如穩(wěn)定性的參數(shù)，可以引入導致與參考il-6a(如參考抗體)相比降低的結合親和力的變化以制備有用的il-6a。在某些實施方案中，例如在某些情況下，其中所述參考涉及fcrn結合或藥代動力學(pk)參數(shù)，如在玻璃體中的半衰期或全身的半衰期(如，在血液、血漿、血清、淋巴、肝、腎、其他組織或體液)，參考抗體可以是非特異地結合il-6的抗體。il-6a多肽的氨基酸序列中的變化可包括用非天然發(fā)生或非標準氨基酸取代一個或多個氨基酸殘基，將一個或多個氨基酸殘基修飾為非天然發(fā)生或非標準形式，或在序列中插入一個或多個非天然發(fā)生或非標準氨基酸。本發(fā)明序列中改變的數(shù)量和位置的例子在本發(fā)明別處描述。天然發(fā)生的氨基酸包括20種“標準的”l-氨基酸，其由它們的標準單字母被確定為g、a、v、l、i、m、p、f、w、s、t、n、q、y、c、k、r,、h、d、e。非天然發(fā)生氨基酸包括任何其他能夠滲入多肽骨架或源自已有氨基酸殘基修飾的殘基。非標準氨基酸可以是天然發(fā)生或非天然發(fā)生的氨基酸。本領域已知數(shù)種天然發(fā)生的非標準氨基酸，如4-羥脯氨酸、5-羥賴氨酸、3-甲基組氨酸和n-乙酰絲氨酸。那些在n-alpha位置衍生化的氨基酸殘基將僅能位于氨基酸序列的n-末端。氨基酸一般地為l-氨基酸。在一些情況下，氨基酸是d-氨基酸。因此改造可以包含將l-氨基酸修飾為，或將其替換為d-氨基酸。氨基酸的甲基化、乙?；?或磷酸化形式是已知的，且本發(fā)明中的氨基酸可進行該種修飾。本發(fā)明的抗體結構域和結合成員中的氨基酸序列可包含本發(fā)明所討論的非天然或非標準氨基酸?？梢允褂帽绢I域中已知的方法，例如分子的合成或合成后修飾或氨基酸的替換，將非標準氨基酸(如d-氨基酸)滲入氨基酸序列。在一些情況下，d-氨基酸被用于增加il-6a的pk?？赏ㄟ^隨機突變一個或多個選擇的vh和/或vl核酸序列在整個可變結構域中產生突變的方式產生本發(fā)明攜帶cdr來源序列的新的vh或vl區(qū)。例如可使用易錯pcr(chao等,natureprotocols,1:755-768(2006))。在一些實施方案中，在整個可變區(qū)或一組cdrs中進行一個或兩個氨基酸替換?？墒褂闷渌绢I域中已知的方法產生突變，例如一般在一個或多個cdrs中的定點突變。用于產生抗體il-6a的一種方法是通過添加、缺失、取代或插入一個或多個氨基酸來改變vh結構域，如本文公開的那些。改變的結構域可與vl結構域(例如本文公開的vl結構域)組合，所述vl結構域也可以使用本領域中已知的方法如本發(fā)明所描述方式被改變。測試這些改變了的分子結合il-6的位點ii的能力以及任選地測試其他需要的特性如與參考分子相比增加的親和力。在某些情況下，變體vh或vl結構域可具有1、2、3、4或5個這樣的改變(如1、2、3、4或5個氨基酸替換)。在實施方案中，本發(fā)明的il-6a是結合il-6的位點ii的抗體的片段并且包含抗原結合位點，如能夠結合il-6的位點ii的抗原結合位點。本發(fā)明的抗體片段一般從參考(親本)抗體分子獲得，如包含seqidno：41和seqidno：42的抗體分子?？墒褂帽绢I域中已知的方法如重組dna、酶切割(如使用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)、抗體的化學切割(如二硫橋的化學還原)的方式產生抗體片段。包含抗體抗原結合位點的抗體片段包括，但不限于分子如fab、fab'、fab'-sh、scfv、fv、dab、fd和二硫鍵穩(wěn)定的可變區(qū)(dsfv)?？梢愿脑彀ㄒ粋€或多個抗體抗原結合位點的多種其他抗體，包括例如f(ab’)2、f(ab)3、雙抗體、三鏈抗體、四鏈抗體和迷你抗體。抗體分子以及它們的構建和使用方法的例子描述于holliger和hudson,2005,natbiotechnol23:1126-1136。結合片段的非限定性的例子是由vl、vh、恒定輕鏈結構域(cl)和恒定重鏈結構域1(ch1)結構域構成的fab片段；由vh和ch1結構域構成的fd片段；由單鏈抗體(singleantibody)的vl和vh結構域構成的fv片段；由vh或vl結構域構成的dab片段；分離的cdr區(qū)；f(ab')2片段、含有兩個連接的fab片段的二價片段；單鏈fv分子(scfv)，其中vh結構域和vl結構域由肽連接子(linker)連接從而聯(lián)合兩結構域以形成抗原結合位點；雙特異性單鏈fv二聚體(如公開于wo1993/011161)以及使用基因融合(如公開于wo94/13804)構建的多價或雙特異性片段的雙抗體?？赏ㄟ^滲入連接vh和vl結構域的二硫橋來穩(wěn)定fv、scfv或雙抗體。還可以使用包含scfv連接到ch3結構域的迷你抗體作為il-6a。其他可用作il-6a的抗體的片段和衍生物包括fab'，其通過在重鏈ch1結構域的羧基末端添加數(shù)個氨基酸殘基(包括抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸)而不同于fab片段，以及包括恒定區(qū)的半胱氨酸分子帶有一個游離巰基的fab'-sh。在一些情況下，il-6a是抗體片段，其已被化學修飾以增強或引入需要的特性，如peg化或以增加半衰期或整合。dab(結構域抗體)是抗體的小單體抗原結合片段(抗體重鏈或輕鏈的可變區(qū)。vhdabs天然發(fā)生于駱駝科動物中(例如駱駝和美洲駝)并能通過用靶抗原免疫駱駝類動物、分離抗原特異性b細胞和直接從單個b細胞中克隆dab基因的方式產生。本發(fā)明的il-6a可以是包含大體上本發(fā)明中vh或vl結構域的dab，或包含大體上本發(fā)明中的一組cdrs的vh或vl結構域。本發(fā)明的抗體包括雙特異性抗體，該抗體的兩個不同的結構域被組合到相同分子中?？蓪l-6a作為雙特異性抗體的一部分滲入，所述抗體可使用本領域已知方法制備，例如化學制備或從雜交瘤制備。該分子可以是前文已討論過的類型的雙特異性抗體片段。產生雙特異性抗體的方法的一個非限制性的例子是bitetm技術，該技術中可使用具有不同特異性的兩個抗體的結合結構域并通過短的柔性肽直接連接。這將兩抗體組合成一個短的單肽鏈?？刹皇褂胒c區(qū)而僅使用可變結構域來構建雙抗體和scfv，這潛在地減輕了抗獨特型反應。雙特異性抗體可構建為整個igg、構建為雙特異性fab'2、構建為fab'peg、構建為雙抗體或構建為其他雙特異性scfv。此外，兩種雙特異性抗體可利用本領域中已知的常規(guī)方法進行連接以形成四價抗體。雙特異性雙抗體，與雙特異性完全抗體相對，是有用的，在某種程度上是因為它們能夠被構建并在大腸桿菌中并表達?？蓮奈膸熘惺褂檬删w展示(wo1994/13804)容易地選擇出合適的結合特異性的雙抗體(以及許多其他多肽，如抗體片段)。如果保持雙抗體的一個臂恒定，例如，直接針對il-6的位點ii的特異性，則可以產生其他臂可變的文庫，從而選擇合適特異性的抗體。雙特異性全抗體可通過其他描述于wo1996/27011、wo1998/50431和wo2006/028936的改造工程化方法制備。在某些情況下，本發(fā)明的il-6a在非抗體分子中包含抗原結合位點，例如，通過合并一個或多個cdrs，如在非抗體蛋白骨架中的一組cdrs，將在下文中進一步討論。在某些情況下，cdrs被合并到非抗體的骨架中?？赏ㄟ^在非抗體蛋白骨架(如纖連蛋白或細胞色素b)上排列cdrs來提供il-6的位點ii的結合位點，或通過隨機或突變蛋白骨架內環(huán)(loop)的氨基酸殘基來賦予對il-6的位點ii的結合特異性。用于蛋白中工程化的新的結合位點的骨架是現(xiàn)有技術已知的。例如用于抗體模擬物的蛋白骨架在wo200034784被公開，其描述了包括具有至少一個隨機化的環(huán)的纖連蛋白iii型結構域的蛋白(抗體模擬物)。任何免疫球蛋白超家族的結構域成員可提供適合于移植入一個或多個cdrs，如一組hcdrs的骨架。骨架可以是人或非人蛋白。非抗體蛋白骨架的優(yōu)勢在于其可以在骨架分子中提供抗原結合位點，所述骨架分子至少比一些抗體分子更小和/或更易制備。小尺寸的結合成員可帶來有用的生理特性，如進入細胞的能力、深度穿透組織或到達其他結構內的靶位，或結合靶抗原蛋白穴的能力。典型的是具有穩(wěn)定主鏈和一個或多個可變環(huán)的蛋白質，在可變環(huán)中一個環(huán)或多個環(huán)的氨基酸序列被特別或隨機突變以產生具有結合靶抗原特異性的抗原結合位點。該蛋白包括來自金黃色葡萄球菌(s.aureus)蛋白質a的igg結合結構域、轉鐵蛋白、四連接素(tetranectin)、纖連蛋白(如第10纖連蛋白的iii型結構域)和脂籠蛋白(lipocalins)以及γ-晶體和其他affilintm骨架(scilproteins,halle,germany)。其他方法的例子包括合成的微體，其基于環(huán)肽(cyclotides)--具有分子內二硫鍵的小蛋白(如versabodiestm,amunixinc.,mountainview,ca)和錨蛋白重復蛋白(darpins，如來自molecularpartnersag,zurich-schlieren,switzerland)。這些蛋白也包括小的，改造的蛋白結構域，如，免疫結構域(參見例如，美國專利公開第2003/082630和2003/157561號)。免疫結構域含有抗體的至少一個互補決定區(qū)(cdr)。il-6a可包含額外的氨基酸，如賦予所述分子除結合抗原的能力以外的其他功能特征的氨基酸。在一些情況下，il-6a攜帶一個可檢測的標記，或與毒素或靶向部分或酶綴合(如，通過肽鍵或連接子)。例如，il-6a可包含一催化位點(如在酶結構域中)和一抗原結合位點(如針對il-6的位點ii的結合位點)，這樣，抗原結合位點與抗原結合并因此靶向催化位點到il-6或il-6/il-6r復合物。所述催化位點能夠，在一些情況下，進一步抑制il-6的生物學功能，如通過切割il-6、il-6r，或其他與il-6a/il-6復合物有關的分子。在一些方面中，本發(fā)明包括與參考抗體相比已經被修飾的抗體il-6a以改變，例如增加、降低或消除il-6a的生物學效應。在一個實施例中，fc區(qū)被修飾或用修飾的fc結構域替換親本fc結構域以改變(與未修飾的親本相比)修飾的il-6a的藥代動力學。在一些實施方案中，il-6a經改造以具有igg2框架。在其他實施方案中，il-6a是在igg1或igg2框架中并具有修飾的fc，與親本或其他參考il-6a相比，其在ph6.0時增加了結合親和力而在ph7.0時基本上不改變結合親和力。在實施方案中，fc結構域被修飾且與親本或其他參考il-6a相比，所述il-6a具有減少的系統(tǒng)累積，降低的半衰期和/或增加的系統(tǒng)清除。在一些實施方案中，抗體il-6a被修飾以增加補體結合和補體依賴性細胞毒性。在其他方面中，抗體il-6a被修飾以增加(與參考抗體相比)抗體激活效應細胞和參與抗體依賴的細胞毒性(adcc)的能力。在一些情況下，本發(fā)明中所公開的抗體可以被修飾以增強其激活效應細胞和參與抗體介導的細胞毒性(adcc)的能力以及增加其補體結合和參與補體依賴性細胞毒性(cdc)的能力。在一些實施方案中，本發(fā)明所公開的抗體被修飾以減小其固定補體和參與補體依賴性細胞毒性(cdc)的能力。在另一個的實施方案中，抗體被修飾以減小其抗體激活效應細胞和參與抗體依賴的細胞毒性(adcc)的能力。在又一實施方案中，本發(fā)明所公開的抗體可以被修飾以減小其激活效應細胞和參與抗體介導的細胞毒性(adcc)的能力以及減小其補體結合和參與補體依賴性細胞毒性(cdc)的能力。避免頻繁地遞送il-6a劑量通常是有利的，例如，當注射遞送入眼睛時。為了促進這一特征，在某些實施方案中，本發(fā)明所公開的il-6a在遞送位點如玻璃體的半衰期為至少4天、例如至少7天、至少9天、至少11天或至少14天。在某些實施方案中，il-6a的平均半衰期為至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、25天、30天、40天、50天或60天。增加抗體半衰期的方法是本領域中已知的，例如描述于美國專利第6,277,375號和國際公開第wo1998/23289號和第wo1997/3461號。在一些實施方案中，il-6a在靶向遞送位點如玻璃體的半衰期大于全身半衰期，如血液、血漿、淋巴、肝、腎或其他組織或體液中的半衰期)。在其他實施方案中，本發(fā)明提供了一種包括容器的制造品。所述容器包括含有本發(fā)明所公開的il-6a的組合物，以及指示該組合物可用于治療il-6相關病癥的包裝說明書或標簽。一般地，該組合物是包含il-6a和藥學上可接受的賦形劑的組合物。在一些情況下，本發(fā)明是含有包含本發(fā)明所公開的il-6a的組合物以及指示施用者向需要治療的受試者施用所述組合物的說明的試劑盒。在需要大的il-6a的實施方案中，例如增強il-6a位于或在遞送位點附近的保留，增加大小但不顯著地對il-6a的功能(如對il-6或il-6/il-6r復合物的結合親和力)產生不利影響的部分可與il-6a聯(lián)合。例如可基因工程化fab以表達含fab和fc部分的單個多肽。在需要相對小尺寸的il-6a的實施方案中，可使用il-6的抗體或片段，例如scfv或fab片段。igg抗體的大小約為150kd，fab約為50kd，而scfv約為25kd。在一些實施方案中，本發(fā)明所描述的il-6a的大小小于約50kd。這種拮抗劑可以是，例如，小于或等于50kd并大于10kd、小于或等于50kd并大于20kd、小于或等于50kd并大于25kd。在一些情況下，通過制造變體來提高il-6拮抗劑(如具有二硫鍵的抗體或其他抑制劑)的穩(wěn)定性，其中該變體的一個或多個二硫橋比親本分子的更為穩(wěn)定。本發(fā)明所描述的某些il-6a分子的其他優(yōu)勢可以是有效的分子的可用性，所述有效的分子具有合適的遞送方式、遞送位點或活性模式的大小。例如，fab形式的il-6a可用于局部應用。改造該分子的方法在本發(fā)明中所描述并且是本領域已知的。適應癥/il-6相關疾病可用本發(fā)明的il-6a治療的疾病包括這些疾病，在這些疾病中升高的il-6與疾病狀態(tài)相關或作為疾病狀態(tài)的先決條件。這樣的疾病包括由il-6驅動的導致血管發(fā)生和炎癥的疾病病理。這包括與正常水平相比升高的il-6，例如玻璃體中il-6升高的疾病(如糖尿病黃斑水腫、糖尿病性視網膜病和葡萄膜炎)或眼組織中il-6升高的疾病。某些眼病的例子包括但不限于干眼(例如，干眼病或干眼綜合征)、過敏性結膜炎,葡萄膜炎,年齡相關性黃斑變性(amd),增生型糖尿病視網膜病變(pdr),糖尿病黃斑水腫(dme),孔源性視網膜脫離(rrd),視網膜靜脈阻塞(rvo),視神經脊髓炎(nmo)?？梢灾委煹钠渌奂膊“切┯赏鈧鹧鄄?，如角膜移植、角膜擦傷，或其他對眼睛造成的該類物理傷害。因此，本發(fā)明包括使用本發(fā)明所描述的il-6a治療患有il-6相關疾病的受試者的方法。在一些實施方案中，il-6相關疾病是炎性疾病。在一些實施方案中，該疾病是青光眼。在一些實施方案中，該疾病是眼部疼痛。在一些實施方案中，受試者的治療還包括確定受試者是否患有il-6相關疾病，和任選地，患者是否抵抗其他非il-6抑制治療，如類固醇或抗vegf治療。某些基于抗體治療的一個問題在于抗體在特定位置如眼睛，例如在玻璃體中，是有效的，但全身施用會導致副作用。一種解決方案是提供一種如本發(fā)明所述的分子為例的治療劑，相對于全身遞送，該治療劑可以局部遞送。由于一些局部遞送的(如遞送到玻璃體中)的治療劑在一定程度上會出現(xiàn)全身遞送，因此設計將具有相對快的全身清除(systemicturnover)的分子是有利的。申請人已經工程化了被設計為例如與親本分子或參考抗體相比能快速全身清除的il-6抗體的實例。這是通過突變fc域以修飾分子的fcrn結合，例如以減少fcrn介導的il-6a的再循環(huán)來實現(xiàn)的。糖尿病黃斑水腫(dme)。糖尿病黃斑水腫(dme)參與視網膜血管的阻塞和滲漏，造成視力下降和潛在的失明。對dme的標準治療方法包括局部施用類固醇或抗vegf抗體。然而很多病人對這些療法是難治的。糖尿病黃斑水腫的發(fā)病機理涉及血管發(fā)生、炎癥和氧化應激。il-6由缺氧和高血糖誘導并能增加血管炎癥、血管通透性和病理性血管發(fā)生。il-6可直接誘導vegf的表達并能在動物模型中促進脈絡膜血管新生。在dme患者中，眼睛的il-6水平與黃斑厚度和疾病的嚴重程度正相關。il-6水平被報道在抗vegf療法失敗的患者中升高而在抗vegf響應的患者中降低。因此，施用本發(fā)明所描述的il-6a與抗vegf治療劑組合來治療糖尿病患者或作為抗vegf治療的替代(包括那些對抗vegf治療不響應的患者)是有用的。用il-6a治療黃斑水腫還可通過去除完全抑制任何一種機制以抑制病癥的需求來提高其安全性，從而保留了各細胞因子的一些需要的生理作用。因此，局部il-6a治療與vegf抑制相組合能夠降低給藥頻率并減輕治療的副作用。在dme中，玻璃體il-6水平與疾病嚴重程度和vegf難治的受試者兩者正相關。因此本發(fā)明所記載的il-6a可用于治療對類固醇療法、抗vegf療法或兩者難治的dme受試者。在一些情況下，il-6a與抗vegf療法或類固醇療法組合使用，如治療dme。本發(fā)明所記載的il-6a還可用于治療病癥例如癌癥，如前列腺癌(prostatecancer)、白血病(leukemia)、多發(fā)性骨髓瘤(multiplemyeloma)，炎性病(如慢性炎癥增生疾病(chronicinflammatoryproliferativediseases))和自身免疫性疾病(autoimmunedisease)，如類風濕性關節(jié)炎(rheumatoidarthritis)、卡斯爾曼病(castleman'sdisease)(巨大或血管濾泡淋巴結增生(giantorangiofollicularlymphnodehyperplasia)、淋巴錯構瘤(lymphoidhamartoma)，血管濾泡性淋巴結增生(angiofollicularlymphnodehyperplasia))、幼年特發(fā)性關節(jié)炎(juvenileidiopathicarthritis)(包括多關節(jié)幼年特發(fā)性關節(jié)炎(polyarticularjuvenileidiopathicarthritis)和系統(tǒng)性幼年特發(fā)性關節(jié)炎(systemicjuvenileidiopathicarthritis))、斯蒂爾病(still'sdisease)(包括幼年特發(fā)性關節(jié)炎(juvenileidiopathicarthritis)和成年型斯蒂爾病(adultonsetstill’sdisease))、成年型斯蒂爾病(adultonsetstill’sdisease)、淀粉樣蛋白a淀粉樣變性病(amyloidaamyloidosis)、風濕性多肌痛(polymyalgiarheumatica)、緩解性血清陰性對稱性滑膜炎伴凹陷性水腫(remittingseronegativesymmetricalsynovitiswithpittingedema)、脊椎關節(jié)炎(spondyloarthritides)、白塞氏病(disease)(包括治療眼部表現(xiàn)(ocularmanifestations)的治療)、動脈粥樣硬化(atherosclerosis)、銀屑病(psoriasis)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosis)、多發(fā)性肌炎(polymyositis)(炎癥性肌病inflammatorymyopathy)、復發(fā)性多軟骨炎(relapsingpolychondritis)、獲得性血友病a(acquiredhemophiliaa)，多發(fā)性硬化癥(multiplesclerosis)，炎癥性貧血(anemiaofinflammation)，和克羅恩病(crohn’sdisease)。il-6拮抗劑還可用于治療某些神經疾病，例如抑郁癥和阿爾茨海默氏病?？捎帽景l(fā)明中所記載的il-6a治療其他疾病，包括但不限于全身性硬化癥(systemicsclerosis)、多發(fā)性大動脈炎(takayasuarteritis)、巨細胞性動脈炎(giantcellarteritis)、移植物抗宿主病(graftversushostdisease)、與腫瘤壞死因子受體相關周期性綜合癥(tnf-receptor-associatedperiodicsyndrometraps)。劑量可將il-6抗體或其片段施用給受試者(如患者)，所述受試者表達，例如異常的高水平的il-6?？贵w或其片段可一次施用，或可多次施用?？墒┯每贵w，例如，從每天三次到每六個月一次或更久?？梢园从媱澥┯萌缑刻烊?、每天兩次、每天一次、每兩天一次、每三天一次、每周一次、每兩周一次、每月一次、每兩個月一次、每三個月一次和每六個月一次?？贵w或片段可經由迷你泵或其他途徑如可植入的緩釋膠囊或通過生產抗體或其片段的細胞持續(xù)施用?？贵w或其片段可經由粘膜、口腔、鼻內、吸入、靜脈內、皮下、肌內、腸胃外、眼內或腫瘤內途徑給藥?？贵w或其片段可施用一次、至少兩次或在至少病癥被治療、減輕或治愈的時間段內施用。一般將施用抗體或其片段，只要病癥存在?？贵w或其片段，一般將其作為本發(fā)明所描述的藥物組合物的一部分施用?？贵w的劑量一般將在0.1到100mg/kg、0.5到50mg/kg,、1到20mg/kg和1到10mg/kg的范圍內。可通過任何合適的方法測量抗體或其片段的血清濃度。本發(fā)明所描述的某些化合物的一個特征在于它們需要相對不頻繁的給藥，例如每周一次、每周兩次、每周三次、每四周一次、每兩周一次、每8周一次、每12周一次、每16周一次、每32周一次、每月一次、每兩個月一次、每三個月一次或每六個月一次。在一些情況下，在需要的基礎上，確定(例如通過受試者的狀態(tài))化合物的施用。本發(fā)明所描述的允許相對不頻繁給藥的il-6拮抗劑的一個特征在于將高效力(至少部分是通過一旦結合到il-6則具有慢解離速率實現(xiàn)的)和遞送相對高濃度的化合物的能力相組合。在一些情況下，il-6a作為單一療法施用。在其他實施方案中，il-6a與甲氨蝶呤或其它疾病改善抗關節(jié)炎藥物同時施用?？贵w的產生可使用本領域已知方法如單克隆抗體方法學(如，參見kohlerandmilstein(1975)nature256:495)生產抗體il-6a或其衍生物或片段。還可采用其他制造單克隆抗體的技術如b淋巴細胞的病毒或致癌性轉化?？苫谑褂帽绢I域已知方法制備的小鼠單克隆抗體制備嵌合或人源化抗體。編碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白的dna可從感興趣的小鼠雜交瘤中獲得，以及所述dna可使用標準分子生物學技術改造以包含非小鼠(如人)的免疫球蛋白序列。例如，為了制備嵌合抗體，可使用本領域已知技術(參見例如美國專利第4,816,567號)將小鼠可變區(qū)與人恒定區(qū)相連接。為了制造人源化抗體，可使用本領域已知技術(參見例如美國專利第5,225,539號和第5,530,101；5,585,089；5,693,762號；和第6,180,370號)將小鼠cdr區(qū)插入人框架。在實施方案中，本發(fā)明所描述的il-6a(如抗il-6抗體或其衍生物或片段)能夠特異地結合人il-6。在實施方案中，il-6a能夠特異地結合il-6的位點ii(如人il-6的位點ii)。在一些實施方案中，il-6a抗體是人單克隆抗體。該抗體可使用包含部分人免疫系統(tǒng)而非小鼠系統(tǒng)的轉基因或轉染色體小鼠來產生。這些轉基因和轉染色體小鼠包括“人ig小鼠”，諸如humab和km參見，例如美國專利號5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299和5,770,429號；美國專利號5,545,807；pct公開號wo92/03918,wo93/12227,wo94/25585,wo97/13852,wo98/24884和wo99/45962；和pct公開號wo01/14424號。在其他方面中，可使用在轉基因或轉染色體中攜帶人免疫球蛋白序列的小鼠，如攜帶人重鏈轉基因和人輕鏈轉染色體的小鼠來生產人抗il-6抗體。這類小鼠在pct公開號wo02/43478中詳細描述。其他表達人免疫球蛋白基因的轉基因動物系統(tǒng)是本領域可獲得的，且能被用于生產抗體il-6a。例如可使用稱作xenomousetm(abgenix,inc.)的備選轉基因系統(tǒng)；此類小鼠被描述于例如美國專利號5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584；和6,162,963中。此外，表達人免疫球蛋白基因的轉染色體動物系統(tǒng)是本領域可獲得的，并可用于生產抗體il-6a。例如攜帶人重鏈轉染色體和人輕鏈轉染色體兩者的小鼠被描述于tomizuka等中(2000,procnatlacadsciusa97:722-727)。還可以使用scid小鼠制備人單克隆抗體，其中在該小鼠中重建了人免疫細胞從而可以通過免疫接種來產生人抗體應答。此類小鼠被描述于例如美國專利號5,476,996和5,698,767中。噬菌體展示文庫在一些情況下，抗體il-6a抗體或其衍生物或片段是在使用噬菌體合成人抗體文庫、用il-6(例如人il-6)或其片段篩選所述文庫、分離結合il-6的噬菌體以及從所述噬菌體獲得抗體的方法中產生的。還可以通過篩選重組組合抗體文庫來分離重組人抗體il-6a。一般來說，所述文庫是scfv噬菌體文庫，該文庫是用人vl和vhcdnas(從分離自b細胞的mrna中制備)產生的。制備和篩選這類文庫是本領域已知的。用于產生噬菌體展示文庫的試劑盒是商業(yè)上可獲得的(如pharmacia公司的重組噬菌體抗體系統(tǒng)，目錄號27-9400-01；和stratagenesurfzaptm噬菌體展示試劑盒，目錄號240612)。其他可用于生產和篩選抗體噬菌體文庫的方法和試劑是本領域已知的(參見，例如美國專利號5,223,409；pct公開號wo92/18619、wo91/17271、wo92/20791、wo92/15679、wo93/01288、wo92/01047、wo92/09690；fuchs等,bio/technology9:1370-1372(1991)；hay等,humantibodhybridomas3:81-85(1992)；huse等,science246:1275-1281(1989)；mccaffert等,nature348:552-554(1990)；griffiths等,emboj12:725-734(1993)；hawkins等人，,jmolbiol226:889-896(1992)；clackson等,nature352:624-628(1991)；gram等,procnatlacadsciusa89:3576-3580(1992)；garrad等,bio/technology9:1373-1377(1991)；hoogenboom等,nucacidres19:4133-4137(1991)；和barbas等,procnatlacadsciusa88:7978-7982(1991)，作為參考全部并入本文。在一個分離和生產具有所需要特征的il-6抗體的例子中，首先用人il-6抗體，使用表位印跡法來選擇相似il-6結合能力的重鏈和輕鏈序列，所述方法描述于pct公開號wo93/062l3中，作為參考并入本文。這一方法中所使用的抗體文庫一般為scfv文庫，該文庫的制備和篩選描述于pct公開號wo92/01047；mccafferty等,nature348:552-554(1990)；andgriffiths等,emboj12:725-734(1993)，作為參考全部并入本文。一旦選擇了初始人vl和vh結構域，就進行“混合并匹配”實驗，在該實驗中篩選不同對的初始選擇的vl和vh片段的il-6結合能力以選擇優(yōu)選的vl/vh對組合物。為了選擇il-6a所需要的特征，可隨機突變所選對的vl和/或vh片段。這種體外親和成熟例如可通過使用與所選擇的vh和vl結構域的一個或兩者的cdr互補的pcr引物擴增vh和vl結構域的方式實現(xiàn)，其中所述引物包含在某些位點的四個核苷酸堿基的隨機組合，從而所產生的pcr產物編碼引入了隨機突變的vh和/或vl的片段。這類隨機突變的vh和vl片段可被用來篩選il-6的結合片段，例如il-6的位點ii的結合片段。在從重組的免疫球蛋白展示文庫中篩選和分離抗體il-6a后，可從展示包裝(displaypackage)(例如從噬菌體基因組)回收編碼選擇的抗體的核酸，并通過本領域已知的重組dna技術將其亞克隆入其他表達載體。可對這類抗體進一步操作以產生抗體片段，如那些在本發(fā)明中記載的抗體片段。藥代動力學(pk)可使用本文描述的方法和/或本領域已知方法進行pk測試。需要使用動物進行測定例如測定pk的一個障礙在于人類的il-6與那些通常用于此類測試的一些動物的il-6具有小于50％的同源性。因此測試pk的一種方法是使用表達人il-6的轉基因小鼠。在一些實施方案中，使用非人靈長類動物來測定pk。在一些實施方案中，抗il-6抗體是突變的以改變其pk，例如通過改變fcrn結合的ph敏感性而改變其pk。獲得這類突變的方法記載于實施例中。因此，在一些實施方案中，與親本il-6a或參考分子相比，所述il-6a具有改變的全身pk(systemicpk)。在一些情況下，pk在玻璃體中是不改變的或是改善的。在一些實施方案中，與親本il-6a或參考分子相比，il-6a具有降低的系統(tǒng)pk(例如，減少的半衰期和/或增加的清除，例如，如在循環(huán)流體如血液，血漿，淋巴或血清中測定的)。用于測試il-6拮抗劑的模型可在疾病模型中測試il-6拮抗劑的il-6相關遞送，特別是測試治療效果和有限的針對il-6有利特性的副作用。例如可以在大鼠或小鼠實驗性自身免疫性葡萄膜炎模型中，使用在完全弗氏佐劑(cfa)中的感光細胞間受體視黃醇類結合蛋白(irbp)免疫接種來測試葡萄膜炎(caspi,investophthalmolvissci52:1873；agarwal等,900:443-69,2012)。其他模型包括那些本領域中已知的樹突狀細胞誘導的葡萄膜炎、培養(yǎng)的效應t細胞的過繼轉移、在irbptcrtg小鼠中的自發(fā)eau、內毒素誘導的葡萄膜炎、自身免疫性葡萄膜視網膜炎(haruta等,investophthalmolvissci53:3264(2011)；yoshimura等,rheumatology48:347-354(2009))。其他能夠用于檢查il-6a在治療il-6相關疾病的治療中的效果的模型系統(tǒng)是例如，脈絡膜新生血管(cnv)模型(izumi-nagai等,amjpathol170:6(2007)；krzystolik等,archophthalmol120:338(2002))和糖尿病模型如那些描述于kern等(animalmodelsofdiabeticcomplicationsconsortium(p01dk57733),updatereport(september2001–january2004)的模型。用于測試il-6a在類風濕關節(jié)炎中的動物模型是本領域已知的，例如參見asquith等(eurjimmunol39:2040-4(2009))andkollias等(annrheumdis70:1357-62(2011)。cnv模型代表例如amd和dme的人類狀況。視網膜新血管形成模型是有用的，例如用于研究缺血性視網膜病變，例如糖尿病視網膜病或早產兒視網膜病。各種脈絡膜和視網膜新血管形成模型在本領域中是已知的(參見，例如，grossniklaus,h.e.等人，progretineyeres.2010nov；29(6):500-19.doi:10.1016/j.preteyeres.2010.05.003.epub2010may19；saisin,y等人，(2003)journalofcellularphysiology,195:241-248；takahashi,k.等人，(2003)investigativeophthalmology&visualscience,44(1):409-415；limaesilva,r.等人，(2007)fasebjournal,21:3219-3230；tobe等人，(1998)americanjournalofpathology,153(5):1641-1646；dong,a等人，(2011)pnas,108(35):14614-14619；dong等人，(2009)jcellphysiol219:544-552；smith,le等人，1994investophthalmolvissci1994；35:101-111；shen,j.等人，(2007)investigativeophthalmology&visualscience,48(9):4335-4341)，并且可用于研究il-6a的功效。脈絡膜新血管形成(cnv)可以通過例如激光，光，手術或遺傳修飾來誘導。氧誘導的視網膜新生血管形成的模型是本領域已知的，并且描述于例如，在smith,le等人，1994investophthalmolvissci1994；35:101-111；shen,j.等人，(2007)investigativeophthalmology&visualscience,48(9):4335-4341中。還可以使用缺血/再灌注模型。參見例如zheng,l等人，investigativeophthalmology&visualscience,vol.48no.1pp.361-367,2007。例如，在第1天，將附接到流體袋的30號針插入麻醉的小鼠的角膜中，并且將眼內壓(iop)升高至約120mmhg以產生缺血。30-90分鐘后，除去針頭，對iop標準化，并且發(fā)生視網膜循環(huán)回流。包括tnf-α和icam-1在內的炎癥標志物的表達可以通過蛋白質印跡和qpcr在第2-6天進行評估。另外，神經節(jié)細胞損失可以通過組織學在第3-14天評估，并且毛細血管變性通過胰蛋白酶消化技術在第10-14天測量。對于治療研究，在誘導缺血之前或之后不久，將測試制品(例如1μl的適當濃度，例如20mg/ml的il6a)經玻璃體內注射。聯(lián)合療法在一些實施方案中，將il-6a與第二治療性實體(therapeuticentity)組合施用。例如在包括vegf抑制劑諸如例如蘭尼單抗的治療方案中施用il-6a。在一些實施方案中，在包括pdgf抑制劑的治療方案中施用il-6a，其中所述pdgf抑制劑諸如例如抗pdgf抗體或抗pdgf受體抗體(例如伊馬替尼)。在一些實施方案中，il-6a與補體途徑抑制劑,例如洛他珠單抗(lampalizumab)(因子d抑制劑)或c5抑制劑組合施用。il-6拮抗劑的遞送本文所述的il-6拮抗劑或組合物可局部遞送，直接接觸或鄰近進行il-6抑制的靶細胞或組織。這種遞送方法的非限制性的實例包括注射、輸液或植入含有il-6拮抗劑的物質。在實施方案中，il-6a或組合物經眼內施用，例如玻璃體內，例如通過玻璃體內注射，眼用插入物或基因遞送。在一些實施方案中，il-6a組合物作為眼用制劑施用。該方法可包括施用il-6a組合物和眼可接受的載體。在某些實施方案中，眼用制劑是液體、半固體、插入物(insert)、膜、微?；蚣{米顆粒。il-6a組合物可以例如通過局部施用或通過注射(例如，玻璃體內注射)施用。在一些實施方案中，將il-6a組合物配制用于玻璃體內施用。在一些實施方案中，il-6a組合物被配制用于局部施用，如眼睛施用。所述局部制劑可以是液體制劑或半固體，例如，局部制劑可以包括水溶液、水性懸浮液、軟膏或凝膠。眼用的il-6a的制劑可以局部施用于眼睛的前部、上眼瞼下，下眼瞼上和在cul-de-sac內。一般地，眼用制劑是無菌的。il-6a眼用制劑可含有適合于眼用制劑的制備的一種或多種藥物賦形劑。這些賦形劑的例子為防腐劑、緩沖劑、螯合劑、抗氧化劑和用于調節(jié)滲透壓的鹽。包括軟膏劑和懸浮液的眼用制劑一般具有適合于所選的施用路徑的粘度。在一些實施方案中，眼用制劑具有從約1,000至約30,000厘泊的粘度。在一些實施方案中，所述制劑是一種包含聚合物的液體制劑。這類聚合物可用于改善的生物利用度、提高粘度或降低液體制劑從眼睛中排出。合適的聚合物包括但不限于，在wagh等人(asianjpharm,2:12-17,2008)描述的那些聚合物。在非限制性的例子中，聚合物是透明質酸酶的鈉鹽、殼多糖、環(huán)糊精(如羥丙基β環(huán)糊精)、聚半乳糖醛酸、木葡聚糖、黃原膠、結冷膠、硫醇化聚合物、聚(原酸酯)(如einmahl,advdrugdelivrev53:45-73,2001)或羅望子種子多糖(如，ghelardi等,antimicrobagentschemother48:3396-3401,2004)。在一些實施方案中，包含用于眼部遞送的il-6a制劑可含有一種或多種的表面活性劑、輔助劑，佐劑、抗氧化劑、張力調節(jié)劑、防腐劑(如edta、bak(苯扎氯銨)、亞氯酸鈉、過硼酸鈉、聚季銨鹽-1(polyquaterium-1))、增稠劑或粘度調節(jié)劑(如羧甲基纖維素、羥甲基纖維素、聚乙烯醇、聚乙二醇、乙二醇400、丙二醇羥甲基纖維素、羥丙基瓜耳豆膠、透明質酸和羥丙基纖維素)等。制劑中的添加劑可以包括，但不限于，氯化鈉、碳酸氫鈉、山梨酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯己定(chlorhexidine)、蓖麻油和過硼酸鈉。在一些實施方案中，純水或去離子水可用于組合物中。可通過添加任何生理和眼用可接受的ph調節(jié)的酸、堿或緩沖劑將ph調節(jié)至約5.0至8.5的范圍內，如ph7.0、ph7.3、ph7.4或ph7.5。眼用可接受的酸的例子包括乙酸、硼酸、檸檬酸、乳酸、磷酸、鹽酸等，堿的例子包括氫氧化鈉、磷酸鈉、硼酸鈉、檸檬酸鈉、乙酸鈉、乳酸鈉、氨基丁三醇、三羥基甲基氨基甲烷等。可用于制劑的鹽和緩沖液的例子包括檸檬酸鹽/右旋糖、碳酸氫鈉、氯化銨以及上述酸和堿的混合物。在一些實施方案中，眼用組合物的滲透壓可以為約10毫滲透摩爾(milliosmolar)(mosm)至約400mosm，例如200至400mosm或220至370mosm。通常，可以用生理上和眼科可接受的鹽或賦形劑來調節(jié)滲透壓。在一些實施方案中，制劑中包括氯化鈉，例如，氯化鈉存在于制劑中的濃度按重量計為0.01％至1％或按重量計為0.05％至0.45％，基于組合物的總重量。還可使用由一種或多種等量的由陽離子(如鉀，銨等)和陰離子(如氯離子，檸檬酸根，抗壞血酸根，硼酸根，磷酸根，碳酸氫根，硫酸根，硫代硫酸根，硫酸氫鹽，硫酸氫鈉，硫酸銨等)組成的鹽與氯化鈉一同或替代氯化鈉以實現(xiàn)在需要的范圍內的滲透壓。在一些實施方案中，還可使用糖，如甘露糖醇，右旋糖，山梨糖醇，葡萄糖等，來調節(jié)滲透壓。在一些實施方案中，所述方法包括形成或提供與眼外表面接觸的藥劑的儲庫(depotoftheagent)。儲庫指的是試劑的供給源，所述儲庫不會被淚液或其他眼部清除機制除去。這允許通過單次應用，連續(xù)、持續(xù)高濃度的藥劑存在于眼睛外表面的流體中。在一些實施方案中，儲庫可以保持多達八個小時以上。在一些實施方案中，眼儲庫制劑包括但不限于，聚合物水性懸浮液、軟膏和固體插入物(solidinserts)。在一些實施方案中，半固體組合物是一種施用到眼時增加粘度的液體制劑，所述粘度通常是由于液體制劑中存在聚合物，隨著溫度、ph或電解質濃度的變化粘度有所增加。聚合物可以是例如，乙?；彵蕉姿崂w維素(celluloseacetophthalate)、聚丙烯酸，結冷膠，透明質酸酶，殼多糖，藻酸鹽(如藻酸鈉)或環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷的嵌段共聚物(如，basf；泊洛沙姆)。在一些實施方案中，聚丙烯酸是交聯(lián)的丙烯酸(如，)。在一些實施方案中，半固體組合物含有卡波姆以及環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷的嵌段共聚物的混合物；甲基纖維素和羥乙基纖維素的混合物；或聚乙二醇以及環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷的嵌段共聚物的混合物。在一些實施方案中，包含il-6a的眼用制劑是軟膏或凝膠。在一些實施方案中，眼用制劑是油基遞送載體。例如，制劑可包含加入il-6a組合物(如在0.1％至2％)的石油或羊毛脂基載體和賦形劑。常見的基質(base)包括但不限于礦物油、礦脂及其組合。在一些實施方案中，軟膏作為條帶(ribbon)施用至下眼瞼。在一些情況下，眼用組合物是眼用插入物。在實施方案中，通過眼用插入物經玻璃體內施用組合物。例如所述眼用插入物是生物學惰性的、柔軟的、生物可腐蝕的、粘彈性的(viscoelastic)、暴露于治療劑后穩(wěn)定滅菌的、對空氣傳播細菌感染抗性的、生物可腐蝕的、生物相容的和/或粘彈性的(viscoelastic)。在一些實施方案中，插入物包含眼用可接受的基質，例如，聚合物基質。所述基質一般是一種聚合物，且il-6a組合物分散在基質內或結合到聚合物基質。在一些實施方案中，藥劑從基質通過溶解或水解共價鍵而緩慢釋放。在一些實施方案中，聚合物是生物可腐蝕(溶解)的，且其溶解速度可控制分散在聚合物基質中藥劑的釋放速度。在另一種形式中，聚合物基質是可生物降解的聚合物，該聚合物例如通過水解而分解，從而釋放出與其結合或分散在其中的藥劑。在進一步的實施方案中，可用另外的聚合物包衣包圍基質和藥劑以進一步控制釋放。在一些實施方案中，插入物包含可生物降解的聚合物，如聚己內酯(pcl)、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物(eva)、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚氨酯、尼龍或聚dl-丙交酯-共-乙交酯)(plga)或任意這些的共聚物。在一些情況下，藥劑被分散到基質材料或分散在單體組合物中，所述單體組合物用于在聚合前制造基質材料。在一些實施方案中，藥劑的量為約0.1至約50％或從約2至約20％。可使用可生物可降解的或生物可腐蝕的聚合物基質，從而不必從眼睛中移除過的插入物。隨著生物可降解或生物可腐蝕聚合物的降解或溶解，所述藥劑得以釋放。在進一步的實施方案中，眼用插入物包含一種聚合物，包括但不限于，那些在wagh,等,"polymersusedinoculardosageformanddrugdeliverysystems",asianj.pharm.,pages12-17(january2008)中記載的聚合物，通過全文引用并入本文。在一些實施方案中，插入物包含聚合物，所述聚合物選自聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯聚合物或共聚物(如，來自rohm或degussa的聚合物家族)、羥甲基纖維素、聚丙烯酸、聚(酰氨基胺)樹枝狀聚合物、聚(二甲基硅氧烷)、聚環(huán)氧乙烷、聚(丙交酯共乙交酯)、聚(2-羥乙基甲基丙烯酸酯)、聚乙烯基醇)或聚(丙烯富馬酸酯)。在一些實施方案中，插入物是450kda的半胱氨酸-聚丙烯酸綴合物。插入物可包括含有il-6a組合物的芯(core)和外套管(如描述于美國專利公開第20040009222號中)。在一些情況下，外管對藥物可以是滲透性的，半滲透性的或不滲透的。在一些實施方案中，芯包括對il-6a組合物的釋放速度不產生顯著影響的聚合物基質。在一些情況下，外套管、芯的聚合物基質或兩者是生物可腐蝕的。共擠出產品(co-extrudedproduct)可分割為(segmentedinto)藥物遞送裝置。在一些實施方案中，所述裝置是未包被的以使各自的端部是開放的，或所述裝置用例如膜(layer)包被，所述膜對il-6a組合物是可滲透的、對il-6a組合物是半滲透的或生物可腐蝕的。在某些實施方案中，il-6a組合物和至少一種聚合物以粉末形式混合。在一些實施方案中，眼用組合物是眼用膜。適合于此類膜的聚合物包括但不限于那些描述于wagh等(同前)的聚合物。在一些實施方案中，所述膜是軟性隱形眼鏡(soft-contractlens)，例如由n，n-二乙基丙烯酰胺和與乙二醇二甲基交聯(lián)的甲基丙烯酸的共聚物組成的眼鏡。在某些實施方案中，il-6a位于管狀的插入物中，且可以是分割的(segmented)。在一些實施方案中，il-6a組合物被配制為治療有效量，由聚合物基質包被的或分在聚合物基質中，使得il-6a組合物為粒狀或顆粒形式。在一些實施方案中，當顆粒中的藥物溶解到或在基質中，沿基質擴散，并被釋放到周圍生理性液體中時，il-6a組合物從配置物中釋放出來。在一些實施方案中，釋放速率主要受il-6a組合物從顆粒/微粒溶解到基質中的速率的限制；沿基質擴散和分散到周圍液體中的步驟不是主要的釋放速率限制因素。在某些實施方案中，聚合物基質是非生物可腐蝕的，而在其他實施方案中其是可生物腐蝕的。示例性的可形成非生物可腐蝕聚合物基質可以是聚氨酯、聚硅氧烷、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)(eva)、聚乙烯醇及其衍生物和共聚物。示例性的可形成非生物可腐蝕聚合物基質可以是聚酐、聚乳酸、聚乙醇酸、聚原酸酯、聚氰基丙烯酸烷基酯(polyalkylcyanoacrylate)及其衍生物和共聚物。在一些情況下，在膠原材料中配制il-6a組合物。例如，插入物可以是可溶性眼用藥物插入物(如能夠被引入到上結膜囊用以藥物遞送的橢圓形聚合物薄膜；橢圓的插入物如由乙烯醋酸乙烯酯制成的(毛果蕓香堿眼部治療系統(tǒng),由alzacorporation開發(fā))；由纖維素制成的桿狀插入物；新型眼科藥物輸送系統(tǒng)(nods)，由聚(乙烯醇)制成；或那些描述于fabrizio(advdrugdelivrev16:95-106,1998)中的插入物。在一些情況下，插入物包含膠原、明膠或聚合物，其中所述聚合物選自聚己內酯(pcl)、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物(eva)、氰基丙烯酸酯、聚氨酯、尼龍、聚(dl-丙交酯-共-乙交酯(plga)或任何這些的共聚物。在一些情況下，在上眼瞼下植入插入物。在一些情況下，插入物被植入到在眼睛的后段、脈絡膜空間或鞏膜內。在一些實施方案中，在玻璃體內或視網膜下植入插入物。在一些實施方案中，視網膜下注射插入物。施用的方法和插入物的制備技術闡述于remington's:thepracticeofscienceofpharmacy,20thedition(lippincottwilliams&wilkins,2006)中，通過引用將其全部并入本發(fā)明。在其他實施方案中，包含的il-6a組合物的插入物提供了藥劑到眼睛玻璃體的持續(xù)釋放。如本發(fā)明所用，“持續(xù)釋放”是指組合物以受控的方式在延長的時間內釋放藥劑。在一些實施方案中，插入物以一種的速率釋放藥劑，使得在藥劑的釋放過程中，水中(aqueousagent)的藥劑的濃度持續(xù)低于玻璃體中藥劑的濃度。在一些實施方案中，水中(aqueousagent)的藥劑的濃度為從約0.002μg/ml到約0.01μg/ml或從約0.01μg/ml，到約0.05μg/ml或到低于約0.05μg/ml。在一些實施方案中，以約1μg/天到約50μg/天，或從1μg/天到約10μg/天的速率釋放藥劑。在一些實施方案中，插入物還包含如上文詳述的額外的治療劑，例如氟輕松(如存在于眼部插入物中)。在一些實施方案中，眼用組合物包含微球或納米顆粒。在一些實施方案中，所述微球包含明膠。在一些實施方案中，微球被注射到眼睛的后段、脈絡膜空間或鞏膜內。在一些實施方案中，微球或納米顆粒包含聚合物，包括但不限于那些在wagh,等(asianjpharm2:12-17,2008)中描述的聚合物。在一些實施方案中，聚合物是殼多糖、聚羧酸，如聚丙烯酸、白蛋白顆粒、透明質酸酯、聚衣康酸、聚(丁基)氰基丙烯酸酯、聚己內酯、聚(異丁基)己內酯、聚(乳酸-共-乙醇酸)或聚(乳酸)。在一些實施方案中，微球或納米顆粒包含固體脂質顆粒。在一些實施方案中，il-6a組合物包含離子交換樹脂。在一些實施方案中，離子交換樹脂是無機沸石樹脂或合成的有機樹脂。在一些實施方案中，離子交換樹脂包括但不限于wagh等中描述的樹脂(同上)，通過引用將其全部并入本發(fā)明。在一些實施方案中，離子交換樹脂為部分中和的聚丙烯酸?？梢栽谒跃酆衔飸乙褐刑峁﹊l-6a組合物。在一些實施方案中，il-6a組合物或聚合物懸液懸浮于水性介質(如具有前文所述特性的水性水性介質)中。聚合懸浮試劑的例子包括，但不限于，葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖凝膠、纖維素聚合物如羥丙基甲基纖維素和含羧基的聚合物，如丙烯酸的聚合物或共聚物，以及其它聚合物緩和劑(polymericdemulcents)。在一些實施方案中，該聚合物緩和劑是水可溶脹的、水不溶性聚合物，特別是交聯(lián)的含羧基的聚合物。在一些實施方案中，以所存在的單體的總重量為基準計，該聚合物懸浮劑包含至少約90重量％到約99.9％，或約95％到約99.9％的一種或多種含羧基的單烯屬不飽和單體。在一些實施方案中，該含羧基的單烯屬不飽和單體包括丙烯酸、甲基丙烯酸、乙基丙烯酸、甲基丙烯酸(巴豆酸)、順式-α-甲基巴豆酸(當歸酸)、反式-α-甲基巴豆酸(α-甲基巴豆酸)、α-丁基巴豆酸、α-苯基丙烯酸、α-芐基丙烯酸、α-環(huán)己基丙烯酸、苯基丙烯酸(肉桂酸)、香豆酸(鄰羥基肉桂酸)以及傘形酸(對羥基香豆酸)。在一些實施方案中，該聚合物是通過多官能團交聯(lián)劑(如，雙官能的交聯(lián)劑)來交聯(lián)。在一些實施方案中，以所存在的單體的總重量為基準計，該交聯(lián)劑的含量為約0.01％到約5％，或約0.1％到約5.0％，或約0.2％到約1％。在一些實施方案中，該交聯(lián)劑是非聚烯基聚醚雙官能交聯(lián)用單體，例如二乙烯基乙二醇、2，3-二羥基己-1，5二烯、2，5-二甲基-1，5-己二烯、二乙烯基苯、n,n-二烯丙基丙烯酰胺、n，n-二烯丙基甲基丙烯酰胺；每一分子含有兩個或更多個烯基醚基團的聚烯基聚醚交聯(lián)劑，如含有末端h2c＝c基團的烯基醚基團，通過用鹵代烯烴如烯丙基溴等將含有至少四個碳原子和至少三個羥基的多元醇醚化來制備，如聚烯丙基蔗糖，聚烯丙基季戊四醇等；分子量約400到約8000的二烯屬非親水性大分子交聯(lián)劑，，例如二醇和多元醇的不溶性二丙烯酸酯和多丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯，由聚酯二醇、聚醚二醇或聚硅氧烷二醇與甲基丙烯酸羥烷基酯衍生的異氰酸酯終端的預聚物的二異氰酸酯丙烯酸或甲基丙烯酸羥烷基酯反應產物等在一些實施方案中，交聯(lián)聚合物可由作為唯一存在的單烯屬不飽和單體的一種或多種含羧基的單烯屬不飽和單體與一種或多種交聯(lián)劑制備。在一些實施方案中，聚合物是其中至多約40％，優(yōu)選約0％到約20％的一種或多種含羧基的單烯屬不飽和單體被一種或多種不含羧基、僅含生理上和眼科學無害的取代基的單烯屬不飽和單體替代的聚合物，所述單體包括丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯，例如甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸2-乙基己酯、甲基丙烯酸辛酯、甲基丙烯酸2-羥乙酯，丙烯酸3-羥丙酯等，乙酸乙烯酯，n-乙烯基吡咯烷酮等(如mueller等，美國專利第4,548,990號)。在一些實施方案中，聚合物包括聚卡波非(noveonaa-1)、和在一些實施方案中，該交聯(lián)聚合物通過使用常規(guī)自由基聚合催化劑將單體懸浮或乳液聚合至當量球徑不超過約50μm的干燥粒度來制備。在一些實施方案中，該平均干燥粒度為當量球徑約1到約30μm，或約3約20μm。在一些實施方案中，聚合物顆粒通過將較大的聚合物顆粒機械研磨來獲得。在其他實施方案中，此類聚合物具有約250,000到約4,000,000，以及3,000,000,000到4,000,000,000的分子量。在其他實施方案中，交聯(lián)聚合物的顆粒是單分散的，是指它們所具有的粒度分布應使得至少約80％、約90％或約95％的顆粒落入主粒度分布的μm帶內。在其他實施方案中，單分散粒度是指不超過約20％，約10％，或約5％顆粒的粒度在1μm以下。在一些實施方案中，聚合物水性懸浮液包括約0.05到約1％、約0.1到約0.5％、或約0.1到約0.5％的治療劑和約0.1到約10％、約0.5到約6.5％、約0.5到約2.0％、約0.5％到約1.2％、約0.6到約0.9％、或約0.6到約0.8％的聚合物懸浮劑。雖然提到的是單種，但應該理解，在總量處于規(guī)定范圍的情況下，可以使用一種或多種聚合物懸浮劑。在一個實施方案中，不溶性的輕度交聯(lián)的聚合物顆粒的量、ph和滲透壓能夠彼此相關，并且與交聯(lián)度相關，以提供具有約500到約100,000厘泊，優(yōu)選約1,000到約30,000厘泊或約1,000到約10,000厘泊的粘度的組合物，所述粘度使用裝有25號芯軸和13r小樣品接頭的brookfield數(shù)字lvt粘度計在12rpm和室溫(約25℃)下測定。在一些實施方案中，該粘度為約10到約400厘泊，約10到約200厘泊或約10到約25厘泊。在一些實施方案中，可以配制聚合物水性懸浮液，使得它們在眼中保持與施用于眼睛之前的粘度相同或基本上相同的粘度。在一些實施方案中，可以配制它們，使得其在與淚液接觸時凝膠化增強。例如，當ph低于約6.7的含有或其他類似聚丙烯酸類聚合物的制劑施用于眼睛時，該聚合物在與淚液接觸時可能溶脹，因為它具有較高的ph(大約7)。該凝膠化或凝膠化的增強可能導致懸浮顆粒的夾帶，從而延長了組合物在眼睛中的停留時間。在一些實施方案中，隨著懸浮顆粒經時溶解，該治療劑慢慢地釋放。在一些實施方案中，該輸送途徑增加了患者舒適感，增加了治療劑與眼組織的接觸時間，從而增加了藥物吸收的程度和制劑在眼睛中的作用持續(xù)時間。在這些藥物輸送系統(tǒng)中含有的治療劑可以取決于諸如藥物本身及其外形、藥物加載的程度和系統(tǒng)的ph以及還可能存在的任何藥物輸送助劑如與眼表相容的離子交換樹脂之類的因素的速率從凝膠中釋放。在一些實施方案中，使用基因遞送，如局部遺傳遞送，將il-6拮抗劑提供給受試者。這種遞送可通過瞬時表達系統(tǒng)遞送，一種穩(wěn)定的(如整合的)表達系統(tǒng)(如由bluebirdbio(cambridge,ma)生產的慢病毒遞送系統(tǒng))，或在細胞工廠中遞送，如那些由neurotech(cumberland,rhodeisland)所生產的細胞工廠。所有技術特征可以這些特征的所有可能的組合方式單獨地組合。等同方案本發(fā)明可用其他不違背其精神或主要特征的其他具體形式來體現(xiàn)。前述實施方案因此在所有方面被認為是說明性的而非對本發(fā)明所述發(fā)明的限制。實施例下列非限制性實施例進一步說明了本發(fā)明所述的本發(fā)明的實施方案。實施例1：在脈絡膜新生血管(cnv)模型中驗證局部il-6的阻斷為了確定局部il-6阻斷是否能夠有效治療眼睛疾病，例如糖尿病黃斑水腫(dme)或濕性amd，抗il-6抗體被局部施用到脈絡膜新生血管模型系統(tǒng)中。激光誘導的cnv模型(eyecro.com/in-vivo/laser-induced-choroidal-neovascularization-cnv/)再現(xiàn)許多dme下的病理過程，包括炎癥和血管發(fā)生。eyecro(oklahomacity,ok)在大鼠中進行了研究。在第0天時，每組中的6只動物進行雙側激光處理以產生每只眼睛3處損傷。在第3天和第10天時，將3μg多克隆抗大鼠il-6抗體(r&dsystemsaf506；minneapolis,mn)玻璃體(ivt)注射到實驗組中，而將pbs或抗vegf多克隆抗體(r&dsystemsaf564)分別施用到載體和陽性對照組。在第15和22天體內造影以測量病變區(qū)域。在第15天和第22天抗il-6處理組相對于載體對照顯著地降低血管發(fā)生?？筰l-6處理組和抗vegf陽性對照之間在應答上(response)沒有顯著差異。圖1示出了該實驗的結果。這些數(shù)據表明，ivt施用il-6a，例如抗il6抗體，可以在cnv大鼠模型中降低血管發(fā)生到與抗vegf陽性對照相似的水平(抗il-6對載體對照，在第15天p＝0.0054和在第22天p＝0.0005)。這些數(shù)據表明，局部阻斷il-6對治療眼病，例如涉及血管滲漏的眼病，如黃斑水腫是有用的。實施例2：候選抗體il-6拮抗劑使用首先涉及免疫接種的流程開發(fā)候選抗體il-6拮抗劑。免疫接種在發(fā)明人的指示下由合同研究組織(cro)實施。向5只balb/c小鼠皮下注射含80μg人il-6(r&dsystems,cat#206-il/cf,minneapolis,mn)，1mnacl和弗氏佐劑的pbs。用80μg和50μg的il-6進行兩次加強免疫。從最高滴度的小鼠中收集脾細胞并與p3x763ag8.653骨髓瘤細胞融合以形成雜交瘤。對雜交瘤上清液篩選il-6結合和拮抗性。對于結合elisa，用含1μg/ml人il-6的pbs包被costar9018板，4℃過夜。用含有2％bsa的pbs封閉孔，洗滌，然后與50μl每種雜交瘤上清液孵育，所述雜交瘤上清液用含2％bsa的pbs以1:2稀釋。60分鐘后，將孔用含0.1％tween-20的300μlpbs洗滌三次。然后每孔加入于pbs-bsa中以1:3000稀釋的抗小鼠hrp，并孵育30分鐘。板孔作如上的洗滌，然后加入3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(tmb)底物，并在450和550nm處測量信號。對于拮抗研究，hek-bluetm-il6報告細胞(invivogen,sandiego,ca)在1:10稀釋的雜交瘤上清液的存在下與濃度遞增的人il-6孵育。20-24小時后，20μl上清液與180μlquantibluetm(invivogen)混合，并在655nm處測量吸光度?；诮Y合和拮抗研究，由申請人篩選出作為前導(lead)的雜交瘤64并在cro亞克隆。進一步用酶聯(lián)免疫吸附實驗(elisa)測試雜交瘤64(小鼠單克隆)抑制il-6/il-6rα復合物結合到gp130的能力。通過elisa，1.5μg/ml濃度的雜交瘤64顯著地減弱了il-6/il-6rα復合物結合到固定化的gp130(圖2)。再篩選所述亞克隆并用5’racepcr擴增亞克隆64.58的可變結構域并測序。小鼠可變結構域的序列(稱為m64)如下：m64vh(可變重鏈)qvqlqqsgaelvrpgtsvkvsckasgyafsnyliewvkqrpgqglewigvitpgsgtinynekfkgkavltadkssstvymqlssltsddsavyfcaksrwdplyyyaleywgqgtsvtvss(seqidno：13)m64vl(可變輕鏈)divltqspaslavslgqratiscrasesvdnygisfmnwfqqkpgqppklliyaasnqgsgvparfsgsgsgtdfslnihpmeeddtamyfcqqskevpltfgagtklelk(seqidno：14)為了創(chuàng)建人源化序列，m64的互補決定區(qū)(cdr)被移植到通過計算算法選擇的與小鼠序列相似的人種系框架(germlineframework)中。人源化序列(稱為h64)如下(與m64序列相比改變的殘基用下劃線標示)且與小鼠序列具有約79.5％的同一性(vh)和84.4％的同一性(vl)：h64vhqvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgyafsnyliewvrqapgqglewmgvitpgsgtinyaqkfqgrvtitadeststaymelsslrsedtavyycarsrwdplyyyaleywgqgttvtvss(seqidno:15)h64vldivmtqspdslavslgeratincrasesvdnygisfmnwyqqkpgqppklliyaasnqgsgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqskevpltfgqgtkleik(seqidno:16)用dna2.0(menlopark,ca)合成人源化序列，然后將其與人igg1恒定結構域融合一并克隆入pcdna3.1來源的表達載體。通過瞬時轉染freestyletm-293細胞(invitrogen,grandisland,ny)表達，并通過蛋白a層析純化igg。在結合和拮抗研究中，與其m64祖先(predecessor)相比，h64igg表現(xiàn)出相當大的效力降低。因此利用酵母展示來恢復喪失的親和力。為了實施目的為恢復或提高人源化h64igg親和力的親和力成熟(affinitymaturation)，h64抗體序列被重新克隆到pyc2/ct來源的酵母載體中以生產fab分子，其中所述載體中fabh鏈通過(g4s)3連接子(seqidno：29)與抗fitcscfv4m5.3融合。然后通過易錯pcr(依照chao等(2006,natureprotocols,1:755-768)的方案)產生h64變體文庫。表達h64變體并通過標記有fitc-peg-nhs的酵母在表面捕獲變體，然后與生物素化的人il-6孵育。用親和素-apc檢測結合的il-6，且在bdfacsariatm分選儀上選擇結合有最高量il-6的細胞，其中結合的il-6的量與展示的fabs的量相關。經過四輪篩選，高親和力變體群體被選擇和測序。由親和力成熟所選擇的克隆序列(稱為h64-1.4)如下，其中所選擇的突變(如與h64的vh和vl序列相比的突變)以粗體顯示，且cdrs用下劃線標示。這些是018的可變結構域(以及下述的020和029的il-6a分子)。需要注意的是完整的fabs包括ck和igg1的ch1結構域。在本申請的上下文中，提及的“fab”重鏈或輕鏈氨基酸序列是指序列可以是由輕鏈衍生序列和重鏈衍生的序列組成的起作用的fab的一部分。h64-1.4vh(018vh)(可變結構域)h64-1.4vl(018vl)(可變結構域)h64-1.4可變結構域被重新克隆到pcdna3.1人igg1載體中，并在freestyletm-hek293細胞(lifetechnologies)中表達全長的igg1。所獲得的純化的igg比原來的h64抗體在結合及細胞拮抗研究中是明顯更為有效的。使用酵母系統(tǒng)測試了親和力，所述親和力從最初的人源化分子的343pm提高到43pm。使用hek-blue細胞系統(tǒng)測定的拮抗劑的效力提高了約10倍。將h64-1.4igg重排為fab以在眼部和其他適應癥中使用。此外，進行另一輪的文庫生成和基于酵母的篩選，以進一步提高親和力。經過四輪篩選，存在具有a76v突變的vh變體的顯著富集。包含a79v的抗體、變體及其片段稱為019il-6a抗體、變體及其片段。實施例3：形式的選擇為了研究基于抗體的il-6拮抗劑的適合的形式，測試了如前文所述的選擇出的il-6抗體的瞬時表達、穩(wěn)定性、聚集性、結合親和力和ic50，其中所述抗體使用018序列的fab、scfv(vh-vl)和scfv(vh-vl)形式。候選il-6a分子(包含018可變區(qū)的序列)其中之一的前述實驗結果示于表1。表1這些數(shù)據展示了鑒定基于il-6拮抗劑抗體的各種形式的關鍵特征的方法，并闡明了對于包含018可變區(qū)的il-6拮抗劑而言，018fab形式與scfv結構相比，在最多的關鍵類別(如表達、穩(wěn)定性、聚集和結合親和性)中具有最受歡迎的特征。018fab的ic50落在用于治療的合理的范圍內。實施例4：il-6a抗體、片段和衍生物的例子使用本發(fā)明所描述的方法，申請人已鑒定出下述序列。下劃線的序列代表重鏈和輕鏈的cdrs。其它序列可在整個說明書中找到。igg1框架中的018重鏈(全長；fl018hc)多肽序列qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgyalsnyliewvrqapgqglewmgvitpgsgtinyaqkfqgrvtitadeststaymelsslrsedtavyycarsrwdplyyyaleywgqgttvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno:19)igg1框架中的018重鏈(全長；fl018hc)核酸序列caagtgcagctggtgcagtcaggggccgaggttaagaagccagggagcagcgtcaaggtatcttgtaaagcgtctggttacgccctttcaaactacctgatcgaatgggtgaggcaggctcccggccaaggcctggaatggatgggagttatcacccctgggagcggcaccattaattacgcccagaaatttcagggacgagtgacgattaccgccgacgagtccaccagtactgcctacatggagctgtcctcactccgcagcgaggacacggcagtttactactgcgcccggagtcgatgggaccctctttactattatgctctggaatactggggccagggaacgaccgttacagtgtcatctgctagcacaaaaggaccatcagtcttcccacttgctccttcatctaagagcacaagtggtggcactgcagcccttggctgcctggtgaaagattatttccccgaacctgttacagtttcttggaactccggtgcactgacatccggagtacacactttcccagctgtgctgcagagctcaggactgtatagcctgtcttcggtggtcactgttccatcgtcgagtcttggcacacagacatatatttgcaacgtcaatcacaagccctccaacacaaaagtggataagaaggtcgagcccaaatcttgtgacaagacccatacgtgtcctccctgtcccgcccctgaactgctgggaggcccttctgtgttcctgttcccacctaagccaaaggacactctgatgatcagccggactcccgaggttacctgtgtggtggtggatgtgtctcatgaagaccctgaggttaagttcaattggtacgtggatggcgtcgaggtgcataacgcaaaaaccaagccgagagaggagcagtacaatagcacctatagagtagtgagcgtcctgactgtcttacatcaggattggctcaatggtaaagaatataagtgcaaggtaagcaacaaggccctacccgcaccaatagagaagaccatctccaaggcgaaaggtcagcccagggagccccaggtttatacactgcctccctcacgcgacgaattaacaaagaatcaggtgtctctcacctgtctcgtcaagggcttttacccttccgacatcgccgtggagtgggaatccaatggccagcctgagaacaattataagacaactcccccagtcctggattcagatgggtcgttctttctatatagtaagttgaccgtggataagtctcgctggcaacaggggaacgtgttctcttgctctgttatgcatgaagcgctgcacaatcattatacccagaagtccctgtccctgagccccgggaag(seqidno：20)igg1框架中的018fab重鏈(018fabhc)多肽序列。cdrs以下劃線標示qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgyalsnyliewvrqapgqglewmgvitpgsgtinyaqkfqgrvtitadeststaymelsslrsedtavyycarsrwdplyyyaleywgqgttvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepksc(seqidno:1)018全長輕鏈(fl018lc)多肽序列。cdrs以下劃線標示divmtqspdslavslgeratincrasesvdnygipfmnwyqqkpgqppklliyaasnrgsgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqseevpltfgqgtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seqidno:2)這也是020和029il-6拮抗劑的輕鏈igg1框架中的018全長輕鏈(018lc)核酸序列gacatagtgatgactcaaagtccggacagcctggcggtgtcactcggcgaacgggcaactatcaactgccgagccagcgagagcgtcgataattacggcatccccttcatgaactggtatcagcagaagccaggacagccgcccaagctgcttatctacgccgcttccaaccggggatcaggggtgcccgatcgatttagtggaagcggtagtgggaccgatttcacactgaccatcagctcccttcaggccgaggatgtggctgtctattattgtcagcaatccgaggaagtgccgctcacgtttggtcagggaaccaaactggagatcaagcggaccgtagcggcgcctagtgtcttcatcttcccaccctccgacgaacagctgaagtctggcactgcttccgtcgtgtgcctgctcaacaacttttaccctagagaggcaaaagttcaatggaaagtagacaatgccttgcagtccgggaactcccaggagtctgtcacagagcaggatagtaaggactcaacctacagcctgtccagcacactgaccctctccaaagccgactacgagaagcacaaagtgtacgcttgcgaagttacgcatcaggggctgtcctcacccgttacaaaaagttttaacagaggggagtgc(seqidno:26)019fab重鏈(019fabhc，除a79v(粗體/斜體)外與018fabhc序列相同019vh(可變區(qū)/019hc)019抗體輕鏈(019lc)序列(多肽和核酸)與018lc相同018hc的cdr1(vhcdr1018)：gyalsnylie(seqidno：4)018hc的cdr2(vhcdr2018)：vitpgsgtin(seqidno：5)018hc的cdr3(vhcdr3018)：srwdplyyyaley(seqidno：6)018lc的cdr1(vlcdr1)：rasesvdnygipfmn(seqidno：7)018lc的cdr2(vlcdr2)：aasnrgs(seqidno：8)018lc的cdr3(vlcdr3)：qqseevplt(seqidno：9)019hc的cdr1(vhcdr1019)：gyalsnylie(seqidno：4)019hc的cdr2(vhcdr2019)：vitpgsgtin(seqidno：5)019hc的cdr3(vhcdr3019)：srwdplyyyaley(seqidno：6)實施例5：表位和結構作圖表位作圖對所選擇的候選il-6拮抗劑進行功能表位作圖。發(fā)現(xiàn)在elisa中候選抗體(小鼠64抗體)沒有減弱il-6rα對il-6的結合，表明該候選抗體不結合位點i。額外進行的實驗證明表明在elisa中嵌合小鼠64抗體減弱il-6/il-6rα復合物對gp130的結合，說明il-6的位點ii或位點iii攜帶該抗體的結合位點。還發(fā)現(xiàn)小鼠64抗體不顯著阻斷已知的位點iii結合抗體ah-65(immunotech,marseille,france)與il-6的結合，說明該候選抗體結合il-6的位點ii。這些數(shù)據表明可產生針對位點ii的抗體，以及證明了鑒定該抗體的方法。為了進一步定義表位，在酵母中產生了il-6的突變，其與4m5.3(boderetal.,2000,procnatlacadsciusa97,10701–10705；chaoetal.,2006,natprotoc1,755–768)相融合。所表達的突變體是在人il-6中具有下述單或雙突變的突變體：r24e/d27e、r30e、y31e、d34r、s118r/v121e、w157e、q159e/t162p、k171e和r179e。所述表達的突變的il-6分子被用于與018(fab)的結合研究。觀察到018(fab)的r24e/k27e、y31e、d34r和s118r/v121r親和力的降低，其均位于il-6的位點ii中。因此，本發(fā)明所描述的發(fā)明包括抗體，其能夠結合到人il-6位置24、27、31、34、118和121中的至少一個，兩個，三個，四個，五個或六個氨基酸，或能夠結合il-6中的等效位點。位點ii表位的結構定義計算下列距離以在結構上定義位點ii。該計算基于il-6/il-6α/gp130六聚體的晶體結構，pdb1p9m(boulangeretal.,2003,science300:2101-2104)。il-6的螺旋1位于(runs)位點i和位點ii之間，導致某些殘基接近于位點ii但具有指向位點i的側鏈，如r30。d2和d3是指il-6rα的細胞外結構域。下列il-6的氨基酸被確定為落入gp130-d2-d3的以內：l19、r24、k27、q28、r30、y31、d34、e110、q111、r113、a114、m117、s118、v121、q124、f125和k128。下列il-6的氨基酸被確定為落入gp130-d2-d3的以內：l19、e23、r24i25、k27、q28、i29、r30、y31、d34、k41、q102、e109、e110、q111、a112、r113、a114、v115、q116、m117、s118、k120、v121、l122、q124、f125和k128。因此，能夠結合一個或多個il-6中落入位點ii或的氨基酸的分子，如抗體或其片段，可以是il-6a。提供下面的人il-6序列作為參考(下劃線所標示的序列是前導序列)。gp130-d2-d3的以內的氨基酸用斜體標記。氨基酸編號，如用于定義表位的突變，不含前導序列。人il-6進行實驗測試了h64-1.4人源化抗體的fab片段，并證明該片段由于靶向位點ii，從而能夠阻斷il-6順式和反式信號。可溶性il-6受體(sil-6r)的存在不改變fab片段的效力。這與抗il-6rigg相反，其在sil6r的存在下效力有所降低，且其僅阻斷順式信號。這些實驗證明靶向位點ii的抗體或該抗體的片段，如fab片段可用于抑制il-6的順式和反式信號。實施例6：靈長類動物研究由于非靈長類動物可以與靈長類動物的活力(activities)具有很大差異，因此一般使用非人靈長類動物進一步評價候選il-6拮抗劑的pk和其他參數(shù)。人il-6與食蟹猴和獼猴il-6有7個位點的不同，其中的一個位于位點(氨基酸28)ii內且與非洲綠猴il-6的位點ii相同。這似乎只降低了含018序列的抗體約3-4倍的結合能力。結合到非人靈長類動物il-6的能力是il-6拮抗劑的一個有用的特征，其促進作為藥物的候選物的開發(fā)，如通過使在非靈長類動物中的測試，如毒性測試成為可能。如同大多數(shù)il-6抗體一樣，因為il-6的低序列同源性，本發(fā)明所描述的抗il-6抗體不與嚙齒動物、兔或犬的il-6發(fā)生交叉反應。然而，在親和力研究中，發(fā)現(xiàn)018fab近似以人親和力結合食蟹猴和非洲綠猴的il-6(表2)。表2：對各種物種的各種il-6的單價親和力(018fab)物種kd人200pm非洲綠猴280pm食蟹猴840pm狗>1μm小鼠>1μm兔>1μm大鼠>1μm這些數(shù)據進一步證明了本發(fā)明所描述的il-6a特異性結合的能力以及在適合的動物中形成具有允許檢測(如毒理學和生殖研究)的特征的分子的能力。實施例7：提高il-6a的表達為了提高018fab和019的fab多肽的表達，利用本領域已知方法制備了向重鏈ch1/鉸鏈區(qū)引入5個額外氨基酸(dktht(seqidno：30))的構建體。改變了的018fab重鏈的序列示于下面的seqidno：24。改變的018序列在本發(fā)明中稱為020且改變的019序列在本發(fā)明中稱為021。020分子(020fab重鏈和018fab輕鏈)與具有018fab重鏈和018fab輕鏈的親本fab相比具有改善的表達。019分子與020分子相比未展現(xiàn)出顯著的親和力差異。020和019的表達分別增加了約2倍，親和力未受改變的影響。020重鏈(在羧基末端具有dktht(seqidno：30)的fab))qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgyalsnyliewvrqapgqglewmgvitpgsgtinyaqkfqgrvtitadeststaymelsslrsedtavyycarsrwdplyyyaleywgqgttvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdktht(seqidno:24)使用020fab在hek-bluetmil-6受體細胞(invivogen,sandiego,ca)中測量il-6的拮抗作用。在含10pmil-6和各種濃度的020或il-6rα抗體(cellsciences,canton,ma)的混合液(含或不含50nmil-6rα)中孵育細胞，孵育20-24小時后，20μl細胞培養(yǎng)上清液與180μlquantibluetm(invivogen)底物混合并孵育1小時；在655nm處測量吸光度。圖3a和圖3b顯示了這些實驗的數(shù)據，證明了在存在或缺乏il-6r下，020抑制il-6活性的能力。實施例8：igg2il-6抗體使用本領域已知方法將018重構(reformat)入人igg2同種型框架中以與igg1形式的抗體相比減少fcγr的結合以及減少adcc。另外，預期018重構為全長形式(如igg2)由于分子的更大大小而降低從玻璃體中的清除率。構建/純化抗il-6igg2抗體為了使用如前文所述的抗-il-6序列構建人igg2抗體，從cdna中pcr擴增出分別在n-和c-末端帶有nhei和m1ui限制性位點的人igg2恒定結構域。純化pcr產物，用nhei和m1ui酶切消化，然后連接入ptt5載體中，所述載體包含抗il6可變結構域，如seqidno：1(見上文)。這樣得到全長的igg2重鏈序列。含有包含018序列的全長輕鏈的質粒被用于提供輕鏈。為了進一步減少fcrn的結合并因此減少il-6a的再循環(huán)，在重鏈中進行了點突變。使用誘變(agilenttechnologies,santaclara,ca)制造突變。使用聚(乙烯亞胺)(pei)將重鏈和輕鏈質粒共轉染到100mlhek293-6e細胞的瞬時培養(yǎng)物中，并培養(yǎng)以允許進行約5天的表達。這種產生的抗體含有抗il-6的位點ii結合部分和igg2結構。含有018cdrs的這種結構在本發(fā)明中稱為018igg2或029。在殘基i253處制造點突變。所述igg2分子被很好地表達且在細胞學實驗中以與020fab相比略微改善的效力阻斷il-6。029成熟序列(cdrs用下劃線標示)029重鏈qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgyalsnyliewvrqapgqglewmgvitpgsgtinyaqkfqgrvtitadeststaymelsslrsedtavyycarsrwdplyyyaleywgqgttvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno:11)029輕鏈divmtqspdslavslgeratincrasesvdnygipfmnwyqqkpgqppklliyaasnrgsgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqseevpltfgqgtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seqidno:12)改變的fcrn結合il-6可以具有某些積極的系統(tǒng)性效應。因此改造il-6使其在玻璃體中具有良好的滯留但具有有限的全身半衰期是有利的。減少或消除fcrn結合應當減少任何逃入循環(huán)的藥物的系統(tǒng)性積累，從而提高il-6a的安全性。因此，由于fcrn介導的運輸可能增加抗體從眼中流出，因此通過在fc的殘基i254、h311或h436引入突變(參見seqidno：23)編號根據martin等,molecularcell,7:4,867-877(2001))，進一步修飾020igg2以消除fcrn的結合。突變的位點在seqidno：23中以粗體標明；i254突變?yōu)閍或r；h311突變?yōu)閍或e、h311突變?yōu)閚且d313突變?yōu)閠，以及h436突變?yōu)閍(在前導序列后開始編號，所述前導序列在seqidno：23中以下劃線標明。含有該序列的il-6拮抗劑稱為018igg2m。抗il-6重鏈(igg2)(常規(guī)字體：vh；斜體：ch)(無前導序列)顯示突變位點(粗體)抗il-6重鏈(igg2)(常規(guī)字體：vh；斜體：ch)有前導序列(下劃線)顯示突變位點(粗體)因此，一些實施方案中包括具有重鏈序列的抗體，所述重鏈序列描述于seqidno：23中，并具有i254(如a或r)、h311(突變?yōu)閍或e)、h436(突變?yōu)閍)，或d313(突變?yōu)閠)且h311突變?yōu)閚的突變。seqidno：25因此提供了一種序列，當在i133(如i133a或i133r)、h190(如h190a或h190e)、h315(h315a)，或d192和h190(如d192t和h190n)處發(fā)生突變時，該序列可用于抗體、片段或其衍生物以產生在低ph下(如ph5.5)或溶酶體ph下具有減弱fc結合的多肽，和/或產生與親本或其他不含該序列的參考分子相比具有減弱的全身半衰期的多肽?？筰l-6輕鏈(igg2)(常規(guī)字體：vh；斜體：ch)實施例9：制劑穩(wěn)定性測試了抗il-6/igg1fab片段(包含igg1ch1結構域)的穩(wěn)定性，所述測試通過使用差示掃描熒光確定最初在pbs中的tm，然后在一系列緩沖液和賦形劑中的tm。發(fā)現(xiàn)檸檬酸鹽緩沖液(ph5.5)將tm提高到超過80℃。因此，在一些實施方案中，il-6a提供于檸檬酸鹽緩沖液中且在一些情況下具有至少80℃的tm。使用sec-mals測試了聚集程度且20mg/ml在磷酸鹽緩沖液(pbs)中未觀察到聚集。實施例10：適合于增強pk的對ph敏感的抗體il-6可以具有某些積極的系統(tǒng)性效應。因此改造il-6使其在玻璃體中具有良好的滯留但具有有限的全身半衰期是有利的。減少或消除與fcrn的結合能夠減少任何逃入循環(huán)的藥物在全身的積累，從而提高il-6a的安全性。因此，由于fcrn介導的運輸可能增加抗體從眼中流出，因此通過在fc的殘基i254、h311或h435引入突變(編號根據martin等,molecularcell,7:4,867-877(2001))，以進一步修飾020igg2以減弱fcrn的結合。這種抗體在本發(fā)明中稱為il-6ph抗體或抗il-6ph并在下面進一步描述。具有ph敏感結合的抗體的產生組氨酸的pka為約6.0，且在結合界面上插入的組氨酸能夠在低ph時在側鏈質子化作用后破壞結合。使用如本發(fā)明中所述的抗il-6位點ii靶向抗體，從018中產生一個包含富含組氨酸的cdr變體的文庫，且使用酵母展示從該文庫中篩選ph敏感的結合。產生的文庫是具有cdrs的組合文庫，所述cdr是由簡并密碼子編碼，使得每個殘基是一個野生型殘基(即，與親本抗體相同)，或組氨酸殘基。通過交替排序在生理ph(7.4)下高結合和在內涵體ph(5.5)下低結合進行篩選。鑒定出了一個酵母-選擇的突變體，其具有在ph7.4下相對高的結合(該突變體具有407pm的單價kd相比親本的192pm的kd)和在ph5.5下相對低的結合(該突變體具有2.362nm的單價kd相比親本的195pm的kd)。這構成在ph5.5下親和力約5.8倍的變化。這種突變體包含在輕鏈cdr1處的多個組氨酸突變。因此，該突變體顯示出在ph7.4下與親本分子相似的結合能力，以及在ph5.5下親和力的顯著喪失。通過本領域已知的方法，使用elisa、facs和spr分析驗證了這一觀察。這些數(shù)據表明，可以創(chuàng)建基于抗體的il-6a，其具有靶向il-6的位點ii的抗il-6的特征，可用于抑制il-6的順式和反式活性，且具有與親本抗體或其他具有野生型fc結構域的抗體相比增加的pk，至少部分通過在ph5.5下改變的結合實現(xiàn)。實施例11：局部il-6阻斷在小鼠激光脈絡膜新血管形成(cnv)模型中的功效為了確定局部il-6阻斷是否能有效治療眼病，例如糖尿病黃斑水腫(dme)或濕性amd，在用于脈絡膜新血管形成的模型系統(tǒng)中局部施用單克隆抗il-6抗體。在此實施例中利用如saishin等人，journalofcellularphysiology,195:241-248(2003)描述的激光誘導的cnv模型。激光誘導的cnv模型再現(xiàn)了糖尿病黃斑水腫(dme)下的許多病理過程，包括炎癥和血管新生。通過玻璃體內(ivt)注射將單克隆抗小鼠il-6抗體(mp5-20f3，其是購自bioxcell，目錄號be0046的大鼠igg1同種型抗體)施用于試驗組。對照組接受vegf抑制物(trap)的玻璃體內注射或抗-hrp同種型對照抗體(針對辣根過氧化物酶大鼠igg1，克隆hrpn，購自bioxcell；目錄號be0088)的玻璃體內注射。對于所有抗體組，將1μl體積中的20μg蛋白質注射到試驗眼中，而將對側眼作為另外的對照不進行處理。在激光后第7天麻醉小鼠，并用griffoniasimplicifolia(gsa)凝集素染色脈絡膜平底以測量病變面積。圖4顯示結果。與對照抗體處理組相比，抗il-6抗體處理組顯示出新生血管形成的統(tǒng)計學顯著降低(p<0.05)。與抗vegf陽性對照相比，平均來說抗il-6抗體處理組也顯示減少的新血管形成。這些數(shù)據表明，通過ivt施用的il-6a，例如單克隆抗il-6抗體可以顯著地降低小鼠cnv模型中的新血管形成。該結果進一步表明，與抗-vegf抗體相比，抗il-6抗體可以產生至少一樣多且有可能更多的新血管形成減少。這些數(shù)據指示il-6的局部抑制有用于治療眼病，例如涉及血管滲漏的疾病，例如濕性amd或黃斑水腫，例如糖尿病黃斑水腫。實施例12：改進的il-6抗體的開發(fā)產生ebi-029抗體的變體。為了更好地表征突變a28v，s30p，i51t和s55g的貢獻，將特定組合引入到野生型ebi-029fab展示載體中并測量結合。結果顯示在圖5中。在與2μmil-6過夜競爭后，與野生型ebi-029fab相比，所有突變體具有顯著更高的相對于展示保留在其細胞表面上的生物素化il-6水平。結合從最高至最低親和力的排列次序是a28v/s30p/i51t/s55g>a28v/i51t/s55g>s30p/i51t/s55g>i51t/s55g>wt。四重突變a28v/s30p/i51t/s55g在本文中也稱為ebi-030。ebi-030的序列顯示如下。030cdr序列030hc的cdr1(vhcdr1030):gyvlpnylie(seqidno:31)030hc的cdr2(vhcdr2030):vttpgggtin(seqidno:32)030hc的cdr3(vhcdr3030):srwdplyyyaley(seqidno:33)030lc的cdr1(vlcdr1030):rasesvdnygipfmn(seqidno:34)030lc的cdr2(vlcdr2030):aasnrgs(seqidno:35)030lc的cdr3(vlcdr3030):qqseevplt(seqidno:36)030重鏈可變區(qū)序列(相對于029的突變以粗體顯示)：030輕鏈可變區(qū)序列：divmtqspdslavslgeratincrasesvdnygipfmnwyqqkpgqppklliyaasnrgsgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqseevpltfgqgtkleikrtv(seqidno:38)030fab(igg1)重鏈多肽序列(cdr加下劃線，相對于029的突變顯示為粗體)：在實施方案中，seqidno：39的羧基端的dktht序列(seqidno：30)不包括在fab序列中。030fab重鏈核酸序列：caagtgcagctggtgcagtcaggggccgaggttaagaagccagggagcagcgtcaaggtatcttgtaaagcgtctggttacgtccttccaaactacctgatcgaatgggtgaggcaggctcccggccaaggcctggaatggatgggagttaccacccctgggggcggcaccattaattacgcccagaaatttcagggacgagtgacgattaccgccgacgagtccaccagtactgcctacatggagctgtcctcactccgcagcgaggacacggcagtttactactgcgcccggagtcgatgggaccctctttactattatgctctggaatactggggccagggaacgaccgttacagtgtcatctgctagcacaaaaggaccatcagtcttcccacttgctccttcatctaagagcacaagtggtggcactgcagcccttggctgcctggtgaaagattatttccccgaacctgttacagtttcttggaactccggtgcactgacatccggagtacacactttcccagctgtgctgcagagctcaggactgtatagcctgtcttcggtggtcactgttccatcgtcgagtcttggcacacagacatatatttgcaacgtcaatcacaagccctccaacacaaaagtggataagaaggtcgagcccaaatcttgtgacaaaacacacaca(seqidno:40)030也可以作為igg2fab重鏈多肽序列產生：qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgyvlpnyliewvrqapgqglewmgvttpgggtinyaqkfqgrvtitadeststaymelsslrsedtavyycarsrwdplyyyaleywgqgttvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverk(seqidno:54)實施例13：變體fab片段的表達和純化通過用bamhi-hf/nhei-hf進行雙重消化，從酵母展示載體產生含有以下突變體組合的vh域插入物：a28v/i51t/s55g，s30p/i51t/s55g和a28v/s30p/i51t/s55g(ebi-030)。插入物通過1％瓊脂糖凝膠電泳純化，并連接到含有前導序列，人igg1ch1結構域和c端his標簽的ptt5衍生的哺乳動物表達載體中。在lb-amp上選擇轉化體，小量制備，并通過測序證實插入物。對于與野生型ebi-029輕鏈(本文公開為seqidno：12)配對的每個突變型fab重鏈，使用pei作為轉染試劑，在hek-6e細胞(canadianresearchcouncil)中進行瞬時轉染。也表達野生型ebi-029fab為對照(野生型fab重鏈本文公開為seqidno：24)。5天后收獲上清液，使用ni-nta瓊脂糖(lifetechnologies)通過親和層析純化表達的fab。通過幾輪濃度/稀釋將純化的蛋白質的緩沖液交換到pbs，ph7.4中，并且通過吸光度280和sds-page測定蛋白質濃度和純度。實施例14：如使用表面等離子共振評價的變體抗體顯示改善的結合通過reichertsr7000dc光譜儀上的表面等離子共振(spr)測量變體029fab分子對il-6的親和力。通過標準胺偶聯(lián)將10mm乙酸鈉(ph4.5)中的20μg/ml的人il-6固定在500-kda羧甲基葡聚糖芯片上。在25℃以25μl/min流速注入10mmhepes，150mmnacl，ph7.3中的每種fab分子的連續(xù)稀釋。4分鐘后，停止加載，并通過流動的運行緩沖液(10mmhepes，150mmnacl，ph7)測量解離5分鐘。傳感圖跡線擬合于1:1結合模型很差，可能是由于芯片上il-6的混合取向或非特異性抗體結合。相反，使用tracedrawer軟件將曲線擬合至2種類(低親和力和高親和力種類，在表3中標記為“低親和力”和“高親和力”)，其中ka1，kd1和kd1是低親和力種類的締合速率，解離速率，和平衡結合常數(shù)，并且ka2，kd2和kd2是高親和力種類的締合速率，解離速率和平衡結合常數(shù)。與wtebi-029fab相比，所有突變體fab具有顯著較慢的解離，其中從最高至最低親和力的排列順序如下-a28v/s30p/i51t/s55g(ebi-030)>s30p/i51t/s55g>a28v/i51t/s55g>wt(ebi-029)。表3：突變體抗體的spr結果實施例15：變體抗體在hek-bluetmil6報告細胞中顯示出改善的拮抗效力hek-bluetmil6報告細胞系(invivogen)用于比較不同突變體ebi-029fab片段之間il6信號傳遞抑制的效力。hek-bluetmil6細胞是穩(wěn)定表達il-6r基因的修飾的hek-293系，并含有處于與四個stat3結合位點融合的ifnβ最小啟動子的控制下的分泌堿性磷酸酶報告基因。為了測定il6拮抗作用，將10μl400pm的人il-6(r&dsystems206-il-010/cf)與10μl濃度范圍內的每種fab變體在96孔板中混合，并在室溫下溫育30分鐘。將對數(shù)期的hek-bluetmil6細胞進行胰蛋白酶消化，并以280,000個細胞/ml重懸于測定培養(yǎng)基(dmem，4.5g/l葡萄糖，10％熱滅活fbs，2mml-谷氨酰胺，pen-step)中。將180μl細胞懸浮液加入到il-6/fab混合物的每個孔中，使最終的il-6濃度達到20pm。將細胞在37℃/5％co2下孵育20小時。然后將來自每孔的20μl上清液與180μl的quanti-bluetm試劑(invivogen)混合，并在37℃下溫育40分鐘，之后在spectramaxm5讀板儀上測量650nm的吸光度。減去來自沒有il-6的孔的背景信號，然后除以用無抑制劑的il-6處理的細胞以取得信號傳遞分數(shù)值。與wtebi-029pab相比，所有突變體顯示出顯著更高的效力，其中拮抗效力排列順序如下：a28v/s30p/i51t/s55g(ebi-030)>a28v/i51t/s55g>s30p/i51t/s55g>wt(ebi-029)。這些結果顯示于圖6中。實施例16：變體抗體在t1165增殖測定中顯示出改善的拮抗效力t1165.85.2.1細胞(r&dsystems)是響應于小鼠，大鼠或人il-6而增殖的鼠漿細胞瘤細胞系。為了測定來自ebi-029fab突變體的拮抗作用，在96孔板中將25μl的2ng/ml人il-6(r&dsystems206-il-010/cf)與25μl在濃度范圍內的每種fab變體混合并在室溫下培養(yǎng)30分鐘。將對數(shù)期的t1165細胞沉淀并以2x105個細胞/ml重懸于測定培養(yǎng)基(90％rpmi1640,10％fbs，2mml-谷氨酰胺，pen-strep)中。將50μl細胞懸浮液加入到il-6/fab混合物的每個孔中，使最終的il-6濃度達到0.5ng/ml。將細胞在37℃/5％co2下孵育72小時。將100μlcell-試劑(promega)加入每個孔中并在室溫下孵育10分鐘。在spectramaxm5讀板儀上測量發(fā)光。所有突變體與wtebi-029fab相比顯示出顯著更高的效力，其中在測試的fab濃度范圍內沒有可測量的il-6信號傳遞(參見圖7)。實施例17：變體抗體的藥物樣性質(druglikeproperty)比較通過差示掃描熒光測定法(dsf)測定每個fab變體的熱穩(wěn)定性。在biorad96孔pcr板中將2μl的2.5或5mg/ml的蛋白質與18μlpbs和2μl50xsyproorange混合。該板在bioradcfx96rt-pcr系統(tǒng)中運行，其中線性溫度從25℃增加至95℃，并隨時間測量熒光。將tm計算為熔化曲線的一階導數(shù)的最低點。所有變體具有76和78℃之間的測量tm值，與wtebi-029fab的76℃的測量tm一致。為了測量聚集，通過sec-mals使用agilent1260hplc與wyattminidawntreos光散射儀器和wyattoptilabrex折射儀的組合評估樣品。注射20-100μg蛋白質并以1ml/min的流速運行。如通過光散射測量的，所有變體的分子量在45000和52000da之間，與野生型ebi-029fab一致。這些結果指示，與ebi-029相比，ebi-030在其藥物樣性質方面表現(xiàn)相似地良好。實施例18：產生全長ebi-029和ebi-030igg2抗體，以及具有突變fc域的igg2抗體將ebi-029和ebi-030重構(reformat)為igg2和突變體fcigg2使用引入n端ecori位點和c-端nhei位點的引物，從fab載體pcr擴增包含前導序列(mdwtwrilflvaaatgahs；seqidno：49)的ebi-029和ebi-030的重鏈可變域。pcr產物在1％瓊脂糖凝膠上純化，并用ecori-hf和nhei-hf雙重消化。含有野生型igg2重鏈序列的或具有h311a突變(h311對應于seqidno：41中的編號；這對應于martin等人，molecularcell,7:4,867-877(2001)中提供的編號中的h310)的變體igg2結構域的基于ptt5的骨架的載體相似地用ecori-fh/nhei-hf消化，并在1％瓊脂糖凝膠上純化。使用quikligase酶(newenglandbiolabs)將插入物連接到消化的骨架中，在top10細胞(lifetechnologies)中轉化，并在lb-amp上選擇。將克隆進行小量制備并測序以確認插入物。選擇h311a突變以降低fc對fcrn的結合親和力，以便減少從眼組織逃逸的分子的系統(tǒng)積累。通過瞬時轉染表達和純化igg2變體通過瞬時轉染在hek-6e細胞中表達ebi-029igg2，ebi-029igg2-h311a，ebi-030igg2和ebi-030igg2-h311a。使用pei作為轉染試劑，將含有各重鏈的ptt5載體與ebi-029lc質粒共轉染。5天后收獲上清液，通過親和層析用蛋白a瓊脂糖純化表達的igg2分子。通過幾輪濃度/稀釋將純化的蛋白質的緩沖液交換到pbs，ph7.4中，通過吸光度280和sds-page測定蛋白質濃度和純度。cho穩(wěn)定池生產根據制造商的說明書使用freedomcho-s試劑盒(lifetechnologies)生成產生ebi-029igg2，ebi-030igg2或ebi-030igg2-h311a的穩(wěn)定cho池。簡而言之，通過標準消化/連接將與ebi-029lc組合的每個重鏈克隆到pcho1.0載體中。使用freestylemax試劑將構建體轉染到cho-s細胞中，并使用增加濃度的嘌呤霉素和mtx選擇穩(wěn)定池。經過兩輪選擇后，通過分析蛋白a層析針對抗體產生篩選池，并選擇最高生產者用于按比例放大和亞克隆。序列顯示如下。030重鏈多肽序列(在igg2框架中，cdr加下劃線)：030輕鏈多肽序列(在igg2框架中,cdr加下劃線):030重鏈核酸序列：caagtgcagctggtgcagtcaggggccgaggttaagaagccagggagcagcgtcaaggtatcttgtaaagcgtctggttacgtccttccaaactacctgatcgaatgggtgaggcaggctcccggccaaggcctggaatggatgggagttaccacccctgggggcggcaccattaattacgcccagaaatttcagggacgagtgacgattaccgccgacgagtccaccagtactgcctacatggagctgtcctcactccgcagcgaggacacggcagtttactactgcgcccggagtcgatgggaccctctttactattatgctctggaatactggggccagggaacgaccgttacagtgtcatctgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaaseqidno:43030輕鏈核酸序列：gacatagtgatgactcaaagtccggacagcctggcggtgtcactcggcgaacgggcaactatcaactgccgagccagcgagagcgtcgataattacggcatccccttcatgaactggtatcagcagaagccaggacagccgcccaagctgcttatctacgccgcttccaaccggggatcaggggtgcccgatcgatttagtggaagcggtagtgggaccgatttcacactgaccatcagctcccttcaggccgaggatgtggctgtctattattgtcagcaatccgaggaagtgccgctcacgtttggtcagggaaccaaactggagatcaagcggaccgtagcggcgcctagtgtcttcatcttcccaccctccgacgaacagctgaagtctggcactgcttccgtcgtgtgcctgctcaacaacttttaccctagagaggcaaaagttcaatggaaagtagacaatgccttgcagtccgggaactcccaggagtctgtcacagagcaggatagtaaggactcaacctacagcctgtccagcacactgaccctctccaaagccgactacgagaagcacaaagtgtacgcttgcgaagttacgcatcaggggctgtcctcacccgttacaaaaagttttaacagaggggagtgcseqidno:44具有h311a突變的030重鏈多肽序列(311a為粗體，cdr加下劃線)，本文也稱為031重鏈多肽序列：031重鏈核酸序列：caagtgcagctggtgcagtcaggggccgaggttaagaagccagggagcagcgtcaaggtatcttgtaaagcgtctggttacgtccttccaaactacctgatcgaatgggtgaggcaggctcccggccaaggcctggaatggatgggagttaccacccctgggggcggcaccattaattacgcccagaaatttcagggacgagtgacgattaccgccgacgagtccaccagtactgcctacatggagctgtcctcactccgcagcgaggacacggcagtttactactgcgcccggagtcgatgggaccctctttactattatgctctggaatactggggccagggaacgaccgttacagtgtcatctgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcgtggcccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa(seqidno:48)實施例19：在hek-blue-il6測定中ebi-030與ebi-029igg2效力的比較使用hek-bluetmil6報告細胞系(invivogen)比較在ebi-029與ebi-030igg2抗體之間的il6信號傳遞抑制的效力。比較了從hek-6e細胞純化的三種蛋白質制劑-ebi-029igg2，ebi-030igg2和ebi-030igg2-h311a(也稱為031或ebi-031)，連同在穩(wěn)定的cho池中產生的ebi-030igg2制劑。另外，也包括批準的抗il6r抗體托珠單抗作為對照。為了測量il6拮抗作用，將400pm的人il-6(r&d系統(tǒng)206-il-010/cf)與不同濃度的各抗體在96孔板中混合，并在室溫下孵育30分鐘。將對數(shù)期的hek-bluetmil6細胞進行胰蛋白酶消化，并以280,000個細胞/ml重懸于測定培養(yǎng)基(dmem，4.5g/l葡萄糖，10％熱滅活fbs，2mml-谷氨酰胺，pen-step)中。將180μl細胞懸液加入到il-6/fab混合物的每個孔中，使最終的il-6濃度達到20pm。將細胞在37℃/5％co2下孵育20小時。然后將來自每個孔的20μl的上清液與180μl的quanti-bluetm試劑(invivogen)混合，并在37℃下溫育40分鐘，然后在spectramaxm5讀板儀上測量在650nm的吸光度。結果顯示于圖8和表5中。與ebi-029相比，ebi-030(包括在hek細胞中產生的具有或不具有h311a突變的ebi-030和在cho細胞中產生的ebi-030)顯示了顯著改善的效力(ic50降低約50倍且ic90降低>100倍)。效力的增加大于通過spr測量的親和力的增加。表5：ic50和ic90值ebi-031(在本文中也稱為ebi-030igg2-h311a)具有比ebi-029的ic50小75倍的ic50，和比ebi-029的ic90小約350倍的ic90。在hek細胞中產生的ebi-030具有比ebi-029的ic50小50倍的ic50，和比ebi-029的ic90小約4000倍的ic90。實施例20：增加的效力對玻璃體il-6阻斷持續(xù)時間的的建模分析使用藥物動力學模型模擬在玻璃體內施用后增加的效力對il-6阻斷的程度和持續(xù)時間的的影響(圖9)。描述游離抗體(a)，游離il-6(il)和抗體/il-6復合物(ail)的變化的微分方程定義如下：d/dt(a)＝-a*kae–a*il*k1+ail*k2d/dt(il)＝kpi–il*kie–a*il*k1+ail*k2d/dt(ail)＝-ail*kaie+a*il*k1–ail*k2其中kae是游離抗體從玻璃體的清除速率，k1是抗體/il-6結合的締合速率，k2是抗體/il6復合物的解離速率，kpi是il-6產生的速率，kei是游離il-6從玻璃體的清除速率，并且kaie是抗體/il-6復合物從玻璃體的清除速率。啟始參數(shù)值和速率如表6所示限定。表6：起始參數(shù)值和速率基于50μl劑量的50mg/ml抗體至具有5ml玻璃體體積的人眼的假設計算a0?；凇?00pg/ml的dme患者中的玻璃體內il-6的臨床測量值估算il0。k1基于1e5m-1s-1的典型抗體締合速率估算，而改變k2以模擬范圍從100pm至1pm的效力值。kae源自～11天的在兔中測量的玻璃體清除半衰期，如先前對人pk測量的縮放1.8。以24小時的清除半衰期間估算kie，且kpi計算為il0*kie。使用berkeleymadonna軟件在300天的時間過程中進行游離抗體和游離il-6的模擬(圖10)。選擇95％il-6阻斷的截斷來測量抑制的持續(xù)時間。該模型預測，增加的抗體效力顯著地延長眼中il-6抑制的持續(xù)時間，從k2/k1＝100pm的130天延長至k2/k1＝10pm的200天，至k2/k1＝1pm的225天。實施例21：il-6a的藥代動力學在pharmoptima(portage，mi)的雄性新西蘭白兔中進行藥代動力學(pk)實驗。所有動物是12-13個月齡，且體重為2.61-3.42公斤。比較以下蛋白質：ebi-029-igg2(seqidno：11和seqidno：12)，ebi-029-igg2-h311a(seqidno：10和seqidno：12)，ebi-030(seqidno：41和seqidno：42)，ebi-030-igg2-h311a(seqidno：47和seqidno：42)，ebi-029fab(seqidno：24和seqidno：12)，(vegf抑制劑)和托珠單抗(tcz；抗il6r抗體)。所有蛋白質在ph7.4的pbs中以13.8mg/ml配制。ebi-029-igg2，ebi-029-igg2-h311a，ebi-030，ebi-030-igg2-h311a，ebi-029fab和托珠單抗在兔中不結合其靶抗原，而確實結合兔vegf。對于玻璃體內pk的研究，用50μl的檢品注射9只動物的每只眼睛。在注射前，將鹽酸利多卡因(可注射2％)，0.5％丙美卡因(proparacaine)或0.5％丁卡因(tetracaine)施用于眼表面。通過眼睛的背斜象限插入bd300μl胰島素注射器(31g×5/16英寸針頭)以進行中部玻璃體的注射。對于系統(tǒng)性pk的研究，3只動物通過耳靜脈注射100μl檢品。在0.083、1、4、8、24、72、168、240和336小時從ivt和iv組的3只動物收集連續(xù)血液樣品，并用檸檬酸-磷酸-葡萄糖溶液1:1稀釋并置于冰上。通過在4℃下以4000rpm離心冷凍血液樣品10分鐘收集血漿，并在-80℃下冷凍儲存。在給藥后0.25、24、168和336小時，從ivt組的所有動物的兩只眼睛中收獲眼組織。動物通過靜脈注射過量巴比妥鹽安樂死。為了收獲房水，在安樂死之后，立即將具有針頭的注射器插入角膜下方，并且緩慢抽出房水。將房水轉移到預先標記的管中并置于干冰上或在-80℃冷凍。為了收獲玻璃體液，使用解剖刀將小切片引入到去核眼的鞏膜中，并通過注射器經開口取出玻璃體。通過注射器上的刻度測量樣品，將其轉移到預先標記的管中，并置于干冰上或在-80℃下冷凍。為了收獲視網膜和脈絡膜，在被摘出眼睛的鞏膜中用解剖刀引入小切片，與角膜緣平行并在其尾部。將剪刀用于繼續(xù)在眼球周圍開口，將其分成兩半。放置后眼球使內部朝上。使用鰓刀，從眼球小心收集視網膜。一旦從眼球收集視網膜，以類似的方式從剩下的眼球收集脈絡膜。將兩種樣品分別轉移到預稱重和預先標記的管中，稱重，并置于干冰上或在-80℃下冷凍。在磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中將視網膜和脈絡膜組織稀釋10倍，勻漿，并儲存在-80℃。通過elisa評估每個組織中的蛋白質濃度。對于ebi-029-igg2，ebi-029-igg2-h311a，ebi-030，ebi-030-igg2-h311a和ebi-029bab，用在pbs中的1μg/ml人il-6在室溫下包被costar半容量板1小時?？子煤?％bsa的pbs封閉，洗滌，然后與使用pbs+5％兔血漿+0.05％吐溫-20作為稀釋劑稀釋的每種樣品的系列稀釋物進行溫育。每個平板上還包括使用純化蛋白質獲得的標準曲線。將樣品在室溫下孵育60分鐘，然后用300μl含有0.05％土溫-20的pbs洗滌三次。然后在每個孔中加入在pbs，1％bsa，0.05％土溫-20中以1:10,000稀釋的抗kappa-hrp(genwayinc.)并孵育30分鐘?？兹缟锨逑?，然后加入3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(tmb)底物，并在spectramax讀板儀上在450和550nm測量信號。使用softmaxpro6軟件，基于標準曲線計算蛋白質濃度。每個elisa在至少3個獨立平板上重復并報告平均半衰期。對于托珠單抗，除了使用抗托珠單抗fab(bioradhca252)作為捕獲試劑，并使用抗人igg-fc-hrp(sigmaa0170)作為檢測抗體之外，如上所述通過elisa測定蛋白質濃度。使用兩種不同的elisa測定來測量游離和總的對于游離的用重組vegf(r&d系統(tǒng))包被孔，并用抗人igg-fc-hrp(sigmaa0170)檢測結合的蛋白質。對于測量總將抗人fc抗體(sigmai2136)用于捕獲，并將抗人igg-ch2-hrp(bioradmca647p)用于檢測。每種elisa在至少3個獨立平板上重復，并報告平均半衰期。結果概述在大多數(shù)動物中，在240和336小時的時間點觀察到針對注射的蛋白質的穩(wěn)健的抗體形成。因為這種抗體形成可以影響蛋白質清除或干擾elisa，所以將數(shù)據分析限制到直到168小時的時間點并包括168小時。對于玻璃體內的pk，與(t1/2＝6.3天)，托珠單抗(t1/2＝4.8天)或ebi-029fab片段(t1/2＝3.9天)相比，所有ebi-029和ebi-030igg2蛋白的清除顯著更慢(eb/029，ebi-029-h311a，ebi-030，和ebi-030-h311a分別為t1/2＝9.3,9.0,15.7,和9.8天)(圖11，表7)。在視網膜，脈絡膜和房水中觀察到相似的趨勢，其中與和托珠單抗相比，ebi-030和ebi-030-h311a以更高的水平積累(參見圖12和圖13)。在ivt施用后，所有蛋白質可在血漿中檢測到，其中ebi-029，ebi-030和托珠單抗以比或ebi-030-h311a顯著更高的水平積累(參見圖14)。類似地，在iv施用后，和ebi-030-h311a從血漿中更快地清除，其中由于fcrn結合減少，ebi-030-h311a半衰期約為野生型igg2的一半(表7)。表7：藥代動力學結果實施例22：ebi-031在高濃度下的溶解度使用amiconultra-15自旋濃縮器將純化的ebi-031在pbs中從3mg/ml濃縮至142mg/ml。通過在與wyattminidawntreos光散射儀和wyattoptilabrex折射率儀組合的tosohg3000swxl7.8x30sec柱上運行，來評估濃縮前和濃縮后的濃度。注射20μg蛋白質，并以1ml/min的流速在pbs中運行。在預期的～150kda的分子量下的峰的質量分數(shù)大約等于兩個濃度(3mg/ml為90.9％，142mg/ml制劑為91.3％)，表明濃縮期間蛋白質聚集沒有顯著增加。這些結果證明ebi-031可以濃縮至高達142mg/ml，同時幾乎沒有可測量的聚集(<10％聚集)。實施例23：ebi-031阻斷順式和反式il6信號使用hek-bluetmil6報告細胞系(invivogen)以比較ebi-031和托珠單抗用于阻斷順式和反式il6信號傳遞的效力。對于順式信號傳遞，在96孔板中將游離il-6(終濃度＝20pm)與一系列濃度的ebi-031或托珠單抗混合，并在室溫下孵育30分鐘。胰蛋白酶消化對數(shù)期的hek-bluetmil6細胞，并重懸于測定培養(yǎng)基(dmem，4.5g/l葡萄糖，10％熱滅活fbs，2mml-谷氨酰胺，pen-step)中，并將50,000個細胞加入每個孔中，最終體積為200μl。將平板在37℃/5％co2下孵育20小時。然后將來自每孔的50μl上清液與150μlquanti-bluetm試劑(invivogen)混合，并在37℃下溫育40分鐘，然后在spectramaxm5讀板儀上測量650nm處的吸光度。減去來自沒有il-6的孔的背景信號，并且然后除以用il-6而沒有用抑制劑處理的細胞以得到信號傳遞分數(shù)值。相比于托珠單抗(ic50＝12.9nm)，ebi-031(ic50＝14.2pm)以>900倍更大的效力阻斷游離il-6(圖16a)。為了測量反式信號傳遞阻斷，除了使用最終濃度為200pm的超il-6代替游離il-6之外，如上所述進行實驗。超il-6是il-6和可溶性il-6受體之間的基因融合物(fischer等人，naturebiotechnology15：142-145(1997)。ebi-031有效阻斷了超il-6(ic50＝32pm)，而托珠單抗不能顯著地抑制至1μm濃度的信號傳遞(圖16b)。這些結果顯示ebi-031在位點ii或接觸gp130的位點以pm親和力結合人il-6位點，并在細胞測定中以比托珠單抗>900倍更多的效力阻斷il-6和il-6/sil-6rα復合物的信號傳遞。實施例24：玻璃體內ebi-031抑制il-6信號傳遞的計算模擬如實施例20所述進行計算模擬，以預測在人中的玻璃體內施用ebi-031應當抑制95％il-6信號傳遞的時間長度。k2設定為0.12d-1，使得在效力測定中測得的k2/k1＝14pm。基于在兔子中測量的玻璃體內清除半衰期對于人縮放1.8，將t1/2清除設定為18天。所有其他參數(shù)在表6中描述。該模型預測ebi-031應該在玻璃體內施用后持續(xù)～150天阻斷95％的il-6信號傳遞(圖17)。這些建模結果表明，ebi-031可以在長時間內(例如高達約6個月)基本上阻斷眼睛中的il-6信號傳遞。實施例25：ebi-031亞型的表征ebi-031是igg2抗體。如前所述，igg2抗體存在三種不同的結構亞型，igg2-a，igg2-b和igg2-a/b亞型(圖18)。在該實施例中，進行實驗以鑒定ebi-031樣品中的結構亞型。rp-hplc分析將反相高效液相層析(rp-hplc)用于分辨ebi-031的各種結構亞型。優(yōu)化以前已經使用的用于分辨igg2二硫化物介導的結構亞型的增強的分析型rp-hplc方法(參見dillon等人，journalofchromatographya，2006,1120：112-120)用于分辨ebi-031。將包含約30μg的ebi-031樣品加載到zorbax300sb-c8柱(150mm×2.1mm,5.0μm,)上。柱溫度設定在75℃。流動相a為含有0.1％tfa的水，并且流動相b為55％ipa，40％acn，4.9％水和0.1％tfa。流速為0.5ml/min。該柱首先用90％流動相a和10％流動相b平衡2分鐘，隨后是10至25％b的2分鐘不連續(xù)梯度。用超過21分鐘的25-32％b的線性梯度實現(xiàn)洗脫。在214nm和/或280nm處監(jiān)測uv吸光度。為了確定分辨率是否與二硫化物有關，在室溫下用5mmdtt和10mm半胱氨酸處理樣品2分鐘，并且然后用rp-hplc方法分析(圖19)。用有效的還原劑，dtt處理導致igg2抗體的減少，導致洗脫成早期峰(峰0和峰1)(圖19中間圖)。使用與dtt相比較溫和的還原劑，半胱氨酸處理也將亞型分布轉移到早期峰(峰0和峰1)，盡管沒有達到用dtt處理的樣品所見的程度(圖19，底圖)。數(shù)據證明，rp-hplc方法可以分辨具有不同二硫鍵連接性的結構亞型。通過非還原肽定位和質譜分析證實了不同的二硫鍵結構：早期洗脫峰(峰1)含有igg2-a/b亞型，并且晚期洗脫峰(峰2)含有igg2-a亞型。重要的是，在ebi-031樣品中沒有檢測到igg2-b亞型b(峰0)(圖19，上圖)。不同ebi-031樣品的比較使用上述rp-hplc分析，分析從不同ebi-031表達細胞系收集的ebi-031樣品，以比較產生的抗體的亞型分布。從克隆細胞系的200l規(guī)模培養(yǎng)物，來自親本細胞系的10l規(guī)模培養(yǎng)物和穩(wěn)定轉染的細胞池中收集ebi-031樣品。使用三步層析法從克隆和親本ebi-031表達細胞系純化ebi-031。使用蛋白a純化從穩(wěn)定轉染的細胞池純化ebi-031。通過上述方法分析樣品。圖20中所示的結果顯示，所有三種ebi-031樣品都含有亞型igg2-a和igg2-a/b，但沒有顯著量的igg2-b。該數(shù)據證明，無論是從克隆的ebi-031表達細胞系，親本ebi-031表達細胞系，或是從穩(wěn)定表達ebi-031的異質細胞群體產生，ebi-031igg2抗體以比其他igg2抗體更少的異質混合物產生。圖21顯示來自克隆ebi-031表達細胞系的200l規(guī)模培養(yǎng)物的ebi-031樣品的亞型分布，例如圖20的上圖。還測量了曲線下面積的區(qū)域，并且亞型之間的分布如圖下的表所示。實施例26：靈長類動物研究中的藥代動力學在靈長類動物研究中研究了ebi-031的藥代動力學。測試了兩只雄性非洲綠猴。將50μl50mg/ml的ebi-031經玻璃體內注射到眼中。madonna軟件用于曲線擬合。使用曲線擬合對來自靈長類動物研究的數(shù)據建模。描述玻璃體中的抗體(a)和玻璃體外的抗體(例如系統(tǒng)性(ap))變化的微分方程定義如下：d/dt(a)＝-a*kaed/dt(ap)＝a*kae(dil)–ap*kape起始參數(shù)值和速率如下表所示定義：表8：起始參數(shù)值和速率參數(shù)值dil-稀釋100kae-玻璃體消除速率0.2kape-系統(tǒng)消除速率1.4初始a-玻璃體中的初始抗體1000000初始ap-玻璃體外的初始抗體0包括的用于擬合的其他考慮因素包括：浮動稀釋度和兩種速率常數(shù)以用于擬合。將初始a保持恒定(在5ml眼中為2x50ml的50mg/ml)。如圖22a，22b和23中所示的建模結果顯示玻璃體消除率常數(shù)對于兩只猴子分別產生4.6和5.7天得半衰期。平均玻璃體消除速率常數(shù)計算為5.2天。系統(tǒng)消除建模為1.1天，和0.63天(平均0.85天)。這些結果證明在靈長類動物中，ebi-031在玻璃體中的半衰期明顯長于系統(tǒng)半衰期。實施例27：ebi-031的藥代動力學進行另一項藥代動力學(pk)實驗，其中將50μl的20mg/mlebi-031溶液經玻璃體內注射到兔子眼中。檢查的時間點為1,3,7和14天(例如，24,72,168和336小時)。對每個時間點分析兩只動物(四只眼睛)。如實施例21所述進行施用ebi-031制劑，收獲眼組織和測定蛋白質濃度的方法。結果顯示于圖24a-24i中。當分析第1-14天玻璃體液中的蛋白質濃度時，ebi-031的半衰期測定為8.95天(圖24a)。然而，在第14天檢測到強的抗體應答，其可以影響這些結果。當分析第1-7天玻璃體液中的蛋白質濃度時，ebi-031的半衰期測定為18.88天。玻璃體內注射后在眼睛其他部位也檢測到ebi-031。ebi-031還滲透到房水(圖24b)，脈絡膜(圖24c)，結膜(圖24d)，角膜(圖24e)，睫狀體(圖24f)，晶狀體(圖24g)，視網膜(圖24h)和鞏膜(圖24i)中。這些組織中的藥物濃度比玻璃體中檢測到的濃度低一到兩個數(shù)量級。其他實施方案在以下權利要求的范圍內。當前第1頁12