抗金黃色葡萄球菌抗體利福霉素綴合物及其用途的制作方法

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本發(fā)明涉及與利福霉素型抗生素綴合的抗葡萄球菌抗體，以及所得抗體-抗生素綴合物在治療葡萄球菌感染中的用途。

發(fā)明背景

金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌是成功的人類共生體，其主要定殖于鼻孔和皮膚。金黃色葡萄球菌(s.aureus；sa)也可侵襲各種組織，導(dǎo)致危及生命的感染；它是全球范圍人類細(xì)菌感染的重要原因。最近出現(xiàn)的金黃色葡萄球菌菌株顯示增加的毒性和在其他健康個(gè)體中增強(qiáng)的引起疾病的能力。在過去幾十年中，由于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(mrsa)的出現(xiàn)和快速傳播，金黃色葡萄球菌的感染變得越來越難以治療，這種耐藥菌對(duì)所有已知的β-內(nèi)酰胺抗生素具有抗性(boucher,h.w.等人，(2009)clininfectdis48,1-12)。目前，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(mrsa)的最普遍和最致命的臨床菌株是usa300，其具有產(chǎn)生大量毒性因子并引起感染個(gè)體死亡的能力(chambers,hf和deleofr(2009)自然微生物學(xué)綜述(naturereviewsmicrobiology)7:629-641)。最嚴(yán)重的感染如心內(nèi)膜炎、骨髓炎、壞死性肺炎和敗血癥在細(xì)菌傳播到血液中之后發(fā)生(lowy,f.d.(1998)nengljmed339,520-532)。與金黃色葡萄球菌密切相關(guān)的表皮葡萄球菌通常與醫(yī)院獲得性的感染相關(guān)，并且代表內(nèi)置醫(yī)療器械最常見的感染源。

對(duì)于葡萄球菌粘附和成功定殖宿主組織而言，重要的是細(xì)胞壁蛋白家族，其特征在于在葡萄球菌中存在的粘附性a-結(jié)構(gòu)域附近的大量絲氨酸-天冬氨酸二肽(sdr)重復(fù)序列(fostertj,hookm(1998)微生物學(xué)進(jìn)展(trendsmicrobiol)6:484-488)。對(duì)粘附重要的這些蛋白質(zhì)包括團(tuán)集因子(clf)a和clfb(fostertj,見上文)。除了clfa和clfb之外，金黃色葡萄球菌還表達(dá)三種sdr蛋白sdrc、sdrd和sdre，它們?cè)诨蚪M中串聯(lián)排列。這些蛋白質(zhì)也被認(rèn)為參與組織定殖，并且其中任一種的消除降低了細(xì)菌的毒性(chengag等人(2009)fasebjournal23:3393-3404)。這個(gè)家族的另外三個(gè)成員srdf、sdrg和sdrh存在于大多數(shù)表皮葡萄球菌菌株中(mccreakw等人(2000)theserine-aspartaterepeat(sdr)proteinfamilyinstaphylococcusepidermidis.microbiology146(pt7):1535-1546)。在這些蛋白質(zhì)的每一個(gè)中，含有25-275個(gè)sd-二肽重復(fù)序列的sdr區(qū)域(seqidno:24)位于n-末端配體結(jié)合a-結(jié)構(gòu)域和c-末端lpxtg基序(seqidno:25)之間，其介導(dǎo)通過轉(zhuǎn)肽酶，即分選酶a錨定到細(xì)胞壁上。sdr-結(jié)構(gòu)域的功能仍然是未知的，但已經(jīng)提出，其充當(dāng)使這些蛋白質(zhì)的n末端配體結(jié)合位點(diǎn)暴露的細(xì)胞壁跨越結(jié)構(gòu)域(hartfordo,等人(1997)molmicrobiol25:1065-1076)。

發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的所有sdr蛋白的sdr結(jié)構(gòu)域被兩個(gè)新的糖基轉(zhuǎn)移酶sdga和sdgb高度糖基化，其以兩個(gè)步驟負(fù)責(zé)糖基化(hazenbos等人(2013)plospathogens9(10):1-18)。這些糖基化事件阻止宿主蛋白酶降解這些蛋白質(zhì)，從而保護(hù)細(xì)菌宿主組織相互作用。hazenbos等人(2013)還表明，sdgb介導(dǎo)的糖基化在人體中產(chǎn)生高度調(diào)理素化抗體的免疫顯性表位。這些抗體占總抗葡萄球菌igg反應(yīng)的很大比例。

侵襲性mrsa感染難以治療，死亡率約為20％，是美國(guó)傳染性疾病死亡的主要原因。因此，萬古霉素、利奈唑胺和達(dá)托霉素成為少數(shù)用于治療侵襲性mrsa感染的抗生素(boucher,h.,miller,l.g.&razonable,r.r.(2010)clininfectdis51suppl2,s183-197)。然而，在mrsa臨床菌株中，已經(jīng)報(bào)道了對(duì)萬古霉素降低的敏感性和對(duì)利奈唑胺和達(dá)托霉素的交叉耐藥性(nannini,e.,murray,b.e.&arias,c.a.(2010)curropinpharmacol10,516-521)。隨著時(shí)間的推移，克服抗性所需的萬古霉素劑量已經(jīng)上升至發(fā)生腎毒性的水平。因此，盡管有這些抗生素，侵襲性mrsa感染的死亡率和發(fā)病率仍然很高。

調(diào)查顯示，金黃色葡萄球菌能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)侵襲和存活，包括負(fù)責(zé)細(xì)菌清除的吞噬細(xì)胞(thwaites,g.e.&gant,v.(2011)natrevmicrobiol9,215-222)；rogers.d.e.,tompsett,r.(1952)j.exp.med95,209-230)；gresham,h.d.,等人(2000)jimmunol164,3713-3722)；kapral,f.a.&shayegani,m.g.(1959)jexpmed110,123-138；anwar,s.,等人(2009)clinexpimmunol157,216-224)；fraunholz,m.&sinha,b.(2012)frontcellinfectmicrobiol2,43)；garzoni,c.&kelley,w.l.(2011)embomolmed3,115-117)。在靜脈內(nèi)感染后幾分鐘內(nèi)，金黃色葡萄球菌被宿主吞噬細(xì)胞(主要是嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)攝取(rogers,d.e.(1956)jem103,713)。盡管大多數(shù)細(xì)菌被這些細(xì)胞有效地殺死，但血液中吞噬細(xì)胞內(nèi)的金黃色葡萄球菌的不完全清除，可以使這些被感染的細(xì)胞作為“特洛伊木馬”用于從初始感染部位傳播細(xì)菌。實(shí)際上，正常的嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)患者可能比那些減少的嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)患者更容易傳播疾病(thwaites,g.e.&gant,v.(2011)見上文)。一旦傳遞到組織，金黃色葡萄球菌可以侵襲各種非吞噬細(xì)胞類型，并且組織中的細(xì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌與慢性或復(fù)發(fā)性感染相關(guān)。此外，細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌暴露于次優(yōu)的抗生素濃度可能會(huì)促進(jìn)抗生素耐藥菌株的出現(xiàn)，從而使臨床問題更加突出。與這些觀察結(jié)果一致，用萬古霉素或達(dá)托霉素治療侵襲性mrsa感染的患者如菌血癥或心內(nèi)膜炎，與超過50％的失敗率相關(guān)(kullar,r.,davis,s.l.,levine,d.p.&rybak,m.j.，impactofvancomycinexposureonoutcomesinpatientswithmethicillin-resistantstaphylococcusaureusbacteremia:supportforconsensusguidelinessuggestedtargets.clinicalinfectiousdiseases:anofficialpublicationoftheinfectiousdiseasessocietyofamerica52,975-981(2011)；fowler,vg,jr.等人，daptomycinversusstandardtherapyforbacteremiaandendocarditiscausedbystaphylococcusaureus.thenewenglandjournalofmedicine355,653-665(2006)；yoon,yk,kim,j.y.,park,d.w.,sohn,j.w.和kim,m.j.，predictorsofpersistentmethicillin-resistantstaphylococcusaureusbacteraemiainpatientstreatedwithvancomycin.thejournalofantimicrobialchemotherapy65:1015-1018(2010))。因此，更成功的抗葡萄球菌治療應(yīng)包括清除細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌。

安莎霉素是一類抗生素，包括利福霉素、利福平(rifampin)、利福平(rifampicin)、利福布汀、利福噴汀、利福拉齊、abi-1657及其類似物，它們抑制細(xì)菌rna聚合酶，并且具有對(duì)革蘭氏陽性菌和選擇性的革蘭氏陰性菌的特殊效力(rothstein,d.m.等人(2003)expertopin.invest.drugs12(2):255-271；us7342011；us7271165)。

已經(jīng)報(bào)道了用于預(yù)防和治療金黃色葡萄球菌(包括mrsa)感染的免疫療法。us2011/0262477涉及細(xì)菌粘附蛋白eap、emp和adsa作為疫苗刺激針對(duì)mrsa的免疫應(yīng)答的應(yīng)用。wo2000071585描述了與特異性金黃色葡萄球菌菌株分離物反應(yīng)的分離的單克隆抗體。us20110059085a1提出了利用對(duì)一種或多種sa莢膜抗原特異性的igm抗體的基于抗體的策略，但沒有描述實(shí)際的抗體。

抗體-藥物綴合物(adc)也稱為免疫綴合物，是靶向的化學(xué)治療分子，其通過將有效的細(xì)胞毒性藥物靶向于表達(dá)抗原的腫瘤細(xì)胞，結(jié)合了抗體和細(xì)胞毒性藥物的理想特性(teicher,b.a.(2009)curr.cancerdrugtargets9:982-1004)，從而通過使效力最大化和使靶點(diǎn)外毒性最小化來增強(qiáng)治療指數(shù)(carter,p.j.和senterp.d.(2008)thecancerj.14(3):154-169；chari,r.v.(2008)acc.chem.res.41:98-107)。adc包含通過接頭單元與細(xì)胞毒性藥物部分共價(jià)連接的靶向抗體。當(dāng)未綴合的藥物的全身給藥可能引起對(duì)正常細(xì)胞和試圖清除的腫瘤細(xì)胞的不可接受的毒性水平時(shí)，免疫綴合物允許將藥物部分靶向遞送至腫瘤并在其中的細(xì)胞內(nèi)蓄積(polakisp.(2005)curr.opin.pharmacol.5:382-387)。

描述了通過用于治療敗血癥的抗生素結(jié)合目標(biāo)細(xì)菌表面的非特異性免疫球蛋白-抗生素綴合物(us5545721；us6660267)。描述了抗生素綴合的抗體，其具有對(duì)細(xì)菌抗原(例如sa莢膜多糖)特異性的抗原結(jié)合部分，但缺乏與細(xì)菌fc結(jié)合蛋白例如葡萄球菌蛋白a反應(yīng)的恒定區(qū)域(us7569677)。

鑒于mrsa對(duì)常規(guī)抗生素的令人震驚的抗藥率，以及侵襲性mrsa感染引起的死亡率和發(fā)病率，很需要治療金黃色葡萄球菌感染的新的治療藥物。本發(fā)明通過提供克服當(dāng)前治療組合物限制的組合物和方法以及提供從下面詳述中顯而易見的額外優(yōu)點(diǎn)而滿足了這一需求。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供了包括消除細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的獨(dú)特治療劑。本發(fā)明證實(shí)，當(dāng)常規(guī)抗生素如萬古霉素?zé)o效時(shí)，這種治療劑在體內(nèi)是有效的。

本發(fā)明提供稱為“抗體-抗生素綴合物”或“aac”的組合物，其包含通過共價(jià)連接與一種或多種利福霉素型抗生素部分綴合的抗體。

本發(fā)明的一個(gè)方面是抗體-抗生素綴合物化合物，其包含rf1抗體，所述rf1抗體通過蛋白酶可切割的非肽類接頭共價(jià)連接利福霉素型抗生素。

本發(fā)明的示例性實(shí)施方案是具有下式的抗體-抗生素綴合物：

ab-(pml-abx)p

其中：

ab是rf1抗體；

pml是具有下式的蛋白酶可切割的非肽類接頭：

-str-pm-y-

其中str是延伸單元；pm是擬肽單元，和y是間隔單元；

abx是利福霉素型抗生素；并且

p是從1到8的整數(shù)。

任何前述實(shí)施方案的抗體-抗生素綴合化合物可以包含本文所述的抗sdr抗體和特異性rf1抗體中的任何一種。這些rf1抗體結(jié)合金黃色葡萄球菌。在示例性的rf1抗體中，抗體是包含輕(l)鏈和重(h)鏈的單克隆抗體，l鏈包含cdrl1、cdrl2和cdrl3，h鏈包含cdrh1、cdrh2和cdrh3，其中cdrh1、cdrh2和cdrh3與cdrl1、cdrl2和cdrl3，分別包含每個(gè)抗體f1(seqidno.1-6)、rf1(seqidno.1-5,7)、rf1.v1(seqidno.1,18,3,4-6)的cdr的氨基酸序列，如表4a和4b所示。

在一些實(shí)施方案中，rf1抗體包含重鏈可變區(qū)(vh)，其中vh在選自seqidno.13的vh序列的vh區(qū)長(zhǎng)度上，包含至少95％的序列同一性?？贵w還可以包含l鏈可變區(qū)(vl)，其中vl在選自分別為抗體rf1和rf1.v6的seqidno.14和seqidno.15的vl序列的vl區(qū)域長(zhǎng)度上，包含至少95％的序列同一性。

在具體實(shí)施方案中，rf1抗體包含如下的l和h鏈對(duì)：包含seqidno.9序列的l鏈與包含seqidno.10序列的h鏈配對(duì)；包含seqidno.11序列的l鏈與包含seqidno.10序列的h鏈配對(duì)；包含seqidno.11序列的l鏈與包含seqidno.12序列的h鏈配對(duì)。

在任何前述實(shí)施方案中，抗體可以是缺乏fc區(qū)的抗原結(jié)合片段。在一些實(shí)施方案中，抗體是f(ab)或f(ab')2。在一些實(shí)施方案中，抗體還包含重鏈恒定區(qū)和/或輕鏈恒定區(qū)，其中重鏈恒定區(qū)和/或輕鏈恒定區(qū)包含被半胱氨酸殘基取代的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方案中，重鏈恒定區(qū)包含氨基酸取代a118c和/或s400c，和/或輕鏈恒定區(qū)包含氨基酸取代v205c，其中所述編號(hào)系統(tǒng)根據(jù)eu編號(hào)。

在上述任何抗體的一些實(shí)施方案中，抗體不是igm同種型。在上述任何抗體的一些實(shí)施方案中，抗體是igg(例如，igg1、igg2、igg3、igg4)、ige、igd或iga(例如，iga1或iga2)同種型。

本發(fā)明的一個(gè)示例性實(shí)施方案是包含抗體-抗生素綴合化合物和藥學(xué)上可接受的載體、助流劑、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。

本發(fā)明的另一方面是治療細(xì)菌感染的方法，其包括向感染的患者施用治療有效量的任何前述實(shí)施方案的抗體-抗生素綴合物。本發(fā)明的另一方面是治療患者中葡萄球菌感染的方法，包括向患者施用治療有效量的本發(fā)明的抗體-抗生素綴合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，患者是人。在一個(gè)實(shí)施方案中，患者感染了金黃色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌感染。在一些實(shí)施方案中，患者被診斷患有金黃色葡萄球菌感染。在一些實(shí)施方案中，治療細(xì)菌感染包括減少細(xì)菌負(fù)荷或計(jì)數(shù)。

本發(fā)明的另一方面是在感染患者中治療葡萄球菌感染的方法，包括向患者施用治療有效量的前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的抗體-抗生素綴合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，患者是人。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)菌感染是金黃色葡萄球菌感染。在一些實(shí)施方案中，患者被診斷患有金黃色葡萄球菌感染。在一些實(shí)施方案中，治療細(xì)菌感染包括減少細(xì)菌負(fù)荷或計(jì)數(shù)。

在任何前述治療方法的一個(gè)實(shí)施方案中，向包括金黃色葡萄球菌在內(nèi)的細(xì)菌感染導(dǎo)致菌血癥的患者施用。在具體實(shí)施方案中，該方法用于治療葡萄球菌性心內(nèi)膜炎或骨髓炎。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體-抗生素綴合化合物以約50mg/kg至100mg/kg的劑量施用于感染的患者。

還提供了在金黃色葡萄球菌感染的患者細(xì)胞中殺死細(xì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌而不殺死宿主細(xì)胞的方法，其通過施用任何上述實(shí)施方案的rf1抗生素綴合化合物。通過使耐藥株(persister)細(xì)菌與任何前述實(shí)施方案的aac接觸，提供了另一種用于在體內(nèi)殺死耐藥株葡萄球菌細(xì)菌細(xì)胞(例如金黃色葡萄球菌)的方法。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述治療方法還包括施用第二治療劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二治療劑是抗生素，其包括普遍針對(duì)金黃色葡萄球菌或特別是mrsa的抗生素。

在一個(gè)實(shí)施方案中，與本發(fā)明的抗體-抗生素綴合化合物組合施用的第二抗生素選自以下結(jié)構(gòu)類別：(i)氨基糖苷類；(ii)β-內(nèi)酰胺類；(iii)大環(huán)內(nèi)酯/環(huán)肽類；(iv)四環(huán)素類；(v)氟代喹啉/氟喹諾酮類；(vi)和噁唑烷酮。

在一個(gè)實(shí)施方案中，與本發(fā)明的抗體-抗生素綴合化合物組合施用的第二抗生素選自克林霉素、新生霉素、瑞他帕林(retapamulin)、達(dá)托霉素、gsk-2140944、cg-400549、西他沙星、替考拉寧、三氯生、萘啶酮(napthyridone)、雷得唑來(radezolid)、多柔比星、氨芐西林、萬古霉素、亞胺培南、多利培南、吉西他濱、達(dá)巴萬星(dalbavancin)和阿奇霉素。

在本文的一些實(shí)施方案中，感染患者中的細(xì)菌負(fù)荷在治療后已經(jīng)降低到不可檢測(cè)的水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，與治療前的陽性血培養(yǎng)物相比，患者的血培養(yǎng)物在治療后是陰性的。在本文的一些實(shí)施方案中，個(gè)體中的細(xì)菌耐藥性是不可檢測(cè)的或低的。在本文的一些實(shí)施方案中，患者對(duì)甲氧西林或萬古霉素的治療無反應(yīng)。

本發(fā)明的示例性實(shí)施方案是制備抗體-抗生素綴合物的方法，包含將利福霉素型抗生素與rf1抗體綴合。

本發(fā)明的一個(gè)示例性實(shí)施方案是用于治療細(xì)菌感染的藥盒，其包含：

a)藥物組合物，包含抗體-抗生素綴合化合物和藥學(xué)上可接受的載體、助流劑、稀釋劑或賦形劑；和

b)使用說明。

本發(fā)明的一個(gè)方面是具有式ii的抗生素-接頭中間體：

其中：

虛線表示任選的鍵；

r是h、c1-c12烷基或c(o)ch3；

r¹是oh；

r²是ch＝n-(雜環(huán)基)，其中所述雜環(huán)基任選地被一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自c(o)ch3、c1-c12烷基、c1-c12雜芳基、c2-c20雜環(huán)基、c6-c20芳基和c3-c12碳環(huán)基的基團(tuán)取代；

或r¹和r²形成五元或六元稠合雜芳基或雜環(huán)基，并且任選地形成螺或稠合的六元雜芳基、雜環(huán)基、芳基或碳環(huán)基環(huán)，其中所述螺或稠合的六元雜芳基、雜環(huán)基、芳基或碳環(huán)基環(huán)任選地被h、f、cl、br、i、c1-c12烷基或oh取代；

pml是連接到r²或由r¹和r²形成的稠合雜芳基或雜環(huán)基的蛋白酶可切割的非肽類接頭；并具有下式：

-str-pm-y-

其中str是延伸單元；pm是擬肽單元，和y是間隔單元；并且

x是選自馬來酰亞胺、硫醇、氨基、溴化物、溴乙酰氨基、碘乙酰氨基、對(duì)甲苯磺酸酯、碘化物、羥基、羧基、吡啶基二硫化物和n-羥基琥珀酰亞胺的反應(yīng)性官能團(tuán)。

應(yīng)當(dāng)理解，本文描述的各種實(shí)施方案的一個(gè)、一些或全部特性可以組合以形成本發(fā)明的其他實(shí)施方案。本發(fā)明的這些和其它方面對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是很明顯的。

附圖說明

圖1a-1f：在體內(nèi)和體外，mrsa的細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存物被保護(hù)免于萬古霉素殺死。圖1a顯示了產(chǎn)生游離細(xì)菌(浮游)與細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的示意圖。通過靜脈注射大約相同劑量的活的游離細(xì)菌或細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌感染四組小鼠，并且選擇的組在感染后立即用萬古霉素處理，然后每天一次(參見實(shí)施例2)。圖1b和圖1c分別顯示感染后4天的感染小鼠的腎臟和腦部細(xì)菌負(fù)荷。虛線表示測(cè)定的檢測(cè)限。圖1d顯示當(dāng)在單層感染細(xì)胞上培養(yǎng)時(shí)，mrsa被保護(hù)免于萬古霉素殺死。(nd＝未檢測(cè)到)。圖1e和圖1f顯示當(dāng)在單層感染細(xì)胞上培養(yǎng)時(shí)，mrsa能夠在萬古霉素存在下生長(zhǎng)。將mrsa(游離細(xì)菌)接種在培養(yǎng)基、培養(yǎng)基+萬古霉素、或培養(yǎng)基+萬古霉素并接種在單層mg63成骨細(xì)胞(圖1e)或人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(hbmec,圖1f)中。細(xì)胞外細(xì)菌(游離細(xì)菌)在僅有培養(yǎng)基時(shí)生長(zhǎng)良好，但被萬古霉素殺死。在含有單層哺乳動(dòng)物細(xì)胞(細(xì)胞內(nèi)+萬古霉素)的孔中，一部分細(xì)菌在感染后的前8個(gè)小時(shí)被保護(hù)免于萬古霉素殺死，并能在24小時(shí)內(nèi)在細(xì)胞內(nèi)的區(qū)室內(nèi)擴(kuò)張。誤差線顯示一式三份的孔的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

圖2顯示了抗體抗生素綴合物(aac)的概念。在一個(gè)實(shí)例中，aac由針對(duì)金黃色葡萄球菌表面上的表位的抗體組成，其通過溶酶體蛋白酶切割的接頭連接到有效的利福霉素型抗生素(例如rifalog)上。

圖3顯示抗體-抗生素綴合物(aac)的藥物活化的可能機(jī)制。aac通過抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(fab)與細(xì)胞外細(xì)菌結(jié)合，并通過fc介導(dǎo)的吞噬作用促進(jìn)調(diào)理化細(xì)菌的攝取。接頭被溶酶體蛋白酶例如組織蛋白酶b切割。在切割接頭之后，接頭被水解，在吞噬溶酶體內(nèi)釋放游離抗生素。游離的抗生素殺死了調(diào)理化細(xì)胞和被吞噬的細(xì)菌，以及任何以前存在于同一區(qū)室中的內(nèi)化的細(xì)菌。

圖4a和4b顯示絲氨酸-天冬氨酸(sdr)蛋白的方面。圖4a顯示通過來自金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的質(zhì)譜法揭示的sdr蛋白的比對(duì)。sdr區(qū)域用陰影線表示。由于在金黃色葡萄球菌上有多種sdr蛋白，并且每個(gè)蛋白質(zhì)有多個(gè)表位，所以rf1表位以豐度表達(dá)。圖4a公開了seqidno:27的“sdsdsdsd”。圖4b是顯示通過sdga和sdgb的sdr蛋白逐步糖基化的模型。首先，sdgb將glcnac部分附加到sdr蛋白上的sd區(qū)域，隨后通過sdga進(jìn)行額外的glcnac修飾。對(duì)于mabrf1的表位包括sdgb依賴性glcnac部分。數(shù)據(jù)表明rf1結(jié)合glcnac和sd骨架的一部分。圖4b公開了seqidno:28的“sdsdsd”。

圖5a、5b和5c顯示mabrf1表現(xiàn)出對(duì)金黃色葡萄球菌的穩(wěn)定結(jié)合和殺傷作用。(圖a-c)用huigg1mabsrf1(正方形)、4675抗-clfa(三角形)或抗皰疹病毒gd(圓圈)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行預(yù)調(diào)理。(圖5a)：通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估m(xù)ab與wt(usa300-δspa)細(xì)菌的結(jié)合，并表示為平均熒光強(qiáng)度(mfi)。(圖5b)：將cfse標(biāo)記的預(yù)調(diào)理的wt(usa300-δspa)細(xì)菌與人pmn一起孵育。通過流式細(xì)胞術(shù)門控cd11b陽性細(xì)胞后，細(xì)菌攝取量表示為cfse陽性pmn的百分比％。(圖5c)：將預(yù)調(diào)理的wt(usa300-δspa)細(xì)菌與pmn一起孵育以評(píng)估細(xì)菌殺傷。每ml活菌cfu的數(shù)目是至少三個(gè)實(shí)驗(yàn)的代表。

圖6顯示了來自各種感染組織的rf1與金黃色葡萄球菌結(jié)合的流式細(xì)胞術(shù)分析。均質(zhì)化的組織用mabrf1(x軸)和抗肽聚糖mab702雙重染色，以將細(xì)菌與組織碎片(y軸)(左圖；箭頭所示的門)區(qū)分開，然后門控細(xì)菌以產(chǎn)生直方圖圖形(另見，hazenbos等人(2013)plospathogens9(10):1-18，圖1d)。

圖7顯示通過流式細(xì)胞術(shù)將rf1與各種葡萄球菌和非葡萄球菌的革蘭氏陽性菌種結(jié)合(另見，hazenbos等人(2013)plospathogens9(10):1-18，圖1e)。

圖8顯示了選擇強(qiáng)效的利福霉素型抗生素(rifalog)二甲基pipbor，因?yàn)槠錃⑺婪菑?fù)制性mrsa的能力。

圖9：生長(zhǎng)抑制測(cè)定證明完整的tac(一種形式的aac)不會(huì)殺死浮游細(xì)菌，除非通過用組織蛋白酶b處理而釋放抗生素。將tac在僅有緩沖液(空心圓圈)中孵育或用組織蛋白酶b處理(實(shí)心圓圈)。完整的tac在過夜孵育后不能防止細(xì)菌生長(zhǎng)。用組織蛋白酶b預(yù)處理tac釋放了足夠的抗生素活性，以防止細(xì)菌在6ug/mltac中生長(zhǎng)，其預(yù)計(jì)含有0.006μg/ml的抗生素。

圖10顯示了rf1-aac在體外巨噬細(xì)胞測(cè)定中的功效，如實(shí)施例19所述。

圖11a和11b顯示了如實(shí)施例20所述的rf1-aac在體內(nèi)的功效。與裸抗體相比，用rf1-aac治療金黃色葡萄球菌感染的小鼠，大大降低或消除了感染器官中的細(xì)菌計(jì)數(shù)。圖11a顯示用含有每個(gè)抗體2個(gè)抗生素分子的aac(aar2)治療，腎臟中的細(xì)菌負(fù)荷降低約30倍，并且用含有每個(gè)抗體4個(gè)抗生素分子的aac(aar4)治療，細(xì)菌負(fù)荷降低超過30,000倍。圖11b顯示用aacaar2治療使心臟中的細(xì)菌負(fù)荷降低約70倍，其中8只小鼠中有6只在心臟中具有檢測(cè)不到的細(xì)菌水平；用aacaar4治療徹底根除了心臟感染，導(dǎo)致8只小鼠中全部8只都具有檢測(cè)不到的細(xì)菌水平。

本發(fā)明的實(shí)施方案詳述

現(xiàn)在將詳細(xì)參考本發(fā)明的某些實(shí)施方案，其實(shí)例在所附的結(jié)構(gòu)和分子式中示出。雖然將結(jié)合列舉的實(shí)施方案，包括方法、材料和實(shí)例來描述本發(fā)明，但是這樣的描述是非限制性的，并且本發(fā)明旨在覆蓋所有替代、修改和等同物，無論它們是一般已知的，還是并入本文。如果一個(gè)或多個(gè)并入的文獻(xiàn)、專利和類似材料與本申請(qǐng)不同或相矛盾，包括但不限于定義的術(shù)語、術(shù)語使用、所描述的技術(shù)等，以本申請(qǐng)為準(zhǔn)。除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到可以用于本發(fā)明的實(shí)踐中的與本文所述類似或等同的許多方法和材料。本發(fā)明在任何情況下都不限于所述的方法和材料。

本文提及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其它參考文獻(xiàn)通過引用整體并入本文。

i.一般技術(shù)

本文描述或參考的技術(shù)和方法，通常被本領(lǐng)域技術(shù)人員很好的理解和使用常規(guī)方法普遍采用，例如，下面描述的廣泛使用的方法：sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)第三版(2001)冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約(molecularcloning:alaboratorymanual3dedition(2001)coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.)；分子生物學(xué)現(xiàn)代方法(currentprotocolsinmolecularbiology)(f.m.ausubel等人編輯,(2003))；酶學(xué)系列方法(theseriesmethodsinenzymology)(academicpress,inc.)；pcr2：實(shí)用方法(pcr2:apracticalapproach)(m.j.macpherson,b.d.hames和g.r.taylor編輯(1995)),harlow和lane編輯(1988)抗體、實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)、和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)(antibodies,alaboratorymanual,andanimalcellculture)(r.i.freshney編輯(1987))；寡核苷酸合成(oligonucleotidesynthesis)(m.j.gait編輯，1984)；分子生物學(xué)方法(methodsinmolecularbiology),humanapress；細(xì)胞生物學(xué)：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(cellbiology:alaboratorynotebook)(j.e.cellis編輯，1998)academicpress；動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)(animalcellculture)(r.i.freshney)編輯，1987)；細(xì)胞和組織培養(yǎng)介紹(introductiontocellandtissueculture)(j.p.mather和p.e.roberts,1998)plenumpress；細(xì)胞和組織培養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)室方法(cellandtissueculture:laboratoryprocedures)(a.doyle,j.b.griffiths,和d.g.newell編輯,1993-8)j.wiley和sons；實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)(handbookofexperimentalimmunology)(d.m.weir和c.c.blackwell編輯)；哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移載體(genetransfervectorsformammaliancells)(j.m.miller和m.p.calos編輯,1987)；pcr：聚合酶鏈?zhǔn)戏磻?yīng)(pcr:thepolymerasechainreaction),(mullis等人編輯,1994)；現(xiàn)代免疫學(xué)方法(currentprotocolsinimmunology)(j.e.coligan等人編輯,1991)；分子生物學(xué)簡(jiǎn)要方法(shortprotocolsinmolecularbiology)(wiley和sons,1999)；免疫學(xué)(immunobiology)(c.a.janeway和p.travers,1997)；抗體(antibodies)(p.finch,1997)；抗生素：實(shí)用方法(antibodies:apracticalapproach)(d.catty.編輯，irlpress,1988-1989)；單克隆抗體：實(shí)用方法(monoclonalantibodies:apracticalapproach)(p.shepherd和c.dean編輯，牛津大學(xué)出版社(oxforduniversitypress),2000)；抗體應(yīng)用：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(usingantibodies:alaboratorymanual)(e.harlow和d.lane,冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(coldspringharborlaboratorypress),1999)；抗體(theantibodies)(m.zanetti和j.d.capra編輯,harwoodacademicpublishers,1995)；和癌癥：腫瘤學(xué)原理與實(shí)踐(cancer:principlesandpracticeofoncology)(v.t.devita等人編輯，j.b.lippincottcompany,1993)。

本申請(qǐng)中使用的術(shù)語是基于iupac系統(tǒng)命名法，除非另有說明。除非另有定義，本文所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義，并且符合：singleton等人(1994)微生物和分子生物學(xué)詞典，第二版(microbiologyandmolecularbiologydictionary,2nded.),j.wiley&sons,newyork,ny；和janeway,c.,travers,p.,walport,m.,shlomchik(2001)免疫學(xué)，第五版(immunobiology,5thed.),garlandpublishing,newyork。

ii.定義

金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)在本文也簡(jiǎn)稱為stapha或s.aureus。同樣，表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermidis)在本文也稱為staphe或s.epidermidis。

“抗體抗生素綴合物”或aac是由通過接頭與抗生素化學(xué)連接的抗體組成的化合物?？贵w結(jié)合細(xì)菌表面上的抗原或表位，例如細(xì)菌細(xì)胞壁組分。如本發(fā)明所用，接頭是蛋白酶可切割的非肽類接頭，其被設(shè)計(jì)為被蛋白酶切割，包括組織蛋白酶b，其是大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型中發(fā)現(xiàn)的溶酶體蛋白酶(dubowchik等人(2002)bioconj.chem.13:855-869)。具有3個(gè)組分的aac圖描述于圖2中?！皌hiomab^tm抗生素綴合物”或“tac”是aac的一種形式，其中抗體通過一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸與接頭-抗生素單元化學(xué)綴合，所述半胱氨酸通常是在抗體的特定位點(diǎn)被重組操作到抗體中的半胱氨酸，以不干擾抗原結(jié)合功能。

當(dāng)指示取代基的數(shù)目時(shí)，術(shù)語“一個(gè)或多個(gè)”是指從一個(gè)取代基到最高可能取代數(shù)量的范圍，即，通過取代基替換一個(gè)氫直到替換所有氫。術(shù)語“取代基”表示替換母體分子上的氫原子的一個(gè)原子或一組原子。術(shù)語“取代的”表示指定的基團(tuán)具有一個(gè)或多個(gè)取代基。當(dāng)任何基團(tuán)可以攜帶多個(gè)取代基且提供多種可能的取代基時(shí)，取代基獨(dú)立地選擇并且不必相同。術(shù)語“未取代的”是指指定的基團(tuán)不含取代基。術(shù)語“任選取代的”是指指定基團(tuán)是未取代的或被一個(gè)或多個(gè)取代基取代，其獨(dú)立地選自可能的取代基的組。當(dāng)指示取代基的數(shù)目時(shí)，術(shù)語“一個(gè)或多個(gè)”是指從一個(gè)取代基到最高可能的取代數(shù)量，即通過取代基替換一個(gè)氫直到替換所有氫。

術(shù)語“抗生素”(abx或abx)包括在給藥濃度和給藥間隔下特異性抑制微生物生長(zhǎng)或殺死微生物例如細(xì)菌、但是對(duì)宿主是非致死性的任何分子。在具體方面，抗生素在給藥濃度和給藥間隔下對(duì)宿主無毒性。對(duì)細(xì)菌有效的抗生素可以廣泛地分類為殺菌(即直接殺死)或抑菌(即防止分裂)?？辜?xì)菌抗生素可進(jìn)一步分類為窄譜或廣譜。與窄譜抗生素相反，廣譜抗生素對(duì)于廣泛的細(xì)菌是有效的，包括革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌，而窄譜抗生素對(duì)于較小范圍或特定的細(xì)菌家族有效?？股氐睦影ǎ?i)氨基糖苷類，例如阿米卡星、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、鏈霉素、妥布霉素、巴龍霉素，(ii)安莎霉素類，例如格爾德霉素、除莠霉素，(iii)碳頭孢烯類，例如氯碳頭孢，(iv)碳青霉烯類，例如厄他培南、多利培南、亞胺培南/西司他丁、美羅培南，(v)頭孢菌素類(第一代)，例如頭孢羥氨芐、頭孢唑啉、頭孢噻吩、頭孢氨芐，(vi)頭孢菌素類(第二代)，例如頭孢克洛、頭孢羥唑、頭孢西丁、頭孢丙烯、頭孢呋辛，(vi)頭孢菌素類(第三代)，例如頭孢克肟、頭孢地尼、頭孢托侖、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢泊肟、頭孢他啶、頭孢布烯、頭孢唑肟、頭孢曲松，(vii)頭孢菌素類(第四代)，例如頭孢吡肟，(viii)頭孢菌素類(第五代)，例如頭孢吡普(ceftobiprole)，(ix)糖肽類，例如替考拉寧、萬古霉素，(x)大環(huán)內(nèi)酯類，例如阿奇霉素、克拉霉素、地紅霉素、紅霉素、羅紅霉素、醋竹桃霉素、泰利霉素、壯觀霉素，(xi)內(nèi)酰胺類，例如氨曲南，(xii)青霉素類，例如阿莫西林、氨芐西林、阿洛西林、羧芐西林、氯唑西林、雙氯西林、氟氯西林、美洛西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素、哌拉西林、替卡西林，(xiii)抗生素多肽類，例如桿菌肽、粘菌素、多粘菌素b，(xiv)喹諾酮類，例如環(huán)丙沙星、依諾沙星、加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星，(xv)磺酰胺類，例如磺胺米隆、偶氮磺胺、磺胺乙酰胺、磺胺甲二唑、磺胺、柳氮磺吡啶、磺胺異噁唑、甲氧芐啶、甲氧芐啶-磺胺甲噁唑(tmp-smx)，(xvi)四環(huán)素類，例如地美環(huán)素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素、土霉素、四環(huán)素，和(xvii)其它如胂凡納明、氯霉素、克林霉素、林可霉素、乙胺丁醇、磷霉素、夫西地酸、呋喃唑酮、異煙肼、利奈唑胺、甲硝唑、莫匹羅星、呋喃妥因、平板霉素、吡嗪酰胺、奎奴普丁/達(dá)福普汀、利福平(rifampin)/利福平(rifampicin)或替硝唑。

術(shù)語“耐甲氧西林金黃色葡萄球菌”(mrsa)也稱為多藥耐藥性金黃色葡萄球菌或耐苯唑西林金黃色葡萄球菌(orsa)，是指對(duì)β-內(nèi)酰胺抗生素有抗性的金黃色葡萄球菌菌株，其中包括青霉素(如甲氧西林、雙氯西林、萘夫西林、苯唑西林等)和頭孢菌素類?！凹籽跷髁置舾行徒瘘S色葡萄球菌”(mssa)是指對(duì)β-內(nèi)酰胺抗生素敏感的金黃色葡萄球菌的任何菌株。

術(shù)語“最小抑菌濃度”(mic)是指在過夜孵育后，抑制微生物的可見生長(zhǎng)的抗微生物劑的最低濃度。測(cè)定mic的試驗(yàn)是已知的。一種方法如下面的實(shí)施例部分所述。

術(shù)語“抗金黃色葡萄球菌抗體”和“與金黃色葡萄球菌結(jié)合的抗體”是指能夠以足夠的親和力結(jié)合金黃色葡萄球菌(“s.aureus”)上的抗原的抗體，使得抗體可用作靶向于金黃色葡萄球菌的診斷和/或治療劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，例如通過放射免疫測(cè)定(ria)測(cè)量，抗金黃色葡萄球菌抗體與非相關(guān)的非金黃色葡萄球菌蛋白的結(jié)合程度不超過抗體與mrsa結(jié)合程度的約10％。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合金黃色葡萄球菌的抗體具有≤1μm、≤100nm、≤10nm、≤5nm、≤4nm、≤3nm、≤2nm、≤1nm、≤0.1nm、≤0.01nm或≤0.001nm(例如10^-8m或更小，例如10^-8m至10^-13m，例如10^-9m至10^-13m)的解離常數(shù)(kd)。在某些實(shí)施方案中，抗金黃色葡萄球菌抗體結(jié)合來自不同物種的葡萄球菌中保守的金黃色葡萄球菌的表位。本文中的抗葡萄球菌抗體是指結(jié)合除金黃色葡萄球菌外至少一種葡萄球菌物種的抗體。

“sdr”是指絲氨酸-天冬氨酸重復(fù)序列；sdr存在于細(xì)胞壁蛋白家族中，其特征在于葡萄球菌中存在的粘附性a-結(jié)構(gòu)域相鄰的大量絲氨酸-天冬氨酸二肽重復(fù)序列(fostertj,hookm(1998)trendsmicrobiol6:484-488)。參與粘附的蛋白質(zhì)包括凝集因子(clf)a和clfb。除了clfa和clfb之外，金黃色葡萄球菌還表達(dá)了三種sdr蛋白，sdrc、sdrd和sdre，該家族的另外三個(gè)成員srdf、sdrg和sdrh存在于大多數(shù)表皮葡萄球菌菌株中(mccreakw等人(2000)絲氨酸天冬氨酸重復(fù)(sdr)蛋白家族在表皮葡萄球菌中的表達(dá)。微生物學(xué)(theserine-aspartaterepeat(sdr)proteinfamilyinstaphylococcusepidermidis.microbiology)146(pt7):1535-1546)。在這些蛋白質(zhì)的每一個(gè)中，含有25-275個(gè)sd-二肽重復(fù)序列的sdr區(qū)域(seqidno:24)位于n-末端配體結(jié)合a結(jié)構(gòu)域和c-末端lpxtg-基序(seqidno:25)之間。

稱為“f1”的抗體具有如us8,617,556的圖1所示的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列，其全部?jī)?nèi)容通過引用并入本文。具體地講，負(fù)責(zé)f1的抗原結(jié)合性質(zhì)的f1的cdr序列也在圖1顯示?？贵wf1完全是人的，能夠特異性結(jié)合葡萄球菌屬物種如金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌。重要的是，抗體f1能夠在體內(nèi)和體外結(jié)合整個(gè)細(xì)菌。此外，抗體f1能夠結(jié)合已經(jīng)在例如動(dòng)物的感染組織中生長(zhǎng)的細(xì)菌。重組產(chǎn)生的f1也稱為“rf1”。rf1(和f1)抗體是抗sdr單克隆抗體。對(duì)于mabrf1的表位包括sdgb依賴性glcnac部分。數(shù)據(jù)表明rf1結(jié)合glcnac和sd骨架的一部分。本文所用的“rf1抗體”包括f1抗體、rf1抗體以及相對(duì)于rf1的含有氨基酸改變的rf1所有變體。rf1和變體抗體的氨基酸序列提供如下。

本文中的術(shù)語“抗體”以最廣泛的含義使用，并且具體涵蓋單克隆抗體、多克隆抗體、二聚體、多聚體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及其抗原結(jié)合的抗體片段(miller等人(2003)j.immunology170:4854-4861)。抗體可以是鼠、人、人源化、嵌合或衍生自其他物種。抗體是由能夠識(shí)別和結(jié)合特異性抗原的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)(janeway,c.,travers,p.,walport,m.,shlomchik(2001)immunobiology,第五版,garlandpublishing,newyork)。靶抗原通常具有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，也稱為表位，由多個(gè)抗體上的cdr識(shí)別。特異性結(jié)合不同表位的每種抗體具有不同的結(jié)構(gòu)。因此，一種抗原可被多于一種相應(yīng)的抗體識(shí)別和結(jié)合?？贵w包括全長(zhǎng)免疫球蛋白分子或全長(zhǎng)免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子，其免疫特異性地結(jié)合關(guān)注的靶點(diǎn)的抗原或其部分，這樣的靶點(diǎn)包括但不限于癌細(xì)胞或產(chǎn)生與自身免疫疾病相關(guān)的自身免疫抗體的細(xì)胞、感染的細(xì)胞、或微生物如細(xì)菌。本文公開的免疫球蛋白(ig)可以是除igm以外的任何同種型(例如igg、ige、igd和iga)和亞類(例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)。免疫球蛋白可以來自任何物種。在一方面，ig是人、鼠或兔來源的。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，ig是人來源的。

抗體的“類”指由其重鏈擁有的恒定結(jié)構(gòu)域或恒定區(qū)的類型。存在五個(gè)主要類別的抗體：iga、igd、ige、igg和igm，并且這些類別中的幾種可以進(jìn)一步劃分成亞類(同種型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。對(duì)應(yīng)于不同類別免疫球蛋白的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別稱作α、δ、ε、γ和μ。

“天然抗體”是指具有不同結(jié)構(gòu)的天然存在的免疫球蛋白分子。舉例來說，天然igg抗體為約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白，由二硫鍵鍵合的兩個(gè)相同輕鏈和兩個(gè)相同重鏈構(gòu)成。自n末端至c末端，各重鏈具有可變區(qū)(vh)，還被稱為可變重結(jié)構(gòu)域或重鏈可變結(jié)構(gòu)域，隨后為三個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域(ch1、ch2及ch3)。類似地，自n末端至c末端，各輕鏈具有可變區(qū)(vl)，還被稱為可變輕結(jié)構(gòu)域或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，隨后為恒定輕(cl)結(jié)構(gòu)域?？贵w的輕鏈可基于其恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列而指定為稱為κ(κ)和λ(λ)的兩種類型之一。

術(shù)語“全長(zhǎng)抗體”、“完整抗體”和“全抗體”在本文中可互換地用于指具有與天然抗體結(jié)構(gòu)基本相似的抗體，或具有包含本文定義的fc區(qū)的重鏈的抗體。

抗體的“抗原結(jié)合片段”是指非完整抗體的分子，其包含完整抗體的一部分，能結(jié)合與完整抗體結(jié)合的抗原?？贵w片段的實(shí)例包括但不限于fv、fab、fab'、fab'-sh、f(ab')2；雙體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scfv)；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。

如本文中所用的術(shù)語“單克隆抗體”是指從基本上同質(zhì)的抗體群體獲得的抗體，即，組成群體的單個(gè)抗體是相同的和/或結(jié)合相同的表位，除了可能的變體抗體之外，例如，含有天然發(fā)生的突變或在產(chǎn)生單克隆抗體制備物期間出現(xiàn)(例如，糖基化的天然變異)，這類變體通常以微小的量存在。igg1抗體的一個(gè)這樣的可能變體是重鏈恒定區(qū)的c末端賴氨酸(k)的切割。與通常包括針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物不同，單克隆抗體制備物的每個(gè)單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一決定簇。因此，修飾語“單克隆的”指示該抗體的特征為從基本上同質(zhì)的抗體群體獲得，并且不得解釋為要求通過任何特定方法產(chǎn)生該抗體。例如，可以通過多種技術(shù)產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體，所述技術(shù)包括但不限于雜交瘤方法、重組dna方法、噬菌體展示方法和利用含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，在本文中描述了用于產(chǎn)生單克隆抗體的這類方法和其他示例性方法。除了它們的特異性之外，單克隆抗體是有利的，因?yàn)樗鼈兛梢栽诓槐黄渌贵w污染的情況下合成。

術(shù)語“嵌合抗體”是指其中一部分重鏈和/或輕鏈衍生自特定來源或物種而重鏈和/或輕鏈的其余部分衍生自不同來源或物種的抗體。

“人抗體”是這樣一種抗體，其擁有對(duì)應(yīng)于人或人細(xì)胞產(chǎn)生的或衍生自利用人抗體庫(kù)或其他編碼人抗體的序列的非人來源的抗體的氨基酸序列。人抗體的這種定義特別排除包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。

“人源化抗體”指包含來自非人hvr的氨基酸殘基和來自人fr的氨基酸殘基的嵌合抗體。在某些實(shí)施方案中，人源化抗體將包含至少1個(gè)、并且通常2個(gè)可變結(jié)構(gòu)域中的基本上全部，其中hvr(例如，cdr)中的全部或基本上全部與非人抗體中的那些對(duì)應(yīng)，并且fr中的全部或基本上全部與人抗體中的那些對(duì)應(yīng)。人源化抗體任選地可以包含從人抗體衍生的抗體恒定區(qū)的至少一部分?？贵w(例如，非人抗體)的“人源化形式”指已經(jīng)進(jìn)行過人源化的抗體。

術(shù)語“可變區(qū)”或“可變域”是指抗體的重或輕鏈中牽涉抗體結(jié)合抗原的結(jié)構(gòu)域。天然抗體的重鏈和輕鏈可變域(分別為vh和vl)一般具有類似的結(jié)構(gòu)，其中每個(gè)域包含4個(gè)保守的框架區(qū)(fr)和3個(gè)高變區(qū)(hvr)。(參見，例如，kindt等人kubyimmunology,第6版,w.h.freeman和co.,第91頁(2007))。單個(gè)vh或vl域可足以賦予抗原結(jié)合特異性。此外，可以分別使用來自結(jié)合抗原的抗體的vh或vl域以篩選互補(bǔ)vl或vh域的文庫(kù)，從而分離結(jié)合特定抗原的抗體。參見，例如portolano等人j.immunol.150:880-887(1993)；clarkson等人，nature352:624-628(1991)。

在本文中術(shù)語“高變區(qū)”，“hvr”或“hv”是指抗體可變區(qū)的區(qū)域，其在序列上是高變的(“互補(bǔ)決定區(qū)”或“cdr”)和/或形成結(jié)構(gòu)上定義的環(huán)和/或含有抗原接觸殘基(“抗原接觸”)。通常，抗體包含六個(gè)hvr；三個(gè)在vh(h1、h2、h3)中，三個(gè)在vl(l1、l2、l3)中。在天然抗體中，h3和l3顯示了六個(gè)hvr中的最大多樣性，特別是h3被認(rèn)為在賦予抗體的特異性方面發(fā)揮獨(dú)特的作用。參見，例如，xu等人，immunity13:37-45(2000)；johnson和wu，分子生物學(xué)方法(methodsinmolecularbiology)248:1-25(lo編輯，humanpress,totowa,nj,2003)。實(shí)際上，僅由重鏈組成的天然存在的駱駝抗體在輕鏈不存在的情況下是功能性的和穩(wěn)定的(hamers-casterman等人，(1993)nature363:446-448；sheriff等人，(1996)naturestruct.biol.3:733-736)。

許多hvr描繪正在使用中并被包括在本文中。kabat互補(bǔ)決定區(qū)(cdrs)基于序列變異性并且是最常用的(kabat等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth),bethesda,md.(1991))。chothia改為指結(jié)構(gòu)環(huán)的位置(chothia和lesk,(1987)j.mol.biol.196:901-917)。對(duì)于抗原接觸，請(qǐng)參閱maccallum等人j.mol.biol.262:732-745(1996)。abmhvrs代表kabathvrs和chothia結(jié)構(gòu)環(huán)之間的折衷，并由oxfordmolecular的abm抗體建模軟件使用?！敖佑|”hvr是基于對(duì)可用的復(fù)雜晶體結(jié)構(gòu)的分析。這些hvr中每一個(gè)的殘基如下所述。

hvr可以包含以下的“延伸hvr”：在vl中的24-36或24-34(l1)、46-56或50-56(l2)和89-97或89-96(l3)，以及在vh中的26-35(h1)、50-65或49-65(h2)和93-102、94-102或95-102(h3)。除非另有說明，在本文中根據(jù)kabat等人的以上文章來編號(hào)hvr殘基、cdr殘基和可變結(jié)構(gòu)域中的其它殘基(例如fr殘基)。

術(shù)語“依照kabat的可變結(jié)構(gòu)域殘基編號(hào)”或“依照kabat的氨基酸位置編號(hào)”及其變化形式指kabat等人的以上文章中的用于抗體編制的重鏈可變結(jié)構(gòu)域或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域編輯的編號(hào)系統(tǒng)。使用此編號(hào)系統(tǒng)，實(shí)際的線性氨基酸序列可包含較少或另外的氨基酸，對(duì)應(yīng)于可變結(jié)構(gòu)域fr或hvr的縮短或插入。例如，重鏈可變結(jié)構(gòu)域可包含h2的殘基52后的單一氨基酸插入(依照kabat為殘基52a)及重鏈fr殘基82后的插入殘基(例如依照kabat為殘基82a、82b和82c等)。對(duì)于給定抗體的殘基kabat編號(hào)可通過將抗體序列與“標(biāo)準(zhǔn)的”kabat編號(hào)序列對(duì)比同源區(qū)域來確定。

“框架”或“fr”是指除高變區(qū)(hvr)殘基外的可變結(jié)構(gòu)域殘基。一般地，可變結(jié)構(gòu)域的fr由4個(gè)fr結(jié)構(gòu)域組成：fr1、fr2、fr3和fr4。因此，hvr和fr序列在vh(或vl)中一般以如下順序出現(xiàn)：fr1-h1(l1)-fr2-h2(l2)-fr3-h3(l3)-fr4。

為了本文的目的，“受體人框架”為包含由人免疫球蛋白框架或如下文定義的人共有框架衍生的輕鏈可變域(vl)框架或重鏈可變域(vh)框架的氨基酸序列的框架。由人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受體人框架可以包含與其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列改變。在一些實(shí)施方案中，氨基酸改變的數(shù)目是10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。在一些實(shí)施方案中，vl受體人框架與vl人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同。

“人共有框架”是表示人免疫球蛋白vl或vh框架序列選集中最常存在的氨基酸殘基的框架。通常，人免疫球蛋白vl或vh序列選集來自可變域序列亞組。通常，序列的亞組是如kabat等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,fifthedition,nihpublication91-3242,bethesdamd(1991)，第1-3卷中的亞組。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于vl，亞組是如kabat等人的上述文章中的亞組κi。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于vh，亞組是如kabat等人的上述文章中的亞組iii。

本文中的術(shù)語“fc區(qū)”用于定義免疫球蛋白重鏈的c末端區(qū)域。該術(shù)語包括天然序列fc區(qū)和變體fc區(qū)。盡管免疫球蛋白重鏈的fc區(qū)的邊界可能變化，但人igg重鏈fc區(qū)通常定義為從cys226或從pro230位置的氨基酸殘基延伸到其羧基末端。fc區(qū)的c末端賴氨酸(根據(jù)eu編號(hào)系統(tǒng)的殘基447-也稱為eu指數(shù)，如在kabat等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md,1991中所述)可以除去，例如，在抗體的制備或純化期間，或通過重組工程化改造編碼抗體重鏈的核酸。因此，完整抗體的組合物可以包含除去所有k447殘基的抗體群體、未除去k447殘基的抗體群體以及具有和不具有k447殘基的抗體混合物的抗體群體。術(shù)語“fc受體”或“fcr”還包括新生兒受體fcrn，其負(fù)責(zé)將母體igg轉(zhuǎn)移至胎兒。guyer等人，j.immunol.117:587(1976)和kim等人,j.immunol.24:249(1994)。測(cè)量與fcrn結(jié)合的方法是已知的(參見，例如，ghetie和ward,immunol.today18:(12):592-8(1997)；ghetie等人，自然生物技術(shù)(naturebiotechnology)15(7):637-40(1997)；hinton等人，j.biol.chem.279(8):6213-6(2004)；wo2004/92219hinton等人)。可以測(cè)定fcrn在體內(nèi)的結(jié)合和人fcrn高親和力結(jié)合多肽的血清半衰期，例如，在轉(zhuǎn)基因小鼠或表達(dá)人fcrn的轉(zhuǎn)染的人細(xì)胞系中，或在其中施用具有變體fc區(qū)的多肽的靈長(zhǎng)類動(dòng)物中。wo2004/42072(presta)描述了抗體變體，其改善或減少與fcr的結(jié)合。另見，例如shields等人，j.biol.chem.9(2):6591-6604(2001)。

“親和力成熟的”抗體是指在一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)(hvr)中具有一個(gè)或多個(gè)改變的抗體，與不具有這種改變的親本抗體相比，這些改變導(dǎo)致抗體對(duì)抗原親和力的改善。

術(shù)語“表位”是指抗原分子上與抗體結(jié)合的特定位點(diǎn)。

“結(jié)合相同表位的抗體”作為參照抗體，是指在競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定中阻斷參照抗體與其抗原結(jié)合50％以上的抗體，相反地，在競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定中參照抗體阻斷該抗體與其抗原結(jié)合50％以上。本文提供了示例性的競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定。

“裸抗體”是指未與異源部分(例如細(xì)胞毒性部分)或放射性標(biāo)記物綴合的抗體。裸抗體可以存在于藥物制劑中。

“效應(yīng)子功能”是指歸因于抗體fc區(qū)的那些生物活性，其隨抗體同種型而變化?？贵w效應(yīng)子功能的實(shí)例包括：c1q結(jié)合和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(cdc)；fc受體結(jié)合；抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(adcc)；吞噬；細(xì)胞表面受體(例如b細(xì)胞受體)的下調(diào)；和b細(xì)胞激活。

“抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性”或adcc是指細(xì)胞毒性的形式，其中分泌的ig結(jié)合到某些細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如，天然殺傷(nk)細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)上存在的fc受體(fcr)上，使得這些細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞特異性結(jié)合攜帶抗原的靶細(xì)胞，隨后用細(xì)胞毒素殺死靶細(xì)胞?？贵w“武裝”細(xì)胞毒性細(xì)胞，并且是通過這種機(jī)制殺死靶細(xì)胞所必需的。用于介導(dǎo)adcc、nk細(xì)胞的初級(jí)細(xì)胞僅表達(dá)fcγ(gamma)riii，而單核細(xì)胞表達(dá)fcγ(gamma)ri、fcγ(gamma)rii和fcγ(gamma)riii。在ravetch和kinet，annu.rev.immunol.9:457-92(1991)的第464頁表3中總結(jié)了造血細(xì)胞上的fc表達(dá)。為了評(píng)估關(guān)注的分子的adcc活性，可以進(jìn)行體外adcc測(cè)定，例如可以執(zhí)行在us5,500,362或us5,821,337中描述的那些。用于這種測(cè)定的有用的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(pbmc)和天然殺傷(nk)細(xì)胞?；蛘呋蛄硗猓梢栽隗w內(nèi)評(píng)價(jià)關(guān)注的分子的adcc活性，例如在clynes等人，pnasusa95:652-656(1998)中公開的動(dòng)物模型中。

“吞噬作用”是指病原體被宿主細(xì)胞(例如巨噬細(xì)胞或嗜中性粒細(xì)胞)吞噬或內(nèi)化的過程。吞噬細(xì)胞通過三種途徑介導(dǎo)吞噬作用：(i)直接細(xì)胞表面受體(例如，凝集素、整聯(lián)蛋白和清道夫受體)，(ii)補(bǔ)體增強(qiáng)-使用補(bǔ)體受體(包括cri、c3b、cr3和cr4的受體)結(jié)合和攝取補(bǔ)體調(diào)理的病原體，和(iii)抗體增強(qiáng)-使用fc受體(包括fcγgammari，fcγgammariia和fcγgammariiia)結(jié)合抗體調(diào)理的粒子，然后其被內(nèi)化并與溶酶體融合成為吞噬溶酶體。在本發(fā)明中，認(rèn)為途徑(iii)在將抗mrsaaac治療劑遞送到感染的白細(xì)胞(例如嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)中起重要作用(微生物的吞噬作用：行動(dòng)的復(fù)雜性(phagocytosisofmicrobes:complexityinaction)d.underhill和aozinsky.(2002)annualreviewofimmunology,vol20:825)。

“補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性”或“cdc”是指在補(bǔ)體存在下裂解靶細(xì)胞。經(jīng)典補(bǔ)體途徑的激活由補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(c1q)與結(jié)合于其同源抗原的抗體(適當(dāng)亞類)結(jié)合引發(fā)。為了評(píng)估補(bǔ)體活化，可以使用cdc測(cè)定法，如gazzano-santoro等人，j.immunol.methods202:163(1996)中所述。

可以改變與fc區(qū)連接的碳水化合物。由哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的天然抗體通常包含支鏈的雙分枝寡糖，其通常通過n-連接與fc區(qū)的ch2結(jié)構(gòu)域的asn297連接。參見，例如wright等人(1997)tibtech15:26-32。寡糖可以包括各種碳水化合物，例如甘露糖、n-乙酰氨基葡萄糖(glcnac)、半乳糖和唾液酸，以及連接到雙分枝寡糖結(jié)構(gòu)的“莖”中的glcnac的巖藻糖。在一些實(shí)施方案中，可以制備在igg中的寡糖修飾，以便產(chǎn)生具有某些另外改進(jìn)特性的igg。例如，提供具有碳水化合物結(jié)構(gòu)的抗體修飾，其缺乏與fc區(qū)(直接或間接)連接的巖藻糖。這樣的修改可能具有改善的adcc功能。參見，例如us2003/0157108(presta,l.)；us2004/0093621(kyowahakkokogyo有限公司)。與“去巖藻糖化”或“巖藻糖缺乏”的抗體修飾相關(guān)的出版物的實(shí)例包括：us2003/0157108；wo2000/61739；wo2001/29246；us2003/0115614；us2002/0164328；us2004/0093621；us2004/0132140；us2004/0110704；us2004/0110282；us2004/0109865；wo2003/085119；wo2003/084570；wo2005/035586；wo2005/035778；wo2005/053742；wo2002/031140；okazaki等人，j.mol.biol.336:1239-1249(2004)；yamane-ohnuki等人biotech.bioeng.87:614(2004)。能夠產(chǎn)生去巖藻糖化抗體的細(xì)胞系的實(shí)例包括缺乏蛋白質(zhì)巖藻糖基化的lee13cho細(xì)胞(ripka等人，arch.biochem.biophys.249:533-545(1986)；美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2003/0157108al,presta,l；和wo2004/056312a1,adams等人，特別是實(shí)施例11)和敲除細(xì)胞系，如α-1,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因、fut8、敲除的cho細(xì)胞(參見例如yamane-ohnuki等人，biotech.bioeng.87:614(2004)；kanda,y.等人，biotechnol.bioeng.,94(4):680-688(2006)；和wo2003/085107)。

“分離的抗體”是已經(jīng)與其天然環(huán)境的一種成分分開的抗體。在一些實(shí)施方案中，將抗體純化至超過95％或99％純度，如通過例如電泳(例如，sds-page、等電聚焦(ief)、毛細(xì)管電泳)或色譜(例如，離子交換或反相hplc)所測(cè)定的。關(guān)于評(píng)估抗體純度的方法的綜述參見，例如flatman等人，j.chromatogr.b848:79-87(2007)。

“分離的核酸”是指已經(jīng)與其天然環(huán)境的一種成分分開的核酸分子。分離的核酸包括正常情況下包含該核酸分子的細(xì)胞中含有的該核酸分子，但是該核酸分子存在于染色體外或與其天然染色體位置不同的染色體位置。

“分離的編碼rf1抗體的核酸”是指一種或多種編碼抗體重鏈和輕鏈的核酸分子，包括在單一載體或分開的載體中的所述核酸分子，以及存在于宿主細(xì)胞中一個(gè)或多個(gè)位置處的所述核酸分子。

如本文所用，術(shù)語“特異性結(jié)合”或“特異性”是指可測(cè)量和可重復(fù)的相互作用，例如靶點(diǎn)和抗體之間的結(jié)合，其在包括生物分子的異質(zhì)分子群體存在下確定靶點(diǎn)的存在。例如，特異性結(jié)合靶點(diǎn)(其可以是表位)的抗體是以更高的親和力、親合力、更容易和/或具有比其它靶點(diǎn)結(jié)合更長(zhǎng)的持續(xù)時(shí)間來結(jié)合該靶點(diǎn)的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，例如通過放射免疫測(cè)定法(ria)測(cè)量，抗體與和rf1無關(guān)的靶點(diǎn)的結(jié)合程度低于抗體與靶點(diǎn)結(jié)合程度的約10％。在某些實(shí)施方案中，特異性結(jié)合rf1的抗體具有≤1μm、≤100nm、≤10nm，≤1nm或≤0.1nm的解離常數(shù)(kd)。在某些實(shí)施方案中，抗體特異性結(jié)合來自不同物種的表位。在另一個(gè)實(shí)施方案中，特異性結(jié)合可以包括,但不是必需排他性結(jié)合。

“結(jié)合親和力”通常是指分子(例如，抗體)的單一結(jié)合位點(diǎn)與其結(jié)合配偶體(例如，抗原)之間的非共價(jià)相互作用的總和強(qiáng)度。除非另有說明，如本文所用，“結(jié)合親和力”是指反映結(jié)合對(duì)成員(例如，抗體和抗原)之間的1:1相互作用的固有結(jié)合親和力。分子x對(duì)其配偶體y的親和力通?？梢杂山怆x常數(shù)(kd)表示。親和力可以通過本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法測(cè)量，包括本文所述的那些。低親和力抗體通常緩慢地結(jié)合抗原并易于解離，而高親和力抗體通常更快地結(jié)合抗原并且易于保持結(jié)合更長(zhǎng)時(shí)間。測(cè)量結(jié)合親和力的各種方法是本領(lǐng)域已知的，其中任何一種可以用于本發(fā)明的目的。以下描述用于測(cè)量結(jié)合親和力的具體說明性和示例性實(shí)施方案。

在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的“kd”或“kd值”，通過用目標(biāo)抗體的fab型及其抗原進(jìn)行的放射性標(biāo)記抗原結(jié)合測(cè)定(ria)來測(cè)量，如以下測(cè)定所述。通過在存在未標(biāo)記抗原的滴定系列的情況中用最小濃度的(¹²⁵i)-標(biāo)記抗原而平衡fab，然后用抗fab抗體包被的板子捕捉結(jié)合的抗原來測(cè)量fab對(duì)抗原的溶液結(jié)合親和力(參見例如chen等人，j.mol.biol.293:865-881(1999))。為了建立測(cè)定法的條件，微量滴定板(dynextechnologies,inc.)用5μg/ml捕獲性抗fab抗體(cappellabs)在50mm碳酸鈉(ph9.6)中包被過夜，隨后在pbs中用2％(w/v)牛血清白蛋白于室溫(約23℃)封閉2-5小時(shí)。在非吸附板(nunc#269620)中，將100pm或26pm[¹²⁵i]-抗原與連續(xù)稀釋的目標(biāo)fab混合(例如與presta等人，cancerres.57:4593-4599(1997)中抗vegf抗體fab-12的評(píng)估一致)。然后將目標(biāo)fab孵育過夜；然而，孵育可持續(xù)更長(zhǎng)時(shí)間(例如，約65小時(shí))以確保達(dá)到平衡。此后，將混合物轉(zhuǎn)移至捕獲板，用于室溫孵育(例如，1小時(shí))。然后除去溶液，并用pbs中的0.1％吐溫-20^tm表面活性劑洗板8次。平板干燥后，加入150μl/孔的閃爍液(microscint-20^tm；packard)，然后在topcount^tmγ計(jì)數(shù)器(packard)上對(duì)平板計(jì)數(shù)10分鐘。選擇給出小于或等于最大結(jié)合的20％的各fab濃度，用于競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定法。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，采用表面等離子共振測(cè)定法，使用-2000或-3000儀器(biacore,inc.,piscataway,nj)于25℃用固定的抗原cm5芯片以約10個(gè)響應(yīng)單位(ru)測(cè)量kd。簡(jiǎn)言之，根據(jù)供應(yīng)商的說明書，用n-乙基-n’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)活化羧甲基化的右旋糖酐生物傳感器芯片(cm5,biacore公司)。將抗原用10mm乙酸鈉ph4.8稀釋至5μg/ml(～0.2μm)，之后以5μl/min的流速注射以實(shí)現(xiàn)大約10個(gè)響應(yīng)單位(ru)的偶聯(lián)蛋白質(zhì)。注射抗原之后，注射1m乙醇胺以封閉未反應(yīng)基團(tuán)。對(duì)于動(dòng)力學(xué)測(cè)量，于25℃以大約25μl/min的流速注射在含0.05％吐溫20^tm表面活性劑的pbs(pbst)中兩倍連續(xù)稀釋的fab(0.78nm至500nm)。使用簡(jiǎn)單的一對(duì)一langmuir結(jié)合模型(evaluationsoftwareversion3.2)，通過同時(shí)擬合結(jié)合和解離傳感圖來計(jì)算結(jié)合速率(kon)和解離速率(koff)。以koff/kon比率計(jì)算平衡解離常數(shù)(kd)。參見，例如chen等人，j.mol.biol.293:865-881(1999)。如果通過上述表面等離子共振測(cè)定法，結(jié)合速率超過10⁶m^-1s^-1，那么可使用熒光淬滅技術(shù)來測(cè)定結(jié)合速率，所述技術(shù)在分光計(jì)例如帶有斷流裝置的分光光度計(jì)(avivinstruments)或8000系列slm-aminco^tm分光光度計(jì)(thermospectronic)中用攪拌比色杯測(cè)量的濃度漸增的抗原存在下，測(cè)量在pbsph7.2中20nm抗-抗原的抗體(fab形式)于25℃的熒光發(fā)射強(qiáng)度(激發(fā)＝295nm；發(fā)射＝340nm，16nm帶通)的升高或降低。

根據(jù)本發(fā)明的“結(jié)合速率”或“kon”還可以使用-2000或-3000系統(tǒng)(biacore,inc.,piscataway,nj)按如上所述測(cè)定。

術(shù)語“宿主細(xì)胞”、“宿主細(xì)胞系”和“宿主細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換使用，并且指已經(jīng)導(dǎo)入外源核酸的細(xì)胞，包括所述細(xì)胞的后代。宿主細(xì)胞包括“轉(zhuǎn)化體”和“經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”，其包括原代的經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞及由其衍生的后代而不考慮傳代的次數(shù)。后代在核酸內(nèi)容物上可以與親本細(xì)胞不完全相同，而是可以含有突變。本文中包括具有與在初始轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選或選擇的相同功能或生物學(xué)活性的突變體后代。

如本文使用的術(shù)語“載體”是指能夠增殖與其連接的另一種核酸的核酸分子。該術(shù)語包括作為自身復(fù)制型核酸結(jié)構(gòu)的載體及整合到其已導(dǎo)入的宿主細(xì)胞的基因組中的載體。某些載體能夠指導(dǎo)與其可操作連接的核酸的表達(dá)。所述載體在本文中稱為“表達(dá)載體”。

關(guān)于參照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定義為候選序列中與參照多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比，在比對(duì)序列并引入間隙之后，如果需要，可以達(dá)到最大百分比序列同一性，并且不考慮作為序列同一性的一部分的任何保守取代。用于確定氨基酸序列同一性百分比的比對(duì)可以通過本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的各種方式實(shí)現(xiàn)，例如，使用諸如blast、blast-2、align或megalign(dnastar)軟件的公眾可用的計(jì)算機(jī)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定用于比對(duì)序列的適當(dāng)參數(shù)，包括在待比較的序列的全長(zhǎng)上實(shí)現(xiàn)最大比對(duì)所需的任何算法。然而，為了本文的目的，使用序列比較計(jì)算機(jī)程序align-2產(chǎn)生％氨基酸序列同一性值。genentech公司編寫了align-2序列比較計(jì)算機(jī)程序，并且源代碼已經(jīng)在華盛頓特區(qū)20559號(hào)美國(guó)版權(quán)局提交了用戶文檔，以美國(guó)版權(quán)注冊(cè)號(hào)txu510087注冊(cè)。align-2程序可從加利福尼亞州南舊金山的genentech公司公開獲得，或者可以從源代碼編譯。align-2程序應(yīng)編譯為在unix操作系統(tǒng)上使用，包括數(shù)字unixv4.0d。所有序列比較參數(shù)由align-2程序設(shè)置，并且不變。

在使用align-2用于氨基酸序列比較的情況下，給定的氨基酸序列a與或相對(duì)于給定的氨基酸序列b的氨基酸序列同一性％(其也可被稱為具有或包含與或相對(duì)于給定氨基酸序列b的某一氨基酸序列同一性％的給定的氨基酸序列a)的計(jì)算如下：100乘以分?jǐn)?shù)x/y，其中x是在該程序的a和b的比對(duì)中，通過序列比對(duì)程序align-2評(píng)價(jià)為相同匹配的氨基酸殘基數(shù)，并且其中y是b中氨基酸殘基的總數(shù)。應(yīng)當(dāng)理解，如果氨基酸序列a的長(zhǎng)度不等于氨基酸序列b的長(zhǎng)度，a與b的氨基酸序列同一性％將不等于b與a的氨基酸序列同一性％。除非另有特別說明，否則本文使用的所有氨基酸序列同一性％值如上所述獲得。

術(shù)語“利福霉素型抗生素”是指具有利福霉素結(jié)構(gòu)或類似結(jié)構(gòu)的抗生素類或組。

術(shù)語“利福拉齊型抗生素”是指具有利福拉齊結(jié)構(gòu)或類似結(jié)構(gòu)的抗生素類或組。

當(dāng)指示取代基的數(shù)目時(shí)，術(shù)語“一個(gè)或多個(gè)”是指從一個(gè)取代基到最高可能取代數(shù)的范圍，即，替換一個(gè)氫到通過取代基替換所有氫。術(shù)語“取代基”表示替換母體分子上的氫原子的一個(gè)原子或一組原子。術(shù)語“取代的”表示指定的基團(tuán)具有一個(gè)或多個(gè)取代基。當(dāng)任何基團(tuán)可以攜帶多種取代基且提供多種可能的取代基時(shí)，獨(dú)立地選擇取代基并且不必相同。術(shù)語“未取代的”是指指定的基團(tuán)不含取代基。術(shù)語“任選取代的”是指指定基團(tuán)是未取代的或被一個(gè)或多個(gè)取代基取代，其獨(dú)立地選自可能的取代基的組。當(dāng)指示取代基的數(shù)目時(shí)，術(shù)語“一個(gè)或多個(gè)”是指從一個(gè)取代基到最高可能的取代數(shù)量，即通過取代基替換一個(gè)氫直到替換所有氫。

本文所用的術(shù)語“烷基”是指具有1至12個(gè)碳原子(c1-c12)的飽和直鏈或支鏈單價(jià)烴基，其中烷基可以任選地被一個(gè)或多個(gè)下述取代基獨(dú)立地取代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，烷基為1至8個(gè)碳原子(c1-c8)或1至6個(gè)碳原子(c1-c6)。烷基的實(shí)例包括但不限于甲基(me，-ch3)、乙基(et，-ch2ch3)、1-丙基(n-pr，正丙基，-ch2ch2ch3)、2-丙基(i-pr，異丙基，-ch(ch3)2)、1-丁基(n-bu，正丁基，-ch2ch2ch2ch3)、2-甲基-1-丙基(i-bu，異丁基，-ch2ch(ch3)2)、2-丁基(s-bu，仲丁基，-ch(ch3)ch2ch3)、2-甲基-2-丙基(t-bu，叔丁基，-c(ch3)3)、1-戊基(正戊基，-ch2ch2ch2ch2ch3)、2-戊基(-ch(ch3)ch2ch2ch3)、3-戊基(-ch(ch2ch3)2)、2-甲基-2-丁基(-c(ch3)2ch2ch3)、3-甲基-2-丁基(-ch(ch3)ch(ch3)2)、3-甲基-1-丁基(-ch2ch2ch(ch3)2)、2-甲基-1-丁基(-ch2ch(ch3)ch2ch3)、1-己基(-ch2ch2ch2ch2ch2ch3)、2-己基(-ch(ch3)ch2ch2ch2ch3)、3-己基(-ch(ch2ch3)(ch2ch2ch3))、2-甲基-2-戊基(-c(ch3)2ch2ch2ch3)、3-甲基-2-戊基(-ch(ch3)ch(ch3)ch2ch3)、4-甲基-2-戊基(-ch(ch3)ch2ch(ch3)2)、3-甲基-3-戊基(-c(ch3)(ch2ch3)2)、2-甲基-3-戊基(-ch(ch2ch3)ch(ch3)2)、2,3-二甲基-2-丁基(-c(ch3)2ch(ch3)2)、3,3-二甲基-2-丁基(-ch(ch3)c(ch3)3)、1-庚基、1-辛基等。

本文所用的術(shù)語“亞烷基”是指1至12個(gè)碳原子(c1-c12)的飽和直鏈或支鏈二價(jià)烴基，其中亞烷基可以任選地被一個(gè)或多個(gè)下述取代基獨(dú)立地取代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，亞烷基是1-8個(gè)碳原子(c1-c8)或1-6個(gè)碳原子(c1-c6)。亞烷基的實(shí)例包括但不限于亞甲基(-ch2-)、亞乙基(-ch2ch2-)、亞丙基(-ch2ch2ch2-)等。

術(shù)語“烯基”是指具有至少一個(gè)不飽和位點(diǎn)即碳-碳sp²雙鍵的2-8個(gè)碳原子(c2-c8)的直鏈或支鏈一價(jià)烴基，其中烯基可以任選地被本文所述的一個(gè)或多個(gè)取代基獨(dú)立地取代，并且包括具有“順式”和“反式”取向，或者“e”和“z”取向的基團(tuán)。實(shí)例包括但不限于亞乙基或乙烯基(-ch＝ch2)、烯丙基(-ch2ch＝ch2)等。

術(shù)語“亞烯基”是指具有至少一個(gè)不飽和位點(diǎn)即碳-碳sp²雙鍵的2-8個(gè)碳原子(c2-c8)的直鏈或支鏈二價(jià)烴基，其中亞烯基可以任選地被本文所述的一個(gè)或多個(gè)取代基獨(dú)立地取代，并且包括具有“順式”和“反式”取向，或者“e”和“z”取向的基團(tuán)。實(shí)例包括但不限于亞乙烯基(-ch＝ch-)、烯丙基(-ch2ch＝ch-)等。

術(shù)語“炔基”是指具有至少一個(gè)不飽和位點(diǎn)即碳-碳sp叁鍵的2-8個(gè)碳原子(c2-c8)的直鏈或支鏈一價(jià)烴基，其中炔基可以任選地被本文所述的一個(gè)或多個(gè)取代基獨(dú)立地取代。實(shí)例包括但不限于乙炔基(-c≡ch)、丙炔基(炔丙基，-ch2c≡ch)等。

術(shù)語“亞炔基”是指具有至少一個(gè)不飽和位點(diǎn)即碳-碳sp叁鍵的2-8個(gè)碳原子(c2-c8)的直鏈或支鏈二價(jià)烴基，其中亞炔基可以任選地被本文所述的一個(gè)或多個(gè)取代基獨(dú)立地取代。實(shí)例包括但不限于亞乙炔基(-c≡c-)、亞丙炔基(亞炔丙基，-ch2c≡c-)等。

術(shù)語“碳環(huán)”、“碳環(huán)基”和“環(huán)烷基”是指單價(jià)非芳香族飽和或部分不飽和環(huán)，具有3-12個(gè)碳原子(c3-c12)的作為單環(huán)，或具有7至12個(gè)碳原子作為雙環(huán)。具有7至12個(gè)原子的雙環(huán)碳環(huán)可以排列成，例如雙環(huán)[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系統(tǒng)，并且具有9或10個(gè)環(huán)原子的雙環(huán)碳環(huán)可以排列成雙環(huán)[5,6]或[6,6]系統(tǒng)，或成橋連系統(tǒng)如雙環(huán)[2.2.1]庚烷、雙環(huán)[2.2.2]辛烷和雙環(huán)[3.2.2]壬烷。螺環(huán)部分也包括在本定義的范圍內(nèi)。單環(huán)碳環(huán)的實(shí)例包括但不限于環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、1-環(huán)戊-1-烯基、1-環(huán)戊-2-烯基、1-環(huán)戊-3-烯基、環(huán)己基、1-環(huán)己-1-烯基、1-環(huán)己-2-烯基、1-環(huán)己-3-烯基、環(huán)己二烯基、環(huán)庚基、環(huán)辛基、環(huán)壬基、環(huán)癸基、環(huán)十一烷基、環(huán)十二烷基等。碳環(huán)基基團(tuán)任選被一個(gè)或多個(gè)本文所述的取代基獨(dú)立地取代。

“芳基”是指通過從母體芳族環(huán)系統(tǒng)的單個(gè)碳原子除去一個(gè)氫原子而衍生的6-20個(gè)碳原子(c6-c20)的單價(jià)芳族烴基。一些芳基在示例性結(jié)構(gòu)中表示為“ar”。芳基包括雙環(huán)基團(tuán)，其包含與飽和的，部分不飽和的環(huán)或芳族碳環(huán)稠合的芳香環(huán)。典型的芳基包括但不限于衍生自苯(苯基)、取代的苯、萘、蒽、聯(lián)苯、茚基、茚滿基、1,2-二氫萘、1,2,3,4-四氫萘基等的基團(tuán)。芳基任選地被一個(gè)或多個(gè)本文所述的取代基獨(dú)立地取代。

“亞芳基”是指通過從母體芳族環(huán)系統(tǒng)的兩個(gè)碳原子除去兩個(gè)氫原子而衍生的6-20個(gè)碳原子(c6-c20)的二價(jià)芳族烴基。一些亞芳基在示例性結(jié)構(gòu)中表示為“ar”。亞芳基包括雙環(huán)基團(tuán)，其包含與飽和的，部分不飽和的環(huán)或芳族碳環(huán)稠合的芳香環(huán)。典型的亞芳基包括但不限于衍生自苯(亞苯基)、取代苯、萘、蒽、聯(lián)苯、亞茚基、亞茚滿基、1,2-二氫萘、1,2,3,4-四氫萘基等的基團(tuán)。亞芳基任選地被一個(gè)或多個(gè)本文所述的取代基取代。

術(shù)語“雜環(huán)”和“雜環(huán)基”在本文中可互換使用，是指飽和或部分不飽和(即，在環(huán)內(nèi)具有一個(gè)或多個(gè)雙鍵和/或叁鍵)的3至約20個(gè)環(huán)原子的碳環(huán)基，其中至少一個(gè)環(huán)原子是選自氮、氧、磷和硫的雜原子，剩余的環(huán)原子是c，其中一個(gè)或多個(gè)環(huán)原子任選地被一個(gè)或多個(gè)如下所述的取代基獨(dú)立地取代。雜環(huán)可以是具有3至7個(gè)環(huán)成員(2至6個(gè)碳原子和1至4個(gè)選自n，o，p和s的雜原子)的單環(huán)或具有7至10個(gè)環(huán)成員(4至9個(gè)碳原子和1至6個(gè)選自n，o，p和s的雜原子)的雙環(huán)，例如：雙環(huán)[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系統(tǒng)。雜環(huán)描述于paquette，leoa.,“現(xiàn)代雜環(huán)化學(xué)原理(principlesofmodernheterocyclicchemistry)”(w.a.benjamin,newyork,1968)，特別是第1、3、4、6、7和9章；“雜環(huán)化合物化學(xué)，一系列專著(thechemistryofheterocycliccompounds,aseriesofmonographs)”(johnwiley&sons,newyork,1950至今)，特別是第13、14、16、19和28卷；和j.am.chem.soc.(1960)82:5566?！半s環(huán)基”還包括其中雜環(huán)基與飽和的，部分不飽和環(huán)或芳族碳環(huán)或雜環(huán)稠合的基團(tuán)。雜環(huán)的實(shí)例包括但不限于嗎啉-4-基、哌啶-1-基、哌嗪基、哌嗪-4-基-2-酮、哌嗪-4-基-3-酮、吡咯烷-1-基、硫嗎啉-4-基、s-二氧代硫嗎啉-4-基、氮雜環(huán)辛烷-1-基、氮雜環(huán)丁烷-1-基、八氫吡啶并[1,2-a]吡嗪-2-基、[1,4]二氮雜環(huán)庚-1-基、吡咯烷基、四氫呋喃基、二氫呋喃基、四氫噻吩基、四氫吡喃基、二氫吡喃基、四氫噻喃基、哌啶基、嗎啉代、硫代嗎啉代、噻咯烷基、哌嗪基、高哌嗪基、氮雜環(huán)丁烷基、氧雜環(huán)丁烷基、硫雜環(huán)丁烷基、高哌啶基、氧雜環(huán)庚烷基、硫雜環(huán)庚烷基、氧氮雜基、二氮雜基、硫雜基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、二氫吲哚基、2h-吡喃基、4h-吡喃基、二噁烷基、1,3-二氧雜環(huán)戊烷基、吡唑啉基、二噻烷基、二硫雜環(huán)戊烷基、二氫吡喃基、二氫噻吩基、二氫呋喃基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、3-氮雜雙環(huán)[3.1.0]己烷基、3-氮雜二環(huán)[4.1.0]庚烷基、氮雜雙環(huán)[2.2.2]己烷基、3h-吲哚基、喹嗪基和n-吡啶基脲。螺環(huán)部分也包括在本定義的范圍內(nèi)。其中2個(gè)環(huán)原子被氧代(＝o)部分取代的雜環(huán)基團(tuán)的實(shí)例是嘧啶酮基和1,1-二氧代-硫嗎啉基。本文的雜環(huán)基團(tuán)任選地被一個(gè)或多個(gè)本文所述的取代基獨(dú)立地取代。

術(shù)語“雜芳基”是指5-、6-或7-元環(huán)的單價(jià)芳族基團(tuán)，并且包括5-20個(gè)原子的稠環(huán)體系(其中至少一個(gè)是芳族的)，其獨(dú)立地含有一個(gè)或多個(gè)選自氮、氧和硫的雜原子。雜芳基的實(shí)例是吡啶基(包括例如，2-羥基吡啶基)、咪唑基、咪唑并吡啶基、嘧啶基(包括例如，4-羥基嘧啶基)、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、異噁唑基、噻唑基、噁二唑基、噁唑基、異噻唑基、吡咯基、喹啉基、異喹啉基、四氫異喹啉基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、噌啉基、吲唑基、吲哚基、酞嗪基、噠嗪基、三嗪基、異吲哚基、蝶啶基、嘌呤基、噁二唑基、三唑基、噻二唑基、呋咱基、苯并呋咱基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基和呋喃并吡啶基。雜芳基任選被一個(gè)或多個(gè)本文所述的取代基獨(dú)立地取代。

在可能的情況下，雜環(huán)或雜芳基可以是碳(碳連接的)或氮(氮連接的)鍵合的。作為舉例而非限制，碳鍵合的雜環(huán)或雜芳基鍵合在吡啶的第2、3、4、5或6位，噠嗪的第3、4、5或6位，嘧啶的2、4、5或6位，吡嗪的2、3、5或6位，呋喃、四氫呋喃、噻吩(thiofuran)、噻吩(thiophene)、吡咯或四氫吡咯的2、3、4或5位，噁唑、咪唑或噻唑的2、4或5位，異噁唑、吡唑或異噻唑的3、4或5位，氮丙啶的2或3位，氮雜環(huán)丁烷的2、3或4位，喹啉的2、3、4、5、6、7或8位，或異喹啉的1、3、4、5、6、7或8位。

舉例而言而非限制，氮鍵合的雜環(huán)或雜芳基鍵合于氮丙啶、氮雜環(huán)丁烷、吡咯、吡咯烷、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑啉、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、二氫吲哚、1h-吲唑的1位，異吲哚或異吲哚啉的2位，嗎啉的4位，以及咔唑或β-咔啉的9位。

“代謝物”是特定化合物或其鹽通過體內(nèi)代謝產(chǎn)生的產(chǎn)物?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)來鑒定化合物的代謝物，并且使用本文所述的測(cè)試來確定其活性。這樣的產(chǎn)物可以例如由所施用的化合物的氧化、還原、水解、酰胺化、脫酰胺化、酯化、脫酯化、酶裂解等產(chǎn)生。因此，本發(fā)明包括本發(fā)明化合物的代謝物，包括通過包含使本發(fā)明的式i化合物與哺乳動(dòng)物接觸足以產(chǎn)生其代謝產(chǎn)物的時(shí)間的方法產(chǎn)生的化合物。

術(shù)語“藥物制劑”是指處于如下的形式，使得容許其中含有的活性成分的生物學(xué)活性是有效的，且不含對(duì)將接受制劑施用的個(gè)體具有不可接受的毒性的其他組分的制劑。

“無菌”制劑是無菌的或不含所有活的微生物及其孢子。

“穩(wěn)定”制劑是其中蛋白質(zhì)在儲(chǔ)存時(shí)基本上保持其物理和化學(xué)穩(wěn)定性和完整性的制劑。用于測(cè)量蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的各種分析技術(shù)在本領(lǐng)域是可獲得的，并且在肽和蛋白質(zhì)藥物遞送(peptideandproteindrugdelivery),247-301,vincentleeed.,marceldekker,inc.,newyork,newyork,pubs.(1991)和jones,a.adv.drugdeliveryrev.10:29-90(1993)中進(jìn)行了綜述。穩(wěn)定性可以在所選擇的溫度下測(cè)量所選擇的時(shí)間段。為了快速篩選，制劑可以在40℃保持2周至1個(gè)月，此時(shí)測(cè)定穩(wěn)定性。當(dāng)制劑在2-8℃下儲(chǔ)存時(shí)，通常制劑應(yīng)在30℃或40℃下穩(wěn)定至少1個(gè)月，和/或在2-8℃下穩(wěn)定至少2年。當(dāng)制劑在30℃下儲(chǔ)存時(shí)，通常制劑應(yīng)在30℃下穩(wěn)定至少2年，和/或在40℃穩(wěn)定至少6個(gè)月。例如，儲(chǔ)存期間的聚集程度可以用作蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的指標(biāo)。因此，“穩(wěn)定”制劑可以是其中小于約10％和優(yōu)選小于約5％的蛋白質(zhì)在制劑中以聚集體存在。在其它實(shí)施方案中，可以確定在制劑儲(chǔ)存過程中聚集體形成的任何增加。

“等滲”制劑是具有與人血液基本相同的滲透壓的制劑。等滲制劑通常具有約250至350mosm的滲透壓。術(shù)語“低滲”描述滲透壓低于人血液的制劑。相應(yīng)地，術(shù)語“高滲”用于描述滲透壓高于人血液的制劑。例如，可以使用蒸氣壓或冰凍型滲透壓計(jì)測(cè)量等滲性。作為加入鹽和/或緩沖液的結(jié)果，本發(fā)明的制劑是高滲的。

本文所用的“載體”包括藥學(xué)上可接受的載體，賦形劑或穩(wěn)定劑，其所使用的劑量和濃度對(duì)暴露于其中的細(xì)胞或哺乳動(dòng)物是無毒的。生理上可接受的載體通常是含水ph緩沖溶液。生理上可接受的載體的實(shí)例包括緩沖液如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如edta；糖醇如甘露醇或山梨糖醇；鹽形成抗衡離子如鈉；和/或非離子表面活性劑如聚乙二醇(peg)和pluronics^tm。

“藥學(xué)上可接受的載體”是指藥物制劑中活性成分以外的對(duì)個(gè)體無毒的成分。藥學(xué)上可接受的載體包括但不限于緩沖劑、賦形劑、穩(wěn)定劑或防腐劑?！八帉W(xué)上可接受的酸”包括在配制濃度和方式下無毒的無機(jī)酸和有機(jī)酸。例如，合適的無機(jī)酸包括鹽酸、高氯酸、氫溴酸、氫碘酸、硝酸、硫酸、磺酸、亞磺酸、對(duì)氨基苯磺酸、磷酸、碳酸等。合適的有機(jī)酸包括直鏈和支鏈烷基、芳族、環(huán)狀、脂環(huán)族、芳基脂族、雜環(huán)、飽和、不飽和、單、二和三羧酸，包括例如甲酸、乙酸、2-羥基乙酸、三氟乙酸、苯乙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、鄰氨基苯甲酸、丙酸、2-羥基丙酸、2-氧代丙酸、丙二酸、環(huán)戊烷丙酸、3-苯基丙酸、丁酸、丁二酸、苯甲酸、3-(4-羥基苯甲酰基)苯甲酸、2-乙酰氧基-苯甲酸、抗壞血酸、肉桂酸、月桂基硫酸、硬脂酸、粘康酸、扁桃酸、琥珀酸、雙羥萘酸、富馬酸、蘋果酸、馬來酸、羥基馬來酸、丙二酸、乳酸、檸檬酸、酒石酸、乙醇酸、葡萄糖酸、葡糖酸、丙酮酸、乙醛酸、草酸、甲磺酸、琥珀酸、水楊酸、鄰苯二甲酸、撲酸、棕櫚酸(palmeicacid)、硫氰酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙烷二磺酸、2-羥基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、萘-2-磺酸、對(duì)甲苯磺酸、樟腦磺酸、4-甲基雙環(huán)[2.2.2]辛-2-烯-1-甲酸、葡庚糖、4,4'-亞甲基雙-3-(羥基-2-烯-1-甲酸)、羥基萘甲酸。

“藥學(xué)上可接受的堿”包括以配制的濃度和方式無毒的無機(jī)和有機(jī)堿。例如，合適的堿包括由無機(jī)堿形成金屬如鋰、鈉、鉀、鎂、鈣、銨、鐵、鋅、銅、錳、鋁、n-甲基葡糖胺、嗎啉、哌啶形成的堿和有機(jī)無毒堿包括伯胺、仲胺和叔胺、取代的胺、環(huán)胺和堿性離子交換樹脂，[例如，n(r')4⁺(其中r'是獨(dú)立地h或c1-4烷基，例如銨、tris)]，例如異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二乙氨基乙醇、三甲胺、二環(huán)己胺、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、咖啡因、普魯卡因、海巴明、膽堿、甜菜堿、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可堿、嘌呤、哌嗪、哌啶、n-乙基哌啶、聚胺樹脂等。特別優(yōu)選的有機(jī)無毒堿是異丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲基胺、二環(huán)己胺、膽堿和咖啡因。

可用于本發(fā)明的其它藥學(xué)上可接受的酸和堿包括衍生自氨基酸的那些，例如組氨酸，甘氨酸，苯丙氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，賴氨酸和天冬酰胺。

“藥學(xué)上可接受的”緩沖劑和鹽包括衍生自上述酸和堿的酸和堿加成鹽的那些。特定的緩沖液和/或鹽包括組氨酸，琥珀酸鹽和乙酸鹽。

“藥學(xué)上可接受的糖”是當(dāng)與關(guān)注的蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，顯著地防止或減少儲(chǔ)存時(shí)蛋白質(zhì)的化學(xué)和/或物理不穩(wěn)定性的分子。當(dāng)制劑被凍干，然后重構(gòu)時(shí)，“藥學(xué)上可接受的糖”也可以稱為“凍干保護(hù)劑”。示例性的糖及其相應(yīng)的糖醇包括：氨基酸，如谷氨酸鈉或組氨酸；甲胺如甜菜堿；溶致鹽如硫酸鎂；多元醇，例如三元或更高分子量的糖醇，例如甘油、葡聚糖、赤蘚糖醇、甘油、阿糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇；丙二醇；聚乙二醇；及其組合。另外的示例性的凍干保護(hù)劑包括甘油和明膠，以及麥芽糖、松三糖、棉子糖、甘露三糖和水蘇糖。還原糖的實(shí)例包括葡萄糖、麥芽糖、乳糖、麥芽酮糖、異麥芽酮糖和乳果糖。非還原性糖的實(shí)例包括選自糖醇和其它直鏈多元醇的多羥基化合物的非還原性糖苷。優(yōu)選的糖醇是單糖苷，特別是通過還原二糖，例如乳糖、麥芽糖、乳果糖和麥芽酮糖，獲得的那些化合物。糖苷側(cè)基可以是糖苷或半乳糖苷。糖醇的另外的實(shí)例是葡萄糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇和異麥芽酮糖。優(yōu)選的藥學(xué)上可接受的糖是非還原糖海藻糖或蔗糖。將藥學(xué)上可接受的糖以“保護(hù)量”(例如預(yù)凍干)加入到制劑中，這意味著蛋白質(zhì)在儲(chǔ)存期間(例如，在重構(gòu)和儲(chǔ)存之后)基本上保持其物理和化學(xué)穩(wěn)定性和完整性。

本文所關(guān)注的“稀釋劑”是藥學(xué)上可接受的(施用于人類時(shí)安全無毒)，并且可用于制備液體制劑，例如凍干后重新配制的制劑。示例性的稀釋劑包括無菌水、注射用抑菌水(bwfi)、ph緩沖溶液(例如磷酸鹽緩沖鹽水)、無菌鹽水溶液、林格溶液或葡萄糖溶液。在替代實(shí)施方案中，稀釋劑可以包括鹽和/或緩沖液的水溶液。

“防腐劑”是可以加入到本文制劑中以減少細(xì)菌活性的化合物。例如，添加防腐劑可以促進(jìn)生產(chǎn)多用途(多劑量)制劑。潛在防腐劑的實(shí)例包括十八烷基二甲基芐基氯化銨、氯化六烴季銨、苯扎氯銨(烷基芐基二甲基氯化銨的混合物，其中烷基是長(zhǎng)鏈化合物)和芐索氯銨。其他類型的防腐劑包括芳族醇如苯酚、丁基和芐醇，對(duì)羥基苯甲酸烷基酯如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯、鄰苯二酚、間苯二酚、環(huán)己醇、3-戊醇和間甲酚。本文最優(yōu)選的防腐劑是芐醇。

“個(gè)體”或“受試者”或“患者”是哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物包括但不限于馴養(yǎng)的動(dòng)物(例如，牛、羊、貓、狗和馬)，靈長(zhǎng)類動(dòng)物(例如，人類和非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物如猴子)，兔子和嚙齒動(dòng)物(例如，小鼠和大鼠)。在某些實(shí)施方案中，個(gè)體或受試者是人。

如本文所用，“治療”(及其語法變化例如“治療”)是指臨床干預(yù)，旨在臨床病理過程中改變待治療的個(gè)體，組織或細(xì)胞的自然過程。治療的期望效果包括但不限于降低疾病進(jìn)展的速度，改善或緩解疾病狀態(tài)，以及緩解或改善的預(yù)后，所有這些都可由本領(lǐng)域技術(shù)人員如醫(yī)師檢測(cè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療可以意味著減輕癥狀，減輕疾病的任何直接或間接的病理后果，降低感染性疾病進(jìn)展的速度，疾病狀態(tài)的改善或緩解，以及緩解或改善的預(yù)后。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的aac和tac用于延緩疾病的發(fā)展或減緩感染性疾病的進(jìn)展或減少血流和/或感染的組織和器官中的細(xì)菌負(fù)荷。

如本文所用，“聯(lián)合”是指除了另一種治療方式之外施用的一種治療方式。因此，“聯(lián)合”是指在向個(gè)人施用其他治療方式之前，期間或之后施用的一種治療方式。

術(shù)語“菌血癥”是指血液中存在細(xì)菌，其是通過血液培養(yǎng)最常檢測(cè)到的。在手術(shù)期間(特別是當(dāng)涉及粘膜如胃腸道時(shí))，或由于導(dǎo)管和其他異物進(jìn)入動(dòng)脈或靜脈時(shí)，細(xì)菌可以進(jìn)入血液作為感染(如肺炎或腦膜炎)的嚴(yán)重并發(fā)癥。菌血癥有幾個(gè)后果。對(duì)細(xì)菌的免疫應(yīng)答可導(dǎo)致敗血癥和敗血性休克，死亡率相對(duì)較高。細(xì)菌也可以通過血液傳播到身體的其他部位，導(dǎo)致感染遠(yuǎn)離原始感染部位。實(shí)例包括心內(nèi)膜炎或骨髓炎。

“治療有效量”是實(shí)現(xiàn)特定病癥的可測(cè)量改善所需的最小濃度。本文的治療有效量可以根據(jù)諸如患者的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重等因素，以及抗體在個(gè)體中引起所需反應(yīng)的能力而變化。治療有效量也是抗體的治療有益效果超過任何毒性或有害作用的量。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療有效量是有效降低體內(nèi)感染中的菌血癥的量。在一方面，“治療有效量”是至少有效地減少?gòu)幕颊邩悠?例如血液)分離出的相對(duì)于給藥前至少一個(gè)對(duì)數(shù)的細(xì)菌負(fù)荷或集落形成單位(cfu)的量。在更具體的方面，減少至少為2個(gè)對(duì)數(shù)。在另一方面，減少量至少為3、4、5個(gè)對(duì)數(shù)。然而在另一方面，使用本領(lǐng)域已知的測(cè)定法，包括本文所例示的測(cè)定，降低到可檢測(cè)水平以下。在另一個(gè)實(shí)施方案中，與感染患者治療前或治療開始時(shí)的陽性血培養(yǎng)物相比，治療有效量是在治療期間給予的一個(gè)或多個(gè)劑量中的aac的量，其實(shí)現(xiàn)陰性的血培養(yǎng)物(即，不產(chǎn)生作為aac靶點(diǎn)的細(xì)菌)。

“預(yù)防有效量”是指為達(dá)到期望的預(yù)防結(jié)果在所需的劑量和時(shí)間段內(nèi)的有效量。通常但不一定是由于在疾病的早期階段，甚至在暴露于感染風(fēng)險(xiǎn)升高的條件之前，在個(gè)體中使用預(yù)防劑量時(shí)，預(yù)防有效量可以小于治療有效量。在一個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)防有效量是至少有效減少、預(yù)防感染從一個(gè)細(xì)胞到另一個(gè)細(xì)胞的發(fā)生或擴(kuò)散的量。

“慢性”給藥是指以連續(xù)而不是急性模式施用藥物，以便在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持初始治療效果(活性)?！伴g歇性”給藥是并非不間斷地連續(xù)進(jìn)行的治療，而是本質(zhì)上是周期性的。

術(shù)語“包裝插入物”用于指通常包括在治療產(chǎn)品的商業(yè)包裝中的說明書，其包含關(guān)于使用這種治療產(chǎn)品的適應(yīng)癥、用途、劑量、給藥、組合療法、禁忌癥和/或警告的信息。

術(shù)語“手性”是指具有鏡像配偶體不重疊性質(zhì)的分子，而術(shù)語“非手性”是指在其鏡像配偶體上重疊的分子。

術(shù)語“立體異構(gòu)體”是指具有相同化學(xué)構(gòu)成但空間中原子或基團(tuán)的排列不同的化合物。

“非對(duì)映體”是指具有兩個(gè)或更多個(gè)手性中心的立體異構(gòu)體，其分子不是彼此的鏡像。非對(duì)映體具有不同的物理性質(zhì)，例如熔點(diǎn)，沸點(diǎn)，光譜性質(zhì)和反應(yīng)性。非對(duì)映異構(gòu)體的混合物可以在高分辨率分析方法如電泳和色譜中分離。

“對(duì)映異構(gòu)體”是指化合物的兩種立體異構(gòu)體，它們是彼此不重疊的鏡像。

本文使用的立體化學(xué)定義和慣例通常遵循s.p.parker編輯，mcgraw-hill化學(xué)詞典(mcgraw-hilldictionaryofchemicalterms)(1984)mcgraw-hillbookcompany,newyork；和eliel,e.和wilen,s.,有機(jī)化合物的立體化學(xué)(stereochemistryoforganiccompounds)(1994)johnwiley&sons,inc.,newyork。許多有機(jī)化合物以光學(xué)活性形式存在，即它們具有旋轉(zhuǎn)偏振光平面的能力。在描述光學(xué)活性化合物時(shí)，前綴d和l，或r和s用于表示分子關(guān)于其手性中心的絕對(duì)構(gòu)型。使用前綴d和l或(+)和(-)來表示化合物對(duì)偏振光平面的旋轉(zhuǎn)符號(hào)，其中(-)或l表示化合物是左旋的。以(+)或d為前綴的化合物是右旋的。對(duì)于給定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，這些立體異構(gòu)體是相同的，除了它們是彼此的鏡像。具體的立體異構(gòu)體也可以稱為對(duì)映異構(gòu)體，這些異構(gòu)體的混合物通常稱為對(duì)映體混合物。將對(duì)映異構(gòu)體的50:50混合物稱為外消旋混合物或外消旋物，其可能發(fā)生在化學(xué)反應(yīng)或過程中不存在立體選擇性或立體定向性的情況。術(shù)語“外消旋混合物”和“外消旋物”是指沒有光學(xué)活性的兩種對(duì)映體物質(zhì)的等摩爾混合物。

術(shù)語“保護(hù)基團(tuán)”是指這樣的取代基，其通常用于阻斷或保護(hù)特定官能團(tuán)，而其它官能團(tuán)在化合物上起反應(yīng)。例如，“氨基保護(hù)基”是連接到氨基上的取代基，該氨基阻斷或保護(hù)化合物中的氨基官能團(tuán)。合適的氨基保護(hù)基包括但不限于乙酰基、三氟乙?；⑹宥⊙豸驶?boc)、芐氧羰基(cbz)和9-芴基亞甲氧基羰基(fmoc)。關(guān)于保護(hù)基及其用途的一般描述，參見t.w.greene,有機(jī)合成中的保護(hù)基(protectivegroupsinorganicsynthesis),johnwiley&sons,newyork,1991，或更新版本。

本文所用的術(shù)語“約”是指本技術(shù)領(lǐng)域中的技術(shù)人員熟知的相應(yīng)值的通常誤差范圍。在此引用“約”值或參數(shù)包括(特別描述)針對(duì)該值或參數(shù)本身的實(shí)施方案。

如本文和所附權(quán)利要求中所使用，單數(shù)形式“一種”、“一個(gè)”和“該”包括復(fù)數(shù)參考，除非上下文另有明確指出。例如，提到“抗體”時(shí)是指從一個(gè)到多個(gè)抗體，例如以摩爾量，并且包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等價(jià)物等。

iii.組合物和方法

抗生素-抗體綴合物(aac)

本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果強(qiáng)有力地表明，旨在消除細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的療法將提高臨床成功率。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，本發(fā)明提供了一種獨(dú)特的治療劑，其選擇性地殺死已經(jīng)侵入宿主細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室的金黃色葡萄球菌。本發(fā)明證明這樣的治療劑在常規(guī)抗生素如萬古霉素失敗的體內(nèi)模型中是有效的。

本發(fā)明提供了一種抗菌治療，其旨在通過靶向于逃避常規(guī)抗生素治療的細(xì)菌群而防止抗生素逃避。該新型抗菌治療是通過抗體抗生素綴合物(aac)實(shí)現(xiàn)的，其中對(duì)在金黃色葡萄球菌(包括mrsa)上發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞壁組分特異型的rf1抗體與有效的利福霉素型抗生素(利福霉素衍生物)化學(xué)連接。利福霉素型抗生素通過設(shè)計(jì)為可被蛋白酶切割的蛋白酶可切割的非肽類接頭連接到抗體上，所述蛋白酶包括組織蛋白酶b，其是大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型中發(fā)現(xiàn)的溶酶體蛋白酶(dubowchik等人(2002)bioconj.chem.13:855-869)。圖2中顯示了具有3個(gè)組分的aac的圖。不受任何一種理論的限制，aac的一種作用機(jī)制如圖3所示。aac作為前藥，其中利福霉素型抗生素是無活性的(由于抗體的大尺寸)，直到接頭被切割為止。由于在天然感染中發(fā)現(xiàn)的顯著比例的金黃色葡萄球菌在宿主感染過程中的某一時(shí)刻被宿主細(xì)胞吸收，主要是嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，在宿主細(xì)胞內(nèi)的時(shí)間為細(xì)菌提供了逃避抗生素活性的重要機(jī)會(huì)。本發(fā)明的aac被設(shè)計(jì)為結(jié)合葡萄球菌細(xì)菌，并且在細(xì)菌被宿主細(xì)胞攝取后在吞噬體內(nèi)部釋放抗生素。通過這種機(jī)制，aac能夠?qū)⒒钚钥股貙ｉT集中在通過常規(guī)抗生素治療金黃色葡萄球菌不佳的地方。雖然本發(fā)明不受特定作用機(jī)制的限制或限定，但aac通過三種潛在的機(jī)制改善抗生素活性：(1)aac在攝取細(xì)菌的哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)遞送抗生素，從而增加難以擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)菌隱藏的吞噬溶酶體中的抗生素的效力。(2)aac調(diào)理細(xì)菌，從而增加吞噬細(xì)胞對(duì)游離細(xì)菌的吸收，并在局部釋放抗生素以便當(dāng)細(xì)菌在吞噬溶酶體中隱藏時(shí)殺死細(xì)菌。由于成千上萬的aac可以結(jié)合單個(gè)細(xì)菌，因此該平臺(tái)在這些細(xì)胞內(nèi)的小環(huán)境中釋放出足夠的抗生素，以維持最大的抗菌殺傷力。此外，隨著越來越多的細(xì)菌從預(yù)先存在的細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)庫(kù)中釋放出來，這種基于抗體的治療方法的快速結(jié)合率確保這些細(xì)菌立即被“標(biāo)記”，然后才能逃逸到相鄰或遠(yuǎn)端的細(xì)胞，從而減輕感染的進(jìn)一步擴(kuò)散。(3)與從血清中快速清除的抗生素相比，aac通過將抗生素與抗體連接來改善體內(nèi)抗生素的半衰期(改善的藥代動(dòng)力學(xué))。aac的改善的藥代動(dòng)力學(xué)能夠在金黃色葡萄球菌富集的區(qū)域中遞送足夠的抗生素，同時(shí)限制需要全身施用的抗生素的總體劑量。該屬性將允許用aac長(zhǎng)期治療以靶向于持續(xù)感染，且抗生素副作用最小。

本發(fā)明的抗體-抗生素綴合化合物包含抗sdr抗體，其由重組引入的半胱氨酸通過蛋白酶可切割的非肽類接頭共價(jià)連接到利福霉素型抗生素。

在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，抗sdr抗體(例如rf1抗體)是包含重組引入的半胱氨酸氨基酸的半胱氨酸改造的抗體。

在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，將蛋白酶可切割的非肽類接頭通過所述rf1(抗sdr抗體)上重組引入的半胱氨酸共價(jià)連接到利福霉素型抗生素。

示例性實(shí)施方案是具有下式的抗體-抗生素綴合物：

ab-(pml-abx)p

其中：

ab是rf1抗體；

pml是具有下式的蛋白酶可切割的非肽類接頭：

-str-pm-y-

其中str是延伸單元；pm是擬肽單元，和y是間隔單元；

abx是利福霉素型抗生素；并且

p是從1到8的整數(shù)。

利福霉素型抗生素可以是利福拉齊型抗生素。

利福霉素型抗生素可以包含與蛋白酶可切割的非肽類接頭連接的季胺。

抗體-抗生素綴合物的示例性實(shí)施方案具有式i：

其中：

虛線表示任選的鍵；

r是h、c1-c12烷基或c(o)ch3；

r¹是oh；

pml是連接到r²或由r¹和r²形成的稠合雜芳基或雜環(huán)基的蛋白酶可切割的非肽類接頭；并且

ab是rf1抗體。

抗生素部分可以通過反應(yīng)性接頭部分與抗體分子綴合，其中抗生素部分的數(shù)目可以通過本文所述的方法引入的游離半胱氨酸殘基的數(shù)量來限制。示例性aac包含具有1、2、3或4個(gè)工程化改造的半胱氨酸氨基酸的抗體(lyon,r.等人(2012)methodsinenzym.502:123-138)。

為了有效瞄準(zhǔn)mrsa，表位優(yōu)選是高度豐富的、在感染期間穩(wěn)定表達(dá)的、并且在所有臨床mrsa菌株中高度保守的。rf1抗體可滿足這些要求，另外也與表皮葡萄球菌結(jié)合。

抗sdr和rf1抗體

如下所述產(chǎn)生抗sdr抗體以生成f1抗體。本文提供了抗sdr抗體的幾個(gè)實(shí)例，包括rf1、sd2、sd3和sd4。

這里將詳細(xì)描述rf1抗體。

rf1抗體是一種完全人類的，能夠特異性結(jié)合葡萄球菌物種，如金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌。重要的是，rf1能夠在體內(nèi)和體外結(jié)合整個(gè)細(xì)菌。此外，抗體rf1能夠結(jié)合已經(jīng)在例如動(dòng)物的感染組織中生長(zhǎng)的細(xì)菌。本文提供的rf1抗體或其功能等同物能夠結(jié)合金黃色葡萄球菌表面蛋白clfa、clfb、sdrc、sdrd和sdre。

表4a和表4b顯示親本抗體f1、rf1抗體及其變體的h鏈和l鏈cdr序列的比對(duì)。f1和rf1在fw1和lccdr3中的順序不同(qhyxrfpyt，其中x可以是i或m(seqidno:26))；f1是i(seqidno:6)和rf1是m(seqidno:7))。

表4a：重鏈cdr序列

表4b：輕鏈cdr序列

在一個(gè)實(shí)施方案中，h和l鏈框架(fr)序列如下：

hcfw1evqlvesggglvqpggslrlscaasgftls(seqidno.16)

hcfw2wvrqapgrglewva(seqidno.17)

hcfw3rftvsrdvsqntvslqmnnlraedsatyfcak(seqidno.18)

hcfw4wgpgtlvtvss(seqidno.19)

lcfw1diqltqspsalpasvgdrvsitc(seqidno.20)

lcfw2wyrqkpgkapnlliy(seqidno.21)

lcfw3gvpsrfsgsgsgteftltisslqpddfatyyc(seqidno.22)

lcfw4fgqgtkveikrtv(seqidno.23)

對(duì)rf1進(jìn)行各種氨基酸修飾以改善穩(wěn)定性和功能。在hccdr2中，通過將第4殘基n變?yōu)閟來消除ng去酰胺化位點(diǎn)，從而提高抗體的穩(wěn)定性。對(duì)lc骨架進(jìn)行tv修復(fù)，以消除rf1中存在的嚴(yán)重抗體聚集。

為了綴合形成本發(fā)明的治療性aac，可以進(jìn)行h和l鏈的以下配對(duì)以形成全長(zhǎng)四聚體抗體?？蚱饋淼氖莄dr1、cdr2、cdr3序列。引入的半胱氨酸(c)是以下劃線標(biāo)記的。粗體殘基是相對(duì)于母體f1的氨基酸變化。在l鏈中，粗體的“rtv”之后的a是恒定區(qū)的第一個(gè)殘基。h鏈中kabat位置114處的帶下劃線的c開始恒定區(qū)。

在1a和2a中，seqidno.9的全長(zhǎng)(fl)l鏈具有在ckappa結(jié)尾附近aa205處工程化改造的cys，與seqidno.10(無cys)的fligg1h鏈配對(duì)。該抗體將具有2個(gè)cys位點(diǎn)，每個(gè)l鏈上有一個(gè)位點(diǎn)，用于與接頭-抗生素單元綴合以形成aac。

1a.rf1-v205cfl輕鏈

2a.rf1.v1fl重鏈(無cys)，配對(duì)帶有cys205的rf1-v205c輕鏈

在1b與2a中，具有工程改造的cys205的seqidno.11的rf1.v6l鏈與seqidno.10(無cys)的fligg1h鏈配對(duì)。該抗體將具有2個(gè)cys位點(diǎn)，每個(gè)l鏈上有一個(gè)位點(diǎn)，用于與接頭-抗生素單元的綴合。

1b.rf1.v6-v205c輕鏈

在1b與2b中，l和h鏈各自具有工程化改造的cys，因此該四聚體抗體可以具有高達(dá)4的aar(抗生素：抗體比例)。

2b.具有cys114(114kabat編號(hào)或118-eu編號(hào))的rf1.v1fl重鏈

evqlvesggglvqpggslrlscaasgftlsrfamswvrqapgrglewvasinsgnnpyyarsvqyrftvsrdvsqntvslqmnnlraedsatyfcakdhpssgwptfdswgpgtlvtvsscstkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seqidno.12)

rf1.v1h鏈可變區(qū)

rf1l鏈可變區(qū)

rf1.v6l鏈可變區(qū)

包括rf1的抗sdr抗體可以包含非半胱氨酸的至少一個(gè)氨基酸被半胱氨酸取代。在一些實(shí)施方案中，非半胱氨酸的至少一個(gè)氨基酸在輕鏈位置205處為纈氨酸，和/或在輕鏈位置110處為纈氨酸，和/或在重鏈位置114處為丙氨酸，其中氨基酸編號(hào)是根據(jù)kabat(1991)，其與根據(jù)eu編號(hào)公約的位置118相同。

利福霉素型抗生素

本發(fā)明的抗體-抗生素綴合物(aac)的抗生素部分(abx)是具有細(xì)胞毒性或細(xì)胞抑制作用的利福霉素型抗生素或基團(tuán)。利福霉素是由細(xì)菌地中海諾卡氏菌(nocardiamediterranei)、地中海擬無枝酸菌(amycolatopsismediterranei)或人工獲得的一組抗生素。它們是抑制細(xì)菌rna聚合酶的較大的安莎霉素家族的亞類(fujii等人(1995)antimicrob.agentschemother.39:1489-1492；feklistov等人(2008)procnatlacadsciusa,105(39):14820-5)，并且對(duì)革蘭氏陽性菌和選擇性革蘭氏陰性菌具有效力。利福霉素對(duì)分枝桿菌特別有效，且因此用于治療結(jié)核病、麻風(fēng)病和鳥分枝桿菌復(fù)合體(mac)感染。利福霉素型群組包括“經(jīng)典的”利福霉素藥物以及利福霉素衍生物利福平(rifampicin)(利福平(rifampin),ca登記號(hào)13292-46-1)、利福布汀(ca登記號(hào)72559-06-9；us2011/0178001)，利福噴汀和利福拉齊(ca登記號(hào)129791-92-0，rothstein等人(2003)expertopin.investig.drugs12(2):255-271；fujii等人(1994)antimicrob.agentschemother38:1118-1122)。許多利福霉素型抗生素都具有抗發(fā)育的有害性質(zhì)(wichelhaus等人(2001)j.antimicrob.chemother.47:153-156)。在1957年首先從地中海鏈霉菌(streptomycesmediterranei)的發(fā)酵培養(yǎng)物中分離出利福霉素。發(fā)現(xiàn)約七種利福霉素，稱為利福霉素a、b、c、d、e、s和sv(us3150046)。利福霉素b是商業(yè)上首次引入的，且在二十世紀(jì)六十年代可用于治療耐藥性結(jié)核病。利福霉素已被用于治療許多疾病，最重要的是hiv相關(guān)性結(jié)核病。由于大量可用的類似物和衍生物，利福霉素已廣泛用于消除已經(jīng)變得對(duì)常用抗生素具有抗性的致病菌。例如，利福平以其有效作用和預(yù)防耐藥性的能力而聞名。它迅速殺死快速分裂的桿菌菌株以及“耐藥株”細(xì)胞，所述細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間保持生物無活性來使其逃避抗生素活性。此外，利福布汀和利福噴汀均已被用于hiv陽性患者的獲得性結(jié)核病。

式i的抗體-抗生素綴合物的抗生素部分(abx)是具有以下結(jié)構(gòu)的利福霉素型部分：

其中：

虛線表示任選的鍵；

r是h、c1-c12烷基或c(o)ch3；

r¹是oh；

其中非肽類接頭pml共價(jià)連接到r²上。

利福霉素型部分的實(shí)施方案是：

其中r³獨(dú)立地選自h和c1-c12烷基；r⁴選自h、f、cl、br、i、c1-c12烷基和oh；且z選自nh、n(c1-c12烷基)、o和s；并且其中非肽類接頭pml共價(jià)連接到n(r³)2的氮原子上。

利福平型部分的實(shí)施方案是：

其中，

r⁵選自h和c1-c12烷基；并且其中非肽類接頭pml共價(jià)連接到nr⁵的氮原子上。

利福布汀型部分的實(shí)施方案是：

其中r⁵選自h和c1-c12烷基；并且其中非肽類接頭pml共價(jià)連接到nr⁵的氮原子上。

苯并噁嗪并利福霉素型部分的實(shí)施方案是：

其中r⁵選自h和c1-c12烷基；并且其中非肽類接頭pml共價(jià)連接到nr⁵的氮原子上。

本文稱為pipbor的苯并噁嗪并利福霉素型部分的實(shí)施方案是：

其中r³獨(dú)立地選自h和c1-c12烷基；并且其中非肽類接頭pml共價(jià)連接到n(r³)2的氮原子上。

本文稱為二甲基pipbor的苯并噁嗪并利福霉素型部分的實(shí)施方案是：

其中非肽類接頭pml共價(jià)連接到n(ch3)2的氮原子上。

半合成衍生物利福霉素s，或還原的鈉鹽型利福霉素sv可以以幾個(gè)步驟轉(zhuǎn)化為利福拉齊型抗生素，其中r為h或ac，r³獨(dú)立地選自h和c1-c12烷基；r⁴選自h、f、cl、br、i、c1-c12烷基和oh；并且z選自nh、n(c1-c12烷基)、o和s(參見，例如wo2014/194247中的圖23a和b，以及圖25a和b)。可制備苯并噁嗪并(z＝o)、苯并噻嗪并(z＝s)、苯并二嗪并(z＝nh、n(c1-c12)烷基)利福霉素(us7271165)。含有取代基的苯并噁嗪并利福霉素(bor)、苯并噻嗪并利福霉素(btr)和苯并二嗪并利福霉素(bdr)類似物根據(jù)us7271165第28欄式a中提供的編號(hào)方案編號(hào)，其通過引用并入本文?！?5-o-脫乙?；崩Ｃ顾厥侵咐Ｃ顾仡愃莆?，其中25位的乙酰基已被除去。在該位置進(jìn)一步衍生化的類似物稱為“25-o-脫乙?；?25-(取代基)利福霉素”，其中在完整化合物名稱中用衍生基團(tuán)的命名替換“取代基”。

利福霉素型抗生素部分可以通過在us4610919；us4983602；us5786349；us5981522；us4859661；us7271165；us2011/0178001；seligson等人，(2001)抗癌藥物(anti-cancerdrugs)12:305-13；chem.pharm.bull.,(1993)41:148中和在wo2014/194247中公開的類似方法合成，它們各自通過引用并入本文。通過使用標(biāo)準(zhǔn)的mic體外測(cè)定，通過測(cè)量其最小抑菌濃度(mic)篩選利福霉素型抗生素部分的抗微生物活性(tomioka等人，(1993)antimicrob.agentschemother.37:67)。

蛋白酶可切割的非肽類接頭

“蛋白酶可切割的非肽類接頭”(pml)是雙官能或多官能部分，其共價(jià)連接到一個(gè)或多個(gè)抗生素部分(abx)和抗體單元(ab)以形成式i的抗體-抗生素綴合物(aac)。aac中的蛋白酶可切割的非肽類接頭是用于細(xì)胞內(nèi)蛋白酶切割的底物，包括在溶酶體條件下。蛋白酶包括各種組織蛋白酶和半胱天冬酶。細(xì)胞內(nèi)aac的非肽類接頭的切割可以釋放具有抗菌作用的利福霉素型抗生素。

可以使用具有與抗生素(abx)和抗體(ab)結(jié)合的反應(yīng)官能性的接頭試劑或接頭-抗生素中間體，方便地制備抗體-抗生素綴合物(aac)。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，半胱氨酸工程化改造的抗體(ab)的半胱氨酸硫醇可以與接頭試劑，抗生素部分或抗生素-接頭中間體的官能團(tuán)形成鍵。

aac的pml部分可以包含一個(gè)氨基酸殘基。

aac的pml部分包含擬肽單元。

一方面，接頭試劑或接頭-抗生素中間體具有反應(yīng)性位點(diǎn)，其具有對(duì)存在于抗體上的親核半胱氨酸具有反應(yīng)性的親電子基團(tuán)?？贵w的半胱氨酸硫醇與接頭試劑或接頭抗生素上的親電子基團(tuán)反應(yīng)，形成共價(jià)鍵。有用的親電子基團(tuán)包括但不限于馬來酰亞胺和鹵代乙酰胺基團(tuán)。

根據(jù)klussman等人(2004)，bioconjugatechemistry15(4):765-773第766頁的綴合方法，且根據(jù)實(shí)施例18的方法，半胱氨酸改造的抗體與接頭試劑或接頭-抗生素中間體，與親電子官能團(tuán)如馬來酰亞胺或α-鹵代羰基反應(yīng)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，接頭試劑或接頭-抗生素中間體的反應(yīng)性基團(tuán)含有可與抗體的游離半胱氨酸硫醇形成鍵的硫醇反應(yīng)性官能團(tuán)。硫醇反應(yīng)官能團(tuán)的實(shí)例包括但不限于馬來酰亞胺、α-鹵代乙?；罨ト珑牾啺孵?、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯、酸酐、酰氯、磺酰氯、異氰酸酯和異硫氰酸酯。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，接頭試劑或抗生素-接頭中間體具有反應(yīng)性官能團(tuán)，其具有對(duì)存在于抗體上的親電子基團(tuán)具有反應(yīng)性的親核基團(tuán)?？贵w上有用的親電子基團(tuán)包括但不限于吡啶基二硫化物、醛和酮羰基。接頭試劑或抗生素-接頭中間體的親核基團(tuán)的雜原子可以與抗體上的親電子基團(tuán)反應(yīng)，并與抗體單元形成共價(jià)鍵。接頭試劑或抗生素-接頭中間體上有用的親核基團(tuán)包括但不限于酰肼、肟、氨基、硫醇、肼、縮氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼。抗體上的親電子基團(tuán)提供了用于連接到接頭試劑或抗生素-接頭中間體的方便位點(diǎn)。

pml部分可以包含一個(gè)或多個(gè)接頭組分。示例性的接頭組分包括單個(gè)氨基酸，例如瓜氨酸(“cit”)，6-馬來酰亞胺基己?；?“mc”)，馬來酰亞胺基丙?；?“mp”)和對(duì)氨基芐氧基羰基(“pab”)，n-琥珀酰亞胺基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(“spp”)和4-(n-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(“mcc”)。各種接頭組分是本領(lǐng)域已知的，其中一些在下面描述。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，接頭可以被調(diào)節(jié)溶解度或反應(yīng)性的基團(tuán)取代。例如，帶電荷的取代基如磺酸根(-so3-)或銨可增加試劑的水溶性，且促進(jìn)接頭試劑與抗體或抗生素部分的偶聯(lián)反應(yīng)，或促進(jìn)ab-l(抗體-接頭中間體)與abx或abx-l(抗生素-接頭中間體)與ab的偶聯(lián)反應(yīng)，這取決于用于制備aac的合成途徑。

本發(fā)明的aac明確地考慮但不限于用以下接頭試劑制備的那些：bmpeo、bmps、emcs、gmbs、hbvs、lc-smcc、mbs、mpbh、sbap、sia、siab、smcc、smpb、smph、磺基-emps、磺基-gmbs、磺基-kmos、磺基-mbs、磺基-siab、磺基-smcc、磺基-smpb、svsb(琥珀酰亞胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)和雙馬來酰亞胺試劑如dtme、bmb、bmdb、bmh、bmoe、bm(peg)2和bm(peg)3。雙馬來酰亞胺試劑允許半胱氨酸工程化改造的抗體的硫醇基團(tuán)以順序或匯合的方式連接到含硫醇的抗生素部分、標(biāo)記物或接頭中間體。除馬來酰亞胺之外，與半胱氨酸工程化改造的抗體、抗生素部分或接頭-抗生素中間體的巰基反應(yīng)的其它官能團(tuán)包括碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、異氰酸酯和異硫氰酸酯。

還可以通過其他商業(yè)來源，例如molecularbiosciencesinc.(boulder,co)獲得有用的接頭試劑，或根據(jù)toki等人(2002)j.org.chem.67:1866-1872；dubowchik等人(1997)tetrahedronletters,38:5257-60；walker,m.a.(1995)j.org.chem.60:5352-5355；frisch等人(1996)bioconjugatechem.7:180-186；us6214345；wo02/088172；us2003130189；us2003096743；wo03/026577；wo03/043583；和wo04/032828中描述的方法合成。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，aac的pml部分包含樹突狀接頭，用于將一個(gè)以上的抗生素部分通過支鏈多官能接頭部分共價(jià)連接至抗體上(sun等人(2002)生物有機(jī)&藥物化學(xué)通訊(bioorganic&medicinalchemistryletters)12:2215；sun等人(2003)生物有機(jī)&藥物化學(xué)(bioorganic&medicinalchemistry)11:1761-1768)。樹突狀接頭可以增加抗生素與抗體的摩爾比，即負(fù)載，其與aac的效力有關(guān)。因此，當(dāng)半胱氨酸改造的抗體僅具有一個(gè)反應(yīng)性半胱氨酸硫醇基團(tuán)時(shí)，多個(gè)抗生素部分可以通過樹枝狀接頭連接。

在式iaac的某些實(shí)施方案中，蛋白酶可切割的非肽類接頭pml具有下式：

-str-pm-y-

其中str是延伸單元；pm是擬肽單元，和y是間隔單元；

abx是利福霉素型抗生素；并且

p是從1到8的整數(shù)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，延伸單元“str”具有下式：

其中r⁶選自c1-c12亞烷基、c1-c12亞烷基-c(＝o)、c1-c12亞烷基-nh、(ch2ch2o)r、(ch2ch2o)r-c(＝o)、(ch2ch2o)r-ch2、和c1-c12亞烷基-nhc(＝o)ch2ch(噻吩-3-基)，其中r是1至10的整數(shù)。

示例性的延伸單元如下所示(其中波浪線表示與抗體共價(jià)連接的位點(diǎn))：

在一個(gè)實(shí)施方案中，pm具有下式：

其中r⁷和r⁸一起形成c3-c7環(huán)烷基環(huán)，和

aa是選自h、-ch3、-ch2(c6h5)、-ch2ch2ch2ch2nh2、-ch2ch2ch2nhc(nh)nh2、-chch(ch3)ch3、和-ch2ch2ch2nhc(o)nh2的氨基酸側(cè)鏈。

在一個(gè)實(shí)施方案中，間隔單元y包含對(duì)氨基芐基(pab)或?qū)Π被S氧基羰基(pabc)。

間隔單元允許釋放抗生素部分而沒有單獨(dú)的水解步驟。間隔單元可以是“自發(fā)性的(self-immolative)”或“非自發(fā)性的”。在某些實(shí)施方案中，接頭的間隔單元包含對(duì)氨基芐基單元(pab)。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，對(duì)氨基芐醇通過對(duì)氨基芐基基團(tuán)和抗生素部分之間的酰胺鍵，氨基甲酸酯，甲基氨基甲酸酯或碳酸酯連接到氨基酸單元上(hamann等人(2005)expertopin.ther.patents(2005)15:1087-1103)。在一個(gè)實(shí)施方案中，間隔單元是對(duì)氨基芐氧基羰基(pab)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)與非肽類接頭的pab間隔單元連接時(shí)，抗生素包含季胺，例如二甲基氨基哌啶基基團(tuán)。這種季胺接頭-抗生素中間體(pla)的實(shí)例是來自表2的pla-1至4。季胺基團(tuán)可調(diào)節(jié)抗生素部分的切割以優(yōu)化aac的抗菌作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗生素與非肽類接頭的pabc間隔單元連接，在aac中形成氨基甲酸酯官能團(tuán)。這樣的氨基甲酸酯官能團(tuán)也可以優(yōu)化aac的抗菌作用。pabc氨基甲酸酯接頭-抗生素中間體(pla)的實(shí)例是來自表2的pla-5和pla-6。

自發(fā)性間隔物的其它實(shí)例包括但不限于與pab基團(tuán)電子性相似的芳族化合物，例如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(us7375078；hay等人(1999)bioorg.med.chem.lett.9:2237)和鄰-或?qū)?氨基芐基縮醛?？梢允褂迷邗０锋I水解后進(jìn)行環(huán)化的間隔物，例如取代和未取代的4-氨基丁酸酰胺(rodrigues等人(1995)chemistrybiology2:223)，適當(dāng)取代的雙環(huán)[2.2.1]和雙環(huán)[2.2.2]環(huán)系統(tǒng)(storm等人(1972)j.amer.chem.soc.94:5815)和2-氨基苯基丙酸酰胺(amsberry等人(1990)j.org.chem.55:5867)。在甘氨酸處被取代的含胺藥物的消除(kingsbury等人(1984)j.med.chem.27:1447)也是在aac中有用的自發(fā)性間隔物的示例。

從aac切割釋放的活性抗生素的量可以通過半胱天冬酶釋放試驗(yàn)來測(cè)量。

對(duì)aac有用的接頭-抗生素中間體

實(shí)施例7-17通過將利福霉素型抗生素部分與接頭試劑偶聯(lián)制備式ii和表2的pml接頭-抗生素中間體(pla)。接頭試劑通過wo2012/113847；us7659241；us7498298；us20090111756；us2009/0018086；us6214345；dubowchik等人(2002)bioconjugatechem.13(4):855-869中描述的方法制備。

表2pml接頭-抗生素中間體

抗體-抗生素綴合物的實(shí)施方案

將半胱氨酸改造的rf1抗體通過游離半胱氨酸硫醇基團(tuán)與利福霉素的衍生物(稱為pipbor等)經(jīng)蛋白酶可切割的非肽類接頭連接，形成表3中的抗體-抗生素綴合物化合物(aac)。接頭設(shè)計(jì)為被包括組織蛋白酶b、d等的溶酶體蛋白酶切割。實(shí)施例7-17詳細(xì)描述了由抗生素和pml接頭等組成的接頭-抗生素中間體的產(chǎn)生。設(shè)計(jì)接頭，使得在pab部分處的酰胺鍵的切割將抗體與活性狀態(tài)的抗生素分離。

命名為“二甲基pipbor”的aac與“pipbor”aac相同，除了抗生素上的二甲基化的氨基和接頭上的氧羰基。

圖3顯示抗體-抗生素綴合物(aac)的藥物活化的可能機(jī)制?；钚钥股?ab)僅在aac在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)內(nèi)化后釋放。aac中抗體的fab部分結(jié)合金黃色葡萄球菌，而aac的fc部分通過fc受體介導(dǎo)的結(jié)合吞噬細(xì)胞(包括嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)增強(qiáng)細(xì)菌攝取。在內(nèi)化到吞噬溶酶體中后，接頭可以通過溶解體蛋白酶裂解，釋放吞噬溶酶體內(nèi)部的活性抗生素。

本發(fā)明的抗體-抗生素綴合物(aac)化合物的一個(gè)實(shí)施方案包括式i：

其中：

虛線表示任選的鍵；

r是h、c1-c12烷基或c(o)ch3；

r¹是oh；

pml是連接到r²或由r¹和r²形成的稠合雜芳基或雜環(huán)基的蛋白酶可切割的非肽類接頭；

ab是rf1抗體；并且

p是從1到8的整數(shù)。