本發(fā)明涉及靶向充氣微囊的懸浮液，其制備物的制劑，及其用作診斷劑的用途。

背景技術(shù)：

近年來造影劑的快速發(fā)展已經(jīng)產(chǎn)生了許多不同的組合物和制劑，其可用于人或動(dòng)物體的器官和組織的造影增強(qiáng)成像以及其治療性處理。

特別適用于超聲造影成像的一類造影劑包括分散在水性介質(zhì)中的納米和/或微米尺寸的氣泡的懸浮液。氣體通常被夾帶或包封在包含例如乳化劑、油、增稠劑或糖的穩(wěn)定化膜層中。這些穩(wěn)定化的氣泡(分散在合適的生理溶液中)通常在本領(lǐng)域中有多種術(shù)語相稱，這一般取決于用于其制備的穩(wěn)定化材料；這些術(shù)語包括例如“微球”、“微泡”、“微膠囊”或“微氣球”，在本文統(tǒng)稱為“充氣微囊”(或“微囊”)。

特別令人目標(biāo)的是充氣微囊的水性懸浮液，其中氣體的氣泡通過非常薄的封皮(膜)結(jié)合在氣體/液體界面處，所述封皮(膜)包括置于氣體與液體界面處的穩(wěn)定化兩親性材料(通常為磷脂)。充氣微囊的水性懸浮液及其制備的實(shí)例公開于例如us5,271,928、us5,445,813、us5,413,774、us5,556,610、5,597,549、us5,827,504、wo97/29783和wo2004/069284中。

最近，已經(jīng)注意到所謂的“分子成像”，其中將合適的靶特異性組分用于造影劑的配制中，以允許對(duì)器官或組織的選擇性造影增強(qiáng)成像。靶向配體的實(shí)例包括例如肽、蛋白質(zhì)、抗體、適體或碳水化合物，其能夠與在致病過程(例如血管生成、炎癥或血栓形成)期間由器官或組織表達(dá)的特異性受體結(jié)合。

例如，國際專利申請(qǐng)wo03/74005、wo03/084574和wo2007/067979描述了合適的肽，其選擇性靶向脆性斑塊(vulnerableplaque)中的受體和腫瘤特異性受體，如激酶結(jié)構(gòu)域區(qū)域(kdr)和vegf(血管內(nèi)皮生長因子)/kdr復(fù)合物。如這些專利申請(qǐng)中所述，這些肽用于配制適用于結(jié)合kdr或vegf/kdr復(fù)合物的靶特異性充氣微囊。

一般通過在生理可接受的氣體的存在下將固體制劑(例如以粉末狀殘留物的形式，通過冷凍干燥制備的)懸浮在生理學(xué)上可接受的水性溶液中來制備充氣微囊。然后一般可以通過(靜脈內(nèi))注射施用所獲得的充氣微囊懸浮液。

如申請(qǐng)人所觀察到的，固體制劑在水性溶液中的懸浮液(在本領(lǐng)域中也稱為“干燥殘余物的重構(gòu)”)可以代表微囊制備過程的關(guān)鍵步驟，且懸浮步驟的許多參數(shù)(包括例如等滲劑的類型及其ph)可以影響最終懸浮液中微囊的特性。

申請(qǐng)人現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)組氨酸尤其可用作制備含肽充氣微囊在含有碳水化合物的生理可接受水性溶液中的懸浮液的ph調(diào)節(jié)劑。

發(fā)明概述

本發(fā)明的一個(gè)方面涉及充氣微囊的水性懸浮液，所述微囊包含磷脂和靶向配體，所述靶向配體包含具有選自agptwceddwyycwlfgtgggk(seqidno.01)、vcwedswggevcfrydpgggk(seqidno.02)或其組合的氨基酸序列的肽，所述懸浮液還包含碳水化合物和組氨酸。

優(yōu)選地，所述微囊進(jìn)一步包含脂肪酸。

優(yōu)選地，靶向配體是二聚體肽的形式，其包含seqidno.01和seqidno.02的組合。

更優(yōu)選地，所述二聚肽具有下式i：

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶向配體共價(jià)結(jié)合于磷脂，優(yōu)選地聚乙二醇化的磷脂。

特別優(yōu)選的是式(ii)的脂肽形式的靶向配體：

優(yōu)選地，所述碳水化合物是葡萄糖、蔗糖或甘露醇，更優(yōu)選地是葡萄糖。

本發(fā)明的另一方面涉及一種用于制備充氣微囊的懸浮液的冷凍干燥的前體制劑，其包含：

磷脂、靶向配體、組氨酸、任選地脂肪酸、任選地聚乙二醇化的磷脂和凍干劑。

本發(fā)明的另一方面涉及藥物試劑盒，其包含：

(a)如上所定義的冷凍干燥的前體制劑；和

(b)用于重構(gòu)所述前體的含碳水化合物的水性溶液。

發(fā)明詳述

一般可以通過在合適的氣體存在下將冷凍干燥的前體制劑(含有形成充氣微囊的相關(guān)組分)懸浮在生理學(xué)上可接受的媒介物中來制備充氣微囊的水性懸浮液。一般情況下，注射溶液優(yōu)選地為等滲摩爾濃度的，使得其滲透質(zhì)量摩爾濃度(osmolality)位于血液的滲透質(zhì)量摩爾濃度的生理范圍內(nèi)，通常在285至310mosmol/kg之間。如本領(lǐng)域已知的，實(shí)際溶液的滲透質(zhì)量摩爾濃度對(duì)應(yīng)于含有非解離溶質(zhì)的理想溶液的摩爾濃度，并以滲摩或毫滲摩每千克溶劑(分別為每千克的滲摩數(shù)或每千克的毫滲摩數(shù))表示。

一般情況下，等滲摩爾濃度的鹽水(例如nacl)溶液是用于重構(gòu)干燥制劑以獲得所需的注射用微囊懸浮液的水性媒介物的第一選擇。如申請(qǐng)人所觀察到的，然而應(yīng)優(yōu)選避免將鹽水媒介物(或更通常的含電解質(zhì)的媒介物)用于制備含有某些靶向肽的微囊，特別是包含上述氨基酸序列的微囊。這種在含有鹽水媒介物的懸浮液中形成的含肽的充氣微囊實(shí)際上傾向于彼此聚集以形成多少有些穩(wěn)定的聚集體，這可能降低制備的功效并且可能導(dǎo)致安全性問題，例如在如果聚集體尺寸太大的情況下。

因此，為了限制這種聚集現(xiàn)象，可將替代液體用于懸浮干燥制劑，例如市售的碳水化合物溶液。

然而，商業(yè)化的注射用水性碳水化合物溶液(例如甘露醇，蔗糖或葡萄糖溶液)可以顯示出變化的ph值。例如，商業(yè)化的注射用5％葡萄糖溶液可以具有范圍為約3.2至約6.5的ph值。在本說明書和權(quán)利要求書中，若無特別說明，術(shù)語“葡萄糖”是指天然存在的對(duì)映異構(gòu)體“d-葡萄糖”，也稱為“右旋糖”。

申請(qǐng)人現(xiàn)在已經(jīng)觀察到，含有靶向肽(特別是上文所列的kdr-結(jié)合肽)的制劑當(dāng)分散于不同ph值的碳水化合物(特別是葡萄糖)溶液中時(shí)，使得微囊懸浮液的最終特性顯示出顯著的變異性。具體而言，已經(jīng)觀察到當(dāng)用約6.5ph的溶液重構(gòu)干燥制劑時(shí)，提供具有相對(duì)高數(shù)量的微囊的懸浮液，當(dāng)用較低ph的溶液重構(gòu)相同的干燥制劑時(shí)，懸浮液中的微囊數(shù)量可能會(huì)減少。

為了避免在最終懸浮液中這種低ph值的負(fù)面影響，可以使用ph調(diào)節(jié)劑，以便在適當(dāng)?shù)膒h(通常為約6至約8.5，優(yōu)選地為約7至約8)下發(fā)生干燥殘余物的重構(gòu)。然而，申請(qǐng)人已經(jīng)觀察到大多數(shù)常規(guī)ph調(diào)節(jié)劑在注射用碳水化合物溶液的通常ph范圍內(nèi)顯示有一定數(shù)量的缺陷。

例如，當(dāng)分散溶液具有相對(duì)低的ph時(shí)，應(yīng)當(dāng)以相當(dāng)高的濃度將堿化劑如碳酸氫鈉加入到懸浮液中，以允許形成的微囊有最佳的再分散。另一方面，如果分散溶液的ph值相對(duì)高，則如此高濃度的堿化劑會(huì)導(dǎo)致最終懸浮液中的ph值過高，這與懸浮液的靜脈內(nèi)注射不相容。

應(yīng)以相對(duì)高濃度加入常規(guī)緩沖劑如tris/hcl緩沖液或磷酸鹽緩沖液，以在整個(gè)微囊制備范圍內(nèi)獲得所需的ph調(diào)節(jié)作用；然而已經(jīng)觀察到，這樣高的濃度可以決定微囊制備過程中的不期望缺陷，從而對(duì)最終懸浮液中的微囊的特性產(chǎn)生可能的負(fù)面影響。

與上述ph調(diào)節(jié)劑的負(fù)面影響相反，申請(qǐng)人現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，組氨酸使得多種配方(具體而言是含有不同量的靶向肽)的不同干燥殘余物在市售碳水化合物分散溶液的一般ph值范圍內(nèi)再分散時(shí)，提供可接受的充氣微囊懸浮液。此外，已經(jīng)觀察到組氨酸可以在相對(duì)大的濃度范圍內(nèi)使用，而不會(huì)對(duì)微囊的最終懸浮液的特性有負(fù)面影響。

通常可以通過將含磷脂的制劑溶解在水性載體中來制備根據(jù)本發(fā)明的充氣微囊的液體懸浮液。因此，制劑包含任選與另外的兩親性物質(zhì)(例如脂肪酸)組合的磷脂；靶向肽優(yōu)選地以脂肽(即共價(jià)結(jié)合磷脂的肽)存在于制劑中。制劑通常為冷凍干燥(凍干)的制劑的形式，優(yōu)選包含凍干添加劑?？梢酝ㄟ^在生理可接受氣體存在下將所述制劑與生理上可接受的液體載體混合(或重構(gòu))來制備本發(fā)明的充氣微囊。

磷脂

如本文所用，術(shù)語“磷脂”旨在包括含有至少一個(gè)磷酸酯基團(tuán)和至少一個(gè)，優(yōu)選兩個(gè)(c12-c24)烴鏈的兩親化合物，其能夠在最終微泡懸浮液中的氣-水邊界界面形成穩(wěn)定化膜層(一般為單分子層形式)。因此，這些材料在本領(lǐng)域中也被稱為“成膜磷脂”。

術(shù)語磷脂包括天然存在的、半合成的或合成的產(chǎn)物，其可以單獨(dú)使用或作為混合物使用。

合適的磷脂的實(shí)例包括具有一個(gè)或優(yōu)選地兩個(gè)(相同或不同)脂肪酸殘基并具有磷酸的甘油的酯，其中磷酸殘基又結(jié)合于親水基團(tuán)，例如膽堿(磷脂酰膽堿-pc)、絲氨酸(磷脂酰絲氨酸-ps)、甘油(磷脂酰甘油-pg)、乙醇胺(磷脂酰乙醇胺-pe)、肌醇(磷脂酰肌醇)。僅具有一個(gè)脂肪酸殘基的磷脂的酯通常在本領(lǐng)域中稱為磷脂的“溶血”形式或“溶血磷脂”。磷脂中存在的脂肪酸殘基通常是長鏈脂肪族酸，通常含有12-24個(gè)碳原子，優(yōu)選地14-22個(gè)；脂肪族鏈可以含有一個(gè)或多個(gè)不飽和或優(yōu)選地完全飽和的基團(tuán)。包括在磷脂中的合適的脂肪酸的實(shí)例是例如月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、山萮酸、油酸、亞油酸和亞麻酸。優(yōu)選地，使用飽和脂肪酸如肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸和花生酸。

磷脂的其它實(shí)例是磷脂酸，即甘油-磷酸與脂肪酸的二酯；鞘脂如鞘磷脂，即其中具有脂肪酸的甘油二酯的殘基被神經(jīng)酰胺鏈替代的那些磷脂酰膽堿類似物；心磷脂，即1,3-二磷脂酰甘油與脂肪酸的酯；糖脂如神經(jīng)節(jié)苷脂gm1(或gm2)或腦苷脂；糖脂；硫脂和鞘糖脂。

天然磷脂的實(shí)例是天然卵磷脂(磷脂酰膽堿(pc)衍生物)，例如一般是大豆或蛋黃卵磷脂。

半合成磷脂的實(shí)例是天然存在的卵磷脂的部分或完全氫化的衍生物。優(yōu)選的磷脂為磷脂酰膽堿的脂肪酸二酯、乙基磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇或鞘磷脂。

磷脂的具體實(shí)例是例如二月桂?；字Ｄ憠A(dlpc)、二肉豆蔻?；字Ｄ憠A(dmpc)、二棕櫚酰基磷脂酰膽堿(dppc)、二花生?；字Ｄ憠A(dapc)、二硬脂?；字Ｄ憠A(dspc)、二油?；字Ｄ憠A(dopc)、1,2-二硬脂?；?sn-甘油酰-3-乙基磷酸膽堿(乙基-dspc)、雙十五酰基磷脂酰膽堿(dpdpc)、1-肉豆蔻?；?2-棕櫚?；?磷脂酰膽堿(mppc)、1-棕櫚?；?2-肉豆蔻酰基-磷脂酰膽堿(pmpc)、1-棕櫚酰基-2-硬脂?；?磷脂酰膽堿(pspc)、1-硬脂酰基-2-棕櫚?；?磷脂酰膽堿(sppc)、1-棕櫚?；?2-油酰基-磷脂酰膽堿(popc)、1-油?；?2-棕櫚酰基-磷脂酰膽堿(oppc)、二月桂?；字８视?dlpg)及其堿金屬鹽、二花生酰基磷脂酰甘油(dapg)及其堿金屬鹽、二肉豆蔻?；字８视?dmpg)及其堿金屬鹽、二棕櫚?；字８视?dppg)及其堿金屬鹽、二硬脂?；字８视?dspg)及其堿金屬鹽、二油?；字８视?dopg)及其堿金屬鹽、二月桂酰磷脂酸(dlpa)、二肉豆蔻酰磷脂酸(dmpa)及其堿金屬鹽、二棕櫚酰磷脂酸(dppa)及其堿金屬鹽、二硬脂酰磷脂酸(dspa)、二花生酰磷脂酸(dapa)及其堿金屬鹽、二月桂?；字Ｒ掖及?dlpe)、二肉豆蔻?；字Ｒ掖及?dmpe)、二棕櫚?；字Ｒ掖及?dppe)、二硬脂?；字Ｒ掖及?dspe)、二油?；字Ｒ掖及?dope)、二花生?；字Ｒ掖及?dape)、二亞油酰基磷脂酰乙醇胺、二月桂?；字＝z氨酸(dlps)、二肉豆蔻酰基磷脂酰絲氨酸(dmps)、二花生?；字＝z氨酸(daps)、二棕櫚?；字＝z氨酸(dpps)、二硬脂?；字＝z氨酸(dsps)、二油?；字＝z氨酸(dops)、二棕櫚酰鞘磷脂(dpsp)、二硬脂酰鞘磷脂(dssp)、二月桂酰基磷脂酰肌醇(dlpi)、二花生酰基磷脂酰肌醇(dapi)、二肉豆蔻?；字＜〈?dmpi)、二棕櫚?；字＜〈?dppi)、二硬脂?；字＜〈?dspi)、二油酰基磷脂酰肌醇(dopi)。

合適的磷脂還包括通過連接親水性聚合物(例如聚乙二醇(peg)或聚丙二醇(ppg))而修飾的磷脂。優(yōu)選的聚合物修飾的磷脂包括“聚乙二醇化的磷脂”，即與peg聚合物結(jié)合的磷脂。聚乙二醇化的磷脂的實(shí)例為聚乙二醇化的磷脂酰乙醇胺(簡稱為“pe-peg”)，即其中親水性乙醇胺部分連接到多種分子量的peg分子(例如300至20000道爾頓，優(yōu)選500至5000道爾頓)的磷脂酰乙醇胺，例如dppe-peg(或dspe-peg、dmpe-peg、dape-peg或dope-peg)。例如，dppe-peg2000是指具有連接有平均分子量約2000的peg聚合物的dppe。

特別優(yōu)選的磷脂是dapc、dspc、dppc、dmpa、dppa、dspa、dmpg、dppg、dspg、dmps、dpps、dsps、dppe、dspe、dmpe、dape、乙基-dspc及其混合物。最優(yōu)選的是dspg、dsps、dspe、dspc、dapc及其混合物。還可以使用磷脂的混合物，例如dppe和/或dspe(包括聚乙二醇化的衍生物)、dppc、dspc和/或dapc與dsps、dpps、dspa、dppa、dspg、dppg、ethyl-dspc和/或乙基-dppc的混合物。

根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述制劑至少包含dspc，優(yōu)選地與dspe-peg2000或dppe-peg5000組合。

其他兩親材料

形成充氣微囊的穩(wěn)定化層的組合物可以任選地包含另外的兩親組分，其也可以有助于形成穩(wěn)定化層，例如，脂肪酸如月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、山萮酸、油酸、亞油酸和亞麻酸，優(yōu)選地飽和脂肪酸如肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸和花生酸；含有脂質(zhì)的聚合物，如幾丁質(zhì)、透明質(zhì)酸、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇(peg)，也稱為“聚乙二醇化的脂質(zhì)”；攜帶磺化的單-、二-、寡-或多糖的脂質(zhì)；膽固醇、膽固醇硫酸酯或膽固醇半琥珀酯；生育酚半琥珀酸酯；具有醚或酯連接的脂肪酸的脂質(zhì)；聚合脂質(zhì)；磷酸二乙酯(diacetylphosphate)；磷酸二鯨蠟酯；神經(jīng)酰胺；聚氧乙烯脂肪酸酯(如聚氧乙烯脂肪酸硬脂酸酯)、聚氧乙烯脂肪醇、聚氧乙烯脂肪醇酯、聚氧乙烯化山梨醇脂肪酸酯、甘油聚乙二醇蓖麻油酸酯、乙氧基化大豆甾醇、乙氧基化蓖麻油或環(huán)氧乙烷(eo)和環(huán)氧丙烷(po)嵌段共聚物；甾醇脂肪酸酯，包括膽固醇丁酸酯、膽固醇異丁酸酯、膽固醇棕櫚酸酯、膽固醇硬脂酸酯、羊毛甾醇乙酸酯、麥角甾醇棕櫚酸酯或植物甾醇正丁酸酯；糖酸的甾醇酯，包括膽固醇葡糖苷酸苷、羊毛甾醇葡糖苷酸苷、7-脫氫膽固醇葡糖苷酸苷、麥角甾醇葡糖苷酸苷、膽固醇葡萄糖酸酯、羊毛甾醇酯葡萄糖酸酯或麥角甾醇葡萄糖酸酯；糖酸和醇形成的酯，包括月桂基葡糖苷酸苷、硬脂酰基葡萄糖醛酸苷、肉豆蔻酰基葡糖酸苷、月桂基葡萄糖酸酯、肉豆蔻酯基葡萄糖酸酯或硬脂酰基葡糖酸酯；糖與脂肪酸的酯，包括蔗糖月桂酸酯、果糖月桂酸酯、蔗糖棕櫚酸酯、蔗糖硬脂酸酯；皂甙，包括菝葜皂甙元、異菝葜皂式配基(smilagenin)、常春藤皂甙元或毛地黃毒甙元；甘油或甘油酯，包括甘油三棕櫚酸酯、甘油二硬脂酸酯、甘油三硬脂酸酯、甘油二肉豆蔻酯、甘油三肉豆蔻酸酯、甘油二月桂酸酯、甘油三月桂酸酯、甘油二棕櫚酸酯；長鏈醇，包括正癸醇、月桂醇、肉豆蔻醇、鯨蠟醇或正十八烷醇；6-(5-膽甾烯-3β-基氧基)-1-硫代-β-d-吡喃半乳糖苷；雙半乳糖甘油二酯；6-(5-膽甾烯-3β-氧基)己基-6-氨基-6-脫氧-1-硫代-β-d-吡喃半乳糖苷；6-(5-膽甾烯-3β-氧基)己基-6-氨基-6-脫氧-1-硫代-β-d-吡喃甘露糖苷；1,2-二油?；?sn-甘油；1,2二棕櫚酰-sn-3-琥珀；1,3-二棕櫚酰基-2-琥珀酰甘油；棕櫚?；甙腚装彼?palmitoylhomocysteine)；烷基胺或烷基銨鹽，其包括至少一個(gè)(c10-c20)，優(yōu)選(c14-c18)烷基鏈，例如，n-硬脂酰胺、ν,ν'-二硬脂胺、n-十六烷基胺、n,n'-雙十六烷基胺、n-硬脂氯化銨、n,n'-二硬脂基氯化銨、n-十六烷基氯化銨、n,n'-雙十六烷基氯化銨、二甲基雙十八烷基溴化銨(ddab)、十六烷基三甲基溴化銨(ctab)；叔銨鹽或季銨鹽，包括一個(gè)或優(yōu)選地兩個(gè)(c10-c20)優(yōu)選地(c14-c18)?；?，其通過(c3-c6)亞烷基橋連接于n原子，如1,2-二硬脂?；?3-三甲基銨-丙烷(dstap)、1,2-二棕櫚?；?3-三甲基銨-丙烷(dptap)、1,2-油?；?3-三甲基銨-丙烷(dotap)、1,2-二硬脂?；?3-二甲基銨-丙烷(dsdap)；及其混合物或組合。

如果存在，這些進(jìn)一步的兩親化合物可以以可變的量存在，例如占形成穩(wěn)定化層的組合物的摩爾數(shù)的高達(dá)25％，優(yōu)選高達(dá)20％。

根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，用于制備充氣微囊的制劑包含至少一種脂肪酸，優(yōu)選地棕櫚酸，與如上定義的磷脂組合，優(yōu)選地為dspc和dppe-peg5000，更優(yōu)選地其相應(yīng)比例為(摩爾比)5％至20％。

靶向配體

靶向配體是包含選自agptwceddwyycwlfgtgggk(seqidno.01)或vcwedswggevcfrydpgggk(seqidno.02)的氨基酸序列的肽。

更優(yōu)選地，所述肽是式i的二聚體肽。

靶向肽優(yōu)選地與磷脂(優(yōu)選地聚乙二醇化磷脂，甚至更優(yōu)選地dspe-peg)綴合。優(yōu)選地，所述靶向肽是式ii的脂肽。制劑中脂肽的量優(yōu)選地為相對(duì)于所有脂質(zhì)(磷脂+脂肪酸)的摩爾比0.1％至5％，更優(yōu)選地為0.2％至1％。

關(guān)于單體肽，二聚肽和脂肽的制備細(xì)節(jié)在wo2007/067979中闡述，其通過引用并入本文。

組氨酸

可以將組氨酸，優(yōu)選地l-組氨酸添加到待重構(gòu)的干燥制劑中或加入到用于重構(gòu)的碳水化合物溶液中。優(yōu)選地將組氨酸加入待凍干的制劑中；這樣就可以使用常規(guī)的再分散碳水化合物溶液。

組氨酸的量優(yōu)選地應(yīng)使得注射用充氣微囊的水性懸浮液中的組氨酸的濃度為1.5mm至20mm，優(yōu)選地為2.5mm至10mm，甚至更優(yōu)選地為3mm至8mm。

水性載體

用于制備充氣微囊的懸浮液的水性載體是含碳水化合物的水性溶液，優(yōu)選地是等滲摩爾濃度的。優(yōu)選地，碳水化合物是葡萄糖。懸浮液中碳水化合物的濃度優(yōu)選地為2％至20％(w/w)，更優(yōu)選地為3％至15％。對(duì)葡萄糖具體而言，最終懸浮液中的濃度優(yōu)選地為3％至8％，更優(yōu)選地為4至6％。

微囊的制備

根據(jù)本發(fā)明的微囊可以根據(jù)本領(lǐng)域任何已知的方法制造。通常，制造方法包括制備包含本發(fā)明組合物的干燥粉末材料，優(yōu)選通過凍干(冷凍干燥)包含所述組合物的水性或有機(jī)懸浮液。然后可以通過在氣體存在下溫和攪拌，將凍干的制備物在水性載體中重構(gòu)來獲得微囊。

優(yōu)選地，如在國際專利申請(qǐng)wo2004/069284中所公開，可以在攪拌下將包含磷脂和脂肪酸的混合物的組合物分散在水和與水不混溶的有機(jī)溶劑(例如支鏈或直鏈烷烴、烯烴、環(huán)烷烴、芳烴、烷基醚、酮、鹵代烴、全氟化烴或其混合物)的乳液中，優(yōu)選與冷凍保護(hù)劑(例如先前列出的那些，特別是碳水化合物、糖醇、聚二醇、聚氧亞烷基二醇及其混合物)混合。乳液可以通過在磷脂和脂肪酸存在下對(duì)水性介質(zhì)和溶劑以本領(lǐng)域已知的任何合適的乳液生成技術(shù)處理而獲得，例如超聲處理、振蕩、高壓均化、微混合、膜乳化、流動(dòng)聚焦乳化、高速攪拌或高剪切混合。優(yōu)選地，首先制備含有磷脂和脂肪酸的有機(jī)溶液；分別地，將靶向脂肽和任選的聚乙二醇化的磷脂溶解在含有凍干保護(hù)劑和任選的組氨酸的水性溶液中；然后如上所述將有機(jī)相和水相混合并乳化。如此獲得的微乳液可以任選地用含有凍干保護(hù)劑和任選的組氨酸的溶液進(jìn)行稀釋。然后根據(jù)常規(guī)技術(shù)將含有由磷脂和脂肪酸包裹并穩(wěn)定的溶劑微滴的微乳液凍干以獲得凍干的材料。

冷凍干燥的(或凍干的)產(chǎn)品通常為粉末或?yàn)V餅的形式，并且可以儲(chǔ)存(通常在小瓶中)并與所需氣體接觸。產(chǎn)品可容易地用適當(dāng)?shù)纳砜山邮芩砸后w載體(例如上述的含碳水化合物的水性溶液)重構(gòu)。

氣體

可以使用任何生物相容性氣體、氣體前體或其混合物以形成本發(fā)明的微囊(以下也稱為“微囊形成氣體”)。

所述氣體可以包括例如空氣；氮；氧；二氧化碳；氫；一氧化氮；惰性氣體，如氦氣、氬氣、氙氣或氪氣；低分子量烴(例如含有多至7個(gè)碳原子)，例如烷烴如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、異丁烷、戊烷或異戊烷，環(huán)烷烴如環(huán)丁烷或環(huán)戊烷，烯烴如丙烯、丁烯或異丁烯，或炔如乙炔；醚；酮；酯；鹵代氣體，優(yōu)選氟化的氣體，例如鹵代的、氟化的或全氟化的低分子量烴(例如包含多至7個(gè)碳原子)；或任何上述的混合物。當(dāng)使用鹵代的烴時(shí)，優(yōu)選所述化合物中的至少一些，更優(yōu)選全部的鹵素原子是氟原子。

氟化的氣體是優(yōu)選氣體，具體而言是全氟化的氣體。氟化的氣體包括含有至少一個(gè)氟原子的材料，例如氟化烴(含有一個(gè)或多個(gè)碳原子和氟的有機(jī)化合物)；六氟化硫；氟化的，優(yōu)選地全氟化的酮如全氟丙酮；和氟化的，優(yōu)選地全氟化的醚，例如全氟二乙醚。優(yōu)選的化合物是全氟化的氣體，例如sf6或全氟化碳(全氟化烴)，即所有氫原子被氟原子代替的烴，已知其形成特別穩(wěn)定的微泡懸浮液，例如在ep0554213中公開的，其通過引用并入本文。

術(shù)語全氟化碳包括飽和的、不飽和的和環(huán)狀的全氟化碳。生物相容的、生理可接受的全氟化碳的實(shí)例是：全氟化烷烴，如全氟化甲烷、全氟化乙烷、全氟化丙烷、全氟化丁烷(例如全氟化正丁烷，任選與其它異構(gòu)體如全氟化異丁烷混合)、全氟化戊烷、全氟化己烷或全氟化庚烷；全氟化烯烴，例如全氟化丙烯、全氟化丁烯(例如全氟化丁-2-烯)或全氟化丁二烯；全氟化炔烴(例如全氟化丁-2-炔)；和全氟化環(huán)烷烴(例如全氟化環(huán)丁烷、全氟化甲基環(huán)丁烷、全氟化二甲基環(huán)丁烷、全氟化三甲基環(huán)丁烷、全氟化環(huán)戊烷、全氟化甲基環(huán)戊烷、全氟化二甲基環(huán)戊烷、全氟化環(huán)己烷、全氟化甲基環(huán)己烷和全氟化環(huán)庚烷)。優(yōu)選的飽和全氟化碳包括例如cf4、c2f6、c3f8、c4f8、c4f10、c5f12和c6f12。

使用任何上述氣體的任何比例的混合物也可能是有利的。例如，混合物可以包括常規(guī)氣體，例如氮，空氣或二氧化碳，以及形成穩(wěn)定的微泡懸浮液的氣體，例如六氟化硫或如上所述的全氟化碳。合適的氣體混合物的實(shí)例可以在例如wo94/09829中找到，其通過引用并入本文。以下組合是特別優(yōu)選的：氣體(a)和(b)的混合物，其中氣體(b)是氟化的氣體，選自前文闡述的那些，包括其混合物，并且(a)選自空氣、氧、氮、二氧化碳或其混合物。氣體(b)的量可以占總混合物的約0.5％至約95％(v/v)，優(yōu)選地約5％至80％。

特別優(yōu)選的氣體是sf6、c3f8、c4f10或其混合物，任選地與空氣、氧、氮、二氧化碳或其混合物混合。特別優(yōu)選的是c4f10，甚至更優(yōu)選的是氮與c4f10的混合物，優(yōu)選地以35/65v/v比例。

在某些情況下，可能期望包括氣態(tài)物質(zhì)的前體(即能夠在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為氣體的材料)。優(yōu)選地，氣態(tài)前體和由其衍生的氣體是生理上可接受的。氣態(tài)前體可以是ph活化的、光活化的、溫度活化的，等等。例如，某些全氟化碳可以用作溫度活化的氣態(tài)前體。這些全氟化碳，如全氟戊烷或全氟己烷，其液/氣相變溫度高于室溫(或制備和/或儲(chǔ)存試劑的溫度)，但低于體溫；因此，它們?cè)谌梭w內(nèi)經(jīng)歷液/氣相轉(zhuǎn)變并被轉(zhuǎn)化為氣體。

藥物試劑盒和施用

根據(jù)本發(fā)明的微囊懸浮液可以原樣存儲(chǔ)，或優(yōu)選地以冷凍干燥的前體的形式儲(chǔ)存，其可以用水性載體重構(gòu)。因此，根據(jù)本發(fā)明，微囊懸浮液的前體優(yōu)選地以干燥的粉末形式儲(chǔ)存，這樣可有利地包裝在雙組件診斷和/或治療試劑盒中，優(yōu)選用于通過注射施用。試劑盒優(yōu)選地包含第一容器，其含有與所選擇的微囊形成氣體接觸的凍干的前體組合物，并包含第二容器，其含有用于重構(gòu)微囊的懸浮液的生理可接受水性載體，特別是如上所述的碳水化合物溶液，優(yōu)選地為5％(w/w)葡萄糖溶液。所述雙組分試劑盒可包括兩個(gè)單獨(dú)的容器或一個(gè)雙室容器。在前一種情況下，所述容器優(yōu)選地是常規(guī)隔膜密封的小瓶，其中含有凍干殘留物的小瓶用隔膜密封，通過該隔膜可以使用任選的預(yù)填充注射器注射載體液體。在這種情況下，用作第二組分容器的注射器還在后續(xù)用于注射造影劑。在后一種情況下，所述雙室容器優(yōu)選地為雙室注射器，并且一旦凍干物得到重構(gòu)，并被適當(dāng)?shù)鼗旌匣蜉p輕搖動(dòng)，可直接使用該容器注射造影劑。

根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，通常通過注射其懸浮液向患者施用有效量的靶向的微囊。因此，對(duì)目標(biāo)區(qū)域(被認(rèn)為包含表達(dá)kdr受體的組織)的成像將通過在目標(biāo)區(qū)域中與受體(如果有)結(jié)合的微囊的存在而增強(qiáng)。

本發(fā)明的微囊懸浮液可以用于多種診斷和/或治療技術(shù)，包括特別是造影增強(qiáng)的超聲成像。

可用于超聲應(yīng)用的成像技術(shù)的實(shí)例包括例如基本和非線性(例如諧波)b模式成像、脈沖或相位倒置成像以及基線和非線性多普勒成像；如果需要，可以使用三維或四維成像技術(shù)。此外，還包括牽涉(例如通過高聲壓的超聲波)破壞充氣微囊的診斷技術(shù)，這些都是高度靈敏的檢測方法。

一般地，一旦已經(jīng)對(duì)進(jìn)行所需超聲成像技術(shù)的受試者(例如哺乳動(dòng)物)施用有效量的微囊懸浮液，即對(duì)所選擇的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行超聲輻射，并且收集所得的回波信號(hào)。這樣，收集的信號(hào)可以用于例如顯示目標(biāo)區(qū)域的造影增強(qiáng)圖像；或者該信號(hào)可用于計(jì)算目標(biāo)區(qū)域的參數(shù)圖。

一般優(yōu)選地通過i.v.注射施用據(jù)本發(fā)明的微囊懸浮液，施用濃度為每千克患者約0.01至約1.0μl的氣體，這取決于它們各自的組成、待成像的組織或器官和/或所選擇的成像技術(shù)。這個(gè)通用的濃度范圍當(dāng)然能夠根據(jù)具體的成像應(yīng)用而變化，例如，當(dāng)能在非常低的劑量下觀察到信號(hào)時(shí)，例如在彩色多普勒或反向脈沖能量顯像中。

以下實(shí)施例將有助于進(jìn)一步闡述本發(fā)明。

實(shí)施例

材料和方法

以下材料用于下文的實(shí)施例中：

懸浮液中微囊的尺寸分布濃度通過配有30μm孔徑的coulter計(jì)數(shù)器(multisizer3)測量(稀釋度：將50μl稀釋于100mlnacl0.9％溶液中)；使用配有inlab410電極(mettlertoledo)的mp230ph計(jì)(mettlertoledo)測量ph值。

實(shí)施例1

制備無ph調(diào)節(jié)添加劑的充氣微囊的凍干前體

制備式ii的脂肽

如pct專利申請(qǐng)wo2007/067979的工作實(shí)施例中詳細(xì)描述的方法制備式ii的脂肽，其通過引用并入本文。簡言之，如在上述pct申請(qǐng)中更詳細(xì)解釋的，使用fmoc保護(hù)的氨基酸通過固相肽合成(spps)合成肽agptwceddwyycwlfgtgggk(seqidno.01)。對(duì)n-末端進(jìn)行乙?；?，并將fmoc-lys(ivdde)-oh(nα-fmoc-nε-[1-(4,4-二甲基-2,6-二氧環(huán)己基-1-亞基)-3-甲基丁基]-l-賴氨酸)偶聯(lián)到lys²²的側(cè)鏈。在fmoc脫保護(hù)后，從樹脂裂解并裂解其它保護(hù)基團(tuán)(除了ivdde基團(tuán))，使肽環(huán)化(形成二硫鍵)。通過制備型hplc純化環(huán)化肽并凍干。

肽vcwedswggevcfrydpgggk(seqidno.02)也使用fmoc保護(hù)的氨基酸通過spps合成。對(duì)n-末端進(jìn)行乙?；⑶覍?duì)lys²¹的側(cè)鏈進(jìn)行fmoc-adoa-oh(8-(fmoc-氨基)-3,6-二氧雜辛酸)的兩次連續(xù)偶聯(lián)。在fmoc脫保護(hù)后，從樹脂裂解并裂解其它保護(hù)基團(tuán)，使肽環(huán)化(形成二硫鍵)。通過制備型hplc純化環(huán)化肽并凍干。

二聚體肽的制備(式i)：將二琥珀酰亞胺基戊二酸酯(dsg)偶聯(lián)至連接于肽(seqidno.01)的lys²²的ε-氨基官能團(tuán)的賴氨酸的α-氨基官能團(tuán)上。純化后，將產(chǎn)物與連接于肽(seqidno.02)的lys21的adoa部分的氨基官能團(tuán)反應(yīng)。通過制備型hplc純化粗制的異二聚體并凍干。然后將剩余的ivdde保護(hù)基團(tuán)裂解，并通過制備型hplc再次純化最終產(chǎn)物，通過離子交換形成乙酸鹽。將產(chǎn)物溶液凍干，得到二聚肽(式i)。

脂肽的制備(式ii)：將二琥珀酰亞胺基戊二酸酯(dsg)與先前合成的二聚肽(式i)偶聯(lián)。純化后，將產(chǎn)物與dspe-peg2000-胺反應(yīng)。通過制備型hplc純化產(chǎn)物并凍干。

prep-01

如下制備用于制備充氣微囊懸浮液的凍干前體：

(i)在70℃將60mg脂質(zhì)混合物(dspc和棕櫚酸，摩爾比為80/20)溶于環(huán)辛烷(4.8ml)中。

(ii)分別地，將dspe-peg2000(3％w/w)和式ii的脂肽(0.2％w/w)分散在1ml的20mmtris緩沖液(ph7.6)中；然后將分散液與60ml的10％peg4000溶液混合。

(iii)使用軸向高速勻漿器(megatronmt3000)在12000rpm將環(huán)辛烷制備物(i)在peg4000水性溶液(ii)中乳化5分鐘。

(iv)將所得乳液在80℃攪拌加熱1小時(shí)。冷卻至室溫(小時(shí))后，

(v)將乳液用10％的peg4000水性溶液稀釋四倍，并以1ml的體積取樣至din8r小瓶中。

(vi)將小瓶插入凍干機(jī)(telstarlyobeta-35冷凍干燥機(jī))中，冷卻至-50℃，2小時(shí)，然后在-25℃、0.2mbar下冷凍干燥12小時(shí)，最終干燥步驟在30℃和0.1mbar下再進(jìn)行6小時(shí)。

將35/65(體積比)的c4f10/n2的混合物加入到小瓶的頂部空間中，然后將其塞住并密封。

prep-02至prep-05

用溶于有機(jī)相中的各種摩爾比的dspc/棕櫚酸(見表1)重復(fù)上述prep-01的制備，不同之處在于dspe-peg2000或dppe-peg5000的量及式(ii)的脂肽的量在步驟(ii)的水性溶液制備中有所改動(dòng)，如表1所示。此外，在步驟(v)中prep-03和prep-05稀釋兩倍(而不是四倍)，然后以1.5ml的體積取樣至din8r小瓶。

下表1總結(jié)了凍干前體的多種制備物的差異。

表1凍干前體的制備

實(shí)施例2

分散糖溶液的ph對(duì)微囊聚集的影響

將根據(jù)實(shí)施例1獲得的制備物在不同ph值，即3.5、3.8和6.5，再次分散于1ml水或多種5％(w/w)葡萄糖溶液中。

為了獲得ph為6.5的5％葡萄糖溶液，在20ml的5％葡萄糖溶液中加入30至34μl的naoh0.1n(→0.15至0.17mmnaoh)。為了獲得ph為3.5的5％葡萄糖溶液，在20ml的5％葡萄糖溶液中加入32至40μl的hcl0.1n。

將獲得的懸浮液鑒定為susp-01至susp-05(分別來自制備物prep-01至prep-05，后綴a至d分別表示：以(a)蒸餾水(對(duì)照)，(b)ph3.5的葡萄糖溶液，(c)ph3.8的葡萄糖溶液和(d)ph6.5的葡萄糖溶液重構(gòu)，因此，例如susp.02c為通過將上述prep.02分散在ph3.8的1ml的5％葡萄糖中而獲得的微囊的懸浮液。

用coulter計(jì)數(shù)器表征所獲得的充氣微囊的懸浮液，以確定懸浮液中微囊的微囊濃度和以數(shù)值(dn)表示的平均粒徑。結(jié)果分別在表2和表3中示出(在這些表和下文的表中，數(shù)值指示涉及單個(gè)懸浮液的實(shí)際值或在相同懸浮液多次制備情況下的平均值)。對(duì)制備的懸浮液的ph也進(jìn)行了測量，并在下表4中報(bào)告。

表2：用不同溶液重構(gòu)的微囊的濃度

*＝對(duì)照

表3：用不同溶液重構(gòu)的微囊懸浮液的dn

*＝對(duì)照

表4：用不同溶液重構(gòu)的微囊懸浮液的ph

*＝對(duì)照

從表2中的數(shù)值可以推斷，當(dāng)ph為3.5或3.9(b列和c列)的葡萄糖溶液用于重構(gòu)冷凍干燥制備物時(shí)，所獲得的懸浮液中的微囊濃度相對(duì)于對(duì)照顯著降低，而當(dāng)使用ph6.5(d列)的葡萄糖溶液時(shí)，濃度基本上與對(duì)照(a列)相似。

從表3可以推斷，用低ph葡萄糖溶液重構(gòu)凍干制備物使微囊的dn值有不期望的增加。

實(shí)施例3

在不同ph值用糖溶液重構(gòu)prep-01中，各種ph調(diào)節(jié)劑對(duì)微囊聚集的影響

實(shí)施例3a：碳酸氫鈉

重復(fù)根據(jù)實(shí)施例1的方法制備prep-01的凍干前體，不同之處在于在步驟(v)中用于稀釋乳液的10％peg4000溶液中加入各種量的碳酸氫鈉，以獲得分別摻入不同量的碳酸氫鈉的凍干前體制備物。添加到peg4000溶液中的碳酸氫鹽的量使得步驟(v)的乳液中的碳酸氫鹽濃度分別為0.125、0.31、0.38、0.80、1.20和2.0mm。

然后根據(jù)實(shí)施例2的方法，將得到的制備物再分散在1ml水或不同ph值的各種5％(w/w)葡萄糖溶液中。

表5顯示了對(duì)獲自含有不同量的碳酸氫鈉的各制備物的多種懸浮液測量的微囊濃度。

表5–含碳酸氫鈉懸浮液中的微囊濃度

*＝對(duì)照

從上表所示的數(shù)據(jù)可以推斷，稀釋的乳液中碳酸氫鈉濃度至少為0.38mm是可取的，以使在用于重構(gòu)的葡萄糖溶液的整個(gè)ph范圍內(nèi)獲得可接受的微囊濃度。另一方面，較低濃度的碳酸氫鹽會(huì)產(chǎn)生不期望的微囊濃度較低的懸浮液，特別是當(dāng)用ph為3.5的葡萄糖溶液重構(gòu)冷凍干燥的前體時(shí)。

表6顯示了對(duì)表5的懸浮液測量的ph值。

表6-含碳酸氫鈉的微囊懸浮液的ph值

*＝對(duì)照

如本領(lǐng)域已知的，經(jīng)ph調(diào)節(jié)的靜脈注射溶液的ph應(yīng)優(yōu)選地在約6至約8.5，優(yōu)選地約7至約8的ph范圍內(nèi)。從表6可推測，當(dāng)用于重構(gòu)的葡萄糖溶液在ph范圍的較高部分時(shí)(溶液d，ph＝6.5)，相對(duì)低濃度的碳酸氫鹽可能已經(jīng)使微囊的最終懸浮液的ph高于用于注射的可接受值。因此，通過閱讀表5和6的組合，似乎相對(duì)高濃度的碳酸氫鈉(這是在相對(duì)低的ph在葡萄糖溶液中提供所需濃度的微囊所需的濃度)可能會(huì)過度增加可注射溶液的ph。另一方面，相對(duì)低濃度的碳酸氫鹽可能不能在重構(gòu)的懸浮液中提供所需濃度的微囊(特別是當(dāng)使用低ph葡萄糖溶液時(shí))。

實(shí)施例3b：tris/hcl緩沖液

重復(fù)進(jìn)行實(shí)施例3a，不同之處在于用通過將tris堿(121.1g-1摩爾)溶解在蒸餾水(750ml)中，加入hcl(約40ml)制備tris/hcl緩沖溶液(ph＝8.0)來代替碳酸氫鈉，然后用蒸餾水將體積定容至1l。向peg4000溶液中加入不同體積的tris/hcl緩沖溶液分別使步驟(v)的乳液中的tris/hcl濃度達(dá)到0.125、2.5、5.0、10.0mm。

表7顯示對(duì)獲自含有不同量的tris/hcl緩沖液的各制備物的多種懸浮液測量的微囊濃度。

表7–含tris/hcl緩沖液(ph＝8.0)的懸浮液中的微囊濃度

*＝對(duì)照

從上表的數(shù)據(jù)可以推斷，含有tris/hcl緩沖液的制備物的重構(gòu)在懸浮液中提供相對(duì)較低濃度的微囊(與對(duì)照相比)，特別是當(dāng)制備物是用低ph葡萄糖溶液重構(gòu)時(shí)。當(dāng)使用高濃度的tris/hcl緩沖液時(shí)，具體而言觀察到微泡濃度有重大降低，特別是在5.0mm或更高的濃度下。為此，在隨后的實(shí)驗(yàn)中，選擇2.5mmtris/hcl緩沖液作為相當(dāng)?shù)膒h調(diào)節(jié)劑。

實(shí)施例3c：磷酸鹽緩沖液

重復(fù)進(jìn)行實(shí)施例3a，不同之處在于用磷酸鹽緩沖液(ph＝7.6)替代碳酸氫鈉，所述磷酸鹽緩沖液通過混合43.5mlna2hpo4溶液(0.2m)與6.5mlnah2po4溶液(0.2m)而制備。將不同體積的磷酸鹽緩沖液加入peg4000溶液中，從而分別獲得步驟(v)的乳液中的磷酸鹽濃度達(dá)到2.5、5.0和10.0mm。

表8和表9分別顯示對(duì)獲自含有不同量的磷酸鹽緩沖液的各制備物的多種懸浮液測量的微囊濃度和dn值。

表8–含磷酸鹽緩沖液(ph＝7.6)懸浮液中的微囊濃度

*＝對(duì)照

對(duì)于實(shí)施例3b，含有磷酸鹽緩沖液的制備物的重構(gòu)在懸浮液中提供相對(duì)較低濃度的微囊(與對(duì)照相比)，特別是當(dāng)制備物是用低ph葡萄糖溶液重構(gòu)時(shí)。當(dāng)使用較高濃度的磷酸鹽緩沖液時(shí)，具體而言觀察到微泡濃度有重大降低。為此，在隨后的實(shí)驗(yàn)中，選擇2.5mm磷酸鹽緩沖液作為相當(dāng)?shù)膒h調(diào)節(jié)劑。

表9–含磷酸鹽緩沖液(ph＝7.6)的懸浮液中微囊的dn值

*＝對(duì)照

從上表可以看出，微囊懸浮液的dn值略高于對(duì)照，特別是對(duì)于用低ph葡萄糖溶液和較高濃度的磷酸鹽緩沖液重構(gòu)的制備物。

實(shí)施例3d：組氨酸

重復(fù)進(jìn)行實(shí)施例3a，不同之處在于用組氨酸代替碳酸氫鈉。向peg4000溶液中分別加入不同量的組氨酸，從而獲得在步驟(v)的乳液中組氨酸濃度分別達(dá)到2.5、5.0和10.0mm。

表10顯示微囊的濃度，表11是對(duì)獲自含有不同量的組氨酸的各制備物的多種懸浮液測量的dn值。最終的微囊懸浮液中組氨酸的濃度分別為2.5、5.0和10.0mm。

表10–含不同濃度組氨酸的懸浮液中的微囊濃度

*＝對(duì)照

表11-含不同濃度組氨酸的懸浮液中的dn

*＝對(duì)照

從上表可以看出，含組氨酸的微囊懸浮液的dn值等于或略低于對(duì)照，表明無論葡萄糖溶液的ph值和組氨酸的濃度如何，含組氨酸懸浮液中的微囊都具有與對(duì)照組相當(dāng)?shù)某叽纭?/p>

實(shí)施例4

在不同ph值用糖溶液重構(gòu)的prep-02中，各種ph調(diào)節(jié)劑對(duì)微囊聚集的影響

實(shí)施例4a：含相當(dāng)?shù)膒h調(diào)節(jié)劑的微囊懸浮液

重復(fù)根據(jù)實(shí)施例1的方法，制備prep-02凍干前體，不同之處在于在步驟v中用于乳液稀釋的10％peg4000溶液中加入碳酸氫鈉、tris/hcl緩沖液或磷酸鹽緩沖液，以獲得各自的凍干前體制備物。向peg4000溶液中加入不同量的ph調(diào)節(jié)劑，從而獲得稀釋乳液中各ph調(diào)節(jié)劑達(dá)到最佳濃度(如實(shí)施例3中所測定)，如表12和13所示。

然后根據(jù)實(shí)施例2的方法，將得到的制備物再分散在1ml水或不同ph值的多種5％(w/w)葡萄糖溶液中。

表12和13顯示對(duì)獲自含有選定ph調(diào)節(jié)劑的各種制備物的多種懸浮液測量的微囊濃度和dn值。

表12–含不同ph調(diào)節(jié)劑的懸浮液中的微囊濃度

*＝對(duì)照

表13–含不同ph調(diào)節(jié)劑的懸浮液中微囊的dn值

*＝對(duì)照

從表12和表13所示的數(shù)據(jù)可以推斷，含不同常規(guī)ph調(diào)節(jié)劑的懸浮液中的顆粒數(shù)通常低于對(duì)照，特別是用低ph葡萄糖溶液重構(gòu)的懸浮液-02(b)，而其dn值一般較高。

實(shí)施例4b：含組氨酸的微囊懸浮液

重復(fù)進(jìn)行實(shí)施例4a，不同之處在于相當(dāng)?shù)膒h調(diào)節(jié)劑被不同濃度的組氨酸替代，如表14和15所示。在這種情況下，最終的微囊懸浮液中組氨酸的濃度為2.5mm、5.0mm和10mm。

表14–含組氨酸的懸浮液中的微囊濃度

*＝對(duì)照表

表15–含組氨酸的懸浮液中微囊的dn值

*＝對(duì)照

從表14和表15所示的數(shù)據(jù)可以推斷出，在任何ph的葡萄糖溶液進(jìn)行重構(gòu)時(shí)和任何濃度的組氨酸存在下，在含組氨酸的懸浮液中測量的微囊的顆粒數(shù)和dn值通常與在對(duì)照溶液中測量的那些是相當(dāng)?shù)摹?/p>

實(shí)施例5

在不同ph用糖溶液重構(gòu)的prep-03中，磷酸鹽緩沖液和組氨酸對(duì)微囊聚集的影響

重復(fù)根據(jù)實(shí)施例1的方法，制備prep-03凍干的前體，不同之處在于將磷酸鹽緩沖液或組氨酸加入到用于乳液稀釋的10％peg4000溶液(步驟v)中以獲得各凍干前體制劑。向peg4000溶液中加入不同量的磷酸鹽或組氨酸，從而獲得在步驟(v)的稀釋乳液中磷酸鹽濃度為2.5mm，組氨酸濃度分別為5mm、10mm和20mm，如表16和17所示，這對(duì)應(yīng)于最終的微囊懸浮液中組氨酸濃度為約3.75mm、7.5mm和15mm。

然后根據(jù)實(shí)施例2的方法，將得到的制備物再分散在不同ph值的2ml的多種5％(w/w)葡萄糖溶液中。

表16和17顯示含有選定的ph調(diào)節(jié)劑的各種制備物的多種懸浮液中的濃度和dn值。

表16-懸浮液中的微囊濃度

表17-不同ph調(diào)節(jié)劑的懸浮液中dn值

從表16的數(shù)據(jù)可以推斷，在含不同濃度的組氨酸的懸浮液中測量的微囊顆粒數(shù)通常高于相當(dāng)?shù)牧姿猁}緩沖的制備物中測量的數(shù)量，特別是在高ph值葡萄糖溶液和高濃度的組氨酸的情況下。從表17的數(shù)據(jù)可推斷，在含不同濃度的組氨酸的懸浮液中測量的微囊的dn值通常低于在相當(dāng)?shù)牧姿猁}緩沖的制備物中測量的dn值。

實(shí)施例5

在不同ph值用糖溶液重構(gòu)的prep-04中，磷酸鹽緩沖液和組氨酸對(duì)微囊聚集的影響

重復(fù)根據(jù)實(shí)施例1的方法，制備prep-04的凍干前體，不同之處在于將相當(dāng)?shù)膒h調(diào)節(jié)劑(即，碳酸氫鹽、tris/hcl或磷酸鹽)或組氨酸加入到用于乳液稀釋的10％peg4000溶液中(步驟v)，以獲得各自的凍干前體制備物。如表18和19所示，添加的ph調(diào)節(jié)劑的量使得在稀釋的乳液中獲得以下濃度：碳酸氫鹽0.38mm、tris/hcl2.5mm、磷酸鹽2.5mm或組氨酸2.5mm。

然后根據(jù)實(shí)施例2的方法，將得到的制備物再分散在不同ph值的1ml多種5％(w/w)葡萄糖溶液中。

表18和19顯示對(duì)獲自含有選擇的ph調(diào)節(jié)劑的各種制備物的多種懸浮液測量的微囊濃度和dn值。

表18-懸浮液中的微囊濃度

*＝對(duì)照

表19–含不同ph調(diào)節(jié)劑的懸浮液中微囊的dn值

從表18的數(shù)據(jù)可以推斷，含不同的常規(guī)ph調(diào)節(jié)劑的懸浮液中的顆粒數(shù)通常低于在含組氨酸的懸浮液中測量的數(shù)量，特別是在低ph葡萄糖溶液中。從表19的數(shù)據(jù)可以推斷，含不同常規(guī)ph調(diào)節(jié)劑的懸浮液中微囊的dn值通常高于在含組氨酸的懸浮液中測定的dn值，特別是在低ph葡萄糖溶液中。

實(shí)施例7

在不同ph值用糖溶液重構(gòu)的prep-05中，磷酸鹽緩沖液和組氨酸微囊聚集的影響

重復(fù)根據(jù)實(shí)施例1的方法，制備prep-05的凍干前體，不同之處在于將磷酸鹽緩沖液或組氨酸加入用于乳液稀釋的10％peg4000溶液中(步驟v)，以獲得各自的凍干前體制備物。向peg4000溶液中加入不同量的磷酸鹽或組氨酸，從而獲得在稀釋的乳液中磷酸鹽濃度為2.5mm，組氨酸濃度為2.5mm、5mm或10mm，如表20和21所示。

然后根據(jù)實(shí)施例2的方法，將得到的制備物再分散在2ml水或不同ph值的多種5％葡萄糖溶液中。

表20和21顯示獲自含有選擇的ph調(diào)節(jié)劑的各種制備物的多種懸浮液中測得的微囊濃度和dn值。

表20-懸浮液中的微囊濃度

表21-懸浮液中微囊的dn值

從表20所示的數(shù)據(jù)可以推斷，含磷酸鹽緩沖液的懸浮液中的顆粒數(shù)通常低于含不同濃度組氨酸的懸浮液中測量的數(shù)量，特別是在低ph的葡萄糖溶液中。從表21所示的數(shù)據(jù)可推斷，含磷酸鹽緩沖液的懸浮液中的微囊dn值通常高于在含不同濃度的組氨酸的懸浮液中測量的dn值，特別是在低ph葡萄糖溶液中。

序列表

<110>braccosuissesa

<120>靶向的氣體填充微囊制劑

<130>id1304

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>22

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>合成的肽

<220>

<221>mod_res

<222>(1)..(1)

<223>乙酰化

<220>

<221>二硫化物

<222>(6)..(13)

<400>1

alaglyprothrtrpcysgluaspasptrptyrtyrcystrpleuphe

151015

glythrglyglyglylys

20

<210>2

<211>21

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>合成的肽

<220>

<221>mod_res

<222>(1)..(1)

<223>乙?；?

<220>

<221>二硫化物

<222>(2)..(12)

<400>2

valcystrpgluaspsertrpglyglygluvalcyspheargtyrasp

151015

proglyglyglylys

20