相關(guān)申請的交叉引用本申請要求于2014年10月09日提交的美國臨時申請?zhí)?2/061,952的權(quán)益；該申請的全部內(nèi)容通過引用整體并入本文。發(fā)明背景調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(tregs)是免疫耐受所需的并作為適應(yīng)性和先天性免疫效應(yīng)細(xì)胞的主要抑制物發(fā)揮作用?；趖regs的療法提供了體內(nèi)平衡機(jī)制用以控制在免疫失調(diào)，例如實體器官移植排斥和移植物抗宿主病(gvhd)，以及越來越多涉及tregs功能紊亂的其它受損外周耐受紊亂(例如，系統(tǒng)性自身免疫疾病包括血管炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(sle)、1型糖尿病(t1d)、多發(fā)性硬化癥(ms)、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(ra)、炎癥性腸病(ibd)和過敏性哮喘)中關(guān)注到的適應(yīng)不良的免疫活化(saadoun等人，(2011)n.engl.j.med.365:2067-2077；hartemann等人，(2013)lancetdiabetesendocrinol.1:295-305；humrich等人，(2014)ann.rheum.dis.73:a46；lambrecht等人，(2013)eur.j.immunol.43:3125-3137)。然而，基于輸注離體擴(kuò)增的tregs的治療途徑難以實現(xiàn)并且不能滿足長期的炎癥控制對維持過繼轉(zhuǎn)移細(xì)胞的功能的需求(brunstein等人，(2011)blood117:1061-1070)。此外，雖然低劑量il-2可提高tregs，但半數(shù)cgvhd參與者未獲得臨床受益(koreth等人，(2011)n.engl.j.med.365:2055-2066)。因此，現(xiàn)有技術(shù)中存在針對用于提高tregs穩(wěn)定性以改善不想要的免疫反應(yīng)的組合物和方法的巨大需求。特別地，cgvhd治療的進(jìn)展是迫切需求的，尤其是對于兒童，其有多年的生活伴隨著cgvhd的致人衰弱化后果，例如皮膚硬化、關(guān)節(jié)攣縮或肺纖維化。發(fā)明概述本發(fā)明(至少部分)基于發(fā)現(xiàn)了多次-可變劑量il-2可在體內(nèi)顯著增加treg的數(shù)目和活性以治療免疫失調(diào)，例如gvhd(例如，發(fā)作的、慢性gvhd)。此種治療的效果可以通過與一種或多種附加抗免疫失調(diào)治療(諸如，給予ecp和/或tregs)相結(jié)合以進(jìn)一步增加。在一個方面中，提供了用于治療罹患免疫失調(diào)的受試者的多次-可變il-2劑量方法，其包括：a)給予所述受試者誘導(dǎo)方案，所述誘導(dǎo)方案包括以增加所述受試者的血漿白細(xì)胞介素-2(il-2)水平并增加所述受試者的調(diào)節(jié)性t淋巴細(xì)胞(tregs)與常規(guī)t淋巴細(xì)胞(tcons)的比率(tregs:tcons)的劑量持續(xù)給予所述受試者il-2；以及b)隨后給予所述受試者至少一個維持方案，所述維持方案包括持續(xù)給予所述受試者il-2維持劑量，所述il-2維持劑量高于所述誘導(dǎo)方案劑量并且i)進(jìn)一步增加所述受試者的血漿il-2水平和ii)進(jìn)一步增加所述tregs:tcons比率，從而治療所述受試者。某些實施方式可適用于本文所述的任何方法。例如，在一個實施方式中，所述il-2維持方案使所述受試者的血漿il-2水平增加至超過由所述誘導(dǎo)方案所誘導(dǎo)的血漿il-2峰值水平。在另一實施方式中，所述血漿il-2水平是通過在il-2給予后分析一次或多次如下指標(biāo)來確定的：il-2蛋白水平、il-2蛋白活性、il-2核酸水平、tregs增殖、tregs活性、tregs磷酸化stat5水平、tregsfoxp3水平和tregs凋亡。在又一實施方式中，所述誘導(dǎo)方案劑量為約0.3x106iu/m2/天至約3.0x106iu/m2/天。在又一實施方式中，所述誘導(dǎo)方案劑量小于約6.0x106iu/m2/天。在另一實施方式中，所述誘導(dǎo)方案的持續(xù)給予包括每天給予一次，且只要所述患者持續(xù)產(chǎn)生臨床獲益即可無限期持續(xù)。在又一實施方式中，所述誘導(dǎo)方案的持續(xù)給予包括至少在連續(xù)的1-14天期間每天給予一次。在又一實施方式中，所述維持方案中的tregs:tcons比率比在所述誘導(dǎo)方案期間的最大tregs:tcons增加至少20％。在另一實施方式中，所述維持方案劑量比所述誘導(dǎo)方案劑量高至少約20％。在又一實施方式中，所述維持方案劑量為約0.3x106iu/m2/天至約3.0x106iu/m2/天。在又一實施方式中，所述維持方案劑量小于約6.0x106iu/m2/天。在另一實施方式中，所述維持方案的持續(xù)給予包括只要所述患者持續(xù)產(chǎn)生臨床獲益即可無限期給予。在又一實施方式中，所述維持方案的持續(xù)給予包括至少在連續(xù)的1-42天期間每天給予一次。在又一實施方式中，以藥學(xué)上可接受的制劑形式給予所述il-2。在另一實施方式中，通過選自下組的給予途徑給予所述il-2：皮下、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)和肌肉內(nèi)。在又一實施方式中，通過皮下給予所述il-2。在又一實施方式中，所述免疫失調(diào)選自下組：移植物抗宿主病(gvhd)、實體器官移植排斥、血管炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(sle)、1型糖尿病(t1d)、多發(fā)性硬化癥(ms)、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(ra)、炎癥性腸病(ibd)和過敏性哮喘。在另一實施方式中，所述免疫失調(diào)是cgvhd。在又一實施方式中，所述受試者已對系統(tǒng)性類固醇響應(yīng)不足。在又一實施方式中，所述受試者盡管接受了包括類固醇在內(nèi)的至少兩種在先系統(tǒng)性治療但仍具有頑固性或復(fù)發(fā)性慢性gvhd。在另一實施方式中，所述受試者在il-2給予之前已接受了體外光分離置換法(ecp)治療。在又一實施方式中，所述誘導(dǎo)方案和/或所述維持方案進(jìn)一步包括給予一種或多種附加治療以治療所述免疫失調(diào)。在又一實施方式中，所述一種或多種附加治療選自下組：ecp和tregs。在另一實施方式中，以包含除了tregs以外的t細(xì)胞的組合物的形式給予所述tregs。在又一實施方式中，所述組合物具有至少1:2的tregs:tcons比率。在又一實施方式中，通過對包含t細(xì)胞的生物材料的cd8+和cd19+細(xì)胞共排除以及cd25+陽性細(xì)胞選擇獲得所述組合物。在另一實施方式中，所述tregs以約0.1x106細(xì)胞/kg體重至1.0x106細(xì)胞/kg體重之間的劑量給予。在又一實施方式中，將所述受試者自身的treg給予所述受試者。在又一實施方式中，使用與造血干細(xì)胞移植物來自相同的造血干細(xì)胞供體的tregs。在另一實施方式中，所述tregs組合物具有>70％總細(xì)胞活率、革蘭氏染色陰性、≥90％cd4+cd25+細(xì)胞和/或≥50％foxp3+細(xì)胞。在又一實施方式中，所述tregs以輸液形式給予。在又一實施方式中，在il-2給予之前、同時或之后給予所述tregs。在另一實施方式中，在il-2給予之前給予所述tregs。在又一實施方式中，所述受試者是哺乳動物，例如免疫失調(diào)的人類或動物模型。在另一方面中，提供了一種根據(jù)從固定每日il-2劑量的治療方法中的獲益情況將罹患免疫失調(diào)的受試者分層的方法，包括從受試者處獲得包含t淋巴細(xì)胞的生物樣本并測定所述受試者樣本中調(diào)節(jié)性t淋巴細(xì)胞(tregs)與常規(guī)t淋巴細(xì)胞(tcons)的比率(tregs:tcons)，其中大于或等于約0.07的tregs:tcons比率表明所述受試者將會受益于所述固定每日il-2劑量的治療方法，而其中小于約0.07的tregs:tcons比率則表明所述受試者將不會受益于所述固定每日il-2劑量的治療方法。在一個實施方式中，所述方法進(jìn)一步包括若確定所述免疫失調(diào)會受益于固定每日il-2劑量的治療方法則推薦、開具處方或給予固定每日il-2劑量的方法或本文所描述的治療方法。在另一實施方式中，所述方法進(jìn)一步包括若確定所述免疫失調(diào)不會受益于固定每日il-2劑量的治療方法則推薦、開具處方或給予固定每日il-2劑量的治療方法以外的抗免疫失調(diào)療法。在又一方面中，提供了一種根據(jù)從固定每日il-2劑量的治療方法中的獲益將罹患免疫失調(diào)的受試者分層的方法，包括從誘導(dǎo)方案之后的受試者處獲得包含t淋巴細(xì)胞的生物樣本并測定所述受試者樣本中調(diào)節(jié)性t淋巴細(xì)胞(tregs)與常規(guī)t淋巴細(xì)胞(tcons)的比率(tregs:tcons)，其中大于或等于約0.20的tregs:tcons比率表明所述受試者將會受益于所述固定每日il-2劑量的治療方法，而其中小于約0.20的tregs:tcons比率則表明所述受試者將不會受益于所述固定每日il-2劑量的治療方法。在一個實施方式中，所述方法進(jìn)一步包括若確定所述免疫失調(diào)會受益于所述固定每日il-2劑量的治療方法則推薦、開具處方或給予固定每日il-2劑量的方法或本文所述的治療方法。在另一實施方式中，所述方法進(jìn)一步包括若確定所述免疫失調(diào)不會受益于固定每日il-2劑量的治療方法則推薦、開具處方或給予固定每日il-2劑量的治療方法以外的抗免疫失調(diào)療法。附圖簡述圖1采用每日低劑量il-2治療期間cd4+treg的體內(nèi)擴(kuò)增。示出了基于cd3+cd4+t進(jìn)行門控的細(xì)胞分選分析結(jié)果。tregs被定義為cd25+cd127-，而tcons被定義為cd25-cd127+。cd4門內(nèi)的tregs％在各圖中顯示。圖1描述了使用劑量水平b的代表性患者。圖2顯示了進(jìn)行il-2治療的中位數(shù)tregs:tcons比率。其在開始il-2治療的數(shù)周內(nèi)具有快速的升高和持續(xù)的平臺期，以及8周時停止il-2治療后的下降。顯示了中位數(shù)及其四分差。圖3顯示il-2水平隨著tregs絕對數(shù)量的增加而下降。左圖顯示了il-2治療期間的treg細(xì)胞計數(shù)和il-2水平。顯示了在一個8周的il-2治療方案期間treg計數(shù)/μl(方格)對比以pg/μl為單位的血漿il-2水平(三角)。右圖顯示了il-2受體α(cd25；il-2r)的細(xì)胞表面表達(dá)。低劑量il-2期間，在tregs中發(fā)現(xiàn)了il-2r表達(dá)的持續(xù)增加(頂線)但在tcons中則未發(fā)現(xiàn)(底線)。圖4顯示了il-2介導(dǎo)的treg作用在1期對比2期研究中的結(jié)果。左圖顯示了1期(圓圈)對比2期試驗(方塊)中的cd4+cd25+cd127-tregs計數(shù)/μl。右圖顯示了1期(圓圈)對比2期試驗(方塊)的tregs:tcons比率。條形指示1期的il-2治療持續(xù)時間(8周，下方的條形)對比2期的il-2治療持續(xù)時間(12周，上方的條形)。圖5顯示了使用cytof對treg亞群的foxp3表達(dá)進(jìn)行spade分析的結(jié)果。在進(jìn)行12周低劑量il-2研究的代表性患者中，rte/初始和記憶treg群體在spade樹形圖中分別集群并在各組內(nèi)進(jìn)一步描繪出活化treg亞群。氣泡大小反映細(xì)胞數(shù)目且foxp3表達(dá)水平強(qiáng)度被示出。在左上圖中，在il-2治療前基線時，記憶treg群體具有較高的foxp3表達(dá)。在右上圖中，在1周時，il-2在所有treg亞群中誘導(dǎo)foxp3。在左下圖中，在il-2治療的12周時，記憶treg具有較高的foxp3表達(dá)。在右下圖中，停止il-2治療后，treg群體大幅耗盡，在記憶treg亞群中具有有限的殘留foxp3表達(dá)。圖6顯示了采用低劑量il-2的tregs和tcons庫多樣性的t細(xì)胞受體(tcr)序列分析結(jié)果。treg熵(e)在8周il-2后的cgvhd患者中增加，tcon熵?zé)o變化。tcons在上方的圖中示出且tregs在下方的圖中示出。各圖的熵(e)被示出。右下圖對比左下圖，盡管y-軸的標(biāo)度增加了(1k→5k)，但其中額外的高產(chǎn)的tregtcr序列還是明顯的。圖7使用tregs:tcons比率示出了il-2治療的反應(yīng)預(yù)測值。示出了臨床響應(yīng)者(pr)對比無響應(yīng)者(sd/mr/pd)在基線時和1周時的tregs:tcons比率。所有數(shù)據(jù)均來源于固定劑量il-2給予實驗。圖8顯示了cd4+dli±il-2后foxp3表達(dá)的結(jié)果。在來自接受cd4+dli(底部的線)、低劑量il-2(中部的線)或cd4+dli+低劑量il-2(頂部的線)的患者的pbmc中通過實時pcr評估foxp3表達(dá)。借鑒自zorn等人，(2009)biol.bloodmarrowtransplant.15:382-388。發(fā)明詳述已確定在固定劑量il-2治療期間血漿il-2水平快速上升(例如，經(jīng)1周)，然后，盡管每日給予il-2，血漿il-2水平下降而tregs計數(shù)上升(matsuoka等人，(2013)sci.transl.med.5:179ra43)，且據(jù)信該結(jié)果是因為il-2與在tregs上組成性表達(dá)的高親和力il-2受體(cd25)結(jié)合而增加的il-2截留。其后，隨著treg絕對數(shù)的增加，tregs上的cd25表達(dá)在il-2治療期間進(jìn)一步的增加(matsuoka等人，(2013)sci.transl.med.5:179ra43)。本文已確定在所有treg亞群中開始il-2誘導(dǎo)方案后1周，伴隨tregs群體規(guī)模的增加發(fā)生tregs增殖的峰值。然而，tregs增殖在2周后減弱，在il-2治療的12周時，在擴(kuò)大的treg亞群得到保留的同時ki-67表達(dá)(增殖)下降。使用pstat5和foxp3標(biāo)記物觀測到相似的tregs活化時間分布模式，其在各treg亞群具有最初早期普遍的增強(qiáng)，之后在il-2治療期間盡管繼續(xù)保持了增大的treg群體規(guī)模但tregs的活化減弱。然后在l-2停止后4周觀測到treg活化標(biāo)記物的表達(dá)的下降和treg群體的大幅耗盡。因此，涉及個體患者il-2劑量增加(例如，在誘導(dǎo)方案的峰值血漿il-2水平后)的維持方案恢復(fù)血漿il-2水平并進(jìn)一步擴(kuò)大treg增殖、活化和新生，而不誘導(dǎo)tcon活化或過度不良事件。以這種方式，il-2誘導(dǎo)的treg增強(qiáng)在體內(nèi)發(fā)生，且避免了il-2在被增加數(shù)目的具有較高cd25表達(dá)的循環(huán)treg結(jié)合后其血漿水平減小所導(dǎo)致的快速耐受。因此，本發(fā)明的方法提供了使用il-2出乎預(yù)料地增強(qiáng)了的免疫失調(diào)的治療，并允許將tregs和tcons直接或間接用作在治療此類免疫失調(diào)中il-2功效的生物標(biāo)志物。i.定義本文所用的冠詞“一(a)”和“一個(an)”是指一個或超過一個(即，至少一個)所述冠詞的語法對象。舉例而言，“一個要素”意指一個要素或者超過一個要素。術(shù)語“改變的量”或“改變的水平”是指升高或降低的生物標(biāo)志物核酸的拷貝數(shù)(例如，種系和/或體系)，例如，相比于對照樣本中生物標(biāo)志物核酸的表達(dá)水平或拷貝數(shù)，生物樣本中升高或降低的表達(dá)水平。術(shù)語生物標(biāo)志物的“改變的量”還包括相比于正常、對照樣本中的相應(yīng)蛋白水平，樣本(例如，免疫失調(diào)樣本)中升高或降低的生物標(biāo)志物蛋白的蛋白水平。此外，可通過檢測可影響生物標(biāo)志物蛋白的表達(dá)或活性的翻譯后修飾(例如，標(biāo)記物的甲基化狀態(tài))，來測定生物標(biāo)志物蛋白的改變的量。若生物標(biāo)志物的量以超過用于評估量的試驗的標(biāo)準(zhǔn)誤差的量分別高于或低于正常水平，且優(yōu)選至少超過該量20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、300％、350％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多，則受試者中生物標(biāo)志物的量“顯著”高于或低于該生物標(biāo)志物的正常量?；蛘?，若受試者中生物標(biāo)志物的量分別高于或低于該生物標(biāo)志物的正常量至少約兩倍，且優(yōu)選至少約三倍、四倍或五倍，則受試者中生物標(biāo)志物的量可視為“顯著”高于或低于該正常量。術(shù)語生物標(biāo)志物的“改變的表達(dá)水平”是指測試樣本(例如，來源于罹患免疫失調(diào)的患者的樣本)中生物標(biāo)志物的表達(dá)水平或拷貝數(shù)大于或小于用于評估表達(dá)或拷貝數(shù)的試驗的標(biāo)準(zhǔn)誤差，且優(yōu)選為對照樣本(例如，來自未患相關(guān)疾病的健康受試者的樣本)中生物標(biāo)志物的表達(dá)水平或拷貝數(shù)(且優(yōu)選為若干對照樣本中生物標(biāo)志物的平均表達(dá)水平或拷貝數(shù))的至少兩倍，且更優(yōu)選為三倍、四倍、五倍或十倍或更多倍。改變的表達(dá)水平大于或小于用于評估表達(dá)或拷貝數(shù)的試驗標(biāo)準(zhǔn)誤差，且優(yōu)選為對照樣本(例如，來自未患相關(guān)疾病的健康受試者的樣本)中生物標(biāo)志物的表達(dá)水平或拷貝數(shù)(且優(yōu)選為若干對照樣本中生物標(biāo)志物的平均表達(dá)水平或拷貝數(shù))的至少兩倍，且更優(yōu)選為三倍、四倍、五倍或十倍或更多倍。術(shù)語生物標(biāo)志物的“改變的活性”是指相比于正常、對照樣本中生物標(biāo)志物的活性，在疾病狀態(tài)下(例如，在免疫失調(diào)樣本中)生物標(biāo)志物升高或降低的活性。生物標(biāo)志物的改變的活性可為例如以下的結(jié)果：生物標(biāo)志物的改變的表達(dá)、生物標(biāo)志物的改變的蛋白水平、生物標(biāo)志物的改變的結(jié)構(gòu)，或者，例如，其與涉及相同或不同通路的其它蛋白的改變的相互作用或者與轉(zhuǎn)錄激活劑或抑制劑的改變的相互作用。術(shù)語生物標(biāo)志物的“改變的結(jié)構(gòu)”是指與正?；蛞吧突蚧虻鞍紫啾龋谏飿?biāo)志物的核酸或蛋白中存在突變或等位基因變體，例如影響生物標(biāo)志物核酸或蛋白的表達(dá)或活性的突變。例如，突變包括但不限于取代、缺失或插入突變。突變可存在于生物標(biāo)志物核酸的編碼區(qū)或非編碼區(qū)。除非本文中另有指明，否則術(shù)語“抗體”(“antibody”和“antibodies”)廣泛包括天然形式的抗體(例如igg、iga、igm、ige)和重組抗體(例如單鏈抗體、嵌合和人源化抗體和多特異性抗體)，以及所有前述的片段和衍生物，該片段和衍生物具有至少一個抗原結(jié)合位點?？贵w衍生物可包括偶聯(lián)至抗體的蛋白或化學(xué)部分。如本文所用的術(shù)語“抗體”還包括抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡稱“抗體部分”)。如本文所用的術(shù)語“抗原結(jié)合部分”是指抗體的一個或多個保留了與抗原(例如，生物標(biāo)志物多肽或其片段)特異性地結(jié)合能力的片段。已發(fā)現(xiàn)抗體的抗原結(jié)合功能能夠由全長抗體的片段實現(xiàn)。術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”中包含的結(jié)合片段的實例包括(i)fab片段，由vl、vh、cl和ch1結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；(ii)f(ab')2片段，包含通過二硫鍵在鉸鏈區(qū)連接的兩個fab片段的二價片段；(iii)由vh和ch1結(jié)構(gòu)域組成的fd片段；(iv)由抗體單一臂的vl和vh結(jié)構(gòu)域組成的fv片段，(v)dab片段(ward等人，(1989)nature341:544-546)，其由vh結(jié)構(gòu)域組成；和(vi)分離的互補(bǔ)性決定區(qū)(cdr)。此外，盡管fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域vl和vh由不同的基因編碼，可以使用重組的方法通過合成的接頭將其連接在一起，所述合成的接頭使其能夠被制成單一的蛋白鏈，在其中vl和vh區(qū)域配對形成單價多肽(稱為單鏈fv(scfv)；參見例如，bird等人，(1988)science242:423-426；和huston等人，(1988)proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883；和osbourn等人，1998，naturebiotechnology16:778)。此類單鏈抗體也旨在被包括在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”中。特定scfv的任何vh和vl序列可連接至人免疫球蛋白恒定區(qū)cdna或基因組序列，以生成編碼完整igg多肽或其它同種型的表達(dá)載體。還可使用蛋白質(zhì)化學(xué)或重組dna技術(shù)將vh和vl用于生成fab、fv或其它免疫球蛋白片段。還包括其它單鏈抗體形式，例如雙價抗體。雙價抗體是二價的雙特異性抗體，其中vh和vl域在單一多肽鏈上表達(dá)，但使用由于太短而無法使在相同結(jié)構(gòu)鏈上的兩個域之間進(jìn)行配對的接頭，從而迫使各結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對并生成兩個抗原結(jié)合位點(參見例如，holliger等人，(1993)proc.natl.acad.sci.u.s.a.90:6444-6448；poljak等人，(1994)structure2:1121-1123)。更進(jìn)一步地，抗體或其抗原結(jié)合部分可為較大的免疫粘附多肽的部分，其通過將抗體或抗體部分與一個或多個其它蛋白或肽的共價或非共價連接形成。此類免疫粘附多肽的實例包括使用鏈霉親和素核心區(qū)以制備四聚scfv多肽(kipriyanov等人，(1995)humanantibodiesandhybridomas6:93-101)以及使用半胱氨酸殘基、生物標(biāo)志物肽和c-末端聚組氨酸標(biāo)簽以制備二價的和生物素化的scfv多肽(kipriyanov等人，(1994)mol.immunol.31:1047-1058)?？墒褂贸Ｒ?guī)技術(shù)，例如分別用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化完整抗體而由完整抗體制備抗體部分，例如fab和f(ab')2片段。此外，可使用如本文所述的標(biāo)準(zhǔn)重組dna技術(shù)獲得抗體、抗體部分和免疫粘附多肽。抗體可以是多克隆的或單克隆的；異種的、同種異體的或同基因的；或其經(jīng)修飾的形式(例如人源化的、嵌合的等)?？贵w還可以是全人的。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體特異性地或基本上特異性地與生物標(biāo)志物多肽或其片段結(jié)合。本文所用的術(shù)語“單克隆抗體”和“單克隆抗體組合物”是指僅包含一種能夠與特定抗原表位免疫反應(yīng)的抗原結(jié)合位點的抗體多肽群體，而術(shù)語“多克隆抗體”和“多克隆抗體組合物”是指包含多種能夠與特定抗原反應(yīng)的抗原結(jié)合位點的抗體多肽群體。單克隆抗體組合物通常顯示出對于與其免疫反應(yīng)的特定抗原的單一結(jié)合親和力?？贵w還可為“人源化的”，其旨在包括通過非人細(xì)胞制得的具有已經(jīng)改變的可變和恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域以更類似于由人類細(xì)胞制得的抗體的抗體。例如，通過改變非人抗體氨基酸序列以并入在人種系免疫球蛋白序列中發(fā)現(xiàn)的氨基酸。本發(fā)明的人源化抗體可包括不由人種系免疫球蛋白序列所編碼的氨基酸殘基(例如，通過體外隨機(jī)或定點突變或者通過體內(nèi)體細(xì)胞突變所引入的突變)，例如在cdr中。本文所用的術(shù)語“人源化抗體”還包括其中來源于另一哺乳動物物種(例如，小鼠)的種系的cdr序列已被接枝到人框架序列上的抗體。術(shù)語“指定分?jǐn)?shù)”是指當(dāng)在患者樣本中進(jìn)行測量后為各生物標(biāo)志物指定的數(shù)值。該指定分?jǐn)?shù)與樣本中生物標(biāo)志物的缺失、存在或推測的量相關(guān)連。指定分?jǐn)?shù)可人工生成(例如，通過目測)或借助于用于圖像采集和分析的儀器。在某些實施方式中，指定分?jǐn)?shù)是通過定性評估(例如，在分級量表上檢測熒光讀數(shù))或定量評估來確定的。在一個實施方式中，測定“累積分?jǐn)?shù)”，其是指來自多個經(jīng)測量生物標(biāo)志物的指定分?jǐn)?shù)的組合。在一個實施方式中，累積分?jǐn)?shù)是指定分?jǐn)?shù)的總和。在另一實施方式中，指定分?jǐn)?shù)的組合包括在將指定分?jǐn)?shù)組合入累積分?jǐn)?shù)之前對其進(jìn)行數(shù)學(xué)運算。在某些實施方式中，累積分?jǐn)?shù)在本文中還稱作預(yù)測分?jǐn)?shù)。術(shù)語“生物標(biāo)志物”是指已被確定為可對抗免疫失調(diào)療法和/或抗免疫失調(diào)有效治療(例如，多次-可變劑量il-2療法單獨使用或與一種或多種其它抗免疫失調(diào)療法組合使用)進(jìn)行預(yù)測的本發(fā)明的可測量實體。生物標(biāo)志物可包括(不限于)細(xì)胞類型(例如，tregs和/或tcons)、細(xì)胞比率(例如tregs：tcons比率)、核酸(例如，基因組核酸和/或轉(zhuǎn)錄核酸)和蛋白，特別是表1中顯示涉及的那些。生物標(biāo)志物可進(jìn)一步包括免疫學(xué)靶標(biāo)或試劑，其下調(diào)不希望的免疫反應(yīng)以治療如本文進(jìn)一步描述的感興趣的免疫失調(diào)。“阻斷”抗體或抗體“拮抗劑”是抑制或減少其結(jié)合的抗原的至少一種生物活性的抗體。在某些實施方式中，本文所述的阻斷抗體或拮抗劑抗體或其片段基本上或完全地抑制抗原的給定生物活性。術(shù)語“體液”指由機(jī)體排泄或分泌的液體以及正常情況下機(jī)體不排泄或不分泌的液體(例如，羊水、眼房水、膽汁、血液和血漿、腦脊液、耵聹和耳垢、考珀液或預(yù)射精液、乳糜、食糜、糞便、女性射液、間質(zhì)液、細(xì)胞內(nèi)液、淋巴液、月經(jīng)、乳汁、黏液、胸膜液、膿、唾液、皮脂、精液、血清、汗液、滑液、淚液、尿液、陰道潤滑液、玻璃體液和嘔吐物)。在某些實施方式中，使用包含淋巴細(xì)胞(例如，t淋巴細(xì)胞及其亞群)的體液。術(shù)語“編碼區(qū)”是指包含翻譯成氨基酸殘基的密碼子的核苷酸序列區(qū)域，而術(shù)語“非編碼區(qū)”是指不翻譯成氨基酸的核苷酸序列區(qū)域(例如，5'和3'非翻譯區(qū))。術(shù)語“互補(bǔ)的”是指兩條核酸鏈的區(qū)域之間或者相同核酸鏈的兩個區(qū)域之間的廣義序列互補(bǔ)性。已知第一核酸區(qū)域的腺嘌呤殘基能夠與反向平行于該第一區(qū)域的第二核酸區(qū)域的胸腺嘧啶或尿嘧啶殘基形成特定氫鍵(“堿基配對”)。類似地，已知第一核酸鏈的胞嘧啶殘基能夠與反向平行于第一鏈的第二核酸鏈的鳥嘌呤殘基堿基配對。若當(dāng)核酸的第一區(qū)域與相同或不同核酸的第二區(qū)域以反向平行方式排列時第一區(qū)域的至少一個核苷酸殘基能夠與第二區(qū)域的殘基形成堿基配對，則兩個區(qū)域是互補(bǔ)的。優(yōu)選地，第一區(qū)域包含第一部分且第二區(qū)域包含第二部分，由此當(dāng)?shù)谝缓偷诙糠忠苑聪蚱叫蟹绞脚帕袝r，至少約50％，且優(yōu)選至少約75％、至少約90％或至少約95％的第一部分的核苷酸殘基能夠與第二部分中的核苷酸殘基形成堿基配對。更優(yōu)選地，第一部分的所有核苷酸殘基能夠與第二部分中的核苷酸殘基形成堿基配對。術(shù)語“對照”是指適于與測試樣本中的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行比較的任何參照標(biāo)準(zhǔn)。在一個實施方式中，對照包括獲得“對照樣本”，檢測其中的表達(dá)產(chǎn)物水平并與來自測試樣本的表達(dá)產(chǎn)物水平進(jìn)行比較。此對照樣本可包括任何適當(dāng)?shù)臉颖?，包括但不限于具有已知結(jié)果的來自對照免疫失調(diào)患者的樣本(可為貯存樣本或之前樣本的測量值)；分離自受試者(例如，正?；颊呋蛎庖呤д{(diào)患者)的正常組織或細(xì)胞、分離自受試者(例如，正常受試者或免疫失調(diào)患者)的經(jīng)培養(yǎng)原代細(xì)胞/組織、獲得自免疫失調(diào)患者的相同器官或身體位置的鄰近的正常細(xì)胞/組織、分離自正常受試者的組織或細(xì)胞樣本、或者獲得自貯藏庫的原代細(xì)胞/組織。在另一優(yōu)選實施方式中，對照可包括來自任何適當(dāng)來源的參照標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)產(chǎn)物水平，其包括但不限于管家基因，來自正常組織(或其它之前分析的對照樣本)的表達(dá)產(chǎn)物水平范圍，來自患者群或者來自具有某種結(jié)果(例如，存活一年、兩年、三年、四年等)或接受某種治療(例如，免疫失調(diào)療法標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理)的患者組的測試樣本內(nèi)的之前測定的表達(dá)產(chǎn)物水平范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，此類對照樣本以及參照標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)產(chǎn)物水平可組合用作本發(fā)明方法中的對照。在一個實施方式中，對照可包括正?；蚍敲庖呤д{(diào)細(xì)胞/組織樣本。在另一優(yōu)選實施方式中，對照可包括一組患者(例如，一組免疫失調(diào)患者)的表達(dá)水平，或者一組接受某種治療的免疫失調(diào)患者的表達(dá)水平，或者一組具有結(jié)果與另一結(jié)果比較的患者的表達(dá)水平。在前述情況下，各患者的具體表達(dá)產(chǎn)物水平可被指定為表達(dá)的百分?jǐn)?shù)水平，或表示為高于或低于參照標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)水平的中值或平均值。在另一優(yōu)選實施方式中，對照可包括正常細(xì)胞、來自采用聯(lián)合化療治療的患者的細(xì)胞、以及來自對感興趣的治療產(chǎn)生響應(yīng)的患有免疫失調(diào)的患者的細(xì)胞。在另一實施方式中，對照還可包括測量值例如，群體中特定基因的平均表達(dá)水平相比于相同群體中管家基因的表達(dá)水平。此群體可包括正常受試者、未經(jīng)歷任何治療(即，未經(jīng)治療)的免疫失調(diào)患者、正經(jīng)歷標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理治療的免疫失調(diào)患者、或者已響應(yīng)感興趣的治療的患有免疫失調(diào)的患者。在另一優(yōu)選實施方式中，對照包括表達(dá)產(chǎn)物水平的比率轉(zhuǎn)化，其包括但不限于測定測試樣本中兩種細(xì)胞類型和/或基因的表達(dá)產(chǎn)物水平比率并將其與參照標(biāo)準(zhǔn)中相同兩種細(xì)胞類型和/或基因的任何適當(dāng)比率進(jìn)行比較；測定測試樣本中兩種或多種細(xì)胞類型和/或基因的表達(dá)產(chǎn)物水平并且測定在任何適當(dāng)對照中表達(dá)產(chǎn)物水平的差異；以及測定測試樣本中兩種或多種細(xì)胞類型和/或基因的表達(dá)產(chǎn)物水平，以測試樣本中管家細(xì)胞類型和/或管家基因的表達(dá)來將其歸一化，以及將其與任何適當(dāng)?shù)膶φ者M(jìn)行比較。在特別優(yōu)選實施方式中，對照包括與測試樣本為相同譜系和/或類型的對照樣本。在另一實施方式中，對照可包括以在一組患者樣本中或基于一組患者樣本的百分?jǐn)?shù)(例如，所有患者均患有免疫失調(diào))來分組的表達(dá)產(chǎn)物水平。在一個實施方式中，確立對照表達(dá)產(chǎn)物水平，其中相對于例如特定百分?jǐn)?shù)的較高或較低的表達(dá)產(chǎn)物水平被用作預(yù)測結(jié)果的基礎(chǔ)。在另一優(yōu)選實施方式中，使用來自具有已知結(jié)果的免疫失調(diào)對照患者的表達(dá)產(chǎn)物水平來確立對照表達(dá)產(chǎn)物水平，并將來自測試樣本的表達(dá)產(chǎn)物水平與對照表達(dá)產(chǎn)物水平進(jìn)行比較作為用于預(yù)測結(jié)果的基礎(chǔ)。如通過以下數(shù)據(jù)所證實的，本發(fā)明的方法不限于在將測試樣本中表達(dá)產(chǎn)物水平與對照中的進(jìn)行比較時使用特定分割點。生物標(biāo)志物核酸的“拷貝數(shù)”是指細(xì)胞(例如，種系和/或體系的)中編碼特定基因產(chǎn)物的dna序列的數(shù)目。通常，對于給定基因，哺乳動物具有兩拷貝的各基因。然而，拷貝數(shù)可通過基因擴(kuò)增或復(fù)制而增加，或者通過刪除而減少。例如，種系拷貝數(shù)改變包括一個或多個基因座處的改變，其中所述一個或多個基因座不能被解釋成對照中種系拷貝的正常補(bǔ)體中的拷貝數(shù)(例如，與確定特定種系dna和相應(yīng)拷貝數(shù)的物種相同的物種的種系dna中的正常拷貝數(shù))。體系拷貝數(shù)改變包括一個或多個基因座處的改變，其中所述一個或多個基因座不能被解釋成對照的種系dna中的拷貝數(shù)(例如，與確定體系dna和相應(yīng)拷貝數(shù)的受試者相同的受試者種系dna中的拷貝數(shù))。生物標(biāo)志物核酸的“正?！笨截悢?shù)(例如，種系和/或體系的)或者生物標(biāo)志物核酸或蛋白的“正?！北磉_(dá)水平是生物樣本(例如，包含組織、全血、血清、血漿、口腔拭子、唾液、腦脊液、尿液、糞便和骨髓的樣本)中的活性/表達(dá)水平或拷貝數(shù)，所述生物樣本來自受試者(例如，未罹患免疫失調(diào)的人)或來自患有免疫失調(diào)的相同受試者中的相應(yīng)非免疫失調(diào)組織。采用術(shù)語“確定用于受試者的適當(dāng)治療方案”以表示用于受試者的治療方案(即，用于預(yù)防和/或治療受試者中免疫失調(diào)的單一療法或者不同療法的組合)的確定，其開始、修改和/或結(jié)束是基于或基本上基于或至少部分基于根據(jù)本發(fā)明的分析的結(jié)果。一個實例是確定是否提供針對免疫失調(diào)的靶向治療以提供抗免疫失調(diào)療法(例如，多次-可變劑量il-2療法單獨使用或與一種或多種其它抗免疫失調(diào)療法組合)。除了根據(jù)本發(fā)明的分析的結(jié)果以外，該確定可基于待治療受試者的個人特質(zhì)。在大部分情況下，將由主治醫(yī)師或醫(yī)生實際確定用于受試者的適當(dāng)治療方案。術(shù)語“表達(dá)特征”或“特征”是指一組兩種或多種協(xié)同表達(dá)的生物標(biāo)志物。例如，組成該特征的基因、蛋白等可在特定細(xì)胞譜系、分化階段或在特定生物反應(yīng)期間表達(dá)。生物標(biāo)志物可反映表達(dá)其的細(xì)胞類型的生物學(xué)特性。表達(dá)數(shù)據(jù)和基因表達(dá)水平可貯存在計算機(jī)可讀介質(zhì)上，例如與微陣列或芯片閱讀裝置結(jié)合使用的計算機(jī)可讀介質(zhì)。可處理此表達(dá)數(shù)據(jù)以生成表達(dá)特征。如果分子或細(xì)胞共價或非共價地與基底結(jié)合從而可采用流體(例如，標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽溶液，ph7.4)沖洗基底而無相當(dāng)大的一部分分子或細(xì)胞與基底解離，則該分子或細(xì)胞“固定”或“附著”于基底。術(shù)語“同源的”是指相同核酸鏈的兩個區(qū)域之間或者兩個不同核酸鏈的區(qū)域之間的核苷酸序列相似性。當(dāng)兩個區(qū)域中的核苷酸殘基位置被相同核苷酸殘基占據(jù)時，則所述區(qū)域在該位置是同源的。若第一區(qū)域與第二區(qū)域各區(qū)域的至少一個核苷酸殘基位置被相同的殘基占據(jù)，則第一區(qū)域與第二區(qū)域是同源的。兩個區(qū)域間的同源性以兩個區(qū)域的核苷酸殘基位置被相同核苷酸殘基占據(jù)的比例來表達(dá)。舉例而言，具有核苷酸序列5'-attgcc-3'的區(qū)域和具有核苷酸序列5'-tatggc-3'的區(qū)域具有50％同源性。優(yōu)選地，第一區(qū)域包含第一部分且第二區(qū)域包含第二部分，由此，各部分至少約50％，且優(yōu)選至少約75％、至少約90％或至少約95％的核苷酸殘基位置被相同的核苷酸殘基占據(jù)。更優(yōu)選地，各部分的所有核苷酸殘基位置均被相同的核苷酸殘基占據(jù)。術(shù)語“免疫失調(diào)”是指以不想要的免疫反應(yīng)為特征的病況，從而期望的抗免疫失調(diào)反應(yīng)抑制此類免疫反應(yīng)。期望下調(diào)免疫反應(yīng)的此類病況是本領(lǐng)域中公知的且包括但不限于，如本文所進(jìn)一步描述的，在移植物抗宿主病(gvhd)中、炎癥或自身免疫疾病中的組織、皮膚和器官移植狀況，例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、過敏、超敏反應(yīng)、寄生性和病毒性感染、需要增加cd4+t細(xì)胞產(chǎn)生或功能的失調(diào)、需要改進(jìn)的疫苗接種功效的失調(diào)以及需要增加調(diào)節(jié)性t細(xì)胞產(chǎn)生或功能的失調(diào)。術(shù)語“抑制”包括降低、限制或阻斷例如特定的作用、功能或相互作用。在一些實施方式中，若免疫失調(diào)的至少一種癥狀被緩解、終止、延緩或預(yù)防，則所述免疫失調(diào)“被抑制”。如本文所用的，若免疫失調(diào)的復(fù)發(fā)或擴(kuò)散被減少、減緩、延遲或預(yù)防，則所述免疫失調(diào)也“被抑制”。術(shù)語“相互作用”當(dāng)涉及兩個分子之間的相互作用時是指分子彼此之間的物理接觸(例如，結(jié)合)。通常，此相互作用的結(jié)果使得所述分子中的一個或全部兩個活化(其產(chǎn)生生物效應(yīng))?！胺蛛x的蛋白”是指當(dāng)分離自細(xì)胞或通過重組dna技術(shù)產(chǎn)生時，基本上不含其它蛋白、細(xì)胞物質(zhì)、分離介質(zhì)和培養(yǎng)基，或者當(dāng)化學(xué)合成時基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)品的蛋白?！胺蛛x的”或“純化的”蛋白或其生物活性部分基本上不含來自于抗體、多肽、肽或融合蛋白所來源的細(xì)胞或組織源的細(xì)胞物質(zhì)或其它污染蛋白，或者當(dāng)化學(xué)合成時基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)品。用語“基本上不含細(xì)胞物質(zhì)”包括生物標(biāo)志物多肽或其片段的制備物，其中將蛋白與其被分離或重組產(chǎn)生自細(xì)胞的細(xì)胞組分分離。在一個實施方式中，用語“基本上不含細(xì)胞物質(zhì)”包括生物標(biāo)志物蛋白或其片段的制備物，其具有少于約30％(以干重計)的非生物標(biāo)志物蛋白(本文也稱作“污染蛋白”)，更優(yōu)選少于約20％的非生物標(biāo)志物蛋白，又更優(yōu)選少于約10％的非生物標(biāo)志物蛋白，且最優(yōu)選少于約5％的非生物標(biāo)志物蛋白。當(dāng)重組產(chǎn)生抗體、多肽、肽或融合蛋白或其片段(例如，其生物活性片段)時，還優(yōu)選基本上不含培養(yǎng)基，即，培養(yǎng)基占蛋白制品的體積少于約20％，更優(yōu)選少于約10％，且最優(yōu)選少于約5％?！霸噭┖小笔前辽僖环N試劑(例如，治療劑、探針、小分子等)的用于特異性檢測和/或治療性影響本發(fā)明標(biāo)記物的表達(dá)的任何產(chǎn)品(例如，包裝或容器)?？梢砸詥挝恍问酵茝V、分發(fā)或銷售試劑盒以進(jìn)行本發(fā)明的方法。試劑盒可包含一種或多種表達(dá)用于本發(fā)明方法的組合物所需的試劑。在某些實施方式中，試劑盒可進(jìn)一步包含參照標(biāo)準(zhǔn)物，例如編碼不會影響或調(diào)節(jié)控制免疫反應(yīng)、細(xì)胞生長、分裂、遷移、存活或凋亡的信號通路的蛋白的核酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員可預(yù)想很多此類對照蛋白，包括但不限于，常見分子標(biāo)記(例如，綠色熒光蛋白和β-半乳糖苷酶)、經(jīng)過geneontology參考未被分類在任何包含細(xì)胞生長、分裂、遷移、存活或凋亡的通路的蛋白、或普遍存在的管家蛋白。試劑盒中的試劑可在單獨容器中提供或以在單一容器中兩種或多種試劑的混合物的形式提供。此外，可包含描述如何使用試劑盒內(nèi)組分的指導(dǎo)材料。生物標(biāo)志物的“正常”表達(dá)水平是受試者(例如，未罹患免疫失調(diào)的人類患者)的細(xì)胞中生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。生物標(biāo)志物的“過表達(dá)”或“顯著較高的表達(dá)水平”是指測試樣本中表達(dá)水平大于用于評估表達(dá)的試驗的標(biāo)準(zhǔn)誤差，且優(yōu)選地比對照樣本(例如，來自不患有生物標(biāo)志物相關(guān)疾病的健康受試者的樣本)中生物標(biāo)志物的表達(dá)活性或水平，且優(yōu)選地比若干對照樣本中生物標(biāo)志物的平均表達(dá)水平高至少10％，且更優(yōu)選高1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20倍或更多。生物標(biāo)志物的“顯著較低的表達(dá)水平”是指測試樣本中表達(dá)水平比對照樣本(例如，來自不患有生物標(biāo)志物相關(guān)疾病的健康受試者的樣本)中生物標(biāo)志物的表達(dá)活性或水平，且優(yōu)選地比若干對照樣本中生物標(biāo)志物的平均表達(dá)水平低至少10％，且更優(yōu)選低1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20倍或更多。該“顯著”水平還可應(yīng)用于本文所述的任意其它測量參數(shù)，例如用于表達(dá)、抑制、細(xì)胞毒性、細(xì)胞生長等的那些。術(shù)語“預(yù)測性”包括生物標(biāo)志物用于確定免疫失調(diào)對抗免疫失調(diào)療法(例如，多次-可變劑量il-2療法單獨使用或與一種或多種其它抗免疫失調(diào)療法組合)產(chǎn)生響應(yīng)的可能性的用途。此種生物標(biāo)志物的預(yù)測性用途可通過例如以下證實：(1)增加或減少的拷貝數(shù)(例如，通過fish、fish+sky、例如如在本領(lǐng)域至少j.biotechnol.，86:289-301中所描述的單分子測序、或qpcr)、生物標(biāo)志物核酸的過表達(dá)或弱表達(dá)(例如，通過ish、northern雜交或qpcr)、增加或減少的生物標(biāo)志物細(xì)胞或細(xì)胞比率(例如，通過細(xì)胞分選和/或計數(shù))、蛋白(例如，通過ihc)和/或生物標(biāo)志物靶標(biāo)、或增加或減少的活性，例如在超過約5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％，或更多的經(jīng)分析免疫失調(diào)樣本中；(2)經(jīng)調(diào)節(jié)后在生物樣本中生物標(biāo)志物絕對或相對的存在或缺失，生物樣本是例如來自受試者(例如，罹患免疫失調(diào)的人)的生物樣本例如包含組織、全血、血清、血漿、口腔拭子、唾液、腦脊液、尿液、糞便或骨髓的樣本；(3)經(jīng)調(diào)節(jié)后在免疫失調(diào)患者的臨床亞群(例如，那些響應(yīng)特定抗免疫失調(diào)療法(例如，多次-可變劑量il-2療法單獨使用或與一種或多種其它抗免疫失調(diào)療法組合)或那些對其產(chǎn)生抗性的)中生物標(biāo)志物絕對或相對的存在或缺失。術(shù)語“防止(prevent)”、“防治(preventing)”、“預(yù)防(prevention)”、“預(yù)防性治療”等是指在受試者中減少疾病、失調(diào)或病況發(fā)展的可能性，所述受試者不患有所述疾病、失調(diào)或病況，但有發(fā)展所述疾病、失調(diào)或病況的風(fēng)險或?qū)ζ湟赘?。術(shù)語“探針”是指能夠選擇性結(jié)合特別預(yù)定的靶分子的任何分子，特別預(yù)定的靶分子是例如由生物標(biāo)志物核酸編碼或與之對應(yīng)的核苷酸轉(zhuǎn)錄本或蛋白。探針可由本領(lǐng)域技術(shù)人員合成，或來源于適當(dāng)?shù)纳镏破?。如本文所述，為了檢測靶分子的目的，可將探針特別設(shè)計為經(jīng)標(biāo)記的?？捎米魈结樀姆肿訉嵗ǖ幌抻趓na、dna、蛋白、抗體和有機(jī)分子。術(shù)語“預(yù)后”包括預(yù)測免疫失調(diào)可能的進(jìn)程和結(jié)果或者從疾病中恢復(fù)的可能性。在一些實施方式中，使用統(tǒng)計算法提供對個體中免疫失調(diào)的預(yù)后。例如，預(yù)后可為外科手術(shù)、免疫失調(diào)的臨床亞型(例如，gvhd亞型如慢性gvhd)的發(fā)展、一種或多種臨床因子的發(fā)展、或從疾病中恢復(fù)。術(shù)語“響應(yīng)抗免疫失調(diào)療法(例如，多次-可變劑量il-2療法單獨使用或其一種或多種其它抗免疫失調(diào)療法組合)”涉及免疫失調(diào)(例如，gvhd)對抗免疫失調(diào)療法(例如，多次-可變劑量il-2療法單獨使用或其一種或多種其它抗免疫失調(diào)療法組合)的任何響應(yīng)?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域公知的方法評估抗免疫失調(diào)響應(yīng)，包括實施例中描述的那些標(biāo)準(zhǔn)?？梢砸远糠绞饺绨俜?jǐn)?shù)改變或以定性方式如“病理完全緩解”(pcr)、“臨床完全緩解”(ccr)、“臨床部分緩解”(cpr)、“臨床病情穩(wěn)定”(csd)、“臨床進(jìn)行性疾病”(cpd)或其它定性標(biāo)準(zhǔn)來記錄響應(yīng)。響應(yīng)的評估可在開始新輔助(“neoadjuvant”)或輔助療法開始后的早期進(jìn)行，例如數(shù)小時、數(shù)天、數(shù)周后或者優(yōu)選數(shù)月后。在一些實施方式中，可通過測量臨床受益率(cbr)來確定本文所述的治療處理的臨床療效。臨床受益率的測定是通過在治療結(jié)束后起至少6個月的時間點測定完全緩解(cr)的患者百分?jǐn)?shù)、部分緩解(pr)的患者數(shù)目和具有穩(wěn)定病情(sd)的患者數(shù)目的總和。該公式的簡寫為cbr＝超過6個月的cr+pr+sd。在一些實施方式中，特定抗免疫失調(diào)治療方案的cbr為至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或更多。用于評估響應(yīng)抗免疫失調(diào)療法的附加標(biāo)準(zhǔn)涉及“生存期”，其包括以下所有：至死亡的生存期，又稱總體生存期(其中所述死亡可為不論原因的或腫瘤相關(guān)的)；“無復(fù)發(fā)生存期”(其中術(shù)語復(fù)發(fā)應(yīng)包括局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)端復(fù)發(fā)二者)；無疾病生存期(其中術(shù)語疾病應(yīng)包括免疫失調(diào)和與之相關(guān)的疾病)。所述生存期的長度可通過參考經(jīng)定義的起始點(例如，診斷或開始治療的時間)和終末點(例如，死亡或復(fù)發(fā))來計算。此外，治療功效的標(biāo)準(zhǔn)可擴(kuò)展至包括給定時期內(nèi)的生存期可能性、復(fù)發(fā)可能性等。例如，為了確定適當(dāng)?shù)拈撝?，可將特定治療方案給予一群受試者并可將結(jié)果與在給予任何治療之前確定的生物標(biāo)志物測量值相關(guān)聯(lián)。結(jié)果測量值可為對根據(jù)新輔助設(shè)定(neoadjuvantsetting)所給予的治療的病理反應(yīng)。或者，可通過對已知生物標(biāo)志物測量值的接受治療后的受試者進(jìn)行一段時間的監(jiān)測獲得結(jié)果測量值，例如總體生存期和無病生存期。監(jiān)測受試者的時段可不同。例如，可監(jiān)測受試者至少0.25、0.5、0.75，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、55或60個月。可使用本領(lǐng)域公知的方法，例如實施例部分中所述的那些，來確定與抗免疫失調(diào)療法結(jié)果相關(guān)聯(lián)的生物標(biāo)志物的測量閾值。該術(shù)語還可涉及改善的預(yù)后，例如如通過以下所反映的：增加的復(fù)發(fā)時間，其為首次復(fù)發(fā)的周期，不包括作為首次事件的第二獨立免疫失調(diào)或者無復(fù)發(fā)證據(jù)的死亡；或增加的總存活期，所述總存活期為從治療至任何原因?qū)е碌乃劳龅臅r期。反應(yīng)或具有反應(yīng)是指當(dāng)暴露于刺激時獲得了有益的終點?；蛘弋?dāng)暴露于刺激時消極或有害癥狀被最小化、緩和或減弱。將會理解的是，對腫瘤或受試者將呈現(xiàn)有利反應(yīng)的可能性的評估等同于對所述腫瘤或受試者將不呈現(xiàn)有利反應(yīng)(即，將呈現(xiàn)缺乏反應(yīng)或為無反應(yīng)的)的可能性的評估。如本文所用的“rna干擾劑”被定義為通過rna干擾(rnai)干擾或抑制目標(biāo)生物標(biāo)志物基因表達(dá)的任何試劑。此類rna干擾劑包括但不限于，包括與本發(fā)明的目標(biāo)生物標(biāo)志物基因同源的rna分子在內(nèi)的核酸分子或其片段、短干擾rna(sirna)、以及通過rna干擾(rnai)干擾或抑制目標(biāo)生物標(biāo)志物核酸表達(dá)的小分子?！皉na干擾(rnai)”是一種進(jìn)化保守的過程，憑借表達(dá)或引入與目標(biāo)生物標(biāo)志物核酸相同或高度相似的rna序列導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄自目標(biāo)基因的信使rna(mrna)的序列特異性降解或特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默(ptgs)(參見coburn，g.和cullen，b.(2002)j.ofvirology76(18):9225)，從而抑制目標(biāo)生物標(biāo)志物核酸的表達(dá)。在一個實施方式中，該rna是雙鏈rna(dsrna)。已在植物、無脊椎動物和哺乳動物細(xì)胞中描述了該過程。在自然界，rnai由dsrna特異性核酸內(nèi)切酶dicer所啟動，其促進(jìn)將長dsrna切割為稱作sirna的雙鏈片段。sirna并入識別和切割目標(biāo)mrna的蛋白復(fù)合物。rnai的啟動還可通過引入核酸分子例如合成sirna、shrna或其它rna干擾劑，以抑制或沉默目標(biāo)生物標(biāo)志物核酸的表達(dá)。如本文所用的，“抑制目標(biāo)生物標(biāo)志物核酸表達(dá)”或“抑制標(biāo)記物基因表達(dá)”包括目標(biāo)生物標(biāo)志物核酸或由目標(biāo)生物標(biāo)志物核酸編碼的蛋白的表達(dá)或蛋白活性或水平的任何降低。相比于尚未被rna干擾劑所靶向的目標(biāo)生物標(biāo)志物核酸的表達(dá)或者由目標(biāo)生物標(biāo)志物核酸編碼的蛋白的活性或水平，所述降低可為至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或更多。用于檢測或確定至少一種生物標(biāo)志物的存在或水平的術(shù)語“樣本”通常是全血、血漿、血清、唾液、尿液、糞便(例如，糞)、淚液和任意其他體液(例如，如上文在“體液”的定義項下所描述的)，或者組織樣本(例如，活檢組織)如小腸、結(jié)腸樣本，或手術(shù)切除組織。在某些情況下，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括在樣本中檢測或確定至少一種標(biāo)記的存在或水平之前從個體獲得所述樣本。在一些實施方式中，根據(jù)本發(fā)明，包含t淋巴細(xì)胞或其亞群的任何樣本都是有用的。術(shù)語“協(xié)同效應(yīng)”是指兩種或多種抗免疫失調(diào)試劑或療法的組合效應(yīng)可大于單獨的每種此類試劑或療法的各自效應(yīng)的總和。術(shù)語“受試者”是指任何動物、哺乳動物或人，或者罹患免疫失調(diào)的任何動物、哺乳動物或人。術(shù)語“受試者”與“患者”可互換。術(shù)語“生存期”包括以下所有：至死亡的生存期，又稱總體生存(其中所述死亡可為不論原因的或腫瘤相關(guān)的)；“無復(fù)發(fā)生存期”(其中術(shù)語復(fù)發(fā)包括局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)端復(fù)發(fā)二者)；無疾病生存期(其中術(shù)語疾病應(yīng)包括免疫失調(diào)和與之相關(guān)的疾病)。所述生存期的長度可通過參考經(jīng)定義的起始點(例如，診斷或開始治療的時間)和終末點(例如，死亡、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移)來計算。此外，治療功效的標(biāo)準(zhǔn)可擴(kuò)展至包括給定時期內(nèi)的治療響應(yīng)、生存可能性、復(fù)發(fā)可能性等。術(shù)語“治療效應(yīng)”是指在動物特別是哺乳動物，且更特別是人中由藥理學(xué)活性物質(zhì)所引起的局部或全身效應(yīng)。因此，該術(shù)語表示在動物或人中旨在用于診斷、治愈、減輕、治療或預(yù)防疾病或者增強(qiáng)期望的身體或心理發(fā)展和狀況的任何物質(zhì)。短語“治療有效量”是指療法或物質(zhì)的量，其以適用于任何治療的合理收益/風(fēng)險比產(chǎn)生一些期望的局部或全身效應(yīng)。在某些實施方式中，化合物的治療有效量將取決于其治療指數(shù)、溶解度等。例如，通過本發(fā)明方法發(fā)現(xiàn)的某些化合物可以以足以產(chǎn)生適用于此治療的合理的收益/風(fēng)險比的劑量給予。“轉(zhuǎn)錄多核苷酸”或“核苷酸轉(zhuǎn)錄物”是與成熟mrna的全部或部分互補(bǔ)或同源的多核苷酸(例如，mrna、hnrna、cdna，或此rna或cdna的類似物)，其通過轉(zhuǎn)錄生物標(biāo)志物核酸并正常進(jìn)行rna轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄后處理(例如，剪接)(若有的話)，以及逆轉(zhuǎn)錄rna轉(zhuǎn)錄本而制得。i.tregs、tcons、tregs/tcons比率調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(tregs)是自然存在的cd4+cd25+foxp3+t淋巴細(xì)胞，其包含～5-10％的循環(huán)cd4+t細(xì)胞群體，用于主要抑制自體反應(yīng)性淋巴細(xì)胞，以及控制先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)(piccirillo和shevach(2004)semin.immunol.16:81-88；fehervari和sakaguchi(2004)curr.opin.immunol.16:203-208；azuma等人，(2003)cancerres.63:4516-4520；cederbom等人，(2000)eur.j.immunol.30:1538-1543；maloy等人，(2003)j.exp.med.197:111-119；serra等人，(2003)immunity19:877-889；thornton和shevach(1998)j.exp.med.188:287-296；janssens等人，(2003)j.immunol.171:4604-4612；gasteiger等人，(2013)j.exp.med.210:1167-1178；sitrin等人，(2013)j.exp.med.210:1153-1165)。tregs至少部分是通過抑制常規(guī)t細(xì)胞(tcons)的增殖、擴(kuò)張和效應(yīng)活性來實現(xiàn)該抑制的。它們還通過抑制t細(xì)胞幫助和活化的細(xì)胞-細(xì)胞接觸，或通過釋放免疫抑制性細(xì)胞因子(例如，il-10或tgf-β)，來抑制效應(yīng)t細(xì)胞破壞其(自-)靶標(biāo)。treg細(xì)胞的損耗顯示出增強(qiáng)il-2誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫(imai等人，(2007)cancersci.98:416-23)。tcons是常規(guī)t細(xì)胞，又稱tconv，其具有效應(yīng)功能(例如，細(xì)胞因子分泌、細(xì)胞毒活性等)，其憑借表達(dá)一種或多種t細(xì)胞受體而增加免疫應(yīng)答。tcons被定義為不是treg的任何t細(xì)胞群體，且包括例如，初始t細(xì)胞、活化t細(xì)胞、記憶t細(xì)胞、靜息tcons、或具有分化趨向的tcons(例如，th1或th2系)?！俺跏紅cons”是已在骨髓中分化的cd4+t細(xì)胞，并成功經(jīng)歷了胸腺中中樞選擇的陰性和陽性選擇過程，但尚未通過暴露于抗原而被活化。初始tcons的通常特征在于表面表達(dá)l-選擇素(cd62l)，不存在活化標(biāo)志物(例如，cd25、cd44或cd69)，并且不存在記憶標(biāo)志物(例如，cd45ro)。因此，據(jù)信初始tcons是靜息且不分裂的，其需要白細(xì)胞介素-7(il-7)和白細(xì)胞介素-15(il-15)來實現(xiàn)體內(nèi)平衡存活(參見至少wo2010/101870)。此類細(xì)胞的存在和活性在抑制免疫反應(yīng)的背景下是不希望的。不同于tregs，tcons不是無能的(anergic)，并且其可響應(yīng)于基于抗原的t細(xì)胞受體活化而增殖(lechler等人，(2001)philos.trans.r.soc.lond.biol.sci.356:625-637)。因此，增加的tregs數(shù)目、增加的treg活性、和/或減少的treg細(xì)胞死亡(例如，凋亡)對于抑制與一系列免疫失調(diào)(例如，cgvhd)相關(guān)的不想要的免疫反應(yīng)而言是有用的。例如，在小鼠模型中將cd4+cd25+tregs和cd25-效應(yīng)t細(xì)胞的1:1混合物加至供體骨髓干細(xì)胞抑制了同種免疫活化和gvhd，而未增加移植后的惡性腫瘤復(fù)發(fā)(edinger等人，(2003)nat.med.9:1144-1150)。在人類中，在hsct接受者中重建受損的treg會伴有cgvhd的活化(zorn等人，(2005)blood106:2903-2911)。在具有活化cgvhd的參與者中，據(jù)信受損的tregs重建、低端粒酶水平和縮短的端粒促成了tregs存活的減少(zorn等人，(2005)blood106:2903-2911；matsuoka等人，(2010)j.clin.invest.120:1479-1493；kawano等人，(2011)blood118:5021-5030)。據(jù)信il-2在tregs體內(nèi)平衡和功能中的作用導(dǎo)致了其作為抗免疫失調(diào)療法的有限的功效，并部分解釋了如下發(fā)現(xiàn)：體內(nèi)給予il-2加上同基因t細(xì)胞耗盡的供體骨髓在mhc-錯配的小鼠異體干細(xì)胞移植(allo-sct)后預(yù)防gvhd而未影響移植物抗白血病(gvl)反應(yīng)(sykes等人(1990)proc.natl.acad.sci.u.s.a.87:5633-5647；sykes等人，(1990)j.exp.med.171:645-658)。在小鼠異體hsct模型中，共輸注離體擴(kuò)增的treg和il-2也導(dǎo)致了gvhd的抑制，以及改善的免疫重建和維持的gvl反應(yīng)(taylor等人(2002)blood99:3493-3499；trenado等人(2003)j.clin.invest.112:1688-1696)。此外，tregs在炎癥抑制中也是重要的。在持續(xù)炎癥的背景下，治療優(yōu)先增強(qiáng)tregs而不活化常規(guī)t細(xì)胞(tcons)或其它可能惡化gvhd的效應(yīng)細(xì)胞是至關(guān)重要的。tregs在體內(nèi)的有效增強(qiáng)還與其它受損的外周耐受的失調(diào)(例如，自身免疫疾病如sle、t1d、ms、銀屑病、ra、ibd、血管炎)直接相關(guān)，其中treg功能失調(diào)被越來越多地被認(rèn)為牽涉其中(grinberg-bleyer等人，(2010)j.exp.med.207:1871-1878；buckner(2010)nat.rev.immunol.10:849-859；humrich等人，(2010)proc.natl.acad.sci.u.s.a.107:204-209；carbone等人，(2014)nat.med.20:69-74)。ii.白細(xì)胞介素-2(il-2)術(shù)語“白細(xì)胞介素-2(il-2)”或“t細(xì)胞生長因子(tcgf)”是指在淋巴細(xì)胞產(chǎn)生、存活和體內(nèi)平衡中發(fā)揮核心作用的一種15.5kda球狀糖蛋白。該術(shù)語包括具有免疫抑制作用(例如，通過增加tregs、增加tregs：tcons比率、增加treg增殖、增加treg功能等)的任何純化或重組il-2分子，包括但不限于，經(jīng)修飾天然il-2分子、截短的il-2分子、變體il-2分子和共價修飾的il-2分子(例如，糖基化或融合蛋白形式)。il-2由四條反向平行、兩親性α-螺旋構(gòu)成，它們形成對于其功能而言重要的四元結(jié)構(gòu)(smith(1988)science240:1169-1176；bazan(1992)science257:410-413)。人il-2的核酸和多肽序列是本領(lǐng)域中公知的。例如，由美國國家生物技術(shù)信息中心維護(hù)的genbank數(shù)據(jù)庫上可獲得的nm_000586.3的cdna序列編碼前體il-2蛋白(np_000577.2)，其中殘基1-20代表信號肽而其余殘基代表成熟的細(xì)胞因子。在一些實施方式中，可將最初的20、21、22或更多個氨基酸作為信號肽移除以產(chǎn)生成熟的細(xì)胞因子。除人以外的物種中il-2直系同源的核酸和前多肽序列也是公知的，并且包括例如，黑猩猩il-2(xm_517425.3和xp_517425.1)、猴il-2(nm_001047130.1和np_001040595.1)、狗il-2(nm_001003305.1和np_001003305.1)、小鼠il-2(nm_008366.3和np_032392.1)和大鼠il-2(nm_053836.1和np_446288.1)。各前多肽的殘基1-20代表信號肽而其余殘基代表成熟的細(xì)胞因子。il-2直系同源的代表性序列在下表1中呈現(xiàn)。值得注意的是，該術(shù)語可進(jìn)一步用于表示本文中所描述的關(guān)于il-2分子的特征的任意組合。例如，可使用序列組成、百分?jǐn)?shù)一致性、序列長度、域結(jié)構(gòu)、功能活性等的任意組合來描述本發(fā)明的il-2分子。又在其它實施方式中，術(shù)語“il-2”包括脫丙氨酰-1(des-alanyl-1)、絲氨酸-125人il-2((阿地白介素)；novartis公司&prometheuslaboratories公司)和/或酵母中產(chǎn)生的重組人il-2阿地白介素以包含22miu阿地白介素的一次性藥瓶中的無菌、白色至灰白色凍干餅的形式提供。對于22百萬國際單位(miu)藥瓶，當(dāng)用1.2ml無菌注射用水(swfi)重構(gòu)時，每ml包含18miu(1.1mg)il-2、50mg甘露醇和～180mcg十二烷基硫酸鈉，用～170mcg磷酸二氫鈉和890mcg磷酸氫二鈉緩沖至ph7.5(范圍：7.2-7.8)。相比于天然il-2，重組il-2是非糖基化的且在兩個氨基酸位點處不同。il-2的天然和重組形式之間不具有可辨別的功能差異。示例性il-2變體、重組il-2、產(chǎn)生il-2的方法，純化il-2的方法、配制方法等是本領(lǐng)域中公知的且可見于例如至少在美國專利號4,530,787、4,569,790、4,572,798、4,604,377、4,748,234、4,853,332、4,959,314、5,464,939、re33,653、5,229,109、7,514,073和7,569,215中，其各自在此通過引用整體并入本文以用于所有目的。例如，考慮到了生物標(biāo)志物的核酸分子，其由于遺傳密碼的簡并性而不同于編碼對應(yīng)于生物標(biāo)志物的蛋白的核酸分子的核苷酸序列。如通過遺傳密碼(下示)所定義的，在特定蛋白的氨基酸序列和能夠編碼該蛋白的核苷酸序列之間存在已知且明確的對應(yīng)關(guān)系。同樣地，如通過遺傳密碼所定義的，在特定核酸的核苷酸序列和由該核酸編碼的氨基酸序列之間存在已知且明確的對應(yīng)關(guān)系。遺傳密碼遺傳密碼的一個重要且公知的特性是其具有簡并性，因此對于用于制備蛋白的大部分氨基酸而言，可以使用一個以上的編碼核苷酸三聯(lián)體(如上所示)。因此，多個不同的核苷酸序列可編碼一個給定的氨基酸序列。認(rèn)為此類核苷酸序列是功能上的等效物，因為其導(dǎo)致在所有生物體內(nèi)產(chǎn)生了相同的氨基酸序列(盡管某些生物體可以相比于其他的序列更有效率地翻譯一些序列)。此外，有時，在給定的核苷酸序列中可以存在嘌呤或嘧啶的甲基化變體。此類甲基化不會影響三核苷酸密碼子與相應(yīng)氨基酸之間的編碼關(guān)系?？紤]到前述內(nèi)容，可以使用編碼生物標(biāo)志物核酸(或其任意部分)的dna或rna的核苷酸序列來獲得多肽氨基酸序列，其使用遺傳密碼將dna或rna翻譯成氨基酸序列。同樣地，對于多肽氨基酸序列而言，可以從遺傳密碼推斷出能夠編碼多肽的相應(yīng)核苷酸序列(由于其冗余性，針對任意給定的氨基酸序列將產(chǎn)生多種核酸序列)。因此，應(yīng)將本文對編碼多肽的核苷酸序列的描述和/或披露考慮為還包括對由所述核苷酸序列編碼的氨基酸序列的描述和/或披露。類似地，應(yīng)將對本文中多肽氨基酸序列的描述和/或披露考慮為還包括對能夠編碼所述氨基酸序列的所有可能的核苷酸序列的描述和/或披露。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，種群(例如，人類種群)內(nèi)可存在導(dǎo)致氨基酸序列改變的dna序列多態(tài)性。此遺傳多態(tài)性可因天然等位基因變異而在種群內(nèi)的個體間存在。等位基因是在給定的基因位置交替出現(xiàn)的一組基因。此外，將會理解的是，影響rna表達(dá)水平的dna多態(tài)性也可存在，其可影響該基因的總體表達(dá)水平(例如，通過影響調(diào)節(jié)或降解)。本文中與“等位基因變體”可互換使用的術(shù)語“等位基因”是指基因或其部分的替代形式。等位基因占據(jù)同源染色體的相同位點或位置。當(dāng)受試者具有兩個相同的等位基因時，則稱受試者對于該基因或等位基因是純合的。當(dāng)受試者具有兩個不同的等位基因時，則稱受試者對于該基因或等位基因是雜合的。例如，生物標(biāo)志物的等位基因可在單一核苷酸或幾個核苷酸中彼此不同，并可包括核苷酸的取代、插入和缺失。一個基因的等位基因還可為包含一個或多個突變的基因形式。本文中可互換使用的術(shù)語“基因多態(tài)性區(qū)域的等位基因變體”或“等位基因變體”是指在種群該基因區(qū)域中發(fā)現(xiàn)的具有幾種可能的核苷酸序列中的一種基因的替代形式。如本文所用的，等位基因變體旨在包括功能性等位基因變體、非功能性等位基因變體、snp、突變和多態(tài)性。術(shù)語“單核苷酸多態(tài)性”(snp)是指由單核苷酸占據(jù)的多態(tài)性位點，其為等位基因序列之間的變異位點。所述位點通常前接和后接高度保守的等位基因序列(例如，再小于1/100或1/1000群體成員中變化的序列)。snp的出現(xiàn)通常是由于在多態(tài)性位點處將一個核苷酸替代為另一核苷酸。snp還可起因于相對于參考等位基因缺失一個核苷酸或插入一個核苷酸。通常，多態(tài)性位點是由不同于參考堿基的堿基所占據(jù)。例如，參考等位基因在多態(tài)性位點處包含堿基“t”(胸苷)的情況下，改變的等位基因在多態(tài)性位點處可包含“c”(胞苷)、“g”(鳥嘌呤)或“a”(腺嘌呤)。snp可出現(xiàn)在編碼蛋白的核酸序列中，在該情況下它們可能導(dǎo)致缺陷性或其它變體蛋白，或遺傳疾病。此snp可能改變基因的編碼序列并因此指定另一氨基酸(“錯義”snp)或snp可能引入終止密碼子(“無義”snp)。當(dāng)snp未改變蛋白的氨基酸序列時，該snp稱為“沉默的”。snp還可出現(xiàn)在核苷酸序列的非編碼區(qū)中。這可能導(dǎo)致缺陷性蛋白表達(dá)(例如，替代剪切的結(jié)果)，或者其可能對蛋白的功能沒有影響。如本文所用的，術(shù)語“基因”和“重組基因”是指包含開放閱讀框的核酸分子，所述開放閱讀框編碼對應(yīng)于本發(fā)明標(biāo)記的多肽。此自然等位基因變異會通常導(dǎo)致給定基因核苷酸序列的1-5％的變異?？赏ㄟ^在多個不同個體中測序感興趣的基因來識別替代等位基因。這可很容易地通過使用雜交探針以在多個個體中識別相同的基因位置來進(jìn)行。任意和所有此類核苷酸變異和產(chǎn)生的氨基酸多態(tài)性或者由天然等位基因變異所導(dǎo)致的以及不改變功能活性的變異均意欲落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。在另一實施方式中，生物標(biāo)志物核酸分子的長度至少為7、15、20、25、30、40、60、80、100、150、200、250、300、350、400、450、550、650、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2200、2400、2600、2800、3000、3500、4000、4500或更多個核苷酸，并在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與對應(yīng)于本發(fā)明標(biāo)志物的核酸分子或者編碼對應(yīng)于本發(fā)明標(biāo)志物的蛋白的核酸分子雜交。如本文所用的術(shù)語“在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交”旨在描述雜交和洗滌條件，在該條件下彼此具有至少60％(65％、70％、75％、80％，優(yōu)選85％)一致性的核苷酸序列彼此之間通常保持雜交。此類嚴(yán)謹(jǐn)條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且能夠在currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，n.y.(1989)的6.3.1-6.3.6節(jié)中找到。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的優(yōu)選、非限制性實例是在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(ssc)中在約45℃下雜交，隨后在0.2xssc、0.1％sds中，在50-65℃下洗滌一次或多次。除了可在種群中存在的本發(fā)明核酸分子的天然產(chǎn)生的等位變體以外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將進(jìn)一步意識到可通過突變引入序列改變，從而導(dǎo)致被編碼蛋白的氨基酸序列的改變，但不因此改變編碼蛋白的生物活性。例如，可以進(jìn)行導(dǎo)致在“非必需”氨基酸殘基處的氨基酸取代的核苷酸取代?！胺潜匦琛卑被釟埢强蓮囊吧托蛄懈淖?、但不改變生物活性的殘基，而“必需”氨基酸殘基是生物活性所需要的。例如，在各種物種的同源物間非保守或僅半保守的氨基酸殘基可能是活性所非必需的，并且因此將可能是改變的靶標(biāo)?；蛘?，各種物種(例如，鼠類和人類)的同源物間保守的氨基酸殘基可能是活性所必需的，并且因此將不大可能是改變的靶標(biāo)。因此，本發(fā)明的另一方面涉及編碼本發(fā)明的多肽的核酸分子，所述多肽含有不是活性所必需的氨基酸殘基的改變。此類多肽的氨基酸序列與對應(yīng)于本發(fā)明標(biāo)記的天然產(chǎn)生蛋白不同，但仍保持生物活性。在一個實施方式中，生物標(biāo)志物蛋白具有與本文所述的生物標(biāo)志物蛋白的氨基酸序列至少約40％一致性，50％、60％、70％、75％、80％、83％、85％、87.5％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或相同的氨基酸序列?？赏ㄟ^將一個或多個核苷酸取代、插入或缺失引入本發(fā)明核酸的核苷酸序列生成編碼變體蛋白的分離的核酸分子，從而將一個或多個氨基酸取代、插入或缺失引入所編碼的蛋白中。可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如定點誘變和pcr介導(dǎo)的誘變引入突變。優(yōu)選地，在一個或多個預(yù)測的非必需氨基酸殘基處進(jìn)行保守性氨基酸取代?！氨Ｊ匦园被崛〈笔前被釟埢痪哂邢嗨苽?cè)鏈的氨基酸殘基取代的取代。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族已在現(xiàn)有技術(shù)中定義。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨基酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β支鏈側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。或者，可以沿著全部或部分編碼序列隨機(jī)引入突變，如通過飽和突變，并且可以對所得到的突變體的生物活性進(jìn)行篩選以鑒定仍保留活性的突變。誘變后，可以重組表達(dá)所編碼的蛋白并且可以確定所述蛋白的活性。本發(fā)明的另一方面涉及生物標(biāo)志物蛋白及其生物活性部分的應(yīng)用。在一個實施方式中，可通過使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白純化技術(shù)的適當(dāng)純化方案從細(xì)胞或組織來源分離對應(yīng)于標(biāo)記的天然多肽。在另一實施方式中，通過重組dna技術(shù)產(chǎn)生對應(yīng)于本發(fā)明標(biāo)記的多肽。替代重組表達(dá)，可使用標(biāo)準(zhǔn)肽合成技術(shù)化學(xué)合成對應(yīng)于本發(fā)明標(biāo)記的多肽。生物標(biāo)志物多肽的生物活性部分包括含有足夠一致于或來源于本文所述的生物標(biāo)志物蛋白氨基酸序列的氨基酸序列的多肽，但其包含少于全長蛋白的氨基酸，且呈現(xiàn)出相應(yīng)全長蛋白的至少一種活性。通常，生物活性部分包含具有相應(yīng)蛋白的至少一種活性的結(jié)構(gòu)域或基序。本發(fā)明的蛋白的生物活性部分可為多肽，其長度為例如50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130或更多個氨基酸。此外，可通過重組技術(shù)制備其它生物活性部分(其中蛋白的其它區(qū)域被刪除)，并評估其是否具有本發(fā)明多肽的天然形式的一種或多種功能活性。優(yōu)選的多肽具有由本文所述的核酸分子編碼的生物標(biāo)志物蛋白的氨基酸序列。其它有用的蛋白與這些序列中的一種基本上一致(例如，至少約40％，優(yōu)選50％，60％，70％，75％，80％，83％，85％，88％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％)并保持相應(yīng)的天然產(chǎn)生蛋白的蛋白功能活性，但由于天然等位變異或誘變而具有不同的氨基酸序列。為確定兩個氨基酸序列或兩個核酸的一致性百分率，依據(jù)最佳比較目的對序列進(jìn)行比對(例如，可以在第一氨基酸或核酸序列的序列中引入缺口用于與第二氨基酸或核酸序列進(jìn)行最佳比對)。然后比較相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝恍蛄兄械哪骋晃恢帽慌c第二序列中相應(yīng)位置相同的氨基酸殘基或核苷酸所占據(jù)時，則所述分子在該位置是相同的。兩條序列之間的一致性百分率是所述序列共有的相同位點的數(shù)量的函數(shù)(即，％一致性＝相同位點的#/位點總#(例如，重疊位點)x100)。在一個實施方式中，兩條序列的長度相同。可使用數(shù)學(xué)算法完成兩個序列間一致性百分率的確定。用于比較兩個序列的數(shù)學(xué)算法的一個優(yōu)選的、非限制性實例是如karlin和altschul(1993)proc.natl.acad.sci.usa90:5873-5877中所改進(jìn)的karlin和altschul的算法(1990)proc.natl.acad.sci.usa87:2264-2268。此算法被整合入了altschul等人(1990)j.mol.biol.215:403-410的nblast和xblast程序中?？梢圆捎胣blast程序進(jìn)行blast核苷酸檢索，設(shè)置評分(score)＝100，字長(wordlength)＝12，以獲得與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以采用xblast程序進(jìn)行blast蛋白檢索，設(shè)置評分＝50，字長＝3，以獲得與本發(fā)明的蛋白分子同源的氨基酸序列。為獲得用于比較目的的具有缺口的比對，可以利用altschul等人，(1997)nucleicacidsres.25:3389-3402中描述的具有缺口的blast。或者，可使用psi-blast以進(jìn)行檢測分子間遠(yuǎn)近關(guān)系的迭代檢索。當(dāng)利用blast、具有缺口的blast和psi-blast程序時，可以使用各程序(例如xblast和nblast)的缺省參數(shù)。參見國家生物技術(shù)信息中心(ncbi)網(wǎng)站ncbi.nlm.nih.gov。用于序列比較的數(shù)學(xué)算法的另一優(yōu)選的、非限制性實例是myers和miller算法，(1988)computapplbiosci，4:11-7。此算法整合入了align程序(2.0版)中，其為gcg序列比對軟件包的一部分。當(dāng)將align程序用于比較氨基酸序列時，可使用pam120權(quán)重殘基表、缺口長度罰分為12和缺口罰分為4。用于識別局部序列相似性的區(qū)域和比對的另一有用算法是如pearson和lipman(1988)proc.natl.acad.sci.usa85:2444-2448中所述的fasta算法。當(dāng)將fasta算法用于比較核苷酸或氨基酸序列時，可使用例如pam120權(quán)重殘基表，k-tuple值為2。可使用與上述那些相似的技術(shù)(允許或不允許缺口)確定兩個序列之間的一致性百分率。在計算一致性百分率時，僅計數(shù)準(zhǔn)確匹配。本發(fā)明還提供了對應(yīng)于生物標(biāo)志物蛋白的嵌合或融合蛋白。如本文所用的，“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包含與異源性多肽(即，除對應(yīng)于標(biāo)記的多肽以外的多肽)可操作地連接的對應(yīng)于本發(fā)明標(biāo)記的多肽的全部或部分(優(yōu)選生物活性部分)。在融合蛋白中，術(shù)語“可操作地連接”旨在指本發(fā)明的多肽和異源性多肽彼此之間框內(nèi)融合。異源性多肽可融合至本發(fā)明的多肽的氨基末端或羧基末端。一種有用的融合蛋白是gst融合蛋白，其中對應(yīng)于本發(fā)明標(biāo)志物的多肽融合至gst序列的羧基末端。此類融合蛋白可以便于本發(fā)明的重組多肽的純化。在另一實施方式中，融合蛋白包含異源性信號序列、免疫球蛋白融合蛋白、毒素、或其它有用的蛋白序列?？梢酝ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)重組dna技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的嵌合和融合蛋白。在另一個實施方式中，可以通過包括自動dna合成儀的常規(guī)技術(shù)合成融合基因?；蛘?，可以通過錨定引物進(jìn)行基因片段的pcr擴(kuò)增，其在兩個連續(xù)的基因片段之間產(chǎn)生互補(bǔ)的懸臂，該互補(bǔ)的懸臂隨后可以被退火和重擴(kuò)增以產(chǎn)生嵌合基因序列(參見例如ausubel等人，見上)。此外，多種已經(jīng)編碼融合部分(例如gst多肽)的表達(dá)載體是市售的?？蓪⒕幋a本發(fā)明多肽的核酸克隆入此表達(dá)載體以使融合部分框內(nèi)連接至本發(fā)明的多肽。可使用信號序列以促進(jìn)分泌蛋白或其它目標(biāo)蛋白的分泌和分離。信號序列的典型特征在于疏水性氨基酸核心，其通常在分泌期間在一個或多個剪切事件中被從成熟蛋白切除。此類信號肽包含隨著成熟蛋白經(jīng)過分泌通路時允許從成熟蛋白處剪切去除信號序列的加工位點。因此，本發(fā)明涉及具有信號序列的多肽以及信號序列已被蛋白水解剪切的多肽(即，剪切產(chǎn)物)。在一個實施方式中，編碼信號序列的核酸序列可在表達(dá)載體中可操作地連接至目標(biāo)蛋白，例如通常不被分泌的蛋白或者原本難以分離的蛋白。信號序列指導(dǎo)蛋白，例如從轉(zhuǎn)染了表達(dá)載體的真核宿主處，的分泌，并且所述信號序列隨后或同時被剪切。然后可輕易地通過現(xiàn)有技術(shù)認(rèn)識到的方法從胞外基質(zhì)中純化蛋白?；蛘撸墒褂么龠M(jìn)純化的序列(例如，具有g(shù)st域的序列)將信號序列連接至目標(biāo)蛋白。本發(fā)明還涉及本文所述的生物標(biāo)志物多肽的變體。此類變體具有改變的氨基酸序列，其可用作激動劑(模擬的)或用作拮抗劑。變體的生成可通過誘變，例如離散點突變或截斷。激動劑可保留同蛋白天然存在形式基本上相同的生物活性或其子集。蛋白拮抗劑可通過例如競爭性結(jié)合至包含了目標(biāo)蛋白的細(xì)胞信號通路的下游或上游成員來抑制蛋白的天然存在形式的一種或多種活性。因此，通過采用具有有限功能的變體的治療可引起特定的生物效應(yīng)。相對于采用蛋白天然存在形式的治療，在受試者中采用具有蛋白天然存在形式的生物活性子集的變體治療受試者可具有較少的副作用。本發(fā)明的另一方面涉及引入了本發(fā)明的重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。術(shù)語“宿主細(xì)胞”和“重組的宿主細(xì)胞”在本文中可互換使用。應(yīng)當(dāng)理解的是，此類術(shù)語不僅指特定的細(xì)胞主體還指此細(xì)胞的后代或潛在后代。由于在后續(xù)傳代過程中因突變或環(huán)境的影響可能發(fā)生某些修飾，因而此后代實際上可能與其親代細(xì)胞并不相同，但是仍將其包括在如本文所用的術(shù)語的范圍內(nèi)。宿主細(xì)胞可為任何原核(例如，大腸桿菌)或真核細(xì)胞(例如，昆蟲細(xì)胞、酵母或哺乳動物細(xì)胞)?？梢酝ㄟ^常規(guī)的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)將載體dna引入原核或真核細(xì)胞中。如本文所用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”旨在指用于將外源性核酸引入宿主細(xì)胞的多種本領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、deae-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或電穿孔。用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的適當(dāng)方法可以見于sambrook等人(見上)，和其他實驗室手冊。就哺乳動物細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染而言，已知依賴于所使用的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)染技術(shù)，僅少數(shù)細(xì)胞可以將外源性dna整合至其基因組。為了識別和選擇這些整合體，通常將編碼選擇性標(biāo)記(例如，對抗生素具有抗性)的基因與感興趣的基因一起引入宿主細(xì)胞。優(yōu)選的選擇性標(biāo)記包括對藥物具有抗性的那些，例如g418、潮霉素和甲氨蝶呤?？梢酝ㄟ^藥物選擇識別具有所引入核酸的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(例如，已并入選擇性標(biāo)記基因的細(xì)胞將存活，而其他細(xì)胞死亡)。表1seqidno:1人il-2cdna序列seqidno:2人il-2氨基酸序列seqidno:3黑猩猩il-2cdna序列seqidno:4黑猩猩il-2氨基酸序列seqidno:5猴il-2cdna序列seqidno:6猴il-2氨基酸序列seqidno:7狗il-2cdna序列seqidno:8狗il-2氨基酸序列seqidno:9小鼠il-2cdna序列seqidno:10小鼠il-2氨基酸序列seqidno:11大鼠il-2cdna序列seqidno:12大鼠il-2氨基酸序列*表1中包含的是rna核酸分子(例如，用尿苷替換胸腺嘧啶)、編碼所編碼蛋白的直系同源的核酸分子、以及其全長中包含與表1中所列的任何seqidno的核酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多的同一性的核酸序列的dna或rna核酸序列，或其部分。此類核酸分子可具有如本文進(jìn)一步描述的全長核酸的功能。*表1中包含的是蛋白的直系同源物，以及其全長中包含與表1中所列的任何seqidno的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多的同一性的氨基酸序列的多肽分子，或其部分。此類多肽可具有如本文進(jìn)一步描述的全長多肽的功能。il-2通過結(jié)合il-2受體(il-2r)介導(dǎo)其作用，所述il-2受體由多達(dá)三個單獨的亞基構(gòu)成，其不同的聯(lián)合可產(chǎn)生與il-2親和力不同的受體形式。α(cd25)、β(cd122)和γ(γc，cd132)亞基的聯(lián)合得到針對il-2的三聚、高親和力受體。由β和γ亞基構(gòu)成的二聚il-2受體被稱為中度親和力il-2r。α亞基形成單體低親和力il-2受體。雖然二聚中度親和力il-2受體結(jié)合il-2的親和力比三聚高親和力受體低約100倍，但二聚和三聚il-2受體變體均能夠在結(jié)合il-2后傳輸信號(minami等人，(1993)annu.rev.immunol.11:245-268)。因此，α-亞基cd25對于il-2的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)不是必需的。其賦予與其受體的高親和力結(jié)合，而β亞基cd122和γ-亞基對于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是關(guān)鍵的(krieg等人，(2010)proc.natl.acad.sci.u.s.a.107:11906-11911)。包括cd25的三聚il-2受體由(靜息的)cd4+叉頭框p3(foxp3)+的調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(tregs)表達(dá)。它們還在常規(guī)活化t細(xì)胞上被瞬時誘導(dǎo)，然而在靜息狀態(tài)下這些細(xì)胞僅表達(dá)二聚il-2受體。在體內(nèi)tregs始終表達(dá)最高水平的cd25(fontenot等人，(2005)nat.immunol.6:1142-1151)。天然il-2首先于1976年作為t淋巴細(xì)胞的生長因子被識別。其由人命名集群(cd)4+和一些cd8+t細(xì)胞產(chǎn)生并主要由活化t細(xì)胞，特別是cd4+輔助t細(xì)胞合成。其刺激t細(xì)胞的增殖和分化、誘導(dǎo)細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(ctls)的生成以及外周血淋巴細(xì)胞到細(xì)胞毒性細(xì)胞和淋巴因子活化殺傷(lak)細(xì)胞的分化、促進(jìn)t細(xì)胞的細(xì)胞因子和溶細(xì)胞分子表達(dá)、促進(jìn)b細(xì)胞的增殖和分化以及b細(xì)胞的免疫球蛋白合成、并刺激自然殺傷(nk)細(xì)胞的生成、增殖和活化(參見例如，waldmann(2009)nat.rev.immunol.6:595-601；olejniczak和kasprzak(2008)med.sci.monit.14:ra179-189；malek(2008)annu.rev.immunol.26:453-479)。已知il-2在產(chǎn)生免疫應(yīng)答中發(fā)揮核心作用。在癌癥臨床試驗中，高劑量重組il-2(例如，高達(dá)14劑的600,000國際單位(iu)/kg/8小時的iv單次推注劑量)在轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌(rcc)和轉(zhuǎn)移性黑素瘤中顯示了抗腫瘤活性。因此，歐洲在1989年且美國在1992年批準(zhǔn)將此高劑量il-2用于治療轉(zhuǎn)移性rcc。在1998年，獲批用于治療轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者。當(dāng)前重組人il-2(阿地白介素)(公司&prometheuslabs公司)已獲美國食品藥品管理局(usfda)的批準(zhǔn)。然而，il-2在免疫反應(yīng)中具有雙重作用，因為其不但介導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞的擴(kuò)增和活性，還關(guān)鍵性涉及維持外周免疫耐受。外周自身耐受的主要機(jī)制是il-2誘導(dǎo)的t細(xì)胞中活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(aicd)。aicd是通過其完全活化的t細(xì)胞經(jīng)由與細(xì)胞表面表達(dá)的死亡受體例如，cd95(又稱fas)或tnf受體的接合而經(jīng)歷程序性細(xì)胞死亡的過程。當(dāng)在增殖期間，表達(dá)高親和力il-2受體(在預(yù)先暴露于il-2后)的抗原活化了的t細(xì)胞被抗原通過t細(xì)胞受體(tcr)/cd3復(fù)合物再刺激時，誘導(dǎo)了fas配體(fasl)和/或腫瘤壞死因子(tnf)的表達(dá)，造成細(xì)胞敏感于fas介導(dǎo)的凋亡。該過程是il-2依賴性的(lenardo(1991)nature353:858-861)并經(jīng)由stat5介導(dǎo)。通過t淋巴細(xì)胞中的aicd過程，不但可針對自身抗原建立耐受，還可針對明顯不是宿主組成部分的持久性抗原(例如，腫瘤抗原)建立耐受。此外，il-2還參與維持外周tregs(fontenot等人，(2005)nat.immunol.6:1142-1151；d'cruz和klein(2005)nat.immunol.6:1152-1159；maloy和powrie(2005)nat.immunol.6:1171-1172)。在體內(nèi)生理濃度下，il-2對于tregs發(fā)育、擴(kuò)增和存活是必需的(malek和bayer(2004)nat.rev.immunol.4:665-674；nelson(2004)j.immunol.172:3983-3988)。事實上，為了刺激免疫效應(yīng)細(xì)胞，hsct后早期給予低劑量il-2，而實際上相比通常表達(dá)低和中親和力受體的tcons，由于tregs上表達(dá)較高高親和力il-2受體α(cd25)而被優(yōu)先擴(kuò)增了(zorn等人，(2006)blood108:1571-1579)。在人類中，il-2調(diào)節(jié)tregs中的foxp3表達(dá)并誘導(dǎo)體內(nèi)treg擴(kuò)張(zorn等人，(2006)blood108:1571-1579)。具有類固醇頑固性cgvhd的患者通過優(yōu)先增加體內(nèi)功能性treg(例如，tregs計數(shù)增加>7倍而未影響cd4+tcons計數(shù)，tregs:tcons中位數(shù)比率自基線起增加>5倍(p<0.001))而響應(yīng)低劑量il-2，且～50％的可評估患者在包括皮膚、關(guān)節(jié)/筋膜/肌肉、肝臟和外周神經(jīng)的cgvhd累及部位按照nih標(biāo)準(zhǔn)具有客觀的部分緩解(pr)(koreth等人，(2011)n.engl.j.med.365:2055-2066；pavletic等人，(2006)biol.bloodmarrowtransplant.12:252-266)。例如，15名患者中具有pr或病情穩(wěn)定(sd)的和輕微響應(yīng)的12名，繼續(xù)接受延長的il-2治療，且12名接受長期il-2治療的患者中的10名在中位數(shù)13個月的隨訪中在平均60％糖皮質(zhì)激素減量(范圍，25-100％)期間具有持續(xù)的臨床響應(yīng)。tregs計數(shù)和tregs:tcons比率在8周時維持提高(二者對比基線均p<0.001)，然后在停止il-2后下降。此外，il-2增強(qiáng)表達(dá)高水平foxp3的tregs，并在功能上能夠抑制自體tcons。tregs免疫反應(yīng)在延長的il-2治療期間得到維持(koreth等人，(2011)n.engl.j.med.365:2055-2066)。血漿il-2水平在第1周時迅速上升，然后盡管繼續(xù)每日給予il-2，血漿il-2水平下降，而tregs計數(shù)上升(matsuoka等人，(2013)sci.transl.med.5:179ra43)。隨著treg的絕對數(shù)增加，且隨著il-2治療期間tregs上的cd25表達(dá)進(jìn)一步增加，il-2水平下降。treg體內(nèi)平衡大幅增強(qiáng)，在開始il-2治療的1周內(nèi)快速誘導(dǎo)treg增殖；胸腺treg新生增加在4-6周時達(dá)到峰值；且treg中細(xì)胞存活標(biāo)志物bcl-2從4周起上升，當(dāng)在8周停止il-2時逆轉(zhuǎn)(matsuoka等人，(2013)sci.transl.med.5:179ra43)。相比而言，其對于tcons體內(nèi)平衡的影響是有限的。免疫功能檢查顯示cgvhd的特征在于由提高的il-7和il-15水平導(dǎo)致的cd4tcons的組成性stat5活化，具有相對功能缺失的il-2和tregpstat5活化(matsuoka等人，(2013)sci.transl.med.5:179ra43)。低劑量il-2療法在開始il-2治療的1周內(nèi)優(yōu)先增強(qiáng)cgvhd患者中的tregstat5磷酸化。tregs:tconspstat5活化比率經(jīng)2周恢復(fù)至正常范圍，其在il-2療法持續(xù)期間得到維持。通過自發(fā)的和fas誘導(dǎo)的試驗評估的凋亡抵抗也在tregs中相比于在tcons中被優(yōu)先誘導(dǎo)。低劑量il-2可恢復(fù)有利于treg對tcon的穩(wěn)態(tài)平衡，并促進(jìn)免疫耐受(matsuoka等人，(2013)sci.transl.med.5:179ra43)。在hcv誘導(dǎo)的血管炎中也記錄了相似的treg增強(qiáng)和臨床受益(saadoun等人，(2011)n.engl.j.med.365:2067-2077)。雖然低劑量il-2尚未用于治療兒童中的gvhd，但其已安全用于同種異體和自體hsct二者之后兒童中的其它適應(yīng)癥。進(jìn)行了兩項研究，在具有高風(fēng)險白血病和/或復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性尤文氏肉瘤的移植后患者中使用1-2x106iu/m2/d范圍劑量的scil-2作為策略以通過誘導(dǎo)自然殺傷(nk)細(xì)胞而預(yù)防復(fù)發(fā)(liu等人，(2008)bonemarrowtransplant42:535-539；schlegel等人，(2011)bestpract.res.clin.haematol.24:443-452)。在一項研究中，患者的中位數(shù)年齡為11歲(范圍為4-16歲)且治療持續(xù)時間范圍為15-250天(schlegel等人，(2011)bestpract.res.clin.haematol.24:443-452)。類似地，在成神經(jīng)細(xì)胞瘤患者中的一項劑量遞增研究在每2周一次的六個5日循環(huán)中以3、6和9x106iu/m2/d的劑量給予scil-2以增加nk細(xì)胞數(shù)(ladenstein等人，(2011)j.clin.oncol.29:441-448)。在該項研究中，患者中位數(shù)年齡為4.1歲(范圍為1.8-7.4歲)。在全部3項研究中，主要不良反應(yīng)是發(fā)燒和注射位點處的局部炎癥。術(shù)語“il-2免疫療法”或“il-2療法”包括通過任何已知途徑(例如，靜脈內(nèi)給予，例如，以推注輸液或在一段時間內(nèi)持續(xù)輸液，通過肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髄內(nèi)(intracerobrospinal)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、口服、局部、吸入和其它已知途徑)向有此需要的受試者給予il-2。通常，il-2的藥代動力學(xué)在人、小鼠、大鼠、兔、羊、豬和食蟹猴間似乎是線性的。皮下給予后，il-2的吸收相對較慢且平均停留時間相比于iv給予延長。在大鼠中的若干多次劑量的研究已對通過皮下(sc)途徑給予il-2(長達(dá)13周的每日給予)進(jìn)行了評估。其證實大鼠中的sc高劑量毒性概況與iv給予后的高劑量毒性概況是相當(dāng)?shù)?。il-2相關(guān)發(fā)現(xiàn)(findings)包括淋巴球增多、嗜酸性粒細(xì)胞增多、輕度貧血、骨髓外造血、淋巴樣增生、肝腫大和脾腫大。在包括肝、肺、淋巴結(jié)、腎、脾和骨髓的許多器官中發(fā)現(xiàn)了浸潤性和增生性改變。在兔sc耐受性研究中，給藥7天后注射位點處的局部炎癥反應(yīng)與il-2的已知作用相一致，且與人類試驗中報道的注射位點反應(yīng)相一致。因此，已證明il-2在動物中的毒性是劑量和持續(xù)時間相關(guān)的，其中所有毒性作用直接或間接與il-2藥理活性相關(guān)。在所有物種中，治療相關(guān)作用在2-4周的無治療期后全部或部分逆轉(zhuǎn)。重復(fù)iv或sc給予il-2后的發(fā)現(xiàn)是可比的。靶器官毒性的嚴(yán)重性與炎癥細(xì)胞浸潤入這些器官的程度相關(guān)。動物中的生物效應(yīng)基本上與臨床試驗中報道的效應(yīng)相似。然而，這些mtd研究涉及用于治療轉(zhuǎn)移性rcc和黑素瘤的高劑量il-2，而不是擬用于增強(qiáng)體內(nèi)treg的低劑量il-2。已在患有癌癥和患有hiv的患者中評估了il-2藥代動力學(xué)。短期iv輸液后，il-2的藥代動力學(xué)概況表征為高血漿濃度、快速分布入血管外空間、以及以1-2小時的半衰期從機(jī)體消除。sc給予后，il-2吸收緩慢且平均停留時間相比于iv給予延長。hiv患者中的最大il-2血漿濃度在sc給藥后的2-5小時內(nèi)出現(xiàn)，且終端相半衰期估計為5小時，提示延長的吸收。推注輸液和持續(xù)iv輸液的清除率近似相同。如根據(jù)其短半衰期所預(yù)期的，預(yù)計在輸液后約6小時達(dá)到穩(wěn)態(tài)。關(guān)于scil-2給予的數(shù)據(jù)提示約35％被吸收入血流，在涉及hiv感染研究的參與者中報道了較高的生物利用度(>60％)。在癌癥或hiv患者中通過sc或持續(xù)iv給予治療五天導(dǎo)致了時間依賴性的il-2清除增加。這與可溶il-2受體血清水平的增加相關(guān)。給藥循環(huán)之間的無藥日恢復(fù)il-2清除至其初始值。il-2的系統(tǒng)性消除至少有3種機(jī)制：腎小球濾過、管周提取和可誘導(dǎo)的受體介導(dǎo)的機(jī)制(在人類中)。自腎小球后毛細(xì)血管管周提取小肽和蛋白進(jìn)入腎小管以及隨后的細(xì)胞內(nèi)分解代謝是獨立于腎小球濾過而發(fā)生的一種腎消除機(jī)制。受體介導(dǎo)的清除主要是il-2與其在應(yīng)答細(xì)胞上的特異性細(xì)胞受體對接的功能。雖然其它細(xì)胞類型(例如，b細(xì)胞)也具有功能性il-2受體，大部分il-2受體是在t細(xì)胞和自然殺傷(nk)細(xì)胞上。在采用高劑量推注il-2治療的轉(zhuǎn)移性黑素瘤或腎細(xì)胞癌中，觀測到cd4+cd25+treg細(xì)胞增加了將近6倍，循環(huán)cd4+foxp3+treg細(xì)胞頻率增加了4倍(ahmadzadeh和rosenberg(2006)blood107:2409-2414)。經(jīng)過去二十年已累積了關(guān)于轉(zhuǎn)移癌患者中il-2作用的可觀的臨床數(shù)據(jù)。在大部分使用高劑量il-2的癌癥試驗中，記錄了可觀的毒性，僅有偶爾的腫瘤反應(yīng)。發(fā)燒、低血壓、黃疸和氮血癥是常見的并發(fā)癥，經(jīng)常迫使收入特護(hù)病房。造血干細(xì)胞移植(hsct)患者不大可能耐受高劑量il-2。已在患有hiv感染和癌癥的患者中評估了延長了時間的低劑量scil-2療法。在一項‘超低劑量’il-2的研究中，七名患有hiv和非霍奇金淋巴瘤的患者在首次緩解中接受了1x106iu/m2/d的il-2(chiron)(shah等人，(2006)clin.cancerres.12:3993-3996)。在～8周治療后，單藥il-2療法導(dǎo)致統(tǒng)計學(xué)上顯著的、成比例的nk細(xì)胞(1.6倍)和tregs(9倍)的增加。其它淋巴細(xì)胞亞群未顯著改變。毒性是輕微的(疲勞、局部瘙癢、肌痛、轉(zhuǎn)氨酶增加等)，沒有3級不良事件。低劑量il-2還已在同種異體hsct后使用。在一項研究中，通過以2-6x105iu/m2/d(≈0.6-1.8x106u/m2/d的il-2(chiron))范圍的劑量向cd6+t細(xì)胞耗盡(tcd)的移植后的29名無癥狀的惡性血液病患者持續(xù)iv輸液給予il-2(amgen，roche)達(dá)3個月的時間以增強(qiáng)免疫移植物抗白血病(gvl)效應(yīng)(soiffer等人(1994)blood84:964-971)。低劑量il-2被良好耐受，僅有4名參加者因毒性而提前退出。29名參加者中僅有1名產(chǎn)生了急性gvhd。8名評估者中的7名，除了預(yù)期的nk細(xì)胞擴(kuò)增以外，還出現(xiàn)了cd4+cd25+t淋巴細(xì)胞(可能代表treg)的45％的中值增加。另外，發(fā)現(xiàn)了foxp3表達(dá)中值增加了～8.5倍，表明實質(zhì)性treg增強(qiáng)(zorn等人，(2006)blood108:1571-1579)。低劑量il-2顯示出了良好耐受，伴有在同種異體hsct后具有顯著的treg擴(kuò)增。il-2免疫療法的非限制性實例是本領(lǐng)域中眾所周知的并至少可見于例如rosenberg等人，(1993)j.natl.cancerinst.85:622-632；guirguis等人，(2002)j.immunother.25:82-87；griffiths和mellon(2004)postgradmed.j.80:320-327；yang等人，(2003)j.clin.oncol.21:3127-2132；mcdermott等人，(2005)j.clin.oncol.23:133-141；negrier等人，(2007)cancer110:2468-2477；mcdermott(2009)med.oncol.26:13-17；美國專利號5,419,900、5,696,079、6,045,788和6,548,055中，其各自在此通過引用整體并入本文以用于所有目的。iii.受試者在一個實施方式中，確定給予抗免疫失調(diào)治療或者預(yù)測其有效響應(yīng)抗免疫失調(diào)療法(例如，多次-可變劑量il-2單獨使用或與一種或多種其它抗免疫失調(diào)療法組合)的受試者，是哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、靈長類、非人哺乳動物、家畜例如狗、貓、牛、馬)，且優(yōu)選是人。成人受試者以及小兒受試者在考慮之中?？扇绫疚乃鲋委熜菏茉囌撸⑶铱墒褂酶咧劣糜诔扇耸茉囌叩闹委焺﹦┝?。在本發(fā)明方法的另一實施方式中，受試者尚未經(jīng)歷治療，例如抗免疫失調(diào)療法(例如，多次-可變劑量il-2單獨使用或與一種或多種其它抗免疫失調(diào)療法組合)。在又一實施方式中，受試者已經(jīng)歷了此治療，例如采用類固醇的治療。本發(fā)明方法可用于治療期望抑制或下調(diào)免疫反應(yīng)的多種不同免疫失調(diào)和/或確定其對抗免疫失調(diào)療法(例如，多次-可變劑量il-2單獨使用或與一種或多種其它抗免疫失調(diào)療法組合)的響應(yīng)性。可通過下調(diào)免疫細(xì)胞反應(yīng)、通過在免疫細(xì)胞中誘導(dǎo)特異性失能(anergy)或二者以抑制活化免疫細(xì)胞的功能。例如，通過共同給予抗原以及本發(fā)明方法的治療組合物可將此類方法用于誘導(dǎo)針對特異性抗原的耐受?？烧T導(dǎo)針對特異性蛋白的耐受。在一個實施方式中，可抑制不期望產(chǎn)生的對過敏原(例如，食物過敏原)或外源蛋白的免疫應(yīng)答/反應(yīng)。例如，接受因子viii的患者時常產(chǎn)生針對該凝血因子的抗體。本發(fā)明方法中共同給予重組因子viii(或通過物理連接至因子viii，例如通過交聯(lián))可導(dǎo)致免疫反應(yīng)下調(diào)。以相似的方式，可誘導(dǎo)減少的克隆缺失和/或增加的耗盡(例如，t細(xì)胞耗盡)。下調(diào)免疫反應(yīng)可用于治療根據(jù)本發(fā)明的多種其它“免疫失調(diào)”，其包括但不限于，組織、皮膚和其它實體器官移植(例如，腎臟、肝臟、心臟和血管化復(fù)合物異體移植體移植)的狀況，在造血干細(xì)胞移植排斥(例如，移植物抗宿主病(gvhd))中，在自身免疫疾病例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、過敏、移植、超敏反應(yīng)中，在需要增加cd4+t細(xì)胞產(chǎn)生或功能的失調(diào)中、在需要改進(jìn)的疫苗接種功效的紊亂中以及需要增加調(diào)節(jié)性t細(xì)胞產(chǎn)生或功能的失調(diào)中。例如，阻斷免疫細(xì)胞功能使得組織移植中組織破壞減少。通常，在組織移植中，移植物排斥的起始是該移植物被免疫細(xì)胞識別為外源物，隨后免疫反應(yīng)破壞該移植物。在移植之前或移植之時給予本文所述的試劑可促進(jìn)生成抑制性信號。此外，抑制還可足以使免疫細(xì)胞失能(anergize)，從而誘導(dǎo)受試者中的耐受。誘導(dǎo)長期耐受避免了重復(fù)給予這些阻斷劑的必要性。下調(diào)免疫反應(yīng)還可用于治療自身免疫疾病，例如1型糖尿病(t1d)和多發(fā)性硬化。許多自身免疫失調(diào)是針對自身組織產(chǎn)生響應(yīng)的免疫細(xì)胞被不適當(dāng)?shù)幕罨约按龠M(jìn)產(chǎn)生涉及疾病病理的細(xì)胞因子和自身抗體的結(jié)果。預(yù)防自身反應(yīng)性免疫細(xì)胞的活化可減少或消除疾病癥狀。給予本文所述的試劑可用于預(yù)防產(chǎn)生疾病發(fā)展中可能涉及的自身抗體或細(xì)胞因子。此外，本發(fā)明方法可誘導(dǎo)自反應(yīng)性免疫細(xì)胞的抗原特異性耐受，其可導(dǎo)致長期減輕疾病。可使用多種良好表征的人類自身免疫疾病的動物模型來確定試劑在預(yù)防或緩解自身免疫失調(diào)中的功效。實例包括鼠類試驗性自身免疫性腦炎、mrl/lpr/lpr小鼠或nzb雜交小鼠中的系統(tǒng)性紅斑狼瘡，鼠類自身免疫性膠原蛋白關(guān)節(jié)炎、nod小鼠和bb大鼠中的糖尿病、以及鼠類試驗性重癥肌無力(參見例如，paul編，fundamentalimmunology，ravenpress，newyork，1993第三版，第30章)。抑制免疫細(xì)胞活化還可用于治療性治療過敏和過敏反應(yīng)，例如通過抑制ige產(chǎn)生。過敏反應(yīng)性質(zhì)上可為全身或局部的，這取決于過敏原的進(jìn)入途徑以及肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞上ige的沉積模式。因此，根據(jù)本發(fā)明方法局部或全身抑制免疫細(xì)胞介導(dǎo)的過敏反應(yīng)(例如，針對食物)。在一個實施方式中，過敏是過敏性哮喘。抑制免疫細(xì)胞活化在治療免疫細(xì)胞的寄生性和病毒性感染中也可能是重要的。例如，在獲得性免疫缺陷綜合癥(aids)中，病毒復(fù)制是由免疫細(xì)胞活化所刺激的。對這些相互作用的調(diào)節(jié)可導(dǎo)致病毒復(fù)制的抑制并因此改善aids發(fā)展。對這些相互作用的調(diào)節(jié)還可用于促進(jìn)妊娠維持?？刹捎谜{(diào)節(jié)這些相互作用的試劑治療由于對胚胎或胎兒的免疫排斥而具有自發(fā)性流產(chǎn)風(fēng)險的女性(例如，之前已自發(fā)性流產(chǎn)過的那些或者之前受孕困難的那些)。根據(jù)本發(fā)明方法下調(diào)免疫反應(yīng)還可用于治療對自體組織的自身免疫進(jìn)攻。因此，對因自身免疫進(jìn)攻(例如，自身免疫失調(diào))而加重的病況以及諸如心臟病、心肌梗塞和動脈粥樣硬化的病況的調(diào)節(jié)也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在一個優(yōu)選實施方式中，免疫失調(diào)是移植物抗宿主病(例如，慢性gvhd)。對于許多具有惡性血液病的患者，同種異體造血干細(xì)胞移植(hsct)提供了僅有的治愈機(jī)會。不幸的是，仍存在明顯的障礙，最突出的是疾病的復(fù)發(fā)和gvhd。超過40％的患者經(jīng)歷hsct復(fù)發(fā)而超過50％的將發(fā)展出cgvhd，一種與可觀的發(fā)病率和死亡率相關(guān)的具有多系統(tǒng)免疫表現(xiàn)的虛弱化病況(kahl等人，(2007)blood110:2744-2748；perez-simon等人(2008)biol.bloodmarrowtransplant.14:1163-1171)。雖然小兒群體中的發(fā)生率較低，但cgvhd仍為用于惡性疾病的同種異體hsct后非復(fù)發(fā)發(fā)病率和死亡率的主要原因，其在20-50％的hsct后存活大于100天的兒童中發(fā)生(baird等人(2010)pediatr.clin.northam.57:297-322)。供體細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)是gvl和gvhd反應(yīng)的原因。新移植的供體免疫系統(tǒng)對殘留腫瘤細(xì)胞的識別和破壞不足使得患者惡性腫瘤復(fù)發(fā)，而針對宿主抗原的失控響應(yīng)則導(dǎo)致gvhd(antin(1993)blood82:2273-2277；ferrara等人(2009)lancet373:1550-1561)。慢性gvhd發(fā)病機(jī)理涉及炎性t-和b-細(xì)胞對同種異體(供體/接受者多態(tài))和自體(供體/接受者非多態(tài))抗原的響應(yīng)，并且在同種異體hsct后其仍為常見問題和主要治療挑戰(zhàn)，而長期幸存者通常經(jīng)歷生活質(zhì)量受損和增加的遠(yuǎn)期死亡(subramaniam等人(2007)leukemia21:853-859)。使用經(jīng)動員外周血祖細(xì)胞而非骨髓作為用于hct的干細(xì)胞來源的增加已導(dǎo)致了cgvhd發(fā)生率的明顯增加(cutler等人(2001)j.clin.oncol.19:3685-3691；lee等人(2007)blood110:4576-4583)。隨著使用同種異體hsct用于治療非惡性適應(yīng)癥(例如，鐮狀細(xì)胞貧血、免疫缺陷和先天性代謝疾病)的增多，預(yù)期小兒患者中cgvhd的發(fā)生率會上升。在成人和兒童二者中，與cgvhd相關(guān)的炎性或纖維化變化最常涉及皮膚、眼睛、嘴、肝臟和呼吸道。系統(tǒng)性類固醇常規(guī)用于治療cgvhd，但具有有限的功效和相當(dāng)?shù)亩拘?。長期類固醇治療對于生長和骨密度的影響在兒童中特別顯著(canalis等人，(2002)j.pediatr.endocrinol.metab.15:1341-1345)。在兒童中，大部分補(bǔ)救劑(salvageagents)的使用是由成人經(jīng)驗外推得到的，且僅有包括嗎替麥考酚酯(mmf)、體外光分離置換法(ecp)和噴司他丁在內(nèi)的少數(shù)療法已在兒科試驗中進(jìn)行了測試(busca等人(2000)bonemarrowtransplant25:1067-1071；berger等人(2007)j.pediatr.hematol.oncol.29:678-687；jacobsohn等人，(2009)blood114:4354-4360)。沒有確立的cgvhd二線療法。經(jīng)常將附加的免疫抑制劑用于類固醇難治性cgvhd，盡管其功效有限。因此，二線治療選擇有限并且類固醇難治性cgvhd成為主要的治療挑戰(zhàn)。iv.抗免疫失調(diào)療法可向期望的受試者或已經(jīng)顯示為可能響應(yīng)此療法的受試者施予本發(fā)明方法(例如，多次-可變劑量il-2單獨使用或與一種或多種其它抗免疫失調(diào)療法組合)。在另一實施方式中，若受試者顯示為不大可能響應(yīng)所述療法則避免使用本發(fā)明的治療方法，并可給予替代的治療方案，例如靶向和/或非靶向抗免疫療法。在一個實施方式中，提供了一種用于治療罹患免疫失調(diào)的受試者的多次-可變il-2劑量方法，其包括：a)給予所述受試者誘導(dǎo)方案，所述誘導(dǎo)方案包括以增加所述受試者的血漿白細(xì)胞介素-2(il-2)水平并增加所述受試者的調(diào)節(jié)性t淋巴細(xì)胞(tregs)與常規(guī)t淋巴細(xì)胞(tcons)的比率(tregs:tcons)的劑量持續(xù)給予所述受試者il-2；以及b)隨后給予所述受試者至少一個維持方案，所述維持方案包括持續(xù)給予所述受試者il-2維持劑量，所述il-2維持劑量高于所述誘導(dǎo)方案劑量并且i)進(jìn)一步增加所述受試者的血漿il-2水平和ii)進(jìn)一步增加所述tregs:tcons比率，從而治療所述受試者。在一個實施方式中，將源自誘導(dǎo)方案的血漿il-2水平耗盡至低于誘導(dǎo)方案之前的先前血漿il-2峰值水平。在某些實施方式中，所述il-2維持方案可使所述受試者的血漿il-2水平增加至超過由所述誘導(dǎo)方案所誘導(dǎo)的血漿il-2峰值水平。術(shù)語“多次-可變il-2劑量方法”是指包括多于一次的il-2給予的治療性干預(yù)，其中所述多于一次的il-2給予使用多于一種的il-2劑量。此方法與“固定”劑量方法相對，其中所述“固定”劑量方法以預(yù)定的方式(例如，每天)給予固定量的il-2。術(shù)語“誘導(dǎo)方案”是指以增加受試者的血漿il-2水平并增加受試者的tregs:tcons比率的劑量持續(xù)給予il-2。在一些實施方式中，使用該方案直至達(dá)到血漿il-2峰值水平。受試者的血漿il-2水平和/或tregs:tcons比率相對于治療起始之前的基線比率增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％或更多。在根據(jù)fda批準(zhǔn)應(yīng)用的某些劑量和方法下，tcons相比于tregs被優(yōu)先活化，從而使得tregs:tcons比率實際上減小。相比之下，本發(fā)明方法通過在本文確定的范圍內(nèi)使用“低劑量il-2”以優(yōu)先提升tregs而非tcons，從而增加tregs:tcons比率，并且在患有免疫失調(diào)的受試者中是安全和有效的。術(shù)語“低劑量il-2”是指其中相比于tcons優(yōu)先增強(qiáng)tregs的劑量范圍。在一個實施方式中，低劑量il-2是指小于或等于用于抗癌免疫療法的“高劑量il-2”劑量(例如，1800萬iu/m2/天至2000萬iu/m2/天，或更多)的50％的il-2劑量。“低劑量il-2”的上限可進(jìn)一步受限于治療引起的不良反應(yīng)，例如發(fā)燒、發(fā)冷、虛弱和疲勞。il-2通常根據(jù)以在給定時間單位內(nèi)相比于體表面積(bsa)給予的以國際單位(iu)計量的量進(jìn)行給藥?？赏ㄟ^直接測量或通過任意多種公知的方法(例如，dubois&dubois公式)如實施例中描述的那些來計算bsa。通常，il-2是以iu/m2bsa/天的單位給予。根據(jù)本發(fā)明方法的示例性低劑量il-2劑量包括，以106iu/m2/天為單位的，0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9和3.0x106iu/m2/天中的任意一種，包括其間的任何值和/或其間的任何范圍。例如，誘導(dǎo)方案劑量可為0.3x106iu/m2/天和3.0x106iu/m2/天之間的范圍，及其間的任何值或范圍。術(shù)語“持續(xù)給予”是指以給定時間隔給予il-2，其間沒有任何間歇性中斷。因此，未出現(xiàn)il-2中斷。例如，誘導(dǎo)劑量可為在至少1-14個連續(xù)日或其間的任何范圍(例如，至少4-7個連續(xù)日)期間每日給予(例如，每日一次或多次)。如本文所述的，通過除皮下給予以外的途徑給予的更長效的il-2試劑和/或il-2試劑也列入考慮范圍。現(xiàn)有技術(shù)中所述的il-2間歇性靜脈給與導(dǎo)致短的il-2半衰期，這與根據(jù)本發(fā)明的增加的血漿il-2水平和增加的tregs:tcons比率無法相比。然而，為了實現(xiàn)持續(xù)的穩(wěn)態(tài)il-2水平也考慮每日一次皮下il-2給藥、持續(xù)iv輸液、長效皮下il-2制劑等?？芍苯踊蜷g接評估血漿il-2水平及其峰值。例如，可使用本領(lǐng)域公知的方法和試劑直接分析il-2核酸和蛋白水平和/或活性，例如通過使用核酸探針、elisa試劑盒、il-2受體活化試驗等(參見例如，sigma-aldrich人il-2elisa試劑盒rab-0286以及美國專利號4,530,787、4,569,790、4,572,798、4,604,377、4,748,234、4,853,332、4,959,314、5,464,939、re33,653、5,229,109、5,419,900、5,696,079、6,045,788、6,548,055、7,514,073和7,569,215，其各自在此通過引用整體并入本文并用于所有目的)。在另一實施方式中，可通過分析il-2的效用(例如，其對tregs增殖、tregs活性、tregs凋亡等的效用)間接分析血漿il-2水平和/或活性。用于確定tregs增殖、tregs活性和/或tregs凋亡的方法是本領(lǐng)域公知的且如本文所述實施例中所示例。例如，可分析tregs和/或tcons細(xì)胞分化和/或活化的生物標(biāo)志物，例如通過分析cd25、磷酸化stat5(pstat5)、foxp3、ki67、tunel等的狀態(tài)。此外，可如本文進(jìn)一步所述的進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞型的表型分析、導(dǎo)致免疫反應(yīng)降低的免疫調(diào)節(jié)的功能分析、血漿細(xì)胞因子分析等。在又一實施方式中，可根據(jù)誘導(dǎo)方案起始后的時間間接確定血漿il-2水平和/或活性。例如，本文已確定在誘導(dǎo)方案起始后的約7天內(nèi)達(dá)到血漿il-2峰值水平。在本發(fā)明的一些實施方式中，根據(jù)誘導(dǎo)方案起始后的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天來確定血漿il-2水平，例如血漿il-2峰值水平。維持方案可起始于誘導(dǎo)方案之后的任何點，例如血漿il-2峰值水平和/或活性峰值之后，但是優(yōu)選盡可能接近達(dá)到血漿il-2峰值水平和/或活性的時間。術(shù)語“維持方案”是指以高于誘導(dǎo)方案劑量和i)進(jìn)一步增加受試者的血漿il-2水平及ii)進(jìn)一步增加tregs:tcons比率的劑量持續(xù)給予受試者il-2。在一個實施方式中，在源自誘導(dǎo)方案的血漿il-2水平被耗盡至低于誘導(dǎo)方案之前的先前血漿il-2峰值水平的時間點或之后開始維持方案。如上所述，這可以以誘導(dǎo)方案起始后的天數(shù)為單位進(jìn)行計量，例如誘導(dǎo)方案起始后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天。為增加血漿il-2水平，以高于誘導(dǎo)方案劑量的劑量向受試者給予il-2。在一個實施方式中，以106iu/m2/天為單位，劑量為0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9和3.0x106iu/m2/天中的任意一種，包括其間的任何值和/或其間的任何范圍。例如，誘導(dǎo)方案劑量可為0.3x106iu/m2/天和3.0x106iu/m2/天之間的范圍和其間的任何值或范圍。維持方案劑量可為至少約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多，或其間的任何值和/或其間的任何范圍。相對于誘導(dǎo)方案的tregs:tcons，增加的血漿il-2水平還增加了tregs:tcons比率，例如比率增加至少約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多，或其間的任何值和/或其間的任何范圍。與誘導(dǎo)方案相一致，術(shù)語“持續(xù)給予”是指以定期間隔給予il-2，其間沒有任何間歇性中斷。因此，未出現(xiàn)il-2中斷。雖然這可通過使用沒有間歇性中斷的il-2給予方案實現(xiàn)，但還可通過使用提供穩(wěn)態(tài)血漿il-2水平的il-2試劑實現(xiàn)il-2持續(xù)給予。例如，可基于長期治療(例如，無限期)每日給予維持劑量(例如，每日一次或多次)。在一些實施方式中，期間為至少1-42個連續(xù)日或其間任何范圍(例如，至少14-42個連續(xù)日)。如上所述，可以以藥學(xué)上可接受的制劑形式給予并通過任何適當(dāng)?shù)慕o予途徑給予il-2，例如通過皮下、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、口服、經(jīng)鼻、經(jīng)皮或肌肉內(nèi)給予。在一個實施方式中，本發(fā)明提供了藥學(xué)上可接受的組合物，其包含與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體(添加劑)和/或稀釋劑一起配制的治療有效量的il-2。本發(fā)明的藥物組合物可特別配制用于以固體或液體形式給予，包括適合于以下的那些：(1)口服給與，例如，浸液(drenches)(水性或非水性溶液或懸浮液)、片劑、大丸劑、粉末、顆粒、糊劑；(2)腸胃外給予，例如，以例如無菌溶液或懸浮液通過皮下、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)注射；(3)局部應(yīng)用，例如應(yīng)用于皮膚的乳膏、軟膏或噴霧；(4)陰道內(nèi)或直腸內(nèi)，例如子宮托、乳膏或泡沫；或(5)氣溶膠，例如水溶膠，脂質(zhì)體制品或固體顆粒，其包含所述化合物。本文所用的短語“藥學(xué)上可接受的”是指在合理醫(yī)學(xué)判斷的范圍內(nèi)，適用于與人類和動物組織接觸而無過多毒性、刺激性、過敏反應(yīng)或其它問題或并發(fā)癥，與合理的收益/風(fēng)險比相稱的那些試劑、材料、組合物和/或劑型。如本文所用的短語“藥學(xué)上可接受的載體”是指涉及將主體化學(xué)品從機(jī)體的一個器官或部分運載或運輸?shù)綑C(jī)體的另一器官或部分的藥學(xué)上可接受的材料、組合物或媒介物，例如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包封材料。從與制劑的其它成分相容以及不會有害于受試者的角度上說，各載體必須是“可接受的”?？捎米魉帉W(xué)上可接受的載體的一些材料實例包括：(1)糖類，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；(3)纖維素及其衍生物，例如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素；(4)黃芪膠粉；(5)麥芽；(6)明膠；(7)滑石；(8)賦形劑，例如可可油和栓劑蠟；(9)油類，例如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；(10)二醇類，例如丙二醇；(11)多元醇類，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯類，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)瓊脂；(14)緩沖劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15)海藻酸；(16)無熱原水；(17)等滲鹽水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸鹽緩沖溶液；和(21)用于藥物制劑中的其它無毒相容性物質(zhì)?？捎糜诒景l(fā)明方法的制劑包括適用于口服、鼻用、局部(包括口腔和舌下)、直腸、陰道、氣溶膠和/或腸胃外給予的那些。制劑可便利地以單位劑型形式存在并可通過藥學(xué)領(lǐng)域公知的任何方法制備。根據(jù)所治的宿主、特定給藥模式的不同，可與載體材料聯(lián)合以產(chǎn)生單一劑型的活性成分的量不同。可與載體材料聯(lián)合以產(chǎn)生單一劑型的活性成分的量將通常為產(chǎn)生治療效應(yīng)的化合物的量。通常，自100％計，該量的范圍將為從約1％至約99％的活性成分，優(yōu)選從約5％至約70％，最優(yōu)選從約10％至約30％。適用于體內(nèi)給予的il-2制劑是本領(lǐng)域公知的(參見例如，美國專利號4,530,787，4,569,790，4,572,798，4,604,377，4,748,234，4,853,332，4,959,314，5,464,939，re33,653，5,229,109，5,419,900，5,696,079，6,045,788，6,548,055，7,514,073和7,569,215，其各自在此通過引用整體并入本文以用于所有目的)。在一些實施方式中，il-2或其它有用的生物標(biāo)志物的核酸分子是有用的，并可插入載體并用作基因治療載體?？赏ㄟ^例如靜脈內(nèi)注射、局部給予(參見美國專利號5,328,470)或通過立體定向注射(參見例如chen等人，(1994)proc.natl.acad.sci.usa91:30543057)將基因治療載體遞送至受試者?；蛑委熭d體的藥物制品可包括在可接受的稀釋劑中的基因治療載體，或可包括其中嵌埋基因運載工具的緩釋基質(zhì)?；蛘?，當(dāng)在重組細(xì)胞可完整產(chǎn)生完整基因遞送載體(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)的情況下，藥物制品可包括一種或多種產(chǎn)生基因遞送系統(tǒng)的細(xì)胞。用于將多核苷酸引入哺乳動物、人類、非人類或其細(xì)胞的任何手段均可用于本發(fā)明的實施，用于將本發(fā)明的各種構(gòu)建體遞送入預(yù)定的接受者。在本發(fā)明的一個實施方式中，通過轉(zhuǎn)染將dna構(gòu)建體遞送至細(xì)胞，即，通過遞送“裸”dna或在與膠態(tài)分散體系的復(fù)合物中的dna。膠態(tài)體系包括高分子復(fù)合物、納米膠囊、微球、珠和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)，其包括水包油乳液、膠束、混合膠束和脂質(zhì)體。本發(fā)明優(yōu)選的膠態(tài)體系是脂質(zhì)復(fù)合的或脂質(zhì)體配制的dna。在前述途徑中，在將dna制劑(例如，與脂質(zhì)一起制劑)之前，可首先通過實驗優(yōu)化包含承載期望dna構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因的質(zhì)粒的表達(dá)(例如，在5'非翻譯區(qū)中引入內(nèi)含子以及去除不必要的序列(felgner等人，annnyacadsci126-139，1995)。然后可使用已知的方法和材料實現(xiàn)dna的制劑(例如，與各種脂質(zhì)或脂質(zhì)體材料的制劑)并將其遞送至作為接受者的哺乳動物。參見例如，canonico等人，amjrespircellmolbiol10:24-29，1994；tsan等人，amjphysiol268；alton等人，natgenet.5:135-142，1993和carson等人申請的美國專利號5,679,647?？苫诮馄屎蜋C(jī)械因素將脂質(zhì)體的靶向分類。解剖分類是基于選擇性的層面，例如，器官特異性、細(xì)胞特異性和細(xì)胞器特異性的?？苫谄涫欠袷潜粍踊蛑鲃拥膮^(qū)分機(jī)械靶向。被動靶向利用脂質(zhì)體分布至器官中網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(res)細(xì)胞(其包含竇狀毛細(xì)血管)的自然趨勢。另一方面，主動靶向涉及通過將脂質(zhì)體偶聯(lián)至特異性配體(例如，單克隆抗體、糖、糖脂或蛋白)，或通過改變脂質(zhì)體的組成或大小而改變脂質(zhì)體，以便實現(xiàn)靶向不同于自然發(fā)生的定位位點的器官和細(xì)胞類型?？梢砸愿鞣N方式修飾靶向遞送系統(tǒng)的表面。在脂質(zhì)體靶向遞送系統(tǒng)的情況下，可將脂質(zhì)基團(tuán)并入脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙層以維持靶向配體與脂質(zhì)體雙層的穩(wěn)定連接?？墒褂酶鞣N連接基團(tuán)將脂質(zhì)鏈連接至靶向配體。與運載工具(例如，脂質(zhì)體)相連的裸dna或dna可給予至受試者中的若干位點(見下文)?？稍谌魏纹谕妮d體中遞送核酸。這些包括病毒或非病毒載體，包括腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體和質(zhì)粒載體。示例性病毒類型包括hsv(單純皰疹病毒)、aav(腺相關(guān)病毒)、hiv(人類免疫缺陷病毒)、biv(牛免疫缺陷病毒)和mlv(鼠白血病病毒)?？梢砸蕴峁┏浞钟行У倪f送水平的任何期望形式給予核酸，包括在病毒顆粒中、在脂質(zhì)體中、在納米顆粒中以及與聚合物復(fù)合。編碼蛋白的核酸或感興趣的核酸可在質(zhì)?；虿《据d體中，或在如本領(lǐng)域已知的其它載體中。此類載體是公知的并可選擇任意載體用于特定應(yīng)用。在本發(fā)明的一個實施方式中，基因運載工具包含啟動子和脫甲基酶編碼序列。優(yōu)選的啟動子是組織特異性啟動子和通過細(xì)胞增殖活化的啟動子，例如胸苷激酶和胸苷酸合成酶啟動子。其它優(yōu)選的啟動子包括通過病毒感染可活化的啟動子，例如α-和β-干擾素啟動子，以及通過激素(例如，雌激素)可活化的啟動子?？墒褂玫钠渌鼏幼影迥岵《緇tr、cmv啟動子和小鼠白蛋白啟動子。啟動子可以是組成型的或可誘導(dǎo)的。在另一實施方式中，如wo90/1109和美國專利5,580,859中所述，使用裸多核苷酸分子作為基因運載工具。此類基因運載工具可以是生長因子dna或rna且在某些實施方式中連接至滅活的腺病毒。curiel等人，hum.gene.ther.3:147-154，1992。可任選使用的其它媒介物包括dna-配體(wu等人，j.biol.chem.264:16985-16987，1989)、脂質(zhì)-dna組合(felgner等人，proc.natl.acad.sci.usa84:74137417，1989)、脂質(zhì)體(wang等人，proc.natl.acad.sci.84:7851-7855，1987)和微彈(williams等人，proc.natl.acad.sci.88:2726-2730，1991)?；蜻\載工具可任選包含病毒序列，例如病毒來源的復(fù)制或包裝信號。這些病毒序列可選自諸如以下的病毒：星狀病毒、冠狀病毒、正粘病毒、乳多空病毒、副粘病毒、細(xì)小病毒、小核糖核酸病毒、痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、披蓋病毒或腺病毒。在一個優(yōu)選實施方式中，生長因子基因運載工具是重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒及其各種用途已描述在多篇參考文獻(xiàn)中，包括例如，mann等人，cell33:153，1983，cane和mulligan，proc.nat'l.acad.sci.usa81:6349，1984，miller等人，humangenetherapy1:5-14，1990，美國專利號4,405,712、4,861,719和4,980,289，以及pct申請?zhí)杦o89/02,468、wo89/05,349和wo90/02,806。多種逆轉(zhuǎn)錄病毒基因運載工具可用于本發(fā)明中，包括例如ep0,415,731；wo90/07936；wo94/03622；wo93/25698；wo93/25234；美國專利號5,219,740；wo9311230；wo9310218；vile和hart，cancerres.53:3860-3864，1993；vile和hart，cancerres.53:962-967，1993；ram等人，cancerres.53:83-88，1993；takamiya等人，j.neurosci.res.33:493-503，1992；baba等人，j.neurosurg.79:729-735，1993(美國專利號4,777,127、gb2,200,651、ep0,345,242和wo91/02805)中描述的那些?？捎糜谶f送本發(fā)明多核苷酸的其它病毒載體系統(tǒng)來源于皰疹病毒，例如單純皰疹病毒(由woo等人于1997年5月20日提交的的美國專利號5,631,236以及由neurovex提交的wo00/08191)、牛痘病毒(ridgeway(1988)ridgeway，“mammalianexpressionvectors,”in:rodriguezrl，denhardtdt編vectors:asurveyofmolecularcloningvectorsandtheiruses.stoneham:butterworth,；baichwal和sugden(1986)“vectorsforgenetransferderivedfromanimaldnaviruses:transientandstableexpressionoftransferredgenes,”in:kucherlapatir編genetransfer.newyork:plenumpress；coupar等人(1988)gene，68:1-10)和若干rna病毒。優(yōu)選的病毒包括甲病毒、痘病毒、沙狀病毒、牛痘病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒等。它們對于各種哺乳動物細(xì)胞提供了若干有吸引力的特性(friedmann(1989)science，244:1275-1281；ridgeway，1988，見上；baichwal和sugden，1986，見上；coupar等人，1988；horwich等人，(1990)j.virol.，64:642-650)。在其它實施方式中，可使用本領(lǐng)域公知的方法操作基因組中的目標(biāo)dna。這可有用于在輸液入受試者之前離體重組工程化受試者t細(xì)胞群。例如，可通過缺失、插入、和/或突變操作基因組中的目標(biāo)dna，方法可以是逆轉(zhuǎn)錄病毒插入、人工染色體技術(shù)、基因插入、帶有組織特異性啟動子的隨機(jī)插入、基因靶向、轉(zhuǎn)位因子和/或用于引入外源dna或產(chǎn)生經(jīng)修飾的dna/經(jīng)修飾的核dna的任何其它方法。其它修飾技術(shù)包括從基因組刪除dna序列和/或改變核dna序列。例如，可通過定點誘變改變核dna序列。在其它實施方式中，可將重組生物標(biāo)志物多肽及其片段給予受試者。在一些實施方式中，可構(gòu)建并給予具有增強(qiáng)的生物學(xué)特性的融合蛋白。此外，可根據(jù)本領(lǐng)域中公知的藥理學(xué)方法(例如，聚乙二醇化、糖基化、寡聚化等)修飾生物標(biāo)志物多肽及其片段，以便進(jìn)一步增強(qiáng)期望的生物活性，例如增加的生物利用度和減少的蛋白水解降解。在一些方面中，多次-可變劑量il-2療法可與一種或多種其它抗免疫失調(diào)療法組合。在一個實施方式中，體外光分離置換法(ecp)是有用的。ecp是一種由以下構(gòu)成的清血過程：uva照射清血法采集的、采用8-甲氧補(bǔ)骨脂素(8-mop)敏化的自體白細(xì)胞，并隨后再回輸以增加tregs(gatza等人，(2008)blood112:1515-1521；capitini等人，(2011)biol.bloodmarrowtransplant.17:790-799；maeda等人，(2008)j.immunol.181:5956-5962)，并在此類treg增加之前通過凋亡t細(xì)胞誘導(dǎo)不成熟和漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(dcs)(perez等人，(1991)transplantation51:1283-1289；stenger等人，(2012)blood119:5088-5103；albert等人，(1998)nature392:86-89；yoo等人(1996)j.invest.dermatol.107:235-242)。關(guān)于ecp機(jī)制的人類數(shù)據(jù)選擇性地報導(dǎo)了tregs(schmitt等人，(2009)transplantation88:411-416；biagi等人，(2007)transplantation84:31-39)或dc表型(shiue等人，(2013)j.invest.dermatol.133:2098-2100)，但其在異質(zhì)群體中，經(jīng)常沒有收入標(biāo)準(zhǔn)或ecp前基線數(shù)據(jù)。ecp是常規(guī)推薦的且cms批準(zhǔn)的cgvhd二線治療(dignan等人，(2012)br.j.haematol.158:62-78)。雖然在實踐中是安全的，但單獨的ecp僅提供有限的臨床受益。約半數(shù)治療患者沒有臨床響應(yīng)；部分響應(yīng)對響應(yīng)者而言是慣例；且長期ecp期間的免疫抑制劑遞減緩慢且經(jīng)常不完全。在另一實施方式中，調(diào)節(jié)性t細(xì)胞輸液是有用的。在hsct背景下輸注tregs已是良好耐受的。一項在23名雙臍帶血(ducb)hsct接受者中的試驗評價了輸注使用il-2離體擴(kuò)增的ucbtreg的安全性。未體內(nèi)給予il-2?；颊咴谝浦埠蠼邮?.1-30x105treg細(xì)胞/kg的劑量。未觀測到輸注毒性。相比于未進(jìn)行ucbtreg輸注的同等治療的108名歷史對照，有較低的ii-iv級急性gvhd發(fā)生率(43％對比61％，p＝.05)，對于感染、復(fù)發(fā)或早期死亡不具有有害影響(brunstein等人，(2011)blood117:1061-1070)。然而，僅能在14天內(nèi)于體內(nèi)檢測到輸注的ucbtregs。在另一項28名經(jīng)歷高風(fēng)險hla-單倍體相合hsct的惡性血液病患者的試驗中，輸注移植圍(peri-transplant)供體treg富集細(xì)胞，隨后輸注tcon，即便沒有移植后的免疫抑制也預(yù)防了gvhd、促進(jìn)了淋巴重建、提高了對條件致病菌的免疫力、且未減弱移植物抗白血病效應(yīng)(diianni等人(2011)blood117:3921-3928)。該研究利用經(jīng)由clinimacs(miltenyibiotec)免疫磁珠分離的2步供體treg細(xì)胞富集：a)臨床級cd8+/cd19+共耗盡(2.1耗盡程序，clinimacs)以及然后是b)cd25+陽性選擇(3.1富集程序，clinimacs)。在體外1:2的treg:tcon比率下treg富集細(xì)胞產(chǎn)物是被抑制的。在輸注高達(dá)4x106的treg富集細(xì)胞/kg后未報道毒性，盡管隨后輸注高達(dá)2x106tcon細(xì)胞/kg(clinimacscd19+耗盡供體淋巴細(xì)胞)。不同于已知的涉及繁瑣和昂貴的treg擴(kuò)增和純化過程的調(diào)節(jié)性t細(xì)胞輸注方法，本文已確定直接采集和輸注hsct供體或受試者的自身tregs而無需在實驗室中擴(kuò)增細(xì)胞，這提供了簡單、有效且持久的免疫失調(diào)治療手段。該效應(yīng)的出現(xiàn)是因為與低劑量il-2組合在體內(nèi)建立了直接在機(jī)體內(nèi)擴(kuò)增輸注的tregs的條件，以便持久地增強(qiáng)患者中的tregs以用于免疫失調(diào)的持久控制。tregs可被純化或富集。“富集的tregs”是指除其它t細(xì)胞以外以下述比例包含tregs的組合物，其中組合物具有至少1:2、1:1.9、1:1.8、1:1.7、1:1.6、1:1.5、1:1.4、1:1.3、1:1.2、1:1.1、1:1、1:0.9、1:0.8、1:0.7、1:0.6、1:0.5、1:0.4、1:0.3、1:0.2、1:0.1或更高，或其間任何值或其間任何范圍的tregs：tcons比率。此類比率的實現(xiàn)可通過純化包含cd8+和cd19+共耗盡的t細(xì)胞的組合物聯(lián)合陽性選擇cd25+細(xì)胞?？梢?.1x106、0.2x106、0.3x106、0.4x106、0.5x106、0.6x106、0.7x106，0.8x106、0.9x106、1.0x106細(xì)胞/千克受試者體重或更多，或其間任何值或其間任何范圍給予包含富集的tregs的細(xì)胞群。此類富集的tregs可進(jìn)一步依據(jù)細(xì)胞標(biāo)記和/或存活率進(jìn)行定義。例如，富集的tregs細(xì)胞組合物可具有大于40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更高，或其間任何值或其間任何范圍的總細(xì)胞存活率。其可具有革蘭氏陰性染色。其可包含大于40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多，或其間任何值或其間任何范圍的cd4+cd25+細(xì)胞。其可包含大于40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多，或其間任何值或其間任何范圍的foxp3+細(xì)胞?？梢砸匀绫疚乃龅娜魏芜m當(dāng)途徑(例如，通過輸液)給予tregs。tregs還可在il-2給予之前、同時或之后給予。在又一實施方式中，治療方法可進(jìn)一步使用阻斷共刺激通路活性的試劑，例如其它b淋巴細(xì)胞抗原(如，b7-1、b7-2或b7-3)以進(jìn)一步下調(diào)免疫反應(yīng)。兩種下調(diào)免疫反應(yīng)的單獨的試劑可組合為單一組合物或單獨給予(同時或先后)以更有效地下調(diào)受試者中免疫細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。此外，治療活性量的一種或多種主體試劑可與其它下調(diào)試劑聯(lián)同使用以影響免疫反應(yīng)。其它免疫調(diào)節(jié)試劑的實例包括但不限于，阻斷共刺激信號的抗體(例如，針對cd28或icos)、用作ctla4激動劑的抗體、和/或針對其它免疫細(xì)胞標(biāo)記的抗體(例如，針對cd40、針對cd40配體、或針對細(xì)胞因子)、融合蛋白(例如，ctla4-fc)和免疫抑制藥物(例如，雷帕霉素、環(huán)孢菌素a或fk506)。此外，促進(jìn)免疫檢查點蛋白活性的試劑也是有用的。術(shù)語“免疫檢查點蛋白”是指cd4+和/或cd8+t細(xì)胞細(xì)胞表面上的一組分子，其通過下調(diào)或抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)而微調(diào)免疫反應(yīng)。免疫檢查點蛋白是本領(lǐng)域公知的且包括但不限于，如上所述的ctla-4，以及pd-1、vista、b7-h2、b7-h3、pd-l1、b7-h4、b7-h6、2b4、icos、hvem、pd-l2、cd160、gp49b、pir-b、kir家族受體、tim-1、tim-3、tim-4、lag-3、btla、sirpα(cd47)、cd48、2b4(cd244)、b7.1、b7.2、ilt-2、ilt-4、tigit和a2ar(參見例如，wo2012/177624)?？捎糜诖龠M(jìn)免疫檢查點蛋白水平和活性的試劑是本領(lǐng)域公知的。在又一實施方式中，任何一線或二線免疫失調(diào)治療可與本發(fā)明的方法組合。代表性實例包括但不限于，甾體、嗎替麥考酚酯(mmf)和噴司他丁(參見例如，busca等人，(2000)bonemarrowtransplant25:1067-1071；berger等人，(2007)j.pediatr.hematol.oncol.29:678-687；jacobsohn等人，(2009)blood114:4354-4360)。v.臨床療效可通過任何本領(lǐng)域已知的方法測量臨床療效。例如，可以定量的方式如在感染區(qū)域的百分?jǐn)?shù)改變或使用半定量方法以定性方式如“病理完全緩解”(pcr)、“臨床完全緩解”(ccr)、“臨床部分緩解”(cpr)、“臨床病情穩(wěn)定”(csd)、“臨床進(jìn)行性疾病”(cpd)或其它定性標(biāo)準(zhǔn)來記錄響應(yīng)。對腫瘤響應(yīng)的評估可在治療開始后的任何時間進(jìn)行，例如數(shù)小時、數(shù)天、數(shù)周后或者優(yōu)選數(shù)月后。在一些實施方式中，可通過測量臨床受益率(cbr)來確定本文所述的治療處理的臨床療效。臨床受益率的測量是通過在治療結(jié)束后起至少6個月的時間點測定完全緩解(cr)的患者百分?jǐn)?shù)、部分緩解(pr)的患者數(shù)目和具有穩(wěn)定病情(sd)的患者數(shù)目的總和。該公式的簡寫為cbr＝超過6個月的cr+pr+sd。在一些實施方式中，特定治療方案的cbr為至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或更多。用于評估響應(yīng)的附加標(biāo)準(zhǔn)涉及“生存期”，其包括以下所有：至死亡的生存期，又稱總體生存期(其中所述死亡可為不論原因的)；“無復(fù)發(fā)生存期”(其中術(shù)語復(fù)發(fā)應(yīng)包括局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)端復(fù)發(fā)二者)；無疾病生存期(其中術(shù)語疾病應(yīng)包括免疫失調(diào)和與之相關(guān)的疾病)。所述生存期的長度可通過參考經(jīng)定義的起始點(例如，診斷或開始治療的時間)和終末點(例如，死亡或復(fù)發(fā))來計算。例如，為了確定適當(dāng)?shù)拈撝?，可將特定治療方案給予一群受試者并可將結(jié)果與在給予任何治療之前確定的生物標(biāo)志物測量值相關(guān)聯(lián)。結(jié)果測量值可為對根據(jù)新輔助設(shè)定(neoadjuvantsetting)所給予的治療的病理反應(yīng)。或者，可通過對已知生物標(biāo)志物測量值的接受抗免疫失調(diào)治療后的受試者進(jìn)行一段時間的監(jiān)測以獲得結(jié)果測量值，例如總體生存期和無病生存期。在某些實施方式中，給予各受試者相同劑量的活性劑。監(jiān)測受試者的時段可不同。例如，可監(jiān)測受試者至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、55或60個月?？墒褂弥T如實施例部分中所述的那些方法來確定與抗免疫失調(diào)療法結(jié)果相關(guān)聯(lián)的生物標(biāo)志物測量閾值。v.本發(fā)明進(jìn)一步的方法可根據(jù)本文所述的方法和技術(shù)人員已知的技術(shù)來分析生物標(biāo)志物核酸和/或生物標(biāo)志物多肽以識別用于診斷和預(yù)后目的的此類基因改變或表達(dá)改變。例如，可檢測識別tregs和/或tcons的生物標(biāo)志物，以及其活性細(xì)胞生物標(biāo)志物。此類方法包括但不限于，1)生物標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄本或多肽水平的改變，2)生物標(biāo)志物基因的一個或多個核苷酸的缺失或插入，4)生物標(biāo)志物基因的一個或多個核苷酸的替代，5)生物標(biāo)志物基因(例如，表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū))的異常修飾，等等。a.樣本采集、制備和分離在一些實施方式中，將來自受試者的樣本中的生物標(biāo)志物的存在、缺失、量和/或活性測量值與預(yù)定對照(標(biāo)準(zhǔn))樣本相比較。來自受試者的樣本通常來自患病組織，例如免疫失調(diào)細(xì)胞或組織。對照樣本可來自相同受試者或來自不同受試者。對照樣本通常是正常、非患病樣本。然而，在一些實施方式中，例如用于將疾病分期或用于評估治療功效，對照樣本可來自患病組織。對照樣本可為來自若干不同受試者的樣本的組合。在一些實施方式中，將來自受試者的生物標(biāo)志物量和/或活性測量值與預(yù)定水平進(jìn)行比較。該預(yù)定水平通常獲得自正常樣本，例如來自與測試樣本獲得自的物種相同的物種成員的細(xì)胞或組織中，或者來自測試樣本獲得自的受試者的非患病細(xì)胞或組織中的生物標(biāo)志物的正?？截悢?shù)、量或活性。如本文所述的，“預(yù)定的”生物標(biāo)志物量和/或活性測量值可為用于(僅舉例來說)評估可能被選擇接受治療的受試者、評估對抗免疫失調(diào)療法(例如，多次-可變劑量il-2療法單獨使用或與一種或多種其它抗免疫失調(diào)療法組合)的響應(yīng)的生物標(biāo)志物量和/或活性測量值?？稍诨加谢虿换加忻庖呤д{(diào)的患者群體中確定預(yù)定的生物標(biāo)志物量和/或活性測量。預(yù)定的生物標(biāo)志物量和/或活性測量可為單一數(shù)值，對每個患者可同等適用，或者預(yù)定的生物標(biāo)志物量和/或活性測量值可根據(jù)患者的特定亞群而變化。受試者的年齡、體重、身高和其它因素可能影響個體的預(yù)定的生物標(biāo)志物量和/或活性測量值。此外，可針對各個體受試者確定預(yù)定的生物標(biāo)志物量和/或活性。在一個實施方式中，本文所述方法中確定和/或比較的量是基于絕對測量值的。在另一實施方式中，本文所述方法中確定和/或比較的量是基于相對測量值，例如比率(例如，生物標(biāo)志物表達(dá)，其歸一化至管家基因表達(dá)，或不同時間點的基因表達(dá))的。預(yù)定的生物標(biāo)志物量和/或活性測量值可為任何適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)。例如，預(yù)定的生物標(biāo)志物量和/或活性測量值可獲得自正對其進(jìn)行患者篩選評估的相同或不同的人。在一個實施方式中，預(yù)定的生物標(biāo)志物量和/或活性測量值可獲得自相同患者的先前評估。在此方式下，可在一段時間監(jiān)測患者篩選的進(jìn)展。此外，若受試者是人，則對照可獲得自對另一人或多個人(例如選定的人組)評估。以這種形式，正對其進(jìn)行篩選評估的人的篩選程度可與其他適當(dāng)?shù)娜?例如，與感興趣的人患有相似或相同病況的其他人和/或與感興趣的人屬于同一種族的那些人)是可比較的。在本發(fā)明的一些實施方式中，生物標(biāo)志物量和/或活性測量值和/或比率自預(yù)定水平的改變?yōu)榧s0.5倍、約1.0倍、約1.5倍、約2.0倍、約2.5倍、約3.0倍、約3.5倍、約4.0倍、約4.5倍、或約5.0倍或更高。在一些實施方式中，倍數(shù)改變?yōu)樾∮诩s1、小于約5、小于約10、小于約20、小于約30、小于約40、或小于約50。在其它實施方式中，生物標(biāo)志物量和/或活性測量值相比于預(yù)定水平的倍數(shù)改變?yōu)榇笥诩s1、大于約5、大于約10、大于約20、大于約30、大于約40、或大于約50。生物樣本可采集自來自患者的各種來源，包括含有核酸和/或蛋白的體液樣本、細(xì)胞樣本或組織樣本?！绑w液”是指由機(jī)體排泄或分泌的液體以及正常情況下機(jī)體不排泄或不分泌的液體(例如，羊水、眼房水、膽汁、血液和血漿、腦脊液、耵聹和耳垢、考珀液或預(yù)射精液、乳糜、食糜、糞便、女性射液、間質(zhì)液、細(xì)胞內(nèi)液、淋巴液、月經(jīng)、乳汁、黏液、胸膜液、膿、唾液、皮脂、精液、血清、汗液、滑液、淚液、尿液、陰道潤滑液、玻璃體液、嘔吐物)。在一優(yōu)選實施方式中，受試者和/或?qū)φ諛颖具x自下組：細(xì)胞、細(xì)胞系、組織切片、石蠟包埋組織、活檢組織、全血、乳頭抽吸液、血清、血漿、口腔拭子、唾液、腦脊液、尿液、糞便和骨髓。在一個實施方式中，樣本是血清、血漿或尿液。在另一實施方式中，樣本是血清。又在其它實施方式中，包含t淋巴細(xì)胞的有用的生物樣本包括但不限于，全血、純化后的血、脾臟組織、淋巴液、淋巴結(jié)組織等?？稍谝豢v向時間段內(nèi)從個體重復(fù)(例如，以日、周、月、每年、每半年等的順序一次或多次)采集樣本。在一段時間內(nèi)從個體獲得許多樣本可用于驗證來自早期檢測的結(jié)果和/或用于識別由于例如疾病進(jìn)展、藥物治療等產(chǎn)生的生物特征改變。例如，可每個月、每兩個月、或根據(jù)本發(fā)明的一個、兩個或三個月間隔的組合來采集和監(jiān)測受試者的樣本。此外，經(jīng)一段時間獲得的受試者的生物標(biāo)志物量和/或活性測量量在監(jiān)測期間可便利地相互比較，以及與正常對照的那些進(jìn)行比較，從而提供用作長期監(jiān)測的內(nèi)部或個人對照的受試者的自身值。樣本制備和分離可涉及任何程序，這取決于采集樣本的類型和/或?qū)ι飿?biāo)志物測量值的分析。此類程序包括，僅舉例而言，濃縮、稀釋、ph調(diào)節(jié)、高豐度多肽(例如，白蛋白，丙種球蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白等)的去除、防腐劑和校準(zhǔn)物的添加、蛋白酶抑制劑的加入、變性劑的加入、樣本的脫鹽、樣本蛋白的濃縮、脂質(zhì)的提取和純化。樣本的制備還可分離在非共價復(fù)合物中與其它蛋白(例如，載體蛋白)結(jié)合的分子。該過程可分離結(jié)合于特定載體蛋白(例如，白蛋白)的那些分子，或使用更通用的方法，例如通過蛋白變性(例如使用酸)從所有載體蛋白釋放結(jié)合分子，然后除去載體蛋白?？墒褂酶哂H和力試劑、高分子量濾器、超速離心和/或電滲析來實現(xiàn)從樣本除去不期望的蛋白(例如、高豐度、不提供信息或不能檢測的蛋白)。高親和力試劑包括選擇性結(jié)合于高豐度蛋白的抗體或其它試劑(例如，適體)。樣本制備還可包括離子交換色譜、金屬離子親和層析、凝膠過濾、疏水層析、聚焦層析、吸附色譜、等電點聚焦和相關(guān)技術(shù)。分子量濾器包括基于尺寸和分子量大小來分離分子的膜。此類濾器可進(jìn)一步使用反滲透、納米過濾、超濾和微量過濾。超速離心是一種從樣本中除去不期望多肽的方法。超速離心是約15,000-60,000rpm下的樣本離心，同時用光學(xué)系統(tǒng)監(jiān)測顆粒的沉降(或其沉降的缺乏)。電滲析是在過程中使用電膜或半透膜的程序，其中在上述過程中在電勢梯度的影響下將離子從一種溶液運送通過半透膜至另一種溶液。因為電滲析中使用的膜可具有選擇性運送具有正電荷或負(fù)電荷的離子、排斥相反電荷的離子、或基于尺寸和電荷可允許某些種類遷移通過半透膜的能力，其使得電滲析可用于濃縮、除去或分離電解質(zhì)。本發(fā)明中的分離和純化可包括本領(lǐng)域任何已知的程序，例如毛細(xì)管電泳(例如，在毛細(xì)管中或芯片上)或?qū)游?例如，在毛細(xì)管、柱中或芯片上)。電泳是用于在電場的影響下分離離子型分子的方法。電泳可在凝膠、毛細(xì)管中，或在芯片上的微通道中進(jìn)行。用于電泳的凝膠實例包括淀粉、丙烯酰胺、聚氧化乙烯、瓊脂糖或其組合。可通過其交聯(lián)、加入清潔劑或變性劑、固定酶或抗體(親和電泳)或底物(酶譜)以及引入ph梯度對凝膠進(jìn)行修飾。用于電泳的毛細(xì)管實例包括與電噴射配合的毛細(xì)管。優(yōu)選使用毛細(xì)管電泳(ce)來分離復(fù)合親水分子和高電荷溶質(zhì)。還可在微流體芯片上實施ce技術(shù)。根據(jù)所用的毛細(xì)管和緩沖液類型，ce可進(jìn)一步分成不同的分離技術(shù)，諸如毛細(xì)管區(qū)帶電泳(cze)、毛細(xì)管等電聚焦(cief)、毛細(xì)管等速電泳(citp)和毛細(xì)管電色譜(cec)。ce技術(shù)與電噴霧離子化結(jié)合的一個實施方式涉及使用揮發(fā)性溶液，例如，包含揮發(fā)性酸和/或堿以及有機(jī)溶劑(例如，乙醇或乙腈)的水性混合物。毛細(xì)管等速電泳(citp)是其中分析物以恒速移動通過毛細(xì)管但卻通過其各自的遷移率而被分離的技術(shù)。毛細(xì)管區(qū)帶電泳(cze)，又稱自由溶液ce(fsce)，是基于種類的電泳遷移率的差異，種類的電泳遷移率是由分子上的電荷以及分子遷移期間遭遇的摩擦阻力(其通常直接與所述分子的大小成比例)決定的。毛細(xì)管等電聚焦(cief)允許通過ph梯度中的電泳分離弱電離兩性分子。cec是傳統(tǒng)高效液相色譜(hplc)和ce兩者之間的雜合技術(shù)。本發(fā)明中使用的分離和純化技術(shù)包括本領(lǐng)域已知的任何色譜程序。色譜可基于某些分析物的差別吸附和洗脫或者分析物在流動相和固定相之間的分配。色譜的不同實例包括但不限于，液相色譜(lc)，氣相色譜(gc)，高效液相色譜(hplc)等。b.用于檢測拷貝數(shù)和/或基因組核酸突變的方法評估生物標(biāo)志物核酸的拷貝數(shù)和/或基因組核酸狀態(tài)(例如，突變)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的?？赏ㄟ^確定本文識別的區(qū)域或標(biāo)志物的拷貝數(shù)來簡單評估染色體獲得或缺失的存在與否。在一個實施方式中，檢測生物樣本中包含基因組標(biāo)志物的基因座中是否存在拷貝數(shù)改變。評估生物標(biāo)志物基因座的拷貝數(shù)的方法包括但不限于，基于雜交的試驗?；陔s交的試驗包括但不限于，傳統(tǒng)“直接探針”法，例如southern印跡，原位雜交(例如，fish和fish+sky)法，和“比較探針”法，例如比較基因組雜交(cgh)，例如基于cdna或基于寡核苷酸的cgh。該方法可以各種形式使用，其包括但不限于，底物(例如，膜或玻璃)結(jié)合法或基于陣列的途徑。在一個實施方式中，評估樣本中的生物標(biāo)志物基因拷貝數(shù)涉及southern印跡(southernblot)。在southern印跡中，將基因組dna(通常在電泳凝膠上是片段化的和分離的)雜交至目標(biāo)區(qū)域特異性探針。比較來自目標(biāo)區(qū)域探針的雜交信號與來自正常基因組dna(例如，相同或相關(guān)細(xì)胞、組織、器官等的非擴(kuò)增部分)分析的對照探針信號的強(qiáng)度提供了對目標(biāo)核酸相對拷貝數(shù)的評估?；蛘呖衫胣orthern印跡(northernblot)評估樣本中編碼核酸的拷貝數(shù)。在northern印跡中，將mrna雜交至目標(biāo)區(qū)域特異性探針。比較來自目標(biāo)區(qū)域探針的雜交信號與來自正常rna(例如，相同或相關(guān)細(xì)胞、組織、器官等的非擴(kuò)增部分)分析的對照探針信號的強(qiáng)度提供了對目標(biāo)核酸相對拷貝數(shù)的評估?；蛘撸墒褂闷渌绢I(lǐng)域眾所周知的檢測rna的方法，從而使得相對于適當(dāng)對照(例如，相同或相關(guān)細(xì)胞、組織、器官等的非擴(kuò)增部分)的較高或較低表達(dá)提供了對目標(biāo)核酸相對拷貝數(shù)的評估。用于確定基因組拷貝數(shù)的一個替代手段是原位雜交(例如，angerer(1987)meth.enzymol152:649)。通常，原位雜交包括以下步驟：(1)固定待分析的組織或生物結(jié)構(gòu)；(2)預(yù)雜交處理所述生物結(jié)構(gòu)以增加目標(biāo)dna可接觸性，以及減少非特異性結(jié)合；(3)將核酸混合物雜交至所述生物結(jié)構(gòu)或組織中的核酸；(4)雜交后洗滌以除去雜交中未結(jié)合的核酸片段；和(5)檢測雜交的核酸片段。每種這些步驟中使用的試劑以及使用條件根據(jù)特定應(yīng)用而改變。在一個典型的原位雜交試驗中，將細(xì)胞固定至固相支持體，通常是載玻片。若探測核酸，則通常用熱或堿將細(xì)胞變性。然后將細(xì)胞與雜交溶液在中等溫度下接觸以允許退火針對編碼蛋白的核酸序列的經(jīng)標(biāo)記的探針。然后通常在預(yù)設(shè)的嚴(yán)格度或增加的嚴(yán)格度下洗滌目標(biāo)(例如，細(xì)胞)直至獲得適當(dāng)?shù)男旁氡?。探針通常是?jīng)標(biāo)記的，例如，采用放射性同位素或熒光報告物。在一個實施方式中，探針足夠長以便與目標(biāo)核酸在嚴(yán)格條件下特異性雜交。探針的長度范圍通常從約200個堿基至約1000個堿基。在一些應(yīng)用中，必須阻斷重復(fù)序列的雜交能力。因此，在一些實施方式中，使用trna、人基因組dna或cot-idna以阻斷非特異性雜交。用于確定基因組拷貝數(shù)的一種替代手段是比較基因組雜交。通常，基因組dna分離自正常參照細(xì)胞，以及分離自測試細(xì)胞(例如，腫瘤細(xì)胞)，若必要的話，并且進(jìn)行擴(kuò)增。將兩個核酸差異化標(biāo)記并接著原位雜交至參照細(xì)胞的中期染色體。參照和測試dna二者中的重復(fù)序列或者被除去，或者通過一些手段減小其雜交能力，例如通過與適當(dāng)?shù)淖钄嗪怂犷A(yù)雜交和/或在所述雜交期間引入針對所述重復(fù)系列的此類阻斷核酸序列。然后以可視化形式渲染結(jié)合的、標(biāo)記的dna序列(若必須的話)。通過檢測來自兩個dna的信號比率被改變的區(qū)域可識別測試細(xì)胞中具有增加或減少的拷貝數(shù)的染色體區(qū)域。例如，相比于基因組的其它區(qū)域，在測試細(xì)胞中具有減少的拷貝數(shù)的那些區(qū)域?qū)@示出相對低于對照的來自測試dna的信號。在測試細(xì)胞中具有增加的拷貝數(shù)的區(qū)域?qū)@示相對較高的來自測試dna的信號。在具有染色體缺失或增加的情況中，將檢測到來自兩種標(biāo)記的信號比率的差異，且所述比率將提供拷貝數(shù)的測量。在cgh的另一實施方式(陣列cgh(acgh))中，固定化的染色體成分被在陣列上結(jié)合目標(biāo)核酸的固相載體集所取代，允許大或完全百分?jǐn)?shù)的基因組呈現(xiàn)在結(jié)合目標(biāo)的固相載體集中。目標(biāo)核酸可包括cdna、基因組dna、寡核苷酸(例如，用于檢測單核苷酸多態(tài)性)等。基于陣列的cgh還可采用單色標(biāo)記進(jìn)行(這與如下的方法相反，采用兩種不同染料標(biāo)記對照和可能的腫瘤樣本并且在雜交前將它們混合，其將由于陣列上探針的競爭性雜交而產(chǎn)生比率)。在單色cgh中，標(biāo)記對照、將其雜交至一個陣列并閱讀絕對信號，并且標(biāo)記可能的腫瘤樣本、將其雜交至第二陣列(具有等同內(nèi)容物)并閱讀絕對信號?；趤碜詢蓚€陣列的絕對信號來計算拷貝數(shù)差異。制備固定化染色體或陣列以及進(jìn)行比較基因組雜交的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的(參見例如，美國專利號：6,335,167；6,197,501；5,830,645；和5,665,549以及albertson(1984)emboj.3:1227-1234；pinkel(1988)proc.natl.acad.sci.usa85:9138-9142；epo公開號430,402；methodsinmolecularbiology，vol.33:insituhybridizationprotocols，choo編，humanapress，totowa，n.j.(1994)等)。在另一實施方式中，使用pinkel等人，(1998)naturegenetics20:207-211，或kallioniemi(1992)proc.natlacadsciusa89:5321-5325(1992)的雜交試驗方案。在又一實施方式中，可使用基于擴(kuò)增的試驗以測量拷貝數(shù)。在此類基于擴(kuò)增的試驗中，核酸序列用作擴(kuò)增反應(yīng)(例如，聚合酶鏈反應(yīng)(pcr))中的模板。在定量擴(kuò)增中，擴(kuò)增產(chǎn)物的量將與原始樣本中模板的量成比例。與適當(dāng)對照(例如，健康組織)的比較提供了拷貝數(shù)的測量。“定量”擴(kuò)增的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。例如，定量pcr涉及使用相同引物同時共擴(kuò)增已知量的對照序列。這提供了可用于校準(zhǔn)pcr反應(yīng)的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。定量pcr的詳細(xì)試驗方案提供在innis等人，(1990)pcrprotocols，aguidetomethodsandapplications，academicpress，inc.n.y.)中。ginzonger等人，2000cancerresearch60:5405-5409中描述了使用定量pcr分析來測量微衛(wèi)星基因座處的dna拷貝數(shù)?；虻囊阎怂嵝蛄凶阋允沟帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員能夠常規(guī)選擇引物以擴(kuò)增基因的任何部分。本發(fā)明的方法中還可使用熒光定量pcr。在熒光定量pcr中，定量是基于熒光信號(例如，taqman和sybr綠)的量。其它適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增方法包括但不限于，連接酶鏈反應(yīng)(lcr)(參見wu和wallace(1989)genomics4:560，landegren等人，(1988)science241:1077，和barringer等人，(1990)gene89:117)、轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(kwoh等人，(1989)proc.natl.acad.sci.usa86:1173)、自我持續(xù)序列復(fù)制(guatelli等人，(1990)proc.nat.acad.sci.usa87:1874)、點pcr和接頭引物pcr等。還可使用雜合性丟失(loh)和主要復(fù)制比例(mcp)繪圖(wang，z.c.等人，(2004)cancerres64(1):64-71；seymour，a.b.等人，(1994)cancerres54，2761-4；hahn，s.a.等人，(1995)cancerres55，4670-5；kimura，m.等人，(1996)geneschromosomescancer17，88-93；li等人，(2008)mbcbioinform.9，204-219)以識別擴(kuò)增或缺失區(qū)域。c.用于檢測生物標(biāo)志物核酸表達(dá)的方法可通過用于檢測轉(zhuǎn)錄分子或蛋白表達(dá)的眾所周知的各種方法來評估生物標(biāo)志物的表達(dá)。此類方法的非限制性實例包括用于檢測分泌的、細(xì)胞表面、細(xì)胞質(zhì)或核蛋白的免疫方法、蛋白純化方法、蛋白功能或活性分析、核酸雜交方法、核酸逆轉(zhuǎn)錄方法、和核酸擴(kuò)增方法。在優(yōu)選實施方式中，通過測量基因轉(zhuǎn)錄(例如，mrna)、通過測量翻譯蛋白的量、或通過測量基因產(chǎn)物活性表征特定基因的活性?？梢砸愿鞣N方法監(jiān)測生物標(biāo)志物表達(dá)，包括通過檢測mrna水平、蛋白水平或蛋白活性，任意其均可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來測量。檢測可以涉及定量基因表達(dá)的水平(例如，基因組dna、cdna、mrna、蛋白、或酶活性)，或者，檢測可為對基因表達(dá)水平的定性評估，特別是與對照水平相比較?？梢酝ㄟ^上下文明確檢測到的水平的類型。在另一實施方式中，檢測或確定生物標(biāo)志物及其功能類似同源物(包括其片段或基因變異(例如，在其調(diào)節(jié)區(qū)或啟動子區(qū)中))的表達(dá)水平包括檢測或確定感興趣的標(biāo)記的rna水平。在一個實施方式中，從測試受試者獲得一種或多種細(xì)胞并從所述細(xì)胞分離rna。在一個優(yōu)選實施方式中，從受試者獲得乳腺組織細(xì)胞樣本。在一個實施方式中，rna獲得自單一細(xì)胞。例如，可通過激光捕獲顯微切割(lcm)從組織樣本分離一個細(xì)胞。使用該技術(shù)，可從組織切片(包括染色組織切片)分離一個細(xì)胞，從而確保期望的細(xì)胞被分離(參見例如，bonner等人，(1997)science278:1481；emmert-buck等人，(1996)science274:998；fend等人，(1999)am.j.path.154:61和murakami等人，(2000)kidneyint.58:1346)。例如，murakami等人，見上，描述了從先前免疫染色的組織切片分離細(xì)胞。還有可能從受試者獲得細(xì)胞并在體外培養(yǎng)細(xì)胞，以便獲得更大群體的可自其提取rna的細(xì)胞。用于建立非轉(zhuǎn)換細(xì)胞(即，原代細(xì)胞培養(yǎng))的方法是現(xiàn)有技術(shù)中已知的。當(dāng)從來自個體的組織樣本或細(xì)胞分離rna時，在組織或細(xì)胞已從受試者移出后阻止基因表達(dá)的進(jìn)一步改變可能是重要的。表達(dá)水平的改變已知在擾動(例如，熱休克或采用脂多糖(lps)或其它試劑活化)后迅速改變。此外，組織和細(xì)胞中的rna可能很快變成降解的。因此，在一個優(yōu)選實施方式中，盡快速凍獲得自受試者的組織或細(xì)胞。可通過各種方法從組織樣本提取rna，例如，硫氰酸胍溶解細(xì)胞后cscl離心(chirgwin等人，1979，biochemistry18:5294-5299)。可如在從單一細(xì)胞制備cdna文庫的方法中所描述的從單一細(xì)胞獲得rna，例如dulac，c.(1998)curr.top.dev.biol.36，245和jena等人，(1996)j.immunol.methods190:199中描述的那些。必須注意避免rna降解，例如通過包含rna酶抑制劑(rnasin)。然后可以基于特定種類富集rna樣本。在一個實施方式中，從rna樣本分離聚(a)+rna。通常，此純化利用mrna上的聚-a尾。特別且如上所關(guān)注到的，可將聚-t寡核苷酸固定在固相載體內(nèi)以用作mrna的親和配體。用于該目的的試劑盒是市售的，例如，messagemaker試劑盒(lifetechnologies，grandisland，ny)。在一個優(yōu)選實施方式中，可以基于標(biāo)記序列富集rna群體。富集的進(jìn)行可通過例如引物特異性cdna合成、或基于cdna合成的多回合線性擴(kuò)增以及模板導(dǎo)向的體外轉(zhuǎn)錄(參見例如，wang等人，(1989)pnas86，9717；dulac等人，見上，和jena等人，見上)?？蛇M(jìn)一步擴(kuò)增富集的或不在特定種類或序列中的rna群體。如本文所定義的，“擴(kuò)增程序”旨在增強(qiáng)、增加或增大rna內(nèi)的分子。例如，在rna是mrna的情況下，可利用擴(kuò)增程序(例如，rt-pcr)以擴(kuò)增mrna，以使得信號可被檢測或者增強(qiáng)檢測。當(dāng)生物、組織或腫瘤樣本是小尺寸或體積時，此擴(kuò)增程序是特別有益的。可使用各種擴(kuò)增和檢測方法。例如，以下是在本發(fā)明的范圍內(nèi)：將mrna逆轉(zhuǎn)錄為cdna，然后進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(rt-pcr)；或者，如美國專利號5,322,770中所述兩個步驟中使用單一酶，或者將mrna逆轉(zhuǎn)錄為cdna，然后進(jìn)行對稱間隙連接酶鏈反應(yīng)(rt-aglcr)，如r.l.marshall等人，pcrmethodsandapplications4:80-84(1994)所述。還可使用實時pcr。本文可利用的其它已知擴(kuò)增方法包括但不限于在pnasusa87:1874-1878(1990)中描述并還在nature350(no.6313):91-92(1991)中描述的所謂的“nasba”或“3sr”技術(shù)；如在公開的歐洲專利申請(epa)號4544610中描述的q-β擴(kuò)增；鏈置換擴(kuò)增(如g.t.walker等人，clin.chem.42:9-13(1996)和歐洲專利申請?zhí)?84315中所述；目標(biāo)介導(dǎo)擴(kuò)增，如通過pct公開wo9322461所述；pcr；連接酶鏈反應(yīng)(lcr)(參見例如，wu和wallace，genomics4，560(1989)，landegren等人，science241，1077(1988))；自我持續(xù)序列復(fù)制(ssr)(參見例如，guatelli等人，proc.nat.acad.sci.usa，87，1874(1990))；和轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(參見例如，kwoh等人，proc.natl.acad.sci.usa86，1173(1989))?，F(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)中已知許多用于確定基因表達(dá)的絕對和相對水平的技術(shù)，適用于本發(fā)明的通用技術(shù)包括northern分析、核糖核酸酶保護(hù)試驗(rpa)、基于微陣列和pcr的技術(shù)，例如定量pcr和差異顯示pcr。例如，northern印跡法涉及在變性瓊脂糖凝膠上運行rna制品，并將其轉(zhuǎn)移至適當(dāng)?shù)闹С煮w，例如活化纖維素、硝酸纖維素或者玻璃或尼龍膜。然后將放射性標(biāo)記的cdna或rna雜交至制品、洗滌并通過放射自顯影進(jìn)行分析。還可使用原位雜交可視化技術(shù)，其中使放射性標(biāo)記的反義rna探針與活檢樣本的薄片雜交、洗滌、用核糖核酸酶切割并暴露于感光乳膠用于放射自顯影。還可用蘇木精染色樣本以證實樣本的組織學(xué)組成，且采用適當(dāng)濾光器的暗場成像顯示顯影的乳膠。還可使用非放射性標(biāo)記(例如，地高辛)?；蛘?，可在dna陣列、芯片或微芯片上檢測mrna表達(dá)?？蓪@得自受試者的測試樣本的經(jīng)標(biāo)記核酸雜交至包含生物標(biāo)志物dna的固體表面。含有生物標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄物的樣本獲得陽性雜交信號。制備dna陣列的方法以及它們的應(yīng)用是本領(lǐng)域眾所周知的(參見例如，美國專利號：6,618,6796；6,379,897；6,664,377；6,451,536；548,257；u.s.20030157485和schena等人，(1995)science20，467-470；gerhold等人，(1999)trendsinbiochem.sci.24，168-173；和lennon等人，(2000)drugdiscoverytoday5，59-65，其在此通過參照整體并入本文)。還可進(jìn)行基因表達(dá)系列分析(sage)(參見例如美國專利申請20030215858)。例如，為監(jiān)測mrna水平，從待檢測的生物樣本提取mrna、逆轉(zhuǎn)錄、并生成熒光標(biāo)記的cdna探針。然后用標(biāo)記的cdna探針探測能夠雜交于標(biāo)記cdna的微陣列，掃描樣片并測量熒光強(qiáng)度。該強(qiáng)度與雜交強(qiáng)度和表達(dá)水平相關(guān)?？捎糜诒疚乃龇椒ㄖ械奶结橆愋桶╟dna、核糖核酸探針、合成寡核苷酸和基因組探針。通常特定的情形將決定所用探針的類型，例如核糖核酸探針用于原位雜交，而cdna用于northern印跡法。在一個實施方式中，探針是針對rna特有的核苷酸區(qū)域。探針可短至差異識別標(biāo)記mrna轉(zhuǎn)錄物所需的長度，并可短至例如，15個堿基；然而，可使用至少17、18、19或20或更多個堿基的探針。在一個實施方式中，引物和探針在嚴(yán)格條件下特異雜交至具有對應(yīng)于標(biāo)記的核苷酸序列的dna片段。如本文所用的，術(shù)語“嚴(yán)格條件”是指雜交將僅在具有至少95％核苷酸序列同一性的情況下發(fā)生。在另一實施方式中，當(dāng)序列之間具有至少97％同一性時發(fā)生“嚴(yán)格條件”下的雜交。探針的標(biāo)記形式可以是任意適當(dāng)?shù)男问剑缡褂梅派湫酝凰?例如，32p和35s)。通過使用適當(dāng)標(biāo)記的堿基可實現(xiàn)放射性同位素標(biāo)記，無論探針是化學(xué)還是生物合成的。在一個實施方式中，生物樣本包含來自測試受試者的多肽分子?；蛘?，生物樣本可包含來自測試受試者的mrna分子或者來自測試受試者的基因組dna分子。在另一實施方式中，該方法進(jìn)一步涉及從對照受試者獲得對照生物樣本，將對照樣本與能夠檢測標(biāo)記多肽、mrna、基因組dna，或其片段的化合物或試劑接觸，從而在生物樣本中檢測標(biāo)記多肽、mrna、基因組dna，或其片段的存在，并將對照樣本中標(biāo)記多肽、mrna、基因組dna，或其片段的存在與測試樣本中標(biāo)記多肽、mrna、基因組dna，或其片段的存在進(jìn)行比較。d.用于檢測生物標(biāo)志物蛋白表達(dá)的方法可通過檢測或定量表達(dá)的多肽來檢測和/或定量生物標(biāo)志物蛋白的活性或水平。多肽的檢測和定量可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的任意各種手段。由生物標(biāo)志物核酸及其功能類似同源物，包括其片段或基因變異(例如，在其調(diào)節(jié)區(qū)或啟動子區(qū)中)編碼的多肽的多肽表達(dá)異常水平與免疫失調(diào)響應(yīng)抗免疫失調(diào)療法(例如，多次-可變劑量il-2療法單獨使用或與一種或多種其它抗免疫失調(diào)療法組合)的可能性相關(guān)。可使用用于檢測多肽的任何現(xiàn)有技術(shù)的已知方法。此類方法包括但不限于，免疫擴(kuò)散、免疫電泳、放射免疫分析(ria)、酶聯(lián)免疫吸附測定(elisas)、免疫熒光試驗、western印跡法、粘合劑-配體(binder-ligand)試驗、免疫組織化學(xué)技術(shù)、凝集、補(bǔ)體檢測、高效液相色譜(hplc)、薄層色譜(tlc)、超擴(kuò)散色譜等(例如，basicandclinicalimmunology，sites和terr編，appletonandlange，norwalk，conn.pp217-262，1991，其通過引用并入)。優(yōu)選的是粘合劑-配體免疫測定法，其包括將抗體與一個或多個表位反應(yīng)，并競爭性置換經(jīng)標(biāo)記的多肽或其衍生物。例如，可進(jìn)行elisa和ria程序以標(biāo)記期望的生物標(biāo)志物蛋白標(biāo)準(zhǔn)(采用放射性同位素例如125i或35s，或可分析酶，例如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)，并且使其與未標(biāo)記的樣本一起與相應(yīng)的抗體接觸，其上使用第二抗體以結(jié)合第一抗體，并測定放射性或固定化酶(競爭性試驗)?；蛘撸瑯颖局械纳飿?biāo)志物蛋白可與相應(yīng)的固定化抗體反應(yīng)，放射性同位素或酶標(biāo)記的抗生物標(biāo)志物蛋白抗體可與體系反應(yīng)，并測定放射性或酶(elisa-三明治試驗)。還可在適當(dāng)時使用其它常規(guī)方法。以上技術(shù)基本上可以“一步”或“兩步”試驗的形式進(jìn)行?！耙徊健痹囼炆婕皩⒖乖c固定化抗體接觸，且未經(jīng)洗滌將混合物與經(jīng)標(biāo)記抗體接觸?！皟刹健痹囼炆婕霸趯⒒旌衔锱c經(jīng)標(biāo)記抗體接觸之前進(jìn)行洗滌。如果適合的話，還可使用其它常規(guī)方法。在一個實施方式中，用于測量生物標(biāo)志物蛋白水平的方法包括以下步驟：將生物標(biāo)本與選擇性結(jié)合生物標(biāo)志物蛋白的抗體或其變體(例如，片段)接觸，并檢測所述抗體或其變體是否結(jié)合于所述樣本并由此測量生物標(biāo)志物蛋白的水平?？赏ㄟ^常規(guī)手段實現(xiàn)生物標(biāo)志物蛋白和/或抗體的酶標(biāo)記和放射性標(biāo)記。此類手段將通常包括將酶共價連接(例如，通過戊二醛)至考慮中的抗原或抗體，特別地只要不會不利地影響酶的活性，這是指酶必須仍然能夠與其底物相互作用，雖然不需要所有的酶都是有活性的，但條件是足夠的酶仍具有活性從而允許實現(xiàn)測定。事實上，一些酶結(jié)合技術(shù)是非特異性的(例如，使用甲醛)，且將僅產(chǎn)生一定比例的活性酶。通常期望將測定體系的一個組分固定在支持物上，從而允許體系的其它組分與該組分接觸并易于除去而無需費力和費時的勞動。有可能在遠(yuǎn)離第一相處固定第二相，但一個相通常是足夠的。有可能將酶自身固定在支持物上，但如果需要固相酶，則通常最好通過將其與抗體結(jié)合并將所述抗體貼附在支持物上而實現(xiàn)，用于其的模型和體系是本領(lǐng)域公知的。簡單的聚乙烯可提供適當(dāng)?shù)闹С治?。可用于?biāo)記的酶沒有特別限制，但可選自例如氧化酶組成員。這些通過與其底物反應(yīng)催化產(chǎn)生過氧化氫，并且因為其良好的穩(wěn)定性、容易獲得和低廉價格、以及其底物(葡萄糖)的即時可獲得性，因此經(jīng)常使用葡糖氧化酶。氧化酶活性的測定可通過測量酶標(biāo)抗體與底物在本領(lǐng)域眾所周知的受控條件下反應(yīng)后形成的過氧化氫的濃度?；诒竟_，可根據(jù)從業(yè)者的傾向使用其它技術(shù)以檢測生物標(biāo)志物蛋白。一種此類技術(shù)是western印跡法(towbin等人，proc.nat.acad.sci.76:4350(1979))，其中在被轉(zhuǎn)移至固相支持體(例如，硝酸纖維素濾器)之前，在sds-page凝膠上運行經(jīng)適當(dāng)處理的樣本。然后使抗生物標(biāo)志物蛋白抗體(未標(biāo)記)與所述支持體接觸并通過第二免疫試劑例如標(biāo)記的蛋白a或抗免疫球蛋白(適當(dāng)?shù)臉?biāo)記包括125i、辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶)進(jìn)行測定。還可使用色譜檢測。免疫組織化學(xué)可用于檢測例如活檢樣本中的生物標(biāo)志物蛋白的表達(dá)。使適當(dāng)?shù)目贵w與例如細(xì)胞薄層接觸，洗滌，然后與第二經(jīng)標(biāo)記的抗體接觸。標(biāo)記可以是熒光標(biāo)記、酶，例如過氧化物酶、親和素、或放射性標(biāo)記。使用顯微鏡檢查對試驗進(jìn)行視覺評分。還可將抗生物標(biāo)志物蛋白抗體(例如，胞內(nèi)抗體)用于成像目的，例如，為了檢測受試者細(xì)胞和組織中生物標(biāo)志物蛋白的存在。適當(dāng)?shù)臉?biāo)記包括放射性同位素，碘(125i，121i)、碳(14c)、硫(35s)、氚(3h)、銦(112in)和锝(99mtc)，熒光標(biāo)記(例如，熒光素和羅丹明)，以及生物素。就體內(nèi)成像目的而言，在此情況下不能從體外檢測到抗體，因此必須標(biāo)記、或在其它方面修飾抗體以允許檢測。用于該目的的標(biāo)記可為實質(zhì)上不會干擾抗體結(jié)合，但允許外部檢測的任何標(biāo)記。適當(dāng)?shù)臉?biāo)記可包括可被x射線照相術(shù)、nmr或mri檢測的那些。對于x射線照相技術(shù)，適當(dāng)?shù)臉?biāo)記包括發(fā)出可檢測的輻射但不會明顯有害于受試者的任何放射性同位素，例如鋇或銫。用于nmr和mri的適當(dāng)?shù)臉?biāo)記通常包括具有可檢測的特征性自旋的那些，例如氘，其可通過適當(dāng)?shù)睦缦嚓P(guān)雜交瘤的營養(yǎng)素標(biāo)記并入抗體。受試者的尺寸和所用的成像系統(tǒng)將決定產(chǎn)生診斷圖像所需的成像部分的量。對于放射性同位素部分，對于人類受試者的放射性的注射量范圍將通常為約5至20毫居里的锝-99。然后，經(jīng)標(biāo)記的抗體或抗體片段將優(yōu)先蓄積在包含生物標(biāo)志物蛋白的細(xì)胞位點。隨后可使用已知技術(shù)檢測經(jīng)標(biāo)記的抗體或抗體片段?？捎糜跈z測生物標(biāo)志物蛋白的抗體包括足夠強(qiáng)力并特異性結(jié)合于待檢測的生物標(biāo)志物蛋白的任何抗體，無論其是天然或合成的、全長的或其片段、單克隆或多克隆的?？贵w可具有至多不超過約10-6m、10-7m、10-8m、10-9m、10-10m、10-11m或10-12m的kd。短語“特異性結(jié)合”是指例如抗體以如下方式結(jié)合于表位或抗原或抗原決定簇：結(jié)合可被結(jié)合相同或相似表位、抗原或抗原決定簇的第二制品所取代或競爭?？贵w可相對于其他蛋白(例如，相關(guān)蛋白)優(yōu)先與生物標(biāo)志物蛋白結(jié)合?？贵w是市售的或可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法來制備?？墒褂玫目贵w及其衍生物包含多克隆或單克隆抗體、嵌合、人類、人源化、靈長類化(cdr-接枝)、飾面或單鏈抗體以及功能片段，即，抗體的生物標(biāo)志物蛋白結(jié)合片段。例如，可使用能夠與生物標(biāo)志物蛋白或其部分結(jié)合的抗體片段，其包括但不限于fv、fab、fab'和f(ab')2片段?？赏ㄟ^酶切或通過重組技術(shù)產(chǎn)生此類片段。例如，木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割可分別生成fab或f(ab')2片段。還可使用其它具有所需底物特異性的蛋白酶來生成fab或f(ab')2片段。還可使用其中已在天然終止位點上游引入一個或多個終止密碼子的抗體基因產(chǎn)生各種截短形式的抗體。例如，可設(shè)計編碼f(ab')2重鏈部分的嵌合基因以包含編碼重鏈ch，域和鉸鏈區(qū)的dna序列。合成和工程化抗體描述在例如cabilly等人，美國專利號4,816,567；cabilly等人，歐洲專利號0,125,023b1；boss等人，美國專利號4,816,397；boss等人，歐洲專利號0,120,694b1；neuberger，m.s.等人，wo86/01533；neuberger，m.s.等人，歐洲專利號0,194,276b1；winter，美國專利號5,225,539；winter，歐洲專利號0,239,400b1；queen等人，歐洲專利號0451216b1；和padlan，e.a.等人，ep0519596a1中。還參見newman，r.等人，biotechnology，10:1455-1460(1992)，關(guān)于靈長類化抗體，和ladner等人，美國專利號4,946,778和bird，r.e.等人，science，242:423-426(1988))關(guān)于單鏈抗體。還可使用產(chǎn)生自文庫(例如，噬菌體展示庫)的抗體。在一些實施方式中，除抗體以外，可以使用與生物標(biāo)志物蛋白特異性結(jié)合的其它試劑，例如肽?？赏ㄟ^現(xiàn)有技術(shù)已知的任何手段來識別與生物標(biāo)志物蛋白特異性結(jié)合的肽。例如，可使用肽噬菌體展示庫篩選生物標(biāo)志物蛋白的特異性肽結(jié)合物。e.用于檢測生物標(biāo)志物結(jié)構(gòu)改變的方法以下說明性方法可用于識別生物標(biāo)志物核酸和/或生物標(biāo)志物多肽分子中結(jié)構(gòu)改變的存在，以便例如識別影響tregs、tcons和/或tregs:tcons比率的序列或試劑。在某些實施方式中，改變的檢測涉及使用聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)(參見例如，美國專利號4,683,195和4,683,202)，例如錨定pcr或racepcr，或者，連接酶鏈反應(yīng)(lcr)(參見例如，landegran等人，(1988)science241:1077-1080；和nakazawa等人，(1994)proc.natl.acad.sci.usa91:360-364)中的探針/引物，后者可特別有用于檢測生物標(biāo)志物核酸例如生物標(biāo)志物基因中的點突變(參見abravaya等人，(1995)nucleicacidsres.23:675-682)。該方法可包括以下步驟：從受試者采集細(xì)胞樣本，從樣本細(xì)胞分離核酸(例如，基因組核酸、mrna或二者)，將核酸樣本與在條件下特異性雜交至生物標(biāo)志物基因的一種或多種引物接觸，從而發(fā)生生物標(biāo)志物基因(若存在的話)的雜交和擴(kuò)增，以及檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的存在與否，或檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的大小并與對照樣本比較長度。預(yù)期pcr和/或lcr可令人滿意地用作初步擴(kuò)增步驟，并與本文所述的任何用于檢測突變的技術(shù)聯(lián)合使用。替代的擴(kuò)增方法包括：自我持續(xù)序列復(fù)制(guatelli，j.c.等人，(1990)proc.natl.acad.sci.usa87:1874-1878)、轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增體系(kwoh，d.y.等人，(1989)proc.natl.acad.sci.usa86:1173-1177)、q-β復(fù)制酶(lizardi，p.m.等人，(1988)bio-technology6:1197)、或任何其它核酸擴(kuò)增方法，然后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)檢測擴(kuò)增分子。如果核酸分子以非常低的數(shù)目存在，則這些檢測方案在檢測此類分子時特別有用。在一替代實施方式中，可通過限制性內(nèi)切酶切割模式的改變來識別來自樣本細(xì)胞的生物標(biāo)志物核酸中的突變。例如，將樣本和對照dna分離、擴(kuò)增(任選地)、用一種或多種限制性內(nèi)切酶消化、通過凝膠電泳確定片段長度尺寸并進(jìn)行比較。樣本和對照dna之間片段長度尺寸的差異指示樣本dna中的突變。此外，使用序列特異性核酶(參見例如，美國專利號5,498,531)可用于通過發(fā)展或缺失核酶切割位點來對特定突變的存在進(jìn)行評分。在其它實施方式中，可通過將樣本和對照核酸(例如，dna或rna)雜交至包含成百上千個寡核苷酸探針的高密度陣列來識別生物標(biāo)志物核酸中的基因突變(cronin，m.t.等人，(1996)hum.mutat.7:244-255；kozal，m.j.等人，(1996)nat.med.2:753-759)。例如，可如“cronin等人，(1996)見上”中所述在包含光生成dna探針的二維陣列中識別生物標(biāo)志物基因突變。簡而言之，可使用第一雜交探針陣列掃描樣本和對照中dna的長延伸，以通過制作連續(xù)、重疊探針的線性陣列識別序列之間的堿基改變。該步驟允許識別點突變。該步驟之后是第二雜交陣列，其通過使用互補(bǔ)于所有檢測的變體或突變的較小的、特化的探針陣列，從而能夠?qū)μ囟ㄍ蛔冞M(jìn)行表征。各突變陣列是由平行的探針集構(gòu)成，一個互補(bǔ)于野生型基因且另一個互補(bǔ)于突變基因?？稍诟鞣N背景中識別此類生物標(biāo)志物基因突變，其包括例如，種系和體系突變。在又一實施方式中，可使用本領(lǐng)域已知的任意各種測序反應(yīng)來直接測序生物標(biāo)志物基因并檢測突變，其是通過比較樣本生物標(biāo)志物的序列以及相應(yīng)的野生型(對照)序列。測序反應(yīng)的實例包括基于由maxam和gilbert(1977)proc.natl.acad.sci.usa74:560orsanger(1977)proc.natl.acadsci.usa74:5463開發(fā)的技術(shù)的那些。還預(yù)期當(dāng)進(jìn)行診斷分析時可利用任意各種自動測序程序(naeve(1995)biotechniques19:448-53)，包括通過質(zhì)譜測序(參見例如，pct國際公開號wo94/16101；cohen等人，(1996)adv.chromatogr.36:127-162；和griffin等人，(1993)appl.biochem.biotechnol.38:147-159)。用于檢測生物標(biāo)志物基因中突變的其它方法包括其中使用剪切阻止來檢測rna/rna或rna/dna異源雙鏈中的錯配堿基的方法(myers等人，(1985)science230:1242)。通常，技術(shù)“錯配剪切”開始自提供異源雙鏈，其通過包含野生型生物標(biāo)志物序列的rna或dna(經(jīng)標(biāo)記)與獲得自組織樣本的潛在突變rna或dna的雜交所形成。采用剪切雙鏈的單鏈區(qū)域的試劑處理雙鏈體，所述區(qū)域例如將由于對照和樣本鏈之間的堿基對錯配而存在。例如，可用核糖核酸酶處理rna/dna雙鏈并用si核酸酶處理dna/dna雜交體以酶促消化錯配區(qū)域。在其它實施方式中，可用羥胺或四氧化鋨并用哌啶處理dna/dna或rna/dna雙鏈以消化錯配區(qū)域。消化錯配區(qū)域后，接著在變性聚丙烯酰胺凝膠上按大小分離所得材料以確定突變位點。參見例如，cotton等人，(1988)proc.natl.acad.sci.usa85:4397和saleeba等人，(1992)methodsenzymol.217:286-295。在一個優(yōu)選實施方式中，可標(biāo)記對照dna或rna以用于檢測。在又一實施方式中，錯配剪切反應(yīng)使用一種或多種蛋白(所謂的“dna錯配修復(fù)”酶)，其用于在檢測和映射獲得自細(xì)胞樣本的生物標(biāo)志物cdna中的點突變的經(jīng)定義系統(tǒng)中識別雙鏈dna中的錯配堿基對。例如，大腸桿菌的muty酶剪切g(shù)/a錯配處的a，并且來自hela細(xì)胞的胸苷dna糖基化酶剪切g(shù)/t錯配處的t(hsu等人，(1994)carcinogenesis15:1657-1662)。根據(jù)一個示例性實施方式，可自電泳實驗方案等檢測基于生物標(biāo)志物序列的探針，例如采用dna錯配修復(fù)酶處理的野生型生物標(biāo)志物，以及剪切產(chǎn)物(若有的話)(例如，美國專利號5,459,039)。在其它實施方式中，可使用電泳遷移率的改變來識別生物標(biāo)志物基因中的突變。例如，可使用單鏈構(gòu)象多態(tài)性(sscp)來檢測突變體和野生型核酸之間電泳遷移率的差異(orita等人，(1989)procnatl.acad.sciusa86:2766；還參見cotton(1993)mutat.res.285:125-144和hayashi(1992)genet.anal.tech.appl.9:73-79)。樣本的單鏈dna片段和對照生物標(biāo)志物核酸將被變性并允許復(fù)性。單鏈核酸的二級結(jié)構(gòu)根據(jù)序列而變化，產(chǎn)生的電泳遷移率改變使得能夠檢測甚至單一堿基改變?？捎脴?biāo)記探針標(biāo)記或檢測dna片段?？墒褂胷na(而不是dna)提高試驗的敏感性，在rna中二級結(jié)構(gòu)對序列的改變更敏感。在一個優(yōu)選實施方式中，主體方法利用異源雙鏈分析來基于電泳遷移率的改變分離雙鏈的異源雙鏈分子(keen等人，(1991)trendsgenet.7:5)。在又一實施方式中，使用變性梯度凝膠電泳(dgge)分析突變體或野生型片段在包含變性劑梯度的聚丙烯酰胺凝膠的移動(myers等人，(1985)nature313:495)。當(dāng)將dgge用作分析方法時，將修飾dna以確保其不會完全變性，例如通過用pcr加入的約40bp的高熔點gc-富集dna的gc夾鉗。在進(jìn)一步的實施方式中，使用溫度梯度代替變性梯度來識別對照和樣本dna遷移率的差異(rosenbaum和reissner(1987)biophys.chem.265:12753)。用于檢測點突變的其它技術(shù)的實例包括但不限于，選擇性寡核苷酸雜交、選擇性擴(kuò)增、或選擇性引物延伸。例如，可制備寡核苷酸引物，其中將已知突變放置于中心，并接著在只當(dāng)發(fā)現(xiàn)完美匹配才允許雜交的條件下將其雜交至目標(biāo)dna(saiki等人，(1986)nature324:163；saiki等人，(1989)proc.natl.acad.sci.usa86:6230)。當(dāng)寡核苷酸連接于雜交膜并用經(jīng)標(biāo)記的目的dna雜交時，此類等位基因特異性寡核苷酸雜交至pcr擴(kuò)增的目標(biāo)dna或多種不同的突變?；蛘?，基于選擇性pcr擴(kuò)增的等位基因特異性擴(kuò)增技術(shù)可與本發(fā)明聯(lián)用。用作特異性擴(kuò)增引物的寡核苷酸可在分子中心攜帶感興趣的突變(以便進(jìn)行基于差異雜交的擴(kuò)增)(gibbs等人，(1989)nucleicacidsres.17:2437-2448)，或在一個引物的3'最末端處攜帶感興趣的突變，其中在適當(dāng)條件下可預(yù)防錯配，或減少聚合酶延伸(prossner(1993)tibtech11:238)。此外，期望在突變區(qū)域中引入新限制位點以創(chuàng)建基于剪切的檢測(gasparini等人，(1992)mol.cellprobes6:1)。預(yù)期在某些實施方式中擴(kuò)增還可使用用于擴(kuò)增的taq連接酶進(jìn)行(barany(1991)proc.natl.acad.sciusa88:189)。在此類情況下，僅當(dāng)5'序列的3'末端處具有完美匹配時才將發(fā)生連接，使得有可能通過尋找擴(kuò)增的存在與否來檢測特定位點處已知突變的存在。本文所述的組合物可用于各種與本文所述生物標(biāo)志物相關(guān)的診斷、預(yù)后和治療應(yīng)用。f.預(yù)測醫(yī)學(xué)本發(fā)明還涉及預(yù)測醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，其中使用診斷分析、預(yù)后分析和監(jiān)測臨床試驗用于預(yù)后(預(yù)測性)目的，從而預(yù)防性治療個體和/或確定療效的可能性。因此，本發(fā)明的一個方面涉及診斷分析，其用于在生物樣本(例如，血液、血清、細(xì)胞或組織)背景下確定本文所述的生物標(biāo)志物(例如，表1中所列的那些)的存在、缺失、量和/或活性水平，從而確定罹患免疫失調(diào)的個體是否可能響應(yīng)抗免疫失調(diào)療法(例如，多次-可變劑量il-2療法單獨使用或與一種或多種其它抗免疫失調(diào)療法組合)，無論是在原發(fā)或復(fù)發(fā)免疫失調(diào)中。此類分析可用于預(yù)后或預(yù)測目的，從而在失調(diào)開始之前或復(fù)發(fā)之后預(yù)防性治療個體，所述失調(diào)以生物標(biāo)志物多肽、核酸表達(dá)或活性為特征，或與之相關(guān)。技術(shù)人員將會理解，任何方法可使用一種或多種(例如，組合)本文所述的生物標(biāo)志物，例如表1中所列的那些。本發(fā)明的另一方面涉及監(jiān)測試劑(例如，藥物、化合物和基于小核酸的分子)對生物標(biāo)志物的表達(dá)或活性(例如，tregs增殖、tregs數(shù)目、tregs活性、tregs:tcons比率等)的影響。技術(shù)人員還將會理解，在某些實施方式中，本發(fā)明的方法實施計算機(jī)程序和計算機(jī)系統(tǒng)。例如，可使用計算機(jī)程序來進(jìn)行本文所述的算法。計算機(jī)系統(tǒng)還可儲存和操作由本發(fā)明的方法生成的數(shù)據(jù)，其包括多個生物標(biāo)志物信號的改變/配置文件，其可被計算機(jī)系統(tǒng)用于實施例本發(fā)明的方法。在某些實施方式中，計算機(jī)系統(tǒng)接收生物標(biāo)志物表達(dá)數(shù)據(jù)；(ii)儲存所述數(shù)據(jù)；以及(iii)以本文所述的許多種方法比較數(shù)據(jù)(例如，相對于適當(dāng)對照進(jìn)行分析)以確定獲自受免疫失調(diào)影響的組織的提供信息的生物標(biāo)志物的狀態(tài)。在其它實施方式中，計算機(jī)系統(tǒng)(i)將確定的生物標(biāo)志物表達(dá)水平與閾值進(jìn)行比較；以及(ii)輸出所述生物標(biāo)志物水平是否被顯著調(diào)節(jié)(例如，高于或低于)閾值的指標(biāo)，或基于所述指標(biāo)的表型。在某些實施方式中，此類計算機(jī)系統(tǒng)也是本發(fā)明考慮到的部分?？墒褂枚喾N類型的計算機(jī)系統(tǒng)以根據(jù)生物信息學(xué)和/或計算機(jī)領(lǐng)域技術(shù)人員所具有的知識來實施本發(fā)明的分析方法。操作此計算機(jī)系統(tǒng)期間可將若干軟件構(gòu)件載入內(nèi)存。軟件構(gòu)件可既包括本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的軟件構(gòu)件又包括本發(fā)明特別的構(gòu)件(例如，lin等人，(2004)bioinformatics20，1233-1240中描述的dchip軟件；現(xiàn)有技術(shù)已知的徑向基機(jī)器學(xué)習(xí)算法(rbm))。本發(fā)明的方法還可被編程或建模在數(shù)學(xué)軟件包中，所述數(shù)學(xué)軟件包允許方程的符號輸入和處理的高級說明(包括所使用的特定算法)，從而無需使用者程序編程個體方程和算法。此類軟件包包括例如，來自mathworks的matlab(natick，mass)、來自wolframresearch的mathematica(champaign，ill)或來自mathsoft的s-plus(seattle，wash)。在某些實施方式中，計算機(jī)包括用于儲存生物標(biāo)志物數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫。在之后的時間點可進(jìn)入和使用此類儲存的概況(profiles)以進(jìn)行感興趣的比較。例如，可儲存來源于未受免疫失調(diào)影響的受試者組織的樣本的生物標(biāo)志物表達(dá)概況和/或生成自相同物種的相關(guān)群體中提供信息的目標(biāo)基因座的基于群體分布的概況并在之后與來源于受到免疫失調(diào)影響的受試者組織或懷疑正受到免疫失調(diào)影響的受試者組織的樣本的概況進(jìn)行比較。除了本文所述的示例性程序結(jié)構(gòu)和計算機(jī)系統(tǒng)以外，其它替代的程序結(jié)構(gòu)和計算機(jī)系統(tǒng)對技術(shù)人員而言將會是顯而易見的。因此，在精神上或范圍上未脫離上述的計算機(jī)系統(tǒng)和程序結(jié)構(gòu)的此類替代系統(tǒng)也意圖被包含在隨附的權(quán)利要求內(nèi)。c.診斷分析本發(fā)明(部分)提供了用于對生物樣本是否與可能響應(yīng)抗免疫失調(diào)療法(例如，多次-可變劑量il-2療法單獨使用或與一種或多種其它抗免疫失調(diào)療法組合)的免疫失調(diào)相關(guān)進(jìn)行準(zhǔn)確分類的方法、系統(tǒng)和代碼。在一些實施方式中，本發(fā)明用于使用統(tǒng)計算法和/或經(jīng)驗數(shù)據(jù)(例如，本文所述的生物標(biāo)志物的量或活性)對與免疫失調(diào)相關(guān)或處于其風(fēng)險之中的樣本(例如，來自受試者)響應(yīng)或不響應(yīng)抗免疫失調(diào)療法(例如，多次-可變劑量il-2療法單獨使用或與一種或多種其它抗免疫失調(diào)療法組合)進(jìn)行分類。用于檢測生物標(biāo)志物的量或活性，并因此可用于對樣本是否可能或不可能響應(yīng)于抗免疫失調(diào)療法(例如，多次-可變劑量il-2療法單獨使用或與一種或多種其它抗免疫失調(diào)療法組合)進(jìn)行分類的一種示例性方法涉及從測試受試者獲得生物樣本，并將所述生物樣本與能夠檢測生物樣本中生物標(biāo)志物的量或活性的試劑接觸，所述試劑例如蛋白結(jié)合劑(如，抗體或其抗原結(jié)合片段)，或核酸結(jié)合劑(如，寡核苷酸)。在一些實施方式中，使用至少一種抗體或其抗原結(jié)合片段，其中兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種或更多種此類抗體或抗體片段可組合(例如，在三明治elisa中)或相繼使用。在某些情況下，統(tǒng)計算法是單一學(xué)習(xí)統(tǒng)計分類系統(tǒng)。例如，可使用單一學(xué)習(xí)統(tǒng)計分類系統(tǒng)來基于預(yù)測或概率值以及生物標(biāo)志物的存在或水平對樣品進(jìn)行分類。使用單一學(xué)習(xí)統(tǒng)計分類系統(tǒng)通常以至少約75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的靈敏度、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和/或總體準(zhǔn)確度將樣本分類為例如可能的抗免疫失調(diào)療法(例如，多次-可變劑量il-2療法單獨使用或與一種或多種其它抗免疫失調(diào)療法組合)響應(yīng)者或進(jìn)展者的樣本。其它適合的統(tǒng)計算法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例如，學(xué)習(xí)統(tǒng)計分類系統(tǒng)包括能夠適用于復(fù)雜數(shù)據(jù)集(例如，感興趣標(biāo)記物嵌板)并且基于此類數(shù)據(jù)集做出決策的機(jī)器學(xué)習(xí)算法技術(shù)。在一些實施方式中，使用單一學(xué)習(xí)統(tǒng)計分類系統(tǒng)例如分類樹(例如，隨機(jī)森林)。在其它實施方式中，使用2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多學(xué)習(xí)統(tǒng)計分類系統(tǒng)的組合，優(yōu)選以串聯(lián)方式。學(xué)習(xí)統(tǒng)計分類系統(tǒng)的實例包括但不限于使用歸納學(xué)習(xí)(例如，決策/分類樹如隨機(jī)森林，分類和回歸樹(c&rt)、加速樹等)、概率近似正確(pac)學(xué)習(xí)、連接學(xué)習(xí)(例如，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(nn)、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ann)、模糊神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(nfn)、網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、感知器如多層感知器、多層前反饋網(wǎng)絡(luò)、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的應(yīng)用、在信念網(wǎng)絡(luò)中的貝葉斯學(xué)習(xí)等)、強(qiáng)化學(xué)習(xí)(例如，在已知環(huán)境中的被動學(xué)習(xí)如天然學(xué)習(xí)、自適應(yīng)動態(tài)學(xué)習(xí)和即時差分學(xué)習(xí)、在未知環(huán)境中的被動學(xué)習(xí)、在未知環(huán)境中的主動學(xué)習(xí)、學(xué)習(xí)動作值函數(shù)、強(qiáng)化學(xué)習(xí)的應(yīng)用等)和遺傳算法以及進(jìn)化編程的那些。其他學(xué)習(xí)統(tǒng)計分類系統(tǒng)包括支持向量機(jī)(例如，核方法)、多元自適應(yīng)回歸樣條(mars)、列文博格-馬夸特算法、高斯-牛頓算法、高斯混合模型、梯度下降算法和學(xué)習(xí)向量量化(lvq)。在某些實施方式中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括將樣本分類結(jié)果發(fā)送至臨床醫(yī)師，例如腫瘤醫(yī)師。在另一實施方式中，診斷受試者后基于所述診斷給予個體治療有效量的經(jīng)定義治療。在一個實施方式中，該方法進(jìn)一步涉及獲得對照生物樣本(例如，來自不患有免疫失調(diào)的受試者或者來自其免疫失調(diào)敏感于抗免疫失調(diào)療法(例如，多次-可變劑量il-2療法單獨使用或與一種或多種其它抗免疫失調(diào)療法組合)的受試者的生物樣本、來自緩解期間受試者的生物樣本、或來自治療期間盡管接受抗免疫失調(diào)療法(例如，多次-可變劑量il-2療法單獨使用或與一種或多種其它抗免疫失調(diào)療法組合)但仍發(fā)展進(jìn)展免疫失調(diào)的受試者的生物樣本。d.預(yù)后分析可進(jìn)一步利用本文所述的診斷方法來識別患有可能或不可能響應(yīng)抗免疫失調(diào)療法(例如，多次-可變劑量il-2療法單獨使用或與一種或多種其它抗免疫失調(diào)療法組合)的免疫失調(diào)或處于發(fā)展其的風(fēng)險中的受試者。可利用本文所述的分析(例如，在前診斷分析或隨后分析)，來識別具有與本發(fā)明的至少一種生物標(biāo)志物的量或活性的錯調(diào)相關(guān)的失調(diào)(例如，在免疫失調(diào)中)或處于發(fā)展其的風(fēng)險中的受試者。或者，可利用預(yù)后分析來識別具有與本發(fā)明的至少一種生物標(biāo)志物的錯調(diào)相關(guān)的失調(diào)(例如，在免疫失調(diào)中)或處于發(fā)展其的風(fēng)險中的受試者。此外，本文所述的預(yù)后分析可用于確定是否可給予受試者試劑(例如，激動劑、拮抗劑、擬肽、多肽、肽、核酸、小分子、或其它侯選藥物)以治療與異常生物標(biāo)志物表達(dá)或活性相關(guān)的疾病或失調(diào)。e.治療方法本發(fā)明的另一方面涉及用于治療目的的調(diào)節(jié)本文所述的一種或多種生物標(biāo)志物(例如，treg增殖、treg數(shù)目、treg活性、treg凋亡、tregs:tcons比率、表1和實施例中所列的生物標(biāo)志物或其片段，等等)的表達(dá)或活性的方法。本發(fā)明的生物標(biāo)志物已被證實與免疫失調(diào)的治療相關(guān)聯(lián)。因此，可調(diào)節(jié)生物標(biāo)志物的活性和/或表達(dá)，以及一種或多種生物標(biāo)志物或其片段和其天然結(jié)合伴侶或其片段之間的相互作用來治療免疫失調(diào)。如上所述，本發(fā)明的調(diào)節(jié)方法涉及使細(xì)胞接觸本發(fā)明的一種或多種生物標(biāo)志物，其包括表1和實施例中所列的一種或多種生物標(biāo)志物或其片段，或調(diào)節(jié)與所述細(xì)胞相關(guān)的生物標(biāo)志物活性的一種或多種活性的試劑。調(diào)節(jié)生物標(biāo)志物活性的試劑可為如本文所述的試劑，例如核酸或多肽、自然存在的生物標(biāo)志物的結(jié)合伴侶、針對生物標(biāo)志物的抗體、針對生物標(biāo)志物的抗體和針對其它免疫相關(guān)目標(biāo)的抗體的組合、一種或多種生物標(biāo)志物激動劑或拮抗劑、一種或多種生物標(biāo)志物激動劑或拮抗劑的擬肽、一種或多種生物標(biāo)志物擬肽、其它小分子、或針對或模擬一種或多種生物標(biāo)志物核酸基因表達(dá)產(chǎn)物的小rna。調(diào)節(jié)本發(fā)明的一種或多種生物標(biāo)志物(包括本發(fā)明的一種或多種生物標(biāo)志物，包括表1和實施例中所列的一種或多種生物標(biāo)志物或其片段)的表達(dá)的試劑是例如，反義核酸分子、rnai分子、shrna、成熟mirna、pre-mirna、pri-mirna、mirna*，anti-mirna、或mirna結(jié)合位點、或其變體、或其它小rna分子、三寡核苷酸、核酶、或用于表達(dá)一種或多種生物標(biāo)志物多肽的重組載體。例如，可合成互補(bǔ)于一個或多個生物標(biāo)志物多肽翻譯起始位點周圍區(qū)域的寡核苷酸。可將一種或多種反義寡核苷酸加至細(xì)胞培養(yǎng)基(通常為200μg/ml濃度)或給予患者來阻止一種或多種生物標(biāo)志物多肽的合成。反義寡核苷酸被細(xì)胞攝取并雜交至一種或多種生物標(biāo)志物的mrna以阻止翻譯?；蛘?，可使用結(jié)合雙鏈dna的寡核苷酸，其形成三體構(gòu)造來阻止dna的解旋和轉(zhuǎn)錄。作為任一的結(jié)果，生物標(biāo)志物多肽的合成被阻斷。當(dāng)調(diào)節(jié)生物標(biāo)志物表達(dá)時，優(yōu)選地，此類調(diào)節(jié)以不同于敲除生物標(biāo)志物基因的方式發(fā)生。由于事實上控制細(xì)胞中生物標(biāo)志物的量而調(diào)節(jié)表達(dá)的試劑也調(diào)節(jié)細(xì)胞中生物標(biāo)志物活性的總量。在一個實施方式中，試劑刺激本發(fā)明的一種或多種生物標(biāo)志物的一種或多種活性，所述生物標(biāo)志物包括表1和實施例中所列的一種或多種生物標(biāo)志物或其片段。此類刺激性試劑的實例包括活性生物標(biāo)志物多肽或其片段以及已引入細(xì)胞的編碼生物標(biāo)志物或其片段的核酸分子(例如，cdna、mrna、shrnas、sirnas、小rnas、成熟mirna、pre-mirna、pri-mirna、mirna*、anti-mirna、或mirna結(jié)合位點、或其變體、或技術(shù)人員已知的其它功能等價分子)。在另一實施方式中，試劑抑制一種生物標(biāo)志物活性。在一個實施方式中，試劑抑制或增強(qiáng)生物標(biāo)志物與自然結(jié)合伴侶(一種或多種)的相互作用。此類抑制性試劑的實例包括反義核酸分子、抗生物標(biāo)志物抗體、生物標(biāo)志物抑制劑、和本文所述篩選實驗中識別的化合物。這些調(diào)節(jié)方法可在體外進(jìn)行(例如，通過將細(xì)胞與試劑接觸)或者通過將試劑與細(xì)胞在體內(nèi)接觸(例如，通過將試劑給予受試者)。在一個實施方式中，該方法涉及給予調(diào)節(jié)(例如，上調(diào)或下調(diào))生物標(biāo)志物表達(dá)或活性的試劑(例如，通過本文所述的篩選實驗識別的試劑)或試劑的組合。在另一實施方式中，該方法涉及給予一種或多種生物標(biāo)志物多肽或核酸分子作為治療，以補(bǔ)償減小、異?；虿幌胍纳飿?biāo)志物表達(dá)或活性。在其中生物標(biāo)志物被異常下調(diào)和/或增加的生物標(biāo)志物活性可能具有有益作用的情況下，期望刺激生物標(biāo)志物的活性。同樣地，在其中生物標(biāo)志物被異常上調(diào)和/或減小的生物標(biāo)志物活性可能具有有益作用的情況下，期望抑制生物標(biāo)志物的活性。此外，還可在與例如化療劑、激素、抗血管發(fā)生劑(antiangiogens)、放射性標(biāo)記的、化合物、或與外科手術(shù)、冷凍療法、和/或放射療法的組合療法中給予調(diào)節(jié)性試劑。前述治療方法的給予可連同其它形式的常規(guī)療法(例如，技術(shù)人員眾所周知的用于免疫失調(diào)的標(biāo)準(zhǔn)照護(hù)治療)，與常規(guī)療法一起或在其之前或之后連續(xù)給予。例如，這些調(diào)節(jié)性試劑可與治療有效劑量的免疫抑制劑或治療一起給予。本發(fā)明還包括用于檢測和/或調(diào)節(jié)本文所述的生物標(biāo)志物的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒還可以包括說明性材料，所述說明性材料披露或描述了如本文提供的在本發(fā)明公開的方法中使用本發(fā)明公開的試劑盒或抗體。試劑盒還可以包括附加的組分以便于實施所述試劑盒設(shè)計的特定應(yīng)用。例如，試劑盒可另外含有檢測標(biāo)記的工具(例如，用于酶標(biāo)的酶底物、檢測熒光標(biāo)記的濾光鏡套件、適合的第二標(biāo)記如綿羊抗-小鼠-hrp等)和對照所需的試劑(例如，對照生物樣本或標(biāo)準(zhǔn))。試劑盒可另外包括緩沖劑和其它被認(rèn)為可用于本發(fā)明公開的方法的試劑。非限制性實例包括降低非特異性結(jié)合的試劑，例如運載體蛋白或清潔劑。以下實施例中描述了本發(fā)明的其它實施方式。通過以下實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，其不應(yīng)被解釋為進(jìn)一步的限制。實施例實施例1:低劑量il-2增加tregs和tregs:tcons比率臨床上，低劑量il-2可增強(qiáng)treg。在類固醇難治性cgvhd的1期研究中，8-周每日皮下il-2(1x106iu/m2)療法是安全和可耐受的(劑量高至3x10iu/m2)(koreth等人，(2011)n.engl.j.med.365:2055-2066)。資格包括未響應(yīng)4周的至少0.25mg/kg強(qiáng)的松的cgvhd、不存在感染、和先前穩(wěn)定劑量的免疫抑制4周。所述研究具有1期3個劑量水平(0.3、1和3x106iu/m2/天，8天)的劑量遞增設(shè)計。累積29名參與者：28名可用于評價毒性；23名可用于評價響應(yīng)。確定mtd是1x106iu/m2/天的il-2。2名參與者發(fā)展出了劑量限制性毒性(血栓性微血管病)。無人經(jīng)歷gvhd發(fā)作。無惡性疾病復(fù)發(fā)。23名參與者中的12名具有客觀的臨床響應(yīng)。低劑量il-2選擇性增加體內(nèi)treg計數(shù)(圖1)而未影響常規(guī)cd4+t(tcon)計數(shù)。tregs:tcons比率也上升(圖2)。nk細(xì)胞計數(shù)以較小的程度上升。低劑量il-2未影響cd8+t、b或nkt計數(shù)。tregs計數(shù)和tregs:tcons比率在il-2治療8周時保持提高，然后在停止il-2后下降。il-2-誘導(dǎo)的tregs表達(dá)foxp3+并在tcons抑制試驗中是有功能的。重要的是，在12周之外的延長期限的il-2治療中臨床和免疫響應(yīng)在響應(yīng)者中得到了維持，使得伴隨產(chǎn)生的免疫抑制能夠遞減。然而，盡管在所有人中優(yōu)先體內(nèi)增強(qiáng)treg，但僅有半數(shù)的可評估參與者具有臨床響應(yīng)(部分緩解，pr)(koreth等人，(2011)n.engl.j.med.365:2055-2066)。即便采用每日皮下(sc)低劑量il-2療法，也有半數(shù)參與者未獲得臨床受益(koreth等人，(2011)n.engl.j.med.365:2055-2066)。這些數(shù)據(jù)表明低劑量il-2在cgvhd中是安全的且優(yōu)先增加treg。血漿il-2水平在固定劑量il-2治療期間迅速上升(例如，在1周時)，然后，盡管每日給予il-2，血漿il-2水平下降而tregs計數(shù)上升(matsuoka等人，(2013)sci.transl.med.5:179ra43)，且據(jù)信該結(jié)果是因為il-2與在tregs上組成性表達(dá)的高親和力il-2受體(cd25)結(jié)合而增加的il-2截留。此后，隨著treg絕對數(shù)的增加，tregs上的cd25表達(dá)在il-2治療期間具有進(jìn)一步的增加(matsuoka等人，(2013)sci.transl.med.5:179ra43)(圖3)。之前進(jìn)行了相似的分析以分析在cgvhd病程早期，在開始不可逆的實質(zhì)組織、皮膚和肌肉骨骼改變之前起始的低劑量il-2的作用。在該2期研究中，用12周程的每日scil-2以1x106iu/m2/天(即，以上所述的mtd)治療先前接受≤2線程的cgvhd療法的患者。間斷4周后，經(jīng)歷臨床受益的患者可接受延長期限的il-2治療，在此期間允許伴隨的免疫抑制遞減。主要目標(biāo)是確定cgvhd臨床響應(yīng)率。患者在研究的基線、6、12和16周時以及1年時按照nih標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行cgvhd評估(filipovich等人，(2005)biol.bloodmarrowtransplant.11:945-956)。次要目標(biāo)包括在1年時評估毒性、免疫影響、免疫作用與臨床響應(yīng)的相關(guān)性和皮質(zhì)類固醇的使用。招募具有中位數(shù)4處cgvhd涉及位點和中位數(shù)1項在先cgvhd療法的35名患者。如上所述，低劑量il-2治療通常是良好耐受的且無患者惡性腫瘤復(fù)發(fā)。在12周時，在33名可評價的患者中的20名中記錄了cgvhd客觀反應(yīng)(pr)且2名患者具有cgvhd進(jìn)展。cgvhd反應(yīng)位點包括皮膚(n＝9)；關(guān)節(jié)/筋膜/肌肉(n＝3)；肝(n＝7)；胃腸道(n＝3)；泌尿生殖道(n＝1)；和肺(n＝5)。具有臨床受益(pr或有輕度響應(yīng)的sd)的23名患者在16周后開始延長的il-2治療，截至12/31/2013，在中位數(shù)5.8個月(范圍，0.4-26.1)的延長期限的il-2治療期間具有平均50％的類固醇劑量遞減(范圍，0-100)。14名仍然處于延長期限的il-2治療中。在免疫學(xué)上，與上述結(jié)果相似，低劑量il-2誘導(dǎo)相似的tregs計數(shù)上升而不影響tcons，且中位treg:tcon比率上升(圖4)。treg計數(shù)和treg:tcon比率在12周時仍然提高且在停止il-2后下降。該2期試驗證實了低劑量il-2在cgvhd中的臨床影響以及其對treg和tcon體內(nèi)平衡的功能效應(yīng)。進(jìn)行中的實驗室研究將確定免疫效應(yīng)是否可與臨床響應(yīng)相關(guān)聯(lián)以及它們在低劑量il-2療法后持續(xù)的程度。本文已進(jìn)一步確定在所有treg亞群中開始il-2誘導(dǎo)方案后1周伴隨tregs群體規(guī)模的增加發(fā)生tregs峰值增殖。選擇使用spade(密度歸一化事件的生成樹級數(shù)分析(spanning-treeprogressionanalysisofdensity-normalizedevents))的飛行時間質(zhì)譜(cytof)，因為cytof避免了熒光細(xì)胞計數(shù)法中由于光譜重疊和自發(fā)熒光而固有的背景噪聲，并提供了高達(dá)37種鑭系元素同位素同時用于以高敏感性測量抗原結(jié)合抗體或其它探針。關(guān)于tregs增殖，在基線處觀測到局限于活化記憶和初始treg的小亞群的有限ki-67增殖。開始il-2后1周，在所有treg亞群中發(fā)生tregs增殖峰值同時伴隨tregs群體規(guī)模的增加(圖5)。然而，tregs增殖在2周后平息，在il-2治療的第12周，在擴(kuò)大的treg亞群得到保留的同時ki-67表達(dá)(增殖)下降。然而，il-2停止后4周，ki-67treg增殖水平和treg群體耗盡。使用pstat5和foxp3標(biāo)志物觀測到相似的tregs活化時間分布模式，其在各treg亞群具有最初早期普遍的增加，之后在il-2治療期間，盡管繼續(xù)保持了增大的treg群體規(guī)模但tregs的活化平息(圖5)。然后在il-2停止后4周觀測到treg活化標(biāo)志物表達(dá)的下降和treg群體的大量耗盡。并非所有患者均響應(yīng)且響應(yīng)者中的受益經(jīng)常是部分的。在1期數(shù)據(jù)中，cgvhd臨床響應(yīng)似乎與研究進(jìn)入時較高的treg:tcon比率相關(guān)，但不與循環(huán)treg計數(shù)或treg:tcon比率的上升相關(guān)。在一些患者中盡管增強(qiáng)了體內(nèi)treg卻缺乏臨床響應(yīng)，這也與我們記錄晚期cgvhd中treg細(xì)胞內(nèi)在缺陷(例如，縮短的端粒)的數(shù)據(jù)相一致(kawano等人，(2011)blood118:5021-5030)。此外，一旦停止il-2則treg的增強(qiáng)快速減弱，表明具有深厚treg缺陷的晚期cgvhd患者需要附加的干預(yù)以進(jìn)一步增加treg數(shù)目和功能并延遲或阻止其下降。本文已確定此類附加的干預(yù)包括維持方案，其涉及在誘導(dǎo)血漿il-2水平后進(jìn)行個體患者il-2劑量遞增以更充分地恢復(fù)血漿il-2水平并進(jìn)一步擴(kuò)大treg增殖、活化和新生，而不誘導(dǎo)tcon活化或過度不良事件。據(jù)信因為treg細(xì)胞組成性表達(dá)有助于形成高親和力il-2受體的cd25，所以盡管持續(xù)每日il-2給藥但il-2的截留增加且血漿il-2水平下降。此外，il-2誘導(dǎo)treg上增加的cd25表達(dá)，其進(jìn)一步增加il-2攝取。il-2誘導(dǎo)treg增殖、pstat5和foxp3treg活化。事實上，rtetreg的生成在il-2療程的后期下降，這與血漿il-2水平的下降相一致。以這種方式，il-2誘導(dǎo)的treg增強(qiáng)在體內(nèi)發(fā)生，并且避免了被增加數(shù)目的具有較高cd25表達(dá)的循環(huán)treg結(jié)合后血漿il-2水平減小所導(dǎo)致的快速耐受。這些方法克服了盡管采用低劑量il-2在體內(nèi)增加treg卻觀察到的部分臨床cgvhd響應(yīng)。在預(yù)期血漿il-2水平下降的時候進(jìn)行個體患者il-2劑量遞增提供了一種用以恢復(fù)il-2水平并進(jìn)一步擴(kuò)大treg的增殖和活化，而不誘導(dǎo)tcon活化或全身性不良事件(constitutionalae)的機(jī)制。此外，本文已確定treg庫的顯著增強(qiáng)是各機(jī)制中的一種，通過該機(jī)制低劑量il-2增強(qiáng)t細(xì)胞耐受和抑制免疫介導(dǎo)的體內(nèi)炎癥，并進(jìn)一步證明低劑量il-2對體內(nèi)tregs的選擇性作用。特別地，使用t細(xì)胞受體(tcr)測序(adaptivebiotechnologies，seattle，wa；在萬維網(wǎng)immunoseq.com上可獲得)來查文庫的多樣性(robins等人，(2012)j.immunol.methods375:14-19；robins等人，(2009)blood114:4099-4107；robins等人，(2010)sci.transl.med.2:47ra64)。該分析利用針對45個vβ和所有13個jβ片段的引物，采用多重pcr來擴(kuò)增tcr的重排cdr3區(qū)，其跨越經(jīng)由連接v、d和j片段及其相關(guān)的無模板插入而形成的可變區(qū)。使用tcr序列的數(shù)目和頻率來表征如通過熵所測量的t細(xì)胞庫的多樣性，其中較高的熵分值反映出各樣本的tcr頻率內(nèi)較大的對數(shù)多樣性。tcr序列分析還能夠在一段時間內(nèi)的系列患者樣本中追蹤個體t細(xì)胞克隆。cgvhd患者中的結(jié)果表明在低劑量il-2治療后tregtcr多樣性具有2-3個對數(shù)增加且tcon多樣性無改變(圖6)。當(dāng)將數(shù)據(jù)結(jié)合時，圖7顯示了響應(yīng)性的預(yù)測，因此根據(jù)tregs:tcons的基線或1周時的比率將預(yù)測的響應(yīng)分層。本文還確定了在bh-3概況分析中，il-2治療將tregs的外源性和內(nèi)源性通路程序性凋亡敏感性恢復(fù)至更生理學(xué)的水平。實施例2:代表性的多次-可變劑量il-2治療方案以下提供了本發(fā)明的多次-可變劑量il-2治療方法的代表性、非限制性實施方式。使用以下患者群體標(biāo)準(zhǔn)：1)具有慢性gvhd且對系統(tǒng)性類固醇響應(yīng)不足的成人和小兒參與者；2)盡管接受至少2種在前系統(tǒng)性治療(包括類固醇)的持續(xù)或復(fù)發(fā)性慢性gvhd；3)無不受控制的活動性感染；4)無惡性疾病復(fù)發(fā)；和5)卡氏行為狀態(tài)評分(karnofskyps)≥60。以下詳述了特定的入選和排除標(biāo)準(zhǔn)：1)參與者數(shù)目：20(10名成人；10名小兒)；2)研究設(shè)計和方法學(xué)：具有難治性cgvhd的成人(n＝10)和小兒(n＝10)患者將接受在每名患者中每2周遞增的每日scil-2劑量，共3個劑量水平(在不存在dlt或嚴(yán)重的非dltae的情況下)，并在他們的個體mtd下維持6周。3)i期安全性和有效性分析如下：主要終點是個體患者劑量遞增的il-2的安全性、毒性和mtd。次要終點是個體患者劑量遞增的il-2的臨床和免疫影響，其包括1)在難治性cgvhd中免疫影響的評估；2)臨床cgvhd響應(yīng)的評估；和3)免疫效應(yīng)與臨床響應(yīng)的相關(guān)性，以及與固定劑量il-2治療患者的免疫和臨床響應(yīng)的比較。評估(8周時)如下：1)評估嚴(yán)重血液毒性；2)評估3級或更高級非血液毒性；3)評估危及生命的感染；4)評估免疫影響；和5)評估gvhd響應(yīng)或進(jìn)展。參與者在8周研究期間可繼續(xù)先前開始的cgvhd治療。這些試劑的特定劑量和日程對于所述研究的目標(biāo)而言是不重要的，且允許按照機(jī)構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行劑量調(diào)整(例如，基于藥物水平進(jìn)行調(diào)整)。雖然在8周研究期間通常無意于遞減伴隨的cgvhd治療，但如果經(jīng)治療醫(yī)師認(rèn)定是臨床必需的，則允許進(jìn)行此類改變。在研究進(jìn)入和8周時記錄類固醇的劑量。利用治療之前、期間和之后獲得的外周血樣來評估治療的免疫效應(yīng)。此類研究包括：1)淋巴細(xì)胞亞群的表型分析：用特異性識別淋巴細(xì)胞標(biāo)志物的單克隆抗體與外周血的共孵育物來識別功能不同的淋巴細(xì)胞亞群。在用直接綴合熒光染料的單克隆抗體培養(yǎng)外周血細(xì)胞后，通過流式細(xì)胞術(shù)計數(shù)個體亞群。產(chǎn)生針對cd4+tregs、以及其它cd4和cd8t細(xì)胞亞群、b細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的抗體面板。該表型分析提供了一種定量評估胸腺再生以及表型上定義明確的t細(xì)胞亞群的增殖和程序性凋亡敏感性的方法。這些允許測量響應(yīng)劑量遞增il-2療法的各t細(xì)胞群體的穩(wěn)態(tài)平衡。在結(jié)合ecp的研究中，這些改變與ecp處理細(xì)胞的劑量相關(guān)，其是通過流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞計數(shù)來自各ecp程序的回輸血沉棕黃層來確定的。2)血漿細(xì)胞因子：使用elisa試驗以測量血漿樣本中的il-2水平。如果需要的話，也可在這些樣本中測量在t細(xì)胞體內(nèi)平衡中發(fā)揮作用的其它細(xì)胞因子，例如il-7、il-10和il-15。3)功能分析：為評估針對治療產(chǎn)生響應(yīng)而體內(nèi)擴(kuò)張的treg細(xì)胞的功能容量，使用選定的樣本以評估它們的免疫抑制能力。在這些實驗中，通過高速細(xì)胞分選純化tregs，并隨后測試其抑制自體t細(xì)胞增殖的能力。4)dna分析：可考慮附加的基因分析(例如，tcr測序)以評估免疫細(xì)胞重建，且可就此類分析評估庫存的dna和細(xì)胞樣本。這些試驗合起來量化個體患者il-2劑量遞增對參與者免疫細(xì)胞的影響。根據(jù)以下合格標(biāo)準(zhǔn)選擇參與者：1)7-8/8hla-匹配的(hla-a，-b，-c，-drb1)同種異體造血干細(xì)胞移植的接受者；和2)參與者必須是盡管使用2種或多種治療卻具有類固醇難治性的cgvhd。類固醇難治性cgvhd被定義為盡管使用≥0.25mg/kg/天(或每隔一日0.5mg/kg)的強(qiáng)的松至少4周(或等價劑量的替代糖皮質(zhì)激素)卻具有持續(xù)的cgvhd體征和癥狀(表2和3)，沒有完全消退體征和癥狀?；加行枰到y(tǒng)治療的廣泛或有限的慢性gvhd的參與者是適合的。表2明確的和可能的cgvhd臨床表現(xiàn)表3慢性gvhd癥狀評分量表你在過去2周是否具有任意以下問題？招募之前接受4周穩(wěn)定劑量的糖皮質(zhì)激素。招募之前4周未加入或減去其他免疫抑制藥物(例如，鈣調(diào)磷酸酶-抑制劑、西羅莫司、嗎替麥考酚酯)。免疫抑制藥物的劑量可基于該藥物的治療范圍進(jìn)行調(diào)整。參與者必須具有如下定義的足夠的器官功能：1)肝:足夠的肝功能(總膽紅素≤2.0mg/dl-在患有g(shù)ilbert綜合征的參與者中允許例外；ast(sgot)/alt(sgpt)≤2x機(jī)構(gòu)(institutional)uln)，除非肝功能缺陷是推測的cgvhd的表現(xiàn)。對于將具有異常的肝功能檢查(lfts)作為cgvhd的唯一表現(xiàn)的參與者，將需要在招募之前在肝活檢組織上有記錄在案的gvhd。若治療醫(yī)師將異常lfts記錄為與肝cgvhd相符，則涉及其他器官系統(tǒng)的活性cgvhd背景下的異常lfts也是允許的，且在該情況下不強(qiáng)制進(jìn)行肝活檢；2)肺:fev1≥50％或dlco(hb)≥40％預(yù)測值，除非肺功能障礙被認(rèn)為是由于慢性gvhd；3)腎:血清肌酐≤機(jī)構(gòu)uln或?qū)τ诩◆皆跈C(jī)構(gòu)正常值之上的參與者肌酐清除率>60ml/min/1.73m2；4)無論其血清肌酐水平如何，小兒患者必須具有≥60ml/min/1.73m2的肌酐清除率；5)通過以下指示的足夠的骨髓功能：嗜中性粒細(xì)胞絕對計數(shù)(anc)≥1000/mcl和血小板≥50,000/mcl，無生長因子或輸血；6)心臟:招募之前6個月內(nèi)無心肌梗死或nyhaiii或iv級心力衰竭、不受控制的心絞痛、嚴(yán)重不受控制的室性心律失常、或急性缺血或主動傳導(dǎo)系統(tǒng)異常的心電圖證據(jù)。研究進(jìn)入之前，篩查時的任何ecg異常必須是研究者記錄為非醫(yī)學(xué)相關(guān)的；7)karnofsky/lansky表現(xiàn)狀態(tài)≥60％(表4)；表4表現(xiàn)狀態(tài)標(biāo)準(zhǔn)karnofsky和lansky表現(xiàn)評分預(yù)期為10的倍數(shù)*將lansky轉(zhuǎn)換為ecog量度僅是用于nci報告目的。8)年齡≥2歲。根據(jù)機(jī)構(gòu)經(jīng)驗和公開的報道，cgvhd在年齡小于2歲的兒童中的發(fā)生率是非常低的(zecca等人，(2002)blood100:1192-1200)。每日sc注射低劑量il-2已用于低至2歲的小兒hsct后患者(ladenstein等人，(2011)j.clin.oncol.29:441-448)。在年輕小兒群體中，伴隨內(nèi)置sc導(dǎo)管的使用，長期每日sc注射其它藥物例如低分子量肝素和胰島素是通常給予的并良好耐受；9)il-2對發(fā)育中的人類胎兒的作用是未知的。因為該原因且因為已知化療劑是致畸的，具有懷胎和稱為孩子父親的可能性的(有生育能力的)參與者必須同意在研究進(jìn)入之前和參與研究期間使用充分避孕(激素或屏障的生育控制方法；禁欲)。當(dāng)女性或她的伴侶參與該研究時若其受孕或疑似受孕，則應(yīng)當(dāng)立即告知其治療醫(yī)師。在該試驗方案中治療或招募的男性也必須同意在研究之前、在研究參與期間和在完成il-2給予后4個月使用充分避孕；以及10)參與者或他們的父母/法律授權(quán)代表對簽署書面知情同意書具有理解能力和/或意愿。根據(jù)以下排除標(biāo)準(zhǔn)排除參與者：1)具有>1mg/kg/天(或等價物)的持續(xù)強(qiáng)的松(等價物)劑量需求的參與者；2)同時使用鈣調(diào)磷酸酶-抑制劑加上西羅莫司的參與者(單獨的任一試劑是可接受的)；3)之前4周內(nèi)開始新的免疫抑制藥物、體外光分離置換或利妥昔單抗治療的參與者；4)之前100天內(nèi)移植后暴露于供體淋巴細(xì)胞輸注(dli)，或者t細(xì)胞或il-2靶向藥物治療(例如，atg、阿倫單抗、巴利昔單抗、地尼白介素-白喉毒素連接物(denileukindiftitox))的參與者；5)招募之前4周內(nèi)其它研究藥物，除非被項目負(fù)責(zé)人放行了的(cleared)。4周前停止的先前固定劑量的il-2治療是允許的；6)具有活性惡性腫瘤復(fù)發(fā)或他們的在先血液紊亂復(fù)發(fā)的參與者；7)不能遵從il-2治療方案的參與者；8)器官移植(同種異體移植)接受者；9)處于聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的hiv-陽性個體是不適合的，因為與同種異體hsct后使用的試劑有藥代動力學(xué)相互作用的可能性。此外，這些個體處于增加的致命感染的風(fēng)險中。當(dāng)指示時在接受聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的參與者中進(jìn)行適當(dāng)?shù)难芯浚?0)與il-2具有相似的化學(xué)或生物組成的化合物的嚴(yán)重過敏反應(yīng)史；11)不受控制的并發(fā)疾病，其包括但不限于，進(jìn)行性或活動性感染、有癥狀的充血性心力衰竭、不穩(wěn)定性心絞痛、心律失常，或?qū)⑾拗谱袷匮芯啃枨蟮木窦膊?社會環(huán)境；12)具有活動性不受控制的乙型肝炎或丙型肝炎的個體是不適合的，因為他們處于hsct后致命的治療相關(guān)的肝毒性的高風(fēng)險中；和13)因為致畸或墮胎作用的可能性而從該研究排除孕婦。因為在乳兒中具有承繼于接受治療的母親的未知但潛在的不良事件風(fēng)險，所以應(yīng)停止母乳哺育。根據(jù)以下治療方案治療受試者：各參與者接受每日皮下il-2用于自我給藥共8周。對于各參與者的初始招募，成人或小兒劑量酌情是在il-2劑量水平a。按照以下計劃(表5)，在不存在dlt或嚴(yán)重非dltae的情況下，各成人和小兒參與者(各自n＝10)在第2周逐步增加每日scil-2劑量(至劑量水平b)和4周時逐步增加每日scil-2劑量(至劑量水平c)，并以mtdil-2持續(xù)共4周。預(yù)期兒童相比于成人具有增加的il-2誘導(dǎo)的胸腺treg生成，且因此可能需要較少的il-2。在基線處和il-2治療期間獲得系列的患者pbmc樣本以監(jiān)測治療效應(yīng)。簡而言之，它們包括測量treg、tcon、cd8、b、nk和dc，以及血漿細(xì)胞因子水平(例如il-2、il-7、il-10、il-15)。il-2的免疫影響的詳細(xì)評估集中于treg和tcon的體內(nèi)平衡。等分的treg富集產(chǎn)品和患者pbmc經(jīng)tcr測序。表5成人群體(n＝10)il-2劑量水平(iu/m2/天)劑量水平a(起始劑量)0.67x106劑量水平b1.35x106劑量水平c2x106小兒群體(n＝10)il-2劑量水平(iu/m2/天)劑量水平a(起始劑量)0.33x106劑量水平b0.67x106劑量水平c1x106伴隨il-2繼續(xù)給予強(qiáng)的松(或等價類固醇)和其它cgvhd試劑，通常無劑量遞減。然而，若認(rèn)為符合參與者的利益(例如類固醇毒性)，則在治療醫(yī)師的裁量下允許遞減強(qiáng)的松。若必須在8周前遞減強(qiáng)的松，則在遞減時進(jìn)行‘8周等價’cgvhd評估以記錄反應(yīng)。值得注意的是，8周之前cgvhd的進(jìn)展若是在其它免疫抑制療法遞減期間，則不認(rèn)為其是毒性或缺乏功效的證據(jù)。延長期限的治療：完成研究期(8周il-2研究治療)后，允許經(jīng)歷臨床受益(完全或部分反應(yīng)；以及不符合nih部分反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的微反應(yīng))并具有可接受的毒性概況的參與者在治療醫(yī)師的裁量下繼續(xù)延長期限的il-2治療。每6個月的延長il-2治療后再評估參與者以確定是否應(yīng)在治療醫(yī)師的裁量下繼續(xù)il-2治療，該治療醫(yī)師記錄繼續(xù)il-2治療的理由。進(jìn)行延長期限的il-2治療的參與者可評估i期毒性終點。延長期限的il-2期間其它免疫抑制藥物的遞減是由治療醫(yī)師裁量。在治療醫(yī)師的裁量下，繼續(xù)進(jìn)行延長期限的治療的參與者允許加入其它cgvhd治療以增強(qiáng)反應(yīng)。在可歸因于il-2的毒性事件中，在治療醫(yī)師的裁量下允許進(jìn)行劑量改變。在進(jìn)行延長期限的il-2治療時的以下日程評估參與者：1)每4周(±2周)門診隨訪和實驗室(cbc、肌酐、alt、ast、總膽紅素)評估il-2的毒性和臨床受益。2)每8周(±2周)免疫試驗，其包括定量血清免疫球蛋白；血漿儲存入庫；和其他單核細(xì)胞的儲存。3)每16周(±4周)cgvhd評估(11.1節(jié))和cgvhd癥狀記分表直至開始il-2治療1年或參與者停止il-2治療，取其先到期者。在小兒患者中采血用于研究目的：對于小兒患者中的免疫學(xué)研究，各次抽血時采集的血液體積不超過30ml或3ml/kg，取較小值。該體積是在用于研究目的的最大可允許總抽血體積之內(nèi)。按照機(jī)構(gòu)指南，用于研究目的的抽血每周發(fā)生頻率不超過2次。此外，基于患者的體重，遵從機(jī)構(gòu)指南關(guān)于28日周期內(nèi)用于研究目的可抽血體積的限制。在治療所有參與者之前2周內(nèi)進(jìn)行以下評估：1)病史和治療患者疾病的基本原理的文檔(包括類固醇劑量)；2)體格檢查，包括生命體征、體重、表現(xiàn)狀況；3)cgvhd評估；4)生育潛能女性的妊娠試驗；5)傳染性疾病標(biāo)記測試；6)血液學(xué)：具有分類的全血細(xì)胞計數(shù)(cbc)；7)血清化學(xué)：葡萄糖、bun、肌酐、總膽紅素、尿酸、堿性磷酸酶、ldh、總蛋白、白蛋白、ast、alt、和鈣；8)小兒患者必須具有通過24小時尿采集或核醫(yī)學(xué)腎小球濾過率(gfr)研究所測量的基線肌酐清除率；9)甲狀腺功能測試(tsh，t4，游離-t4)；10)cmv病毒載量；和11)免疫學(xué)：定量血清免疫球蛋白；血漿存儲入庫；和其他單核細(xì)胞儲存。除非另有指明，否則在治療具有涉及特定器官系統(tǒng)的cgvhd的參與者之前2周內(nèi)需要以下評估：1)采用希曼試驗(schirmer’stest)的眼部檢查，對于具有眼部cgvhd的參與者(可選的)；2)皮膚病學(xué)評估(±成人活檢)，對于具有皮膚cgvhd的參與者；3)口腔檢查(±成人活檢)，對于具有口腔cgvhd的參與者(可選的)；4)肺功能測試，對于具有肺部cgvhd臨床表現(xiàn)的參與者；5)受影響關(guān)節(jié)的屈曲評估，對于具有與cgvhd相關(guān)的攣縮或肌肉骨骼涉及的個體；6)治療期間評估(結(jié)束1、2、3、4、5、6、8周)；7)病史和臨床檢查；8)與病史和臨床檢查同日進(jìn)行的毒性評估；9)血液學(xué)：具有分類的cbc；10)血清化學(xué)：葡萄糖、bun、肌酐、尿酸、總膽紅素、堿性磷酸酶、ldh、總蛋白、白蛋白、ast、alt、和鈣；11)cmv病毒載量；12)免疫學(xué)：定量免疫球蛋白；血漿存銀；和附加單核細(xì)胞儲存；和13)甲狀腺功能測試(tsh、t4、游離-t4)(8周)。對于具有涉及特定器官的cgvhd的參與者，除非另有指明，否則在結(jié)束8周的研究治療時以及在類固醇遞減時(若更早的話)需要以下評估(除了cgvhd癥狀評分以外)：1)類固醇劑量；2)采用希曼試驗的眼部檢查，對于具有眼部cgvhd的參與者(可選的)；3)皮膚病學(xué)評估(±成人活檢)，對于具有皮膚cgvhd的參與者；4)口腔檢查(±成人活檢)，對于具有口腔cgvhd的參與者(可選的)；5)肺功能測試，對于具有肺部cgvhd臨床表現(xiàn)的參與者；和6)受影響關(guān)節(jié)的屈曲評估，對于具有與cgvhd相關(guān)的攣縮或肌肉骨骼涉及的個體。以下是il-2給予的細(xì)節(jié)：重組人il-2(阿地白介素)(公司&prometheuslabs公司)是由prometheuslaboratories公司提供。重組人il-2是以意圖用于靜脈內(nèi)(iv)給予的包含22miu阿地白介素的一次性藥瓶中的無菌、白色至灰白色凍干餅的形式提供。對于22百萬國際單位(miu)藥瓶，當(dāng)用1.2ml無菌注射用水(swfi)重構(gòu)時，每ml包含18miu(1.1mg)il-2、50mg甘露醇和～180mcg十二烷基硫酸鈉，用～170mcg磷酸二氫鈉和890mcg磷酸氫二鈉緩沖至ph7.5(范圍:7.2-7.8)。重構(gòu)后，所得溶液應(yīng)為澄清、無色至淡黃色液體。不同于所述的那些的重構(gòu)和稀釋程序可能改變il-2的遞送和/或藥理學(xué)并且是不推薦的。proleukin是未防腐的無菌制品。在2-8℃(36-46°f)下冷藏庫中儲存凍干il-2的藥瓶。不要在標(biāo)簽上所印的有效期外使用。藥瓶應(yīng)僅被進(jìn)入一次用于重構(gòu)以最小化污染的機(jī)會。若不立即使用，使用中儲存時間應(yīng)正常不長于2-8℃下24小時，除非重構(gòu)已在層流氣流罩中受控和確認(rèn)的無菌條件下進(jìn)行。當(dāng)根據(jù)指示重構(gòu)和稀釋時，il-2當(dāng)儲存在冷藏和室溫[2-25℃(36-77°f)]下時，在塑料袋(例如，pvc袋)中穩(wěn)定達(dá)48小時。經(jīng)重構(gòu)和稀釋的溶液應(yīng)儲存在2-8℃下的冷藏庫中。不要冷凍。應(yīng)目視檢查產(chǎn)品的微粒物質(zhì)或變色并在給予前將其帶至室溫。當(dāng)合格的醫(yī)護(hù)專業(yè)人員在無菌條件下制備用于日常使用的一次性注射器(按照研究者的手冊(chironcorporation，2003年9月10日，113頁)時，數(shù)據(jù)支持經(jīng)重構(gòu)稀釋il-2制品(用swfi重構(gòu)并進(jìn)一步用d5w稀釋)的穩(wěn)定性和無菌性以及用swfi重構(gòu)但未進(jìn)一步稀釋的產(chǎn)品的穩(wěn)定性和無菌性直至2-8℃(36-46°f)下14天。因此，若在受控和確認(rèn)的條件下使用層流氣流罩進(jìn)行重構(gòu)和稀釋，制備并在2-8℃(36-46°f)下儲存的一個或多個劑量需在14天內(nèi)使用。應(yīng)采用無菌注射用水(swfi)加上d5w重構(gòu)il-2。由于增加的聚集，應(yīng)避免采用抑菌注射用水或0.9％注射用氯化鈉重構(gòu)或稀釋。包含經(jīng)重構(gòu)和稀釋溶液的單一日用注射器應(yīng)儲存在2-8℃下的冷藏庫中。不要冷凍。應(yīng)目視檢查產(chǎn)品的微粒物質(zhì)或變色并在給予前將其帶至室溫。在用1.2mlswfi和4.8mld5w稀釋22miuil-2藥瓶(最終il-2濃度＝3.6miu/ml)后，應(yīng)同時在藥房中制備用于日常sc門診使用的全部il-2注射器，并應(yīng)立即丟棄任何剩余的產(chǎn)品。重構(gòu)期間應(yīng)使swfi沿藥瓶側(cè)面以避免起泡，并應(yīng)溫和旋動藥瓶的內(nèi)容物。應(yīng)不振搖藥瓶。重構(gòu)后，將在一次性注射器中(若需要的話在冷袋中)提供達(dá)2周的il-2供應(yīng)，用于家用冰箱2-8℃下儲存。在家sc自我給藥期間將每日使用一個一次性注射器，并將其丟棄在提供的利器容器中。在家、門診或住院背景下可通過每日皮下注射自我給藥il-2。參與者將被推薦輪換注射部位。藥劑師(或藥劑師監(jiān)督下的指派人員)在無菌條件下制備藥物?；隗w表面積(bsa)確定給予的藥物量(以iu為單位)。使用dubois公式(表3)或等價的小兒替代公式基于體重計算bsa。應(yīng)基于研究進(jìn)入時的體重計算劑量。本文描述了隨后的劑量改變(若有的話)。未給予靜脈推注或團(tuán)注(bolus)。在首次il-2劑量或之后劑量之前無需前用藥。表6:體表面積(bsa)和肌酐清除率應(yīng)使用獲得以下以平方米(m2)為單位的結(jié)果的dubois公式計算體表面積(bsa)：bsa＝(w0.425xh0.725)x0.007184其中重量是以千克為單位而高度是以厘米為單位?？墒褂萌缦碌腸ockroft-gault方程式計算肌酐清除率(crcl)：對于女性，使用85％的經(jīng)計算crcl值。注意:在明顯肥胖的參與者中，所述cockroft-gault公式將傾向于高估肌酐清除率(脂肪組織傾向于貢獻(xiàn)很少的需要腎清除的肌酐)。對于小兒使用，允許bsa(mosteller)和crcl(schwartz)的替代公式。應(yīng)遵循用于cgvhd管理的機(jī)構(gòu)實踐，如按照hsct標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(sop)來進(jìn)行抗病毒、抗真菌和抗菌預(yù)防和監(jiān)測。這些通常包括：在較高風(fēng)險的參與者中，每日阿昔洛韋(或等價物)用于hsv預(yù)防、復(fù)方新諾明(或等價物)用于pcp預(yù)防，iv丙種球蛋白用于低丙球蛋白血癥、唑類用于真菌預(yù)防；以及在較高風(fēng)險的參與者中監(jiān)測β-葡聚糖和半乳甘露聚糖水平。治療的持續(xù)時間是按照上述計劃。在不存在由于不良事件的治療延遲的情況下，可繼續(xù)治療直至適用以下標(biāo)準(zhǔn)中的一個：1)受試者撤回同意；2)不順從；3)管理原因；4)不可接受的不良事件；5)威脅生命的過敏反應(yīng)；6)其它4級毒性事件；7)復(fù)發(fā)或不解決的3級毒性事件；8)持續(xù)或復(fù)發(fā)的嚴(yán)重血液毒性(6.2節(jié))；9)治療醫(yī)師裁量下的關(guān)于il-2的威脅生命的感染；10)惡性血液病復(fù)發(fā)；11)按照治療醫(yī)師的判斷，8周前需要加入新的免疫抑制藥物的gvhd臨床惡化。皮質(zhì)類固醇劑量的增加將被考慮為惡化gvhd的證據(jù)。改變其它免疫抑制藥物的劑量以維持單獨的治療水平不是移除的標(biāo)準(zhǔn)；或12)參與者狀況的一般或具體改變，使得參與者在治療研究者看來不能接受進(jìn)一步的治療。自治療開始跟隨參與者1年，或直至死亡，以先發(fā)生者為準(zhǔn)。跟隨因為不能接受的不良事件而移除的參與者直至所述不良事件的解決或穩(wěn)定。參與者還被要求允許長期隨訪以致也能識別后期毒性(若它們發(fā)生)。對于受益于延長期限的治療的參與者的隨訪(包括不良事件)可繼續(xù)超過1年。若參與者在本地居住，則在dfci進(jìn)行隨訪，若參與者在遠(yuǎn)方居住，則由當(dāng)?shù)啬[瘤學(xué)提供者提供隨訪。對于遠(yuǎn)方居住的參與者，可以每6個月為基礎(chǔ)與他們的當(dāng)?shù)啬[瘤學(xué)提供者進(jìn)行電話溝通。當(dāng)適用任何所列標(biāo)準(zhǔn)時移除參與者。在研究特定的病例報告表(crf)中記錄研究移除的原因以及參與者移除的日期。與參與者討論替代的治療選項。在病例報告表(crf)中記錄將參與者移除研究的原因以及參與者移除的日期。當(dāng)參與者被移除時填寫qact治療結(jié)束/停止研究表。使用以下建議進(jìn)行8周il-2治療期間的劑量延遲和改變。毒性評估的進(jìn)行是使用nci常見不良事件評價標(biāo)準(zhǔn)(ctcae)的ctep4.0版，其被識別并位于萬維網(wǎng)上ctep網(wǎng)站：ctep.cancer.gov/protocoldevelopment/electronic_applications/ctc.htm。如有可能，從癥狀學(xué)上管理癥狀。在毒性的情況下，使用適當(dāng)?shù)乃幬镏委?包括止吐劑、止瀉劑等)。從研究治療首次劑量的時間、貫穿研究并直至最后的研究隨訪收集參與者所經(jīng)歷的所有ctcae3級和更高級別不良事件。聯(lián)系在研究停止隨訪時繼續(xù)經(jīng)歷毒性的參與者以額外評估直至毒性已消退或被認(rèn)為不可逆。對于進(jìn)行延長期限的il-2的參與者，劑量改變是推薦的但不是強(qiáng)制的。與經(jīng)給予試劑相關(guān)的不良事件和潛在風(fēng)險的列表出現(xiàn)在下面并確定是否進(jìn)行劑量延遲和改變或者事件是否除常規(guī)報告以外還需要速報。il-2(proleukin)是一種商業(yè)試劑。以下描述了hsct參與者中低劑量il-2的相關(guān)副作用。主要涉及高劑量il-2的額外的詳細(xì)毒性信息可見于proleukin藥品說明書(packageinsert)中。局部反應(yīng)：接受sc低劑量il-2的大部分hsct參與者報告注射部位反應(yīng)，典型為數(shù)日內(nèi)消退的局灶性紅斑；以及2-3周后消退的硬結(jié)。在具有更顯著硬結(jié)(ctc3級)的參與者中偶爾需要劑量中斷。長期劑量中斷可能導(dǎo)致參與者不可評估反應(yīng)。全身癥狀：一些接受低劑量il-2的hsct參與者在開始il-2的72小時內(nèi)發(fā)展發(fā)燒、惡心、疲勞和關(guān)節(jié)痛。治療中斷導(dǎo)致3天癥狀消退。參與者耐受以更低的劑量再引入il-2。長期劑量中斷可能導(dǎo)致參與者不可評估反應(yīng)。甲狀腺功能失調(diào)：在一些接受低劑量il-2的hsct參與者中觀察到甲狀腺功能測試異常。兩名參與者發(fā)展了在接受il-2時需要治療的臨床甲狀腺功能減退。停止il-2后，甲狀腺功能回到正常。因此，在研究進(jìn)入和研究8周時將檢查甲狀腺組(tsh、t4、游離t4)的水平。具有甲狀腺功能減退證據(jù)的參與者將被激動(抗微粒體、抗甲狀腺球蛋白抗體)和根據(jù)臨床指示給予替代甲狀腺素。造血作用：hsct后早期，低劑量il-2在治療1周后的大部分參與者中引起絕對淋巴細(xì)胞計數(shù)的初始減少。此后，伴隨繼續(xù)輸液，在所有參與者中出現(xiàn)淋巴細(xì)胞計數(shù)的穩(wěn)定增加。低劑量il-2還引起嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)的初始增加(3周時峰值)，然后逐步下降。未觀測到單核細(xì)胞或中性粒細(xì)胞計數(shù)的改變。在一些接受低劑量il-2的hsct參與者中血小板計數(shù)減少>20％。在接受il-2的前2周內(nèi)關(guān)注到該減少，且繼續(xù)治療與血小板計數(shù)的進(jìn)一步降低不相關(guān)。沒有參與者需要血小板輸注或發(fā)生流血事件。未關(guān)注到低劑量il-2對血紅蛋白水平或網(wǎng)織紅細(xì)胞(reticulocyte)計數(shù)的顯著影響。血栓性微血管病(tma)：兩名接受每日sc低劑量il-2的參與者發(fā)展了被認(rèn)為可能涉及il-2的血栓性微血管病sae(血小板減少、微血管病性溶血性貧血伴隨裂細(xì)胞癥、腎功能不全)。tma還是鈣調(diào)磷酸酶抑制劑(cni)和西羅莫司(參與者均接受這兩者治療)的已知并發(fā)癥，但il-2可能也對其有貢獻(xiàn)。一名患者已需要長期血液透析.。在不允許組合使用cni加上西羅莫司后，沒有患者隨后發(fā)展tma。.具有與cgvhd相關(guān)以及與其研究中使用的免疫抑制藥物相關(guān)的毒性。這些毒性被研究者常規(guī)管理。對于不良反應(yīng)的綜合列表，參照個體免疫抑制劑的藥品說明書。根據(jù)nci常見不良事件毒性標(biāo)準(zhǔn)(ctcae)，4.0版評估毒性。對于任意以下情形移除參與者并應(yīng)放棄il-2治療：過敏反應(yīng)：涉及il-2的威脅生命的過敏反應(yīng)需要停止il-2，并被認(rèn)為是dlt；血栓性微血管病(tma)：需要血液透析/cvvh、或需要住院的tma伴隨cns功能失調(diào)、腎功能不全需要停止il-2，并被認(rèn)為是dlt；ctc4級毒性：涉及il-2的4級非血液學(xué)毒性需要停止il-2，并被認(rèn)為是dlt，除非其單獨表現(xiàn)無癥狀的可校正實驗值(例如，尿酸)；ctc3級毒性：對于意料之外的3級非血液學(xué)毒性保留il-2，除非其單獨表現(xiàn)無癥狀的可校正實驗值(例如，尿酸)。若該毒性在2周內(nèi)消退至1級或低于1級，可以以50％劑量(若毒性在劑量水平a期間)或之前的較低劑量水平(若毒性在劑量水平b或c期間)重新開始il-2，并將不再遞增劑量。若該毒性未在2周內(nèi)消退至1級或低于1級，或在以較低劑量重新開始il-2后復(fù)發(fā)至3級或以上，則其將停止，并被認(rèn)為是dlt；嚴(yán)重血液學(xué)毒性：對于不涉及惡性疾病復(fù)發(fā)、感染或其它病因?qū)W的嚴(yán)重外周計數(shù)下降(anc<500，plts<10,000)保留il-2。若計數(shù)在2周內(nèi)改善(anc>1000，plts>20,000)，則以50％劑量(若毒性在劑量水平a期間)或之前較低劑量水平(若毒性在劑量水平b或c期間)重新開始il-2，并將不再遞增劑量。若外周計數(shù)未在2周內(nèi)改善，或在重新開始il-2后再次下降(anc<500，plts<10,000)，則停止il-2，并將其認(rèn)為是dlt；死亡：治療相關(guān)的死亡被認(rèn)為是dlt。以下是附加考慮：感染：值得注意的是，感染不被認(rèn)為是治療相關(guān)的，因為cgvhd和同時的免疫抑制藥物二者均是感染的已知風(fēng)險因素。感染被認(rèn)為是cgvhd的預(yù)期并發(fā)癥。然而，在完成8周il-2治療之前發(fā)展ctc3級或更高感染的參與者可能具有il-2保留(withheld)。若il-2保留，在治療醫(yī)師的裁量下，他們可以被考慮在控制感染后重新開始il-2。il-2劑量是：對于治療中斷≤1周或劑量水平a：以相同劑量重新開始；對于治療中斷>1周和劑量水平b或c：以低于2周的劑量水平重新開始并按照計劃遞增)；復(fù)發(fā)：同樣地，惡性血液病復(fù)發(fā)也不被認(rèn)為是治療相關(guān)的，因為cgvhd患者具有已知的復(fù)發(fā)發(fā)生率。然而，所有復(fù)發(fā)情形將被記錄，并將具有il-2保留；治療中斷：>4周的il-2治療中斷導(dǎo)致參與者被認(rèn)為不可評估反應(yīng)，除非伴隨較短療程的il-2記錄了cgvhd的客觀改善；預(yù)期的非血液學(xué)毒性：為了患者耐受性的利益并在治療醫(yī)師的裁量下，對于小于ctcae3級毒性(例如，持續(xù)全身癥狀)，il-2可被保留和/或以50％劑量(若毒性在劑量水平a期間)或之前劑量水平(若毒性在劑量水平b或c期間)重新開始，并不再遞增劑量；cgvhd的惡化：8周il-2治療期間需要加入新的免疫抑制藥物(在治療醫(yī)師的裁量下)的gvhd惡化是il-2停止的一個標(biāo)準(zhǔn)。8周以前皮質(zhì)類固醇劑量增加高于基線被認(rèn)為是cgvhd惡化的證據(jù)。改變其它免疫抑制藥物劑量以維持單獨的治療水平不是il-2停止的標(biāo)準(zhǔn)或不被認(rèn)為是cghvd惡化的證據(jù)。下表是用于記錄的數(shù)據(jù)的匯總：表7x-需要評估ο-具有這些器官系統(tǒng)的臨床牽連的參與者需要(口腔和眼部評估是可選的)。1免疫學(xué)：定量免疫球蛋白；血漿存儲；其他單核細(xì)胞的儲存2在8周之前不應(yīng)遞減全身性類固醇，除非認(rèn)為醫(yī)療需要(例如類固醇毒性)，且若在早期遞減，在遞減時進(jìn)行‘8周等價’cgvhd評估以記錄反應(yīng)a1、2、3、4、5、6、8周的測試將±4天進(jìn)行，以考慮到周末、假日等附近的時間安排和管理靈活性。b對于成人參與者，皮膚活檢是可選但強(qiáng)烈建議的。*在il-2開始后還將進(jìn)行4天(±1天)cbc/手動分類、血清肌酐和ldh的附加實驗室測試，以評估與血栓性微血管病相關(guān)的貧血、血小板減少、裂細(xì)胞和/或腎功能不全。對于具有妊娠可能的女性。#僅對小兒患者+對于開始的8周il-2，至少每2周完成并回到臨床；且對于延長期限的il-2，至少每8周。評估毒性和反應(yīng)二者。接受il-2的參與者可評估毒性。已接受至少4周il-2的參與者被認(rèn)為可評估反應(yīng)的缺乏。參與者在基線和研究8周時(以及在8周之前早期類固醇遞減的時間，如果必要的話)按照nih指南(可在萬維網(wǎng)asbmt.affiniscape.com/associations/11741/files/responsecriteriaappendixaforma.pdf上獲得)經(jīng)歷標(biāo)準(zhǔn)化cgvhd評估(flipovich等人，(2005)biol.bloodmarrowtransplant.11:945-956)。按照nih一致標(biāo)準(zhǔn)評估cgvhd響應(yīng)(pavletic等人，(2006)biol.bloodmarrowtransplant.12:252-266)。在反應(yīng)確定中不包括口腔和眼部位置，因為對于那些部位允許附加的局部治療。參與者具有根據(jù)以下定義分類的他們的反應(yīng)：完全反應(yīng)：器官反應(yīng)：在特定器官中消退所有涉及cgvhd的可逆臨床表現(xiàn)；總體反應(yīng)：在涉及cgvhd的各器官和部位消退所有可逆臨床表現(xiàn)。取決于涉及的相關(guān)器官系統(tǒng)，參與者經(jīng)歷眼部、口腔、皮膚、肌肉骨骼和肺部系統(tǒng)的重復(fù)詳細(xì)評估；部分反應(yīng)：器官反應(yīng)：用于測量涉及cgvhd的疾病臨床表現(xiàn)的量級中至少50％的改善(例如，從80％bsa至40％bsa的皮膚皮疹50％的減少)，單獨相對于起始值的百分?jǐn)?shù)在全量級中具有最小25％的改善(表8)；總體反應(yīng)：測量中至少一個器官或部位的改善，測量中沒有任何其它器官或部位的進(jìn)展。值得注意的是，對于全球評級和分類量表，3-或7-分量表中的1-分改變或者0至10分量表中的2-至3-分的改變(0.5sd改變)被認(rèn)為是臨床上有意義的。此外，閉塞性細(xì)支氣管炎綜合征(bos)響應(yīng)治療的標(biāo)志是肺功能的穩(wěn)定化，在3個月期間內(nèi)沒有fev1的進(jìn)一步減小。無反應(yīng)者(例如，輕微反應(yīng)、病情穩(wěn)定)不具有符合nih關(guān)于部分反應(yīng)或疾病進(jìn)展標(biāo)準(zhǔn)的cgvhd改變。表8cgvhd響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)用于cgvhd中部分器官反應(yīng)的建議計算。或者，可使用分類的器官特異性和全球評分以確定反應(yīng)。*s，起始分?jǐn)?shù)或值；e，結(jié)束分?jǐn)?shù)或值；uln，正常上限；lln，正常下限實例1.皮膚：起始分?jǐn)?shù)＝85，結(jié)束分?jǐn)?shù)＝30；e/s＝30/85＝0.35＝pr2.皮膚：起始分?jǐn)?shù)＝65，結(jié)束分?jǐn)?shù)＝45；e/s＝45/65＝0.75＝非pr3.皮膚：起始分?jǐn)?shù)＝45，結(jié)束分?jǐn)?shù)＝15；s–e＝30＝pr4.皮膚：起始分?jǐn)?shù)＝30，結(jié)束分?jǐn)?shù)＝15；s–e＝15＝非pr進(jìn)行性疾?。浩鞴龠M(jìn)展：用于測量涉及cgvhd的疾病臨床表現(xiàn)的量級中至少25％的絕對增加(表9)。值得注意的是，對于全球評級和分類量表，3-或7-分量表中的1-分改變或者0-至10-分量表中的2-至3-分改變(0.5sd改變)被認(rèn)為是臨床上有意義的。此外，‘cgvhd的臨床惡化’與根據(jù)nih標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)展性cgvhd不是同義的，因為參與者可能經(jīng)歷不符合客觀nih進(jìn)展標(biāo)準(zhǔn)的惡化癥狀。如果這樣，在治療醫(yī)師的判斷下，他們?nèi)跃哂幸蛉狈l-2功效而停止il-2并開始附加的免疫抑制的選項。表9心臟病的nyha分類下表呈現(xiàn)了紐約心臟協(xié)會心臟疾病分類.來源：紐約心臟協(xié)會標(biāo)準(zhǔn)委員會。用于診斷心臟和大血管疾病的術(shù)語和標(biāo)準(zhǔn)(nomenclatureandcriteriafordiagnosisofdiseasesoftheheartandgreatvessels).第9版.boston，ma:little，brown&co；1994:253-256。參與者使用經(jīng)確認(rèn)的慢性gvhd癥狀量表(表10)自我報告cgvhd的癥狀和體征。在基線和8周的結(jié)束時(以及如果必要的話在8周之前早期類固醇遞減的時間)獲得自我報告的癥狀量表。表10cgvhd進(jìn)展標(biāo)準(zhǔn)cgvhd中器官進(jìn)展的建議計算*s，起始分?jǐn)?shù)或值；e，結(jié)束分?jǐn)?shù)或值；uln，正常上限肺功能量表是fev1和dlco(校正hb)分?jǐn)?shù)的總和，各自計算為：>預(yù)測的80％＝1；70-79％＝2；60-69％＝3；50-59％＝4；40-49％＝5；<40％＝6。若起始肺功能分?jǐn)?shù)≥10，進(jìn)展被定義為至少相距2周測量的兩次測試中fev1的減小≥5％。選擇該時間間隔是因為這些綜合征可快速進(jìn)展。急性gvhd分期*使用“九分法”以確定體表面積。1以總膽紅素形式給出范圍。若已記錄膽紅素提高的額外原因，則下調(diào)一期。2若已記錄腹瀉的額外原因，則下調(diào)一期。(改編自thomas等人，nejm，1975，895-90頁)。在基線時和在8周il-2結(jié)束時記錄參與者的皮質(zhì)類固醇每日總劑量。在替代的皮質(zhì)類固醇每日劑量的情況下，為研究目的記錄平均日劑量。參與者還經(jīng)歷免疫功能測試，其在il-2開始之前，以及1、2、3、4、6和8周的結(jié)束時進(jìn)行。測試包括定量免疫球蛋白；血漿存儲；和去單核細(xì)胞的儲存。在之前低劑量il2研究中，觀測到給予一群患者固定的劑量，盡管每日給予il-2，血漿il-2水平在治療1周時達(dá)到峰值后下降，而treg計數(shù)上升。進(jìn)一步的研究顯示treg增殖和活化水平也在2周后平息。本文相信血漿il-2水平的下降是由于其被在經(jīng)il-2-擴(kuò)張的treg上表達(dá)的增加的高親和力il-2受體(cd25)攝取和截留，血漿il-2水平的下降可減小對于擴(kuò)張的treg池的il-2隨后可用性。據(jù)信患者間(intra-patient)劑量遞增最大化il-2誘導(dǎo)的treg體內(nèi)增強(qiáng)并避免由于被增加數(shù)目的具有較高cd25表達(dá)的循環(huán)treg結(jié)合后血漿il-2水平降低所導(dǎo)致的快速耐受。此外，據(jù)信毒性/dlt率隨著各患者內(nèi)劑量的連續(xù)增加而降低，因為在劑量遞增時更大的treg池將可用于il-2攝取和截留。如上所述，考慮了三個il-2遞增劑量：成人患者為0.67x106(劑量水平a)、1.35x106(劑量水平b)和2x106iu/m2/d(劑量水平c)而小兒患者為0.33x106(劑量水平a)、0.67x106(劑量水平b)和1x106iu/m2/d(劑量水平c)以確定各患者中的mtd。各參與者的初始招募是在劑量水平a。在不存在dlt或嚴(yán)重的非dlt的ae的情況下，各成人或小兒參與者在2周時劑量遞增(至劑量水平b)和在4周時劑量遞增(至劑量水平c)，并繼續(xù)接受mtdil-2共4周。若患者在任何劑量水平經(jīng)歷dlt，則將所述患者從研究中移除。若患者在劑量遞增時經(jīng)歷不可接受的il-2相關(guān)性ae(非dlt)，則患者可遞減至先前耐受的劑量。mtd被定義為在各患者中不存在dlt的情況下的最大劑量水平。下表11顯示了各種dlt率下個體劑量遞增的概率。例如，若個體的真實但未知的dlt率是10％，則劑量遞增的概率是90％，其是dlt率的互補(bǔ)概率。表11各受試者中劑量遞增的概率總共招募20名患者(10名成人和10名小兒患者)并評估研究設(shè)計的可行性。在之前成人患者中的il-2研究中，1x106iu/m2/天的il-2被確認(rèn)為mtd。然而，采用患者內(nèi)劑量遞增的當(dāng)前設(shè)計，據(jù)信患者經(jīng)歷較低的毒性且因此mtd劑量水平較高。若在20名患者中15名或更多的患者宣稱劑量水平b或c為其mtd，則認(rèn)為當(dāng)前研究設(shè)計是可行的。采用該決策規(guī)則，若真實但未知的可行率是85％則推斷該研究設(shè)計可行的概率是0.93，若可行率是80％則概率是0.8，且若可行率是55％則概率是0.06?；谥把芯?，據(jù)信各群體中至少7名患者將達(dá)到其mtd而不經(jīng)歷dlt，且若真實但未知的dlt率是0.2則觀測到至少7名患者完成其mtd而無dlt的概率將是0.88，且若dlt率是0.3則概率是0.65。在相關(guān)研究中，組合以及單獨分析il-2劑量、血漿il-2水平和treg和成人和小兒患者臨床響應(yīng)之間的關(guān)系。受試者的性別不被用作入選或排除的標(biāo)準(zhǔn)且對于少數(shù)族裔的應(yīng)計(accrual)沒有限制。在2013年，41％的全部獲移植的患者是女性且約10％的患者是少數(shù)族裔?；谖覀?013年移植項目中的該自我報告的種族和性別，通過性別和種族定義的亞組中預(yù)期的應(yīng)計在下表12中匯總。表12次要終點包括8周的慢性gvhd響應(yīng)率、研究進(jìn)入后1年的總體存活和復(fù)發(fā)以及8周治療期間的免疫學(xué)評估。敘述性和圖表性地分析次要終點。在相關(guān)研究中，組合以及單獨研究il-2劑量、血漿il-2水平和treg增殖和活化和成人和小兒患者臨床響應(yīng)之間的關(guān)系。實施例3:與調(diào)節(jié)性t細(xì)胞給予相結(jié)合的代表性低劑量il-2治療方案以下提供了與調(diào)節(jié)性t細(xì)胞給予相結(jié)合的低劑量il-2治療方案的代表性、非限制性實施方式。在其它實施方式中，低劑量il-2治療方案可替換為實施例1的多次-可變劑量il-2治療方案和/或本文所述的方法，包括來自任意實施例的任意組合。例如且除非另外指明，來自實施例2的標(biāo)準(zhǔn)可全部或部分伴隨以下實施例3中所述的那些使用。雖然低劑量il-2可在體內(nèi)優(yōu)先增加tregs，但持久的臨床響應(yīng)僅為～50％的cgvhd患者。此外，在一項尋求增強(qiáng)具有hsct后惡性腫瘤復(fù)發(fā)的患者中移植物抗白血病(gvl)反應(yīng)的試驗中，cd4+富集的供體淋巴細(xì)胞輸注(clinimacscd8+耗盡；劑量3-10x107cd4+細(xì)胞/kg)加上12周低劑量il-2(0.6x106iu/m2/d)相比于單獨的低劑量il-2或cd4+富集的細(xì)胞輸注誘導(dǎo)了更大的體內(nèi)foxp3+treg擴(kuò)張，而未誘導(dǎo)gvhd(zorn等人，(2009)biol.bloodmarrowtransplant.15:382-388)(圖8)。伴隨低劑量il-2接受cd4富集的dli的患者相比于接受單獨的低劑量il-2的患者具有更大的體內(nèi)treg擴(kuò)張(p＝.03)或相比于接受cd4富集的dli的患者具有更大的體內(nèi)treg擴(kuò)張(p＝.001)(圖8)。這些cd4+cd25+t細(xì)胞顯示正常抑制功能且cd4富集的dli和il-2治療與gvhd不相關(guān)。在意大利一項經(jīng)歷cd34選擇的單倍相合hsct的28名患者的試驗中，移植周圍輸注供體treg富集細(xì)胞后輸注供體tcon，即便是在不存在移植后免疫抑制的情況下也預(yù)防了gvhd(diianni等人，(2011)blood117:3921-3928)?；诒疚乃龅慕Y(jié)果，據(jù)信結(jié)合低劑量il-2和采用的treg富集細(xì)胞治療會產(chǎn)生附加的臨床受益。已接受供體tregs富集細(xì)胞輸注加上低劑量il-2的首位參與者無任何不良反應(yīng)。此外，來自5組獨立白細(xì)胞除去術(shù)的數(shù)據(jù)證實了2步clinimacscd8/cd19共耗盡后cd25+treg富集的可行性(表13)。起始自具有包含6.5-9.7％cd20+b細(xì)胞、11.4-28.3％cd8+t細(xì)胞和5.9-16.7％cd4+cd25+cd127-treg細(xì)胞的1.6-4.07x1010存活的總有核細(xì)胞(tnc)的白細(xì)胞分離產(chǎn)物，取得了具有包含0-0.4％cd20+b細(xì)胞、0.01-1.2％cd8+t細(xì)胞、83.1-92％cd4+cd25+treg富集細(xì)胞和72.8-93.9％cd4+cd25+cd127-treg細(xì)胞的0.58-1.76x108存活的tnc的treg富集產(chǎn)物。典型foxp3+treg包含41.3-69.6％的上述產(chǎn)物，為了抑制，其也在1:2的treg:tcon比率之上。表13使用以下患者群體標(biāo)準(zhǔn)：1)具有需要系統(tǒng)治療的慢性gvhd(需要系統(tǒng)治療的廣泛或有限的慢性gvhd)的參與者；2)盡管接受2種或多種治療的活動性cgvhd；所述治療包括至少4周的≥0.25mg/kg/天劑量的強(qiáng)的松(或等價物)；3)無不受控制的活動性感染；和4)無惡性疾病復(fù)發(fā)。以下詳述了特定的入選和排除標(biāo)準(zhǔn)：1)參與者數(shù)目：2-25；2)研究設(shè)計和方法學(xué)：評估在類固醇難治性慢性移植物抗宿主病(cgvhd)中調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(treg)富集細(xì)胞加上8周低劑量每日白細(xì)胞介素-2(il-2)的安全性和最大耐受劑量水平(mtd)。3)i期treg富集細(xì)胞目標(biāo)劑量：劑量水平a:0.1x106細(xì)胞/kg(起始劑量水平)劑量水平b:0.3x106細(xì)胞/kg劑量水平c:1x106細(xì)胞/kg安全性和有效性分析如下：主要終點是treg富集的供體細(xì)胞輸注加上低劑量每日scil-2(1x106u/m2/d)的毒性和mtd。次要終點是1)treg富集的輸注加上8周低劑量il-2的可行性；2)treg富集的輸注加上8周低劑量il-2的臨床響應(yīng)；3)treg富集的輸注加上8周低劑量il-2的免疫效應(yīng)；和4)臨床響應(yīng)的預(yù)測器。評估(8周時)如下：1)評估treg富集細(xì)胞輸注的可行性；2)評估treg富集細(xì)胞輸注的輸注毒性；3)評估不涉及惡性疾病的3級或更高級的血液毒性；4)評估不涉及gvhd的3級或更高級的非血液毒性；5)評估危及生命的感染；6)評估慢性gvhd響應(yīng)或進(jìn)展；和7)評估免疫影響。此外，評估供體來源的treg富集細(xì)胞產(chǎn)物中和在基線時以及8周il-2治療后研究患者中treg和tcon群體的總體t細(xì)胞庫的多樣性。所得序列數(shù)據(jù)可用于追蹤跨越系列患者樣本的個體t細(xì)胞克隆，實現(xiàn)在低劑量il-2治療期間對于采用的treg細(xì)胞產(chǎn)物而言獨特的t細(xì)胞克隆的體內(nèi)擴(kuò)張和繼而的存活。還測定了treg和tcon之間共享tcr庫的程度及以采用的treg細(xì)胞輸注加上低劑量il-2治療的組合作為用于再建treg體內(nèi)平衡的參數(shù)后其如何改變。樣本組分分離和低溫保存：對于單核細(xì)胞的分離，用hank平衡鹽溶液(hbss)稀釋抗凝樣本，將其層置在ficoll-paquetmplus上并接著在17℃下1,000xg離心20分鐘。離心后，收獲聚蔗糖(ficoll)和介質(zhì)之間界面處的細(xì)胞，在hbss中洗滌兩次并計數(shù)。用編碼cm數(shù)的條形碼標(biāo)記冷凍管并將其儲存在汽相液氮中，并在冷凍工作表中記錄位置信息。對于血漿儲存，輕輕旋轉(zhuǎn)原發(fā)抗凝樣本并在用如上所述的介質(zhì)稀釋細(xì)胞團(tuán)塊之前移除血漿。當(dāng)需要非冷凍保存樣本時(例如，用于流式細(xì)胞術(shù)的全血)，未經(jīng)進(jìn)一步處理而分散樣本。依照實驗室sop錄入和錄出樣本。使用qiagenbloodmini和micro柱(取決于細(xì)胞量)使用制造商推薦的試驗方案從2.5x104至10x106細(xì)胞之間分離雙鏈dna(dsdna)以用于tcr。將樣本洗脫入100μl洗脫緩沖液。按照制造商的說明，在加入quant-ittmpicogreentm試劑(invitrogen)、生成標(biāo)準(zhǔn)dna曲線和在熒光讀板器上測量后量化洗脫的dsdna。免疫學(xué)方法：表型分析：通過計數(shù)外周血中確定的淋巴細(xì)胞亞群來評估免疫重建。分析有15％edta的采集的全血。將熒光染料綴合的抗體(beckmancoulter，bdbiosciences，invitrogenormiltenyi)加至各反應(yīng)管，然后加入100μl全血。孵育10分鐘后，加入1mlbdfacslyse溶血劑并將樣本渦旋和孵育15分鐘。使用bdii流式細(xì)胞儀和軟件分析抗體標(biāo)記的細(xì)胞。雖然這些分析常規(guī)是在采集24小時內(nèi)的新鮮全血上進(jìn)行的，但它們也可用于冷凍保存的pbmc。直接的綴合試劑和熒光染料組在下表14中顯示。各管中同時分析7-8種顏色提供了采用3-管組對t、b和nl細(xì)胞內(nèi)的不同亞群的綜合調(diào)查。各管中僅使用400μl全血和分析200,000細(xì)胞?？蓪⒏郊拥墓芗又猎摌?biāo)準(zhǔn)組以提供對特定亞群更詳細(xì)的分析或為新亞群的增加標(biāo)記。由于消除了與聚蔗糖-泛影葡胺密度沉積低溫保存和重融相關(guān)的可變性，全血的使用促進(jìn)了準(zhǔn)確計數(shù)各樣本中特定細(xì)胞的絕對數(shù)。treg和tcon體內(nèi)平衡：對treg和tcon亞群的分析利用之前開發(fā)的表型和功能分析(matsuoka等人，(2010)j.clin.invest.120:1479-1493)。以下表15中匯總了標(biāo)記的表型組。這些分析提供了一種定量方式以評估胸腺新生，以及表型上定義明確的t細(xì)胞亞群的增殖和程序性凋亡敏感性。聚焦于t細(xì)胞新生(例如，cd45ra+cd31+)、增殖(例如，ki-67)、活化(例如，pstat5)和存活(例如，bcl-2)的不同測量，它們提供了各t細(xì)胞群體的穩(wěn)態(tài)平衡的詳細(xì)評估。流式分選的細(xì)胞群還可用于體外功能分析(例如，通過fas誘導(dǎo)實驗的程序性凋亡抑制；通過cfse稀釋的tcon抑制、胸苷摻入、或ifn-γ試驗)。相同樣本內(nèi)treg和tcon亞群的內(nèi)部交叉比較提供了一種評估差別效應(yīng)和對共同體內(nèi)環(huán)境的反應(yīng)的獨特方式。在定義間隔的結(jié)果的比較識別在一段時間內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡的改變。血漿細(xì)胞因子的測量：通過在1000xg下全血離心15分鐘來分離血漿，并在-70℃下儲存庫等分。使用elisa以測量不同時間點的穩(wěn)態(tài)細(xì)胞因子水平。將結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)、功能分析和臨床結(jié)果相關(guān)聯(lián)。當(dāng)前使用市售的高靈敏性和可再生試劑盒：人il-2化學(xué)發(fā)光elisa(pierce:產(chǎn)品#84772)；quantikine免疫測定人il-7hs(r&d:產(chǎn)品#hs750)；和化學(xué)發(fā)光免疫測定人il-15(r&d:產(chǎn)品#q1500b)。遵循推薦的程序，包括一式兩份使用樣本，采用適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)稀釋和對照。在各96孔測試板上包括三份已知濃度的樣本以評估批間精度。使用spectra180酶標(biāo)儀(moleculardevices，sunnyvale，ca)測量分析結(jié)果。tcr序列分析：分析來自采用的treg富集細(xì)胞產(chǎn)物和來自在基線時以及低劑量il-2后的患者系列pbmc樣本的cd3+cd4+cd25中-高cd127低treg和cd3+cd4+cd25陰-低cd127中-高tcon。基于以上免疫表型概況通過細(xì)胞分選純化treg和tcon(各自>25,000細(xì)胞)，在裝載用于immunoseq分析之前在板上點樣各樣本400-1200ng提取的dsdna。相關(guān)分析：在探索性統(tǒng)計分析中，確定在一段時間內(nèi)測量的臨床(例如，cgvhd特性和/或伴隨試劑)或免疫學(xué)變量(例如，il-2前后的treg計數(shù)、treg/tcon比率、treg擴(kuò)張)和治療反應(yīng)的關(guān)聯(lián)。根據(jù)以下合格標(biāo)準(zhǔn)選擇參與者：1)7-8/8hla-匹配的(hla-a，-b，-c，-drb1)同種異體造血干細(xì)胞移植的接受者；2)參與者必須是盡管使用2種或多種治療卻具有類固醇難治性cgvhd。類固醇難治性cgvhd被定義為盡管使用≥0.25mg/kg/天(或每隔一天0.5mg/kg)的強(qiáng)的松至少4周(或等價劑量的替代糖皮質(zhì)激素)卻具有持續(xù)的cgvhd體征和癥狀(表2和3)，沒有完全消退體征和癥狀?；加行枰到y(tǒng)治療的廣泛的慢性gvhd或有限的慢性gvhd的參與者是適合的；3)招募之前接受4周穩(wěn)定劑量的糖皮質(zhì)激素；4)招募之前4周未加入或減去其他免疫抑制藥物(例如，鈣調(diào)磷酸酶-抑制劑、西羅莫司、嗎替麥考酚酯)。免疫抑制藥物的劑量可基于該藥物的治療范圍進(jìn)行調(diào)整；5)患者年齡≥18歲。因為關(guān)于在<18歲的參與者中使用il-2，當(dāng)前沒有可用的劑量或不良事件數(shù)據(jù)，將兒童從該研究排除；6)ecog表現(xiàn)狀態(tài)0-2(表4)；7)參與者必須具有如下定義的足夠器官功能：a)肝:足夠的肝功能(總膽紅素≤2.0mg/dl-在患有g(shù)ilbert綜合征的參與者中例外允許；ast(sgot)/alt(sgpt)≤2xuln)，除非肝功能缺陷是推測的cgvhd的表現(xiàn)。對于將具有異常的肝功能檢查(lfts)作為cgvhd的唯一表現(xiàn)的參與者，將需要在招募之前在肝活檢組織上有記錄在案的gvhd。若治療醫(yī)師將異常lfts記錄為與肝cgvhd相符，則涉及其他器官系統(tǒng)的活性cgvhd背景下的異常lfts也是允許的，且在該情況下將不強(qiáng)制進(jìn)行肝活檢；b)肺:fev1≥50％或dlco(hb)≥40％預(yù)測值，除非肺功能障礙被認(rèn)為是由于慢性gvhd；c)腎:血清肌酐小于正常機(jī)構(gòu)限值的上限或?qū)τ诩◆皆跈C(jī)構(gòu)正常值之上的參與者肌酐清除率≥60ml/min/1.73m2；d)通過以下指示的足夠的骨髓功能：anc>1000/mm3和血小板>50,000/mm3，無生長因子或輸血；和e)心臟:招募之前6個月內(nèi)無心肌梗死或nyhaiii或iv級心力衰竭、不受控制的心絞痛、嚴(yán)重不受控制的室性心律失常、或急性缺血或主動傳導(dǎo)系統(tǒng)異常的心電圖證據(jù)。研究進(jìn)入之前，篩查時的任何ecg異常必須是研究者記錄為非醫(yī)學(xué)相關(guān)的；8)il-2對發(fā)育中的人類胎兒的作用是未知的。因為該原因且因為已知化療劑是致畸的，具有懷胎可能性的女性和男性必須同意在研究進(jìn)入之前和參與研究期間使用充分避孕(激素或屏障的生育控制方法；禁欲)。當(dāng)參與該研究時若女性受孕或疑似受孕，則她應(yīng)當(dāng)立即告知其治療醫(yī)師；和9)對簽署書面知情同意書具有理解能力和意愿。根據(jù)以下排除標(biāo)準(zhǔn)排除參與者：1)>1mg/kg/天的持續(xù)強(qiáng)的松(或等價物)劑量需求；2)同時使用鈣調(diào)磷酸酶-抑制劑加上西羅莫司的參與者(單獨的任一試劑是可接受的)；3)血栓性微血管病、溶血性尿毒癥綜合征或血栓性血小板減少性紫癜病史；4)之前4周內(nèi)新的慢性gvhd治療(例如，格列衛(wèi)、體外光分離置換、利妥昔單抗、免疫抑制藥物)；5)之前4周內(nèi)低劑量il-2治療；6)之前100天內(nèi)移植后暴露于t細(xì)胞或替代的il-2靶向藥物治療(例如，atg、阿倫單抗、巴利昔單抗、地尼白介素-白喉毒素連接物)；7)之前100天內(nèi)供體淋巴細(xì)胞輸注；8)活性惡性病復(fù)發(fā)；9)活性不受控制的感染；10)不能遵從il-2治療方案；11)器官移植(同種異體移植)接受者；12)處于聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的hiv-陽性個體是不適合的，因為與同種異體hsct后使用的試劑有藥代動力學(xué)相互作用的可能性。此外，這些個體處于增加的致命感染的風(fēng)險中。當(dāng)指示時在接受聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的參與者中進(jìn)行適當(dāng)?shù)难芯浚?3)具有活性不受控制的乙型肝炎或丙型肝炎的個體是不適合的，因為他們處于hsct后致命的治療相關(guān)肝毒性的高風(fēng)險中；14)招募之前4周內(nèi)其它研究藥物，除非項目負(fù)責(zé)人放行了(cleared)；和15)因為致畸或墮胎作用的可能性而從該研究排除孕婦。因為在乳兒中具有承繼于接受治療的母親的未知但潛在的不良事件風(fēng)險，所以應(yīng)停止母乳哺育。根據(jù)以下治療方案治療受試者：供體白細(xì)胞分離產(chǎn)物：用于該研究的清血法相比于通常未改變的白細(xì)胞分離法未給供體帶來任何增加的風(fēng)險。相同的原始造血干細(xì)胞供體將經(jīng)歷清血法以獲得供體淋巴細(xì)胞。當(dāng)可能時，這通過外周靜脈途徑進(jìn)行。供體評估和清血法可在其它中心(包括國際站點)進(jìn)行，并需要按照各供體中心的標(biāo)準(zhǔn)操作程序完成適當(dāng)?shù)耐鈺歪t(yī)學(xué)評估。遵循21cfr1271的c部分評估所有供體并按照用于移植受體以及他們的各自供體的那些規(guī)定對其進(jìn)行處理。供體淋巴細(xì)胞優(yōu)選采集自單一清血法。清血法后，一小份產(chǎn)物經(jīng)歷分析以確定基線細(xì)胞計數(shù)、存活率和微生物學(xué)/無菌檢驗。若按照cmcf是足夠的，則如下詳述地處理產(chǎn)物并在完成處理的36小時內(nèi)輸注。研究治療：treg富集細(xì)胞產(chǎn)物：一旦收到供體白細(xì)胞分離產(chǎn)物，則根據(jù)制造商的說明(miltenyibiotec)使用臨床級clinimacs試劑系統(tǒng)對其進(jìn)行連續(xù)的2步treg細(xì)胞富集：i)cd8+/cd19+共耗盡(2.1耗盡程序，clinimacs)；然后是ii)cd25+陽性選擇(3.1富集程序，clinimacs)。用于該制備的詳細(xì)方案以及clinimacs試劑系統(tǒng)的使用是按照clinimacs用戶手冊(表16)。例如，受試者的先前干細(xì)胞供體可經(jīng)歷清血法以獲得用于受試者的供體淋巴細(xì)胞。若適當(dāng)?shù)脑?最小劑量≥3x107cd3+細(xì)胞/kg)，則如下所述處理產(chǎn)物并在規(guī)定的產(chǎn)物過期時間內(nèi)輸注。一旦收到供體白細(xì)胞分離產(chǎn)物，則根據(jù)制造商的說明(miltenyibiotec)使用臨床級clinimacs試劑系統(tǒng)對其進(jìn)行cd8+/cd19+共耗盡然后是cd25+陽性選擇的連續(xù)2步treg細(xì)胞富集。使用處理之前和完成treg富集之后移出的樣本以確定細(xì)胞活力并計數(shù)cd3+、cd4+、cd8+、cd25+、cd127+和foxp3+細(xì)胞。將產(chǎn)物表示為“treg富集細(xì)胞”。釋放的標(biāo)準(zhǔn)包括：產(chǎn)物中>70％細(xì)胞活力，革蘭氏陰性染色；≥90％cd4+cd25+；和≥50％foxp3+細(xì)胞。表16細(xì)胞產(chǎn)物評估：在處理之前和完成treg富集之后移出樣本。將這些用于在處理之前和/或之后確定細(xì)胞活力并計數(shù)cd3+、cd4+、cd8+、cd25+、cd127+和foxp3+細(xì)胞(必要時組合，例如cd4+cd25+foxp3+細(xì)胞)。還進(jìn)行革蘭氏染色、內(nèi)毒素和無菌檢驗。將產(chǎn)物表示為“treg富集細(xì)胞”。釋放的標(biāo)準(zhǔn)包括：產(chǎn)物中通過臺盼藍(lán)測定≥70％細(xì)胞存活率、革蘭氏陰性染色/內(nèi)毒素、≥70％cd4+cd25+和≥50％cd4+cd25+cd127-細(xì)胞(表17)。表17a.針對釋放標(biāo)準(zhǔn)的clinmacs選擇后/輸注前測試*目標(biāo)劑量，然而也可輸注具有較低細(xì)胞劑量的產(chǎn)物。b.用于文件編制的輸注后測試*需要確定cd3、cd4、cd25、cd127計數(shù)值得注意的是，目標(biāo)treg富集細(xì)胞劑量/kg不是釋放標(biāo)準(zhǔn)。即便在獲得必需qc樣本后細(xì)胞劑量/kg在可用的最大細(xì)胞數(shù)上低于目標(biāo)也輸注產(chǎn)物。treg富集細(xì)胞劑量：參與者以供體treg富集的總有核細(xì)胞的確定劑量作為目標(biāo)。初始募集是在目標(biāo)劑量水平a。隨后的列組將按照以下計劃劑量遞增*接受者重量列組treg富集細(xì)胞劑量(活細(xì)胞/kg*)劑量水平a(起始劑量)0.1x106劑量水平b0.3x106劑量水平c1x106這是i期劑量發(fā)現(xiàn)設(shè)計：在給定的劑量水平應(yīng)計5名參與者(在初始4名參與者積累(accrued)后具有強(qiáng)制的28天中斷)。若5名中≤1名經(jīng)28天具有dlt，則進(jìn)行劑量遞增。若這是劑量水平c，則該劑量是mtd。若群體中≥2名參與者經(jīng)歷dlt，則該mtd被認(rèn)為是超出的。若這是劑量水平a，則停止積累。若這是劑量水平b，則劑量水平a是mtd。若這是劑量水平c，則劑量水平b是mtd。然后在推定的mtd積累另外10名參與者以進(jìn)一步評估毒性和功效。treg富集細(xì)胞輸注：在clinimacs細(xì)胞產(chǎn)物已通過釋放標(biāo)準(zhǔn)(表17)之前不將其給予。若不符合釋放標(biāo)準(zhǔn)，則不輸注產(chǎn)物，且患者不可評估dlt，但產(chǎn)物可評估可行性。如本文所述確定生成適當(dāng)?shù)膖reg富集產(chǎn)物的可行性。一旦已符合釋放標(biāo)準(zhǔn)，則通過中央或外周靜脈導(dǎo)管將產(chǎn)物輸注入接受者。通過靜脈導(dǎo)管經(jīng)～5-10分鐘輸注細(xì)胞。在輸注前tylenol650mgpo和benadryl25mgiv術(shù)前用藥是通常的(但不必需)。結(jié)束輸注后監(jiān)測參與者的輸液反應(yīng)發(fā)展～1小時。利用超過劑量輸注的treg富集細(xì)胞小份用于表型、功能和/或dna、rna和蛋白研究。按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序冷凍保存任何剩余的treg富集細(xì)胞用于未來的質(zhì)量控制應(yīng)用和相關(guān)性分析。白細(xì)胞介素-2：treg富集細(xì)胞輸注日開始，各參與者接受每日皮下il-2用于自我給藥8周，然后是4周的中斷(除非應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明方法的多次-可變劑量il-2方案)。以門診治療標(biāo)準(zhǔn)給予il-2。在實施例2中描述預(yù)期的毒性和潛在風(fēng)險以及劑量改變。伴隨繼續(xù)無劑量改變的il-2和強(qiáng)的松(或等價類固醇)和其它試劑的給予。在研究的初始6周期間不允許遞減強(qiáng)的松，但其后在治療醫(yī)師的裁量下(例如類固醇毒性)可在反應(yīng)者中減少強(qiáng)的松(在按照nihcgvhd標(biāo)準(zhǔn)記錄反應(yīng)后)。值得注意的是，其它免疫抑制藥物遞減期間臨床穩(wěn)定的cgvhd被認(rèn)為是功效的證據(jù)；且其它免疫抑制療法遞減期間cgvhd的進(jìn)展不被認(rèn)為是毒性或缺乏功效的證據(jù)。延長期限的治療：完成研究期(8周il-2研究治療和4周停止il-2)后，允許經(jīng)歷臨床受益(完全或部分反應(yīng)；以及不符合nih部分反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的微反應(yīng))并具有可接受的毒性概況的參與者在治療醫(yī)師的裁量下繼續(xù)延長期限的il-2治療。每6個月的延長il-2治療后再評估參與者以確定是否應(yīng)在治療醫(yī)師的裁量下繼續(xù)il-2治療，該治療醫(yī)師記錄繼續(xù)il-2治療的理由。進(jìn)行延長期限的il-2治療的參與者不可評估i期毒性終點(例如，為了細(xì)胞劑量遞增/遞減目的)。延長期限的il-2期間其它免疫抑制藥物的遞減是由治療醫(yī)師裁量。在治療醫(yī)師的裁量下，繼續(xù)進(jìn)行延長期限的治療的參與者允許加入其它cgvhd治療以增強(qiáng)反應(yīng)。在可歸因于il-2的毒性事件中，在治療醫(yī)師的裁量下允許按照指南進(jìn)行劑量改變。在進(jìn)行延長期限的il-2治療時的以下建議時間表評估參與者：1)每4周(±2周)門診隨訪和實驗室(cbc、肌酐、alt、ast、總膽紅素)評估il-2的毒性和臨床受益；2)每8周(±2周)免疫試驗，其包括定量血清免疫球蛋白；血漿儲存入庫；和其他單核細(xì)胞的儲存；和3)每16周(±4周)cgvhd評估和cgvhd癥狀記分表直至自il-2治療1年或參與者停止il-2治療，取其先到期者。在治療所有參與者之前2周內(nèi)進(jìn)行以下評估：1)病史和治療患者疾病的基本原理的文檔(包括類固醇劑量)；2)體格檢查，包括生命體征、體重、表現(xiàn)狀況；3)cgvhd評估；4)生育潛能女性的妊娠試驗；5)傳染性疾病標(biāo)記測試；6)肺功能檢查(之前4周內(nèi))；7)血液學(xué)：具有分類的全血細(xì)胞計數(shù)(cbc)；8)血清化學(xué)：葡萄糖、bun、肌酐、尿酸、總膽紅素、堿性磷酸酶、ldh、總蛋白、白蛋白、ast、alt、和鈣；9)甲狀腺功能測試(tsh，t4，游離-t4)；10)cmv病毒載量；和11)免疫學(xué)：定量血清免疫球蛋白；血漿存儲入庫；和他單核細(xì)胞儲存。除非另有指明，否則在治療具有涉及特定器官的cgvhd的參與者之前兩周內(nèi)需要以下評估：1)采用希曼試驗的眼部檢查，對于具有眼部cgvhd的參與者(可選的)；2)皮膚病學(xué)評估，對于具有皮膚cgvhd的參與者；3)口腔檢查(±活檢)，對于具有口腔cgvhd的參與者(可選的)；和4)受影響關(guān)節(jié)的屈曲評估，對于具有與cgvhd相關(guān)的攣縮或肌肉骨骼涉及的個體。治療(1、2、3、4、6、8周的結(jié)束)、停止il-2(10、12周的結(jié)束)和延長觀測(16、20、24周的結(jié)束)期間評估包括：1)病史和臨床檢查；2)與病史和臨床檢查同日進(jìn)行的毒性評估；3)血液學(xué)：具有分類的cbc；4)血清化學(xué)：葡萄糖、bun、肌酐、尿酸、總膽紅素、堿性磷酸酶、ldh、總蛋白、白蛋白、ast、alt、和鈣；5)cmv病毒載量；6)免疫學(xué)：定量免疫球蛋白；血漿存銀；和附加單核細(xì)胞儲存；和7)甲狀腺功能測試(tsh、t4、游離-t4)(8、16、24周)。對于具有涉及特定器官的cgvhd的參與者，除非另有指明，否則在結(jié)束8周的研究治療時以及在類固醇遞減時(若更早的話)需要以下評估(除了cgvhd癥狀評分以外)：1)類固醇劑量；2)采用希曼試驗的眼部檢查，對于具有眼部cgvhd的參與者(可選的)；3)皮膚病學(xué)評估，對于具有皮膚cgvhd的參與者；4)口腔檢查(±活檢)，對于具有口腔cgvhd的參與者(可選的)；5)肺功能測試，對于具有肺部cgvhd臨床表現(xiàn)的參與者；和6)受影響關(guān)節(jié)的屈曲評估，對于具有與cgvhd相關(guān)的攣縮或肌肉骨骼涉及的個體。treg富集細(xì)胞輸注的不良事件列表：用于治療惡性疾病復(fù)發(fā)的未經(jīng)選擇的供體淋巴細(xì)胞輸注已與tcon介導(dǎo)的gvhd惡化以及與主要在涉及骨髓的重大白血病/淋巴瘤情況下的骨髓抑制相關(guān)。然而，treg是tcon的主導(dǎo)抑制物，且clinimacstreg富集產(chǎn)物即便在1:2的treg:tcon比率下也是體外抑制性的，在不具有活性gvhd或惡性疾病復(fù)發(fā)的hsct接受者中，達(dá)4x106細(xì)胞/kg的輸注后也未報告毒性(diianni等人，(2011)blood117:3921-3928)。因此，據(jù)信以包含≥50％cd4+cd25+cd127-treg(在1:2的treg:tcon抑制作用比率之上)的0.5x106細(xì)胞/kg的起始劑量水平輸注treg富集產(chǎn)物是安全的。監(jiān)測gvhd進(jìn)展和骨髓抑制以確認(rèn)活性cgvhd中treg富集細(xì)胞輸液的安全性。下表是用于記錄的數(shù)據(jù)的匯總：表18x-需要評估ο-具有這些器官系統(tǒng)的臨床牽連的參與者需要1免疫學(xué)：定量免疫球蛋白；血漿存儲；其他單核細(xì)胞儲存2在8周之前不應(yīng)遞減系統(tǒng)性類固醇，除非認(rèn)為醫(yī)療需要(例如類固醇毒性)，且若在早期遞減，進(jìn)行‘8周等價’cgvhd評估以記錄反應(yīng)a1、2、3、4、6、8、10、12周的測試將±4天進(jìn)行，以考慮到周末、假日等附近的時間安排和管理靈活性。b16、20、24周的測試將±7天進(jìn)行，用于時間安排和管理靈活性。對于接受延長的il-2的參與者，還請參考針對附加隨訪需求的相關(guān)試驗方案章節(jié)。c16、24周d測試可安排至直至4周前，以考慮到時間安排和管理靈活性*在il-2開始后還將進(jìn)行4天(+/-1天)cbc/手動分類、血清肌酐和ldh的附加實驗室測試，以評估與血栓性微血管病相關(guān)的貧血、血小板減少、裂細(xì)胞和/或腎功能不全。對于具有妊娠可能的女性。+對于開始的8周il-2，至少每2周完成并回到臨床；且對于延長期限的il-2，至少每8周。評估毒性和反應(yīng)二者。接受treg富集細(xì)胞輸注的參與者可評估毒性。已接受treg富集細(xì)胞輸注加上至少6周il-2的參與者被認(rèn)為可評估反應(yīng)的缺乏。這些參與者具有根據(jù)本文所述定義分類的他們的反應(yīng)。例如且在實施例2中定義之外，慢性gvhd癥狀評分是指參與者使用經(jīng)確認(rèn)的慢性gvhd癥狀量表自我報告cgvhd的癥狀和體征。在基線和8、10、12周的結(jié)束時(以及在8周之前早期類固醇遞減的時間，如果必要的話)獲得自我報告的癥狀量表。慢性gvhd的類固醇使用是指參與者在基線時以及在8周il-2結(jié)束時記錄其皮質(zhì)類固醇的每日總劑量。在替代的皮質(zhì)類固醇每日劑量的情況下，為研究目的記錄平均日劑量。免疫評估是指參與者經(jīng)歷針對免疫功能的測試，其在il-2開始之前，以及在1、2、3、4、6、8、10、12、16和24周的結(jié)束時進(jìn)行。測試包括定量免疫球蛋白；血漿存儲；和其他單核細(xì)胞儲存。該i期研究的主要終點是確定連同1x106iu/m2/天皮下il-2給予至具有需要系統(tǒng)治療的類固醇難治性慢性gvhd的接受者的treg富集細(xì)胞的mtd。在8周il2治療后通過dlt評估m(xù)td?？紤]三個treg富集細(xì)胞遞增劑量以確定mtd：0.1x106細(xì)胞/kg(劑量水平a)；0.3x106細(xì)胞/kg(劑量水平b)；1x106細(xì)胞/kg(劑量水平c)。直至4x106treg富集細(xì)胞/kg的劑量按照文獻(xiàn)是良好耐受的，但在該研究中0.1x106treg富集細(xì)胞/kg將為初始劑量水平以提供分析緩沖。一組5名接受符合發(fā)布標(biāo)準(zhǔn)的產(chǎn)品的可評估參與者以各目標(biāo)劑量水平進(jìn)入(在初始4名參與者積累后具有28天中斷)。若參與者未發(fā)展dlt而需要從該研究早期移除，則他們被認(rèn)為不可用于確定mtd的評估。在特定劑量組招募額外的參與者以替代該組內(nèi)從研究移除的任何參與者。若在1組5名參與者內(nèi)觀測到≤1dlt，則進(jìn)行劑量遞增。若這是劑量水平c，則該劑量為mtd。若在1組中觀測到≥2dlt，則該mtd被認(rèn)為是超出的。若這是劑量水平a，則停止積累。若這是劑量水平b，則劑量水平a是mtd。若這是劑量水平c，則劑量水平b是mtd。采用該設(shè)計，若真實但未知的dlt率是10％，則劑量遞增的概率是0.92；若dlt率是20％則概率是0.74，但若dlt率是40％則概率是0.34。下表19提供了劑量遞增的操作特性。表19操作特性真實但未知的dlt率10％20％30％40％50％60％劑量遞增的概率(5名中≤1)0.920.740.530.340.190.09一旦確立mtd，則在mtd下治療附加的10名可評估參與者。采用10名可評估參與者，針對毒性的90％置信區(qū)間的最大寬度是在±28％以內(nèi)。樣本大小范圍將為約2-25名可評估的參與者，其取決于經(jīng)測試劑量水平的數(shù)目。還分析次要終點。例如，進(jìn)行clinimacs評估。評估使用clinimacs裝置實現(xiàn)成功的treg富集輸注產(chǎn)品的可行性。若白細(xì)胞分離產(chǎn)物包含≥70％細(xì)胞活力、陰性微生物學(xué)，則認(rèn)為其適合用于確定clinimacs選擇的可行性。輸注的clinimacs產(chǎn)物在處理后包含≥70％細(xì)胞活力、革蘭氏陰性染色/內(nèi)毒素、≥70％cd4+cd25+細(xì)胞和≥50％cd4+cd25+cd127-treg，并適合用于mtd評估。若用于確定mtd的適合產(chǎn)物的比率(可行率)是80％或更高則認(rèn)為clinimacs系統(tǒng)是可行的，且若50％或更低則認(rèn)為其是不可行的。在開始的10個產(chǎn)物中，若只有6個或更少的產(chǎn)物符合這些標(biāo)準(zhǔn)，則認(rèn)為該系統(tǒng)是不可行的。相反地，若開始的10個產(chǎn)物中≥7個符合該標(biāo)準(zhǔn)，則研究繼續(xù)進(jìn)行。采用該決策規(guī)則，若真實但未知的可行率是50％則早期停止的概率是0.83，且若可行率是80％則概率是0.12。還評估了制造treg富集產(chǎn)物符合目標(biāo)細(xì)胞劑量水平的可行性。若實際實現(xiàn)的細(xì)胞劑量低于目標(biāo)劑量水平，則實際給予的細(xì)胞劑量表明選擇用于10名患者擴(kuò)大組的推定mtd。次要終點還包括臨床響應(yīng)，如通過簡單描述性匯總統(tǒng)計描繪的treg富集輸注加上8周低劑量il-2的完全和部分反應(yīng)、穩(wěn)定和進(jìn)展的疾病、以及免疫效應(yīng)所匯總的。主要敘述性和圖表性分析次要終點。特別地，表征treg富集輸注加上8周低劑量il-2同時在細(xì)胞數(shù)目和細(xì)胞因子產(chǎn)生中的治療前和治療后改變兩方面，對b細(xì)胞、nk細(xì)胞或樹突細(xì)胞的免疫效應(yīng)。此外，若樣本大小允許，則探索反應(yīng)的臨床(患者和移植相關(guān)的)和生物(例如treg、tcon數(shù)目、treg:tcon比率和treg功能)預(yù)測器。還對反應(yīng)進(jìn)行監(jiān)測。接受至少6周il-2的參與者可評估反應(yīng)的缺乏，即便具有主要試驗方案治療差異或即便他們是不適合的。分配各參與者以下類別中的一種：1)按照nih標(biāo)準(zhǔn)完成完全cgvhd響應(yīng)，2)按照nih標(biāo)準(zhǔn)部分cgvhd響應(yīng)，3)按照nih標(biāo)準(zhǔn)無反應(yīng)(包括病情穩(wěn)定)，4)按照nih標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)展性cgvhd，5)惡性疾病復(fù)發(fā)，6)因毒性的早期死亡，7)因為其它原因的早期死亡，或9)未知(不能評估，數(shù)據(jù)不足)。通過任意約定，類別9通常指定臨床數(shù)據(jù)庫中任意數(shù)據(jù)類型的“未知”狀態(tài)。還對毒性進(jìn)行監(jiān)測。接受treg富集細(xì)胞產(chǎn)物的所有參與者可評估毒性。cgvhd的進(jìn)展(按照nih標(biāo)準(zhǔn))被認(rèn)為是dlt。在之前研究中，無患者在8周il-2期間經(jīng)歷cgvhd進(jìn)展以致他們按照治療醫(yī)師的判斷需要附加的治療或增加的類固醇。還評估參與者的惡性疾病復(fù)發(fā)和感染。實施例4:與體外光分離置換法(ecp)相結(jié)合的代表性低劑量il-2治療方案以下提供了與ecp相結(jié)合的低劑量il-2治療方案的代表性、非限制性實施方式。在其它實施方式中，低劑量il-2治療方案可替換為實施例1的多次-可變劑量il-2治療方案和/或本文所述的方法，包括來自任意實施例的任意組合。例如且除非另外指明，來自實施例2的標(biāo)準(zhǔn)可全部或部分與以下實施例4中所述的那些一起使用。ecp最常見的適應(yīng)癥是同種異體hsct后糖皮質(zhì)激素難治性cgvhd。在急性gvhd的小鼠模型中的初始研究表明ecp的治療機(jī)制依賴于cd4+cd25+foxp3+的調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(treg)，其用于控制由常規(guī)t細(xì)胞(tcon)介導(dǎo)的自體和同種免疫反應(yīng)。然而，支持該ecptreg假說的人類數(shù)據(jù)是缺乏的。平行地，用于糖皮質(zhì)激素難治性cgvhd的低劑量白細(xì)胞介素-2(il-2)的人類試驗顯示出伴隨體內(nèi)treg數(shù)目和功能增加的臨床響應(yīng)。然而，半數(shù)治療患者未具有臨床響應(yīng)且長期ecp期間免疫抑制物的遞減是緩慢的，且經(jīng)常不完全(dignan等人，(2012)br.j.haematol.58:62-78；flowers等人，(2008)blood112:2667-2674)。在ecp患者中沒有以下研究：1)報道定量的treg和dc亞群數(shù)據(jù)，2)報道相關(guān)的細(xì)胞因子改變，或3)將任意這些改變與ecp劑量或淋巴細(xì)胞凋亡程度相關(guān)聯(lián)。ecp和低劑量il-2二者在cgvhd中均具有可測量的臨床療效。基于本文所述的結(jié)果，據(jù)信聯(lián)合干預(yù)策略顯著調(diào)節(jié)treg擴(kuò)張以更好抑制cgvhd，以及期望抑制免疫反應(yīng)的其它病癥。il-2同時在體外和體內(nèi)遞送增殖和存活信號至treg。實際上，4名受試者已如本文所述接受il-2和ecp用于難治性皮膚cgvhd而無副作用。全部在3個月時具有客觀的cgvhd反應(yīng)，具有增加的皮膚柔韌度，且全部被選擇繼續(xù)il-2和ecp。重要的是，2名測試受試者中的2名采用il-2和ecp相比于單一療法具有體內(nèi)treg上升。一名對il-2具有部分反應(yīng)的患者在延長期限的il-2治療期間開始ecp，相比于單獨的il-2具有增強(qiáng)的cgvhd臨床響應(yīng)和treg的1.7倍上升。在對ecp反應(yīng)不足的另一患者中，加入低劑量il-2誘導(dǎo)cgvhd響應(yīng)伴隨相比于單獨的ecp的treg的33倍上升。該研究擴(kuò)大至在1-16周每周兩次ecp的16周試驗，在8-16周期間以1x106iu/m2/天的劑量連續(xù)加入每日低劑量il-2，目標(biāo)是優(yōu)化用于cgvhd的ecp治療。在一些實施方式中，該研究是12周研究，其中具有類固醇難治性cgvhd的患者將接受1-12周ecp，連續(xù)加入低劑量il-26-12周。使用以下患者群體標(biāo)準(zhǔn)：1)具有需要系統(tǒng)治療的cgvhd的患者。具有需要系統(tǒng)治療的廣泛cgvhd或有限cgvhd的患者是有資格的；和2)對至少4周的≥0.25mg/kg/天劑量的強(qiáng)的松(或等價物)反應(yīng)不足。以下詳述了特定的入選和排除標(biāo)準(zhǔn)：1)參與者數(shù)目：25-34；2)研究設(shè)計和方法學(xué)：ii期安全性和有效性分析如下：主要終點是確定在類固醇難治性cgvhd中ecp加上低劑量每日scil-2的總體臨床響應(yīng)率。例如，可評估16周時的總體cgvhd反應(yīng)率、加至ecp的8周每日il-2的毒性、ecp加上低劑量il-2的免疫效應(yīng)、ecp加上低劑量il-2期間的強(qiáng)的松使用、以及研究進(jìn)入后的總體和無進(jìn)展存活、非復(fù)發(fā)死亡率和1年時復(fù)發(fā)。次要終點是1)確定ecp加上低劑量scil-2治療的毒性；2)評估ecp加上低劑量每日scil-2的免疫效應(yīng)；3)確定采用ecp加上低劑量il-2治療的持續(xù)強(qiáng)的松使用；和4)評估開始ecp加上低劑量il-2后的總體存活、無進(jìn)展存活、非復(fù)發(fā)死亡率和1年時復(fù)發(fā)。根據(jù)以下合格標(biāo)準(zhǔn)選擇參與者：1)7-8/8hla-匹配的成人供體同種異體干細(xì)胞移植的接受者，具有清髓性或非清髓性預(yù)處理方案；2)參與者必須具有類固醇難治性cgvhd。類固醇難治性cgvhd被定義為盡管使用≥0.25mg/kg/天(或每隔一日0.5mg/kg)的強(qiáng)的松至少4周(或等價劑量的替代皮質(zhì)類固醇)卻具有持續(xù)的cgvhd體征和癥狀(表2和3)，沒有完全消退體征和癥狀。患有需要系統(tǒng)治療的廣泛慢性gvhd或有限慢性gvhd的患者是適合的；3)招募之前接受4周穩(wěn)定劑量的皮質(zhì)類固醇；4)招募之前4周未加入或減去其他免疫抑制藥物(例如，鈣調(diào)磷酸酶-抑制劑、西羅莫司、嗎替麥考酚酯)。免疫抑制藥物的劑量可基于該藥物的治療范圍進(jìn)行調(diào)整；5)患者年齡≥18歲。因為關(guān)于在<18歲的參與者中使用il-2，當(dāng)前沒有可用的劑量或不良事件數(shù)據(jù)，將兒童從該研究排除；6)估計的預(yù)期壽命大于3個月；7)ecog表現(xiàn)狀態(tài)0-2(表4)；8)參與者必須具有如下定義的足夠器官功能：a)肝:足夠的肝功能(總膽紅素<2.0mg/dl-在患有g(shù)ilbert綜合征的患者中例外允許；ast(sgot)/alt(sgpt)≤2xuln)，除非肝功能缺陷是推測的cgvhd的表現(xiàn)。對于將具有異常的肝功能檢查(lfts)作為cgvhd的患者，將需要在招募之前在肝活檢組織上有記錄在案的gvhd。若治療醫(yī)師將異常lfts記錄為與肝cgvhd相符，則涉及其他器官系統(tǒng)的活性cgvhd背景下的異常lfts也是允許的，且在該情況下將不強(qiáng)制進(jìn)行肝活檢；b)腎:血清肌酐在正常機(jī)構(gòu)限值內(nèi)或?qū)τ诩◆皆跈C(jī)構(gòu)正常之上的參與者水平肌酐清除率>60ml/min/1.73m2；c)通過以下指示的足夠的骨髓功能：anc>1000/mm3和血小板>50,000/mm3，無生長因子或輸血；和d)心臟:招募之前6個月內(nèi)無心肌梗死或nyhaiii或iv級心力衰竭、不受控制的心絞痛、嚴(yán)重不受控制的室性心律失常、或急性缺血或主動傳導(dǎo)系統(tǒng)異常的心電圖證據(jù)。研究進(jìn)入之前，任何ecg異常必須是研究者記錄為非醫(yī)學(xué)相關(guān)的；9)il-2對發(fā)育中的人類胎兒的作用是未知的。因為該原因且因為已知化療劑是致畸的，具有懷胎可能的女性和男性必須同意在研究進(jìn)入之前和參與研究期間使用充分避孕(激素或屏障的生育控制方法；禁欲)。當(dāng)參與該研究時若女性受孕或疑似她受孕，則她應(yīng)當(dāng)立即告知其治療醫(yī)師；和10)對簽署書面知情同意書具有理解能力和意愿。根據(jù)以下排除標(biāo)準(zhǔn)排除參與者：1)>1mg/kg/天的持續(xù)強(qiáng)的松(或等價物)劑量需求；2)同時使用鈣調(diào)磷酸酶-抑制劑加上西羅莫司的參與者。單獨的任一試劑是可接受的；3)血栓性微血管病、溶血性尿毒癥綜合征或血栓性血小板減少性紫癜病史；4)招募之前4周內(nèi)暴露于任何新的免疫抑制藥物；5)招募之前4周內(nèi)體外光分離置換(ecp)或利妥昔單抗；6)ecp的任何禁忌癥，即肝素或8-mop的禁忌癥；7)招募之前100天內(nèi)移植后暴露任何新的免疫抑制藥物(例如，阿倫單抗)；8)招募之前100天內(nèi)供體淋巴細(xì)胞輸注；9)活性惡性病復(fù)發(fā)；10)活性不受控制的感染；11)不能順應(yīng)il-2治療方案；12)不受控制的心絞痛或有癥狀的充血性心力衰竭(nyhaiii或iv級；表9)；13)器官移植(同種異體移植)接受者；14)處于聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的hiv-陽性個體是不適合的，因為與同種異體hsct后使用的試劑有藥代動力學(xué)相互作用的可能性。此外，這些個體處于增加的致命感染的風(fēng)險中。當(dāng)指示時在接受聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的參與者中進(jìn)行適當(dāng)?shù)难芯浚?5)具有活性乙型肝炎或丙型肝炎的個體是不適合的，因為他們處于hsct后致命的治療相關(guān)的肝毒性的高風(fēng)險中；16)招募之前4周內(nèi)其它研究藥物，除非被主要研究者清除；和17)因為致畸或墮胎作用的可能性而排除孕婦。因為在乳兒中具有在繼發(fā)承繼于接受治療的母親未知但潛在的不良事件風(fēng)險，所以應(yīng)停止母乳哺育。根據(jù)以下治療方案治療受試者：各研究參與者按照輸血醫(yī)學(xué)sop接受醫(yī)護(hù)標(biāo)準(zhǔn)每周兩次的ecp16周。簡而言之，采用therakosuvarxts系統(tǒng)進(jìn)行ecp。按照制造商指南通過受試者血細(xì)胞比容和血容量確定處理的血容量和8-mop劑量。還可在光活化之前從ecp再循環(huán)袋采集500μl血沉棕黃層小份并表征wbc亞群的絕對數(shù)。ecp和ecp加上il-2的免疫影響的詳細(xì)評估可在外周血treg、tcon、cd8、b、nk和dc細(xì)胞亞群上進(jìn)行，包括凋亡群體。在各ecp循環(huán)后測量細(xì)胞因子。還確定反應(yīng)與免疫變量的經(jīng)時關(guān)聯(lián)，其包括分析強(qiáng)的松使用、總體存活、無進(jìn)展存活、非復(fù)發(fā)死亡率和復(fù)發(fā)。清血法醫(yī)師可評估ecp相關(guān)性毒性，包括出血、血球減少和程序不耐受(即，全身癥狀或心血管不穩(wěn)定)。還對接受任意ecp或ecp加上il-2的參與者中的毒性進(jìn)行監(jiān)測。還確定反應(yīng)預(yù)測器，例如使用單變量分析，包括先前cgvhd治療數(shù)目的影響。臨床響應(yīng)者在16周后依照醫(yī)護(hù)標(biāo)準(zhǔn)繼續(xù)ecp，和或不和延長期限的il-2治療。若進(jìn)行ecp的參與者在8周之前經(jīng)歷需要附加治療的cgvhd惡化，經(jīng)與研究pi磋商，他們可早期開始低劑量il-2。8周后，即，從結(jié)束8-16周，參與者開始每日低劑量scil-2(1x106iu/m2/天)用于自我給藥剩下的8周ecp。通常以門診治療標(biāo)準(zhǔn)給予il-2。在實施例2中描述預(yù)期的毒性和潛在風(fēng)險以及劑量改變。伴隨繼續(xù)無劑量改變的il-2給予和強(qiáng)的松(或等價類固醇)的給予。若認(rèn)為符合參與者的利益(例如類固醇毒性)，則在治療醫(yī)師的裁量下允許遞減強(qiáng)的松。值得注意的是，其它免疫抑制藥物遞減期間臨床穩(wěn)定的cgvhd被認(rèn)為是il-2功效的證據(jù)且其它免疫抑制療法遞減期間cgvhd的進(jìn)展不被認(rèn)為是il-2毒性或缺乏功效的證據(jù)。在其它實施方式中，給予cgvhd受試者每周兩次ecp共12周以及6-12周期間6周1x106iu/m2/天的il-2的一階段單臂試驗，所述受試者例如以下那些：對于至少4周的劑量為0.25/mg/kg/天的強(qiáng)的松或其等價物反應(yīng)不足；總白血球計數(shù)≥1000/mm3，血小板≥25,000/mm3；和無先前ecp或il-2治療。延長期限的治療：完成16周研究后，允許經(jīng)歷臨床受益(完全或部分反應(yīng)；以及不符合nih部分反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的微反應(yīng))與可接受的毒性概況的患者在治療醫(yī)師的裁量下繼續(xù)無限期延長期限的il-2治療。對于合理的臨床或管理原因，延長期限的治療的重新開始可延遲僅達(dá)2周。重新開始治療中更長的延遲必須得到主要研究者的批準(zhǔn)。進(jìn)行延長的il-2的情況下，每4周再評估患者以確定是否應(yīng)在治療醫(yī)師的裁量下繼續(xù)il-2治療，所述治療醫(yī)師記錄繼續(xù)il-2治療的基本原理。在持續(xù)進(jìn)行的基礎(chǔ)上采集延長期限的il-2的毒性數(shù)據(jù)并將所有治療相關(guān)的sae報告至主要研究者和irb。延長期限的il-2期間其它免疫抑制藥物的遞減是在治療醫(yī)師的裁量下進(jìn)行。在可歸因于il-2的毒性事件中，在治療醫(yī)師的裁量下允許如本文所述的劑量改變。進(jìn)行延長期限的il-2治療的患者需要的評估包括：1)在當(dāng)?shù)鼗蛟谘芯恐行呐R床隨訪用于評估每4周(±2周)il-2的毒性和臨床受益。需要的實驗室測試是具有分類的cbc和血清化學(xué)-葡萄糖、bun、肌酐、總膽紅素、堿性磷酸酶、ast、alt、鈣。2)每8周(±4周)在研究中心臨床隨訪。需要的實驗室試驗(除了以上以外)包括包含定量血清免疫球蛋白、血漿存儲、和其他單核細(xì)胞儲存的免疫試驗。針對所有參與者在ecp之前2周內(nèi)進(jìn)行以下評估：1)病史和治療患者疾病的基本原理的文檔(包括類固醇劑量)；2)體格檢查，包括生命體征、體重、表現(xiàn)狀況；3)cgvhd評估；4)生育潛能女性的妊娠試驗；5)血液學(xué)：具有分類的全血細(xì)胞計數(shù)(cbc)；6)血清化學(xué)：葡萄糖、bun、肌酐、尿酸、總膽紅素、堿性磷酸酶、ldh、總蛋白、白蛋白、ast、alt、和鈣；7)甲狀腺功能測試(tsh、t4、游離-t4)；8)cmv病毒載量；9)定量血清免疫球蛋白；和10)免疫學(xué)：血漿存儲和其他單核細(xì)胞儲存。在針對具有涉及特定器官系統(tǒng)的cgvhd的患者進(jìn)行ecp之前兩周內(nèi)需要以下評估(除非指明的情形)：1)采用希曼試驗的眼部檢查，對于具有眼部cgvhd的患者(可選的)；2)皮膚病學(xué)(±活檢)，對于具有皮膚cgvhd的患者；3)口腔檢查(±活檢)，對于具有口腔cgvhd的患者(可選的)；4)肺功能測試，對于具有肺部cgvhd臨床表現(xiàn)的患者(治療之前4周內(nèi)至之后1周)；和5)受影響關(guān)節(jié)的屈曲評估，對于具有與cgvhd相關(guān)的攣縮或肌肉骨骼涉及的個體。ecp和il-2治療(1、2、4、6、8、9、10、12、14周的結(jié)束)和停止研究(16周的結(jié)束)期間評估以下：1)病史和臨床檢查(包括類固醇劑量，8&16周)；2)研究團(tuán)隊成員回顧的藥物日志(伴隨il-2治療開始)；3)將與病史和臨床檢查同日進(jìn)行的毒性評估；4)血液學(xué)：具有分類的cbc；5)血清化學(xué)：葡萄糖、bun、肌酐、尿酸、總膽紅素、堿性磷酸酶、ldh、總蛋白、白蛋白、ast、alt、和鈣；6)cmv病毒載量(或按照機(jī)構(gòu)實踐)；7)定量血清免疫球蛋白(4、8、12、16周)；8)免疫學(xué)：血漿存銀和附加單核細(xì)胞儲存(1、2、4、6、8、9、10、12、14、16周)；和9)甲狀腺功能測試(tsh、t4、游離-t4)(16周)。對于具有涉及特定器官的cgvhd的患者，在結(jié)束8周和16周的研究時需要(除非指明的情況)以下評估(除了cgvhd癥狀評分以外)：1)cgvhd評估；2)采用希曼試驗的眼部檢查，對于具有眼部cgvhd的患者(可選的)；3)皮膚病學(xué)評估(±活檢)，對于具有皮膚cgvhd的患者；4)口腔檢查(±活檢)，對于具有口腔cgvhd的患者(可選的)；5)肺功能測試，對于具有肺部cgvhd臨床表現(xiàn)的患者；和6)受影響關(guān)節(jié)的屈曲評估，對于具有與cgvhd相關(guān)的攣縮或肌肉骨骼涉及的個體。下表是用于記錄的數(shù)據(jù)的匯總：表20x-需要評估ο-具有這些器官系統(tǒng)的臨床牽連(口腔和眼部評估是可選的)，為了時間安排的靈活性，基線肺功能測試可安排至直至開始治療前4周至之后1周。1免疫學(xué)：血漿存儲；其他單核細(xì)胞儲存。2不應(yīng)遞減系統(tǒng)性類固醇，除非具有毒性，例如嚴(yán)重高血糖癥(有研究pi的許可)。a1、2、4、6、8、9、10、12、14周的測試將±4天進(jìn)行，以考慮到周末、假日等周圍的時間安排和管理靈活性。b在8周用于類固醇劑量和cgvhd評估。c延長的治療期間的測試將±2周進(jìn)行，以考慮到患者旅行、工作、假日等周圍的時間安排和管理靈活性。d4、8、12周。*在il-2開始后還將進(jìn)行4±2天cbc/手動分類、血清肌酐和ldh的附加實驗室測試，以評估與血栓性微血管病相關(guān)的貧血、血小板減少、裂細(xì)胞和/或腎功能不全。δ在強(qiáng)制性研究中心隨訪的時間每8周(±4周)。#在強(qiáng)制性研究中心隨訪的時間1年期間每16周(+/-4周)。對于具有妊娠可能的女性。+研究il-2治療期間至少每2周完成并回到臨床。對于延長期限的il-2，至少每8周完成并回到臨床。評估毒性和反應(yīng)二者。接受至少一個劑量il-2的參與者可評估il-2治療毒性。接受至少4周il-2并已再評估他們的疾病的參與者被認(rèn)為可評估結(jié)合il-2加上ecp反應(yīng)。這些參與者具有根據(jù)本文提供以及以下描述的定義分類的他們的反應(yīng)。例如且在實施例2中定義之外，慢性gvhd癥狀評分是指參與者使用經(jīng)確認(rèn)的慢性gvhd癥狀量表自我報告cgvhd的癥狀和體征。在基線以及8和16周時獲得自我報告的癥狀量表。慢性gvhd的類固醇使用是指參與者在基線時以及在8和16周時記錄其皮質(zhì)類固醇的每日總劑量。在替換皮質(zhì)類固醇每日劑量的情況下，為研究目的記錄平均日劑量。免疫評估是指參與者經(jīng)歷針對免疫功能的測試，其在基線時，以及在1、2、4、6、8、9、10、12、14和16周時進(jìn)行。測試包括血漿存儲和其他單核細(xì)胞儲存。在基線時以及在4、8、12和16周時測試定量免疫球蛋白。對于在患有類固醇難治性慢性移植物抗宿主病(cgvhd)的患者中評估12周體外光分離置換(ecp)并在6-12周加入每日低劑量皮下(sc)白細(xì)胞介素-2(il-2)的功效的一階段ii期試驗，主要終點是如在治療12周時評估的總體反應(yīng)。基于隨機(jī)2期ecp對比安慰劑試驗(40％皮膚cgvhd響應(yīng)率和33％非皮膚cgvhd響應(yīng)率)(flowers等人，(2008)blood112:2667-2674)，若總體反應(yīng)率≥60％則il-2加上ecp是有效的，且若≤40％則是無價值的。采用該設(shè)計，若真實但未知的反應(yīng)率是60％則得出有效結(jié)論的概率是0.84，且若真實率是40％則概率是0.09。在之前的1期il-2研究中相同患者群體中中位基線treg計數(shù)是16.8細(xì)胞/μl。假設(shè)相似的基線treg計數(shù)，在34名患者中若效應(yīng)量(即，平均差除以其標(biāo)準(zhǔn)偏差)是1則將有>99％概率在6周ecp時檢測treg計數(shù)增加至33.6細(xì)胞/μl，且若效應(yīng)量是0.6則90％概率。還相信ecp加上il-2對于treg計數(shù)具有協(xié)同效應(yīng)。在34名患者中，若30名完成12周治療且treg從6周時的33.6上升至12周時的200，若效應(yīng)量是1則將有>99％概率檢測該差異且若效應(yīng)量是0.6則87％概率?？v向數(shù)據(jù)分析評估treg經(jīng)時增加且確定其是否與單獨的ecp或ecp加上il-2相關(guān)。還進(jìn)行免疫和臨床響應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)分析。受試者的性別不被用作該研究中入選或排除的標(biāo)準(zhǔn)且對于少數(shù)族裔的應(yīng)計(accrual)沒有限制。在2013年，41％的全部已接受移植的患者是女性且約10％的患者是少數(shù)族裔?；谖覀?013年移植項目中該自我報告中的種族和性別，通過性別和種族定義的亞組中預(yù)期的應(yīng)計在下表21中匯總。表21通過引用并入本文提及的所有出版物、專利和專利申請均通過引用以其整體并入本文，就如同指示各出版物、專利或?qū)＠暾埫鞔_特別地和單獨地通過引用并入。在沖突的情況下，將以本申請(包括本文中的任意定義)為準(zhǔn)。以登錄號的形式與公共數(shù)據(jù)庫中的條目相關(guān)聯(lián)的任意多核苷酸和多肽序列也均通過引用以其整體并入本文，例如在萬維網(wǎng)上由基因組研究所(tigr)和/或在萬維網(wǎng)上由國家生物技術(shù)信息中心(ncbi)所維護(hù)的那些。等同物本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到或者能夠確定使用不超過常規(guī)的實驗就能夠得到本文所述本發(fā)明特定實施方式的多種等同物。此類等同物旨在包括在以下權(quán)利要求中。當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12