本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防、改善或治療退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的、含茯苓皮提取物的組合物。

背景技術(shù)：

退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病是其中心智功能由于神經(jīng)細(xì)胞(神經(jīng)元)逐漸發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能性的丟失而惡化的疾病。由于神經(jīng)系統(tǒng)特定區(qū)域中的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生退行性變性，退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病可能伴隨諸如癡呆、錐體外系異常、小腦異常、感覺障礙和運動障礙等癥狀。此外，由于同時發(fā)生多種異常而可能出現(xiàn)復(fù)雜的癥狀。按照患者的臨床表現(xiàn)對疾病進行診斷。但是癥狀差異很大，不同的疾病常常具有相同的臨床癥狀，這使得診斷很困難(soc.sci.med.vol.40.no.6,pp.847-858,1995)。

在退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，疾病的癥狀是慢慢發(fā)展的，而且該疾病常常是由衰老引起的。一旦疾病已經(jīng)顯現(xiàn)出來，就會持續(xù)進行數(shù)年或數(shù)十年，直至死亡，因此增加了社會負(fù)擔(dān)。已知遺傳影響，諸如家族史，很可能是疾病的病因，但獲得性因素也起到重要作用。按照其臨床癥狀，可對退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病進行分類，例如進行性癡呆(阿爾茨海默氏病等)、神經(jīng)系統(tǒng)障礙(例如皮克病)、姿勢和運動障礙(例如帕金森氏病)、進行性共濟失調(diào)、肌肉萎縮和無力，以及感知和運動障礙等(internationaljournalofengineeringandtechnology,vol.2,no.4,august2010classificationofneurodegenerativedisordersbasedonmajorriskfactorsemployingmachinelearningtechniques)。

aβ斑塊和過磷酸化tau蛋白纏結(jié)的細(xì)胞毒性作為阿爾茨海默氏癡呆(一種典型的退行性腦病)的直接病因正在得到關(guān)注。

aβ是從前體app，通過諸如β-分泌酶和γ-分泌酶等酶的作用而生成，分布在神經(jīng)細(xì)胞外部。當(dāng)aβ濃度高于一定水平時，aβ蛋白之間結(jié)合而形成不溶的老年斑(senileplaque)。該物質(zhì)可導(dǎo)致炎癥和神經(jīng)毒性，并且破壞周圍的神經(jīng)細(xì)胞。例如，已知在阿爾茨海默氏病患者中觀察到的神經(jīng)元死亡和小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生與老年斑相關(guān)。體外測試示出aβ肽能誘導(dǎo)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化(腦巨噬細(xì)胞)，這支持了aβ肽引起阿爾茨海默氏病患者腦部中所發(fā)現(xiàn)的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生和腦部炎癥的假說。迄今為止，還沒有被廣泛接受的預(yù)期一旦形成老年斑就可顯著溶解aβ，或預(yù)防沉積物形成的療法或治療藥物。

tau蛋白由四部分組成：n末端突出部，脯氨酸聚集結(jié)構(gòu)域、微管結(jié)合結(jié)構(gòu)域和c-末端(mandelkowetal.,acta.neuropathol.,103,26-35,1996)。起到連接微管的作用，其中微管形成神經(jīng)細(xì)胞的物理結(jié)構(gòu)。已知在中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元細(xì)胞中的tau蛋白經(jīng)異常過磷酸化或修飾，會導(dǎo)致退行性腦病，例如tau蛋白病變(tauopathy)。阿爾茨海默氏病(alzheimer'sdisease)、皮克病(picksdisease)、17號染色體相關(guān)的額顳癡呆合并帕金森癥(ftdp-17)是典型的tau蛋白病變(leeetal.,annu.rev.neurosci.,24,1121-1159,2001；bergeronetal.,j.neuropathol.exp.neurol.,56,726-734,1997；bugianietal.,j.neuropathol.exp.neurol.,58,667-677,1999；delacourteetal.,ann.neurol.,43,193-204,1998；ittnerandgotz,nat.rev.neurosci.,12,65-72,2011)。

在二十世紀(jì)八十年代對阿爾茨海默氏病的研究中，暗示神經(jīng)營養(yǎng)因子具有對退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療潛力(nature.1987sep3-9；329(6134):65-8.ameliorationofcholinergicneuronatrophyandspatialmemoryimpairmentinagedratsbynervegrowthfactor)。研究示出了通過向側(cè)腦室給予神經(jīng)生長因子(ngf)恢復(fù)了基底前腦中的膽堿能神經(jīng)元，從而使實驗動物的記憶力得到改善，其中膽堿能神經(jīng)元由于衰老而丟失，并已知是阿爾茨海默氏病的病因之一。因此，對使用神經(jīng)營養(yǎng)因子來治療退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病進行了持續(xù)研究。在后來的研究中，通過將腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(bdnf)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3(nt-3)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-4(nt-4)和睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(cntf)(這些是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的一部分)注射到由于面神經(jīng)和坐骨神經(jīng)結(jié)節(jié)而運動神經(jīng)功能受損的實驗動物中，進行了恢復(fù)運動神經(jīng)功能的研究，并且獲得了陽性結(jié)果(nature.1992dec24-31；360(6406):757-9.brain-derivedneurotrophicfactorpreventsthedeathofmotoneuronsinnewbornratsafternervesection)。進一步地，在使用患運動神經(jīng)元的數(shù)量和功能隨著年齡增長而逐漸喪失的疾病的重組小鼠(wobbler)的實驗中，通過給予小鼠bdnf和cntf，使運動神經(jīng)元的數(shù)量增加，并且改善了功能(science.1994aug19；265(5175):1107-10.arrestofmotorneurondiseaseinwobblermiceco-treatedwithcntfandbdnf)。除了上述研究之外，還報道了神經(jīng)營養(yǎng)因子通過增加多種感知和運動神經(jīng)病變模型中的神經(jīng)元的數(shù)量和功能，改善了實驗動物的記憶、認(rèn)知和行為障礙。

茯苓(茯)的學(xué)名是poriacocos。茯苓在分類上屬于真擔(dān)子菌綱、層菌亞綱，非褶菌目，多孔菌科的真菌。茯苓是一類屬于桿菌的真菌，是褐腐菌，是在松樹中的一類腐生生物，但也寄生于活的松樹的根部。菌絲體生長，同時長出白色分枝，并且菌絲開始長在一起。當(dāng)適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件，諸如溫度和濕度持續(xù)存在時，形成菌核硬塊，這被稱為茯苓。根據(jù)內(nèi)部的顏色，白色是白茯苓，淡紅色是赤茯苓。茯苓的外皮被稱為茯苓皮。

茯苓的主要成分是茯苓酸(c33h52o5)、松苓酸(c30h18o3)、松苓新酸(3β羥基-7,9(11),24-羊毛甾三烯-21-酸(3β-hyderoxy-lanosta-7.9(11),24-trien-21-oicacid)、土莫酸(c31h50o)和齒孔酸(c31h50o3)等，已經(jīng)報道了在茯苓和茯苓皮中分離出了三萜茯苓新酸及其衍生物。還含有麥角甾醇、卵磷脂、腺嘌呤、膽堿、葡萄糖、果糖、蛋白質(zhì)，大量的無機物質(zhì)，以及破壞敏酸齒孔酸、聚亞苯基酸a和c和三萜系化合物。

茯苓皮味甘性暖，味道和性質(zhì)均輕，故為良性的藥物物質(zhì)。在過去的文獻中，記載了茯苓皮可緩解口渴、便于排尿、去濕氣、適當(dāng)?shù)卣{(diào)整身體狀態(tài)，通過協(xié)調(diào)消化系統(tǒng)的功能而增加能量，并且通過舒緩腰部來改善腹部淤血的血液循環(huán)。茯苓皮主要用于與記憶力相關(guān)的藥方。在最近的文獻中，還報道了茯苓皮具有抗糖尿病和抗癌效果(linghui,evaluationofthechemotherapeuticandchemopreventivepotentialoftriterpenoidsfromporiacocos,linghui,doctoralthesisofdepartmentofpharmacy,nationaluniversityofsingapore,2010)。

茯苓皮是屬于多孔菌科的茯苓菌核的外皮。已知作為藥用物質(zhì)，具有利水消腫的效果。它尤其含有豐富的羊毛甾烷類三萜茯苓新酸，并且《東醫(yī)寶鑒》中記載了茯苓皮用于水腫藥方的五皮散(橘皮、大腹皮、茯苓皮、生姜皮、桑白皮)的成分。在最近的研究中，報道了茯苓皮具有如利尿、促進排尿、消除水腫等治療效果(triterpenesfromthesurfacelayerofporiacocos,takaakitai,phytochem,39,5,1995；urinarymetabonomicstudyofthesurfacelayerofporiacocosasaneffectivetreatmentforchronicrenalinjuryinrats,yingyongzhaoetal,journalofethnopharmacology,148,2,2013)。

在這一背景下，本發(fā)明人進行了研究，以開發(fā)用于有效預(yù)防、改善和治療退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物和食品組合物的材料。結(jié)果，在研究茯苓皮的神經(jīng)心理活性過程中，本發(fā)明的發(fā)明人證明了這些茯苓皮提取物在由多種腦損傷或記憶抑制藥物所誘導(dǎo)的腦神經(jīng)病變模型中，顯示出顯著的記憶恢復(fù)活性。此外，本發(fā)明人通過證明這些茯苓皮提取物示出抑制導(dǎo)致腦中神經(jīng)細(xì)胞死亡的物質(zhì)的生成，并且促進促神經(jīng)細(xì)胞再生和分化的蛋白的表達來保護神經(jīng)細(xì)胞，從而完成了本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

【技術(shù)問題】

本發(fā)明的目的是提供用于預(yù)防和治療退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物，和用于預(yù)防和改善退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的食品組合物，所述藥物組合物和所述食品組合物包含作為活性成分的茯苓(學(xué)名：poriacocos)皮提取物。

【技術(shù)方案】

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了用于預(yù)防和治療退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物，和用于預(yù)防和改善退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的食品組合物，所述藥物組合物和所述食品組合物包含茯苓皮提取物。

【有益效果】

根據(jù)本發(fā)明，茯苓皮提取物抑制β-淀粉樣肽(aβ)的生成和tau蛋白的磷酸化，這顯示出保護神經(jīng)細(xì)胞的效果。此外，它還顯示出以下效果：抑制乙酰膽堿酯酶(ache)，從而提高神經(jīng)傳導(dǎo)且介導(dǎo)記憶增強作用。因此，茯苓皮提取物可有效用于開發(fā)預(yù)防和治療退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病(包括癡呆)的藥物組合物，或預(yù)防和改善退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的健康食品組合物。

附圖說明

圖1是示出了實驗動物模型中的被動回避測試結(jié)果的圖，其中經(jīng)茯苓皮提取物處理之后，通過東莨菪堿抑制記憶形成。

圖2是示出了實驗動物模型中的y-迷宮測試結(jié)果的圖，其中經(jīng)茯苓皮提取物處理之后，通過東莨菪堿抑制記憶形成。

圖3是示出了實驗動物模型中的新物體識別(nor)測試結(jié)果的圖，其中經(jīng)茯苓皮提取物處理之后，通過東莨菪堿抑制記憶形成。

圖4是示出了當(dāng)經(jīng)茯苓皮提取物處理時，動物模型中的y-迷宮測試結(jié)果的圖，其中將β-淀粉樣肽灌注到腦中以誘導(dǎo)阿爾茨海默氏癡呆的癥狀。

圖5是示出了當(dāng)經(jīng)茯苓皮提取物處理時，動物模型中的新物體識別測試(nort)結(jié)果的圖，其中將β-淀粉樣肽灌注到腦中以誘導(dǎo)阿爾茨海默氏癡呆的癥狀。

圖6是示出了當(dāng)經(jīng)茯苓皮提取物處理時，動物模型中的神經(jīng)細(xì)胞染色結(jié)果的圖，其中將β-淀粉樣肽灌注到腦中以誘導(dǎo)阿爾茨海默氏癡呆的癥狀。

圖7是示出了在使用茯苓皮提取物處理正常動物之后，β-淀粉樣肽測量結(jié)果的圖。

圖8是示出了在使用茯苓皮提取物處理正常動物之后，ngf生成量的測量結(jié)果的圖。

圖9示出了在使用茯苓皮提取物處理神經(jīng)細(xì)胞系sh-sy5y之后，測量ache活性的結(jié)果。

圖10示出了在使用茯苓皮提取物處理神經(jīng)細(xì)胞系sh-sy5y之后，通過mtt測量凋亡程度的結(jié)果。

圖11示出了在使用茯苓皮提取物處理神經(jīng)細(xì)胞系sh-sy5y之后，測量tau蛋白磷酸化程度的結(jié)果。

圖12示出了在使用茯苓皮提取物處理神經(jīng)細(xì)胞系sh-sy5y之后，測量ngf生成程度的結(jié)果。

具體實施方式

下面，將詳細(xì)描述本發(fā)明。

本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物，所述藥物組合物包含作為活性成分的茯苓(學(xué)名：poriacocos)皮提取物。

本發(fā)明的茯苓皮提取物可按照制備草藥提取物的常規(guī)方法來提供，但具體指作為粗提物使用水、醇，或水和醇的混合物獲得的提取物。為提取溶劑之一的醇可以是，但并不限于具有1至4個碳原子的低級醇，優(yōu)選是甲醇、乙醇、丁醇或酒精，更優(yōu)選是乙醇。在此，“酒精”指通過發(fā)酵淀粉原料或糖原料，并且進行蒸餾所產(chǎn)生的乙醇。進一步地，水和醇的混合溶劑不受特別限制，可以以任意期望的比例進行混合。

在本發(fā)明的一個實施方式中，茯苓皮提取物可以使用60(v/v)～80％(v/v)的乙醇，65(v/v)～75(v/v)％的乙醇或70(v/v)％的乙醇來提取，但并不限于此。

在具體實施方式中，可以通過如下過程來獲得本發(fā)明的茯苓皮提取物。首先，洗滌和干燥本發(fā)明的茯苓，然后切制干燥的草藥以獲得切制的草藥。將1～20(v/w)倍、優(yōu)選5～10(v/w)倍的水、具有1至4個碳原子的低級醇或水和具有1至4個碳原子的低級醇(優(yōu)選70(v/v)％的乙醇)的混合物，添加到干燥的切制茯苓中。在10℃至100℃的溫度下，優(yōu)選在室溫下進行1至72小時的提取，優(yōu)選通過以下方法進行48小時的提?。豪涮崛?、熱水提取、超聲提取、回流冷卻提取、加熱提取、超臨界提取、使用熱水提取法的提取，優(yōu)選進行一次冷提取，并且在減壓下進行濃縮以產(chǎn)生茯苓皮提取物。

本發(fā)明的含茯苓皮提取物作為活性成分的組合物可用于治療退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了含茯苓皮提取物作為活性成分的、用于預(yù)防和治療退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物，茯苓皮提取物在制備退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療劑中的應(yīng)用，并且提供了通過向個體給予治療有效量的茯苓皮提取物來治療退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法。

如上所述，本發(fā)明的退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病指，由神經(jīng)細(xì)胞(神經(jīng)元)逐漸發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能性丟失所引起的心智功能退行性疾病。具體地，它包括選自由阿爾茨海默氏病、克雅二氏病、亨廷頓氏舞蹈病、多發(fā)性硬化癥、格林-巴利綜合征、帕金森氏病、盧伽雷氏病、進行性共濟失調(diào)和由神經(jīng)元逐漸死亡所引起的進行性癡呆所組成的組中的疾病。

在本發(fā)明的一個實施方式中，用于預(yù)防和治療退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物基于100重量份的全部藥物組合物，可包含作為活性成分的0.01至90重量份、0.1至90重量份、1至90重量份、或10至90重量份的茯苓皮提取物，但并不限于此，可依據(jù)疾病的狀態(tài)、類型和進展的不同而不同。

在本發(fā)明的另一實施方式中，含茯苓皮提取物作為活性成分的、用于預(yù)防和治療退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物可被配制成用于預(yù)防和治療退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物制劑，該藥物制劑包括藥學(xué)上可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑。

載劑、賦形劑和稀釋劑的實例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥苯甲酯、羥苯丙酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油。

另外，本發(fā)明的組合物可被配制成如下形式的藥物組合物：口服制劑，例如粉劑，顆粒劑，片劑，膠囊，混懸劑，乳劑，糖漿劑和氣霧劑；外用制劑，栓劑或無菌注射液。通常來講，在配制的情況中，可通過使用常用的如填充劑的稀釋劑、增量劑、粘結(jié)劑、潤濕劑、崩解劑、表面活性劑或賦形劑進行制備。口服給藥的固體形式的制劑包括片劑、丸劑、粉劑、顆粒劑、膠囊等，可包含至少一種賦形劑，例如淀粉、碳酸鈣、蔗糖、乳糖、明膠等。除了簡單的賦形劑之外，還可使用潤滑劑，例如硬脂酸鎂和滑石。除了常用的簡單稀釋劑如水和液體石蠟之外，口服用液體制劑的實例包括混懸劑、溶液、乳劑和糖漿劑，以及各種賦形劑，例如潤濕劑、甜味劑、芳香劑、防腐劑等。腸胃外給藥的制劑包括無菌水溶液、非水溶液、混懸劑、乳劑、凍干制劑和栓劑。懸浮劑的實例包括丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄欖油，可注射性酯如油酸乙酯，等等。栓劑基質(zhì)的實例包括外特坡松(witepsol)、聚乙二醇、吐溫(tween)61、可可油脂、月桂酯和甘油明膠。

本發(fā)明的含茯苓皮提取物作為活性成分的、用于預(yù)防和治療退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物的劑量可依據(jù)患者的年齡、性別和體重的不同而不同。通常，0.1至100mg/kg，優(yōu)選1至30mg/kg的量可一天給藥一次至幾次。劑量也可依據(jù)給藥途徑、疾病程度、性別、體重、年齡、健康狀態(tài)、飲食、給藥時間、給藥方法、排泄率等增加或減小。相應(yīng)地，上述用量不是要以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

本發(fā)明的含茯苓皮提取物的用于預(yù)防和治療退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物可以各種途徑給予哺乳動物，例如大鼠、小鼠、牲畜和人?？深A(yù)期所有的給藥方式，例如口服給藥、直腸或靜脈內(nèi)給藥、肌內(nèi)給藥、皮下給藥、子宮內(nèi)硬膜給藥或大腦內(nèi)注射給藥。

本發(fā)明的茯苓皮提取物的毒副作用小，因此可用于預(yù)防目的而安全地長期使用。

本發(fā)明還提供了含茯苓皮提取物的食品組合物。茯苓皮提取物抑制導(dǎo)致腦中神經(jīng)細(xì)胞死亡的物質(zhì)的生成，促進促神經(jīng)細(xì)胞再生和分化的蛋白的表達來保護神經(jīng)細(xì)胞，從而可有效用于生產(chǎn)健康功能性食品和普通食品，該健康功能性食品和普通食品尤其可顯示出預(yù)防和改善神經(jīng)退行性疾病的效果。

具體地，本發(fā)明所限定的健康功能性食品被定義為：最近通過“2002年對于健康功能性食品的規(guī)定”所定義的“在已充分確立了在人體內(nèi)的功能性和安全性基礎(chǔ)上，韓國食品藥品管理局的通知2004-12中規(guī)定的關(guān)于健康功能性食品成分或識別成分的規(guī)定的列表上的健康食品”。

本發(fā)明的含茯苓皮提取物的食品組合物可用于各種食品中以緩解退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病癥狀?？上蚱渲刑砑颖景l(fā)明的草藥提取物的食品是各種食品，例如飲料、口香糖、茶、維生素復(fù)合物、健康功能性食品和健康功能性飲料，并且可以丸劑、粉劑、顆粒劑、浸劑、片劑、膠囊或飲料的形式來使用。

茯苓皮提取物在健康食品組合物中的量通常為0.1wt％至15wt％，優(yōu)選0.2wt％至10wt％，而在健康飲料組合物的情況中，基于100ml可包含0.1g至30g，優(yōu)選0.2g至5g的茯苓皮提取物。

當(dāng)本發(fā)明的食品組合物制備為飲料形式時，除了以所示比例含所述草藥提取物作為必要成分的那些之外，對于液體成分沒有特別限制。此外，如普通飲料那樣，可添加各種調(diào)味劑或天然碳水化合物作為額外的成分。

上述天然碳水化合物的實例包括單糖，例如葡萄糖和果糖；雙糖，例如麥芽糖、蔗糖等；多糖；糊精，環(huán)糊精等，或糖醇，例如木糖醇、山梨糖醇和赤蘚糖醇。除了上面提到的天然香料之外，可有利地使用天然調(diào)味劑(甘味料、甜菊提取物(如萊苞迪甙a、甘草甜素等))和合成的香料(糖精、阿斯巴甜等)。天然碳水化合物的比例通常為每100ml完全健康飲料組合物約1g至20g，優(yōu)選約5g至12g。

除了上面的描述之外，本發(fā)明的食品組合物可進一步包括各種添加劑，例如各種營養(yǎng)物、維生素、礦物質(zhì)(電解質(zhì))，調(diào)味劑例如合成的香料和天然的香料，色素和增稠劑(奶酪、巧克力等)，果膠酸及其鹽，褐藻酸及其鹽，保護膠體增稠劑，ph調(diào)節(jié)劑，穩(wěn)定劑，防腐劑，甘油，醇，碳酸飲料中使用的碳酸化劑等。此外，本發(fā)明的組合物可包括天然果汁和果肉，用于生產(chǎn)果汁飲品和植物飲品。這些成分可獨立使用或組合使用。這些添加劑的比例不受特別的限制，但通常選自每100重量份的本發(fā)明的總食品組合物的0至約20重量份的范圍內(nèi)。

在另一實施方式中，本發(fā)明是用于預(yù)防、改善或治療退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，所述方法包括給予含茯苓皮提取物的活性成分的組合物。或者，本發(fā)明提供了茯苓皮提取物在預(yù)防、改善或治療退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用。用于所述方法或應(yīng)用的所述含茯苓皮提取物的組合物的用量、劑型、給藥方法等如上所述。

【本發(fā)明的實施方式】

將參考下面的實施例和實驗，對本發(fā)明進行詳細(xì)的解釋。但是，下面的實施例和實驗僅是用于示例本發(fā)明，本發(fā)明的范圍并不限于此。

<實施例1>本發(fā)明的茯苓皮提取物的制備

在京東(kyungdong)市場的草藥店購買干燥的茯苓(poriacocos)皮，去除污染物，將完全干燥的草藥用于實驗。100g切制的茯苓皮與1l的蒸餾水(dw)，或30(v/v)％、50(v/v)％、70(v/v)％或95(v/v)％乙醇水溶液混合，將混合物在室溫保持48小時。過濾后，在減壓下濃縮混合物，然后進行凍干以獲得實施例1的茯苓皮提取物(粗提物)(參見表1)。

【表1】

本發(fā)明的茯苓皮提取物的制備

<實驗例1>對茯苓皮的記憶改善和神經(jīng)細(xì)胞保護效果的測試

<1-1>實驗動物的準(zhǔn)備

東莨菪堿誘導(dǎo)的記憶受損(scopolamineinducedmemoryimpairment)模型

六周齡icr小鼠用于本實驗，并且每一實驗組均由8只動物組成。

在給予茯苓皮提取物和對比藥物30分鐘之后，腹腔內(nèi)(i.p)給予1mg/kg東莨菪堿。向正常動物注射相同量的生理鹽水。

在給予東莨菪堿30分鐘之后，進行行為研究。

aβ灌注模型

六周齡的icr小鼠用于本實驗。麻醉動物，固定在立體定位器(stoelting)中，使用hamilton微量注射器(配備有26號針頭)注射3ul溶媒(vehicle)(人造csf)或aβ426分鐘。

將經(jīng)aβ42處理的動物隨機分成實驗組。從給予aβ422天后開始，每天給予一次實驗藥物和陽性對照藥物多奈哌齊(donepezil)連續(xù)給藥11天。

將凍干的藥物，茯苓皮乙醇提取物和對照藥物懸浮在3％hpmc水溶液中，所有藥物均在實驗當(dāng)天制備。

測量腦中的蛋白

為了檢驗茯苓皮提取物對神經(jīng)細(xì)胞死亡誘導(dǎo)物或參與細(xì)胞保護的物質(zhì)生成的效力，持續(xù)5天給予六周齡icr小鼠茯苓皮提取物和對照藥物。在第五天，給藥后4小時，處死實驗動物并且分離出腦。分離出海馬區(qū)用于蛋白分析。進行蛋白測定，以量化樣品中的總蛋白含量。測量值表示為每單位蛋白的測量值。

<1-2>被動回避測試(passiveavoidancetask)

在兩個獨立分開的明亮方盒和黑暗方盒中進行被動回避實驗。使用50w白熾燈對明亮區(qū)域(20×20×20cm)進行照明。明亮區(qū)域和黑暗區(qū)域(20×20×20cm)相隔1cm，并且安裝了2mm不銹鋼桿。

在習(xí)慣期期間，兩個部分通過閘門(5×5cm)分隔開，將實驗動物放置在明亮部分中30秒之后，打開閘門。允許動物自由通過。當(dāng)它們抵達黑暗區(qū)域時，關(guān)閉閘門，3秒之后拿出動物。

24小時后進行獲得實驗(acquisitiontrial)。在藥物和對照藥物給藥30分鐘后，腹腔內(nèi)給予1mg/kg東莨菪堿，并且在30分鐘之后進行行為實驗。實驗小鼠最初放置在明亮區(qū)域中，30秒之后打開區(qū)域之間的門。當(dāng)實驗小鼠進入黑暗區(qū)域中時，關(guān)閉閘門，通過不銹鋼桿立即施加持續(xù)2秒，強度為0.5ma的電擊(electricalfootshock)，測量實驗動物進入黑暗區(qū)域的時間。

在進行獲得試驗并且給予了24小時休息時間之后，將實驗動物放置在明亮區(qū)域中以進行保留試驗(retentiontrial)，測量直至進入黑暗區(qū)域的時間。獲得試驗和保留試驗都測定小鼠的四只爪子全部從明亮房間進入黑暗房間所花費的時間。

結(jié)果如圖1所示，證實了當(dāng)口服給予0、30(v/v)％、50(v/v)％、70(v/v)％和95(v/v)％的乙醇茯苓皮提取物時，獲得了顯著改善空間記憶的效果。最有效的70％乙醇茯苓皮提取物示出了與1mg/kg多奈哌齊(dpz)類似的效力，其中已知多奈哌齊是乙酰膽堿酯酶抑制劑(圖1)。

<1-3>y-迷宮測試

進行y-迷宮實驗，來研究短期記憶效果。將動物放置在y-迷宮的一個臂上，允許動物自由移動8分鐘。測量自發(fā)交替和總進入次數(shù)。當(dāng)動物相繼進入三個臂時，它們被定義為交替(alternation)進入，通過下面的等式1計算比率。

[等式1]

自發(fā)交替率(％)＝[(變換次數(shù))/(總進臂數(shù)-2)]×100

結(jié)果如圖2所示，以100mg/kg的藥量口服給予0、30(v/v)％、50(v/v)％、70(v/v)％和95(v/v)％的乙醇茯苓皮提取物，改善了東莨菪堿誘導(dǎo)的實驗動物模型的空間記憶力，在東莨菪堿誘導(dǎo)的實驗動物模型中，記憶形成被抑制。如圖4所示，在給予aβ42的阿爾茨海默氏癡呆模型中也恢復(fù)了空間記憶力(圖2和圖4)。

<1-4>新物體識別(nor)測試

在45cm寬、45cm長和50cm高的黑暗盒子內(nèi)，放置相同尺寸但不同形狀的兩個塑料物體。允許實驗動物自用移動8分鐘，測量在每一物體上花費的時間(訓(xùn)練過程)。24小時后，將實驗動物放置在具有一個來自訓(xùn)練過程的熟悉物體和一個新物體的盒子中，測量在每一物體上花費的時間(測試過程)。使用下面的等式(2)計算記錄的值，表示為新物體的識別結(jié)果。

[等式2]

新物體的識別率(％)＝在新物體上花費的時間/(在新物體上花費的時間+在有經(jīng)驗的物體上花費的時間)×100

如圖3所示，當(dāng)以100mg/kg的藥量口服給予0、30(v/v)％、50(v/v)％、70(v/v)％和95(v/v)％的乙醇茯苓皮提取物時，東莨菪堿誘導(dǎo)的記憶形成被抑制的實驗動物模型示出認(rèn)知記憶得到改善。如圖5所示，由于給予aβ42的阿爾茨海默氏癡呆模型也恢復(fù)了認(rèn)知記憶(圖3、圖5)。

<1-5>免疫組化染色

對于免疫組化染色，向如實驗例1-1中所述的aβ灌注動物注入1×pbs(磷酸鹽緩沖鹽水)，經(jīng)4％多聚甲醛固定，并且摘取腦。將腦在相同的溶液中固定一天，并且保存在30％蔗糖溶液中，4℃中，每兩天換一次溶液，直至進行冷凍切片。然后，在冷凍切片機(cryostat)中通過滴加oct(優(yōu)化的切片溫度)化合物，在-20℃使腦組織充分冷凍，然后進行30μm厚的切片，并且在防腐液中儲存在4℃。使用海馬區(qū)進行免疫組化染色。經(jīng)pbs沖洗過的組織用1％h2o2處理15分鐘。之后，組織用0.05mpbs、1.5％常規(guī)山羊血清、0.5mg/ml牛血清白蛋白、0.3％tritonx-100和山羊neun一級抗體(1:500)處理，并且為了防止非特異性反應(yīng)，在4℃反應(yīng)24小時。在去除一級抗體之后，使組織與綴合過氧化物酶的二級抗體(1:200)反應(yīng)90分鐘，將abc稀釋在緩沖液中并在室溫反應(yīng)約1小時。使用pbs沖洗三次之后，使用0.02％dab和0.01％h2o2對組織進行顯影，并且進行乙醇和二甲苯脫水來制備玻片樣本。

結(jié)果如圖6所示，當(dāng)以100mg/kg的藥量口服給予茯苓皮的0、30(v/v)％、50(v/v)％、70(v/v)％和95(v/v)％乙醇提取物時，顯著增加了因β淀粉樣肽毒性而減少的神經(jīng)元(neun陽性)(圖6)。證實了茯苓皮提取物對神經(jīng)元細(xì)胞具有保護效果，能提高記憶力。

<1-6>測量腦中的aβ生成

進行elisa實驗來研究茯苓皮提取物對β淀粉樣肽生成的抑制效果，其中β淀粉樣肽生成已知是導(dǎo)致阿爾茨海默氏病的主要原因。

摘取實驗例<1-1>中的正常動物的腦，添加ripa緩沖液并且進行機械均質(zhì)化。離心后，獲取上清液，并且使用β淀粉樣肽分析試劑盒(ibl)測量腦中β淀粉樣肽的濃度。

結(jié)果如圖7所示，當(dāng)口服給予100mg/kg茯苓皮的0、30(v/v)％、50(v/v)％、70(v/v)％和95(v/v)％乙醇提取物時，顯著降低了腦中β淀粉樣肽的濃度(圖7)。上述結(jié)果證明了茯苓皮提取物去除了導(dǎo)致阿爾茨海默氏癡呆的β淀粉樣肽。

<1-7>ngf(神經(jīng)生長因子)水平的測量

進行elisa實驗來證明茯苓皮提取物對ngf生成的效力，其中ngf已知具有使神經(jīng)元再生和分化的活性。摘取實驗例<1-1>中的正常動物的腦后，分離出海馬區(qū)，向其中添加ripa緩沖液并且進行機械均質(zhì)化。對于ngf測量，添加對應(yīng)于每一腦的重量的高鹽高去垢劑緩沖液，并且進行機械均質(zhì)化。在添加了10ul4nhcl并且靜置15分鐘之后，使與受體結(jié)合的ngf分離，添加4nnaoh，使混合物再靜置15分鐘。通過離心，取出上清液，并且使用ngf測量試劑盒(millipore)測量腦中的ngf濃度。

結(jié)果如圖8所示，當(dāng)口服給予100mg/kg茯苓皮的0、30(v/v)％、50(v/v)％、70(v/v)％和95(v/v)％乙醇提取物時，顯著降低了腦中的ngf濃度。這些結(jié)果表明茯苓皮提取物通過促進ngf的生成而促進對神經(jīng)細(xì)胞的保護。

<實驗例2>證明茯苓皮提取物的體外(invitro)神經(jīng)細(xì)胞的保護效果

<2-1>測量神經(jīng)細(xì)胞系中的乙酰膽堿酯酶(ache)的活性

已經(jīng)開發(fā)并且使用了多種乙酰膽堿酯酶抑制劑，因為這些抑制劑通過增加神經(jīng)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)中的乙酰膽堿濃度來活化膽堿能神經(jīng)元，從而增強記憶力并且改善癡呆。測量乙酰膽堿酯酶的活性，來證明茯苓皮提取物的乙酰膽堿酯酶抑制效果。從kclb(韓國細(xì)胞系庫)購買了sh-sy5y細(xì)胞，一種神經(jīng)細(xì)胞系。將sh-sy5y細(xì)胞(1×10⁶細(xì)胞/孔)接種在六孔培養(yǎng)板上，并且在含10％胎牛血清的dmem/f12(杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基，dulbecco'smodifiedeagle'smedium)培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時。使用含10μm視黃酸和3％fbs的dmem/f12培養(yǎng)基分化5天之后，使用10、100μg/ml茯苓皮提取物處理細(xì)胞。使用ripa緩沖液(150mmnacl、0.5％tritonx-100、50mmtris-hcl、ph7.4、25mmnaf、20mmegta、1mmdtt、1mmna3vo4、蛋白酶抑制劑雞尾酒)裂解細(xì)胞，并且使用購自pierce的bca試劑對蛋白含量進行定量。按照ellman法，使用乙酰膽堿作為底物來確定乙酰膽堿酯酶的活性。乙酰膽堿酯酶所產(chǎn)生的硫代膽堿與dtnb反應(yīng)，通過測量405nm的吸光度變化來確定所產(chǎn)生的5-硫代-2-硝基苯甲酸鹽。

結(jié)果如圖9所示，當(dāng)以10μg/ml的濃度給予神經(jīng)細(xì)胞系茯苓皮的0、30(v/v)％、50(v/v)％、70(v/v)％、95(v/v)％乙醇提取物時，aβ42誘導(dǎo)的乙酰膽堿酯酶活性恢復(fù)至正常水平(圖9)。

<2-2>神經(jīng)細(xì)胞系中的細(xì)胞保護效果

在由人造聚集物aβ42引起對神經(jīng)細(xì)胞系毒性的模型中，使用mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽)測定，來測量茯苓皮提取物的細(xì)胞保護效果。將sh-sy5y(1×10⁴細(xì)胞/孔)接種在96孔培養(yǎng)板中，并且在含10％胎牛血清的dmem/f12(杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基：營養(yǎng)物混合物f-12)培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時。在使用含10μm視黃酸和3％fbs的dmem/f12培養(yǎng)基分化5天之后，使用濃度為0.01、0.1、1、10、100或200ug/ml的茯苓皮提取物處理細(xì)胞并且保持6小時。之后，使用aβ42處理并且培養(yǎng)總共48小時。使用2mg/mlmtt處理4小時之后，將formazon溶解在dmso中，并且測量590nm處的吸光度。

如圖10所示，在給予10μg/ml茯苓皮的0、30(v/v)％、50(v/v)％、70(v/v)％、95(v/v)％乙醇提取物之后，aβ42誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性以濃度依賴的方式降低，而且細(xì)胞數(shù)量增加(圖10)。

<2-3>對神經(jīng)元細(xì)胞系中的磷酸化tau蛋白的測量

測量磷酸化tau蛋白的水平，以證明茯苓皮提取物對tau蛋白過磷酸化的抑制效果。將sh-sy5y細(xì)胞(1×10⁶細(xì)胞/孔)接種在六孔培養(yǎng)板上，并且在含10％fbs(胎牛血清)的dmem/f12(杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基)培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時。在使用含10μm視黃酸和3％fbs的dmem/f12培養(yǎng)基分化5天后，使用10或100ug/ml茯苓皮提取物處理6小時，然后經(jīng)aβ42處理并且培養(yǎng)總共48小時。使用ripa緩沖液裂解細(xì)胞之后，使用購自pierce的bca試劑對蛋白含量進行定量。使用購自invitrogen的人tau[ps199]酶聯(lián)免疫吸附測試(elisa)試劑盒，測量磷酸化的tau蛋白。

如圖11所示，當(dāng)神經(jīng)元細(xì)胞系經(jīng)10ug/ml茯苓皮的0、30(v/v)％、50(v/v)％、70(v/v)％、95(v/v)％的乙醇提取物處理時，由aβ42誘導(dǎo)的tau蛋白磷酸化被抑制，并且恢復(fù)至正常水平。廣泛用于癡呆(一種代表性退行性腦病)的多奈哌齊是沒有示出對tau蛋白磷酸化的抑制效果(圖11)。

<2-4>神經(jīng)細(xì)胞系中的神經(jīng)生長因子(ngf)水平的測量

測量ngf水平，以確定茯苓皮提取物的認(rèn)知改善的機制。將sh-sy5y細(xì)胞(1×10⁶細(xì)胞/孔)接種在六孔培養(yǎng)板上，并且在含10％胎牛血清的dmem/f12(杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基)培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時。使用含10μm視黃酸和3％fbs的dmem/f12培養(yǎng)基分化5天之后，使用10或100μg/ml茯苓皮提取物處理細(xì)胞。使用ripa緩沖液裂解細(xì)胞，并且使用購自pierce的bca試劑對蛋白含量進行定量。使用購自abcam的β神經(jīng)生長因子人酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)試劑盒，測量ngf水平。

如圖12所示，在使用10ug/ml茯苓皮的0、30(v/v)％、50(v/v)％、70(v/v)％和95(v/v)％的乙醇提取物處理的神經(jīng)元細(xì)胞系中，ngf生成顯著增加。廣泛用于癡呆(一種典型的退行性腦病)的多奈哌齊是沒有示出與ngf相關(guān)的效果(圖12)。

如上所述，本發(fā)明的茯苓皮提取物通過抑制β淀粉樣肽的生成和tau蛋白磷酸化(其通過引起神經(jīng)元細(xì)胞死亡而導(dǎo)致退行性腦病)抑制了疾病的發(fā)生或進行，并且通過抑制乙酰膽堿酯酶而提高了記憶力。本發(fā)明的茯苓皮提取物還促進了ngf的生成，這促進了對神經(jīng)元的保護和神經(jīng)分化。因此，本發(fā)明可用于預(yù)防、改善和治療由于神經(jīng)元逐漸死亡而導(dǎo)致的進行性癡呆，不僅可用于如阿爾茨海默氏癡呆的疾病，還可用于克雅二氏病、亨廷頓氏舞蹈病、多發(fā)性硬化癥、格林-巴利綜合征、帕金森氏病和盧伽雷氏病。本發(fā)明還可用于預(yù)防、改善和治療退行性神經(jīng)障礙，包括姿勢和運動障礙、進行性共濟失調(diào)、肌肉萎縮和無力以及感覺和運動障礙。

下文中，將描述本發(fā)明實施例1中的含茯苓皮提取物的組合物的制備例，但這僅是是對本發(fā)明的詳細(xì)描述，本發(fā)明并不限于此。

制備例1：注射劑的制備

實施例1的提取物..............................100mg

焦亞硫酸鈉...................................3.0mg

對羥基苯甲酸甲酯.............................0.8mg

對羥基苯甲酸丙酯.............................0.1mg

注射用無菌蒸餾水.............................適量

通過常規(guī)的注射劑制備方法，混合上述成分制成2ml。之后，將混合物填充到2ml安瓿中并且滅菌，以制備成注射劑。

制備例2：片劑的制備

實施例1的提取物.............................200mg

乳糖........................................100mg

淀粉........................................100mg

硬脂酸鎂....................................適量

按照常規(guī)的片劑制備方法，混合上述組分并且進行壓片來制備片劑。

制備例3：膠囊的制備

實施例1的提取物............................100mg

乳糖.......................................50mg

淀粉.......................................100mg

滑石.......................................2mg

硬脂酸鎂...................................適量

按照常規(guī)的膠囊制備方法，混合上述組分并且填充到明膠膠囊中來制備膠囊。

制備例4：液體劑的制備

實施例1的乙醇提取物........................1000mg

糖...............................................20g

異構(gòu)糖.........................20g

檸檬香........................................適量

添加了純化水之后，總液體體積................100ml

按照生產(chǎn)液體制劑的常規(guī)方法混合上述組分，填充在100ml棕色瓶中，滅菌來制備液體制劑。