發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及促進(jìn)皮脂減少的細(xì)菌來(lái)源的細(xì)胞外產(chǎn)物。所述產(chǎn)物由南極假交替單胞菌(pseudoalteromonasantarctica)的菌株分泌。本發(fā)明還涉及細(xì)菌來(lái)源的細(xì)胞外產(chǎn)物在化妝品或皮膚藥物組合物中的用途，所述化妝品或皮膚藥物組合物用于治療和/或護(hù)理皮膚、粘膜和/或毛發(fā)。

發(fā)明背景

皮膚、粘膜、毛發(fā)和/或指甲構(gòu)成生物體與其環(huán)境之間的物理屏障。皮膚由兩種組織組成：表皮和真皮。表皮是皮膚的最外層，其是不滲透的，并因此提供對(duì)外部病原體的防護(hù)作用。它是一種自身不斷更新的角質(zhì)化多復(fù)層上皮細(xì)胞。

表皮具有來(lái)自表皮中的主要類(lèi)型的細(xì)胞(角質(zhì)形成細(xì)胞)的高角蛋白含量、黑色素和在皮膚表面的角質(zhì)層或親水性膜中發(fā)現(xiàn)的較大含量的脂質(zhì)。在覆蓋皮膚表面的脂質(zhì)膜中發(fā)現(xiàn)皮脂和角質(zhì)形成細(xì)胞來(lái)源的脂質(zhì)，其中這些脂質(zhì)的主要部分具有皮脂來(lái)源。[a.pappas，“epidermalsurfacelipids”，dermato-endocrinology2009，1，72-76]。

皮脂分泌物在皮脂腺中產(chǎn)生，皮脂腺遍及身體以及手和腳掌中，并且發(fā)現(xiàn)它們?cè)诿娌康拿芏葹?00-900個(gè)腺體/cm²。[k.r.smith和d.m.thiboutot，“sebaceousglandlipids：friendorfoe？”，journaloflipidresearch2008，49，271-281]，主要與毛囊有關(guān)，其中皮脂分泌物通過(guò)其通道到達(dá)皮膚表面。皮脂腺分泌物皮脂是由主要由脂肪酸、甘油二酯、甘油三酯、膽固醇和角鯊烯構(gòu)成的混合物組成的油狀和蠟狀物質(zhì)，其提供了溫度調(diào)節(jié)功能并減少了皮膚表面的水分流失。

在人中，產(chǎn)生的皮脂量根據(jù)人口群體的不同在一定范圍變化，這也取決于年齡和激素因素的調(diào)節(jié)。根據(jù)皮脂量的不同，其區(qū)別在于：

-油性皮膚。油性皮膚是由皮脂腺過(guò)多的功能引起的。當(dāng)皮膚中存在過(guò)多的皮脂時(shí)，皮膚的特征在于較厚的質(zhì)地、油膩和光亮的外觀，以及存在擴(kuò)張的孔和皮膚缺陷。

-組合皮膚。其特征在于同時(shí)存在干燥和油膩的區(qū)域。通常，油性區(qū)域位于前額、鼻子和下巴上(稱(chēng)為t區(qū))。t區(qū)外面的部分通常是干燥區(qū)域，這歸因于該區(qū)域的皮膚較薄，這增加了其脫屑。

-干性皮膚。皮脂缺乏意味著不能夠保持足夠的水合作用，這使得脆弱的皮膚具有較高的脫屑和細(xì)皺紋的傾向。由于顯示出不可察覺(jué)的毛孔特征，所以屏障功能的能力降低意味著對(duì)有害外部因素例如uv、寒冷和風(fēng)等的敏感性更高。

-正常皮膚。由于適量的皮脂能夠保持良好的水分平衡，所以這種皮膚呈現(xiàn)出良好的彈性和抗性，幾乎沒(méi)有可見(jiàn)的毛孔和具有均勻的膚色。

盡管在很大程度上依賴(lài)于年齡和種族來(lái)源，但存在大量平均的顯示出油性皮膚的人群，以及存在具有與油性t區(qū)的組合皮膚的人群。

與過(guò)量皮脂相關(guān)的一些皮膚病學(xué)障礙是：

-皮脂溢，即產(chǎn)生皮脂分泌過(guò)多的皮脂腺功能障礙，其導(dǎo)致紅色、刺激性和鱗狀皮膚。

-痤瘡，即當(dāng)皮膚毛孔中俘獲皮脂、死細(xì)胞和細(xì)菌停止時(shí)發(fā)生的感染。

-粉刺，即硬化的皮脂和大量的角化細(xì)胞的積累，其導(dǎo)致堵塞卵泡的方式。

-粟粒疹或乳斑，即夾帶在皮膚下的角化細(xì)胞和皮脂物質(zhì)的蓄積。

在皮脂腺內(nèi)部，當(dāng)成熟的皮脂腺細(xì)胞在腺體內(nèi)部破裂時(shí)，皮脂被釋放，并且皮脂通過(guò)毛囊的通道脫離至皮膚表面。在達(dá)到皮脂釋放之前，腺體功能可以知曉在與毛囊相鄰的層中存在一些未分化的細(xì)胞群，當(dāng)它們移動(dòng)到腺體的基底層時(shí)開(kāi)始其增殖，并且它們變成脂質(zhì)-填充的皮脂腺細(xì)胞，因?yàn)樗鼈兊竭_(dá)腺體的中心部分，其中它們最終和進(jìn)行性地發(fā)生[c.niemanandv.horsley，“developmentandhomeostasisofthesebaceousgland”，seminarsincell&developmentalbiology2012，23，928-936]。

大量的化合物已經(jīng)顯示出它們?cè)谡{(diào)節(jié)皮脂腺功能中的作用，例如雄激素、雌激素、類(lèi)視色素、lxr型受體(肝x受體)、過(guò)氧化酶體激增劑激活的受體、生長(zhǎng)激素/胰島素樣生長(zhǎng)因子和黑皮質(zhì)素[k.r.smith和d.m.thiboutot，“sebaceousglandlipids：friendorfoe？”，journaloflipidresearch2008，49，271-281]。

黑皮質(zhì)素家族由與阿黑皮素(propiomelanocortin)(pomc)結(jié)構(gòu)相關(guān)的一組肽類(lèi)與調(diào)節(jié)黑皮質(zhì)素肽作用的黑皮質(zhì)素受體(mcr)組成。mcr與g蛋白(gpcr)結(jié)合并通過(guò)不同的途徑傳遞信號(hào)：產(chǎn)生環(huán)腺苷酸(camp)，激活蛋白激酶a，并且增加[ca²⁺]陽(yáng)離子的濃度。

mc5r是已經(jīng)在各種人體組織中表征的不同的黑皮質(zhì)素受體之一，并且它牽涉脂質(zhì)生產(chǎn)[m.a.bednarek等人，“potentandselectivepeptideagonistsofα-melanocitestimulatinghormonone(αmsh)actionathumanmelanocortinreceptor5；theirsynthesisandbiologicalevaluationinvitro”，chem.biol.drug.des.2007，69，350-355]。例如，缺乏mc5r受體表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠顯示皮脂生成顯著減少[d.m.thibotout等人，“themelanocortin5receptorisexpressedinhumansebaceousglandsandratpreputialcells”，j.invest.dermatol.2000，115，614-619]。此外，mc5r被認(rèn)為是皮脂腺細(xì)胞分化的標(biāo)記，因?yàn)樵谖捶只钠ぶ偌?xì)胞中未檢測(cè)到mc5r，而在分化的后期階段在皮脂腺細(xì)胞中檢測(cè)到mc5r，而在基底、未分化的皮脂腺細(xì)胞中檢測(cè)不到mc5r。類(lèi)似地，mc5r僅在分化開(kāi)始時(shí)的體外培養(yǎng)物中和顯示出顯著的脂質(zhì)顆粒的完全分化的皮脂腺細(xì)胞中可以被檢測(cè)到[l.zhang等人，“melanocortin-5receptor：amarkerofhumansebocytedifferentiation”，peptides2006，27，413-420]。由于mc5r是與導(dǎo)致皮脂生成的皮脂分化過(guò)程相關(guān)的標(biāo)記，因此，該受體mc5r的抑制可用作減少皮脂產(chǎn)生并因此用于治療和/或預(yù)防與過(guò)量皮脂相關(guān)的障礙和/或疾病的策略。

此外，已經(jīng)證實(shí)mc5r受體的抑制在治療脂溢性皮炎、癌癥和炎性疾病方面是有益的(us2009/221558)。例如，米爾-多里綜合征由與體內(nèi)腺癌(通常在結(jié)腸、前列腺、乳腺或卵巢)相關(guān)的皮脂腺中的腺瘤組成，并且通過(guò)抑制mc5r受體來(lái)預(yù)防皮脂腺細(xì)胞分化可以在治療腫瘤生長(zhǎng)中有效(us2009/221558)。還觀察到，受體mc5r的抑制對(duì)于治療厭食癥或惡病質(zhì)(us2003/110518)和用于治療化膿性汗腺炎和耳垢過(guò)量產(chǎn)生(wo03/040118a1)方面是有益的。

還已知某些化合物，例如抑制皮脂腺的雌激素對(duì)膠原蛋白合成具有刺激作用，且由此具有皮膚緊致作用[a.parchami，r.a.fatahiandehkordi，“effectofovariectomyandchronicsexsteroidadministrationonrabbitskin”，globalveterinaria，2010，4(6)，610-615]。

在現(xiàn)有技術(shù)中描述了來(lái)自海洋的胞外聚合物質(zhì)matmarine^tm，其作用于mc5r受體[soap，perfumery&cosmetics，productinnovation2013，39頁(yè)]。matmarine^tmmatmarinetm據(jù)說(shuō)可以降低皮脂率(8.4％)，數(shù)量(20.5％)和毛孔面積(18.8％)。

令人驚奇地，本發(fā)明的申請(qǐng)人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，由南極假交替單胞菌菌株產(chǎn)生的分子量低于10kda的提取物抑制mc5r受體并增加皮膚中的膠原蛋白合成。

從現(xiàn)有技術(shù)中已知，由南極假交替單胞菌種類(lèi)產(chǎn)生的糖蛋白具有愈合的特性(ep1402898b1)、保濕并修復(fù)皮膚角化障礙(ep2337556a1)?，F(xiàn)有技術(shù)還公開(kāi)了具有分子重量為109kda、52.5kda、48kda、44kda、42kda、34.5kda、33kda、31kda和24kda的南極假交替單胞菌膜囊上的蛋白譜圖。主要蛋白質(zhì)的平均分子量為98-112kda[morphologicalandphysiologicalstudyofpseudoalteromonasantarcticanf3andcharacterizationofmembranevesiclespresentintheproducedextracellularmaterial，doctoralthesisofmarianevot，universityofbarcelona提交]。

發(fā)明概述

所公開(kāi)的技術(shù)提供了通過(guò)南極假交替單胞菌種類(lèi)菌株的提取物減少皮膚、粘膜和/或毛發(fā)中的漿液的溶液。

附圖簡(jiǎn)述

圖1：密度圖顯示在不同培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的皮脂腺細(xì)胞的大小(fsc-a)和粒度(ssc-a)的形態(tài)學(xué)參數(shù)。未分化的皮脂腺細(xì)胞顯示兩個(gè)具有相似粒度水平但兩種不同大小的主要細(xì)胞群體。分化的皮脂腺細(xì)胞表現(xiàn)出獨(dú)特的細(xì)胞群，其特征在于高粒度水平和小的細(xì)胞大小。用2.5μg/ml根據(jù)實(shí)施例1得到的提取物處理的皮脂腺細(xì)胞顯示與未分化的皮脂腺細(xì)胞相似的形態(tài)減少的粒度和增加的細(xì)胞大小的變化。

本發(fā)明的描述

本發(fā)明涉及通過(guò)南極假交替單胞菌種類(lèi)生產(chǎn)的10,000da以下的分子量提取物的化妝品和/或皮膚藥物用途。令人驚奇地，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，上述舉出的提取物減少皮膚和/或毛發(fā)中的皮脂的量，增加皮膚中的膠原蛋白合成，并且它們也是光保護(hù)劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，mc5r受體的抑制減少了皮膚和/或頭發(fā)中的皮脂產(chǎn)生，并且其減少了皮脂的量。

定義

為了便于對(duì)本發(fā)明的理解，包括了在本發(fā)明的上下文中使用的一些術(shù)語(yǔ)和表述的含義。

在本發(fā)明的上下文中，“皮膚”應(yīng)當(dāng)被理解為包含它的從最上層或角質(zhì)層到最下層或皮下組織(包括兩者)的層。這些層由不同類(lèi)型的細(xì)胞組成，例如角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、黑素細(xì)胞和/或脂肪細(xì)胞等。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“皮膚”包括頭皮。

在本說(shuō)明書(shū)的上下文中使用的術(shù)語(yǔ)“治療”當(dāng)其不伴隨“化妝品、非治療性”的限制時(shí)，是指施用根據(jù)本發(fā)明的化合物以減輕或消除疾病或障礙或減少或消除與該疾病或障礙相關(guān)的一種或多種癥狀。術(shù)語(yǔ)“治療”也涵蓋減輕或消除疾病或障礙的生理后果的能力。

當(dāng)術(shù)語(yǔ)“治療”伴隨著“化妝品、非治療性”的限制時(shí)，它們是指將化合物應(yīng)用于皮膚、毛發(fā)和/或粘膜，特別是目的在于改善化妝品的皮膚、毛發(fā)和/或粘膜的美容質(zhì)量，例如、但不限于其水合水平、彈性、堅(jiān)固度、光澤、色調(diào)或質(zhì)地等。本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)“護(hù)理”是指保持皮膚、毛發(fā)和/或粘膜的質(zhì)量。這些品質(zhì)經(jīng)過(guò)健康受試者以及呈現(xiàn)皮膚和/或粘膜疾病和/或障礙的那些受試者中的皮膚、毛發(fā)和/或粘膜美容處理和/或護(hù)理而得到改善并維持，例如、但不限于皮膚上的潰瘍和損傷、銀屑病、皮炎、痤瘡或玫瑰痤瘡等。

本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“預(yù)防”是指本發(fā)明化合物在其出現(xiàn)之前預(yù)防、延緩或阻止疾病或障礙出現(xiàn)或發(fā)展的能力。

在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“老化”是指皮膚隨年齡(按時(shí)間順序的老化(chronoaging)或通過(guò)暴露于日光(光老化)或環(huán)境因素例如煙草煙霧、寒冷、炎熱或風(fēng)的極端氣候條件、化學(xué)污染物或污染物質(zhì)所經(jīng)歷的變化，并包括通過(guò)觸摸的所有外部可見(jiàn)和/或可察覺(jué)的變化，例如、但不限于皮膚上的不連續(xù)性的發(fā)展，例如皺紋、細(xì)線、溝、不規(guī)則或粗糙度、毛孔大小增加、彈性缺失、硬度缺失、光滑度缺失、從變形恢復(fù)的能力喪失、皮膚下垂例如下垂的頰部、眼袋出現(xiàn)或雙下巴外觀等；皮膚顏色的變化，例如痕跡、變紅、眼袋或出現(xiàn)色素沉著過(guò)度的區(qū)域，例如老年斑或雀斑等；真皮、表皮、血管系統(tǒng)(例如蜘蛛狀血管病或毛細(xì)血管擴(kuò)張癥的外觀)或那些靠近皮膚的組織的異常分化、角化過(guò)度、彈性組織變性、角化病、脫發(fā)、陳皮樣皮膚、膠原蛋白結(jié)構(gòu)缺失和其它角質(zhì)層的組織學(xué)改變等。術(shù)語(yǔ)“光老化”將由于皮膚長(zhǎng)時(shí)間暴露于紫外線輻射導(dǎo)致的一組過(guò)程組合在一起，其導(dǎo)致皮膚過(guò)早老化，并呈現(xiàn)與衰老相同的物理特性，例如、但不限于松弛性、下垂、顏色變化或色素沉著異常、異常和/或過(guò)度角化。

因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及通過(guò)用于治療皮膚和/或粘膜的南極假交替單胞菌的種類(lèi)的菌株產(chǎn)生的10,000da以下的分子量的提取物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述治療是指治療和/或預(yù)防炎癥、皮膚癌、黑頭粉刺、粟粒疹、痤瘡，皮脂溢、脂溢性皮炎、化膿性汗腺炎或皮膚光保護(hù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述炎癥選自，例如、但不限于銀屑病、敏感性皮膚、皮炎、特應(yīng)性皮炎、接觸性皮炎、尿布皮炎、脂溢性皮炎、濕疹、紅斑痤瘡、痤瘡，過(guò)度增生性皮膚病、燒傷、曬傷、甲殼炎、術(shù)后、用強(qiáng)脈沖光療法(ipl)治療后、用單色脈沖光療法(激光)治療后、用化學(xué)剝離劑治療后或過(guò)度暴露于侵蝕性外用藥物后的皮膚炎癥、陰道粘膜炎癥、口腔粘膜炎炎癥、牙齦炎、牙周炎、鼻炎、過(guò)敏性鼻炎等。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于治療癌癥、厭食癥或惡病質(zhì)的由南極假交替單胞菌的種類(lèi)的菌株產(chǎn)生的10,000da以下的分子量的提取物。在一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥的治療是抑制腫瘤生長(zhǎng)或muir-torre綜合征的治療。在一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥治療是抑制腫瘤生長(zhǎng)或?qū)γ谞?多里綜合征的治療。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及由南極假交替單胞菌的種類(lèi)的菌株產(chǎn)生的10,000da以下的分子量的提取物在美容、非治療性治療和/或護(hù)理皮膚、粘膜和/或毛發(fā)中的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，皮膚、粘膜和/或毛發(fā)的美容、非治療性治療和/或護(hù)理是治療皮膚和/或毛發(fā)中皮脂量的減少，治療和/或預(yù)防皮膚老化，治療和/或預(yù)防皮膚皺紋，治療皮膚緊致，防止皮膚緊致度缺失和/或毛發(fā)衛(wèi)生保健。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，皮膚和/或粘膜的治療以及皮膚、粘膜和/或毛發(fā)的美容、非治療性治療和/或護(hù)理抑制mc5r受體。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，皮膚和/或粘膜的治療以及皮膚、粘膜和/或毛發(fā)的美容、非治療性治療和/或護(hù)理刺激膠原蛋白合成。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，皮膚和/或粘膜的治療以及皮膚、粘膜和/或毛發(fā)的美容、非治療性治療和/或護(hù)理通過(guò)局部或透皮應(yīng)用進(jìn)行。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，由南極假交替單胞菌的種類(lèi)的菌株產(chǎn)生的提取物的分子量高于50da且低于10,000da，在100da至8,000da之間，150da至6,000da之間或300da至5,000da之間。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，南極假交替單胞菌的種類(lèi)的菌株是具有保藏號(hào)cect8690的菌株。所述菌株已于2014年7月29日寄存在公共機(jī)構(gòu)coleccióndecultivostipo(cect)(edificio3cue，parccientíficuniversitatdevalencia，catedráticoagustínescardino9，46980paterna，valencia，spain)根據(jù)“布達(dá)佩斯條約”在1977年4月28日的國(guó)際承認(rèn)微生物保藏條款(internationalrecognitionofthedepositofmicroorganisms)而在法律上得到認(rèn)可。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，分子量在10,000da以下的提取物可以通過(guò)在適合的培養(yǎng)基中發(fā)酵南極假交替單胞菌種類(lèi)的菌株獲得，通常攪拌和通氣以合成和分泌所述產(chǎn)物至培養(yǎng)基，隨后是隔離和純化。用于生產(chǎn)本發(fā)明提取物的發(fā)酵可以在介于5℃至37℃之間或在8℃至20℃之間的溫度下攪拌和充氣的培養(yǎng)基中進(jìn)行，所述培養(yǎng)基具有在5.5-9之間或6.5-7.5的ph，如果需要在發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行調(diào)整。發(fā)酵的時(shí)間期限為24至120小時(shí)或36至72小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在10,000da下分子量的提取物的分離和純化的方法通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行，例如離心和過(guò)濾。在涉及從發(fā)現(xiàn)提取物的上清液中分離南極假交替單胞菌種類(lèi)的菌株離心和過(guò)濾步驟之后，進(jìn)行過(guò)濾以消除高分子量的分子，以便純化該提取物，并且使用保留分子量大于10,000da的分子的膜。在一個(gè)實(shí)施方案中，南極假交替單胞菌種類(lèi)的菌株是具有保藏號(hào)cect8690的菌株。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，10,000da以下的分子量的南極假交替單胞菌種類(lèi)的菌株的提取物在色譜分析高效液相色譜(hplc)中具有5至20分鐘或8至17分鐘之間的保留時(shí)間，其中使用色譜柱tskgelg2000swxl，5m，7.8mmx30mm(tosohbioscience)和具有0.1mph＝6.70+0.1m磷酸鹽緩沖液+0.1m硫酸鈉的水作為洗脫液。

在一個(gè)實(shí)施方案中，在南極假交替單胞菌種類(lèi)的菌株的發(fā)酵中，一些外源性糖，例如、但不限于半乳糖、葡萄糖、甘露糖、苦杏仁苷、纖維二糖、麥芽糖、淀粉、糖原、乳糖及其混合物和/或包含這些糖的混合物的提取物可以用作碳源。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供2-40g/l或10-30g/l的外源葡萄糖供應(yīng)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)基包含額外的氮或碳源，例如酵母提取物、麥芽提取物或胨，其中這些成分的每一種的濃度為0.1-20g/l或0.5-10g/l。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，還提供用于南極假交替單胞菌種類(lèi)的菌株的發(fā)酵培養(yǎng)的無(wú)機(jī)鹽，并且該無(wú)機(jī)鹽選自提供離子na⁺、k⁺、nh4⁺、ca²⁺、mg²⁺、po4^3-、so4^2-、cl^-、co3^2-或微量元素，例如cu、mn、fe和zn的鹽。

本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及化妝品或皮膚用藥物組合物，其特征在于它包含化妝品或皮膚藥學(xué)有效量的由南極假交替單胞菌種類(lèi)菌株的產(chǎn)生的10,000da以下分子量的提取物和至少一種化妝品和/或皮膚藥學(xué)可接受的賦形劑、輔劑和/或成分。所述組合物可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法制備[“harry’scosmeticology”，第7版，(1982)，wilkinsonj.b.，moorer.j.編輯.longmanhouse，essex，gb]。在一個(gè)實(shí)施方案中，南極假交替單胞菌種類(lèi)的菌株是具有保藏號(hào)cect8690的菌株。

在本發(fā)明組合物中由南極假交替單胞菌種類(lèi)菌株生產(chǎn)的10,000da以下分子量的提取物的化妝品或皮膚藥學(xué)上有效量以及其劑量將取決于許多因素，包括年齡、患者的狀況、病癥的性質(zhì)或嚴(yán)重性、待治療和/或護(hù)理的障礙或疾病、提取物的施用途徑和頻率。

“化妝品或皮膚藥學(xué)有效量”應(yīng)當(dāng)被理解為無(wú)毒性的、但由南極假交替單胞菌種類(lèi)菌株產(chǎn)生的10,000da以下分子量的提取物以提供期望的效果的足夠量。本發(fā)明的提取物以化妝品或皮膚藥物濃度使用以獲得期望的效果；在一個(gè)實(shí)施方案中，該濃度占組合物總重的0.0000000001％(按重量計(jì))-20％(按重量計(jì))；或0.00000001％(按重量計(jì))-10％(按重量計(jì))或0.000001％(按重量計(jì))-5％(按重量計(jì))或0.0001％(按重量計(jì))-5％(按重量計(jì))。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的提取物還可以并入化妝品和/或皮膚藥物遞送系統(tǒng)和/或緩釋系統(tǒng)中。

術(shù)語(yǔ)“遞送系統(tǒng)”涉及與本發(fā)明提取物一起施用的稀釋劑、輔劑、媒介物或添加劑。這些化妝品或藥用載體可以是液體，例如水、油或表面活性劑，包括石油、動(dòng)物、植物或合成來(lái)源的那些，例如、但不限于花生油、大豆油、礦物油、芝麻油、蓖麻油、聚山梨醇酯、山梨坦酯、醚硫酸鹽、硫酸鹽、甜菜堿、糖苷、麥芽糖苷、脂肪醇、壬苯醇醚、泊洛沙姆，聚氧乙烯、聚乙二醇、葡萄糖、甘油、洋地黃皂苷等。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉可以在其中可以施用本發(fā)明的提取物的不同遞送系統(tǒng)中使用的稀釋劑、輔劑或添加劑。

術(shù)語(yǔ)“緩釋”以通常的含義使用，其涉及化合物的遞送系統(tǒng)，該系統(tǒng)在一段時(shí)間期限內(nèi)提供這種化合物的逐步釋放，并且在一個(gè)實(shí)施方案中，盡管不一定但在一段時(shí)間期限內(nèi)為相對(duì)恒定的化合物釋放水平。

遞送或緩釋系統(tǒng)的實(shí)例包括、但不限于脂質(zhì)體、混合脂質(zhì)體、油質(zhì)體、類(lèi)脂質(zhì)體囊泡、短鏈醇類(lèi)的磷脂脂質(zhì)體、毫微粒(milliparticles)、微粒、納米粒和固體脂質(zhì)納米粒、納米結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)載體、海綿、環(huán)糊精、囊泡、膠束、混合的表面活性劑膠束、表面活性劑-磷脂混合膠束、毫微球(millispheres)、微球和納米球、脂質(zhì)球(lipospheres)、微膠囊、微膠囊和納米膠囊以及微乳和納米乳，可以加入以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的活性成分更大的穿透力和/或改善其藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)特性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述遞送或緩釋系統(tǒng)是脂質(zhì)體、表面活性劑-磷脂混合膠束和微乳以及具有內(nèi)部反膠束結(jié)構(gòu)的油包水型微乳和包含微乳的納米膠囊。

緩釋系統(tǒng)可以通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法制備，并且包含它們的組合物可以例如通過(guò)局部或透皮給藥施用，包括粘合性貼劑、非粘性貼劑、封閉貼劑和微電子貼劑；或通過(guò)全身給藥施用，例如、但不限于口服或胃腸外途徑，包括鼻、直腸或皮下植入或注射，或直接植入或注入特定身體部位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述緩釋系統(tǒng)應(yīng)釋放相對(duì)恒定量的本發(fā)明的提取物。緩釋系統(tǒng)中包含的提取物的量將取決于例如施用的組合物、本發(fā)明的提取物的釋放動(dòng)力學(xué)和持續(xù)時(shí)間以及待治療或預(yù)防的病癥、障礙和/或疾病的性質(zhì)。

包含本發(fā)明提取物的組合物也可以吸附在固體有機(jī)聚合物或固體礦物載體上，例如但不限于滑石粉、膨潤(rùn)土、二氧化硅、淀粉或麥芽糖糊精等。

包含由南極假交替單胞菌種類(lèi)菌株產(chǎn)生的10,000da以下分子量的提取物的組合物也可以摻入到與皮膚直接接觸的織物、無(wú)紡布或醫(yī)療裝置中，從而釋放本發(fā)明的提取物，無(wú)論是通過(guò)將結(jié)合系統(tǒng)生物降解到織物、無(wú)紡布或醫(yī)療裝置中，還是歸因于它們與身體之間的摩擦、身體的水分、皮膚的ph或體溫。此外，本發(fā)明的提取物可以并入用于制造與身體直接接觸的衣服的織物和無(wú)紡布中。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含本發(fā)明提取物的織物、無(wú)紡布和醫(yī)療裝置用于治療和/或預(yù)防通過(guò)抑制mc5r受體或通過(guò)刺激膠原蛋白合成而改善或預(yù)防的病癥、障礙和/或疾病。

織物、無(wú)紡布、衣服，醫(yī)療裝置和用于將化合物固定在其上的裝置的實(shí)例，其中有上述的遞送系統(tǒng)和/或持續(xù)釋放系統(tǒng)，可以在文獻(xiàn)中找到，并且是現(xiàn)有技術(shù)中已知的[schaabc.k.(1986)happimay1986；nelsong.，“applicationofmicroencapsulationintextiles”，(2002)，int.j.pharm.，242(1-2)，55-62；“biofunctionaltextilesandtheskin”(2006)curr.probl.dermatol.第33卷，hipleru.c.和elsnerp.編輯.s.kargerag，basel，switzerland；malcolmr.k.等人，”controlledreleaseofamodelantibacterialdrugfromanovelself-lubricatingsiliconebiomaterial“，(2004)，j.cont.release，97(2)，313-320]。優(yōu)選的織物、無(wú)紡布、衣服和醫(yī)療裝置是繃帶、紗布、t恤、襪子、緊身衣、內(nèi)衣、腰帶、手套、尿布、衛(wèi)生巾、敷料、床罩、擦拭物、粘合貼劑、非粘性貼劑、閉塞性貼片、微電子貼片和/或面罩。

包含本發(fā)明提取物的化妝品或皮膚藥物組合物可以用于局部或透皮應(yīng)用的不同類(lèi)型的組合物中，任選地包括配制期望的施用形式必不可少的化妝品和/或皮膚藥學(xué)上可接受的賦形劑。

局部或透皮應(yīng)用的組合物可以被生產(chǎn)為任意的固體、液體或半固體制劑，例如、但不限于霜?jiǎng)?、?fù)合型乳液(例如、但不限于水包油型乳劑和/或水包硅酮乳劑、油包水型乳劑和/或硅酮包水型乳劑、水/油/水或水/硅油/水型乳劑和油/水/油或硅酮/水/硅酮型乳劑)、無(wú)水組合物、水分散體、油、奶、香膏、泡沫、洗劑、凝膠、霜樣凝膠、含水酒精溶液、水甘醇溶液、水凝膠、搽劑、漿液(sera)、肥皂、洗發(fā)水、調(diào)理劑、面膜、發(fā)膠、漿液(serum)、多糖膜、軟膏、摩絲、潤(rùn)發(fā)油、粉末、化妝棒(bar)、化妝筆(pencil)和噴霧劑或氣霧劑(噴霧劑)，包括保留型(leaveon)和沖洗型(rinseoff)制劑。可以使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的技術(shù)將這些局部或透皮應(yīng)用制劑摻入不同類(lèi)型的固體配件中，例如、但不限于繃帶、紗布、t-恤、襪子、緊身衣、內(nèi)衣、腰帶、手套、尿布、衛(wèi)生巾、敷料、床罩、擦拭物、粘附貼劑、非粘附貼劑、封閉貼劑、微電子貼劑和/或面膜中；或可以將它們摻入不同化妝產(chǎn)品中，例如化妝粉底(例如粉底液和粉餅)、卸妝水、卸妝乳、眼下遮瑕膏、眼影、唇膏、潤(rùn)唇膏、保濕唇膏和唇粉等。

本發(fā)明的化妝品或皮膚藥物組合物可以包括增加本發(fā)明胞外多糖的經(jīng)皮吸收的試劑，例如、但不限于二甲亞砜、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、表面活性劑、氮酮(1-正十二烷基氮雜環(huán)庚烷-2-酮)、醇、脲、乙氧基二甘醇、丙酮、丙二醇或聚乙二醇等。此外，本發(fā)明的化妝品或皮膚藥物組合物可以通過(guò)離子透入、超聲促滲、電穿孔、微電子貼劑、機(jī)械壓力、滲透壓梯度、封閉療法(occlusivecure)、顯微注射或通過(guò)壓力無(wú)針注射(例如通過(guò)氧氣壓力的注射)或其任意組合而被應(yīng)用于待治療的局部區(qū)域，以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明提取物的更好的穿透力。應(yīng)用區(qū)域?qū)⒂纱委熀?或預(yù)防的病癥、障礙和/或疾病的性質(zhì)而確定。

在本發(fā)明中所述的化妝品或皮膚藥物組合物中包含的化妝品或皮膚藥學(xué)上可接受的賦形劑、輔劑和/或成分是常用于化妝品或皮膚藥物組合物中的另外的成分，例如、但不限于減少皮脂產(chǎn)生的其它試劑、抗皮脂溢劑、控油劑、抗痤瘡劑、刺激皮膚或表皮大分子的合成和/或能夠抑制或預(yù)防其降解的試劑、膠原蛋白合成刺激劑，彈性蛋白合成刺激劑、核心蛋白聚糖合成-刺激劑、層粘連蛋白合成刺激劑、防衛(wèi)素合成-刺激劑、伴侶蛋白合成-刺激劑、camp合成-刺激劑、調(diào)節(jié)aqp-3的試劑、調(diào)節(jié)水通道蛋白合成的試劑、來(lái)自水通道蛋白家族的蛋白質(zhì)、透明質(zhì)酸合成-刺激劑、糖胺聚糖合成-刺激劑、纖連蛋白合成-刺激劑、sirtuin合成-刺激劑、熱休克蛋白、熱休克蛋白合成-刺激劑、抑制神經(jīng)元胞吐作用的藥劑、其它抗膽堿能藥，抑制肌肉收縮的藥劑，抗老化劑、抗皺劑、止汗劑、抗炎劑和/或止痛劑，抗瘙癢劑、鎮(zhèn)定劑、麻醉劑、乙酰膽堿受體聚集抑制劑、抑制乙酰膽堿酯酶的試劑、皮膚松弛劑、黑色素合成刺激或抑制劑、增白劑或脫色素劑、色素原化劑(propigmentingagent)、自鞣劑、no-合成酶抑制劑、5α-還原酶抑制劑、賴(lài)氨酰和/或脯氨酰羥化酶抑制劑、抗氧化劑、自由基清除劑和/或抗大氣污染的試劑、反應(yīng)性羰基種類(lèi)清除劑、抗糖化劑、抗組胺劑、抗病毒劑、抗寄生蟲(chóng)劑、乳化劑、軟化劑、有機(jī)溶劑、液體推進(jìn)劑、皮膚調(diào)理劑、保濕劑、保持水分的物質(zhì)，α羥基酸、β羥基酸、增濕劑、表皮水解酶、維生素、氨基酸、蛋白質(zhì)、顏料或著色劑、染料、生物聚合物、膠凝聚合物、增稠劑、表面活性劑、軟化劑、乳化劑、粘合劑、防腐劑，能夠減少或治療眼袋的藥劑、剝脫劑、角質(zhì)溶解藥、脫屑劑、抗微生物劑、抗真菌劑、抑真菌劑、殺菌劑、制菌劑、刺激脂質(zhì)和角質(zhì)層成分合成的試劑、神經(jīng)酰胺、脂肪酸、抑制膠原蛋白降解的試劑、抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的試劑、抑制彈性蛋白降解的試劑、抑制絲氨酸蛋白酶例如激肽釋放酶、白細(xì)胞彈性蛋白酶或組織蛋白酶g的試劑，刺激成纖維細(xì)胞增殖的試劑、刺激角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的試劑、刺激脂肪細(xì)胞增殖的試劑、刺激黑素細(xì)胞增殖的試劑、刺激角化細(xì)胞分化的試劑、刺激或延緩脂肪細(xì)胞分化的試劑、抗角化過(guò)度劑、粉刺消除劑(comedolyticagents)、抗牛皮癬藥、dna修復(fù)劑、dna保護(hù)劑、干細(xì)胞保護(hù)劑、穩(wěn)定劑、用于治療和/或護(hù)理敏感皮膚的藥劑、緊膚劑、抗伸長(zhǎng)斑劑、粘合劑、脂肪分解劑或刺激脂肪分解的試劑、脂肪形成劑、調(diào)節(jié)pgc-1α表達(dá)的試劑、調(diào)節(jié)pparγ活性的試劑、增加或降低脂肪細(xì)胞甘油三酯含量的試劑、抗蜂窩組織劑、抑制par-2活性的試劑、刺激愈合的試劑、輔助愈合的試劑、刺激上皮再生的試劑、輔助上皮再生劑、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、作用于毛細(xì)管循環(huán)和/或微循環(huán)的試劑、刺激血管發(fā)生的藥劑、抑制血管通透性的藥劑、靜脈強(qiáng)壯劑(venotonicagents)、作用于細(xì)胞代謝的藥劑、改善真皮表皮交界部的藥劑、誘導(dǎo)毛發(fā)生長(zhǎng)的試劑、毛發(fā)生長(zhǎng)抑制劑或阻滯劑、脫發(fā)阻滯劑、防腐劑、香料、氣味吸收劑和/或體臭掩蔽除臭劑、螯合劑、植物提取物、精油、海產(chǎn)提取物、從生物技術(shù)方法得到的試劑、無(wú)機(jī)鹽、細(xì)胞提取物、防曬劑和對(duì)紫外線a和/或b射線和/或紅外線a射線有活性的有機(jī)或無(wú)機(jī)光保護(hù)劑或其混合物，條件是它們與組合物中的其余成分在物理和化學(xué)上相容，且特別是南極假交替單胞菌種類(lèi)菌株產(chǎn)生的提取物的分子量在10,000da以下。同樣，這些另外的成分的特性不應(yīng)該不可接受地改變本發(fā)明提取物的有益性。這些另外的成分的特性可以是合成的或天然的，例如植物提取物，或來(lái)自生物技術(shù)方法，或來(lái)自合成方法和生物技術(shù)方法的組合。另外的實(shí)例可以在ctfainternationalcosmeticingredientdictionary&handbook，第12版(2008)中找到。在本發(fā)明的上下文中，生物技術(shù)方法應(yīng)當(dāng)被理解為在生物體或其部分中產(chǎn)生活性成分或其部分的任意方法。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的化妝品和/或皮膚用藥物組合物包含：

-0.0000000001％(按重量計(jì))-20％(按重量計(jì))的由南極假交替單胞菌種類(lèi)菌株產(chǎn)生的10,000da以下分子量的提取物；

-0.1％(按重量計(jì))-20％(按重量計(jì))的選自(inci名稱(chēng))甘油、丙二醇、丁二醇、戊二醇、辛酰二醇、乳酸、脲、透明質(zhì)酸鈉的保濕劑；

-0.1％(按重量計(jì))-20％(按重量計(jì))的選自(inci名稱(chēng))二甲硅油、硬脂酸甘油酯、辛酸/癸酸甘油三酯、鯨蠟硬脂醇、卵磷脂、苯甲酸c12-15烷基酯、角鯊?fù)?、羊毛脂、山崳醇、醋酸生育酚、泛醇、牛油?shù)果黃油、棕櫚酸視黃醇酯、視黃醇的軟化劑或皮膚調(diào)理劑；

-0.1％(按重量計(jì))-20％(按重量計(jì))的選自(inci名稱(chēng))選自黃原膠、聚氧乙烯烷基硫酸鈉、硬脂酸、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、十八烷醇、鯨蠟醇、硬脂醇聚醚-2、鯨蠟硬脂醇聚醚-20、椰油酰胺丙基甜菜堿。

在一個(gè)實(shí)施方案中，減少皮脂產(chǎn)生的試劑、抗皮脂溢劑、控油劑(mattifyingagent)、抗痤瘡劑選自例如但不限于：mat-xsclinical[inci：肌氨酸、黃原膠]、mat-xsbright[inci：雄蕊雞腳參(orthosiphonstamineus)葉提取物，麥芽糖糊精，黃原膠]、betapur[inci：reumusboldus葉提取物，黃原膠]或neurobiox[inci：basf銷(xiāo)售的歐蓍草(achilleamillefolium)提取物，黃原膠]；evermat[inci：綠花恩南番茄(enantiachlorantha)樹(shù)皮提取物，齊墩果酸]、sederma/croda銷(xiāo)售的ac.net[inci：丁二醇，peg-60杏仁甘油酯類(lèi)，辛酰二醇，甘油，卡波姆，去甲二氫愈創(chuàng)木酸，齊墩果酸]或sebuless[inci：麥芽糖糊精，歐洲丁香(syringavulgaris)(lilac)提取物]、crodarom銷(xiāo)售的phytessencepurpleginseng[inci：甘油或拳參(polygonumbistorta)根提取物]、由silab銷(xiāo)售的p-refinyl[inci：lensesculenta(lentil)種子提取物]、由codif銷(xiāo)售的epsseamat[inci：浮游生物表多糖-5，苯氧乙醇]或epidermist4.0[inci：浮游生物提取物]、albanmuller銷(xiāo)售的seborami[inci：鉆果大蒜芥(sisymbriumofiicinale)提取物，牛蒡(arctiumlappa)根提取物，檸檬酸，乙醇酸，pca鋅，菌類(lèi)植物膠]、mibelle銷(xiāo)售的poreaway[inci：乳香黃連木(pistacialentiscus)樹(shù)膠/乳香黃連木(乳香脂)樹(shù)膠，卵磷脂]、provital銷(xiāo)售的citrustem[inci：黃原膠，苯甲酸鈉，葡糖酸內(nèi)酯，葡萄糖酸鈣]或affipore[inci：山布枯(barosmabetulina)葉提取物，檸檬酸]、laboratoriesexpanscience銷(xiāo)售的sweetone[inci：糖水解物，麥芽糖糊精]、solabia銷(xiāo)售的seboxyl[inci：黑穗醋栗(ribesnigrum)(黑穗狀醋栗)葉提取物，懸鉤子(rubusidaeus)(覆盆子)葉提取物]或saniskin[inci：虎杖(polygonumcuspidatum)根提取物，肉豆蔻醇]、dsm銷(xiāo)售的alpafloralp-sebum[inci：弗來(lái)歇氏柳葉菜(epilobiumfleischeri)提取物，檸檬酸，山梨酸鉀](méi)或regu-seb[inci：阿甘樹(shù)(arganiaspinosa)仁提取物，鋸葉棕(serenoaserrulata)果實(shí)提取物，芝麻(sesam)種子提取物]、aquabiotechnology銷(xiāo)售的dermaclarine[inci：水解卵蛋白(和)蛋白酶]、lucasmeyer銷(xiāo)售的linumine[inci：亞麻(linumusitatissimum)(亞麻仁)種子提取物]、evonik銷(xiāo)售的granactiveacne[inci：稻(oryzasativa)(稻米)糠提取物，齒葉乳香樹(shù)(boswelliaserrata)提取物，蜂蜜提取物，寡肽-10]、seppic銷(xiāo)售的sepicontrola5[inci：辛?；拾彼?，肌氨酸，錫蘭肉桂(cinnamoniumzeylanicum)樹(shù)皮提取物]、symrise銷(xiāo)售的sympeptide380[inci：肉豆蔻?；?23]或laboratoiresserobiologiques/cognis/basf銷(xiāo)售的sebaryl[inci：煙酰胺，酵母提取物，七葉樹(shù)(aesculushippocastanum)(馬栗樹(shù))種子提取物，甘草酸銨，泛醇，丙二醇，葡萄糖酸鋅，咖啡因，生物素]等。

在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，該抗皺紋和/或抗衰老劑選自(例如但不限于)：葡萄(vitisvinifera)、狗牙薔薇(rosacanina)、姜黃(curcumalonga)、銀杏(ginkgobiloba)、高山火絨草(leontopodiumalpinum)或鹽生杜氏藻(dunaliellasalina)等的提取物；sederma/croda銷(xiāo)售的[inci：棕櫚酰五肽-4]、matrixyl[inci：棕櫚酰四肽-7，棕櫚酰寡肽]、synthe’6^tm[inci：甘油，水，羥丙基環(huán)糊精，棕櫚酰三肽-38]、essenskin^tm[inci：羥基蛋氨酸鈣]、renovage[inci：替普瑞酮]、resistem^tm[inci：心葉球花(globulariacordifolia)發(fā)酵物]、beautifeye[inci：合歡花(albiziajulibrissin)皮提取物，darutoside]、meiritage[inci：膜莢黃芪(astragalusmembranaceus)根提取物，白術(shù)(atractyloidesmacrocephala)根提取物，狹葉柴胡(bupleurumfalcatum)根提取物]、senestem[inci：長(zhǎng)葉車(chē)前(plantagolanceolata)葉提取物]、venuceane[inci：嗜熱棲熱菌(thermusthermophillus)發(fā)酵物]或[inci：棕櫚酰寡肽]；pentapharm/dsm銷(xiāo)售的[inci：五肽-3]、[inci：二肽二氨基丁酰芐基酰胺二乙酸鹽]、[inci：棕櫚酰三肽-5]、phytaluronate[inci：槐豆(長(zhǎng)角豆(ceratoniasiliqua))膠]、regu-scence[inci：龍須菜(asparagusofficinalis)莖提取物，苯甲酸鈉，山梨酸鉀，葡糖酸內(nèi)酯，葡萄糖酸鈣]、syn-tc[inci：十四烷基氨基丁?；i氨?；被∷犭迦宜猁}，棕櫚酰三肽-5，棕櫚酰二肽-5二氨基丁?；u基蘇氨酸]或[inci：大豆油(大豆)蛋白，氧化還原酶]；laboratoiressérobiologiques/cognis/basf銷(xiāo)售的myoxinol^tm[inci：水解羊角豆(hibiscusesculentus)提取物]、syniorage^tm[inci：乙?；碾?11]、dermican^tm[inci：乙酰基四肽-9]、shadownyl[inci：藻類(lèi)提取物，2-甲-2，4-戊二醇，辛酰二醇，黃原膠]或dn-age^tmls[inci：翅莢決明(cassiaalata)葉提取物]；exsymol銷(xiāo)售的algisum[inci：甘露糖醛酸甲基硅烷醇酯]、exage[inci：咪唑基乙基二氨基丙酰胺]或hydroxyprolisilane[inci：甲基硅烷醇羥脯氨酸天冬氨酸酯]；lipotec/lubrizol銷(xiāo)售的[inci：乙?；?8]、snap-7[inci：乙?；唠?4]、snap-8[inci：乙?；穗?3]、[inci：六肽-10]、[inci：五肽-18]、[inci：乙?；?30]、[inci：水解小麥蛋白，水解大豆蛋白，三肽-1]、[inci：二氨基丙?；?33]、decorinyl^tm[inci：三肽-10瓜氨酸]、[inci：三肽-9瓜氨酸]、[inci：假交替單胞菌屬發(fā)酵提取物，水解小麥蛋白，水解大豆蛋白，三肽-10瓜氨酸，三肽-1]、[inci：乙?；碾?5]、peptideac29[inci：乙酰基三肽-30瓜氨酸]、relistase^tm[inci：乙?；滨Ｉ滨６交拾彼醈、thermostressine^tm[inci：乙酰基四肽-22]、lipochroman^tm[inci：二甲基甲氧基苯并二氫吡喃醇]、chromabright^tm[inci：二甲基甲氧基苯并二氫吡喃基棕櫚酸酯]、[inci：假交替單胞菌屬發(fā)酵提取物]、dglyage^tm[inci：鹽酸賴(lài)氨酸，卵磷脂，三肽-9瓜氨酸]、vilastene^tm[inci：鹽酸賴(lài)氨酸，卵磷脂，三肽-10瓜氨酸]、hyadisine^tm[inci：假交替單胞菌屬發(fā)酵提取物]、hyanify^tm[inci：異構(gòu)寡糖(saccharideisomerate)]、diffuporine^tm[inci：乙?；?37]、silusyne^tm[inci：大豆(大豆油)油，倍半油酸山梨坦，異十六烷，玻璃酸鈉，月桂基二銨羥丙基水解大豆蛋白，乙?；?39]、adifyline^tm[inci：乙酰基六肽-38]、uplevity^tm[inci：乙?；碾?2]、juveleven^tm[inci：乙酰基六肽-51酰胺]或telangyn^tm[inci：乙?；碾?40]或inyline^tm[inci：乙酰基六肽-40]；instituteuropeendebiologiecellulaire銷(xiāo)售的[inci：三肽-1，葡聚糖]、vincience/isp/ashland銷(xiāo)售的is[inci：六肽-9]、laminixylis^tm[inci：七肽]、orsirtine^tmgl[inci：oryzasativa(稻米)提取物]、d’orientine^tmis[inci：海棗(phoenixdactylifera)(date)種子提取物]、phytoquintescine^tm[inci：?jiǎn)瘟Ｐ←?單粒小麥(triticummonococcum))提取物]、肽q10[inci：五肽-34三氟乙酸鹽]、telosense[inci：水解酵母蛋白，水解大豆蛋白]或quintescine^tmis[inci：二肽-4]、infinitecactivos銷(xiāo)售的bont-l-peptide[inci：棕櫚?；?19]、seppic銷(xiāo)售的deepaline^tmpvb[inci：棕櫚?；庑←湹鞍譣或dphp[inci：二棕櫚酰基羥基脯氨酸]、gattefossé銷(xiāo)售的expression[inci：acmellaoleracea提取物]、in-tense[inci：金紐扣(spilanthesacmella)花提取物]或agedefense2[inci：胡桃(juglansregia)(胡桃)種子提取物]、biotechmarine銷(xiāo)售的thalassine^tm[inci：藻類(lèi)提取物]、atrium/unipexinnovations銷(xiāo)售的chronoline^tm[inci：辛酰基四肽-3]或thymulen-4[inci：乙?；碾?2]、coletica/engelhard/basf銷(xiāo)售的equistat[inci：蘋(píng)果(pyrusmalus)果實(shí)提取物，大豆油種子提取物]或juvenesce[inci：乙氧基二甘醇和辛酸甘油三酯，視黃醇，熊果酸，植物甲萘醌，伊洛馬司他]、mibellebiochemistry銷(xiāo)售的ameliox[inci：肌肽，生育酚，水飛薊(silybummarianum)果實(shí)提取物]、phytocelltecsymphytum[inci：異麥芽酮糖醇(isomalt)，聚合草(symphytumofficinale)根細(xì)胞培養(yǎng)物，卵磷脂，苯甲酸鈉]、雪生藻類(lèi)粉[inci：chlamydocapsa提取物，麥芽糖糊精，卵磷脂]、dermcom[inci：阿拉伯樹(shù)膠，金番紅花(crocuschyrsanthus)球莖提取物]、anagain[inci：豌豆(pisumsativum)(豌豆)，籽苗提取物]或phytocelltecmalusdomestica[inci：蘋(píng)果(malusdomestica)果實(shí)細(xì)胞培養(yǎng)物]、silab銷(xiāo)售的bioxilift[inci：大茴香籽(pimpinellaanisum)提取物]、vitagenyl[inci：桃樹(shù)(prunuspersica)(桃子)葉提取物]或sms[inci：番荔枝(annonasquamosa)種子提取物]、symrise銷(xiāo)售的symvitalagerepair[inci：生姜(zingiberofficinale)(生姜)根提取物]、provital銷(xiāo)售的citrustem[inci：黃原膠，苯甲酸鈉，葡糖酸內(nèi)酯，葡萄糖酸鈣]、melavoid[inci：黃細(xì)心(boerhaviadiffusa)根提取物]、darkout[inci：非洲馬鈴薯(hypoxisrooperi)根莖提取物，刺云石(caesalpiniaspinosa)樹(shù)膠]或linefill[inci：二甲基異山梨醇酯，芝麻(sesame)種子提取物]、lucasmeyer銷(xiāo)售的adipofill’in[inci：鳥(niǎo)氨酸，磷脂類(lèi)，糖脂類(lèi)]、elix-ir[inci：萹蓄蓼(polygonumaviculare)提取物]或progeline[inci：三氟乙?；?2]、albanmuller銷(xiāo)售的amiperfect[inci：平鋪白珠樹(shù)(gaultheriaprocumbens)(冬綠樹(shù))葉提取物]或repulpamier[inci：猴面包樹(shù)(adansoniadigitata)果肉提取物，玫瑰茄(hibiscussabdariffa)花提取物]、codif銷(xiāo)售的celloxyl[inci：uapacabojeri葉提取物]或resistress[inci：槐米(sophorajaponica)花提取物]、solabia銷(xiāo)售的actiporine8g[inci：叉珊瑚(janiarubens)提取物]或epsseafill[inci：浮游生物提取物]、induchem銷(xiāo)售的novhyalbiotechg[inci：乙酰氨基葡糖磷酸二鈉]或rubixyl[inci：六肽-47]；ca²⁺通道拮抗劑，例如、但不限于阿爾維林、錳或鎂鹽、某些仲胺或叔胺、視黃醇及其衍生物、艾地苯醌、輔酶q10及其衍生物、乳香酸及其衍生物、ghk及其衍生物和/或鹽、肌肽及其衍生物、dna修復(fù)酶例如、但不限于光解酶、t4核酸內(nèi)切酶v或氯化物通道激動(dòng)劑等和/或其混合物。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗炎劑和/或止痛劑例如選自但不限于：羥基積雪草苷提取物、紫錐花屬(echinacea)提取物、莧菜紅種子油、檀香油、桃樹(shù)葉提取物、真蘆薈(aloevera)、山金車(chē)(arnicamontana)、艾(artemisiavulgaris)、大葉馬蹄香(asarummaximum)、金盞花(calendulaofficinalis)、辣椒屬(capsicum)、石胡荽(centipedacunninghamii)、母菊(chamomillarecutita)、文殊蘭(crinumasiaticum)、北美金縷梅(hamamelisvirginiana)、鉤果草(harpagophytumprocumbens)、金絲桃(hypericumperforatum)、圣母百合(liliumcandidum)、錦葵(malvasylvestris)、茶樹(shù)(melaleucaalternifolia)、甘牛至(origanummajorana)、牛至(origanumvulgare)、月桂櫻(prunuslaurocerasus)、rosmarinusofficialis、白柳(salixalba)、水飛薊、菊蒿(tanacetumparthenium)、麝香草(thymusvulgaris)、鉤藤(uncariaguianensis)或大蕁麻(vaccinummyrtillus)的提取物、atriuminnovations/unipexgroup銷(xiāo)售的ω-3和ω-6脂肪酸、neutrazen^tm[inci：水，丁二醇，葡聚糖，棕櫚?；?8]、lipotec/lubrizol銷(xiāo)售的delisens^tm[proposedinci：乙?；?46]、instituteuropéendebiologiecellulaire/unipexgroup銷(xiāo)售的[inci：葡聚糖，乙?；唠?1]、laboratoiresserobiologiques/cognis/basf銷(xiāo)售的skinasensyl^tm[inci：乙?；碾?15]或anasensyl^tm[inci：甘露糖醇，甘草酸銨，咖啡因，七葉樹(shù)(hippocastanum)(馬栗樹(shù))提取物]、sederma/croda銷(xiāo)售的calmosensine^tm[inci：乙?；?1]、輔酶q10或烷基甘油基醚類(lèi)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述緊膚劑和/或再增濃和/或重組劑選自、例如、但不限于：malpighiapunicitolia、朝鮮薊(cynarascolymus)、草棉(gossypiumherbaceum)、翠綠蘆薈(aloebarbadensis)、稷(panicummiliaceum)、黑桑(morusnigra)、芝麻(sesamumindicum)、大豆油(glycinesoja)、軟粒小麥(triticumvulgare)的提取物、provital銷(xiāo)售的refirminghsc[inci：triticumvulgare，silybummarianum，大豆油，equisetumarvense，alchemillavulgaris，medicagosativa，raphanussativus]，lipoout[inci：浮游生物提取物]或refirming[inci：金花菊，落得打(asiaticcentella)，墨角藻屬(fucus)，胡蘆巴]、atriumbiotechnologies/unipexinnovations銷(xiāo)售的[inci：山梨醇，藻類(lèi)提取物]、pentapharm/dsm銷(xiāo)售的[inci：天然營(yíng)養(yǎng)因子]、包含異黃酮類(lèi)的植物提取物、sederma/croda銷(xiāo)售的biopeptideel^tm[inci：棕櫚?；央腯、biopeptidecl^tm[inci：棕櫚?；央腯、[inci：水(水溶液)，丙二醇，卵磷脂，咖啡因，棕櫚?；鈮A]、[inci：棕櫚?；咫?3]、3000[inci：棕櫚?；碾?3，棕櫚?；央腯或bio-bustyl^tm[inci：聚甲基丙烯酸甘油酯，拉恩菌屬(rahnella)大豆蛋白發(fā)酵物，水(水溶液)，丙二醇，甘油，peg-8，棕櫚?；央腯、laboratoiresserobiologiques/cognis/basf銷(xiāo)售的hc[inci：甘油，水(水溶液)，糖胺聚糖類(lèi)，糖原]、[inci：甘露糖醇，環(huán)糊精，糖原，熊果(aratostaphylosuvaursi)葉提取物]、ls[inci：水解酪蛋白，水解酵母蛋白，賴(lài)氨酸hcl]或ls9120[inci：欖仁樹(shù)(terminaliacatappa)葉提取物，sambucusnegra花提取物，pvp，單寧酸]、silab銷(xiāo)售的[inci：水解小麥蛋白]、[inci：水解大豆粉]或ridulisse[水解大豆蛋白]、lipotec/lubrizol銷(xiāo)售的[inci：六肽-10]、decorinyl^tm[inci：三肽-10瓜氨酸]、[inci：假交替單胞菌屬發(fā)酵提取物，水解小麥蛋白，水解大豆蛋白，三肽-10瓜氨酸，三肽-1]、silusyne^tm[inci：大豆(大豆油)油，倍半油酸山梨坦，異十六烷，玻璃酸鈉，月桂基二銨羥丙基水解大豆蛋白，乙?；?39]或adifyline^tm[inci：乙?；?38]、[inci：卵磷脂，熊果酸，端膠原，黃原膠，硫酸軟骨素鈉]、coletica/engelhard/basf銷(xiāo)售的eperuline[inci：麥芽糖糊精，鐮形木莢蘇木(eperuafalcata)樹(shù)皮提取物]或[inci：水解麥芽提取物]、pentapharm/dsm銷(xiāo)售的[inci：棕櫚酰基三肽-5]、atriumbiotechnologies/unipexinnovations銷(xiāo)售的[inci：水(水溶液)，糖胺聚糖類(lèi)，菌類(lèi)植物膠]、sphingokinenp[inci：evonik銷(xiāo)售的辛?；参锴拾贝?caprooylphytosphingosine)]、lucasmeyer銷(xiāo)售的body3復(fù)合物[inci：皂粘土，牛油樹(shù)果(butyrospermumparkii)(shea)堅(jiān)果提取物，牛油果(perseagratissima)(鱷梨樹(shù))果實(shí)提取物]、lonza銷(xiāo)售的prosynergendf[inci：乳桿菌屬(lactobacillus)/ulkeniaamoeboidea發(fā)酵提取物過(guò)濾物]或instituteuropeendebiologiecellulaire/unipexinnovations銷(xiāo)售的ip2000[inci：葡聚糖，三氟乙酰基三肽-2]等。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，刺激皮膚或表皮大分子的合成的試劑選自，例如、但不限于：膠原合成-刺激劑、彈性蛋白合成-刺激劑、核心蛋白聚糖合成-刺激劑、層粘連蛋白合成-刺激劑、伴侶蛋白合成-刺激劑、sirtuin的合成刺激劑、sirtuin激活劑、水通道蛋白合成-調(diào)節(jié)劑、纖連蛋白合成-刺激劑、抑制膠原蛋白降解的藥劑、抑制彈性蛋白降解的藥劑、抑制絲氨酸蛋白酶例如激肽釋放酶、白細(xì)胞彈性蛋白酶或組織蛋白酶g的藥劑、刺激成纖維細(xì)胞增殖的藥劑、刺激脂肪細(xì)胞增殖的藥劑，加速或延緩脂肪細(xì)胞分化的藥劑；以及dna修復(fù)劑和/或dna保護(hù)劑，例如、但不限于積雪草(centellaasiatica)、啤酒糖酵母(saccharomycescerivisiae)、馬鈴薯(solanumtuberosum)、迷迭香(rosmarinusofficinalis)、厚葉越橘(vacciniumangustifolium)的提取物、藻類(lèi)巨藻(macrocystispyrifera)、粉團(tuán)扇藻(padinapavonica)的提取物、大豆、麥芽、亞麻、紅色三葉草、kakkon、白色羽扇豆植物的提取物、榛子提取物、玉米提取物、酵母提取物、山毛櫸枝條提取物、莢豆種子提取物、植物激素提取物例如赤霉素、植物生長(zhǎng)素或細(xì)胞因子等；或鹽水浮游生物的提取物、牛奶與保加利亞乳桿菌(lactobacillusbulgaricus)的發(fā)酵產(chǎn)物、積雪草皂苷類(lèi)及其衍生物、維生素c及其衍生物、肉桂酸及其衍生物、sederma/croda銷(xiāo)售的[inci：棕櫚?；咫?3]、3000[inci：棕櫚?；碾?3、棕櫚?；央腯或biopeptidecl^tm[inci：聚甲基丙烯酸甘油酯，丙二醇，棕櫚?；央腯、lipotec/lubrizol銷(xiāo)售的[inci：假交替單胞菌屬發(fā)酵提取物]、[inci：三肽-10瓜氨酸]、[inci：六肽-10]、lipeptide[inci：水解蔬菜蛋白]、[inci：水解小麥蛋白，水解大豆蛋白，三肽-1]、relistase^tm[inci：乙?；滨；滨；交拾彼醈、thermostressine^tm[inci：乙?；碾?22]、peptideac29[inci：乙酰基三肽-30瓜氨酸]、diffuporine^tm[inci：乙酰基六肽-37]、silusyne^tm[inci：大豆(大豆油)油，倍半油酸山梨坦、異十六烷、玻璃酸鈉，月桂基二銨羥丙基水解大豆蛋白，乙酰基六肽-39]或adifyline^tm[inci：乙?；?38]、albanmuller銷(xiāo)售的pf[inci：酵母β-葡聚糖]、comercializadoporsolabia銷(xiāo)售的phytovityl[inci：水溶液，玉米須提取物]、coletica/engelhard/basf銷(xiāo)售的[inci：水解麥芽提取物]、vincience/isp/ashland銷(xiāo)售的phytocohesinepsp^tm[inci：β谷固醇硫酸鈉]、無(wú)機(jī)物例如鈣等、維a酸及其衍生物、異黃酮、類(lèi)胡蘿卜素、特別是番茄紅素、假二肽類(lèi)、維a酸及其衍生物例如視黃醇或棕櫚酸視黃酯等或類(lèi)肝素等。

應(yīng)用

在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及由南極假交替單胞菌種類(lèi)菌株生產(chǎn)的10,000da以下分子量的提取物在制備用于治療和/或護(hù)理皮膚、粘膜和/或毛發(fā)的化妝品或皮膚藥物組合物中的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述皮膚、粘膜和/或頭發(fā)的治療和/或護(hù)理是指治療和/或預(yù)防炎癥、癌癥、黑頭粉刺、粟粒疹、痤瘡、皮脂溢、脂溢性皮炎、化膿性汗腺炎、皮膚的光保護(hù)、治療皮膚和/或毛發(fā)中的皮脂量的減少、治療和/或預(yù)防皮膚衰老、治療和/或預(yù)防皮膚皺紋、治療皮膚緊致、預(yù)防皮膚緊致度和/或頭發(fā)衛(wèi)生保健缺失。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述炎癥選自、例如但不限于銀屑病、敏感性皮膚、皮炎、特應(yīng)性皮炎、接觸性皮炎、尿布皮炎、脂溢性皮炎、濕疹、酒渣鼻、痤瘡、過(guò)度增生性皮膚病、燒傷、曬傷、甲殼炎、手術(shù)后皮膚炎癥、用強(qiáng)脈沖光療法(ipl)治療后，用單色脈沖光療法(激光)治療后，用化學(xué)剝離劑治療或過(guò)度暴露于侵蝕性外用藥物后、陰道粘膜炎癥、口腔粘膜炎、牙齦炎、牙周炎、鼻炎、過(guò)敏性鼻炎等。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及南極假交替單胞菌種類(lèi)的菌株產(chǎn)生的分子量在10,000da以下的提取物在制備用于治療癌癥、厭食癥或惡病質(zhì)的藥物組合物中的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥的治療是治療皮膚癌、處理腫瘤生長(zhǎng)抑制或米爾-多里綜合征。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及南極假交替單胞菌種類(lèi)的菌株產(chǎn)生的分子量在10,000da以下的提取物在制備用于抑制mc5r受體的化妝品或皮膚用藥物組合物中的用途。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及南極假交替單胞菌種類(lèi)的菌株產(chǎn)生的分子量在10,000da以下的提取物在制備用于刺激膠原蛋白合成的化妝品或皮膚用藥物組合物中的用途。

本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及治療和/或護(hù)理皮膚、粘膜和/或毛發(fā)的方法，包含施用美容和/或皮膚用藥學(xué)有效量的南極假交替單胞菌種類(lèi)的菌株產(chǎn)生的分子量在10,000da以下的提取物。在一個(gè)實(shí)施方案中，皮膚、粘膜和/或頭發(fā)的治療和/或護(hù)理指的是治療和/或預(yù)防炎癥、癌癥、黑頭粉刺、粟粒疹、痤瘡、皮脂溢、脂溢性皮炎、化膿性汗腺炎、皮膚的光保護(hù)、治療皮膚和/或毛發(fā)中皮脂量的減少、治療和/或預(yù)防皮膚老化、治療和/或預(yù)防皮膚皺紋、治療皮膚緊致度、防止皮膚緊致度和/或頭發(fā)的衛(wèi)生保健缺失。在一個(gè)實(shí)施方案中，炎癥選自例如、但不限于：牛皮癬、敏感性皮膚、皮炎、特應(yīng)性皮炎、接觸性皮炎、尿布皮炎、脂溢性皮炎、濕疹、酒渣鼻、痤瘡、過(guò)度增生性皮膚病、燒傷、曬傷、甲溝炎、手術(shù)后、用強(qiáng)脈沖光療法(ipl)治療后、用單色脈沖光療法(激光)治療后、用化學(xué)剝離劑處理后或過(guò)度暴露于侵蝕性外用藥物后的皮膚炎癥、陰道粘膜炎癥、口腔粘膜炎癥、牙齦炎，牙周炎、鼻炎、過(guò)敏性鼻炎等。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種治療癌癥、厭食癥或惡病質(zhì)的方法，包含施用美容和/或皮膚用藥學(xué)有效量的由南極假交替單胞菌種類(lèi)的菌株產(chǎn)生的分子量在10,000da以下的提取物。在一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥的治療是治療皮膚癌、處理腫瘤生長(zhǎng)抑制或治療米爾-多里綜合征。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及抑制mc5r受體的方法，包含施用美容和/或皮膚用藥學(xué)有效量的由南極假交替單胞菌種類(lèi)的菌株產(chǎn)生的分子量在10,000da以下的提取物。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及刺激膠原蛋白合成的方法，包含施用美容和/或皮膚用藥學(xué)有效量的由南極假交替單胞菌種類(lèi)的菌株產(chǎn)生的分子量在10,000da以下的提取物。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，由南極假交替單胞菌種類(lèi)的菌株產(chǎn)生的提取物的分子量高于50da且低于10,000da，在100da至8,000da之間，在150da至6,000da之間或在300da和5,000da之間。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，南極假交替單胞菌種類(lèi)的菌株是具有保藏號(hào)cect8690的菌株。

在另一個(gè)方面，由南極假交替單胞菌種類(lèi)的菌株產(chǎn)生的分子量在10,000da以下的提取物可以通過(guò)任意方式施用，所述方式與哺乳動(dòng)物、優(yōu)選人的身體中的作用部位接觸，并且在一個(gè)實(shí)施方案中為包含所述提取物的組合物的形式。通過(guò)南極假交替單胞菌種類(lèi)的菌株產(chǎn)生的10,000da以下的分子量的提取物的施用在局部或經(jīng)皮上進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，局部或透皮應(yīng)用通過(guò)離子電滲療法、超聲促滲、電穿孔、機(jī)械壓力、滲透壓梯度、閉塞固化、顯微注射、通過(guò)經(jīng)壓力的無(wú)針頭注射、微電子貼片，面罩或其任何組合進(jìn)行。

應(yīng)用或施用的頻率可以根據(jù)每個(gè)受試者的需要的不同而廣泛變化，這啟示從每個(gè)月一次到每天10次、從每周一次到每天4次、從每周三次到每天三次或每天一次的應(yīng)用或施用范圍。

生物材料的保藏

將南極假交替單胞菌種類(lèi)的菌株根據(jù)布達(dá)佩斯條約(budapesttreaty)保藏在coleccióndecultivostipo(cect)(edificio3cue，parccientíficuniversitatdevalencia，catedráticoagustínescardino9，46980paterna，valencia，spain)。保藏在2014年7月29日完成，且保藏號(hào)為cect8690。

實(shí)施例

將上文涉及的對(duì)比文件各自通過(guò)引用的方式并入本文作為參考，包括要求保護(hù)優(yōu)先權(quán)的任何先前申請(qǐng)，無(wú)論上述是否具體列出。舉出任何文件并非承認(rèn)這類(lèi)對(duì)比文件符合現(xiàn)有技術(shù)或構(gòu)成任何管轄范圍內(nèi)的技術(shù)人員的一般知識(shí)。除了實(shí)施例中，或者另外明確指出的是，本說(shuō)明書(shū)中規(guī)定材料用量、反應(yīng)條件、分子量、碳原子數(shù)等的所有數(shù)值定量應(yīng)當(dāng)被理解為近似的，即，經(jīng)歷所示值的±5％、±3％、±1％、±0.1％或±0.01％的變異性。應(yīng)當(dāng)理解，本文舉出的上限和下限用量、范圍和比率限度可以獨(dú)立地組合。類(lèi)似地，本文描述的技術(shù)的每個(gè)要素的范圍和用量可以與任意其它要素的范圍或用量一起使用。

實(shí)施例1：具有保藏號(hào)cect8690的南極假交替單胞菌種類(lèi)的菌株分泌的提取物的制備和分離。

a)具有保藏號(hào)cect8690的南極假交替單胞菌種類(lèi)的菌株的培養(yǎng)方法。

將具有保藏號(hào)cect8690的南極假交替單胞菌種類(lèi)的菌株在12℃和ph＝7.0下在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，其培養(yǎng)基包含20g/l葡萄糖、7g/l氯化銨和包含1g/lnacl、1g/l七水合硫酸鎂、5g/l磷酸二鈉、2g/l磷酸鉀、0.05g/l氯化鈣和0.018g/l七水合硫酸亞鐵的鹽溶液。接種物使用所需量的指數(shù)狀態(tài)的預(yù)培養(yǎng)物形成，其具有0.2au(550nm)的初始光密度。培養(yǎng)持續(xù)48小時(shí)，氧氣濃度控制在30％空氣飽和度，并以約250rpm的值攪拌。

b)在10kda以下的提取物的分離

通過(guò)以6000g離心在1h期間將細(xì)菌與培養(yǎng)肉湯分離。用具有最終孔徑為0.22μm的膜過(guò)濾完成細(xì)菌的消除。隨后，用具有10kda的篩的聚醚砜膜過(guò)濾未純化的提取物，且感興趣的產(chǎn)物透過(guò)膜。

實(shí)施例2：在具有保藏號(hào)cect8690的南極假交替單胞菌種類(lèi)中的10kda以下的提取物中的蛋白質(zhì)濃度的定量。

在實(shí)施例3至14中使用的根據(jù)實(shí)施例1純化的10kda以下的提取物的濃度值是用雙金雞寧酸法以及所使用試劑盒(bca蛋白測(cè)定試劑盒，23227)供應(yīng)商提供的說(shuō)明測(cè)定的總蛋白濃度。

根據(jù)實(shí)施例1得到的在10kda以下提取物中測(cè)量的總蛋白質(zhì)濃度為361.55μg/ml。

實(shí)施例3：色譜分析se-hplc-uv

制備根據(jù)實(shí)施例1得到的產(chǎn)物為250μg/ml的溶液，并通過(guò)hplc-uv分析。將100μl注射在高效液相色譜(hplc)lc20ashimadzu中。使用的色譜柱是tskgelg2000swxl，5m，7.8mmx30mm(tosohbioscience)，且具有0.1m磷酸鹽緩沖液，ph＝6.70+0.1m硫酸鈉的水作為洗脫液。

在這些條件下，產(chǎn)物在10分鐘至15分鐘之間顯示出峰值，平均峰值在10.75分鐘。使用不同標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算分子量：來(lái)自牛血清的白蛋白(66000da)、來(lái)自牛胰腺i型的核糖核酸酶a(13700da)和水楊酸(138da)。分子量的對(duì)數(shù)與保留時(shí)間有關(guān)，以獲得線性相關(guān)。使用這種相關(guān)性，產(chǎn)物顯示7714da和178da之間的分子量。同樣根據(jù)這種相關(guān)性，主峰最大值(10.75分鐘)的停留時(shí)間相當(dāng)于4381da的分子量。

實(shí)施例4：使用報(bào)道基因測(cè)定法對(duì)人黑素皮質(zhì)素受體5(mc5r)啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定未分化上皮乳腺細(xì)胞系(mcf7)的抑制的評(píng)價(jià)。

在人mc5r啟動(dòng)子的一個(gè)區(qū)域上用包含螢火蟲(chóng)螢光素酶基因的質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染未分化的上皮乳腺細(xì)胞系(mcf7)。用根據(jù)實(shí)施例1得到的提取物處理該細(xì)胞系的選擇的克隆16mcf7-mc-16，以測(cè)定人mc5r啟動(dòng)子的抑制。

在用聚-l-賴(lài)氨酸溶液處理的96-白板中的補(bǔ)充有10％fbs(胎牛血清)、1％青霉素-鏈霉素和1μg/ml嘌呤霉素的dulbecco改進(jìn)的eagle培養(yǎng)基(dmem)(高葡萄糖)中接種每孔3萬(wàn)mcf7-mc-16細(xì)胞用于熒光素酶活性測(cè)定。平行地，如上所述，將每孔3萬(wàn)個(gè)mcf7-mc-16細(xì)胞接種在用聚-l-賴(lài)氨酸溶液處理的96-透明孔板中，以通過(guò)結(jié)晶紫染色進(jìn)行總細(xì)胞數(shù)定量。在開(kāi)始處理之前24h，接種細(xì)胞，并在co2溫育箱中在37℃和5％co2下溫育。

在處理當(dāng)天，用包含氯化鈣和氯化鎂的dulbecco磷酸鹽緩沖液(dpbs)將mcf7-mc-16細(xì)胞洗滌2次，并在37℃在co2溫育箱中與無(wú)酚紅的dmem高葡萄糖一起在37℃下溫育6h。然后，用0.25μg/ml或2.5μg/ml濃度的根據(jù)實(shí)施例1得到的具有保藏號(hào)為cect8690的南極假交替單胞菌種類(lèi)的提取物處理細(xì)胞。作為基礎(chǔ)活化的對(duì)照，將細(xì)胞與單獨(dú)的培養(yǎng)基一起溫育。將細(xì)胞在不合酚紅的dmem高葡萄糖中溫育并補(bǔ)充1％cs-fbs(活性炭剝離的胎牛血清)16-24h。

在溫育期后，在96-白孔板中測(cè)定通過(guò)與螢火蟲(chóng)熒光素酶反應(yīng)產(chǎn)生的每秒相對(duì)光單位(rlu/秒)，并在96-孔板中測(cè)定總細(xì)胞數(shù)/孔。

熒光素酶活性測(cè)定

根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，將螢火蟲(chóng)熒光素酶底物(steady-gloluciferaseassaysystem，promega)加入到96-白色孔板中。簡(jiǎn)而言之，首先，裂解細(xì)胞并加入螢火蟲(chóng)螢光素酶底物。溫育10-15min后，讀取來(lái)自螢火蟲(chóng)螢光素酶活性的熒光。使用多板式(multiplate)發(fā)光計(jì)(lumistar-bmg)對(duì)螢火蟲(chóng)螢光素酶與其底物之間的反應(yīng)產(chǎn)生的每秒相對(duì)光單位(rlu/秒)進(jìn)行定量。

通過(guò)結(jié)晶紫染色測(cè)定法對(duì)總細(xì)胞數(shù)的測(cè)定

將包含細(xì)胞的96-澄清孔板用dpbs洗滌，并在室溫下在結(jié)晶紫溶液(0.05％結(jié)晶紫，4％福爾馬林)中溫育20min。細(xì)胞的dna被結(jié)晶紫染料溶液染色。此后，除去晶體紫溶液，并用milliq水洗滌孔。由細(xì)胞吸收的結(jié)晶紫染料的量與每個(gè)孔中的細(xì)胞數(shù)成正比。最終，當(dāng)將細(xì)胞在室溫下干燥1-2小時(shí)時(shí)，加入0.1mhcl溶液且在微孔板吸光度讀數(shù)器(microplateabsorbancereader)(multiskan-thermoelectrocorporation)中在630nm處讀取吸光度。用測(cè)試劑量的總細(xì)胞數(shù)校準(zhǔn)計(jì)算每秒螢火蟲(chóng)發(fā)光(rlu/秒)結(jié)果，并計(jì)算人mc5r啟動(dòng)子的誘導(dǎo)相對(duì)于基礎(chǔ)對(duì)照的減少。

表1

結(jié)果表明，在10kda以下的南極假交替單胞菌的提取物減少人mc5r啟動(dòng)子的誘導(dǎo)。

實(shí)施例5：使用脂質(zhì)液滴熒光測(cè)定法的皮脂脂質(zhì)在初級(jí)人皮脂腺細(xì)胞中的積累的抑制。

通過(guò)在根據(jù)實(shí)施例1得到的具有保藏號(hào)cect8690的10kda以下的提取物處理之后測(cè)定在條件分化培養(yǎng)基中尼羅紅在初級(jí)人皮脂腺細(xì)胞中的熒光信號(hào)來(lái)測(cè)定脂質(zhì)積累的抑制。

將人皮脂腺細(xì)胞以5,000細(xì)胞/孔接種在胞外基質(zhì)包被的在96-孔板上的皮脂腺細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(含血清的50％完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基和50％無(wú)血清培養(yǎng)基)中，并在3天期間在co2溫育箱(37℃和5％co2)中溫育。

溫育后，用條件分化培養(yǎng)基(皮脂腺細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的10nm[nle⁴，d-phe⁷]-α-促黑激素，ndp-α-msh)處理人皮脂腺細(xì)胞，作為脂質(zhì)積累的基礎(chǔ)對(duì)照或者在條件分化培養(yǎng)基中用0.25μg/ml和2.5μg/ml根據(jù)實(shí)施例1得到的具有具有保藏號(hào)cect8690的南極假交替單胞菌種類(lèi)的10kda以下的提取物處理。每次處理一式三份且平行地進(jìn)行用于脂質(zhì)積聚測(cè)定和細(xì)胞計(jì)數(shù)。在co2溫育箱(37℃和5％co2)中4天期間將細(xì)胞在不同的處理中溫育。

在基礎(chǔ)對(duì)照中，用條件分化培養(yǎng)基處理分化的皮脂腺細(xì)胞，其為最大分化條件和由此在該皮脂腺細(xì)胞模型中存在最大脂質(zhì)蓄積。

通過(guò)adipored^tm試劑測(cè)定法對(duì)皮脂脂質(zhì)積累的定量

按照制造商的說(shuō)明書(shū)，用含有鈣和鎂的磷酸緩沖鹽水(pbs)洗滌每種條件的人皮脂腺細(xì)胞，并加入稀釋的adipored試劑。完成試劑添加后，將人皮脂腺細(xì)胞在室溫下溫育15min。然后，使用分別具有485nm和530nm的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的fluostargalaxy讀出器測(cè)定中性脂質(zhì)的熒光。

通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定法對(duì)細(xì)胞密度(細(xì)胞數(shù)/ml)的定量。

通過(guò)用胰蛋白酶處理從96-孔板上分離人皮脂腺細(xì)胞。從一式三份樣品中采集體積后，將分離的細(xì)胞離心。棄去約80％的上清液以便用tc10^tm自動(dòng)化細(xì)胞計(jì)數(shù)器(biorad)濃縮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定。

然后，用細(xì)胞密度(細(xì)胞/ml)對(duì)每種條件的熒光信號(hào)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以獲得脂質(zhì)蓄積的標(biāo)準(zhǔn)化值。最終，計(jì)算與基礎(chǔ)對(duì)照相比標(biāo)準(zhǔn)化脂質(zhì)蓄積的百分比。

得到的結(jié)果表明，根據(jù)實(shí)施例1得到的具有保藏號(hào)cect8690的南極假交替單胞菌種類(lèi)的10kda以下的提取物降低了人皮脂腺細(xì)胞培養(yǎng)物中皮脂脂質(zhì)的百分比。

表3

實(shí)施例6：使用成年人皮膚成纖維母細(xì)胞對(duì)針對(duì)模擬日光的細(xì)胞毒性劑量的光保護(hù)的體外研究。

當(dāng)用細(xì)胞毒性劑量的模擬日光處理后24小時(shí)測(cè)量時(shí)，將光保護(hù)效能測(cè)定為活性染料中性紅的吸收增加。

將成人人皮膚成纖維細(xì)胞維持在培養(yǎng)物中24小時(shí)，以在96-孔板中產(chǎn)生單層。然后，將細(xì)胞與pbs(磷酸緩沖鹽水)一起預(yù)溫育用于經(jīng)照射的對(duì)照，或與2.5μg/ml根據(jù)實(shí)施例1得到的具有保藏號(hào)為cect8690的南極假交替單胞菌種類(lèi)的10kda以下的提取物在黑暗中在37℃、5％co2加濕空氣預(yù)溫育1h。

然后，將溫育的細(xì)胞在室溫下暴露于～30-60j/cm²的照射劑量150/180/210分鐘。將另一個(gè)板同時(shí)保存在黑暗中，并且用作非照射對(duì)照。將包含溫育的細(xì)胞的經(jīng)過(guò)照射的板的培養(yǎng)基用新鮮培養(yǎng)基替換，并將板保持溫育24h。通過(guò)吸收中性紅來(lái)確定細(xì)胞活力，即在與中性紅溶液(sigma)溫育2小時(shí)后裂解細(xì)胞，并在分光光度計(jì)中在540nm測(cè)量細(xì)胞裂解物的光密度。中性紅是弱陽(yáng)離子染料，其通過(guò)非擴(kuò)散方式易于透入細(xì)胞膜。中性紅細(xì)胞在胞內(nèi)積累于未受損細(xì)胞的溶酶體中，并且在損傷或不活力細(xì)胞中幾乎不吸收。為了計(jì)算細(xì)胞存活率百分比，將未處理的細(xì)胞用作參比。將測(cè)試產(chǎn)物的光保護(hù)潛能計(jì)算為處理的細(xì)胞相對(duì)于未經(jīng)處理的照射細(xì)胞(用pbs處理)的細(xì)胞存活率的增加。結(jié)果如表4所示。

表4

實(shí)施例7：通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)對(duì)人真皮成纖維細(xì)胞上的i型膠原蛋白合成的體外研究。

用胰蛋白酶處理成年人皮膚成纖維細(xì)胞，并且將5x10⁴個(gè)細(xì)胞/孔接種在48-孔板中。在37℃在5％co2加濕空氣中溫育24h后，加入包含根據(jù)實(shí)施例1得到的12.5μg/ml、6.25μg/ml、2.5μg/ml和1.25μg/ml的具有保藏號(hào)cect8690的南極假交替單胞菌種類(lèi)的10kda以下提取物的新鮮培養(yǎng)基。每個(gè)濃度一式三份進(jìn)行測(cè)試。將未經(jīng)處理的人皮膚成纖維細(xì)胞作為對(duì)照接種在48-孔板中的6孔中。將人皮膚成纖維細(xì)胞在37℃在5％co2加濕空氣中再溫育48h。然后，采集培養(yǎng)基以便通過(guò)elisa分析。

從1mg/ml的儲(chǔ)備溶液開(kāi)始，用來(lái)自小牛皮膚的i型膠原蛋白(sigma)制備定量i型膠原蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將這些稀釋液與先前采集的培養(yǎng)基一起轉(zhuǎn)移到96-孔板中。將標(biāo)準(zhǔn)曲線稀釋液和從細(xì)胞培養(yǎng)物處理中采集的上清液轉(zhuǎn)移至96-孔板。樣品中和標(biāo)準(zhǔn)曲線稀釋液中的膠原蛋白在4℃下在加濕的氣氛中將96-孔板的壁包被過(guò)夜。然后，用包含0.05％tween-20(sigma)的磷酸緩沖鹽水(pbs)將孔板洗滌3次，并用3％牛血清白蛋白(bsa)(sigma)的溶液封閉1h。封閉后，將孔板與抗-膠原蛋白i型抗體(sigma)一起溫育2h。該溫育后，加入二次抗體(山羊抗-小鼠igg-hrp，molecularprobes)。然后，在攪拌下將孔板與磷酸酶底物(opd，sigma)一起溫育30分鐘。通過(guò)加入3mh2so4終止反應(yīng)。在微量滴定板讀數(shù)器中讀取490nm處的吸光度，并且使用i型膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸確定膠原蛋白濃度。膠原蛋白合成增加與未處理細(xì)胞相比的關(guān)系的結(jié)果如表5所示。

表5

實(shí)施例8：通過(guò)tbars測(cè)定法的脂質(zhì)過(guò)氧化的體外抑制的研究。

使用脂質(zhì)體作為細(xì)胞膜模型并且由于在tbars測(cè)定(硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì))期間mda(丙二醛)與tba(硫代巴比妥酸)之間形成加合物)來(lái)監(jiān)測(cè)熒光測(cè)定脂質(zhì)過(guò)氧化。將脂質(zhì)體用根據(jù)實(shí)施例1得到的10kda以下的具有保藏號(hào)cect8690的南極假交替單胞菌種類(lèi)的提取物處理，并與基礎(chǔ)對(duì)照進(jìn)行比較，以研究脂質(zhì)體的脂質(zhì)過(guò)氧化作用的降低。

脂質(zhì)體的制備

將溶解于氯仿：甲醇(1∶1)中的包含30mm大豆磷脂酰膽堿(emulmetik930)的溶液在無(wú)氧n2的氣流氣氛中干燥，得到薄膜。在高真空下除去最后痕量的溶劑3h。通過(guò)加入tris-nacl緩沖液(140mmnacl，20mmtrisph＝7.4)形成多層脂質(zhì)體(mlv)，然后攪拌5min以確保完全懸浮。然后將囊泡懸浮液超聲處理以將磷脂囊泡分解成小單層脂質(zhì)體(suv)。

脂質(zhì)體過(guò)氧化

將1ml的suv懸浮液加入到試管中。然后，在不同的管中加入40μl不同濃度的10kda以下的南極假交替單胞菌種類(lèi)的提取物。加入40μltris-nacl緩沖液作為過(guò)氧化反應(yīng)的基礎(chǔ)對(duì)照。將試管在37℃下溫育30min，并且一式兩份測(cè)試每種濃度。

通過(guò)加入40μl新鮮制備的aaph(2，2′-偶氮雙(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽(270mm))引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化，然后將試管在37℃下溫育1h，并以100rpm攪拌。通過(guò)加入200μlbht(丁羥甲苯)(在乙醇中4％w/v)并在-20℃冷凍樣品來(lái)終止過(guò)氧化反應(yīng)。

tbars測(cè)定

制備mda的校準(zhǔn)曲線：從5支試管中的通過(guò)酸水解tep(1，1，3，3-四乙氧基丙烷)(在h2so41％中10mm)中得到的mda溶液分別制備0、0.8、1.6、2.4和3.2nmol的mda。最后，向每支試管中加入500μl蒸餾水和100μlbht(在乙醇中4％w/v)。

為了與tba反應(yīng)，將樣品解凍，用移液管取出600μl，并加入到250μl的sds(十二烷基硫酸鈉)(3％w/v)中?；旌虾螅尤?00μl新鮮制備的tba(在熱水中1％w/v)并混合。然后，加入500μl的7mm的hcl，攪拌并在95℃的水浴中溫育15min。最后，將樣品置于室溫下，并且加入2ml的1-丁醇。將樣品劇烈攪拌并以1500rpm離心5分鐘。

將每個(gè)樣品的150μl每個(gè)孔的上部相置于不透明底部黑色96-孔板中，一式兩份。在多板式熒光讀出器(fluostargalaxy，bmglabtechgmbh，offenburg，germany)中，在500nm的激發(fā)波長(zhǎng)和530nm的發(fā)射波長(zhǎng)下測(cè)定熒光。根據(jù)熒光測(cè)量測(cè)量值確定脂質(zhì)過(guò)氧化，其中100％是基礎(chǔ)對(duì)照條件的值。

表6

實(shí)施例9：根據(jù)實(shí)施例1得到的10kda以下的具有保藏號(hào)為cect8690的南極假交替單胞菌種類(lèi)的提取物對(duì)初級(jí)人皮脂腺細(xì)胞中mc5r蛋白質(zhì)水平的影響

將初級(jí)人皮脂腺細(xì)胞接種在用胞外基質(zhì)(em)包被的細(xì)胞外基質(zhì)(em)的t25cm²燒瓶上，生長(zhǎng)培養(yǎng)基條件為150,000個(gè)細(xì)胞，而在降低的血清培養(yǎng)基中的其余條件下為250,000個(gè)細(xì)胞。將細(xì)胞在co2溫育箱(37℃和5％co2)中在3天期間在皮脂腺細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中溫育。

溫育后，測(cè)定不同的條件：生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的皮脂腺細(xì)胞作為分化的陰性對(duì)照，在降低的血清培養(yǎng)基中的皮脂腺細(xì)胞作為分化的陽(yáng)性對(duì)照，以及具有根據(jù)實(shí)施例1得到的0.25和2.5μg/ml的具有保藏號(hào)cect8690的南極假交替單胞菌種類(lèi)的10kda以下的提取物的皮脂腺細(xì)胞。

處理后，制備細(xì)胞用于通過(guò)間接流式細(xì)胞術(shù)的免疫細(xì)胞化學(xué)。

用于間接流式細(xì)胞術(shù)的樣品制備。免疫細(xì)胞化學(xué)

將細(xì)胞在1ml冰冷的磷酸緩沖鹽水(pbs)、10％新生小牛血清(ncs)、1％疊氮化鈉中再懸浮至約1-5x10⁶個(gè)細(xì)胞/ml。將包含用于每個(gè)條件的細(xì)胞的懸浮液分入兩支試管，1支試管用初級(jí)抗體(抗-mc5r受體抗體[epr8386]，abcam)和二次抗體(對(duì)家兔igg-h&l(apc)的山羊多克隆二次抗體)染色，abcam)，而另1支試管僅用二次抗體(二次抗體對(duì)照)染色。

將包含細(xì)胞的懸浮液在室溫下在黑暗中用0.5％甲醛(sigma)在pbs中固定。然后，通過(guò)用冰冷的pbs離心洗滌懸浮液。

最后，將細(xì)胞在包含3％bsa和1％疊氮化鈉的500μl冰冷的pbs中重新懸浮至約0.5-2.5x10⁶個(gè)細(xì)胞/ml。計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞懸浮液在4℃在黑暗中儲(chǔ)存過(guò)夜。

用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞外mc5r蛋白水平

將測(cè)定進(jìn)行至少3次。使用于每次處理的細(xì)胞懸浮液通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器(facscantoii，bdbiosciences)進(jìn)行，并且采集100,000-200,000個(gè)事件，事件數(shù)取決于每次具體測(cè)定。使用winmdi2.9軟件分析數(shù)據(jù)。

表示每個(gè)樣品的形態(tài)學(xué)的光散射點(diǎn)圖(ssc對(duì)fsc)，并且拉出繪圖區(qū)域或門(mén)(r1)以棄去細(xì)胞碎片。

表示每個(gè)樣品門(mén)(r1)的apc(熒光染料)與fsc(細(xì)胞大小)關(guān)系的熒光點(diǎn)圖。將每個(gè)條件與其二次抗體對(duì)照進(jìn)行比較，繪制門(mén)(r2)以定義陽(yáng)性apc細(xì)胞(mc5r)。對(duì)于每個(gè)樣品，區(qū)域r1+r2中包含的事件被量化。每個(gè)條件的陽(yáng)性mc5r事件中被減去二次抗體對(duì)照。

相對(duì)于減少的血清培養(yǎng)基條件計(jì)算mc5r蛋白質(zhì)水平。如表7所示，根據(jù)實(shí)施例1得到的具有保藏號(hào)為cect8690的南極假交替單胞菌種類(lèi)的10kda以下的提取物降低血清減少培養(yǎng)基中初級(jí)人皮脂腺細(xì)胞中的mc5r蛋白質(zhì)水平。

表7

實(shí)施例10：在10kda以下的具有保藏號(hào)cect8690的南極假交替單胞菌種類(lèi)的提取物對(duì)初級(jí)人皮脂腺細(xì)胞的分化過(guò)程的影響。

將人皮脂腺細(xì)胞接種在胞外基質(zhì)包被的t25cm²燒瓶上，在皮脂腺細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(50％具有血清的完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基：50％無(wú)血清培養(yǎng)基)中以250,000個(gè)細(xì)胞/t25接種，并在3天期間在co2溫育箱(37℃和5％co2)中溫育。

溫育后，將人皮脂腺細(xì)胞用基礎(chǔ)生長(zhǎng)培養(yǎng)基作為分化的陰性對(duì)照、或條件分化培養(yǎng)基(10nm[nle⁴，d-phe⁷]-α-促黑激素，ndp-α-msh，在皮脂腺細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中)作為分化的陽(yáng)性對(duì)照、或條件分化培養(yǎng)基中根據(jù)實(shí)施例1得到的2.5μg/ml的具有保藏號(hào)cect8690的南極假交替單胞菌種類(lèi)的10kda以下的提取物進(jìn)行處理。在co2溫育箱(37℃和5％co2)中4天期間將細(xì)胞在不同的處理中溫育。處理4天后，準(zhǔn)備的細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行處理。

流式細(xì)胞術(shù)的樣品制備

通過(guò)用冰冷的pbs在100g下離心5min將人皮脂腺細(xì)胞洗滌3次，并且在室溫下用0.5％甲醛溶液(sigma)固定10min，并用冰冷的pbs再洗滌1次。將細(xì)胞沉淀最終重新懸浮在包含3％牛血清白蛋白(bsa)和1％疊氮化鈉的冰冷pbs中，并在黑暗中于4℃保存過(guò)夜。

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞形態(tài)學(xué)：大小(前向散射；fsc)和粒度(邊散射；ssc)

將測(cè)定進(jìn)行至少3次。使包含用于每次處理的細(xì)胞的懸浮液通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器(facscantoii，bdbiosciences)運(yùn)行，并采集100,000-200,000個(gè)事件，事件數(shù)取決于每次具體測(cè)定。在流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)中，fsc(前向散射)與細(xì)胞表面積或細(xì)胞大小成正比，而ssc(邊散射)與細(xì)胞粒度或內(nèi)部復(fù)雜度成正比。fsc與ssc的關(guān)系允許識(shí)別不同細(xì)胞類(lèi)型的特定形態(tài)。使用winmdi2.9軟件分析每次處理的皮脂腺細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，且它們代表粒度與粒徑的關(guān)系(ssc與fsc的關(guān)系)。繪制門(mén)以棄去細(xì)胞碎片，且門(mén)控細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)用ssc與fsc關(guān)系的密度圖表示。通過(guò)設(shè)置對(duì)陰性和陽(yáng)性分化對(duì)照的方向軸來(lái)評(píng)估形態(tài)學(xué)變化。

流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)的點(diǎn)圖表示用于確定圖表8中事件的分布，量化每個(gè)象限中的事件數(shù)。

表8

表9顯示了進(jìn)行的3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)。在該測(cè)定中，相當(dāng)于每次處理的細(xì)胞懸浮液通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器運(yùn)行并采集100,000個(gè)事件。表9顯示了在不同培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的皮脂腺細(xì)胞的大小與粒度關(guān)系的圖形形態(tài)參數(shù)的每個(gè)象限中的事件數(shù)。分化的皮脂腺細(xì)胞與未分化的皮脂腺細(xì)胞比較顯示形態(tài)特征的變化，其特征在于高粒度水平(q2增加)和小細(xì)胞大小(增加q3和減少q4)。用根據(jù)實(shí)施例1得到的提取物處理的皮脂腺細(xì)胞顯示與未分化的皮脂腺細(xì)胞相似的粒度減小(q2減少)和細(xì)胞大小增加(減少q3和增加q4)的形態(tài)學(xué)變化。

表9

表9中的結(jié)果顯示，根據(jù)實(shí)施例1得到的具有保藏號(hào)cect8690的南極假交替單胞菌種類(lèi)的10kda以下的提取物在分化條件培養(yǎng)基的存在下維持一些未分化的皮脂腺細(xì)胞。

圖1顯示了在不同培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的皮脂腺細(xì)胞的大小(fsc-a)和顆粒度(ssc-a)的形態(tài)學(xué)參數(shù)的密度圖。未分化的皮脂腺細(xì)胞顯示兩個(gè)具有相似粒度水平、但兩種不同大小的主要細(xì)胞群。分化的皮脂腺細(xì)胞表現(xiàn)出獨(dú)特的細(xì)胞群，其特征在于高粒度水平和小細(xì)胞大小。用2.5μg/ml根據(jù)實(shí)施例1得到的提取物處理的皮脂腺細(xì)胞顯示與未分化的皮脂腺細(xì)胞相似的形態(tài)粒度減小和細(xì)胞大小增加的形態(tài)變化。這些圖像屬于與表9中所示相同的實(shí)驗(yàn)。

實(shí)施例11.人表皮角化細(xì)胞的基因表達(dá)譜的研究。

通過(guò)用根據(jù)實(shí)施例1得到的具有保藏號(hào)cect8690的10kda以下的南極假交替單胞菌種類(lèi)的2.5μg/ml提取物處理，在人皮角化細(xì)胞的基因圖譜內(nèi)研究了基因集合顯著增加/減少的次數(shù)，并且與未處理細(xì)胞中的基礎(chǔ)水平(陰性對(duì)照)比較。

將成人表皮角化細(xì)胞heka(cascadebiologics)接種在用包被基質(zhì)(15x10⁴個(gè)細(xì)胞/燒瓶t25)預(yù)處理的t25燒瓶上。將成人表皮角化細(xì)胞在具有5％co2的氣氛中于37℃在完整的epilife培養(yǎng)基(補(bǔ)充edgs的epilife培養(yǎng)基，cascadebiologics)中溫育6天。溫育后，在完全epilife培養(yǎng)基中在具有5％co2的氣氛中，用具有根據(jù)實(shí)施例1得到的具有保藏號(hào)cect8690的南極假交替單胞菌種類(lèi)的10kda以下的2.5μg/ml的提取物將細(xì)胞在37℃下處理24小時(shí)，將完全epilife培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。對(duì)于每個(gè)條件，溫育和處理在至少4次生物測(cè)定(燒瓶)中進(jìn)行。

處理后，裂解細(xì)胞，并通過(guò)rneasyplusmini試劑盒(qiagen)從每個(gè)燒瓶和每種條件提取和純化rna。將裂解的細(xì)胞勻漿并將rnases滅活。通過(guò)使用gdnaeliminator旋轉(zhuǎn)柱從樣品中除去基因組dna。然后，將樣品通過(guò)特殊的rna結(jié)合柱，并經(jīng)過(guò)幾次微量離心洗滌以消除污染物和雜質(zhì)，用50μl超純水洗脫純化的rna。

通過(guò)分光光度法(nanodrop)和生物分析儀(agilentbioanalyzer)評(píng)估得到的rna的純度、完整性和濃度。

隨后，進(jìn)行標(biāo)記并將樣品與人基因表達(dá)微陣列(asureprintg3，agilent)雜交。

將用處理得到的標(biāo)準(zhǔn)化值與用陰性對(duì)照得到的標(biāo)準(zhǔn)化值進(jìn)行比較，以獲得具有差異表達(dá)的基因。然后，通過(guò)bioconductor軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行參數(shù)分析。然后通過(guò)gsea(基因集合分析富集(genesetanalysisenrichment))評(píng)估所得到的值，以便將在基因本體論和生物學(xué)途徑方面具有差異表達(dá)的基因組合在一起。

得到的結(jié)果如下表10至13中所示，其中將基因組合在一起。

表10.由根據(jù)實(shí)施例1得到的提取物減量調(diào)節(jié)的牽涉炎癥的基因。

表11.由根據(jù)實(shí)施例1得到的提取物增量調(diào)節(jié)的氧化性應(yīng)激和/或解毒作用中牽涉的基因。

表12.由根據(jù)實(shí)施例1得到的提取物增量調(diào)節(jié)的抗炎反應(yīng)中牽涉的基因。

表13.根據(jù)實(shí)施例1得到的提取物增量調(diào)節(jié)的牽涉水合的基因。

實(shí)施例12：人皮脂腺細(xì)胞的基因表達(dá)譜的研究。

通過(guò)用根據(jù)實(shí)施例1得到的具有保藏號(hào)cect8690的10kda以下的南極假交替單胞菌種類(lèi)的2.5μg/ml提取物處理，在人皮脂腺細(xì)胞的基因圖譜內(nèi)研究了基因集合顯著增加/減少的次數(shù)，并且與未處理細(xì)胞中的基礎(chǔ)水平(陰性對(duì)照)比較。

將人皮脂腺細(xì)胞(celprogen)接種在用胞外基質(zhì)(celprogen)包被的t25燒瓶上(25x10⁴個(gè)細(xì)胞/燒瓶)，并在皮脂腺細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(50％人皮脂腺細(xì)胞完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基和50％人皮脂腺細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，celprogen)在37℃在5％co2氣氛中溫育3天。3天后，從培養(yǎng)物中減少血清，并用降低的血清培養(yǎng)基(5％人皮脂腺細(xì)胞完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基和95％人皮脂腺細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，celprogen)替代皮脂腺細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并將皮脂腺細(xì)胞溫育3天。溫育后，在減少血清培養(yǎng)基中將細(xì)胞在37℃下在具有5％co2的氣氛中用根據(jù)實(shí)施例1得到的具有保藏號(hào)cect8690的南極假交替單胞菌種類(lèi)的10kda以下的2.5μg/ml的提取物中處理24小時(shí)，將減少血清培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。對(duì)于每個(gè)條件，溫育和處理在至少4次生物測(cè)定(燒瓶)中進(jìn)行。

處理之后，將細(xì)胞裂解，并通過(guò)rneasyplusmini試劑盒(qiagen)從每個(gè)燒瓶和每個(gè)條件下提取和純化rna。將裂解的細(xì)胞勻漿并將rnases滅活。通過(guò)使用gdnaeliminator旋轉(zhuǎn)柱從樣品中除去基因組dna。然后，將樣品通過(guò)特殊的rna結(jié)合柱，并經(jīng)過(guò)幾次微量離心洗滌以消除污染物和雜質(zhì)后，用50μl超純水洗脫純化的rna。

通過(guò)分光光度法(nanodrop)和生物分析儀(agilentbioanalyzer)評(píng)估所獲rna的純度、完整性和濃度。

隨后進(jìn)行標(biāo)記并將樣品與人基因表達(dá)微陣列(asureprintg3，agilent)雜交。

將用處理得到的標(biāo)準(zhǔn)化值與用陰性對(duì)照得到的標(biāo)準(zhǔn)化值進(jìn)行比較，以獲得具有差異表達(dá)的基因。然后，通過(guò)bioconductor軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行參數(shù)分析。然后通過(guò)gsea(基因集合分析富集)評(píng)估所得到的值，以便將在基因本體論和生物學(xué)途徑方面具有差異表達(dá)的基因組合在一起。

得到的結(jié)果如下表14至17中所示，其中將基因組合在一起。

表14.根據(jù)實(shí)施例1得到的提取物減少調(diào)節(jié)的牽涉炎癥的基因。

表15.根據(jù)實(shí)施例1得到的提取物減少調(diào)節(jié)的牽涉皮脂腺細(xì)胞增殖和分化的基因。

表16.根據(jù)實(shí)施例1得到的提取物增量調(diào)節(jié)的牽涉氧化性應(yīng)激和dna-修復(fù)的基因。

表17.根據(jù)實(shí)施例1得到的提取物增量調(diào)節(jié)的牽涉類(lèi)視色素代謝的基因。類(lèi)視色素代謝與皮膚中皮脂產(chǎn)生相關(guān)。

實(shí)施例13：具有保藏號(hào)cect8690的南極假交替單胞菌種類(lèi)的10kda以下的提取物的化妝品組合物的制備。

在適合的容器中，在渦輪機(jī)攪拌下將a相的成分溶解在水中，直到達(dá)到完全分散。隨后在渦輪機(jī)攪拌下逐步加入b相novemerec2[inci：水(水溶液)，丙烯酸鈉，甲基丙烯酸丙烯酸山萮醇聚酮-25酯，交聯(lián)聚合物，氫化聚癸烯，月桂基葡萄糖苷]。

然后，加入根據(jù)實(shí)施例1得到的濃度為62.5μg/ml的南極假交替單胞菌種類(lèi)10kda以下的提取物的水溶液和水楊酸鈉(c相)。

成分清單在表18中。

表18

實(shí)施例14：具有保藏號(hào)cect8690的南極假交替單胞菌種類(lèi)的10kda以下的提取物的化妝品組合物的制備。

在適合的容器中，在渦輪機(jī)攪拌下將a相的成分溶解在水中，直到達(dá)到完全分散。將根據(jù)實(shí)施例1得到的10kda以下的南極假交替單胞菌種類(lèi)的提取物作為250μg/ml濃度的提取物的水溶液加入到a相中。

隨后，在渦輪機(jī)攪拌下，b相的組分逐步加入，直至完全分散。將ph調(diào)節(jié)為6.3-6.8。

成分清單如表19中所示。

表19

實(shí)施例15：具有保藏號(hào)cect8690的南極假交替單胞菌種類(lèi)的10kda以下的提取物對(duì)亞洲皮膚類(lèi)型的志愿者的油性皮膚的效能的體內(nèi)研究。

本研究在20至35歲的20名亞洲女性志愿者中進(jìn)行。志愿者將實(shí)施例14的組合物每天兩次(早晚)應(yīng)用于面部和前額28天。本研究測(cè)定在使用實(shí)施例14的組合物前的初始時(shí)間和第28天時(shí)分泌皮脂、斑點(diǎn)的活動(dòng)性濾泡的數(shù)量和表面。受試者比較了它們?cè)诘?8天時(shí)得到的結(jié)果與在初期得到的結(jié)果作為其自身的參比。用皮脂敏感性粘性膜測(cè)定效能。結(jié)果如表20中所示。

表20

結(jié)果顯示，在20名志愿者中，分泌皮脂的活動(dòng)性卵泡平均減少9.5％，而分泌皮脂的活動(dòng)性卵泡表面平均減少27.2％。

實(shí)施例16：具有保藏號(hào)cect8690的南極假交替單胞菌種類(lèi)的10kda以下的提取物的bb霜?jiǎng)┙M合物的制備。

在適合的容器中，在渦輪機(jī)攪拌下將a相[inci：水，甲基葡萄糖醚-20，尿囊素，氫氧化鈉，edta二鈉，山梨酸鉀](méi)的成分溶解，并且將該混合物在50℃下加熱直到總體分散完成。

隨后，使b1相[inci：ultrez20丙烯酸酯類(lèi)/丙烯酸c10-30烷基酯交聯(lián)聚合物]保持濕潤(rùn)，且然后分散，并且加入b2相[inci：黃原膠]，使其保持濕潤(rùn)且然后也分散。

接下來(lái)，加入相c的成分[inci：ci77891&水&甘油&黃原膠&檸檬酸鈉，ci77492&水&甘油&黃原膠&檸檬酸鈉，ci77491&水&甘油&黃原膠&檸檬酸鈉，ci77499&水&甘油&黃原膠&檸檬酸鈉]，并通過(guò)攪拌使其顏色本身均勻化。當(dāng)該混合物均勻時(shí)，將溫度升至75℃。

將d相成分[inci：異硬脂酸異丙酯，辛酸癸酸甘油三酯，甲基葡萄糖倍半硬脂酸酯，山萮醇，二甲硅油，peg-20甲基葡萄糖倍半硬脂酸酯，苯氧乙醇，醋酸維生素e)稱(chēng)重入另一個(gè)燒杯中，并在80℃加熱該混合物。

當(dāng)達(dá)到相應(yīng)的溫度時(shí)，通過(guò)在攪拌下將d相混合物緩慢地加入到a、b1、b2和c相的混合物中制備乳劑(首先以600rpm且然后以10000rpm用turax1分鐘)。

當(dāng)混合物冷卻至65℃時(shí)，加入e相[inci：云母，氮化硼，云母]。然后，將根據(jù)實(shí)施例1得到的62.5μg/ml濃度的南極假交替單胞菌種類(lèi)的10kda以下的提取物的水溶液和水楊酸鈉(f相)[inci：水，假交替單胞菌屬發(fā)酵提取物，水楊酸鈉]，并且當(dāng)該批量處于30℃時(shí)，將g相[inci：香料]加入到前述混合物中。

成分清單如表21中所示。

表21

實(shí)施例17：bb霜安慰劑組合物的制備。

根據(jù)實(shí)施例16的介紹制備該組合物，但不使用南極假交替單胞菌提取物，該組合物具有如下表22中包括的成分。

表22

實(shí)施例18：具有保藏號(hào)cect8690的南極假交替單胞菌種類(lèi)的低于10kda的提取物在bb霜的持久的控油效果中的功效的體內(nèi)研究。

本研究在18至42歲之間的22名白人女性志愿者中進(jìn)行。志愿者將實(shí)施例16的組合物應(yīng)用于半面臉，而將安慰劑(實(shí)施例17)應(yīng)用于另一半面臉。在單次產(chǎn)品應(yīng)用之后，在使用該組合物之前的最初時(shí)間，在產(chǎn)品施用之后即刻以及在產(chǎn)品應(yīng)用后2小時(shí)和8小時(shí)測(cè)定皮膚光澤度。使用gl200測(cè)定效能。結(jié)果如表23中所示。

表23

在產(chǎn)品應(yīng)用后即刻得到的測(cè)量值顯示使用活性成分霜?jiǎng)?實(shí)施例16的組合物，其中包含具有保藏號(hào)cect8690的南極假交替單胞菌種類(lèi)的10kda以下的提取物)導(dǎo)致的皮膚光澤度的下降高于安慰劑霜?jiǎng)?小時(shí)后發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的結(jié)果。然而。在產(chǎn)品施用8小時(shí)后，活性成分霜?jiǎng)┠軌驕p少皮膚光澤度，而使用安慰劑霜?jiǎng)┢つw光澤度增加。

實(shí)施例19：用根據(jù)實(shí)施例1得到的具有保藏號(hào)cect8690的南極假交替單胞菌種類(lèi)菌株分泌的細(xì)菌胞外產(chǎn)物進(jìn)行的體內(nèi)研究；用于白種人皮膚類(lèi)型志愿者中油性皮膚處理的效能試驗(yàn)。

本研究在28天期間進(jìn)行，其中具有初始時(shí)間、14天后和28天后的測(cè)量值。包括20名志愿者，為年齡在20至35歲之間的白種人女性。受試者應(yīng)用實(shí)施例13的凝膠霜，每天兩次(早晚)。將受試者使用他們自身作為參比，并將在不同時(shí)間得到的結(jié)果與初始時(shí)得到的結(jié)果進(jìn)行比較。

產(chǎn)品的功效通過(guò)以下方法評(píng)價(jià)：

-用測(cè)定以確定鼻子兩側(cè)上皮膚的皮脂率；結(jié)果如表24所示。

-用epiflash數(shù)碼照片，用于鼻子兩側(cè)上的毛孔圖像分析；結(jié)果如表25所示。

-具有visia-cr的數(shù)碼照片，用于圖像分析前額上的皮膚光澤；結(jié)果如表26所示。

＊根據(jù)平均值計(jì)算

表24.在14和28天時(shí)，有關(guān)皮脂總量相對(duì)于初始時(shí)間的百分比變化性。

結(jié)果顯示在產(chǎn)品應(yīng)用14天后皮脂比例減少了8.4％。在28天后，皮脂比例減少至多為9.4％。

＊根據(jù)平均值計(jì)算

表25.在14和28天時(shí)，斑點(diǎn)的數(shù)量和總面積相對(duì)于初始時(shí)間的百分比變化性。

結(jié)果顯示，在產(chǎn)品應(yīng)用14天后毛孔數(shù)減少20.5％，而在應(yīng)用28天后減少18.0％。關(guān)于毛孔總面積，發(fā)現(xiàn)在產(chǎn)品應(yīng)用14和28天后分別下降了18.8％和18.7％。

＊根據(jù)平均值計(jì)算

表26.在14和28天時(shí)，前額上皮膚光澤相對(duì)于初始時(shí)間的百分比變化性。

結(jié)果顯示在治療14天后皮膚光澤強(qiáng)度降低了17％。產(chǎn)品應(yīng)用28天后，皮膚光澤度降低至多為27.3％。