本發(fā)明涉及內(nèi)含抑制素的納米粒子，尤其涉及用于增強(qiáng)細(xì)胞功能的內(nèi)含抑制素納米粒子制劑。另外，本發(fā)明還涉及含有內(nèi)含抑制素納米粒子的干細(xì)胞及其制備方法。

背景技術(shù)：

抑制素(statin)作為抑制肝臟中膽固醇生物合成的限速酶即hmg-coa還原酶的化合物為人所知。通過(guò)抑制素可使血液中的膽固醇值下降，因此被用于高膽固醇血癥的治療藥物。另外，臨床試驗(yàn)還表明，除了高膽固醇血癥以外，抑制素因其抗炎作用而對(duì)心絞痛、心肌梗死之類的缺血性心臟病、以及動(dòng)脈硬化等疾病也有效。

迄今為止，為了提高抑制素對(duì)上述疾病的治療效果、降低副作用進(jìn)行了各種研究，例如專利文獻(xiàn)1中公開(kāi)了通過(guò)將抑制素包覆在納米粒子內(nèi)，并對(duì)患者局部給予該內(nèi)含抑制素納米粒子，能夠用比以往更少量的抑制素促進(jìn)血管生成。

另外，近年來(lái)還進(jìn)行了使用具有多潛能性、可分化成心肌細(xì)胞的干細(xì)胞，治療缺血性心臟病的研究。非專利文獻(xiàn)1中公開(kāi)了通過(guò)對(duì)心肌梗死模型小鼠的心肌直接給予脂肪組織源性干細(xì)胞，可實(shí)現(xiàn)心臟功能的改善和梗死尺寸的減小。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1：日本特開(kāi)2012-21002號(hào)公報(bào)

非專利文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)1：masaakiiietal.，laboratoryinvestigation(2011)91，539-552

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明要解決的問(wèn)題

為了治療心肌梗死等缺血性心臟病，在給予例如上述專利文獻(xiàn)1所公開(kāi)的內(nèi)含抑制素的納米粒子的情況下，如上所述，通過(guò)對(duì)患者局部給予內(nèi)含抑制素的納米粒子，利用比以往更少量的抑制素可實(shí)現(xiàn)有效性，但需要對(duì)患部進(jìn)行局部給藥，給藥不便，還期待有效性的進(jìn)一步提高。另外，在不采用局部給藥而采用靜胍給藥等的情況下，需要更多容量，還有可能產(chǎn)生副作用。

另一方面，非專利文獻(xiàn)1公開(kāi)了在使用干細(xì)胞治療心肌梗死等缺血性心臟病的情況下，也需要干細(xì)胞對(duì)患部的局部給藥，例如在對(duì)小鼠的心肌進(jìn)行給藥時(shí)，為了獲得治療效果，所需的細(xì)胞量為5×10⁵細(xì)胞/小鼠(cells/mouse)。作為干細(xì)胞，例如可使用間充質(zhì)來(lái)源的成體干細(xì)胞(somaticstemcell)，此類干細(xì)胞可從骨髓或脂肪組織中獲得，但一次所得干細(xì)胞量有限，因此將干細(xì)胞用于上述治療等時(shí)，最好使用較少的細(xì)胞數(shù)。由此，為了利用更少數(shù)量的干細(xì)胞來(lái)獲得優(yōu)異的治療效果，需要使該干細(xì)胞的各種功能提高。

本發(fā)明是鑒于上述問(wèn)題而完成的，其目的在于可提高該干細(xì)胞的功能，以提高用作細(xì)胞制劑的干細(xì)胞對(duì)疾病的治療效果、抑制副作用。

用于解決問(wèn)題的方案

為了達(dá)成上述目的，本發(fā)明人進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)使干細(xì)胞中含有將抑制素包覆在納米粒子內(nèi)而成的內(nèi)含抑制素納米粒子，可增強(qiáng)該干細(xì)胞的功能，將抑制素高效地傳遞至所需患部，在缺血性心臟病等各種疾病的治療中顯示出良好的效果，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明涉及的內(nèi)含抑制素納米粒子制劑特征在于，包含將抑制素包覆在含有生物吸收性聚合物(bioabsorbablepolymer)的納米粒子內(nèi)而成的內(nèi)含抑制素納米粒子，該納米粒子的個(gè)數(shù)平均粒徑小于1000nm，用于增強(qiáng)干細(xì)胞的功能。

本發(fā)明涉及的內(nèi)含抑制素納米粒子制劑通過(guò)對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行處理，可增強(qiáng)該處理后的干細(xì)胞的功能，通過(guò)對(duì)生物體內(nèi)給予該干細(xì)胞，顯示出各種有效性。具體而言，若用本發(fā)明涉及的內(nèi)含抑制素納米粒子制劑對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行處理，則處理后的干細(xì)胞通過(guò)吞噬作用而攝取內(nèi)含抑制素納米粒子，攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的干細(xì)胞，其遷移能力(migratorycapacity)、增殖能力和血管生成因子產(chǎn)生能力增強(qiáng)。因此，通過(guò)對(duì)患有例如缺血性心臟病的患者體內(nèi)給予經(jīng)本發(fā)明涉及的內(nèi)含抑制素納米粒子處理的可分化成心血管系統(tǒng)細(xì)胞的干細(xì)胞，干細(xì)胞集聚于缺血部位而增殖并釋放出血管生成因子，從而促進(jìn)缺血部位的血管生成。進(jìn)而，該集聚并增殖的干細(xì)胞分化成心肌從而促進(jìn)心肌的再生。另外，通過(guò)本發(fā)明涉及的攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的干細(xì)胞的給藥，促使存在于心外膜附近的細(xì)胞在心肌梗死部位分裂增殖，從而促進(jìn)心肌的再生。其結(jié)果，顯示出優(yōu)異的缺血性心臟病的治療效果。另外，該干細(xì)胞可以緩慢釋放出被其攝取的抑制素，由此，還可獲得抑制素本身的血管生成效果等抑制素所特有的各種效果，因此對(duì)以缺血性心臟病為代表的各種疾病的治療有益。進(jìn)而，通過(guò)從集聚于患部的干細(xì)胞釋放出的抑制素，可使體內(nèi)的干細(xì)胞、骨髓源性血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(epc)的集聚亢進(jìn)，其結(jié)果，在例如缺血性心臟病的情況下，可進(jìn)一步促進(jìn)缺血部分的心肌再生。另外，抑制素等化合物在單純靜胍給藥時(shí)，會(huì)隨著血流而被運(yùn)送至患部，但在心肌梗死等缺血性心臟病中，血流受阻，難以正常到達(dá)患部，而本發(fā)明所述的抑制素被遷移性增強(qiáng)的干細(xì)胞攝取并運(yùn)送，因此即便血流受阻也能到達(dá)患部。即，可形成良好的藥物傳遞系統(tǒng)，從而能夠減少應(yīng)給藥的細(xì)胞數(shù)。通過(guò)上述作用，可對(duì)心肌梗死等缺血性心臟病的治療發(fā)揮極好的效果。應(yīng)予說(shuō)明，為了使干細(xì)胞通過(guò)上述吞噬作用高效地?cái)z取內(nèi)含抑制素納米粒子，上述納米粒子的個(gè)數(shù)平均粒徑小于1000nm。

本發(fā)明涉及的內(nèi)含抑制素納米粒子制劑中，作為生物吸收性聚合物，可以使用聚乳酸聚合物(polylacticacid：pla)或聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolicacid)：plga)。

通過(guò)pla和plga在體內(nèi)水解，可將所包覆的抑制素釋放，另外，pla通過(guò)水解而分解成乳酸，plga通過(guò)水解而分解成乳酸和乙二醇，最終分別成為水和二氧化碳，對(duì)人和動(dòng)物無(wú)害，因此特別優(yōu)選將pla或plga用作納米粒子材料。

本發(fā)明涉及的內(nèi)含抑制素納米粒子制劑優(yōu)選為用于增強(qiáng)作為上述干細(xì)胞的脂肪源性干細(xì)胞的制劑。

脂肪源性干細(xì)胞可如下獲得：采集脂肪組織，對(duì)所采集的組織進(jìn)行膠原酶處理后，利用離心比重法(centrifugalspecificgravitymethod)僅采集單核細(xì)胞，將所采集的單核細(xì)胞用培養(yǎng)板培養(yǎng)4日左右，選取并分離出粘附的細(xì)胞作為脂肪源性干細(xì)胞。另外，還可以使用celution系統(tǒng)(cytoritherapeutics，inc.制)等簡(jiǎn)便而大量地從脂肪組織中提取、分離培養(yǎng)脂肪源性干細(xì)胞。脂肪源性干細(xì)胞屬于間充質(zhì)干細(xì)胞，具有優(yōu)異的多潛能性，另外，如上所述，由于脂肪源性干細(xì)胞能夠簡(jiǎn)便而大量地采集，因此有利于用于各種疾病的治療。

另外，本發(fā)明涉及的功能增強(qiáng)干細(xì)胞特征在于，含有將上述抑制素包覆在生物相容性納米粒子內(nèi)而成的內(nèi)含抑制素納米粒子。

這種本發(fā)明涉及的功能增強(qiáng)干細(xì)胞含有上述內(nèi)含抑制素納米粒子，因此如上所述，可通過(guò)該內(nèi)含抑制素納米粒子來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞功能，對(duì)以缺血性心臟病為代表的各種疾病的治療發(fā)揮優(yōu)異效果。另外，本發(fā)明涉及的功能增強(qiáng)細(xì)胞能夠緩慢釋放出抑制素，該釋放出的抑制素可使骨髓干細(xì)胞、骨髓源性血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(epc)的集聚亢進(jìn)，因此有利于缺血性心臟病等的治療。

由于上述理由，本發(fā)明涉及的功能增強(qiáng)干細(xì)胞優(yōu)選為上述脂肪源性干細(xì)胞，還優(yōu)選為了治療心肌梗死等缺血性心臟病而給予患者的干細(xì)胞。

另外，本發(fā)明涉及的功能增強(qiáng)干細(xì)胞還可以與藥學(xué)上可接受的溶劑和賦形劑混合制成細(xì)胞制劑。本發(fā)明涉及的干細(xì)胞對(duì)生物體內(nèi)的給藥優(yōu)選無(wú)需開(kāi)胸等手術(shù)的給藥，還優(yōu)選制成靜胍給藥用細(xì)胞制劑。由此，本發(fā)明涉及的干細(xì)胞可以簡(jiǎn)便地對(duì)患者給藥。另外，如上所述，本發(fā)明涉及的功能增強(qiáng)干細(xì)胞起到優(yōu)異的藥物傳遞系統(tǒng)的作用，可將干細(xì)胞集聚在所需患部并緩慢釋放抑制素，因此無(wú)需局部給藥，即使采用靜胍給藥也能夠以較少容量獲得良好的效果。

本發(fā)明涉及的功能增強(qiáng)干細(xì)胞的制備方法特征在于，包括用上述內(nèi)含抑制素納米粒子對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行處理的步驟。特別是，在上述用內(nèi)含抑制素納米粒子對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行處理的步驟中，優(yōu)選向培養(yǎng)有干細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加內(nèi)含抑制素納米粒子使其濃度達(dá)到20μg/ml～100μg/ml，處理時(shí)間為30分鐘～2小時(shí)。

由此，通過(guò)向培養(yǎng)有干細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加內(nèi)含抑制素納米粒子這一簡(jiǎn)便的步驟，能夠得到上述功能增強(qiáng)干細(xì)胞。另外，通過(guò)以上述濃度和時(shí)間進(jìn)行處理，可將內(nèi)含抑制素納米粒子高效地?cái)z入干細(xì)胞內(nèi)。

由于上述理由，在本發(fā)明涉及的功能增強(qiáng)干細(xì)胞的制備方法中，優(yōu)選使用脂肪源性干細(xì)胞作為干細(xì)胞，另外還優(yōu)選使用用于治療缺血性心臟病的干細(xì)胞。

發(fā)明的效果

根據(jù)本發(fā)明涉及的內(nèi)含抑制素納米粒子、以及含有該內(nèi)含抑制素納米粒子的功能增強(qiáng)干細(xì)胞及其制備方法，能夠增強(qiáng)干細(xì)胞的功能，通過(guò)對(duì)生物體內(nèi)給予該干細(xì)胞，對(duì)以缺血性心臟病為代表的各種疾病的治療有效。

附圖說(shuō)明

圖1是示出向脂肪源性干細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加終濃度達(dá)到20μg/ml、50μg/ml、80μg/ml或100μg/ml的內(nèi)含羅丹明紅熒光染料(rhodamineredfluorescentdye)的pla納米粒子，1小時(shí)后或2小時(shí)后用激光共聚焦熒光顯微鏡(confocallaserfluorescencemicroscope)觀察干細(xì)胞所得結(jié)果的照片。

圖2是示出以100μg/ml的濃度用內(nèi)含辛伐他汀的pla納米粒子對(duì)脂肪源性干細(xì)胞進(jìn)行1小時(shí)處理后，對(duì)從脂肪源性干細(xì)胞釋放到培養(yǎng)基中的辛伐他汀量進(jìn)行測(cè)定所得結(jié)果的圖表。

圖3(a)是示出經(jīng)pla納米粒子或內(nèi)含抑制素的pla納米粒子處理后的脂肪源性干細(xì)胞的遷移性測(cè)定結(jié)果的圖表，(b)是示出經(jīng)內(nèi)含抑制素的pla納米粒子處理后的脂肪源性干細(xì)胞的增殖性測(cè)定結(jié)果的圖表。

圖4是示出使用定量pcr法對(duì)經(jīng)內(nèi)含抑制素納米粒子處理后的脂肪源性干細(xì)胞中的血管生成因子的mrna表達(dá)進(jìn)行測(cè)定所得結(jié)果的圖表，示出作為血管生成因子的(a)vegf-a、(b)vegf-c、(c)fgf-2的rna表達(dá)的測(cè)定結(jié)果。

圖5是示出給予pbs、內(nèi)含抑制素納米粒子、脂肪源性干細(xì)胞、或者攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞之后，心肌梗死模型小鼠心臟的超聲診斷結(jié)果的圖表，(a)表示左室射血分?jǐn)?shù)(ef)，(b)表示左室縮短分?jǐn)?shù)(fs)，(c)表示左室舒張末期內(nèi)徑(lvdd)，(d)表示左室收縮末期內(nèi)徑(lvds)。

圖6是示出給予pbs、或者攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞28日后，心肌梗死模型小鼠心臟的照片。

圖7(a)是示出給予pbs、內(nèi)含抑制素納米粒子、攝取了不含抑制素的納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞、或者攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞之后，心肌梗死模型小鼠的心臟梗死部分的切片經(jīng)馬松三色染色(massontrichromestain)所得結(jié)果的照片，(b)是示出各切片中纖維化部分的長(zhǎng)度的圖表，(c)是示出各切片中纖維化部分的心肌壁厚的圖表。

圖8示出給予pbs、內(nèi)含抑制素納米粒子、攝取了不含抑制素的納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞、或者攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞之后，心肌梗死模型小鼠的心臟梗死部分的切片經(jīng)馬松三色染色所得的結(jié)果，是將纖維化部分放大的照片。

圖9(a)是示出給予攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞60日后，心肌梗死模型小鼠心臟的照片，(b)～(e)是示出沿(a)所示的(b)～(e)各線切出的切片經(jīng)馬松三色染色所得結(jié)果的照片。

圖10是示出給予pbs、內(nèi)含抑制素納米粒子、攝取了不含抑制素的納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞、或者攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞之后，心肌梗死模型小鼠的心臟梗死部分的切片經(jīng)同工凝集素b4或抗smα肌動(dòng)蛋白抗體(anti-smαactinantibody)進(jìn)行免疫染色所得結(jié)果的照片。

圖11示出給予pbs、內(nèi)含抑制素納米粒子、攝取了不含抑制素的納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞、或者攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞之后，心肌梗死模型小鼠的心臟梗死部分的切片經(jīng)同工凝集素b4染色，測(cè)量血管密度所得的結(jié)果，(a)示出將切片染色后的顯微鏡照片，(b)是示出測(cè)出的血管密度的圖表。

圖12是示出給予攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞之后，心肌梗死模型小鼠的心臟梗死部分的切片經(jīng)同工凝集素b4和抗ki67抗體進(jìn)行免疫染色所得結(jié)果的照片。

圖13是示出給予攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞之后，心肌梗死模型小鼠的心臟梗死部分的切片經(jīng)抗smα-肌動(dòng)蛋白抗體和抗ki67抗體進(jìn)行免疫染色所得結(jié)果的照片。

圖14是示出給予攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞14日后，上述心肌梗死模型小鼠的心臟梗死部分的切片經(jīng)抗wt1抗體和上述抗ki67抗體進(jìn)行免疫染色所得結(jié)果的照片。

圖15是示出給予攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞之后，心肌梗死模型小鼠的心臟梗死部分的切片經(jīng)抗gata4抗體和抗αmhc抗體進(jìn)行免疫染色所得結(jié)果的照片。

圖16是示出給予攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞之后，心肌梗死模型小鼠的心臟梗死部分的切片經(jīng)抗nkx2.5抗體和抗αmhc抗體進(jìn)行免疫染色所得結(jié)果的照片。

圖17是示出給予攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞之后，心肌梗死模型小鼠的心臟梗死部分的切片經(jīng)抗ctn-1抗體或抗smα肌動(dòng)蛋白抗體、以及抗人線粒體抗體(anti-humanmitochondriaantibody)進(jìn)行免疫染色所得結(jié)果的照片。

圖18是示出對(duì)從tie2/lacz轉(zhuǎn)基因小鼠接受骨髓移植的心肌梗死小鼠給予攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞之后，該心肌梗死模型小鼠的心臟梗死部分的切片經(jīng)抗ctn-1抗體、抗smα肌動(dòng)蛋白抗體或同工凝集素b4、以及抗β-gal(β-半乳糖苷酶)抗體進(jìn)行免疫染色所得結(jié)果的照片。

具體實(shí)施方式

以下，根據(jù)附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行說(shuō)明。以下的優(yōu)選實(shí)施方式的說(shuō)明本質(zhì)上僅是示例，并不意圖限制本發(fā)明、本發(fā)明的適用方法、或者本發(fā)明的用途。

本發(fā)明涉及的內(nèi)含抑制素納米粒子制劑中所用的內(nèi)含抑制素納米粒子，是將抑制素包覆在含有聚乳酸-羥基乙酸共聚物的納米粒子內(nèi)而成的內(nèi)含抑制素納米粒子，用于增強(qiáng)干細(xì)胞的功能。本發(fā)明涉及的內(nèi)含抑制素納米粒子制劑除了上述內(nèi)含抑制素納米粒子以外，還可包含穩(wěn)定劑、保存劑、緩沖劑、ph調(diào)整劑、賦形劑等常用于制劑的添加劑。

本發(fā)明中，抑制素包括所有3-羥基-3-甲戊二酸單酰輔酶a(hmg-coa)還原酶抑制劑類化合物，例如可列舉出：辛伐他汀、瑞舒伐他汀、匹伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀、以及美伐他汀等。如上所述，已知抑制素具有降低膽固醇的作用，而除此之外通過(guò)大規(guī)模臨床試驗(yàn)明確了抑制素可使心血管事件的發(fā)生及發(fā)展風(fēng)險(xiǎn)降低。另外，對(duì)于來(lái)源于血管內(nèi)皮細(xì)胞或骨髓的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞介導(dǎo)的血管生成促進(jìn)作用也多有報(bào)道。

本發(fā)明中，納米粒子只要是可包覆抑制素的生物吸收性聚合物則其材料沒(méi)有限定，優(yōu)選使用含有聚乳酸聚合物(polylacticacid：pla)或聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolicacid)：plga)的納米粒子。pla在體內(nèi)水解而分解成乳酸，plga在體內(nèi)水解而分解成乳酸和乙二醇，最終分別成為水和二氧化碳，因此對(duì)體內(nèi)無(wú)害而優(yōu)選。

本發(fā)明中，從干細(xì)胞的攝取效率的觀點(diǎn)出發(fā)，內(nèi)含抑制素納米粒子的制備方法只要是能夠?qū)⑵浼庸こ捎霉馍⑸浞y(cè)定時(shí)粒徑小于1000nm、優(yōu)選為約100nm～400nm、更優(yōu)選為200nm～400nm的納米粒子的方法，則可以采用任意方法進(jìn)行制備，優(yōu)選采用球晶制粒技術(shù)(sphericalcrystallizationtechnique)制備。球晶制粒技術(shù)作為可以通過(guò)對(duì)化合物合成的最終工序中結(jié)晶的生成、生長(zhǎng)過(guò)程進(jìn)行控制來(lái)設(shè)計(jì)球狀晶粒，從而直接控制其物性進(jìn)行加工的方法而廣為人知。公知的乳化溶劑擴(kuò)散法(esd法)為該球晶制粒技術(shù)中的一種。

乳化溶劑擴(kuò)散法使用可將用于包覆抑制素的上述pla或plga等生物吸收性聚合物溶解的良溶劑、以及不能溶解該聚合物的不良溶劑這兩種有機(jī)溶劑來(lái)進(jìn)行。首先，將pla或plga等聚合物溶解于良溶劑中，向良溶劑中添加抑制素溶液而不讓該聚合物析出，進(jìn)行混合。若將所得混合液滴入攪拌下的不良溶劑中，則良溶劑與不良溶劑急速地相互擴(kuò)散，因此有機(jī)溶劑相與水相的界面紊亂，良溶劑自乳化，形成亞微米尺寸的乳液滴。然后，良溶劑和不良溶劑的相互擴(kuò)散進(jìn)一步發(fā)展，乳液滴內(nèi)的pla或plga等聚合物以及抑制素的溶解度下降，其結(jié)果，生成內(nèi)含抑制素的球形晶粒聚合物納米粒子。

本發(fā)明中，干細(xì)胞是具有全能性、多潛能性(multipotency)或多能性(pluripotency)的細(xì)胞，例如可列舉出胚胎干細(xì)胞(es細(xì)胞)、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(ips細(xì)胞)和間充質(zhì)干細(xì)胞等成體干細(xì)胞。本發(fā)明中，從更簡(jiǎn)便且大量地獲得很多干細(xì)胞的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選使用從骨髓組織、脂肪組織等得到的間充質(zhì)干細(xì)胞。其中，特別優(yōu)選使用脂肪源性干細(xì)胞。已知脂肪源性干細(xì)胞已在臨床進(jìn)行細(xì)胞單獨(dú)給藥，分化成脂肪、骨、肝臟、心臟等。脂肪源性干細(xì)胞可從脂肪組織中獲得，該脂肪組織可使用吸脂等微創(chuàng)技術(shù)從皮下脂肪等而容易地獲得。脂肪源性干細(xì)胞可以通過(guò)使用celution系統(tǒng)(cytoritherapeutics，inc.制、)等從上述所得的脂肪組織中提取和分離而大量采集。因此，用作本發(fā)明涉及的干細(xì)胞極為有利。

本發(fā)明涉及的內(nèi)含抑制素納米粒子對(duì)干細(xì)胞的處理可通過(guò)例如添加到培養(yǎng)有該干細(xì)胞的培養(yǎng)基中而進(jìn)行。由此，干細(xì)胞通過(guò)吞噬作用而將內(nèi)含抑制素納米粒子攝入細(xì)胞內(nèi)，因此無(wú)需使用特別的試劑等即可簡(jiǎn)便地使干細(xì)胞中含有內(nèi)含抑制素納米粒子。

經(jīng)本發(fā)明涉及的內(nèi)含抑制素納米粒子處理后的干細(xì)胞，遷移能力、增殖能力和血管生成因子產(chǎn)生能力特別增強(qiáng)，從而對(duì)心肌梗死等缺血性心臟病的治療效果特別增強(qiáng)。具體而言，如果對(duì)缺血性心臟病患者靜脈給予經(jīng)本發(fā)明涉及的內(nèi)含抑制素納米粒子處理后的上述脂肪源性干細(xì)胞，則由于遷移性和增殖性增強(qiáng)，脂肪源性干細(xì)胞通過(guò)血流及其遷移性而到達(dá)心臟，在缺血性損傷心肌部分集聚并增殖，分化成心血管系統(tǒng)細(xì)胞。另外，所集聚的包含內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞可促進(jìn)血管生成因子的產(chǎn)生和釋放，從而通過(guò)大量血管生成因子促進(jìn)心肌組織的再生。

另外，如上所述，脂肪源性干細(xì)胞通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)對(duì)所攝取的內(nèi)含抑制素納米粒子進(jìn)行水解，將其所包覆的抑制素緩慢釋放，因此對(duì)體內(nèi)給予脂肪源性干細(xì)胞的情況下，給藥后在缺血性損傷心肌緩釋出抑制素，通過(guò)釋放出的抑制素促進(jìn)骨髓干細(xì)胞、骨髓源性血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(epc：endothelialprogenitorcell)的集聚，也促進(jìn)骨髓干細(xì)胞向心血管系統(tǒng)細(xì)胞的分化，從而促進(jìn)組織的再生。已知epc是存在于骨髓內(nèi)的血細(xì)胞類造血干細(xì)胞中的一個(gè)細(xì)胞分離部分(fraction)，而且雖然數(shù)量少但也存在于末梢循環(huán)血液中，集聚于缺血組織而分化成構(gòu)成毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞，對(duì)新生血管的形成也起作用，作為缺血性疾病中用于血管生成的細(xì)胞治療資源還廣泛進(jìn)行了臨床試驗(yàn)。進(jìn)而，還報(bào)道了epc不但會(huì)分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞，還會(huì)分化成心肌細(xì)胞。本發(fā)明涉及的含有內(nèi)含抑制素納米粒子的干細(xì)胞，可將具有上述功能的epc集聚于缺血性損傷心肌部分，因此對(duì)其治療極為有利。進(jìn)而，通過(guò)本發(fā)明涉及的含有內(nèi)含抑制素納米粒子的干細(xì)胞的給藥，存在于心外膜附近的細(xì)胞在心肌梗死部分一邊分裂增殖一邊生成肉芽，從而促進(jìn)心肌的再生。其結(jié)果，有利于心肌梗死的治療。應(yīng)予說(shuō)明，本發(fā)明涉及的含有內(nèi)含抑制素納米粒子的干細(xì)胞不但能夠治療缺血性心臟病，在干細(xì)胞可分化的心臟以外的其他臟器的損傷中，也可獲得抑制素的效果、以及干細(xì)胞和epc的再生功能所產(chǎn)生的治療效果。

[實(shí)施例]

以下，示出為了對(duì)本發(fā)明涉及的用于增強(qiáng)干細(xì)胞功能的內(nèi)含抑制素納米粒子制劑、以及含有該納米粒子制劑的功能增強(qiáng)干細(xì)胞及其制備方法進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明的實(shí)施例。

首先，對(duì)內(nèi)含抑制素納米粒子的制備方法進(jìn)行說(shuō)明。此處，特別使用辛伐他汀作為抑制素，使用含有聚乳酸聚合物(pla)的納米粒子作為納米粒子。

將pla(wakopurechemicalindustriesltd.，pla0020，重均分子量20000)50mg和辛伐他汀2.5mg溶解于丙酮2ml、乙醇0.5ml的混合溶解中，制成聚合物溶液。將該聚合物溶液滴入室溫下、以500rpm攪拌的2wt％pva溶液10ml中，得到內(nèi)含辛伐他汀的pla納米粒子懸浮液。接著，在室溫下、一邊以500rpm繼續(xù)攪拌一邊蒸餾除去有機(jī)溶劑(丙酮、乙醇)。經(jīng)過(guò)約5小時(shí)將溶劑蒸餾除去后，將懸浮液在4℃下、以60000g離心分離30分鐘，將沉淀物回收并再懸浮于蒸餾水中。該離心分離和再懸浮于蒸餾水中的操作共進(jìn)行3次。然后，將懸浮液冷凍干燥一夜，得到內(nèi)含辛伐他汀的pla納米粒子。1mg納米粒子中包覆有24.94μg辛伐他汀。以下試驗(yàn)中，使用該內(nèi)含辛伐他汀的pla納米粒子。

接著，為了討論用如上所得的內(nèi)含抑制素納米粒子對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行處理時(shí)的最適處理濃度，進(jìn)行以下試驗(yàn)。

為了進(jìn)行該試驗(yàn)，首先，采用利用膠原酶處理和離心比重法的公知方法，從人脂肪組織獲得人脂肪源性干細(xì)胞(adiposederivedstemcell：adsc)。該方法詳細(xì)說(shuō)明如下。首先，配制含有dnasei(0.1mg/ml，roche，1284932)和3mmcacl2的膠原酶1型(1mg/ml，wako035-17604)/1％bsahbss溶液作為膠原酶溶液。然后，用手術(shù)刀將人脂肪組織(約1g～2g)切碎，與約3倍于其組織體積的上述膠原酶溶液一起加入15ml試管中，37℃下振蕩培養(yǎng)60分鐘。然后，向培養(yǎng)后的15ml試管內(nèi)加入室溫的5mmedta/pbs(將edta(0.5medta，ph8.0，lifetechnologies，am9260g)，10xdpbs，ca(-)，mg(-)(gibco，14200-166)稀釋而制成)，取約15ml的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行300g×5min的離心后，吸去上清(包含脂肪層)，添加5mmedta/pbs至20ml。將所得的細(xì)胞懸浮液一邊過(guò)細(xì)胞篩(70μm，bd)一邊回收到新的50ml試管中。向兩根15ml試管中加入室溫的histopaque10774ml，每個(gè)試管中平穩(wěn)地加入10ml上述回收的細(xì)胞溶液，使該細(xì)胞溶液分層而不混合。將兩根試管在室溫下以800g×20min(無(wú)間歇(breakless))進(jìn)行離心，離心后用帶有18g針的2.5ml注射器僅將單核細(xì)胞層回收，移入新的15ml試管中，添加冷卻的5mmedta/pbs至14ml。然后，以200g×10min進(jìn)行離心(有間歇(withabreak))，棄去上清。然后，用1ml冷卻的5mmedta/pbs將細(xì)胞懸浮，定容至14ml后，以200g×10min進(jìn)行離心，棄去上清。將所得的細(xì)胞團(tuán)塊(cellpellet)用初代培養(yǎng)用培養(yǎng)基(10％fbs/dmemf12，sigmad8042+antibiotic-antimycotic，gibco15240-062)懸浮后以約3×10⁴/cm²～4×10⁴/cm²的細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)皿中。然后，用5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～5日，將粘附細(xì)胞作為人細(xì)胞源性干細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)中。

如此得到人細(xì)胞源性干細(xì)胞后，采用上述乳化溶劑擴(kuò)散法，通過(guò)代替抑制素而將羅丹明紅熒光染料包覆在pla納米粒子中，得到內(nèi)含羅丹明紅熒光染料的pla納米粒子。將所得的內(nèi)含羅丹明紅熒光染料的pla納米粒子添加到上述脂肪源性干細(xì)胞的培養(yǎng)基中，使該pla納米粒子的終濃度達(dá)到20μg/ml、50μg/ml、80μg/ml或100μg/ml。1小時(shí)后(1h)或2小時(shí)后(2h)，使用激光共聚焦熒光顯微鏡，對(duì)內(nèi)含羅丹明紅熒光染料的pla納米粒子的攝取進(jìn)行觀察。應(yīng)予說(shuō)明，核的染色使用dapi按照常法進(jìn)行。其結(jié)果示于圖1。

如圖1所示，可知內(nèi)含羅丹明紅熒光染料的pla納米粒子在所有濃度下均能被脂肪源性干細(xì)胞攝取。但是，脂肪源性干細(xì)胞對(duì)內(nèi)含羅丹明紅熒光染料的pla納米粒子的攝取量呈處理濃度依賴性增大。而且還可知，與處理時(shí)間為1小時(shí)的情況相比，在處理時(shí)間為2小時(shí)的情況下脂肪源性干細(xì)胞對(duì)內(nèi)含辛伐他汀的pla納米粒子的攝取量較多。特別確認(rèn)了，在以100μg/ml的濃度用內(nèi)含羅丹明紅熒光染料的pla納米粒子對(duì)脂肪源性干細(xì)胞進(jìn)行處理的情況下，干細(xì)胞攝取了大量?jī)?nèi)含羅丹明紅熒光染料的pla納米粒子。

接著，為了討論攝取了內(nèi)含辛伐他汀的pla納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞在此后要花費(fèi)多長(zhǎng)時(shí)間從細(xì)胞內(nèi)釋放出抑制素，對(duì)釋放到培養(yǎng)基中的抑制素的量進(jìn)行測(cè)定。此處，與上述試驗(yàn)相同，以100μg/ml的濃度用內(nèi)含辛伐他汀的pla納米粒子對(duì)脂肪源性干細(xì)胞進(jìn)行1小時(shí)處理后，更換培養(yǎng)基，測(cè)定從更換培養(yǎng)基起6小時(shí)后、18小時(shí)后、以及24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、120小時(shí)、168小時(shí)和336小時(shí)后釋放到培養(yǎng)基中的辛伐他汀的量。具體而言，該測(cè)定采用hplc(high-pressureliquidchromatography)法進(jìn)行。其測(cè)定結(jié)果示于圖2。

如圖2所示，自測(cè)定開(kāi)始24小時(shí)后從脂肪源性干細(xì)胞中釋放出約60％左右的抑制素，釋放出所有抑制素需要花費(fèi)約336小時(shí)的時(shí)間。從此結(jié)果可知，被脂肪源性干細(xì)胞攝取的抑制素不是從脂肪源性干細(xì)胞中急速釋放，而是緩慢釋放。因此，脂肪源性干細(xì)胞在到達(dá)缺血心肌之前不會(huì)將大部分的抑制素釋放，而是能夠在到達(dá)患部之后經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間釋放出抑制素，因此可期待良好的治療效果。

接著，為了討論由上述內(nèi)含辛伐他汀的納米粒子引起的脂肪源性干細(xì)胞的遷移能力、增殖能力和血管生成因子產(chǎn)生能力這些功能的增強(qiáng)，進(jìn)行以下試驗(yàn)。

首先，使用遷移性試驗(yàn)試劑盒(transwell(注冊(cè)商標(biāo)))對(duì)脂肪源性干細(xì)胞的遷移能力進(jìn)行討論。具體而言，在transwell板(transwellplate)各孔的多孔膜上以5×10⁴細(xì)胞/孔(cells/well)接種脂肪源性干細(xì)胞，向培養(yǎng)基中添加不含抑制素的pla納米粒子使其濃度達(dá)到20μg/ml，或者添加內(nèi)含辛伐他汀的pla納米粒子使其濃度達(dá)到20μg/ml、50μg/ml和100μg/ml，16～18小時(shí)后對(duì)通過(guò)transwell的膜的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。其結(jié)果示于圖3(a)。

如圖3(a)所示，在用20μg/ml不含抑制素的pla納米粒子進(jìn)行處理的情況(pla20)、以及用20μg/ml內(nèi)含辛伐他汀的pla納米粒子進(jìn)行處理的情況(pla-st20)下，與未處理的對(duì)照組(control)相比，脂肪源性干細(xì)胞的遷移性無(wú)變化，而在用50μg/ml內(nèi)含辛伐他汀的pla納米粒子進(jìn)行處理的情況(statin50)下，脂肪源性干細(xì)胞的遷移性增大。另外，在用100μg/ml內(nèi)含辛伐他汀的pla納米粒子進(jìn)行處理的情況(statin100)下，結(jié)果導(dǎo)致脂肪源性干細(xì)胞的遷移性降低。此結(jié)果表明，雖然為最適處理濃度，但內(nèi)含辛伐他汀的pla納米粒子可使脂肪源性干細(xì)胞的遷移能力亢進(jìn)。

接著，使用mtt比色(mttassay)討論內(nèi)含辛伐他汀的納米粒子對(duì)脂肪源性干細(xì)胞增殖性的提高，對(duì)其結(jié)果進(jìn)行說(shuō)明。

首先，將脂肪源性干細(xì)胞以5000細(xì)胞/孔的細(xì)胞數(shù)接種在96孔板中，添加內(nèi)含辛伐他汀的pla納米粒子使其濃度達(dá)到20μg/ml、50μg/ml或100μg/ml，48小時(shí)后更換培養(yǎng)基，向各孔中添加mtt溶液，2小時(shí)后使用分光光度計(jì)測(cè)定450nm的吸光度。其結(jié)果示于圖3(b)。

如圖3(b)所示，在用內(nèi)含辛伐他汀的納米粒子以20μg/ml(statin20)、50μg/ml(statin50)和100μg/ml(statin100)的濃度進(jìn)行處理的情況下，與未處理的對(duì)照組(control)相比，均出現(xiàn)脂肪源性干細(xì)胞的增殖，特別在以50μg/ml的濃度進(jìn)行處理的情況下，與對(duì)照組相比，可見(jiàn)增殖性的顯著增加。此結(jié)果表明，通過(guò)內(nèi)含辛伐他汀的pla納米粒子，能夠使脂肪源性干細(xì)胞的增殖能力亢進(jìn)。

接著，為了討論內(nèi)含辛伐他汀的納米粒子對(duì)脂肪源性干細(xì)胞的血管生成因子產(chǎn)生能力的效果，使用定量pcr法對(duì)脂肪源性干細(xì)胞內(nèi)的血管生成因子的mrna表達(dá)量進(jìn)行解析。此處，作為血管生成因子測(cè)定vegf-a、vegf-c和fgf-2的細(xì)胞內(nèi)mrna表達(dá)量。

首先，向培養(yǎng)有脂肪源性干細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加內(nèi)含辛伐他汀的pla納米粒子使其濃度達(dá)到20μg/ml、50μg/ml或100μg/ml，24小時(shí)后將以各濃度進(jìn)行處理的細(xì)胞回收，使用nucleospinrna試劑盒(takarabioinc.)提取這些細(xì)胞的rna。然后，使用與vegf-a、vegf-c和fgf-2的dna序列相關(guān)的引物，通過(guò)定量pcr法對(duì)各細(xì)胞內(nèi)vegf-a、vegf-c和fgf-2的mrna表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定如下進(jìn)行：使用revertraaceqpcrrt試劑盒(toyobo)提取rna，由提取出的rna合成cdna，將所合成的cdna與ssofastevagreenmastermix試劑(bio-rad)和引物(vegf-a：f-ttactctcacctgcttct，r-ctgcttcttccaacaatg，vegf-c：f-tcaaggacagaagagacta，r-ccacatctatacacacctc，fgf-2：f-ttcttccaatgtctgctaa，r-gaccaattatccaaactgag)一起用熱循環(huán)儀(cfxconnectbio-rad)進(jìn)行反應(yīng)(95℃30秒進(jìn)行1循環(huán)、95℃5秒/56℃5秒進(jìn)行40循環(huán))。

其測(cè)定結(jié)果示于圖4。應(yīng)予說(shuō)明，結(jié)果示出以gapdh的mrna表達(dá)量為基準(zhǔn)的上述各因子的表達(dá)量的比率(上述各因子的表達(dá)量/gapdh的mrna表達(dá)量)。

如圖4(a)所示，在以20μg/ml(statin20)、50μg/ml(statin50)和100μg/ml(statin100)的任意濃度用內(nèi)含辛伐他汀的納米粒子進(jìn)行處理的情況下，vegf-a的mrna表達(dá)量與未處理的對(duì)照組(control)相比增大，特別在以100μg/ml的濃度用內(nèi)含辛伐他汀的納米粒子進(jìn)行處理時(shí)呈現(xiàn)顯著增大。

另外，如圖4(b)所示，在以20μg/ml(statin20)、50μg/ml(statin50)和100μg/ml(statin100)的任意濃度用內(nèi)含辛伐他汀的納米粒子進(jìn)行處理的情況下，vegf-c的mrna表達(dá)量與未處理的對(duì)照組(control)相比也增大，特別在以50μg/ml或100μg/ml的濃度用內(nèi)含辛伐他汀的納米粒子進(jìn)行處理時(shí)呈現(xiàn)顯著增大。

同樣地，如圖4(c)所示，在以20μg/ml(statin20)、50μg/ml(statin50)和100μg/ml(statin100)的任意濃度用內(nèi)含辛伐他汀的納米粒子進(jìn)行處理的情況下，fgf-2的mrna表達(dá)量與未處理的對(duì)照組(control)相比也增大，特別在以50μg/ml或100μg/ml的濃度用內(nèi)含辛伐他汀的納米粒子進(jìn)行處理時(shí)呈現(xiàn)顯著增大。以上結(jié)果表明，通過(guò)內(nèi)含辛伐他汀的pla納米粒子使脂肪源性干細(xì)胞的血管生成因子產(chǎn)生能力亢進(jìn)。

如上所述，由內(nèi)含抑制素納米粒子引起的脂肪源性干細(xì)胞的遷移能力、增殖能力和血管生成因子產(chǎn)生能力這些功能的增強(qiáng)的討論結(jié)果為，通過(guò)內(nèi)含抑制素納米粒子可增強(qiáng)脂肪源性干細(xì)胞的功能。這些功能是在脂肪源性干細(xì)胞在生物體內(nèi)給藥后集聚于缺血心肌部分，有利于該部分的再生的功能，通過(guò)使這些功能增強(qiáng)，脂肪源性干細(xì)胞對(duì)心肌梗死等缺血性心臟病的治療極為有利。

接著，使用心肌梗死模型小鼠，對(duì)本發(fā)明涉及的內(nèi)含抑制素納米粒子以及含有該納米粒子的干細(xì)胞的心肌梗死治療效果進(jìn)行討論。

首先，對(duì)12周齡雄balb/c裸鼠進(jìn)行缺血誘發(fā)(冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎模型)，同時(shí)進(jìn)行心臟超聲圖像診斷(第0日)，3日后(第3日)，尾靜胍給予pbs(磷酸緩沖生理鹽水)、如上所述分別得到的攝取了不含抑制素pla納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞、攝取了內(nèi)含抑制素pla納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞、或者內(nèi)含抑制素pla納米粒子。應(yīng)予說(shuō)明，作為攝取了內(nèi)含抑制素pla納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞，使用以100μg/ml的濃度用內(nèi)含抑制素納米粒子對(duì)脂肪源性干細(xì)胞進(jìn)行1小時(shí)處理所得的干細(xì)胞。脂肪源性干細(xì)胞的給藥量為1×10⁴細(xì)胞/小鼠，內(nèi)含抑制素pla納米粒子的給藥量為50μg/小鼠。另外，在同一日(第3日)內(nèi)還進(jìn)行心臟超聲圖像診斷。經(jīng)過(guò)11日后(第14日)，再次進(jìn)行心臟超聲圖像診斷。經(jīng)過(guò)14日后(第28日)，再次進(jìn)行心臟超聲圖像診斷，然后解剖進(jìn)行心臟的組織學(xué)解析。在心臟超聲圖像診斷中，測(cè)定左室射血分?jǐn)?shù)(ef)、左室縮短分?jǐn)?shù)(fs)、左室舒張末期內(nèi)徑(lvdd)和左室收縮末期內(nèi)徑(lvds)。作為組織學(xué)解析，對(duì)毛細(xì)血管密度、纖維化面積率、脂肪源性干細(xì)胞的存活率(takingrate)和脂肪源性干細(xì)胞的分化頻率進(jìn)行解析。心臟超聲圖像診斷的結(jié)果示于圖5，第28日從上述小鼠中摘出的心臟示于圖6，組織學(xué)解析的結(jié)果示于圖7、圖8、圖10～17。另外，從給予上述攝取了內(nèi)含抑制素pla納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞后第60日的小鼠中摘出的心臟、及其不同部分的切片示于圖9。

如圖5(a)和(b)所示，第3日在所有組中ef和fs降低，心臟功能惡化，然后在第14日和第28日，未處理的對(duì)照組(pbs：●)中未見(jiàn)改善，但在攝取了不含抑制素pla納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞的給藥組(pla+adsc：▲)、以及內(nèi)含抑制素pla納米粒子的給藥組(statin/pla：)中略有改善。另外，攝取了內(nèi)含抑制素pla納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞的給藥組(statin/pla+adsc：■)中，出現(xiàn)顯著改善。另外，如圖5(c)和(d)所示，對(duì)于lvdd和lvds，將未處理的對(duì)照組(pbs：●)、攝取了不含抑制素pla納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞的給藥組(pla+adsc：▲)、以及內(nèi)含抑制素pla納米粒子的給藥組(statin/pla：)進(jìn)行比較，攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞的給藥組(statin/pla+adsc：■)中，可抑制lvdd和lvds尺寸的增大，可確認(rèn)心功能的改善。

另外，如圖6所述，從外觀也可確認(rèn)，攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞的給藥組(右側(cè)的照片)與對(duì)照組(左側(cè)的照片)相比，心臟的擴(kuò)大受到抑制。

另外，按照常法制作各組摘出心臟中梗死部分的切片，進(jìn)行馬松三色染色，對(duì)心肌壁切面面積進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果示于圖7。圖7(a)表示染色后切片的照片，箭頭表示纖維化而染成藍(lán)色的瘢痕部分。圖7(b)表示以整周長(zhǎng)度為100％時(shí)染成藍(lán)色的纖維化部分的長(zhǎng)度(圖7(a)箭頭方向的長(zhǎng)度)所占的比例，圖7(c)表示以正常心肌壁厚為100％時(shí)染成藍(lán)色的纖維化部分的心肌壁厚所占的比例。

如圖7(a)和(b)所示，與未處理的對(duì)照組(control)、攝取了不含抑制素pla納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞的給藥組(pla+adsc)、以及內(nèi)含抑制素pla納米粒子的給藥組(stain/pla)相比，在攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞的給藥組(adsc+statin/pla)中，纖維化而染成藍(lán)色的瘢痕部分的長(zhǎng)度較短。進(jìn)而，如圖7(a)和(c)所示，攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞的給藥組與其他組相比，心肌壁厚也較厚，意味著促進(jìn)了心肌部分的再生。

圖8示出各組切片中纖維化部分的放大照片。如圖8所示，對(duì)照組(control)中呈現(xiàn)出幾乎全染成藍(lán)色的平滑外觀，另外，攝取了不含抑制素pla納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞的給藥組(pla+adsc)、以及內(nèi)含抑制素pla納米粒子的給藥組(statin/pla)雖然微有染成紅色的部分，但與對(duì)照組相比未見(jiàn)大差異。另一方面，攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞的給藥組(adsc+statin/pla)中，纖維化的心肌壁向外側(cè)膨出，出現(xiàn)染成紅色的部分。該部分在其他組中未見(jiàn)，推測(cè)該部分處于通過(guò)攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞而再生為新心肌的過(guò)程中。

另外，圖6～8中示出給予攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞28日后小鼠的心臟，為了確認(rèn)此后是否有進(jìn)一步的治療效果，對(duì)給予攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞60日后小鼠心臟的外觀進(jìn)行觀察，并對(duì)該心臟不同部分的切片進(jìn)行上述同樣的染色、觀察。其結(jié)果示于圖9。應(yīng)予說(shuō)明，圖9(a)是示出該小鼠的心臟的照片，圖9(b)～圖9(e)是沿圖9(a)所示的(b)～(e)各線切出的切片經(jīng)馬松三色染色所得結(jié)果的照片。應(yīng)予說(shuō)明，圖9(b)的曲線箭頭表示通過(guò)上述染色而染成藍(lán)色的區(qū)域。

如圖9(a)所示，給予攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞60日后，在28日后出現(xiàn)的梗死(纖維化)部分有進(jìn)一步縮小的趨勢(shì)。另外，如圖9(b)～(e)所示，梗死部分的各切片中心肌壁增厚，另外，除了圖9(b)所示的結(jié)扎部分以外大部分染成紅色，因此可判斷為促進(jìn)了心肌部分的再生。此結(jié)果表明，給予攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞60日后，可見(jiàn)功能性心肌的再生治療效果。

接著，為了對(duì)梗死部分的心肌組織內(nèi)的血管生成進(jìn)行討論，使用與在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的糖蛋白、以及在血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)的蛋白分別結(jié)合的抗體等對(duì)上述切片進(jìn)行免疫染色，結(jié)果示于圖10。具體而言，使用與在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的糖蛋白結(jié)合的植物源性蛋白即fitc(fluoresceinisothiocyanate)標(biāo)記的同工凝集素b4、以及與在血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)的蛋白即smα肌動(dòng)蛋白結(jié)合的兔源性igg抗體作為上述抗體等，使用alexa488-羊源性抗兔igg抗體作為兔源性igg的二次抗體，進(jìn)行染色。

如圖10所示，在對(duì)照組(control(pbs))中，使用fitc-同工凝集素b4(isolectinb4)、以及抗smα肌動(dòng)蛋白抗體(smα-actin)時(shí)均幾乎未見(jiàn)染色，即幾乎未檢測(cè)出血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞，可判斷為血管幾乎不存在。另外，在內(nèi)含抑制素納米粒子的給藥組(statin/plga)中，也幾乎未檢測(cè)出血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞，在攝取了不含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞的給藥組(pla-adsc)中，略微檢測(cè)出血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞。于之相對(duì)，在攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞的給藥組(statinpla-adsc)中，非常多的區(qū)域內(nèi)可見(jiàn)染色，可判斷是由血管生成所引起的。即，通過(guò)給予攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞，可促進(jìn)心肌內(nèi)血管組織的再生。

接著，對(duì)缺血邊界區(qū)域內(nèi)的血管密度進(jìn)行討論。具體而言，對(duì)于各組的纖維化部分，與上述解析同樣用fitc-同工凝集素b4進(jìn)行熒光染色，測(cè)定顯微鏡視野內(nèi)染色區(qū)域的大小。另外，將該測(cè)定結(jié)果以血管密度制成圖表。其結(jié)果示于圖11。

如圖11(a)和(b)所示，與對(duì)照組(control(pbs))相比，在攝取了不含抑制素pla納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞的給藥組(pla+adsc)、以及內(nèi)含抑制素pla納米粒子的給藥組(statin/pla)中，血管密度略有增大，另外與這些給藥組相比，在攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞的給藥組(stain/pla+adsc)中，可進(jìn)一步確認(rèn)血管密度增大。由其結(jié)果也可判斷出，通過(guò)給予攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞，在梗死周圍部分(缺血部分)促進(jìn)了血管生成而有助于心肌組織再生。

接著，為了討論缺血心肌組織的細(xì)胞增殖活性，使用與細(xì)胞增殖期內(nèi)表達(dá)的ki67蛋白結(jié)合的抗體，對(duì)上述切片進(jìn)行免疫染色，結(jié)果示于圖12。具體而言，對(duì)于照組和攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞的給藥組的纖維化部分，使用fitc-同工凝集素b4、兔源性抗ki67抗體、以及作為二次抗體的alexa594-羊源性抗兔igg抗體，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和增殖期的細(xì)胞進(jìn)行免疫染色。

如圖12所示，在未處理的對(duì)照組(control)中，無(wú)論使用何種抗體均未見(jiàn)染色，但在攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞的給藥組(stain+adsc)中，不但與上述試驗(yàn)同樣被fitc-同工凝集素b4染色，而且還出現(xiàn)被抗ki67抗體染色。此結(jié)果意味著，通過(guò)給予攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞，可促進(jìn)缺血心肌組織的細(xì)胞增殖活性。另外，同工凝集素b4的染色部分與ki67的染色部分不同，所增殖的細(xì)胞與形成毛細(xì)血管的血管內(nèi)皮細(xì)胞不同(間質(zhì)的成纖維細(xì)胞等)。

另外，圖13示出使用抗smα-肌動(dòng)蛋白抗體和抗ki67抗體，與上述同樣對(duì)切片進(jìn)行免疫染色所得的結(jié)果。如圖13所示，在此情況下，對(duì)照組(control)中無(wú)論使用何種抗體均幾乎未見(jiàn)染色。另一方面，在攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞的給藥組(statin+adsc)中，不但與上述試驗(yàn)同樣被抗smα-肌動(dòng)蛋白抗體染色，而且還出現(xiàn)被抗ki67抗體染色。另外，抗smα-肌動(dòng)蛋白抗體的染色部分與抗ki67抗體的染色部分不同，所增殖的細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞不同(間質(zhì)的成纖維細(xì)胞等)。

另外，圖14示出使用對(duì)心外膜細(xì)胞所具有的wt1蛋白進(jìn)行染色的抗wt1抗體和上述抗ki67抗體，與上述同樣對(duì)給予攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞14日后上述心肌梗死模型小鼠的心臟梗死部分的切片進(jìn)行免疫染色所得的結(jié)果。如圖14所示，心肌梗死部分中多見(jiàn)被抗wt抗體染色的心外膜細(xì)胞，另外，其最外部多見(jiàn)被抗wt1抗體和抗ki67抗體共同染色的增殖期細(xì)胞(箭頭部分)。此結(jié)果意味著，在梗死部分，心外膜細(xì)胞一邊向外側(cè)增殖分裂一邊生成肉芽，從而使心肌壁再次增厚而再生。因此，可推測(cè)出即使在例如從心肌梗死發(fā)病起經(jīng)過(guò)1個(gè)月以上，梗死部分大多處于瘢痕狀態(tài)的情況下，通過(guò)給予本發(fā)明所述的攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞，可使殘留在瘢痕部分的心外膜細(xì)胞增殖，促進(jìn)心肌的再生，從而治療心肌梗死。

接著，為了討論攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞對(duì)心肌的再生，使用與在心肌細(xì)胞中表達(dá)的蛋白結(jié)合的抗體進(jìn)行免疫染色，結(jié)果示于圖15。此處，作為與在心肌細(xì)胞中表達(dá)的蛋白結(jié)合的抗體，使用與也在未成熟心肌細(xì)胞中表達(dá)的gata4結(jié)合的兔源性igg抗體、作為二次抗體的alexa488羊源性抗兔igg抗體、與不在未成熟心肌細(xì)胞中表達(dá)而僅在成熟心肌細(xì)胞中表達(dá)的αmhc結(jié)合的小鼠源性igg抗體、以及作為二次抗體的alexa594羊源性抗小鼠igg抗體。

如圖15所示，對(duì)上述gata4進(jìn)行免疫染色的結(jié)果，在未處理的對(duì)照組(control)中幾乎未被染色，而在攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞的給藥組(statin+adsc)中檢測(cè)出很多染色區(qū)域。另一方面，對(duì)上述αmhc進(jìn)行免疫染色的結(jié)果為，在對(duì)照組幾乎未見(jiàn)染色，而在攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞的給藥組中微有染色，但與抗gata4抗體的染色結(jié)果相比染色區(qū)域明顯較少。

圖16示出使用與gata4同樣在未成熟心肌細(xì)胞中表達(dá)的nkx2.5的兔源性igg抗體、作為二次抗體的alexa488羊源性抗兔igg抗體、以及上述αmhc的抗體，與上述同樣進(jìn)行免疫染色的結(jié)果。如圖16所示，與圖15的結(jié)果相同，使用在未成熟心肌細(xì)胞中表達(dá)的nkx2.5進(jìn)行免疫染色的結(jié)果為，在對(duì)照組(control)中幾乎未見(jiàn)染色，而在攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞的給藥組(statin+adsc)中檢測(cè)出很多染色區(qū)域。

圖15和圖16所示的結(jié)果表明，給予攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞時(shí)，缺血心肌組織中出現(xiàn)未成熟心肌細(xì)胞。即，意味著通過(guò)攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞促進(jìn)了心肌組織的再生。

在以上實(shí)驗(yàn)中，如上所述示出了以1×10⁴細(xì)胞/小鼠對(duì)心肌梗死模型小鼠給予攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞時(shí)的結(jié)果，接著，對(duì)以5×10⁴細(xì)胞/小鼠的量給藥時(shí)心肌組織的再生進(jìn)行討論。為此，對(duì)與上述同樣制成的心肌梗死模型小鼠進(jìn)行缺血處理3日后，以5×10⁴細(xì)胞/小鼠尾靜胍給予攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞，25日后與上述同樣進(jìn)行解剖，制成心肌梗死部分的切片。使用與在心肌骨格肌細(xì)胞中表達(dá)的ctn-1(心肌型肌鈣蛋白)結(jié)合的兔源性igg抗體和作為二次抗體的alexa488羊源性抗兔igg抗體、或者在平滑肌細(xì)胞中表達(dá)的與上述相同的抗smα肌動(dòng)蛋白抗體、以及與人線粒體(hmtcd)結(jié)合的兔源性igg抗體和作為二次抗體的alexa594羊源性抗兔igg抗體，對(duì)該切片進(jìn)行免疫染色。其結(jié)果示于圖17。

如圖17所示，在心肌梗死模型小鼠中，以5×10⁴細(xì)胞/小鼠給予攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞時(shí)，在心肌組織的纖維化部分可見(jiàn)抗ctn-1抗體的染色(箭頭部分)，確認(rèn)了心肌細(xì)胞的表達(dá)。另外，還可見(jiàn)hmtcd抗體的染色(箭頭部分)，即表明給予的人脂肪組織源性干細(xì)胞殘留在心肌組織內(nèi)。另外，將這些圖像重合時(shí)，出現(xiàn)染色區(qū)域重疊的部分(箭頭部分)。因此，意味著給予的人脂肪源性干細(xì)胞分化成心肌。應(yīng)予說(shuō)明，雖然也被smα肌動(dòng)蛋白抗體染色，但該染色區(qū)域與hmtcd抗體的染色區(qū)域幾乎不重疊。

以上結(jié)果意味著，以5×10⁴細(xì)胞/小鼠的容量給予攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞時(shí)，在缺血心肌組織內(nèi)發(fā)生給藥細(xì)胞的集聚和殘存，進(jìn)而特別發(fā)生該細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化。

接著，對(duì)由攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞所釋放出的抑制素而使骨髓源性血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(epc)向梗死部分集聚的效果進(jìn)行討論。如上所述，已知epc是存在于骨髓中的血細(xì)胞類造血干細(xì)胞中的一個(gè)細(xì)胞分離部分，可分化成構(gòu)成毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞。另外，還已知epc是血管穩(wěn)定化因子中的一種即血管生成素-1的受體，在被識(shí)別為內(nèi)皮系細(xì)胞標(biāo)記的tie2陽(yáng)性細(xì)胞中含有大量epc。因此，將可通過(guò)基因重組利用β-gal(β-半乳糖苷酶)的免疫染色鑒定tie2陽(yáng)性細(xì)胞的tie2/lacz轉(zhuǎn)基因小鼠作為供體，從其骨髓中提取骨髓單核細(xì)胞。

tie2/lacz轉(zhuǎn)基因小鼠可采用常法制作，具體而言可通過(guò)以下方式制作：將lacz基因結(jié)合在小鼠tie2啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的內(nèi)部，制成重組基因載體，然后從在細(xì)菌內(nèi)擴(kuò)增的上述重組基因載體中分離、純化出小鼠tie2/lacz基因表達(dá)載體，將該小鼠tie2/lacz基因表達(dá)載體微注射到小鼠受精卵中。另外，骨髓單核細(xì)胞的提取如下進(jìn)行。首先，小鼠處死后將股骨、脛骨、脊骨、髂骨分離，切碎后放入乳缽中，加入室溫的5mmedta/pbs20ml，用研杵敲擊(tapping)骨片制成細(xì)胞懸浮液。將該細(xì)胞懸浮液一邊過(guò)細(xì)胞篩(40μm，bd)一邊回收到新的50ml試管中，向兩根15ml試管中加入室溫的histopaque10834ml(sigma，10831)，每個(gè)試管中平穩(wěn)地加入10ml細(xì)胞溶液，使該細(xì)胞溶液分層而不混合。然后，將兩根試管在室溫下以800g×20min(無(wú)間歇)進(jìn)行離心，離心后用帶有18g針的2.5ml注射器僅將單核細(xì)胞層回收，移入新的15ml試管中，添加冷卻的5mmedta/pbs至14ml。然后，以200g×10min進(jìn)行離心(有間歇)，棄去上清。之后，用1ml冷卻的5mmedta/pbs將細(xì)胞懸浮，定容至14ml后，以200g×10min進(jìn)行離心，棄去上清，制成骨髓單核細(xì)胞團(tuán)塊，用于以下所示的骨髓移植實(shí)驗(yàn)中。

作為骨髓移植如下進(jìn)行：首先，對(duì)6～8周齡雄balb/c裸鼠照射x射線(以5gy照射2次)，得到骨髓細(xì)胞完全破壞的小鼠作為受體小鼠，移植上述所得的供體小鼠的骨髓單核細(xì)胞。4周后，與上述試驗(yàn)同樣對(duì)該受體小鼠進(jìn)行缺血誘發(fā)(冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎模型)，該處理進(jìn)行3日后，尾靜胍給予內(nèi)含抑制素pla納米粒子。應(yīng)予說(shuō)明，脂肪源性干細(xì)胞的給藥量為1×10⁴細(xì)胞/小鼠。給藥25日后進(jìn)行解剖，按照常法制作心臟梗死部分的切片。然后，使用上述抗ctn-1抗體、抗smα肌動(dòng)蛋白抗體或fitc-同工凝集素b4、以及兔源性igg的抗β-gal抗體和作為二次抗體的alexa594羊源性抗兔igg抗體，對(duì)該切片進(jìn)行免疫染色。其結(jié)果示于圖18。

如圖18所示，使用抗ctn-1抗體、抗smα肌動(dòng)蛋白抗體和fitc-同工凝集素b4時(shí)，與上述結(jié)果相同，在缺血心肌組織內(nèi)心肌細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞被染色。另外，使用β-gal抗體的時(shí)，也在缺血心肌組織內(nèi)出現(xiàn)染色區(qū)域。即，可見(jiàn)來(lái)源于骨髓的epc集聚于缺血心肌組織。另外，將用抗ctn-1抗體或fitc-同工凝集素b4染色所得的圖像與用抗β-gal抗體染色所得的圖像重疊時(shí)，染色部分相互重疊(箭頭部分)，意味著從骨髓集聚的epc分化成心肌細(xì)胞。另一方面，將用smα肌動(dòng)蛋白抗體染色所得的圖像與用β-gal抗體染色所得的圖像重疊時(shí)，染色部分幾乎互不重疊。

該結(jié)果表明，對(duì)心肌梗死小鼠給予攝取了內(nèi)含抑制素納米粒子的脂肪源性干細(xì)胞時(shí)，通過(guò)集聚于缺血性損傷心肌部分的脂肪源性干細(xì)胞釋放出抑制素，epc集聚到該缺血性損傷心肌部分，所集聚的epc促進(jìn)血管生成，并且分化成心肌細(xì)胞促進(jìn)缺血性損傷部分的治療。

綜上所述，本發(fā)明涉及的內(nèi)含抑制素納米粒子可增強(qiáng)干細(xì)胞的遷移性、增殖性和血管生成因子產(chǎn)生能力等功能，該功能增強(qiáng)干細(xì)胞集聚于梗死部分，在增殖的同時(shí)釋放出血管生成因子，從而促進(jìn)梗死部分的血管生成。進(jìn)而，該集聚并增殖的干細(xì)胞分化成心肌，從而促進(jìn)心肌的再生，其結(jié)果，顯示出優(yōu)異的心肌梗死等缺血性心臟病的治療效果。另外，該干細(xì)胞能夠?qū)⑺鶖z取的抑制素緩慢釋放，由此可得到抑制素本身的血管生成效果等抑制素所特有的各種效果，因此有益于以缺血性心臟病為代表的各種疾病的治療。進(jìn)而，通過(guò)從集聚于患部的干細(xì)胞釋放出的抑制素，可使體內(nèi)的干細(xì)胞、骨髓源性血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(epc)的集聚亢進(jìn)，其結(jié)果，在例如缺血性心臟病的情況下，能夠進(jìn)一步促進(jìn)梗死部分心肌的再生。另外，抑制素等化合物在單純給藥時(shí)，會(huì)隨著血流被運(yùn)送至患部，但在心肌梗死等缺血性心臟病中，血流受阻，難以正常到達(dá)患部，而本發(fā)明所述的抑制素被遷移性增強(qiáng)的干細(xì)胞攝取并運(yùn)送，因此即便血流受阻也能到達(dá)患部，即可形成良好的藥物傳遞系統(tǒng)，從而能夠減少應(yīng)給藥的細(xì)胞數(shù)。通過(guò)上述作用，本發(fā)明對(duì)心肌梗死等缺血性心臟病的治療可發(fā)揮極好的效果。

sequencelisting

<110>伊井正明,公益財(cái)團(tuán)法人先端醫(yī)療振興財(cái)團(tuán)

<120>用于增強(qiáng)干細(xì)胞功能的內(nèi)含抑制素納米粒子制劑、以及含有其的功能增強(qiáng)干細(xì)胞及其制備方法

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