相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2014年12月3日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?2/087,184的優(yōu)先權(quán),其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文,用于所有目的。序列表本申請(qǐng)包含已經(jīng)以ascii格式電子提交的序列表,其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文。所述ascii副本,于2015年11月20日創(chuàng)建,名稱為p32433-wo_sl.txt,且大小為190541字節(jié)。本發(fā)明涉及與利福霉素型抗生素綴合的抗壁磷壁酸(“抗wta”)抗體,以及所得抗體-抗生素綴合物在治療葡萄球菌感染中的用途。發(fā)明背景金黃色葡萄球菌(sa)是世界范圍內(nèi)人類細(xì)菌感染的重要原因,是醫(yī)院和社區(qū)環(huán)境中的主要健康問(wèn)題。然而,金黃色葡萄球菌不僅僅是一種病原體,并且通常定殖于健康個(gè)體的前鼻孔和皮膚。當(dāng)感染確實(shí)發(fā)生時(shí),在細(xì)菌傳播到血液中之后發(fā)生最嚴(yán)重的感染例如心內(nèi)膜炎、骨髓炎、壞死性肺炎和敗血癥(lowy,f.d.(1998)"staphylococcusaureusinfections"nengljmed339,520-532)。在過(guò)去幾十年中,由于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(mrsa)的出現(xiàn)和快速傳播,金黃色葡萄球菌的感染變得越來(lái)越難以治療,這種菌對(duì)所有已知的β-內(nèi)酰胺抗生素具有抗性(boucher,h.w.等人,(2009)"badbugs,nodrugs:noeskape!anupdatefromtheinfectiousdiseasessocietyofamerica"clininfectdis48,1-12)。侵入性mrsa感染難以治療,死亡率約為20%,是美國(guó)傳染性疾病死亡的主要原因。因此,萬(wàn)古霉素、利奈唑胺和達(dá)托霉素成為少數(shù)用于治療侵入性mrsa感染的抗生素(boucher,h.,miller,l.g.&razonable,r.r.(2010)"seriousinfectionscausedbymethicillin-resistantstaphylococcusaureus"clininfectdis51suppl2,s183-197)。然而,在mrsa臨床菌株中,已經(jīng)報(bào)道了對(duì)萬(wàn)古霉素降低的敏感性和對(duì)利奈唑胺和達(dá)托霉素的交叉耐藥性(nannini,e.,murray,b.e.&arias,c.a.(2010)"resistanceordecreasedsusceptibilitytoglycopeptides,daptomycin,andlinezolidinmethicillin-resistantstaphylococcusaureus"curropinpharmacol10,516-521)。隨著時(shí)間的推移,克服抗性所需的萬(wàn)古霉素劑量已經(jīng)上升至發(fā)生腎毒性的水平。因此,盡管有這些抗生素,侵入性mrsa感染的死亡率和發(fā)病率仍然很高。調(diào)查顯示,金黃色葡萄球菌能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)侵入和存活,包括負(fù)責(zé)細(xì)菌清除的吞噬細(xì)胞(thwaites,g.e.&gant,v.(2011)arebloodstreamleukocytestrojanhorsesforthemetastasisofstaphylococcusaureus?natrevmicrobiol9,215-222);rogers.d.e.,tompsett,r.(1952)"thesurvivalofstaphylococciwithinhumanleukocytes"j.exp.med95,209-230);gresham,h.d.,等人(2000)"survivalofstaphylococcusaureusinsideneutrophilscontributestoinfection"jimmunol164,3713-3722);kapral,f.a.&shayegani,m.g.(1959)"intracellularsurvivalofstaphylococci"jexpmed110,123-138;anwar,s.,等人(2009)"theriseandriseofstaphylococcusaureus:laughinginthefaceofgranulocytes"clinexpimmunol157,216-224);fraunholz,m.&sinha,b.(2012)"intracellularstaphylococcusaureus:live-inandletdie"frontcellinfectmicrobiol2,43);garzoni,c.&kelley,w.l.(2011)"returnofthetrojanhorse:intracellularphenotypeswitchingandimmuneevasionbystaphylococcusaureus"embomolmed3,115-117)。在靜脈感染后幾分鐘內(nèi),金黃色葡萄球菌被宿主吞噬細(xì)胞(主要是嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)攝取(rogers,d.e.(1956)"studiesonbacterimia:mechanismsrelatingtothepersistenceofbacteremiainrabbitsfollowingtheintravanousinjectionofstaphylococci"jem103,713)。盡管大多數(shù)細(xì)菌被這些細(xì)胞有效地殺死,但血液中吞噬細(xì)胞內(nèi)的金黃色葡萄球菌的不完全清除,可以使這些被感染的細(xì)胞作為“特洛伊木馬”用于從初始感染部位傳播細(xì)菌。實(shí)際上,正常的嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)患者可能比那些減少的嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)患者更容易傳播疾病(thwaites,g.e.&gant,v.(2011)見(jiàn)上文)。一旦傳遞到組織,金黃色葡萄球菌可以侵入各種非吞噬細(xì)胞類型,并且組織中的細(xì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌與慢性或復(fù)發(fā)性感染相關(guān)。此外,細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌暴露于次優(yōu)的抗生素濃度可能會(huì)促進(jìn)抗生素耐藥菌株的出現(xiàn),從而使臨床問(wèn)題更加突出。與這些觀察結(jié)果一致,用萬(wàn)古霉素或達(dá)托霉素治療侵入性mrsa感染的患者如菌血癥或心內(nèi)膜炎,與超過(guò)50%的失敗率相關(guān)(kullar,r.,davis,s.l.,levine,d.p.&rybak,m.j.,impactofvancomycinexposureonoutcomesinpatientswithmethicillin-resistantstaphylococcusaureusbacteremia:supportforconsensusguidelinessuggestedtargets.clinicalinfectiousdiseases:anofficialpublicationoftheinfectiousdiseasessocietyofamerica52,975-981(2011);fowler,vg,jr.等人,daptomycinversusstandardtherapyforbacteremiaandendocarditiscausedbystaphylococcusaureus.thenewenglandjournalofmedicine355,653-665(2006);yoon,yk,kim,j.y.,park,d.w.,sohn,j.w.和kim,m.j.,predictorsofpersistentmethicillin-resistantstaphylococcusaureusbacteraemiainpatientstreatedwithvancomycin.thejournalofantimicrobialchemotherapy65:1015-1018(2010))。因此,更成功的抗葡萄球菌治療應(yīng)包括清除細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌。安莎霉素是一類抗生素,包括利福霉素、利福平(rifampin)、利福平(rifampicin)、利福布汀、利福噴汀、利福拉齊、abi-1657及其類似物,它們抑制細(xì)菌rna聚合酶,并且具有對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和選擇性的革蘭氏陰性菌的特殊效力(rothstein,d.m.等人(2003)expertopin.invest.drugs12(2):255-271;us7342011;us7271165)。已經(jīng)報(bào)道了用于預(yù)防和治療金黃色葡萄球菌(包括mrsa)感染的免疫療法。us2011/0262477涉及細(xì)菌粘附蛋白eap、emp和adsa作為疫苗刺激針對(duì)mrsa的免疫應(yīng)答的應(yīng)用。wo2000/071585描述了與特異性金黃色葡萄球菌菌株分離物反應(yīng)的分離的單克隆抗體。us2011/0059085a1提出了利用對(duì)一種或多種sa莢膜抗原特異性的igm抗體的基于抗體的策略,但沒(méi)有描述實(shí)際的抗體??贵w-藥物綴合物(adc)也稱為免疫綴合物,是靶向的化學(xué)治療分子,其通過(guò)將有效的細(xì)胞毒性藥物靶向于表達(dá)抗原的腫瘤細(xì)胞,結(jié)合了抗體和細(xì)胞毒性藥物的理想特性(teicher,b.a.(2009)curr.cancerdrugtargets9:982-1004),從而通過(guò)使效力最大化和使靶點(diǎn)外毒性最小化來(lái)增強(qiáng)治療指數(shù)(carter,p.j.和senterp.d.(2008)thecancerj.14(3):154-169;chari,r.v.(2008)acc.chem.res.41:98-107)。adc包含通過(guò)接頭單元與細(xì)胞毒性藥物部分共價(jià)連接的靶向抗體。當(dāng)未綴合的藥物的全身給藥可能引起對(duì)正常細(xì)胞和試圖清除的腫瘤細(xì)胞的不可接受的毒性水平時(shí),免疫綴合物允許將藥物部分靶向遞送至腫瘤并在其中的細(xì)胞內(nèi)蓄積(polakisp.(2005)curr.opin.pharmacol.5:382-387)。描述了通過(guò)用于治療敗血癥的抗生素結(jié)合目標(biāo)細(xì)菌表面的非特異性免疫球蛋白-抗生素綴合物(us5,545,721;us6,660,267)。描述了抗生素綴合的抗體,其具有對(duì)細(xì)菌抗原(例如sa莢膜多糖)特異性的抗原結(jié)合部分,但缺乏與細(xì)菌fc結(jié)合蛋白例如葡萄球菌蛋白a反應(yīng)的恒定區(qū)(us7569677)。鑒于mrsa對(duì)常規(guī)抗生素的令人震驚的抗藥率,以及侵入性mrsa感染引起的死亡率和發(fā)病率,很需要治療金黃色葡萄球菌感染的新的治療藥物。本發(fā)明滿足了這一需求,提供了克服當(dāng)前治療組合物限制的組合物和方法以及提供從下面詳述中顯而易見(jiàn)的額外優(yōu)點(diǎn)。發(fā)明概述本發(fā)明提供了包括消除細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的獨(dú)特治療劑。本發(fā)明證實(shí),當(dāng)常規(guī)抗生素如萬(wàn)古霉素?zé)o效時(shí),這種治療劑在體內(nèi)是有效的。本發(fā)明提供稱為“抗體-抗生素綴合物”或“aac”的組合物,其包含通過(guò)共價(jià)連接與一種或多種利福霉素型抗生素部分綴合的抗體。本發(fā)明的一個(gè)方面是抗體-抗生素綴合物化合物,其包含抗壁磷壁酸(wta)抗體,其通過(guò)蛋白酶可切割的非肽類接頭共價(jià)連接利福霉素型抗生素。本發(fā)明的示例性實(shí)施方案是具有下式的權(quán)利要求1的抗體-抗生素綴合物:ab-(pml-abx)p其中:ab是抗壁磷壁酸抗體;pml是具有下式的蛋白酶可切割的非肽類接頭:-str-pm-y-其中str是延伸單元;pm是擬肽單元,和y是間隔單元;abx是利福霉素型抗生素;并且p是從1到8的整數(shù)。任何前述實(shí)施方案的抗體-抗生素綴合化合物可以包含本文所述的抗壁磷壁酸(wta)抗體中的任何一種。這些抗wta抗體結(jié)合金黃色葡萄球菌。在一項(xiàng)實(shí)施方案中,所述抗體是抗-wtaα單克隆抗體。在示例性的wtaα抗體中,該ab是包含輕(l)鏈和重(h)鏈的單克隆抗體,l鏈包含cdrl1、cdrl2和cdrl3,且h鏈包含cdrh1、cdrh2和cdrh3,其中cdrl1、cdrl2和cdrl3與cdrh1、cdrh2和cdrh3分別包含以下各個(gè)抗體4461(seqidno.1-6)、4624(seqidno.7-12)、4399(seqidno.13-18)和6267(seqidno.19-24)的cdr的氨基酸序列,如表1a和1b所示。在一些實(shí)施方案中,抗wta抗體包含重鏈可變區(qū)(vh),其中vh分別與選自抗體4461、4624、4399和6267的seqidno.26、seqidno.28、seqidno.30、seqidno.32的vh序列在vh區(qū)長(zhǎng)度上包含至少95%的序列同一性。該抗體還可以包含l鏈可變區(qū)(vl),其中vl分別與選自抗體4461、4624、4399和6267的seqidno.25、seqidno.27、seqidno.29、seqidno.31的vl序列在vl區(qū)域長(zhǎng)度上包含至少95%的序列同一性。在另一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明的抗體-抗生素綴合化合物包含抗wtaβ單克隆抗體。示例性的抗wtaβ抗體包含輕鏈和h鏈,所述l鏈包含cdrl1、cdrl2和cdrl3,且所述h鏈包含cdrh1、cdrh2和cdrh3,其中cdrl1、cdrl2和cdrl3以及cdrh1、cdrh2和cdrh3包含圖12(seqidno:33-110)所示每個(gè)抗體的相應(yīng)cdr的氨基酸序列??捎糜诋a(chǎn)生本發(fā)明的aac的另一個(gè)抗wtaβ抗體包含l鏈可變區(qū)(vl),其中vl在vl區(qū)域的長(zhǎng)度上包含與選自分別對(duì)應(yīng)于以下每種抗體的vl序列至少95%的序列同一性:6078、6263、4450、6297、6239、6232、6259、6292、4462、6265、6253、4497和4487,如圖15a-1、15a-2、15a-3在kabat位置1-107處所示。該抗體還可以包含重鏈可變區(qū)(vh),其中vh在vh區(qū)域的長(zhǎng)度上包含與選自分別對(duì)應(yīng)于以下每個(gè)抗體的vh序列至少95%的序列同一性:6078、6263、4450、6297、6239、6232、6259、6292、4462、6265、6253、4497和4487,如圖15b-1至15b-6在kabat位置1-113所示。在另一種抗wtaβ抗體中,vl包含seqidno.111序列,且vh包含seqidno.112序列,其中x是q或e,x1是m、i或v。本發(fā)明提供了可用于產(chǎn)生本發(fā)明的aac的抗wtaβ,其中抗體輕鏈含有工程化的半胱氨酸并且包含seqidno.115序列,且h鏈包含seqidno.116,其中x是m、i或v。在可選的配對(duì)l和h鏈中,抗體輕鏈包含seqidno.113序列,且h鏈含有工程化的半胱氨酸,并包含seqidno.117,其中x是m、i或v。cys可以被設(shè)計(jì)進(jìn)入l鏈和h鏈中的每一個(gè);在該wtaβ抗體的一個(gè)實(shí)例中,輕鏈含有工程化的半胱氨酸,并且包含seqidno.115序列,并且h鏈含有工程化的半胱氨酸,并且包含seqidno.117,其中x是m、i或v??捎糜诰Y合的另一抗wtaβ抗體包含vh和vl,其中vh在seqidno.156的vh的長(zhǎng)度上包含至少95%的序列同一性,并且vl在序列seqidno.119的vl的長(zhǎng)度上包含至少95%的序列同一性。在具體實(shí)施方案中,抗wtaβ抗體包含vh和vl,vh包含seqidno.156的序列,且vl包含seqidno.119的序列。本發(fā)明的抗wtaβ抗體可以包含含有seqidno.121序列的l鏈和含有seqidno.124序列的h鏈。在另一個(gè)實(shí)例中,抗wtaβ抗體包含含有seqidno.123序列的l鏈和含有seqidno.157或seqidno.124序列的h鏈。在其它實(shí)施方案中,該抗體包含:i)seqidno.99-104的l鏈和h鏈cdr、或seqidno.33-38的l鏈和h鏈cdr;或ii)與seqidno.120或seqidno.156的vh配對(duì)的seqidno.119或seqidno.123的vl;或iii)與seqidno.112的vh配對(duì)的seqidno.111的vl。在本發(fā)明的aac的一些實(shí)施方案中,抗體結(jié)合與前述任一實(shí)施方案的抗體相同的表位。在任何一項(xiàng)前述實(shí)施方案中,抗體可以是缺乏fc區(qū)的抗原結(jié)合片段。在一些實(shí)施方案中,抗體是f(ab)或f(ab')2。在一些實(shí)施方案中,抗體還包含重鏈恒定區(qū)和/或輕鏈恒定區(qū),其中重鏈恒定區(qū)和/或輕鏈恒定區(qū)包含被半胱氨酸殘基取代的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方案中,重鏈恒定區(qū)包含氨基酸取代a118c和/或s400c,和/或輕鏈恒定區(qū)包含氨基酸取代v205c,其中所述編號(hào)系統(tǒng)根據(jù)eu編號(hào)。在上述任何抗體的一些實(shí)施方案中,抗體不是igm同種型。在上述任何抗體的一些實(shí)施方案中,抗體是igg(例如,igg1、igg2、igg3、igg4)、ige、igd或iga(例如,iga1或iga2)同種型。本發(fā)明的一個(gè)示例性實(shí)施方案是包含抗體-抗生素綴合化合物和藥學(xué)上可接受的載體、助流劑、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。本發(fā)明的抗wta-aac可用作有效治療人和獸醫(yī)學(xué)的葡萄球菌的抗微生物劑,例如金黃色葡萄球菌、腐生性葡萄球菌和溶血性葡萄球菌,以及利斯特菌,例如單核細(xì)胞增生利斯特菌。在具體方面,本發(fā)明的aac可用于治療金黃色葡萄球菌感染。因此,本發(fā)明還提供了治療人或獸醫(yī)學(xué)患者中的葡萄球菌感染的方法,包括向患者施用治療有效量的前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的抗體-抗生素綴合物。在一個(gè)實(shí)施方案中,所述細(xì)菌感染是金黃色葡萄球菌感染。在一些實(shí)施方案中,患者被診斷患有金黃色葡萄球菌感染。在一些實(shí)施方案中,治療細(xì)菌感染包括減少細(xì)菌負(fù)荷或計(jì)數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方案中,所述治療方法是向包括金黃色葡萄球菌在內(nèi)的細(xì)菌感染導(dǎo)致菌血癥的患者施用。在具體實(shí)施方案中,該方法用于治療葡萄球菌性心內(nèi)膜炎或骨髓炎。在一個(gè)實(shí)施方案中,抗體-抗生素綴合化合物以約50mg/kg至100mg/kg的劑量施用于感染的患者。還提供了在金黃色葡萄球菌感染的患者細(xì)胞中殺死細(xì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌而不殺死宿主細(xì)胞的方法,其通過(guò)施用任何上述實(shí)施方案的抗wta抗生素綴合化合物。通過(guò)使耐藥株(persister)細(xì)菌與任何前述實(shí)施方案的aac接觸,提供了另一種用于在體內(nèi)殺死耐藥株葡萄球菌細(xì)菌細(xì)胞(例如金黃色葡萄球菌)的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中,所述治療方法還包括施用第二治療劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中,第二治療劑是抗生素,其包括普遍針對(duì)金黃色葡萄球菌或特別是mrsa的抗生素。在一個(gè)實(shí)施方案中,與本發(fā)明的抗體-抗生素綴合化合物組合施用的第二抗生素選自以下結(jié)構(gòu)類別:(i)氨基糖苷類;(ii)β-內(nèi)酰胺類;(iii)大環(huán)內(nèi)酯/環(huán)肽類;(iv)四環(huán)素類;(v)氟代喹啉/氟喹諾酮類;(vi)和噁唑烷酮。在一個(gè)實(shí)施方案中,與本發(fā)明的抗體-抗生素綴合化合物組合施用的第二抗生素選自克林霉素、新生霉素、瑞他帕林(retapamulin)、達(dá)托霉素、gsk-2140944、cg-400549、西他沙星、替考拉寧、三氯生、萘啶酮(napthyridone)、雷得唑來(lái)(radezolid)、多柔比星、氨芐西林、萬(wàn)古霉素、亞胺培南、多利培南、吉西他濱、達(dá)巴萬(wàn)星(dalbavancin)和阿奇霉素。在本文的一些實(shí)施方案中,感染患者中的細(xì)菌負(fù)荷在治療后已經(jīng)降低到不可檢測(cè)的水平。在一個(gè)實(shí)施方案中,與治療前的陽(yáng)性血培養(yǎng)物相比,患者的血培養(yǎng)物在治療后是陰性的。在本文的一些實(shí)施方案中,個(gè)體中的細(xì)菌耐藥性是不可檢測(cè)的或低的。在本文的一些實(shí)施方案中,個(gè)體對(duì)甲氧西林或萬(wàn)古霉素的治療無(wú)反應(yīng)。本發(fā)明的示例性實(shí)施方案是制備抗體-抗生素綴合物的方法,包含將利福霉素型抗生素與抗壁磷壁酸(wta)抗體綴合。本發(fā)明的一個(gè)示例性實(shí)施方案是用于治療細(xì)菌感染的藥盒,其包含:a)藥物組合物,包含抗體-抗生素綴合化合物和藥學(xué)上可接受的載體、助流劑、稀釋劑或賦形劑;和b)使用說(shuō)明。本發(fā)明的一個(gè)方面是具有式ii的抗生素-接頭中間體:其中:虛線表示任選的鍵;r是h、c1-c12烷基或c(o)ch3;r1是oh;r2是ch=n-(雜環(huán)基),其中所述雜環(huán)基任選地被一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自c(o)ch3、c1-c12烷基、c1-c12雜芳基、c2-c20雜環(huán)基、c6-c20芳基和c3-c12碳環(huán)基的基團(tuán)取代;或r1和r2形成五元或六元稠合雜芳基或雜環(huán)基,并且任選地形成螺或稠合的六元雜芳基、雜環(huán)基、芳基或碳環(huán)基環(huán),其中所述螺或稠合的六元雜芳基、雜環(huán)基、芳基或碳環(huán)基環(huán)任選地被h、f、cl、br、i、c1-c12烷基或oh取代;pml是連接到r2或由r1和r2形成的稠合雜芳基或雜環(huán)基的蛋白酶可切割的非肽類接頭;并具有下式:-str-pm-y-其中str是延伸單元;pm是擬肽單元,和y是間隔單元;并且x是選自馬來(lái)酰亞胺、硫醇、氨基、溴化物、溴乙酰氨基、碘乙酰氨基、對(duì)甲苯磺酸酯、碘化物、羥基、羧基、吡啶基二硫化物和n-羥基琥珀酰亞胺的反應(yīng)性官能團(tuán)。應(yīng)當(dāng)理解,本文描述的各種實(shí)施方案的一個(gè)、一些或全部特性可以組合以形成本發(fā)明的其他實(shí)施方案。本發(fā)明的這些和其它方面對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是很明顯的。附圖簡(jiǎn)述圖1:在體內(nèi)和體外,mrsa的細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存物被保護(hù)免于萬(wàn)古霉素殺死。圖1a顯示了產(chǎn)生游離細(xì)菌(浮游)與細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的示意圖。通過(guò)靜脈注射大約相同劑量的活的游離細(xì)菌或細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌感染四組小鼠,并且選擇的組在感染后立即用萬(wàn)古霉素處理,然后每天一次(參見(jiàn)實(shí)施例2)。圖1b和圖1c分別顯示感染后4天的感染小鼠的腎臟和腦部細(xì)菌負(fù)荷。虛線表示測(cè)定的檢測(cè)限。圖1d顯示當(dāng)在單層感染細(xì)胞上培養(yǎng)時(shí),mrsa被保護(hù)免于萬(wàn)古霉素殺死。(nd=未檢測(cè)到)。圖1e和圖1f顯示當(dāng)在單層感染細(xì)胞上培養(yǎng)時(shí),mrsa能夠在萬(wàn)古霉素存在下生長(zhǎng)。將mrsa(游離細(xì)菌)接種在培養(yǎng)基、培養(yǎng)基+萬(wàn)古霉素、或培養(yǎng)基+萬(wàn)古霉素并接種在單層mg63成骨細(xì)胞(圖1e)或人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(hbmec,圖1f)中。細(xì)胞外細(xì)菌(游離細(xì)菌)在僅有培養(yǎng)基時(shí)生長(zhǎng)良好,但被萬(wàn)古霉素殺死。在含有單層哺乳動(dòng)物細(xì)胞(細(xì)胞內(nèi)+萬(wàn)古霉素)的孔中,一部分細(xì)菌在感染后的前8個(gè)小時(shí)被保護(hù)免于萬(wàn)古霉素殺死,并能在24小時(shí)內(nèi)在細(xì)胞內(nèi)的區(qū)室內(nèi)擴(kuò)張。誤差線顯示一式三份的孔的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖2顯示了抗體抗生素綴合物(aac)的概念。在一個(gè)實(shí)例中,aac由針對(duì)金黃色葡萄球菌表面上的表位的抗體組成,其通過(guò)溶酶體蛋白酶切割的接頭連接到有效的利福霉素型抗生素(例如rifalog)上。圖3顯示抗體-抗生素綴合物(aac)的藥物活化的可能機(jī)制。aac通過(guò)抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(fab)與細(xì)胞外細(xì)菌結(jié)合,并通過(guò)fc介導(dǎo)的吞噬作用促進(jìn)調(diào)理化細(xì)菌的攝取。接頭被溶酶體蛋白酶例如組織蛋白酶b切割。在切割接頭之后,接頭被水解,在吞噬溶酶體內(nèi)釋放游離抗生素。游離的抗生素殺死了調(diào)理化細(xì)胞和被吞噬的細(xì)菌,以及任何以前存在于同一區(qū)室中的內(nèi)化的細(xì)菌。圖4顯示革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌例如金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁,其具有壁磷壁酸(wta)、脂磷壁酸(lta)和肽聚糖(pgn)鞘的漫畫(huà)顯示,它們穩(wěn)定細(xì)胞膜并提供附著位點(diǎn)。圖5顯示了在定義部分中詳細(xì)描述的壁磷壁酸(wta)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和糖基修飾。圖6a和6b總結(jié)了來(lái)自mab庫(kù)的初步篩選的抗體特征,所述mab顯示結(jié)合來(lái)自u(píng)sa300或wood46金黃色葡萄球菌菌株的細(xì)胞壁制備物的陽(yáng)性elisa,如實(shí)施例3所述。在與wta結(jié)合的抗體中,4個(gè)特異于wtaα且13個(gè)特異性結(jié)合wtaβ。圖7a顯示了在直接從感染的小鼠腎臟分離的mrsa上alexa-488標(biāo)記的抗β-glcnacwta或抗α-glcnacwta抗體的滴定。抗cmv-gd抗體作為抗體同種型對(duì)照品。圖7b顯示用于產(chǎn)生aac的抗體識(shí)別了壁磷壁酸上的表位,由糖基轉(zhuǎn)移酶tars介導(dǎo)。在wtusa300、usa300-tarm或usa300-tars上使用抗β-glcnacwta抗體或同種型對(duì)照品進(jìn)行facs分析。圖8顯示了選擇強(qiáng)效的利福霉素型抗生素(rifalog)二甲基pipbor,因?yàn)槠錃⑺婪菑?fù)制性mrsa的能力。圖9:生長(zhǎng)抑制測(cè)定證明完整的tac(一種形式的aac)不會(huì)殺死浮游細(xì)菌,除非通過(guò)用組織蛋白酶b處理而釋放抗生素。將tac在僅有緩沖液(空心圓圈)中孵育或用組織蛋白酶b處理(實(shí)心圓圈)。完整的tac在過(guò)夜孵育后不能防止細(xì)菌生長(zhǎng)。用組織蛋白酶b預(yù)處理tac釋放了足夠的抗生素活性,以防止細(xì)菌在0.6ug/mltac中生長(zhǎng),其預(yù)計(jì)含有0.006μg/ml的抗生素。圖10顯示了如實(shí)施例10所述,與裸抗體相比,用抗-wta-pmlaac處理金黃色葡萄球菌感染的大鼠大幅減少或根除細(xì)菌計(jì)數(shù)。圖10a是顯示實(shí)施例10中所述的實(shí)驗(yàn)和注射時(shí)間點(diǎn)的時(shí)間線的示意圖。圖10b顯示用表3中的aac(dar2)處理,降低腎臟中的細(xì)菌負(fù)荷約7,000倍。圖10c顯示用aac(dar2)處理,降低心臟中的細(xì)菌負(fù)荷大約500倍。圖11a提供四種人抗wtaα抗體4461、4624、4399、6267的輕鏈可變區(qū)(vl)(分別為seqidno.25、27、29和31,按出現(xiàn)次序)的氨基酸序列比對(duì)。根據(jù)kabat編號(hào)的cdr序列cdrl1、l2和l3加下劃線。圖11b顯示圖11a的四種人抗wtaα抗體的重鏈可變區(qū)(vh)的氨基酸序列比對(duì)。根據(jù)kabat編號(hào)的cdr序列cdrh1、h2和h3以下劃線表示(分別為seqidno.26、28、30和32,按出現(xiàn)次序)。圖12顯示了13種人抗wtaβ抗體的l和h鏈的cdr序列(seqidno:33-110)。圖13a-1和13a-2顯示了抗wtaβab6078(未修飾)及其變體v2、v3、v4的全長(zhǎng)l鏈(輕鏈)的比對(duì)(分別為seqidno.113、113、115、113、115、113、115和115,按出現(xiàn)次序)。根據(jù)kabat編號(hào)的cdr序列cdrl1、l2和l3加下劃線??蚋鶕?jù)kabat和chothia顯示接觸殘基和cdr殘基。含有工程化cys的l鏈變體由恒定區(qū)末端附近的黑框中的c表示(在該情況下為eu殘基205)。變體名稱,例如v2lc-cys是指包含引入l鏈的cys的變體2。hclc-cys是指每個(gè)h和l鏈含有工程化的cys。變體2、3和4如圖13b所示在h鏈的開(kāi)始處具有改變。圖13b-1、13b-2、13b-3、13b-4顯示抗wtaβab6078(未修飾)及其變體v2、v3、v4的全長(zhǎng)h鏈(重鏈)的比對(duì)(分別為seqidno.114、139-144和143,按出現(xiàn)次序),其在h鏈開(kāi)始處具有變化。含有工程化cys的h鏈變體由恒定區(qū)開(kāi)始端的黑框中的c表示(在該情況下為eu殘基118)。圖14a-1和14a-2顯示抗-wtaβab4497(未修飾)和cys工程化l鏈(分別為seqidno.121、123、145和145,按出現(xiàn)次序)的全長(zhǎng)l鏈的比對(duì)。根據(jù)kabat編號(hào)的cdr序列cdrl1、l2和l3加下劃線??蚋鶕?jù)kabat和chothia顯示接觸殘基和cdr殘基。含有工程化cys的l鏈變體由恒定區(qū)末端附近虛線框中的c表示(在該情況下為eu殘基205)。圖14b-1、14b-2、14b-3顯示抗-wtaβab4497(未修飾)及其v8變體(其在cdrh3的96位將d改變?yōu)閑,含有或不含有工程化的cys)的全長(zhǎng)h鏈的比對(duì)(分別為seqidno:146-147、157和147,按出現(xiàn)的次序)。含有工程化cys的h鏈變體由恒定區(qū)開(kāi)始端的黑框中的c表示(在該情況下為eu殘基118)。圖15a-1、15a-2、15a-3顯示了十三種人抗wtaβ抗體的全長(zhǎng)輕鏈的氨基酸序列比對(duì)(分別為seqidno:113、158-167、121和168,按出現(xiàn)次序)??勺儏^(qū)(vl)跨越kabat氨基酸位置1-107。根據(jù)kabat編號(hào)的cdr序列cdrl1、l2和l3被加下劃線。圖15b-1至15b-6顯示了圖15a-1、15a-2、15a-3的十三種人抗wtaβ抗體的全長(zhǎng)重鏈的氨基酸序列比對(duì)(分別為seqidno:114、169-176、133-134、138和127,按出現(xiàn)次序)。可變區(qū)(vh)跨越kabat氨基酸位置1-113。根據(jù)kabat編號(hào)的cdr序列cdrh1、h2和h3加下劃線。用星號(hào)標(biāo)記的h鏈eu位置118可以改為cys,用于藥物綴合。用黑色突出顯示的殘基可以被不影響抗原結(jié)合的其它殘基替代,以避免脫酰胺化、天冬氨酸異構(gòu)化、氧化或n-連接的糖基化。圖16顯示ab4497與突出顯示氨基酸位置的其突變體和通過(guò)elisa測(cè)試的它們的相對(duì)抗原結(jié)合強(qiáng)度的比較。圖16分別公開(kāi)seqidno:177、177、177、178、178、179、179、180、180和180,按出現(xiàn)次序。圖17顯示在靜脈感染模型中用50mg/kg游離抗體的預(yù)處理是無(wú)效的。在用2x107cfu的usa300感染之前30分鐘通過(guò)靜脈內(nèi)注射向balb/c小鼠施用單劑量的載體對(duì)照物(pbs)或50mg/kg抗體。治療組包括不與金黃色葡萄球菌結(jié)合的同種型對(duì)照抗體(gd),其是針對(duì)壁磷壁酸(4497)的β修飾的抗體或針對(duì)壁磷壁酸(7578)的α修飾的抗體。通過(guò)腹膜內(nèi)注射(萬(wàn)古霉素),用110mg/kg萬(wàn)古霉素治療,每天向?qū)φ招∈笫┯脙纱巍1景l(fā)明的實(shí)施方案詳述現(xiàn)在將詳細(xì)參考本發(fā)明的某些實(shí)施方案,其實(shí)例在所附的結(jié)構(gòu)和分子式中示出。雖然將結(jié)合列舉的實(shí)施方案,包括方法、材料和實(shí)例來(lái)描述本發(fā)明,但是這樣的描述是非限制性的,并且本發(fā)明旨在覆蓋所有替代、修改和等同物,無(wú)論它們是一般已知的,還是并入本文。如果一個(gè)或多個(gè)并入的文獻(xiàn)、專利和類似材料與本申請(qǐng)不同或相矛盾,包括但不限于定義的術(shù)語(yǔ)、術(shù)語(yǔ)使用、所描述的技術(shù)等,以本申請(qǐng)為準(zhǔn)。除非另有定義,本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到可以用于本發(fā)明的實(shí)踐中的與本文所述類似或等同的許多方法和材料。本發(fā)明在任何情況下都不限于所述的方法和材料。本文提及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其它參考文獻(xiàn)通過(guò)引用整體并入本文。i.一般技術(shù)本文描述或參考的技術(shù)和方法,通常被本領(lǐng)域技術(shù)人員很好的理解和使用常規(guī)方法普遍采用,例如,下面描述的廣泛使用的方法:sambrook等人,分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)第三版(2001)冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社,冷泉港,紐約(molecularcloning:alaboratorymanual3dedition(2001)coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.);分子生物學(xué)現(xiàn)代方法(currentprotocolsinmolecularbiology)(f.m.ausubel等人編輯,(2003));酶學(xué)系列方法(theseriesmethodsinenzymology)(academicpress,inc.);pcr2:實(shí)用方法(pcr2:apracticalapproach)(m.j.macpherson,b.d.hames和g.r.taylor編輯(1995)),harlow和lane編輯(1988)抗體、實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)、和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)(antibodies,alaboratorymanual,andanimalcellculture)(r.i.freshney編輯(1987));寡核苷酸合成(oligonucleotidesynthesis)(m.j.gait編輯,1984);分子生物學(xué)方法(methodsinmolecularbiology),humanapress;細(xì)胞生物學(xué):實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(cellbiology:alaboratorynotebook)(j.e.cellis編輯,1998)academicpress;動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)(animalcellculture)(r.i.freshney)編輯,1987);細(xì)胞和組織培養(yǎng)介紹(introductiontocellandtissueculture)(j.p.mather和p.e.roberts,1998)plenumpress;細(xì)胞和組織培養(yǎng):實(shí)驗(yàn)室方法(cellandtissueculture:laboratoryprocedures)(a.doyle,j.b.griffiths,和d.g.newell編輯,1993-8)j.wiley和sons;實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)(handbookofexperimentalimmunology)(d.m.weir和c.c.blackwell編輯);哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移載體(genetransfervectorsformammaliancells)(j.m.miller和m.p.calos編輯,1987);pcr:聚合酶鏈?zhǔn)戏磻?yīng)(pcr:thepolymerasechainreaction),(mullis等人編輯,1994);現(xiàn)代免疫學(xué)方法(currentprotocolsinimmunology)(j.e.coligan等人編輯,1991);分子生物學(xué)簡(jiǎn)要方法(shortprotocolsinmolecularbiology)(wiley和sons,1999);免疫學(xué)(immunobiology)(c.a.janeway和p.travers,1997);抗體(antibodies)(p.finch,1997);抗生素:實(shí)用方法(antibodies:apracticalapproach)(d.catty.編輯,irlpress,1988-1989);單克隆抗體:實(shí)用方法(monoclonalantibodies:apracticalapproach)(p.shepherd和c.dean編輯,牛津大學(xué)出版社(oxforduniversitypress),2000);抗體應(yīng)用:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(usingantibodies:alaboratorymanual)(e.harlow和d.lane,冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(coldspringharborlaboratorypress),1999);抗體(theantibodies)(m.zanetti和j.d.capra編輯,harwoodacademicpublishers,1995);和癌癥:腫瘤學(xué)原理與實(shí)踐(cancer:principlesandpracticeofoncology)(v.t.devita等人編輯,j.b.lippincottcompany,1993)。本申請(qǐng)中使用的術(shù)語(yǔ)是基于iupac系統(tǒng)命名法,除非另有說(shuō)明。除非另有定義,本文所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義,并且符合:singleton等人(1994)微生物和分子生物學(xué)詞典,第二版(microbiologyandmolecularbiologydictionary,2nded.),j.wiley&sons,newyork,ny;和janeway,c.,travers,p.,walport,m.,shlomchik(2001)免疫學(xué),第五版(immunobiology,5thed.),garlandpublishing,newyork。ii.定義“抗體抗生素綴合物”或aac是由通過(guò)接頭與抗生素化學(xué)連接的抗體組成的化合物。抗體結(jié)合細(xì)菌表面上的抗原或表位,例如細(xì)菌細(xì)胞壁組分。如本發(fā)明所用,接頭是蛋白酶可切割的非肽類接頭,其被設(shè)計(jì)為被蛋白酶切割,包括組織蛋白酶b,其是大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型中發(fā)現(xiàn)的溶酶體蛋白酶(dubowchik等人(2002)bioconj.chem.13:855-869)。具有3個(gè)組分的aac圖描述于圖2中?!皌hiomabtm抗生素綴合物”或“tac”是aac的一種形式,其中抗體通過(guò)一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸與接頭-抗生素單元化學(xué)綴合,所述半胱氨酸通常是在抗體的特定位點(diǎn)被重組操作到抗體中的半胱氨酸,以不干擾抗原結(jié)合功能。術(shù)語(yǔ)“壁磷壁酸”(wta)的含義是指通過(guò)磷酸二酯鍵與n-乙酰胞壁酸糖的c6羥基連接而共價(jià)連接到肽聚糖上的陰離子糖聚合物。盡管精細(xì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)可以在生物體之間變化,但在一個(gè)實(shí)施方案中,wta是具有位置2上的d-核糖醇和d-丙氨酸基酯的1,5-磷酸二酯鍵和位置4上的糖基取代基的重復(fù)單元的核糖醇磷壁酸。糖基可以是存在于金黃色葡萄球菌中的n-乙酰葡糖胺基α或β。醛醇/糖醇磷酸酯重復(fù)序列上的羥基被陽(yáng)離子d-丙氨酸酯和單糖如n-乙酰葡糖胺取代。一方面,羥基取代基包括d-丙氨酰和α或βglcnhac。在一個(gè)特定方面,wta包含下式的化合物:其中波浪線表示重復(fù)連接單元或聚糖醇-p或肽聚糖的連接位點(diǎn),其中x是d-丙氨?;颞Ch;且y是α-glcnhac或β-glcnhac。glcnhac在金黃色葡萄球菌中,wta通過(guò)由n-乙酰葡糖胺(glcnac)-1-p和n-乙酰甘露糖胺(mannac)構(gòu)成的二糖與n-乙酰胞壁酸(murnac)的6-oh共價(jià)連接,其隨后與兩個(gè)或三個(gè)甘油磷酸酯單位連接。實(shí)際的wta聚合物由11-40個(gè)核糖醇-磷酸酯(rbo-p)重復(fù)單元組成。wta的分步合成首先由稱為tago的酶啟動(dòng),缺乏tago基因的金黃色葡萄球菌(通過(guò)人工刪除該基因)不產(chǎn)生任何wta??梢酝ㄟ^(guò)α-或β-糖苷鍵用在c2-oh位置的d-丙氨酸(d-ala)和/或c4-oh位置的n-乙酰葡糖胺(glcnac)進(jìn)一步定制該重復(fù)單元。根據(jù)金黃色葡萄球菌菌株或細(xì)菌的生長(zhǎng)期,糖苷鍵可以是α-、β-或這兩個(gè)端基異構(gòu)體的混合物。如本文所用,術(shù)語(yǔ)“wta抗體”是指結(jié)合wta(無(wú)論是wtaα或wtaβ)的任何抗體。術(shù)語(yǔ)“抗壁磷壁酸α抗體”或“抗-wtaα抗體”或“抗αwta”或“抗αglcnacwta抗體”可互換使用,是指特異性結(jié)合壁磷壁酸(wta)α的抗體。類似地,術(shù)語(yǔ)“抗壁磷壁酸β抗體”或“抗wtaβ抗體”或“抗-βwta”或“抗-βglcnacwta抗體”可互換使用,是指特異性結(jié)合壁磷壁酸(wta)β的抗體。術(shù)語(yǔ)“抗生素”(abx或abx)包括在給藥濃度和給藥間隔下特異性抑制微生物生長(zhǎng)或殺死微生物例如細(xì)菌、但是對(duì)宿主是非致死性的任何分子。在具體方面,抗生素在給藥濃度和給藥間隔下對(duì)宿主無(wú)毒性。對(duì)細(xì)菌有效的抗生素可以廣泛地分類為殺菌(即直接殺死)或抑菌(即防止分裂)??辜?xì)菌抗生素可進(jìn)一步分類為窄譜或廣譜。與窄譜抗生素相反,廣譜抗生素對(duì)于廣泛的細(xì)菌是有效的,包括革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌,而窄譜抗生素對(duì)于較小范圍或特定的細(xì)菌家族有效??股氐睦影ǎ?i)氨基糖苷類,例如阿米卡星、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、鏈霉素、妥布霉素、巴龍霉素,(ii)安莎霉素類,例如格爾德霉素、除莠霉素,(iii)碳頭孢烯類,例如氯碳頭孢,(iv)碳青霉烯類,例如厄他培南、多利培南、亞胺培南/西司他丁、美羅培南,(v)頭孢菌素類(第一代),例如頭孢羥氨芐、頭孢唑啉、頭孢噻吩、頭孢氨芐,(vi)頭孢菌素類(第二代),例如頭孢克洛、頭孢羥唑、頭孢西丁、頭孢丙烯、頭孢呋辛,(vi)頭孢菌素類(第三代),例如頭孢克肟、頭孢地尼、頭孢托侖、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢泊肟、頭孢他啶、頭孢布烯、頭孢唑肟、頭孢曲松,(vii)頭孢菌素類(第四代),例如頭孢吡肟,(viii)頭孢菌素類(第五代),例如頭孢吡普(ceftobiprole),(ix)糖肽類,例如替考拉寧、萬(wàn)古霉素,(x)大環(huán)內(nèi)酯類,例如阿奇霉素、克拉霉素、地紅霉素、紅霉素、羅紅霉素、醋竹桃霉素、泰利霉素、壯觀霉素,(xi)內(nèi)酰胺類,例如氨曲南,(xii)青霉素類,例如阿莫西林、氨芐西林、阿洛西林、羧芐西林、氯唑西林、雙氯西林、氟氯西林、美洛西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素、哌拉西林、替卡西林,(xiii)抗生素多肽類,例如桿菌肽、粘菌素、多粘菌素b,(xiv)喹諾酮類,例如環(huán)丙沙星、依諾沙星、加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星,(xv)磺酰胺類,例如磺胺米隆、偶氮磺胺、磺胺乙酰胺、磺胺甲二唑、磺胺、柳氮磺吡啶、磺胺異噁唑、甲氧芐啶、甲氧芐啶-磺胺甲噁唑(tmp-smx),(xvi)四環(huán)素類,例如地美環(huán)素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素、土霉素、四環(huán)素,和(xvii)其它如胂凡納明、氯霉素、克林霉素、林可霉素、乙胺丁醇、磷霉素、夫西地酸、呋喃唑酮、異煙肼、利奈唑胺、甲硝唑、莫匹羅星、呋喃妥因、平板霉素、吡嗪酰胺、奎奴普丁/達(dá)福普汀、利福平(rifampin)/利福平(rifampicin)或替硝唑。金黃色葡萄球菌也簡(jiǎn)稱為stapha或s.aureus。術(shù)語(yǔ)“耐甲氧西林金黃色葡萄球菌”(mrsa)也稱為多藥耐藥性金黃色葡萄球菌或耐苯唑西林金黃色葡萄球菌(orsa),是指對(duì)β-內(nèi)酰胺抗生素有抗性的金黃色葡萄球菌菌株,其中包括青霉素(如甲氧西林、雙氯西林、萘夫西林、苯唑西林等)和頭孢菌素類?!凹籽跷髁置舾行徒瘘S色葡萄球菌”(mssa)是指對(duì)β-內(nèi)酰胺抗生素敏感的金黃色葡萄球菌的任何菌株。術(shù)語(yǔ)“抗金黃色葡萄球菌抗體”和“與金黃色葡萄球菌結(jié)合的抗體”是指能夠以足夠的親和力結(jié)合金黃色葡萄球菌(“s.aureus”)上的抗原的抗體,使得抗體可用作靶向于金黃色葡萄球菌的診斷和/或治療劑。在一個(gè)實(shí)施方案中,例如通過(guò)放射免疫測(cè)定(ria)測(cè)量,抗金黃色葡萄球菌抗體與非相關(guān)的非金黃色葡萄球菌蛋白的結(jié)合程度不超過(guò)抗體與mrsa結(jié)合程度的約10%。在某些實(shí)施方案中,結(jié)合金黃色葡萄球菌的抗體具有≤1μm、≤100nm、≤10nm、≤5nm、≤4nm、≤3nm、≤2nm、≤1nm、≤0.1nm、≤0.01nm或≤0.001nm(例如10-8m或更小,例如10-8m至10-13m,例如10-9m至10-13m)的解離常數(shù)(kd)。在某些實(shí)施方案中,抗金黃色葡萄球菌抗體結(jié)合來(lái)自不同物種的葡萄球菌中保守的金黃色葡萄球菌的表位。術(shù)語(yǔ)“最小抑菌濃度”(mic)是指在過(guò)夜孵育后抑制微生物可見(jiàn)生長(zhǎng)的抗微生物劑的最低濃度。測(cè)定mic的試驗(yàn)方法是已知的。一種方法如下面的實(shí)施例部分所述。本文中的術(shù)語(yǔ)“抗體”以最廣泛的含義使用,并且具體涵蓋單克隆抗體、多克隆抗體、二聚體、多聚體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及其抗原結(jié)合的抗體片段(miller等人(2003)j.immunology170:4854-4861)。抗體可以是鼠、人、人源化、嵌合或衍生自其他物種??贵w是由能夠識(shí)別和結(jié)合特異性抗原的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)(janeway,c.,travers,p.,walport,m.,shlomchik(2001)immunobiology,第五版,garlandpublishing,newyork)。靶抗原通常具有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn),也稱為表位,由多個(gè)抗體上的cdr識(shí)別。特異性結(jié)合不同表位的每種抗體具有不同的結(jié)構(gòu)。因此,一種抗原可被多于一種相應(yīng)的抗體識(shí)別和結(jié)合??贵w包括全長(zhǎng)免疫球蛋白分子或全長(zhǎng)免疫球蛋白分子的免疫活性部分,即包含抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子,其免疫特異性地結(jié)合關(guān)注的靶點(diǎn)的抗原或其部分,這樣的靶點(diǎn)包括但不限于癌細(xì)胞或產(chǎn)生與自身免疫疾病相關(guān)的自身免疫抗體的細(xì)胞、感染的細(xì)胞、或微生物如細(xì)菌。本文公開(kāi)的免疫球蛋白(ig)可以是除igm以外的任何同種型(例如igg、ige、igd和iga)和亞類(例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)。免疫球蛋白可以來(lái)自任何物種。在一方面,ig是人、鼠或兔來(lái)源的。在一個(gè)具體實(shí)施方案中,ig是人來(lái)源的??贵w的“類”指由其重鏈擁有的恒定結(jié)構(gòu)域或恒定區(qū)的類型。存在五個(gè)主要類別的抗體:iga、igd、ige、igg和igm,并且這些類別中的幾種可以進(jìn)一步劃分成亞類(同種型),例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。對(duì)應(yīng)于不同類別免疫球蛋白的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別稱作α、δ、ε、γ和μ?!疤烊豢贵w”是指具有不同結(jié)構(gòu)的天然存在的免疫球蛋白分子。舉例來(lái)說(shuō),天然igg抗體為約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白,由二硫鍵鍵合的兩個(gè)相同輕鏈和兩個(gè)相同重鏈構(gòu)成。自n末端至c末端,各重鏈具有可變區(qū)(vh),還被稱為可變重結(jié)構(gòu)域或重鏈可變結(jié)構(gòu)域,隨后為三個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域(ch1、ch2及ch3)。類似地,自n末端至c末端,各輕鏈具有可變區(qū)(vl),還被稱為可變輕結(jié)構(gòu)域或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域,隨后為恒定輕(cl)結(jié)構(gòu)域??贵w的輕鏈可基于其恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列而指定為稱為κ(κ)和λ(λ)的兩種類型之一。術(shù)語(yǔ)“全長(zhǎng)抗體”、“完整抗體”和“全抗體”在本文中可互換地用于指具有與天然抗體結(jié)構(gòu)基本相似的抗體,或具有包含本文定義的fc區(qū)的重鏈的抗體??贵w的“抗原結(jié)合片段”是指非完整抗體的分子,其包含完整抗體的一部分,能結(jié)合與完整抗體結(jié)合的抗原。抗體片段的實(shí)例包括但不限于fv、fab、fab'、fab'-sh、f(ab')2;雙體;線性抗體;單鏈抗體分子(例如scfv);以及由抗體片段形成的多特異性抗體。如本文中所用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”是指從基本上同質(zhì)的抗體群體獲得的抗體,即,組成群體的單個(gè)抗體是相同的和/或結(jié)合相同的表位,除了可能的變體抗體之外,例如,含有天然發(fā)生的突變或在產(chǎn)生單克隆抗體制備物期間出現(xiàn)(例如,糖基化的天然變異),這類變體通常以微小的量存在。igg1抗體的一個(gè)這樣的可能變體是重鏈恒定區(qū)的c末端賴氨酸(k)的切割。與通常包括針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物不同,單克隆抗體制備物的每個(gè)單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一決定簇。因此,修飾語(yǔ)“單克隆的”指示該抗體的特征為從基本上同質(zhì)的抗體群體獲得,并且不得解釋為要求通過(guò)任何特定方法產(chǎn)生該抗體。例如,可以通過(guò)多種技術(shù)產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體,所述技術(shù)包括但不限于雜交瘤方法、重組dna方法、噬菌體展示方法和利用含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法,在本文中描述了用于產(chǎn)生單克隆抗體的這類方法和其他示例性方法。除了它們的特異性之外,單克隆抗體是有利的,因?yàn)樗鼈兛梢栽诓槐黄渌贵w污染的情況下合成。術(shù)語(yǔ)“嵌合抗體”是指其中一部分重鏈和/或輕鏈衍生自特定來(lái)源或物種而重鏈和/或輕鏈的其余部分衍生自不同來(lái)源或物種的抗體。“人抗體”是這樣一種抗體,其擁有對(duì)應(yīng)于人或人細(xì)胞產(chǎn)生的或衍生自利用人抗體庫(kù)或其他編碼人抗體的序列的非人來(lái)源的抗體的氨基酸序列。人抗體的這種定義特別排除包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體?!叭嗽椿贵w”指包含來(lái)自非人hvr的氨基酸殘基和來(lái)自人fr的氨基酸殘基的嵌合抗體。在某些實(shí)施方案中,人源化抗體將包含至少1個(gè)、并且通常2個(gè)可變結(jié)構(gòu)域中的基本上全部,其中hvr(例如,cdr)中的全部或基本上全部與非人抗體中的那些對(duì)應(yīng),并且fr中的全部或基本上全部與人抗體中的那些對(duì)應(yīng)。人源化抗體任選地可以包含從人抗體衍生的抗體恒定區(qū)的至少一部分。抗體(例如,非人抗體)的“人源化形式”指已經(jīng)進(jìn)行過(guò)人源化的抗體。術(shù)語(yǔ)“可變區(qū)”或“可變域”是指抗體的重或輕鏈中牽涉抗體結(jié)合抗原的結(jié)構(gòu)域。天然抗體的重鏈和輕鏈可變域(分別為vh和vl)一般具有類似的結(jié)構(gòu),其中每個(gè)域包含4個(gè)保守的框架區(qū)(fr)和3個(gè)高變區(qū)(hvr)。(參見(jiàn),例如,kindt等人kubyimmunology,第6版,w.h.freeman和co.,第91頁(yè)(2007))。單個(gè)vh或vl域可足以賦予抗原結(jié)合特異性。此外,可以分別使用來(lái)自結(jié)合抗原的抗體的vh或vl域以篩選互補(bǔ)vl或vh域的文庫(kù),從而分離結(jié)合特定抗原的抗體。參見(jiàn),例如portolano等人j.immunol.150:880-887(1993);clarkson等人,nature352:624-628(1991)。在本文中術(shù)語(yǔ)“高變區(qū)”,“hvr”或“hv”是指抗體可變區(qū)的區(qū)域,其在序列上是高變的(“互補(bǔ)決定區(qū)”或“cdr”)和/或形成結(jié)構(gòu)上定義的環(huán)和/或含有抗原接觸殘基(“抗原接觸”)。通常,抗體包含六個(gè)hvr;三個(gè)在vh(h1、h2、h3)中,三個(gè)在vl(l1、l2、l3)中。在天然抗體中,h3和l3顯示了六個(gè)hvr中的最大多樣性,特別是h3被認(rèn)為在賦予抗體的特異性方面發(fā)揮獨(dú)特的作用。參見(jiàn),例如,xu等人,immunity13:37-45(2000);johnson和wu,分子生物學(xué)方法(methodsinmolecularbiology)248:1-25(lo編輯,humanpress,totowa,nj,2003)。實(shí)際上,僅由重鏈組成的天然存在的駱駝抗體在輕鏈不存在的情況下是功能性的和穩(wěn)定的(hamers-casterman等人,(1993)nature363:446-448;sheriff等人,(1996)naturestruct.biol.3:733-736)。許多hvr描繪正在使用中并被包括在本文中。kabat互補(bǔ)決定區(qū)(cdrs)基于序列變異性并且是最常用的(kabat等人,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth),bethesda,md.(1991))。chothia改為指結(jié)構(gòu)環(huán)的位置(chothia和lesk,(1987)j.mol.biol.196:901-917)。對(duì)于抗原接觸,請(qǐng)參閱maccallum等人j.mol.biol.262:732-745(1996)。abmhvrs代表kabathvrs和chothia結(jié)構(gòu)環(huán)之間的折衷,并由oxfordmolecular的abm抗體建模軟件使用。“接觸”hvr是基于對(duì)可用的復(fù)雜晶體結(jié)構(gòu)的分析。這些hvr中每一個(gè)的殘基如下所述。hvr可以包含以下的“延伸hvr”:在vl中的24-36或24-34(l1)、46-56或50-56(l2)和89-97或89-96(l3),以及在vh中的26-35(h1)、50-65或49-65(h2)和93-102、94-102或95-102(h3)。除非另有說(shuō)明,在本文中根據(jù)kabat等人的以上文章來(lái)編號(hào)hvr殘基、cdr殘基和可變結(jié)構(gòu)域中的其它殘基(例如fr殘基)。術(shù)語(yǔ)“依照kabat的可變結(jié)構(gòu)域殘基編號(hào)”或“依照kabat的氨基酸位置編號(hào)”及其變化形式指kabat等人的以上文章中的用于抗體編制的重鏈可變結(jié)構(gòu)域或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域編輯的編號(hào)系統(tǒng)。使用此編號(hào)系統(tǒng),實(shí)際的線性氨基酸序列可包含較少或另外的氨基酸,對(duì)應(yīng)于可變結(jié)構(gòu)域fr或hvr的縮短或插入。例如,重鏈可變結(jié)構(gòu)域可包含h2的殘基52后的單一氨基酸插入(依照kabat為殘基52a)及重鏈fr殘基82后的插入殘基(例如依照kabat為殘基82a、82b和82c等)。對(duì)于給定抗體的殘基kabat編號(hào)可通過(guò)將抗體序列與“標(biāo)準(zhǔn)的”kabat編號(hào)序列對(duì)比同源區(qū)域來(lái)確定?!翱蚣堋被颉癴r”是指除高變區(qū)(hvr)殘基外的可變結(jié)構(gòu)域殘基。一般地,可變結(jié)構(gòu)域的fr由4個(gè)fr結(jié)構(gòu)域組成:fr1、fr2、fr3和fr4。因此,hvr和fr序列在vh(或vl)中一般以如下順序出現(xiàn):fr1-h1(l1)-fr2-h2(l2)-fr3-h3(l3)-fr4。為了本文的目的,“受體人框架”為包含由人免疫球蛋白框架或如下文定義的人共有框架衍生的輕鏈可變域(vl)框架或重鏈可變域(vh)框架的氨基酸序列的框架。由人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受體人框架可以包含與其相同的氨基酸序列,或者它可以含有氨基酸序列改變。在一些實(shí)施方案中,氨基酸改變的數(shù)目是10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。在一些實(shí)施方案中,vl受體人框架與vl人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同?!叭斯灿锌蚣堋笔潜硎救嗣庖咔虻鞍譾l或vh框架序列選集中最常存在的氨基酸殘基的框架。通常,人免疫球蛋白vl或vh序列選集來(lái)自可變域序列亞組。通常,序列的亞組是如kabat等人,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,fifthedition,nihpublication91-3242,bethesdamd(1991),第1-3卷中的亞組。在一個(gè)實(shí)施方案中,對(duì)于vl,亞組是如kabat等人的上述文章中的亞組κi。在一個(gè)實(shí)施方案中,對(duì)于vh,亞組是如kabat等人的上述文章中的亞組iii。本文中的術(shù)語(yǔ)“fc區(qū)”用于定義免疫球蛋白重鏈的c末端區(qū)域。該術(shù)語(yǔ)包括天然序列fc區(qū)和變體fc區(qū)。盡管免疫球蛋白重鏈的fc區(qū)的邊界可能變化,但人igg重鏈fc區(qū)通常定義為從cys226或從pro230位置的氨基酸殘基延伸到其羧基末端。fc區(qū)的c末端賴氨酸(根據(jù)eu編號(hào)系統(tǒng)的殘基447-也稱為eu指數(shù),如在kabat等人,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md,1991中所述)可以除去,例如,在抗體的制備或純化期間,或通過(guò)重組工程化改造編碼抗體重鏈的核酸。因此,完整抗體的組合物可以包含除去所有k447殘基的抗體群體、未除去k447殘基的抗體群體以及具有和不具有k447殘基的抗體混合物的抗體群體。術(shù)語(yǔ)“fc受體”或“fcr”還包括新生兒受體fcrn,其負(fù)責(zé)將母體igg轉(zhuǎn)移至胎兒。guyer等人,j.immunol.117:587(1976)和kim等人,j.immunol.24:249(1994)。測(cè)量與fcrn結(jié)合的方法是已知的(參見(jiàn),例如,ghetie和ward,immunol.today18:(12):592-8(1997);ghetie等人,自然生物技術(shù)(naturebiotechnology)15(7):637-40(1997);hinton等人,j.biol.chem.279(8):6213-6(2004);wo2004/92219hinton等人)??梢詼y(cè)定fcrn在體內(nèi)的結(jié)合和人fcrn高親和力結(jié)合多肽的血清半衰期,例如,在轉(zhuǎn)基因小鼠或表達(dá)人fcrn的轉(zhuǎn)染的人細(xì)胞系中,或在其中施用具有變體fc區(qū)的多肽的靈長(zhǎng)類動(dòng)物中。wo2004/42072(presta)描述了抗體變體,其改善或減少與fcr的結(jié)合。另見(jiàn),例如shields等人,j.biol.chem.9(2):6591-6604(2001)?!坝H和力成熟的”抗體是指在一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)(hvr)中具有一個(gè)或多個(gè)改變的抗體,與不具有這種改變的親本抗體相比,這些改變導(dǎo)致抗體對(duì)抗原親和力的改善。術(shù)語(yǔ)“表位”是指抗原分子上與抗體結(jié)合的特定位點(diǎn)。“結(jié)合相同表位的抗體”作為參照抗體,是指在競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定中阻斷參照抗體與其抗原結(jié)合50%以上的抗體,相反地,在競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定中參照抗體阻斷該抗體與其抗原結(jié)合50%以上。本文提供了示例性的競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定?!奥憧贵w”是指未與異源部分(例如細(xì)胞毒性部分)或放射性標(biāo)記物綴合的抗體。裸抗體可以存在于藥物制劑中?!靶?yīng)子功能”是指歸因于抗體fc區(qū)的那些生物活性,其隨抗體同種型而變化。抗體效應(yīng)子功能的實(shí)例包括:c1q結(jié)合和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(cdc);fc受體結(jié)合;抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(adcc);吞噬;細(xì)胞表面受體(例如b細(xì)胞受體)的下調(diào);和b細(xì)胞激活?!翱贵w依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性”或adcc是指細(xì)胞毒性的形式,其中分泌的ig結(jié)合到某些細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如,天然殺傷(nk)細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)上存在的fc受體(fcr)上,使得這些細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞特異性結(jié)合攜帶抗原的靶細(xì)胞,隨后用細(xì)胞毒素殺死靶細(xì)胞??贵w“武裝”細(xì)胞毒性細(xì)胞,并且是通過(guò)這種機(jī)制殺死靶細(xì)胞所必需的。用于介導(dǎo)adcc、nk細(xì)胞的初級(jí)細(xì)胞僅表達(dá)fcγ(gamma)riii,而單核細(xì)胞表達(dá)fcγ(gamma)ri、fcγ(gamma)rii和fcγ(gamma)riii。在ravetch和kinet,annu.rev.immunol.9:457-92(1991)的第464頁(yè)表3中總結(jié)了造血細(xì)胞上的fc表達(dá)。為了評(píng)估關(guān)注的分子的adcc活性,可以進(jìn)行體外adcc測(cè)定,例如可以進(jìn)行在us5,500,362或us5,821,337中描述的那些。用于這種測(cè)定的有用的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(pbmc)和天然殺傷(nk)細(xì)胞?;蛘呋蛄硗猓梢栽隗w內(nèi)評(píng)價(jià)關(guān)注的分子的adcc活性,例如在clynes等人,pnasusa95:652-656(1998)中公開(kāi)的動(dòng)物模型中。“吞噬作用”是指病原體被宿主細(xì)胞(例如巨噬細(xì)胞或嗜中性粒細(xì)胞)吞噬或內(nèi)化的過(guò)程。吞噬細(xì)胞通過(guò)三種途徑介導(dǎo)吞噬作用:(i)直接細(xì)胞表面受體(例如,凝集素、整聯(lián)蛋白和清道夫受體),(ii)補(bǔ)體增強(qiáng)-使用補(bǔ)體受體(包括cri、c3b、cr3和cr4的受體)結(jié)合和攝取補(bǔ)體調(diào)理的病原體,和(iii)抗體增強(qiáng)-使用fc受體(包括fcγgammari,fcγgammariia和fcγgammariiia)結(jié)合抗體調(diào)理的粒子,然后其被內(nèi)化并與溶酶體融合成為吞噬溶酶體。在本發(fā)明中,認(rèn)為途徑(iii)在將抗mrsaaac治療劑遞送到感染的白細(xì)胞(例如嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)中起重要作用(微生物的吞噬作用:行動(dòng)的復(fù)雜性(phagocytosisofmicrobes:complexityinaction)d.underhill和aozinsky.(2002)annualreviewofimmunology,vol20:825)?!把a(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性”或“cdc”是指在補(bǔ)體存在下裂解靶細(xì)胞。經(jīng)典補(bǔ)體途徑的激活由補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(c1q)與結(jié)合于其同源抗原的抗體(適當(dāng)亞類)結(jié)合引發(fā)。為了評(píng)估補(bǔ)體活化,可以使用cdc測(cè)定法,如gazzano-santoro等人,j.immunol.methods202:163(1996)中所述??梢愿淖兣cfc區(qū)連接的碳水化合物。由哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的天然抗體通常包含支鏈的雙分枝寡糖,其通常通過(guò)n-連接與fc區(qū)的ch2結(jié)構(gòu)域的asn297連接。參見(jiàn),例如wright等人(1997)tibtech15:26-32。寡糖可以包括各種碳水化合物,例如甘露糖、n-乙酰氨基葡萄糖(glcnac)、半乳糖和唾液酸,以及連接到雙分枝寡糖結(jié)構(gòu)的“莖”中的glcnac的巖藻糖。在一些實(shí)施方案中,可以制備在igg中的寡糖修飾,以便產(chǎn)生具有某些另外改進(jìn)特性的igg。例如,提供具有碳水化合物結(jié)構(gòu)的抗體修飾,其缺乏與fc區(qū)(直接或間接)連接的巖藻糖。這樣的修改可能具有改善的adcc功能。參見(jiàn),例如us2003/0157108(presta,l.);us2004/0093621(kyowahakkokogyo有限公司)。與“去巖藻糖化”或“巖藻糖缺乏”的抗體修飾相關(guān)的出版物的實(shí)例包括:us2003/0157108;wo2000/61739;wo2001/29246;us2003/0115614;us2002/0164328;us2004/0093621;us2004/0132140;us2004/0110704;us2004/0110282;us2004/0109865;wo2003/085119;wo2003/084570;wo2005/035586;wo2005/035778;wo2005/053742;wo2002/031140;okazaki等人,j.mol.biol.336:1239-1249(2004);yamane-ohnuki等人biotech.bioeng.87:614(2004)。能夠產(chǎn)生去巖藻糖化抗體的細(xì)胞系的實(shí)例包括缺乏蛋白質(zhì)巖藻糖基化的lee13cho細(xì)胞(ripka等人,arch.biochem.biophys.249:533-545(1986);美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2003/0157108al,presta,l;和wo2004/056312a1,adams等人,特別是實(shí)施例11)和敲除細(xì)胞系,如α-1,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因、fut8、敲除的cho細(xì)胞(參見(jiàn)例如yamane-ohnuki等人,biotech.bioeng.87:614(2004);kanda,y.等人,biotechnol.bioeng.,94(4):680-688(2006);和wo2003/085107)?!胺蛛x的抗體”是已經(jīng)與其天然環(huán)境的一種成分分開(kāi)的抗體。在一些實(shí)施方案中,將抗體純化至超過(guò)95%或99%純度,如通過(guò)例如電泳(例如,sds-page、等電聚焦(ief)、毛細(xì)管電泳)或色譜(例如,離子交換或反相hplc)所測(cè)定的。關(guān)于評(píng)估抗體純度的方法的綜述參見(jiàn),例如flatman等人,j.chromatogr.b848:79-87(2007)?!胺蛛x的核酸”是指已經(jīng)與其天然環(huán)境的一種成分分開(kāi)的核酸分子。分離的核酸包括正常情況下包含該核酸分子的細(xì)胞中含有的該核酸分子,但是該核酸分子存在于染色體外或與其天然染色體位置不同的染色體位置?!胺蛛x的編碼抗wtaβ抗體的核酸”是指一種或多種編碼抗體重鏈和輕鏈的核酸分子,包括在單一載體或分開(kāi)的載體中的所述核酸分子,以及存在于宿主細(xì)胞中一個(gè)或多個(gè)位置處的所述核酸分子。如本文所用,術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”或“特異性”是指可測(cè)量和可重復(fù)的相互作用,例如靶點(diǎn)和抗體之間的結(jié)合,其在包括生物分子的異質(zhì)分子群體存在下確定靶點(diǎn)的存在。例如,特異性結(jié)合靶點(diǎn)(其可以是表位)的抗體是以更高的親和力、親合力、更容易和/或具有比其它靶點(diǎn)結(jié)合更長(zhǎng)的持續(xù)時(shí)間來(lái)結(jié)合該靶點(diǎn)的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中,例如通過(guò)放射免疫測(cè)定法(ria)測(cè)量,抗體與和wtaβ無(wú)關(guān)的靶點(diǎn)的結(jié)合程度低于抗體與靶點(diǎn)結(jié)合程度的約10%。在某些實(shí)施方案中,特異性結(jié)合wtaβ的抗體具有≤1μm、≤100nm、≤10nm、≤1nm或≤0.1nm的解離常數(shù)(kd)。在某些實(shí)施方案中,抗體特異性結(jié)合來(lái)自不同物種的表位。在另一個(gè)實(shí)施方案中,特異性結(jié)合可以包括、但不是必需排他性結(jié)合?!敖Y(jié)合親和力”通常是指分子(例如,抗體)的單一結(jié)合位點(diǎn)與其結(jié)合配偶體(例如,抗原)之間的非共價(jià)相互作用的總和強(qiáng)度。除非另有說(shuō)明,如本文所用,“結(jié)合親和力”是指反映結(jié)合對(duì)成員(例如,抗體和抗原)之間的1:1相互作用的固有結(jié)合親和力。分子x對(duì)其配偶體y的親和力通??梢杂山怆x常數(shù)(kd)表示。親和力可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法測(cè)量,包括本文所述的那些。低親和力抗體通常緩慢地結(jié)合抗原并易于解離,而高親和力抗體通常更快地結(jié)合抗原并且易于保持結(jié)合更長(zhǎng)時(shí)間。測(cè)量結(jié)合親和力的各種方法是本領(lǐng)域已知的,其中任何一種可以用于本發(fā)明的目的。以下描述用于測(cè)量結(jié)合親和力的具體說(shuō)明性和示例性實(shí)施方案。在一個(gè)實(shí)施方案中,根據(jù)本發(fā)明的“kd”或“kd值”,通過(guò)用目標(biāo)抗體的fab型及其抗原進(jìn)行的放射性標(biāo)記抗原結(jié)合測(cè)定(ria)來(lái)測(cè)量,如以下測(cè)定所述。通過(guò)在存在未標(biāo)記抗原的滴定系列的情況中用最小濃度的(125i)-標(biāo)記抗原而平衡fab,然后用抗fab抗體包被的板子捕捉結(jié)合的抗原來(lái)測(cè)量fab對(duì)抗原的溶液結(jié)合親和力(參見(jiàn)例如chen等人,j.mol.biol.293:865-881(1999))。為了建立測(cè)定法的條件,微量滴定板(dynextechnologies,inc.)用5μg/ml捕獲性抗fab抗體(cappellabs)在50mm碳酸鈉(ph9.6)中包被過(guò)夜,隨后在pbs中用2%(w/v)牛血清白蛋白于室溫(約23℃)封閉2-5小時(shí)。在非吸附板(nunc#269620)中,將100pm或26pm[125i]-抗原與連續(xù)稀釋的目標(biāo)fab混合(例如與presta等人,cancerres.57:4593-4599(1997)中抗vegf抗體fab-12的評(píng)估一致)。然后將目標(biāo)fab孵育過(guò)夜;然而,孵育可持續(xù)更長(zhǎng)時(shí)間(例如,約65小時(shí))以確保達(dá)到平衡。此后,將混合物轉(zhuǎn)移至捕獲板,用于室溫孵育(例如,1小時(shí))。然后除去溶液,并用pbs中的0.1%吐溫-20tm表面活性劑洗板8次。平板干燥后,加入150μl/孔的閃爍液(microscint-20tm;packard),然后在topcounttmγ計(jì)數(shù)器(packard)上對(duì)平板計(jì)數(shù)10分鐘。選擇給出小于或等于最大結(jié)合的20%的各fab濃度,用于競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定法。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案,采用表面等離子共振測(cè)定法,使用或儀器(biacore,inc.,piscataway,nj)于25℃用固定的抗原cm5芯片以約10個(gè)響應(yīng)單位(ru)測(cè)量kd。簡(jiǎn)言之,根據(jù)供應(yīng)商的說(shuō)明書(shū),用n-乙基-n’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)活化羧甲基化的右旋糖酐生物傳感器芯片(cm5,biacore公司)。將抗原用10mm乙酸鈉ph4.8稀釋至5μg/ml(~0.2μm),之后以5μl/min的流速注射以實(shí)現(xiàn)大約10個(gè)響應(yīng)單位(ru)的偶聯(lián)蛋白質(zhì)。注射抗原之后,注射1m乙醇胺以封閉未反應(yīng)基團(tuán)。對(duì)于動(dòng)力學(xué)測(cè)量,于25℃以大約25μl/min的流速注射在含0.05%吐溫20tm表面活性劑的pbs(pbst)中兩倍連續(xù)稀釋的fab(0.78nm至500nm)。使用簡(jiǎn)單的一對(duì)一langmuir結(jié)合模型(evaluationsoftwareversion3.2),通過(guò)同時(shí)擬合結(jié)合和解離傳感圖來(lái)計(jì)算結(jié)合速率(kon)和解離速率(koff)。以koff/kon比率計(jì)算平衡解離常數(shù)(kd)。參見(jiàn),例如chen等人,j.mol.biol.293:865-881(1999)。如果通過(guò)上述表面等離子共振測(cè)定法,結(jié)合速率超過(guò)106m-1s-1,那么可使用熒光淬滅技術(shù)來(lái)測(cè)定結(jié)合速率,所述技術(shù)在分光計(jì)例如帶有斷流裝置的分光光度計(jì)(avivinstruments)或8000系列slm-amincotm分光光度計(jì)(thermospectronic)中用攪拌比色杯測(cè)量的濃度漸增的抗原存在下,測(cè)量在pbsph7.2中20nm抗-抗原的抗體(fab形式)于25℃的熒光發(fā)射強(qiáng)度(激發(fā)=295nm;發(fā)射=340nm,16nm帶通)的升高或降低。根據(jù)本發(fā)明的“結(jié)合速率”或“kon”還可以使用或系統(tǒng)(biacore,inc.,piscataway,nj)按如上所述測(cè)定。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”、“宿主細(xì)胞系”和“宿主細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換使用,并且指已經(jīng)導(dǎo)入外源核酸的細(xì)胞,包括所述細(xì)胞的后代。宿主細(xì)胞包括“轉(zhuǎn)化體”和“經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”,其包括原代的經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞及由其衍生的后代而不考慮傳代的次數(shù)。后代在核酸內(nèi)容物上可以與親本細(xì)胞不完全相同,而是可以含有突變。本文中包括具有與在初始轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選或選擇的相同功能或生物學(xué)活性的突變體后代。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“載體”是指能夠增殖與其連接的另一種核酸的核酸分子。該術(shù)語(yǔ)包括作為自身復(fù)制型核酸結(jié)構(gòu)的載體及整合到其已導(dǎo)入的宿主細(xì)胞的基因組中的載體。某些載體能夠指導(dǎo)與其可操作連接的核酸的表達(dá)。所述載體在本文中稱為“表達(dá)載體”。關(guān)于參照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(%)”定義為候選序列中與參照多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比,在比對(duì)序列并引入間隙之后,如果需要,可以達(dá)到最大百分比序列同一性,并且不考慮作為序列同一性的一部分的任何保守取代。用于確定氨基酸序列同一性百分比的比對(duì)可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的各種方式實(shí)現(xiàn),例如,使用諸如blast、blast-2、align或megalign(dnastar)軟件的公眾可用的計(jì)算機(jī)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定用于比對(duì)序列的適當(dāng)參數(shù),包括在待比較的序列的全長(zhǎng)上實(shí)現(xiàn)最大比對(duì)所需的任何算法。然而,為了本文的目的,使用序列比較計(jì)算機(jī)程序align-2產(chǎn)生%氨基酸序列同一性值。genentech公司編寫(xiě)了align-2序列比較計(jì)算機(jī)程序,并且源代碼已經(jīng)在華盛頓特區(qū)20559號(hào)美國(guó)版權(quán)局提交了用戶文檔,以美國(guó)版權(quán)注冊(cè)號(hào)txu510087注冊(cè)。align-2程序可從加利福尼亞州南舊金山的genentech公司公開(kāi)獲得,或者可以從源代碼編譯。align-2程序應(yīng)編譯為在unix操作系統(tǒng)上使用,包括數(shù)字unixv4.0d。所有序列比較參數(shù)由align-2程序設(shè)置,并且不變。在使用align-2用于氨基酸序列比較的情況下,給定的氨基酸序列a與或相對(duì)于給定的氨基酸序列b的氨基酸序列同一性%(其也可被稱為具有或包含與或相對(duì)于給定氨基酸序列b的某一氨基酸序列同一性%的給定的氨基酸序列a)的計(jì)算如下:100乘以分?jǐn)?shù)x/y,其中x是在該程序的a和b的比對(duì)中,通過(guò)序列比對(duì)程序align-2評(píng)價(jià)為相同匹配的氨基酸殘基數(shù),并且其中y是b中氨基酸殘基的總數(shù)。應(yīng)當(dāng)理解,如果氨基酸序列a的長(zhǎng)度不等于氨基酸序列b的長(zhǎng)度,a與b的氨基酸序列同一性%將不等于b與a的氨基酸序列同一性%。除非另有特別說(shuō)明,否則本文使用的所有氨基酸序列同一性%值如上所述獲得。術(shù)語(yǔ)“利福霉素型抗生素”是指具有利福霉素結(jié)構(gòu)或類似結(jié)構(gòu)的抗生素類或組。術(shù)語(yǔ)“利福拉齊型抗生素”是指具有利福拉齊結(jié)構(gòu)或類似結(jié)構(gòu)的抗生素類或組。當(dāng)指示取代基的數(shù)目時(shí),術(shù)語(yǔ)“一個(gè)或多個(gè)”是指從一個(gè)取代基到最高可能取代數(shù)的范圍,即,替換一個(gè)氫到通過(guò)取代基替換所有氫。術(shù)語(yǔ)“取代基”表示替換母體分子上的氫原子的一個(gè)原子或一組原子。術(shù)語(yǔ)“取代的”表示指定的基團(tuán)具有一個(gè)或多個(gè)取代基。當(dāng)任何基團(tuán)可以攜帶多種取代基且提供多種可能的取代基時(shí),獨(dú)立地選擇取代基并且不必相同。術(shù)語(yǔ)“未取代的”是指指定的基團(tuán)不含取代基。術(shù)語(yǔ)“任選取代的”是指指定基團(tuán)是未取代的或被一個(gè)或多個(gè)取代基取代,其獨(dú)立地選自可能的取代基的組。當(dāng)指示取代基的數(shù)目時(shí),術(shù)語(yǔ)“一個(gè)或多個(gè)”是指從一個(gè)取代基到最高可能的取代數(shù)量,即通過(guò)取代基替換一個(gè)氫直到替換所有氫。本文所用的術(shù)語(yǔ)“烷基”是指具有1至12個(gè)碳原子(c1-c12)的飽和直鏈或支鏈單價(jià)烴基,其中烷基可以任選地被一個(gè)或多個(gè)下述取代基獨(dú)立地取代。在另一個(gè)實(shí)施方案中,烷基為1至8個(gè)碳原子(c1-c8)或1至6個(gè)碳原子(c1-c6)。烷基的實(shí)例包括但不限于甲基(me,-ch3)、乙基(et,-ch2ch3)、1-丙基(n-pr,正丙基,-ch2ch2ch3)、2-丙基(i-pr,異丙基,-ch(ch3)2)、1-丁基(n-bu,正丁基,-ch2ch2ch2ch3)、2-甲基-1-丙基(i-bu,異丁基,-ch2ch(ch3)2)、2-丁基(s-bu,仲丁基,-ch(ch3)ch2ch3)、2-甲基-2-丙基(t-bu,叔丁基,-c(ch3)3)、1-戊基(正戊基,-ch2ch2ch2ch2ch3)、2-戊基(-ch(ch3)ch2ch2ch3)、3-戊基(-ch(ch2ch3)2)、2-甲基-2-丁基(-c(ch3)2ch2ch3)、3-甲基-2-丁基(-ch(ch3)ch(ch3)2)、3-甲基-1-丁基(-ch2ch2ch(ch3)2)、2-甲基-1-丁基(-ch2ch(ch3)ch2ch3)、1-己基(-ch2ch2ch2ch2ch2ch3)、2-己基(-ch(ch3)ch2ch2ch2ch3)、3-己基(-ch(ch2ch3)(ch2ch2ch3))、2-甲基-2-戊基(-c(ch3)2ch2ch2ch3)、3-甲基-2-戊基(-ch(ch3)ch(ch3)ch2ch3)、4-甲基-2-戊基(-ch(ch3)ch2ch(ch3)2)、3-甲基-3-戊基(-c(ch3)(ch2ch3)2)、2-甲基-3-戊基(-ch(ch2ch3)ch(ch3)2)、2,3-二甲基-2-丁基(-c(ch3)2ch(ch3)2)、3,3-二甲基-2-丁基(-ch(ch3)c(ch3)3)、1-庚基、1-辛基等。本文所用的術(shù)語(yǔ)“亞烷基”是指1至12個(gè)碳原子(c1-c12)的飽和直鏈或支鏈二價(jià)烴基,其中亞烷基可以任選地被一個(gè)或多個(gè)下述取代基獨(dú)立地取代。在另一個(gè)實(shí)施方案中,亞烷基是1-8個(gè)碳原子(c1-c8)或1-6個(gè)碳原子(c1-c6)。亞烷基的實(shí)例包括但不限于亞甲基(-ch2-)、亞乙基(-ch2ch2-)、亞丙基(-ch2ch2ch2-)等。術(shù)語(yǔ)“烯基”是指具有至少一個(gè)不飽和位點(diǎn)即碳-碳sp2雙鍵的2-8個(gè)碳原子(c2-c8)的直鏈或支鏈一價(jià)烴基,其中烯基可以任選地被本文所述的一個(gè)或多個(gè)取代基獨(dú)立地取代,并且包括具有“順式”和“反式”取向,或者“e”和“z”取向的基團(tuán)。實(shí)例包括但不限于亞乙基或乙烯基(-ch=ch2)、烯丙基(-ch2ch=ch2)等。術(shù)語(yǔ)“亞烯基”是指具有至少一個(gè)不飽和位點(diǎn)即碳-碳sp2雙鍵的2-8個(gè)碳原子(c2-c8)的直鏈或支鏈二價(jià)烴基,其中亞烯基可以任選地被本文所述的一個(gè)或多個(gè)取代基獨(dú)立地取代,并且包括具有“順式”和“反式”取向,或者“e”和“z”取向的基團(tuán)。實(shí)例包括但不限于亞乙烯基(-ch=ch-)、烯丙基(-ch2ch=ch-)等。術(shù)語(yǔ)“炔基”是指具有至少一個(gè)不飽和位點(diǎn)即碳-碳sp叁鍵的2-8個(gè)碳原子(c2-c8)的直鏈或支鏈一價(jià)烴基,其中炔基可以任選地被本文所述的一個(gè)或多個(gè)取代基獨(dú)立地取代。實(shí)例包括但不限于乙炔基(-c≡ch)、丙炔基(炔丙基,-ch2c≡ch)等。術(shù)語(yǔ)“亞炔基”是指具有至少一個(gè)不飽和位點(diǎn)即碳-碳sp叁鍵的2-8個(gè)碳原子(c2-c8)的直鏈或支鏈二價(jià)烴基,其中亞炔基可以任選地被本文所述的一個(gè)或多個(gè)取代基獨(dú)立地取代。實(shí)例包括但不限于亞乙炔基(-c≡c-)、亞丙炔基(亞炔丙基,-ch2c≡c-)等。術(shù)語(yǔ)“碳環(huán)”、“碳環(huán)基”和“環(huán)烷基”是指單價(jià)非芳香族飽和或部分不飽和環(huán),具有3-12個(gè)碳原子(c3-c12)的作為單環(huán),或具有7至12個(gè)碳原子作為雙環(huán)。具有7至12個(gè)原子的雙環(huán)碳環(huán)可以排列成,例如雙環(huán)[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系統(tǒng),并且具有9或10個(gè)環(huán)原子的雙環(huán)碳環(huán)可以排列成雙環(huán)[5,6]或[6,6]系統(tǒng),或成橋連系統(tǒng)如雙環(huán)[2.2.1]庚烷、雙環(huán)[2.2.2]辛烷和雙環(huán)[3.2.2]壬烷。螺環(huán)部分也包括在本定義的范圍內(nèi)。單環(huán)碳環(huán)的實(shí)例包括但不限于環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、1-環(huán)戊-1-烯基、1-環(huán)戊-2-烯基、1-環(huán)戊-3-烯基、環(huán)己基、1-環(huán)己-1-烯基、1-環(huán)己-2-烯基、1-環(huán)己-3-烯基、環(huán)己二烯基、環(huán)庚基、環(huán)辛基、環(huán)壬基、環(huán)癸基、環(huán)十一烷基、環(huán)十二烷基等。碳環(huán)基基團(tuán)任選被一個(gè)或多個(gè)本文所述的取代基獨(dú)立地取代。“芳基”是指通過(guò)從母體芳族環(huán)系統(tǒng)的單個(gè)碳原子除去一個(gè)氫原子而衍生的6-20個(gè)碳原子(c6-c20)的單價(jià)芳族烴基。一些芳基在示例性結(jié)構(gòu)中表示為“ar”。芳基包括雙環(huán)基團(tuán),其包含與飽和的,部分不飽和的環(huán)或芳族碳環(huán)稠合的芳香環(huán)。典型的芳基包括但不限于衍生自苯(苯基)、取代的苯、萘、蒽、聯(lián)苯、茚基、茚滿基、1,2-二氫萘、1,2,3,4-四氫萘基等的基團(tuán)。芳基任選地被一個(gè)或多個(gè)本文所述的取代基獨(dú)立地取代。“亞芳基”是指通過(guò)從母體芳族環(huán)系統(tǒng)的兩個(gè)碳原子除去兩個(gè)氫原子而衍生的6-20個(gè)碳原子(c6-c20)的二價(jià)芳族烴基。一些亞芳基在示例性結(jié)構(gòu)中表示為“ar”。亞芳基包括雙環(huán)基團(tuán),其包含與飽和的,部分不飽和的環(huán)或芳族碳環(huán)稠合的芳香環(huán)。典型的亞芳基包括但不限于衍生自苯(亞苯基)、取代苯、萘、蒽、聯(lián)苯、亞茚基、亞茚滿基、1,2-二氫萘、1,2,3,4-四氫萘基等的基團(tuán)。亞芳基任選地被一個(gè)或多個(gè)本文所述的取代基取代。術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)”和“雜環(huán)基”在本文中可互換使用,是指飽和或部分不飽和(即,在環(huán)內(nèi)具有一個(gè)或多個(gè)雙鍵和/或叁鍵)的3至約20個(gè)環(huán)原子的碳環(huán)基,其中至少一個(gè)環(huán)原子是選自氮、氧、磷和硫的雜原子,剩余的環(huán)原子是c,其中一個(gè)或多個(gè)環(huán)原子任選地被一個(gè)或多個(gè)如下所述的取代基獨(dú)立地取代。雜環(huán)可以是具有3至7個(gè)環(huán)成員(2至6個(gè)碳原子和1至4個(gè)選自n,o,p和s的雜原子)的單環(huán)或具有7至10個(gè)環(huán)成員(4至9個(gè)碳原子和1至6個(gè)選自n,o,p和s的雜原子)的雙環(huán),例如:雙環(huán)[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系統(tǒng)。雜環(huán)描述于paquette,leoa.,“現(xiàn)代雜環(huán)化學(xué)原理(principlesofmodernheterocyclicchemistry)”(w.a.benjamin,newyork,1968),特別是第1、3、4、6、7和9章;“雜環(huán)化合物化學(xué),一系列專著(thechemistryofheterocycliccompounds,aseriesofmonographs)”(johnwiley&sons,newyork,1950至今),特別是第13、14、16、19和28卷;和j.am.chem.soc.(1960)82:5566?!半s環(huán)基”還包括其中雜環(huán)基與飽和的,部分不飽和環(huán)或芳族碳環(huán)或雜環(huán)稠合的基團(tuán)。雜環(huán)的實(shí)例包括但不限于嗎啉-4-基、哌啶-1-基、哌嗪基、哌嗪-4-基-2-酮、哌嗪-4-基-3-酮、吡咯烷-1-基、硫嗎啉-4-基、s-二氧代硫嗎啉-4-基、氮雜環(huán)辛烷-1-基、氮雜環(huán)丁烷-1-基、八氫吡啶并[1,2-a]吡嗪-2-基、[1,4]二氮雜環(huán)庚-1-基、吡咯烷基、四氫呋喃基、二氫呋喃基、四氫噻吩基、四氫吡喃基、二氫吡喃基、四氫噻喃基、哌啶基、嗎啉代、硫代嗎啉代、噻咯烷基、哌嗪基、高哌嗪基、氮雜環(huán)丁烷基、氧雜環(huán)丁烷基、硫雜環(huán)丁烷基、高哌啶基、氧雜環(huán)庚烷基、硫雜環(huán)庚烷基、氧氮雜基、二氮雜基、硫雜基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、二氫吲哚基、2h-吡喃基、4h-吡喃基、二噁烷基、1,3-二氧雜環(huán)戊烷基、吡唑啉基、二噻烷基、二硫雜環(huán)戊烷基、二氫吡喃基、二氫噻吩基、二氫呋喃基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、3-氮雜雙環(huán)[3.1.0]己烷基、3-氮雜二環(huán)[4.1.0]庚烷基、氮雜雙環(huán)[2.2.2]己烷基、3h-吲哚基、喹嗪基和n-吡啶基脲。螺環(huán)部分也包括在本定義的范圍內(nèi)。其中2個(gè)環(huán)原子被氧代(=o)部分取代的雜環(huán)基團(tuán)的實(shí)例是嘧啶酮基和1,1-二氧代-硫嗎啉基。本文的雜環(huán)基團(tuán)任選地被一個(gè)或多個(gè)本文所述的取代基獨(dú)立地取代。術(shù)語(yǔ)“雜芳基”是指5-、6-或7-元環(huán)的單價(jià)芳族基團(tuán),并且包括5-20個(gè)原子的稠環(huán)體系(其中至少一個(gè)是芳族的),其獨(dú)立地含有一個(gè)或多個(gè)選自氮、氧和硫的雜原子。雜芳基的實(shí)例是吡啶基(包括例如,2-羥基吡啶基)、咪唑基、咪唑并吡啶基、嘧啶基(包括例如,4-羥基嘧啶基)、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、異噁唑基、噻唑基、噁二唑基、噁唑基、異噻唑基、吡咯基、喹啉基、異喹啉基、四氫異喹啉基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、噌啉基、吲唑基、吲哚基、酞嗪基、噠嗪基、三嗪基、異吲哚基、蝶啶基、嘌呤基、噁二唑基、三唑基、噻二唑基、呋咱基、苯并呋咱基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基和呋喃并吡啶基。雜芳基任選被一個(gè)或多個(gè)本文所述的取代基獨(dú)立地取代。在可能的情況下,雜環(huán)或雜芳基可以是碳(碳連接的)或氮(氮連接的)鍵合的。作為舉例而非限制,碳鍵合的雜環(huán)或雜芳基鍵合在吡啶的第2、3、4、5或6位,噠嗪的第3、4、5或6位,嘧啶的2、4、5或6位,吡嗪的2、3、5或6位,呋喃、四氫呋喃、噻吩(thiofuran)、噻吩(thiophene)、吡咯或四氫吡咯的2、3、4或5位,噁唑、咪唑或噻唑的2、4或5位,異噁唑、吡唑或異噻唑的3、4或5位,氮丙啶的2或3位,氮雜環(huán)丁烷的2、3或4位,喹啉的2、3、4、5、6、7或8位,或異喹啉的1、3、4、5、6、7或8位。舉例而言而非限制,氮鍵合的雜環(huán)或雜芳基鍵合于氮丙啶、氮雜環(huán)丁烷、吡咯、吡咯烷、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑啉、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、二氫吲哚、1h-吲唑的1位,異吲哚或異吲哚啉的2位,嗎啉的4位,以及咔唑或β-咔啉的9位。“代謝物”是特定化合物或其鹽通過(guò)體內(nèi)代謝產(chǎn)生的產(chǎn)物??梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)來(lái)鑒定化合物的代謝物,并且使用本文所述的測(cè)試來(lái)確定其活性。這樣的產(chǎn)物可以例如由所施用的化合物的氧化、還原、水解、酰胺化、脫酰胺化、酯化、脫酯化、酶裂解等產(chǎn)生。因此,本發(fā)明包括本發(fā)明化合物的代謝物,包括通過(guò)包含使本發(fā)明的式i化合物與哺乳動(dòng)物接觸足以產(chǎn)生其代謝產(chǎn)物的時(shí)間的方法產(chǎn)生的化合物。術(shù)語(yǔ)“藥物制劑”是指處于如下的形式,使得容許其中含有的活性成分的生物學(xué)活性是有效的,且不含對(duì)將接受制劑施用的個(gè)體具有不可接受的毒性的其他組分的制劑。“無(wú)菌”制劑是無(wú)菌的或不含所有活的微生物及其孢子?!胺€(wěn)定”制劑是其中蛋白質(zhì)在儲(chǔ)存時(shí)基本上保持其物理和化學(xué)穩(wěn)定性和完整性的制劑。用于測(cè)量蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的各種分析技術(shù)在本領(lǐng)域是可獲得的,并且在肽和蛋白質(zhì)藥物遞送(peptideandproteindrugdelivery),247-301,vincentleeed.,marceldekker,inc.,newyork,newyork,pubs.(1991)和jones,a.adv.drugdeliveryrev.10:29-90(1993)中進(jìn)行了綜述。穩(wěn)定性可以在所選擇的溫度下測(cè)量所選擇的時(shí)間段。為了快速篩選,制劑可以在40℃保持2周至1個(gè)月,此時(shí)測(cè)定穩(wěn)定性。當(dāng)制劑在2-8℃下儲(chǔ)存時(shí),通常制劑應(yīng)在30℃或40℃下穩(wěn)定至少1個(gè)月,和/或在2-8℃下穩(wěn)定至少2年。當(dāng)制劑在30℃下儲(chǔ)存時(shí),通常制劑應(yīng)在30℃下穩(wěn)定至少2年,和/或在40℃穩(wěn)定至少6個(gè)月。例如,儲(chǔ)存期間的聚集程度可以用作蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的指標(biāo)。因此,“穩(wěn)定”制劑可以是其中小于約10%和優(yōu)選小于約5%的蛋白質(zhì)在制劑中以聚集體存在。在其它實(shí)施方案中,可以確定在制劑儲(chǔ)存過(guò)程中聚集體形成的任何增加?!暗葷B”制劑是具有與人血液基本相同的滲透壓的制劑。等滲制劑通常具有約250至350mosm的滲透壓。術(shù)語(yǔ)“低滲”描述滲透壓低于人血液的制劑。相應(yīng)地,術(shù)語(yǔ)“高滲”用于描述滲透壓高于人血液的制劑。例如,可以使用蒸氣壓或冰凍型滲透壓計(jì)測(cè)量等滲性。作為加入鹽和/或緩沖液的結(jié)果,本發(fā)明的制劑是高滲的。本文所用的“載體”包括藥學(xué)上可接受的載體,賦形劑或穩(wěn)定劑,其所使用的劑量和濃度對(duì)暴露于其中的細(xì)胞或哺乳動(dòng)物是無(wú)毒的。生理上可接受的載體通常是含水ph緩沖溶液。生理上可接受的載體的實(shí)例包括緩沖液如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸;抗氧化劑,包括抗壞血酸;低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽;蛋白質(zhì),如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白;親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸;單糖、二糖和其他碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合劑如edta;糖醇如甘露醇或山梨糖醇;鹽形成抗衡離子如鈉;和/或非離子表面活性劑如聚乙二醇(peg)和pluronicstm?!八帉W(xué)上可接受的載體”是指藥物制劑中活性成分以外的對(duì)個(gè)體無(wú)毒的成分。藥學(xué)上可接受的載體包括但不限于緩沖劑、賦形劑、穩(wěn)定劑或防腐劑?!八帉W(xué)上可接受的酸”包括在配制濃度和方式下無(wú)毒的無(wú)機(jī)酸和有機(jī)酸。例如,合適的無(wú)機(jī)酸包括鹽酸、高氯酸、氫溴酸、氫碘酸、硝酸、硫酸、磺酸、亞磺酸、對(duì)氨基苯磺酸、磷酸、碳酸等。合適的有機(jī)酸包括直鏈和支鏈烷基、芳族、環(huán)狀、脂環(huán)族、芳基脂族、雜環(huán)、飽和、不飽和、單、二和三羧酸,包括例如甲酸、乙酸、2-羥基乙酸、三氟乙酸、苯乙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、鄰氨基苯甲酸、丙酸、2-羥基丙酸、2-氧代丙酸、丙二酸、環(huán)戊烷丙酸、3-苯基丙酸、丁酸、丁二酸、苯甲酸、3-(4-羥基苯甲酰基)苯甲酸、2-乙酰氧基-苯甲酸、抗壞血酸、肉桂酸、月桂基硫酸、硬脂酸、粘康酸、扁桃酸、琥珀酸、雙羥萘酸、富馬酸、蘋(píng)果酸、馬來(lái)酸、羥基馬來(lái)酸、丙二酸、乳酸、檸檬酸、酒石酸、乙醇酸、葡萄糖酸、葡糖酸、丙酮酸、乙醛酸、草酸、甲磺酸、琥珀酸、水楊酸、鄰苯二甲酸、撲酸、棕櫚酸(palmeicacid)、硫氰酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙烷二磺酸、2-羥基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、萘-2-磺酸、對(duì)甲苯磺酸、樟腦磺酸、4-甲基雙環(huán)[2.2.2]辛-2-烯-1-甲酸、葡庚糖、4,4'-亞甲基雙-3-(羥基-2-烯-1-甲酸)、羥基萘甲酸?!八帉W(xué)上可接受的堿”包括以配制的濃度和方式無(wú)毒的無(wú)機(jī)和有機(jī)堿。例如,合適的堿包括由無(wú)機(jī)堿形成金屬如鋰、鈉、鉀、鎂、鈣、銨、鐵、鋅、銅、錳、鋁、n-甲基葡糖胺、嗎啉、哌啶形成的堿和有機(jī)無(wú)毒堿包括伯胺、仲胺和叔胺、取代的胺、環(huán)胺和堿性離子交換樹(shù)脂,[例如,n(r')4+(其中r'是獨(dú)立地h或c1-4烷基,例如銨、tris)],例如異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二乙氨基乙醇、三甲胺、二環(huán)己胺、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、咖啡因、普魯卡因、海巴明、膽堿、甜菜堿、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可堿、嘌呤、哌嗪、哌啶、n-乙基哌啶、聚胺樹(shù)脂等。特別優(yōu)選的有機(jī)無(wú)毒堿是異丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲基胺、二環(huán)己胺、膽堿和咖啡因??捎糜诒景l(fā)明的其它藥學(xué)上可接受的酸和堿包括衍生自氨基酸的那些,例如組氨酸,甘氨酸,苯丙氨酸,天冬氨酸,谷氨酸,賴氨酸和天冬酰胺。“藥學(xué)上可接受的”緩沖劑和鹽包括衍生自上述酸和堿的酸和堿加成鹽的那些。特定的緩沖液和/或鹽包括組氨酸,琥珀酸鹽和乙酸鹽?!八帉W(xué)上可接受的糖”是當(dāng)與關(guān)注的蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí),顯著地防止或減少儲(chǔ)存時(shí)蛋白質(zhì)的化學(xué)和/或物理不穩(wěn)定性的分子。當(dāng)制劑被凍干,然后重構(gòu)時(shí),“藥學(xué)上可接受的糖”也可以稱為“凍干保護(hù)劑”。示例性的糖及其相應(yīng)的糖醇包括:氨基酸,如谷氨酸鈉或組氨酸;甲胺如甜菜堿;溶致鹽如硫酸鎂;多元醇,例如三元或更高分子量的糖醇,例如甘油、葡聚糖、赤蘚糖醇、甘油、阿糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇;丙二醇;聚乙二醇;及其組合。另外的示例性的凍干保護(hù)劑包括甘油和明膠,以及麥芽糖、松三糖、棉子糖、甘露三糖和水蘇糖。還原糖的實(shí)例包括葡萄糖、麥芽糖、乳糖、麥芽酮糖、異麥芽酮糖和乳果糖。非還原性糖的實(shí)例包括選自糖醇和其它直鏈多元醇的多羥基化合物的非還原性糖苷。優(yōu)選的糖醇是單糖苷,特別是通過(guò)還原二糖,例如乳糖、麥芽糖、乳果糖和麥芽酮糖,獲得的那些化合物。糖苷側(cè)基可以是糖苷或半乳糖苷。糖醇的另外的實(shí)例是葡萄糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇和異麥芽酮糖。優(yōu)選的藥學(xué)上可接受的糖是非還原糖海藻糖或蔗糖。將藥學(xué)上可接受的糖以“保護(hù)量”(例如預(yù)凍干)加入到制劑中,這意味著蛋白質(zhì)在儲(chǔ)存期間(例如,在重構(gòu)和儲(chǔ)存之后)基本上保持其物理和化學(xué)穩(wěn)定性和完整性。本文所關(guān)注的“稀釋劑”是藥學(xué)上可接受的(施用于人類時(shí)安全無(wú)毒),并且可用于制備液體制劑,例如凍干后重新配制的制劑。示例性的稀釋劑包括無(wú)菌水、注射用抑菌水(bwfi)、ph緩沖溶液(例如磷酸鹽緩沖鹽水)、無(wú)菌鹽水溶液、林格溶液或葡萄糖溶液。在替代實(shí)施方案中,稀釋劑可以包括鹽和/或緩沖液的水溶液?!胺栏瘎笔强梢约尤氲奖疚闹苿┲幸詼p少細(xì)菌活性的化合物。例如,添加防腐劑可以促進(jìn)生產(chǎn)多用途(多劑量)制劑。潛在防腐劑的實(shí)例包括十八烷基二甲基芐基氯化銨、氯化六烴季銨、苯扎氯銨(烷基芐基二甲基氯化銨的混合物,其中烷基是長(zhǎng)鏈化合物)和芐索氯銨。其他類型的防腐劑包括芳族醇如苯酚、丁基和芐醇,對(duì)羥基苯甲酸烷基酯如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯、鄰苯二酚、間苯二酚、環(huán)己醇、3-戊醇和間甲酚。本文最優(yōu)選的防腐劑是芐醇。“個(gè)體”或“受試者”或“患者”是哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物包括但不限于馴養(yǎng)的動(dòng)物(例如,牛、羊、貓、狗和馬),靈長(zhǎng)類動(dòng)物(例如,人類和非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物如猴子),兔子和嚙齒動(dòng)物(例如,小鼠和大鼠)。在某些實(shí)施方案中,個(gè)體或受試者是人。如本文所用,“治療”(及其語(yǔ)法變化例如“治療”)是指臨床干預(yù),旨在臨床病理過(guò)程中改變待治療的個(gè)體,組織或細(xì)胞的自然過(guò)程。治療的期望效果包括但不限于降低疾病進(jìn)展的速度,改善或緩解疾病狀態(tài),以及緩解或改善的預(yù)后,所有這些都可由本領(lǐng)域技術(shù)人員如醫(yī)師檢測(cè)。在一個(gè)實(shí)施方案中,治療可以意味著減輕癥狀,減輕疾病的任何直接或間接的病理后果,降低感染性疾病進(jìn)展的速度,疾病狀態(tài)的改善或緩解,以及緩解或改善的預(yù)后。在一些實(shí)施方案中,本發(fā)明的aac、tac用于延緩疾病的發(fā)展或減緩感染性疾病的進(jìn)展或減少血流和/或感染的組織和器官中的細(xì)菌負(fù)荷。如本文所用,“聯(lián)合”是指除了另一種治療方式之外施用的一種治療方式。因此,“聯(lián)合”是指在向個(gè)人施用其他治療方式之前,期間或之后施用的一種治療方式。術(shù)語(yǔ)“菌血癥”是指血液中存在細(xì)菌,其是通過(guò)血液培養(yǎng)最常檢測(cè)到的。在手術(shù)期間(特別是當(dāng)涉及粘膜如胃腸道時(shí)),或由于導(dǎo)管和其他異物進(jìn)入動(dòng)脈或靜脈時(shí),細(xì)菌可以進(jìn)入血液作為感染(如肺炎或腦膜炎)的嚴(yán)重并發(fā)癥。菌血癥有幾個(gè)后果。對(duì)細(xì)菌的免疫應(yīng)答可導(dǎo)致敗血癥和敗血性休克,死亡率相對(duì)較高。細(xì)菌也可以通過(guò)血液傳播到身體的其他部位,導(dǎo)致感染遠(yuǎn)離原始感染部位。實(shí)例包括心內(nèi)膜炎或骨髓炎?!爸委熡行Я俊笔菍?shí)現(xiàn)特定病癥的可測(cè)量改善所需的最小濃度。本文的治療有效量可以根據(jù)諸如患者的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重等因素,以及抗體在個(gè)體中引起所需反應(yīng)的能力而變化。治療有效量也是抗體的治療有益效果超過(guò)任何毒性或有害作用的量。在一個(gè)實(shí)施方案中,治療有效量是有效降低體內(nèi)感染中的菌血癥的量。在一方面,“治療有效量”是至少有效地減少?gòu)幕颊邩悠?例如血液)分離出的相對(duì)于給藥前至少一個(gè)對(duì)數(shù)的細(xì)菌負(fù)荷或集落形成單位(cfu)的量。在更具體的方面,減少至少為2個(gè)對(duì)數(shù)。在另一方面,減少量至少為3、4、5個(gè)對(duì)數(shù)。然而在另一方面,使用本領(lǐng)域已知的測(cè)定法,包括本文所例示的測(cè)定,降低到可檢測(cè)水平以下。在另一個(gè)實(shí)施方案中,與感染患者治療前或治療開(kāi)始時(shí)的陽(yáng)性血培養(yǎng)物相比,治療有效量是在治療期間給予的一個(gè)或多個(gè)劑量中的aac的量,其實(shí)現(xiàn)陰性的血培養(yǎng)物(即,不產(chǎn)生作為aac靶點(diǎn)的細(xì)菌)?!邦A(yù)防有效量”是指為達(dá)到期望的預(yù)防結(jié)果在所需的劑量和時(shí)間段內(nèi)的有效量。通常但不一定是由于在疾病的早期階段,甚至在暴露于感染風(fēng)險(xiǎn)升高的條件之前,在個(gè)體中使用預(yù)防劑量時(shí),預(yù)防有效量可以小于治療有效量。在一個(gè)實(shí)施方案中,預(yù)防有效量是至少有效減少、預(yù)防感染從一個(gè)細(xì)胞到另一個(gè)細(xì)胞的發(fā)生或擴(kuò)散的量?!奥浴苯o藥是指以連續(xù)而不是急性模式施用藥物,以便在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持初始治療效果(活性)?!伴g歇性”給藥是并非不間斷地連續(xù)進(jìn)行的治療,而是本質(zhì)上是周期性的。術(shù)語(yǔ)“包裝插入物”用于指通常包括在治療產(chǎn)品的商業(yè)包裝中的說(shuō)明書(shū),其包含關(guān)于使用這種治療產(chǎn)品的適應(yīng)癥、用途、劑量、給藥、組合療法、禁忌癥和/或警告的信息。術(shù)語(yǔ)“手性”是指具有鏡像配偶體不重疊性質(zhì)的分子,而術(shù)語(yǔ)“非手性”是指在其鏡像配偶體上重疊的分子。術(shù)語(yǔ)“立體異構(gòu)體”是指具有相同化學(xué)構(gòu)成但空間中原子或基團(tuán)的排列不同的化合物?!胺菍?duì)映體”是指具有兩個(gè)或更多個(gè)手性中心的立體異構(gòu)體,其分子不是彼此的鏡像。非對(duì)映體具有不同的物理性質(zhì),例如熔點(diǎn),沸點(diǎn),光譜性質(zhì)和反應(yīng)性。非對(duì)映異構(gòu)體的混合物可以在高分辨率分析方法如電泳和色譜中分離?!皩?duì)映異構(gòu)體”是指化合物的兩種立體異構(gòu)體,它們是彼此不重疊的鏡像。本文使用的立體化學(xué)定義和慣例通常遵循s.p.parker編輯,mcgraw-hill化學(xué)詞典(mcgraw-hilldictionaryofchemicalterms)(1984)mcgraw-hillbookcompany,newyork;和eliel,e.和wilen,s.,有機(jī)化合物的立體化學(xué)(stereochemistryoforganiccompounds)(1994)johnwiley&sons,inc.,newyork。許多有機(jī)化合物以光學(xué)活性形式存在,即它們具有旋轉(zhuǎn)偏振光平面的能力。在描述光學(xué)活性化合物時(shí),前綴d和l,或r和s用于表示分子關(guān)于其手性中心的絕對(duì)構(gòu)型。使用前綴d和l或(+)和(-)來(lái)表示化合物對(duì)偏振光平面的旋轉(zhuǎn)符號(hào),其中(-)或l表示化合物是左旋的。以(+)或d為前綴的化合物是右旋的。對(duì)于給定的化學(xué)結(jié)構(gòu),這些立體異構(gòu)體是相同的,除了它們是彼此的鏡像。具體的立體異構(gòu)體也可以稱為對(duì)映異構(gòu)體,這些異構(gòu)體的混合物通常稱為對(duì)映體混合物。將對(duì)映異構(gòu)體的50:50混合物稱為外消旋混合物或外消旋物,其可能發(fā)生在化學(xué)反應(yīng)或過(guò)程中不存在立體選擇性或立體定向性的情況。術(shù)語(yǔ)“外消旋混合物”和“外消旋物”是指沒(méi)有光學(xué)活性的兩種對(duì)映體物質(zhì)的等摩爾混合物。術(shù)語(yǔ)“保護(hù)基團(tuán)”是指這樣的取代基,其通常用于阻斷或保護(hù)特定官能團(tuán),而其它官能團(tuán)在化合物上起反應(yīng)。例如,“氨基保護(hù)基”是連接到氨基上的取代基,該氨基阻斷或保護(hù)化合物中的氨基官能團(tuán)。合適的氨基保護(hù)基包括但不限于乙?;?、三氟乙?;?、叔丁氧羰基(boc)、芐氧羰基(cbz)和9-芴基亞甲氧基羰基(fmoc)。關(guān)于保護(hù)基及其用途的一般描述,參見(jiàn)t.w.greene,有機(jī)合成中的保護(hù)基(protectivegroupsinorganicsynthesis),johnwiley&sons,newyork,1991,或更新版本。本文所用的術(shù)語(yǔ)“約”是指本
技術(shù)領(lǐng)域:
中的技術(shù)人員熟知的相應(yīng)值的通常誤差范圍。在此引用“約”值或參數(shù)包括(特別描述)針對(duì)該值或參數(shù)本身的實(shí)施方案。如本文和所附權(quán)利要求中所使用,單數(shù)形式“一種”、“一個(gè)”和“該”包括復(fù)數(shù)參考,除非上下文另有明確指出。例如,提到“抗體”時(shí)是指從一個(gè)到多個(gè)抗體,例如以摩爾量,并且包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等價(jià)物等。iii.組成成分和方法抗生素-抗體綴合物(aac)本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果強(qiáng)有力地表明,旨在消除細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的療法將提高臨床成功率。為了實(shí)現(xiàn)這一目的,本發(fā)明提供了一種獨(dú)特的治療劑,其選擇性地殺死已經(jīng)侵入宿主細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室的金黃色葡萄球菌。本發(fā)明證明這樣的治療劑在常規(guī)抗生素如萬(wàn)古霉素失敗的體內(nèi)模型中是有效的。本發(fā)明提供了一種抗菌治療,其旨在通過(guò)靶向于逃避常規(guī)抗生素治療的細(xì)菌群而防止抗生素逃避。該新型抗菌治療是通過(guò)抗體抗生素綴合物(aac)實(shí)現(xiàn)的,其中對(duì)在金黃色葡萄球菌(包括mrsa)上發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞壁組分特異型的抗體與有效的抗生素(利福霉素衍生物)化學(xué)連接。該抗生素通過(guò)設(shè)計(jì)為可被蛋白酶切割的蛋白酶可切割的非肽類接頭連接到抗體上,所述蛋白酶包括組織蛋白酶b,其是大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型中發(fā)現(xiàn)的溶酶體蛋白酶(dubowchik等人(2002)bioconj.chem.13:855-869)。圖2中顯示了具有3個(gè)組分的aac的圖。不受任何一種理論的限制,aac的一種作用機(jī)制如圖3所示。aac作為前藥,其中抗生素是無(wú)活性的(由于抗體的大尺寸),直到接頭被切割為止。由于在天然感染中發(fā)現(xiàn)的顯著比例的金黃色葡萄球菌在宿主感染過(guò)程中的某一時(shí)刻被宿主細(xì)胞吸收,主要是嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,在宿主細(xì)胞內(nèi)的時(shí)間為細(xì)菌提供了逃避抗生素活性的重要機(jī)會(huì)。本發(fā)明的aac被設(shè)計(jì)為結(jié)合葡萄球菌細(xì)菌,并且在細(xì)菌被宿主細(xì)胞攝取后在吞噬體內(nèi)部釋放抗生素。通過(guò)這種機(jī)制,aac能夠?qū)⒒钚钥股貙iT集中在通過(guò)常規(guī)抗生素治療金黃色葡萄球菌不佳的地方。雖然本發(fā)明不受特定作用機(jī)制的限制或限定,但aac通過(guò)三種潛在的機(jī)制改善抗生素活性:(1)aac在攝取細(xì)菌的哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)遞送抗生素,從而增加難以擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)菌隱藏的吞噬溶酶體中的抗生素的效力。(2)aac調(diào)理細(xì)菌,從而增加吞噬細(xì)胞對(duì)游離細(xì)菌的吸收,并在局部釋放抗生素以便當(dāng)細(xì)菌在吞噬溶酶體中隱藏時(shí)殺死細(xì)菌。由于成千上萬(wàn)的aac可以結(jié)合單個(gè)細(xì)菌,因此該平臺(tái)在這些細(xì)胞內(nèi)的小環(huán)境中釋放出足夠的抗生素,以維持最大的抗菌殺傷力。此外,隨著越來(lái)越多的細(xì)菌從預(yù)先存在的細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)庫(kù)中釋放出來(lái),這種基于抗體的治療方法的快速結(jié)合率確保這些細(xì)菌立即被“標(biāo)記”,然后才能逃逸到相鄰或遠(yuǎn)端的細(xì)胞,從而減輕感染的進(jìn)一步擴(kuò)散。(3)與從血清中快速清除的抗生素相比,aac通過(guò)將抗生素與抗體連接來(lái)改善體內(nèi)抗生素的半衰期(改善的藥代動(dòng)力學(xué))。aac的改善的藥代動(dòng)力學(xué)能夠在金黃色葡萄球菌富集的區(qū)域中遞送足夠的抗生素,同時(shí)限制需要全身施用的抗生素的總體劑量。該屬性將允許用aac長(zhǎng)期治療以靶向于持續(xù)感染,且抗生素副作用最小??贵w-抗生素綴合化合物包含抗壁磷壁酸(wta)抗體,其通過(guò)蛋白酶可切割的非肽類接頭共價(jià)連接到利福霉素型抗生素。示例性實(shí)施方案是具有下式的抗體-抗生素綴合物:ab-(pml-abx)p其中:ab是抗壁磷壁酸抗體;pml是具有下式的蛋白酶可切割的非肽類接頭:-str-pm-y-其中str是延伸單元;pm是擬肽單元,和y是間隔單元;abx是利福霉素型抗生素;并且p是從1到8的整數(shù)。利福霉素型抗生素可以是利福拉齊型抗生素。利福霉素型抗生素可以包含與蛋白酶可切割的非肽類接頭連接的季胺??贵w-抗生素綴合物的示例性實(shí)施方案具有式i:其中:虛線表示任選的鍵;r是h、c1-c12烷基或c(o)ch3;r1是oh;r2是ch=n-(雜環(huán)基),其中所述雜環(huán)基任選地被一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自c(o)ch3、c1-c12烷基、c1-c12雜芳基、c2-c20雜環(huán)基、c6-c20芳基和c3-c12碳環(huán)基的基團(tuán)取代;或r1和r2形成五元或六元稠合雜芳基或雜環(huán)基,并且任選地形成螺或稠合的六元雜芳基、雜環(huán)基、芳基或碳環(huán)基環(huán),其中所述螺或稠合的六元雜芳基、雜環(huán)基、芳基或碳環(huán)基環(huán)任選地被h、f、cl、br、i、c1-c12烷基或oh取代;pml是連接到r2或由r1和r2形成的稠合雜芳基或雜環(huán)基的蛋白酶可切割的非肽類接頭;并且ab是抗壁磷壁酸(wta)抗體??股夭糠挚梢酝ㄟ^(guò)反應(yīng)性接頭部分與抗體分子綴合,其中抗生素部分的數(shù)目可以通過(guò)本文所述的方法引入的游離半胱氨酸殘基的數(shù)量來(lái)限制。示例性aac包含具有1、2、3或4個(gè)工程化改造的半胱氨酸氨基酸的抗體(lyon,r.等人(2012)methodsinenzym.502:123-138)???壁磷壁酸(wta)抗體本文公開(kāi)了與在多種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌(包括金黃色葡萄球菌)上表達(dá)的wta結(jié)合的某些抗wta抗體和綴合的抗wta抗體??箇ta抗體可以選擇和通過(guò)us8283294;meijerpj等人(2006)jmolbiol.358(3):764-72;lanttoj等人(2011)jvirol.85(4):1820-33和下文實(shí)施例3-4中所述方法產(chǎn)生。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的細(xì)胞壁由多個(gè)肽聚糖(pgn)鞘的厚層構(gòu)成,不僅可以穩(wěn)定細(xì)胞膜,而且可以提供許多可以連接其它分子的位點(diǎn)(圖4)。這些細(xì)胞表面糖蛋白的主要類別是磷壁酸(“ta”),其在許多聚糖結(jié)合蛋白(gpb)上發(fā)現(xiàn)是磷酸酯豐富的分子。ta有兩種類型:(1)脂磷壁酸(“l(fā)ta”),其錨定于質(zhì)膜并從細(xì)胞表面延伸到肽聚糖層中;和(2)壁ta(“wta”),其共價(jià)連接到肽聚糖并延伸穿過(guò)細(xì)胞壁外(圖4)。wta可以占gpb總細(xì)胞壁質(zhì)量的60%。因此,其呈現(xiàn)高度表達(dá)的細(xì)胞表面抗原。wta的化學(xué)結(jié)構(gòu)因生物而異。在金黃色葡萄球菌中,wta通過(guò)由n-乙酰葡萄糖胺(glcnac)-1-p和n-乙酰甘露糖胺(mannac)構(gòu)成的二糖與n-乙酰胞壁酸(murnac)的6-oh共價(jià)連接,其隨后與約2或3個(gè)甘油磷酸酯(圖5)單位連接。實(shí)際的wta聚合物由11-40個(gè)核糖醇-磷酸鹽(rbo-p)重復(fù)單元組成。wta的分步合成首先由稱為tago的酶啟動(dòng),缺乏tago基因(通過(guò)刪除該基因)的金黃色葡萄球菌不產(chǎn)生任何wta??梢酝ㄟ^(guò)α-或β-糖苷鍵用在c2-oh位置的d-丙氨酸(d-ala)和/或c4-oh位置的n-乙酰葡糖胺(glcnac)進(jìn)一步定制該重復(fù)單元。根據(jù)金黃色葡萄球菌菌株或細(xì)菌的生長(zhǎng)期,糖苷鍵可以是α-、β-或這兩個(gè)端基異構(gòu)體的混合物。這些glcnac糖修飾由兩種特異性金黃色葡萄球菌衍生的糖基轉(zhuǎn)移酶(gtfs)實(shí)現(xiàn):tarmgtf介導(dǎo)α-糖苷鍵,而tarsgtfs介導(dǎo)β-糖苷鍵。鑒于mrsa的細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存受到保護(hù)以逃避抗生素的顯著證據(jù),開(kāi)發(fā)本發(fā)明的新型治療組合物以通過(guò)使用金黃色葡萄球菌特異性抗體將抗生素固定在細(xì)菌上,使得當(dāng)細(xì)菌在體內(nèi)被宿主細(xì)胞吞噬或以其它方式內(nèi)化時(shí),其將抗生素帶入宿主細(xì)胞,從而阻止這種抗生素逃避方法。本發(fā)明的aac的抗wta抗體可以是抗wtaα或抗wtaβ抗體。從金黃色葡萄球菌感染患者的b細(xì)胞克隆了整個(gè)說(shuō)明書(shū)中提供的示例性抗wta抗體(如下文實(shí)施例中所述)。在一個(gè)實(shí)施方案中,抗wta和抗金黃色葡萄球菌抗體是人單克隆抗體。本發(fā)明的aac或tac包括包含本發(fā)明wta抗體的cdr的嵌合抗體和人源化抗體。對(duì)于本發(fā)明的治療用途,用于綴合抗生素以產(chǎn)生aac的wta抗體可以是igm以外的任何同種型。在一個(gè)實(shí)施方案中,wta抗體是人igg同種型。在更具體的實(shí)施方案中,wta抗體是人igg1。在整個(gè)說(shuō)明書(shū)和附圖中,由4位數(shù)字(例如4497)指定的ab也可以用前面的“s”來(lái)表示,例如s4497;這兩個(gè)名稱都是指與抗體的野生型(wt)未修飾序列相同的抗體。抗體的變體通過(guò)抗體號(hào)例如4497v8之后的“v”表示。除非特別指出(例如通過(guò)變體號(hào)),所示的氨基酸序列是原始的、未修飾的/未改變的序列。這些抗體可以在一個(gè)或多個(gè)殘基處改變,例如為了改善pk、穩(wěn)定性、表達(dá)、可制造性(例如,如下文實(shí)施例中所述),同時(shí)保持基本上與野生型未經(jīng)修飾的抗體相比相當(dāng)或改善的抗原結(jié)合親和力。具有保守氨基酸取代的本發(fā)明wta抗體的變體包括在本發(fā)明中。以下除非另有說(shuō)明,cdr編號(hào)是根據(jù)kabat進(jìn)行,且恒定區(qū)編號(hào)是根據(jù)eu進(jìn)行編號(hào)。為了綴合以產(chǎn)生tac化合物,本發(fā)明的抗wta抗體可以在l鏈和h鏈中的一個(gè)中或兩個(gè)都包含工程化cys,用于與接頭-抗生素中間體綴合,如下所述。圖11a和11b分別提供了四種人抗wtaα抗體的輕鏈可變區(qū)(vl)和重鏈可變區(qū)(vh)的氨基酸序列比對(duì)。根據(jù)kabat編號(hào),cdr序列cdrl1、l2、l3和cdrh1、h2、h3加有下劃線。表1a:抗wtaα的輕鏈cdr序列。表1b:抗wtaα的重鏈cdr序列。每對(duì)vl和vh的序列如下:4461輕鏈可變區(qū)diqmtqspdslavslgeratinckssqsvlsrannnyyvawyqhkpgqppklliywastrefgvpdrfsgsgsgtdftltinslqaedvavyycqqyytsrrtfgqgtkveik(seqidno.25)4461重鏈可變區(qū)qvqlvqsgaevrkpgasvkvsckasgysftdyymhwvrqapgqglewmgwinpksggtnyaqrfqgrvtmtgdtsisaaymdlasltsddtavyycvkdcgsgglrdfwgqgttvtvss(seqidno.26)4624輕鏈可變區(qū)diqmtqspdslsvslgeratincrsnqnllsssnnnylawyqqkpgqplklliywastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqyyanprtfgqgtkveik(seqidno.27)4624重鏈可變區(qū)qvqlqqsrvevkrpgtsvkvscktsgytfsdyyihwvrlapgqglelmgwinpntggtyyaqkfrdrvtmtrdtsiataylemssltsddtavyycakdcgrgglrdiwgpgtmvtvss(seqidno.28)4399輕鏈可變區(qū)eivltqspdslavslgeratincksnqnvlassndknylawfqhkpgqplklliywasiresgvpdrfsgsgsgtdftltisslraedvavyycqqyytnprtfgqgtkvefn(seqidno.29)4399重鏈可變區(qū)evqlvqsgaevkkpgtsvkvsckasgytftdyyihwvrlapgqglelmgwinpntggtnyaqkfqgrvtmtrdtsiataymelssltsddtavyycakdcgnaglrdiwgqgttvtvss(seqidno.30)6267輕鏈可變區(qū)diqltqspdslavslgeratinckssqnvlyssnnknylawyqqkpgqppklliywastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqyytsppytfgqgtkleie(seqidno.31)6267重鏈可變區(qū)evqlvqsgaevkkpgeslkisckgsgysftsywigwvrqmpgkglewmgiihpgdsktryspsfqgqvtisadksistaylqwnslkasdtamyycarlycsggscysdrafsslgaggyyyygmgvwgqgttvtvss(seqidno.32).為了生產(chǎn)aac化合物,本發(fā)明提供了一種分離的單克隆抗體,其結(jié)合壁磷壁酸α(wtaα),包含一個(gè)輕鏈和一個(gè)h鏈,該l鏈包含cdrl1、l2、l3,且該h鏈包含cdrh1、h2、h3,其中cdrl1、l2、l3和h1、h2、h3分別包含每個(gè)抗體4461(seqidno.1-6)、4624(seqidno.7-12)、4399(seqidno.13-18)和6267(seqidno.19-24)的cdr的氨基酸序列,如上文表1a和表1b中所示。在另一個(gè)實(shí)施方案中,結(jié)合wtaa的分離的單克隆抗體包含h鏈可變區(qū)(vh)和l鏈可變區(qū)(vl),其中vh分別在抗體4461、4624、4399和6267各自的vh區(qū)序列的長(zhǎng)度上分別具有至少95%的序列同一性。在另一個(gè)特定的方面,該序列同一性是96%、97%、98%、99%或100%。本發(fā)明還提供了包含從圖12中示例的ab列表中的抗wtaβ抗體的aac。在一個(gè)實(shí)施方案中,該分離的抗wtaβ單克隆抗體包含選自圖12中的13個(gè)ab中的每一個(gè)的cdr的cdrl1、l2、l3和h1、h2、h3。在另一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明提供了在13個(gè)抗體中的每一個(gè)的v區(qū)結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度上包含至少95%序列同一性的分離的抗wtaβ抗體。在另一個(gè)具體方面,序列同一性為96%、97%、98%、99%或100%。在13種抗wtaβ抗體中,6078和4497被修飾以產(chǎn)生變體:i)在l鏈和h鏈中的一個(gè)或兩個(gè)中具有工程化cys,用于與接頭-抗生素中間體綴合;和ii)其中h鏈中的第一個(gè)殘基q被改變?yōu)閑(v2),或者將前兩個(gè)殘基qm改變?yōu)閑i或ev(v3和v4)。圖13a-1和13a-2提供抗wtaβ抗體6078(未修飾)及其變體v2、v3、v4的全長(zhǎng)l鏈的氨基酸序列。含有工程化cys的l鏈變體由黑框中的c表示恒定區(qū)的末端(在該情況下為eu殘基號(hào)205)。變體名稱,例如v2lc-cys是指包含引入到l鏈中的cys的變體2。hclc-cys的含義是抗體的h和l鏈都含有工程化的cys。圖13b-1至13b-4顯示了抗-wtaβ抗體6078(未修飾)及其變體v2、v3、v4的全長(zhǎng)h鏈的比對(duì),其在h鏈的第一個(gè)或第一和二個(gè)殘基中有變化。包含工程化cys的h鏈變體由黑框中的c表示恒定區(qū)的末端(在eu殘基號(hào)118)。6078輕鏈可變區(qū)(vl)divmtqspsilsasvgdrvtitcrasqtisgwlawyqqkpaeapklliykastlesgvpsrfsgsgsgteftltisslqpddfgiyycqqyksysfnfgqgtkveik(seqidno.111)6078重鏈可變區(qū)(vh)xx1qlvqsgaevkkpgasvkvsceasgytltsydinwvrqatgqgpewmgwmnansgntgyaqkfqgrvtltgdtsistaymelsslrsedtavyycarssilvrgalgryfdlwgrgtlvtvss(seqidno.112)其中x是q或e;且x1是m、i或v。6078輕鏈divmtqspsilsasvgdrvtitcrasqtisgwlawyqqkpaeapklliykastlesgvpsrfsgsgsgteftltisslqpddfgiyycqqyksysfnfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seqidno.113)6078半胱氨酸工程化的輕鏈divmtqspsilsasvgdrvtitcrasqtisgwlawyqqkpaeapklliykastlesgvpsrfsgsgsgteftltisslqpddfg1yycqqyksysfnfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspctksfnrgec(seqidno.115)6078wt全長(zhǎng)重鏈qmqlvqsgaevkkpgasvkvsceasgytltsydinwvrqatgqgpewmgwmnansgntgyaqkfqgrvtltgdtsistaymelsslrsedtavyycarssilvrgalgryfdlwgrgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqty1cnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seqidno.114)6078變體(v2、v3或v4)全長(zhǎng)重鏈exqlvqsgaevkkpgasvkvsceasgytltsydinwvrqatgqgpewmgwmnansgntgyaqkfqgrvtltgdtsistaymelsslrsedtavyycarssilvrgalgryfdlwgrgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seqidno.116)其中x可以是m、i或v。6078變體(v2、v3或v4),cys-工程化的重鏈exqlvqsgaevkkpgasvkvsceasgytltsydinwvrqatgqgpewmgwmnansgntgyaqkfqgrvtltgdtsistaymelsslrsedtavyycarssilvrgalgryfdlwgrgtlvtvsscstkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seqidno.117)其中x可以是m、i或v。在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明提供了分離的抗wtaβ抗體,其包含重鏈和輕鏈,其中該重鏈包含與seqidno:112至少95%序列同一性的vh。在另外的實(shí)施方案中,該抗體還包含與seqidno:111具有至少95%序列同一性的vl。在一個(gè)具體實(shí)施方案中,該抗wtaβ抗體包含輕鏈和重鏈,其中l(wèi)鏈包含seqidno:111的vl,且h鏈包含seqidno:112的vh。在更具體的實(shí)施方案中,該分離的抗wtaβ抗體包含seqidno:113的l鏈和seqidno:114的h鏈。6078cys工程化的h和l鏈的變體可以以任何以下組合配對(duì)以形成用于與接頭-abx中間體綴合的完整ab,以產(chǎn)生本發(fā)明的抗wtaaac。未修飾的l鏈(seqidno.13)可以與seqidno:117的cys工程化的h鏈變體配對(duì);該變體可以是其中x是m、i或v的化合物。seqidno.115的cys工程化的l鏈可以與以下配對(duì):seqidno:114的h鏈;seqidno.116的h鏈變體;或seqidno.117的cys工程化的h鏈變體(在該版本中,h和l鏈均為cys工程化的)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中,本發(fā)明的抗wtaβ抗體和抗wtaβaac包含seqidno.115的l鏈和seqidno.116的h鏈。圖14a-1和14a-2提供了抗wtaβab4497(未修飾)及其v8變體的全長(zhǎng)l鏈。含有工程化cys的l鏈變體由恒定區(qū)末端附近(在eu殘基號(hào)205)的黑框中的c表示。圖14b-1、14b-2、14b-3顯示抗wtaβab4497(未修飾)和其v8變體的全長(zhǎng)h鏈比對(duì),v8變體在cdrh3的96位將d改變?yōu)閑,具有或不具有工程化的cys。含有工程化cys的h鏈變體由恒定區(qū)ch1開(kāi)始處的黑框中的c表示(在該情況下為eu殘基號(hào)118)。未修飾的cdrh3是gdggldd(seqidno.104);4497v8cdrh3是geggldd(seqidno.118)。4497輕鏈可變區(qū)diqltqspdslavslgeratinckssqsifrtsrnknllnwyqqrpgqpprllihwastrksgvpdrfsgsgfgtdftltitslqaedvaiyycqqyfsppytfgqgtkleik(seqidno.119)4497重鏈可變區(qū)evqlvesggglvqpggslrlscsasgfsfnsfwmhwvrqvpgkglvwisftnnegtttayadsvrgrfiisrdnakntlylemnnlrgedtavyycargdgglddwgqgtlvtvss(seqidno.120)4497.v8重鏈可變區(qū)evqlvesggglvqpggslrlscsasgfsfnsfwmhwvrqvpgkglvwisftnnegtttayadsvrgrfiisrdnakntlylemnnlrgedtavyycargegglddwgqgtlvtvss(seqidno.156)4497輕鏈diqltqspdslavslgeratinckssqsifrtsrnknllnwyqqrpgqpprllihwastrksgvpdrfsgsgfgtdftltitslqaedvaiyycqqyfsppytfgqgtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seqidno.121)4497v.8重鏈evqlvesggglvqpggslrlscsasgfsfnsfwmhwvrqvpgkglvwisftnnegtttayadsvrgrfiisrdnakntlylemnnlrgedtavyycargegglddwgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seqidno.122)4497-cys輕鏈diqltqspdslavslgeratinckssqsifrtsrnknllnwyqqrpgqpprllihwastrksgvpdrfsgsgfgsdftltitslqaedvaiyycqqyfsppytfgqgtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seqidno.123)4497.v8-重鏈evqlvesggglvqpggslrlscsasgfsfnsfwmhwvrqvpgkglvwisftnnegtttayadsvrgrfiisrdnakntlylemnnlrgedtavyycargegglddwgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seqidno.157;與seqidno.122相同)。4497.v8-cys重鏈evqlvesggglvqpggslrlscsasgfsfnsfwmhwvrqvpgkglvwisftnnegtttayadsvrgrfiisrdnakntlylemnnlrgedtavyycargegglddwgqgtlvtvsscstkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlgkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seqidno.124)本發(fā)明提供的另一種分離的抗wtaβ抗體包含重鏈和輕鏈,其中重鏈包含與seqidno:120具有至少95%序列同一性的vh。在另外的實(shí)施方案中,該抗體還包含與seqidno:119具有至少95%序列同一性的vl。在一個(gè)具體實(shí)施方案中,抗wtaβ抗體包含輕鏈和重鏈,其中所述l鏈包含seqidno:119的vl,且h鏈包含seqidno:120的vh。在更具體的實(shí)施方案中,該分離的抗wtaβ抗體包含seqidno:121的l鏈和seqidno:122的h鏈。4497cys工程化的h和l鏈變體可以以任何以下組合配對(duì)以形成完整的ab,用于與接頭-abx中間體綴合,以產(chǎn)生本發(fā)明的抗wtaaac。未修飾的l鏈(seqidno.121)可以與seqidno:124的cys工程化的h鏈變體配對(duì)。seqidno:123的cys工程化的l鏈可以與以下配對(duì):seqidno:157的h鏈變體;或seqidno.124的cys工程化h鏈變體(在該版本中,h和l鏈都是cys工程化的)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中,本發(fā)明的抗wtaβ抗體和抗wtaβaac包含seqidno:123的l鏈。另一個(gè)實(shí)施方案是結(jié)合與圖11a和圖11b的抗wtaα抗體中的每一個(gè)所結(jié)合的相同表位的抗體。還提供了結(jié)合與圖12、圖13a和13b以及圖14a和14b的抗wtaβ抗體相同的表位的抗體??箇ta抗體與wta的結(jié)合受到glcnac-糖修飾對(duì)wta的端基異構(gòu)取向的影響。分別通過(guò)tarm糖基轉(zhuǎn)移酶或tars糖基轉(zhuǎn)移酶,通過(guò)α-或β-糖苷鍵在c4-oh位置通過(guò)n-乙酰葡糖胺(glcnac)糖修飾來(lái)修飾wta。因此,使用抗wta的抗體對(duì)來(lái)自缺乏tarm(δtarm)、tars(δtars)或tarm和tars(δtarm/δtars)的糖基轉(zhuǎn)移酶突變體菌株的細(xì)胞壁制備物進(jìn)行免疫印跡分析。對(duì)wta上的α-glcnac修飾特異性的wta抗體(s7574)不結(jié)合來(lái)自δtarm菌株的細(xì)胞壁制備物(meijer,p.j.等人(2006)“isolationofhumanantibodyrepertoireswithpreservationofthenaturalheavyandlightchainpairing.”journalofmolecularbiology358,764-772)。反之亦然,對(duì)wta上的β-glcnac修飾特異性的wta抗體(s4462)不結(jié)合來(lái)自δtars菌株的細(xì)胞壁制備物。如所預(yù)期的那樣,這兩種抗體都不與缺少糖基轉(zhuǎn)移酶(δtarm/δtars)的缺失菌株和缺乏任何wta(δtago)的菌株的細(xì)胞壁制備物結(jié)合。根據(jù)這樣的分析,抗體已經(jīng)被表征為如圖6a和6b中的表中所列的抗α-glcnacwtamab或者抗β-glcnacwtamab。半胱氨酸氨基酸可以在抗體中的反應(yīng)性位點(diǎn)進(jìn)行工程化,并且不形成鏈內(nèi)或分子間二硫鍵(junutula等人,2008bnaturebiotech.,26(8):925-932;dornan等人(2009)blood114(13):2721-2729;us7521541;us7723485;wo2009/052249,shen等人(2012)naturebiotech.,30(2):184-191;junutula等人(2008)jourofimmun.methods332:41-52)。該工程化的半胱氨酸硫醇可以與具有硫醇反應(yīng)性的親電基團(tuán)如馬來(lái)酰亞胺或α-鹵代酰胺的本發(fā)明的接頭試劑或接頭-抗生素中間體反應(yīng),以形成具有半胱氨酸工程化的抗體(thiomabtm或thiomab)和抗生素(abx)部分的aac。因此抗生素部分的位置可以被設(shè)計(jì)、控制并已知??梢钥刂瓶股刎?fù)載,因?yàn)楣こ袒陌腚装彼崃虼蓟鶊F(tuán)通常以高產(chǎn)率與硫醇反應(yīng)性接頭試劑或接頭-抗生素中間體反應(yīng)。通過(guò)在重鏈或輕鏈上的單個(gè)位點(diǎn)取代引入半胱氨酸氨基酸來(lái)制備抗wta抗體,在對(duì)稱四聚體抗體上提供兩個(gè)新的半胱氨酸??梢詫?shí)現(xiàn)接近2的抗生素負(fù)載和綴合產(chǎn)物aac的近似的均質(zhì)性。在某些實(shí)施方案中,可能需要產(chǎn)生半胱氨酸工程化的抗wta抗體,例如“thiomab”,其中抗體的一個(gè)或多個(gè)殘基被半胱氨酸殘基取代。在具體實(shí)施方案中,該取代的殘基出現(xiàn)在抗體的可接近位點(diǎn)處。通過(guò)用半胱氨酸取代那些殘基,因此反應(yīng)性硫醇基團(tuán)定位在抗體的可接近位點(diǎn),并且可用于將抗體與其它部分(例如抗生素部分或接頭-抗生素部分)綴合以產(chǎn)生免疫綴合物,如本文進(jìn)一步描述。在某些實(shí)施方案中,任何一個(gè)或多個(gè)以下殘基可以被半胱氨酸取代,包括輕鏈的v205(kabat編號(hào));重鏈a118(eu編號(hào));和重鏈fc區(qū)的s400(eu編號(hào))。顯示了抗wta抗體的非限制性的示例性半胱氨酸工程化的重鏈a118c(seqidno:149)和輕鏈v205c(seqidno:151)突變體??梢匀鏹unutula等人,2008bnaturebiotech.,26(8):925-932;us7521541;us-2011/0301334所述產(chǎn)生半胱氨酸工程化的抗wta抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明提供了用于綴合以產(chǎn)生aac的分離的抗wta抗體,該抗體包含重鏈和輕鏈,其中該重鏈包含野生型重鏈恒定區(qū)序列或半胱氨酸工程化的突變體(thiomab),且所述輕鏈包含野生型輕鏈恒定區(qū)序列或半胱氨酸工程化的突變體(thiomab)。一方面,該重鏈具有與以下序列至少95%的序列同一性:重鏈(igg1)恒定區(qū),野生型astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno:148)重鏈(igg1)恒定區(qū),a118c″thiomab″cstkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno:149)且輕鏈具有與以下序列至少95%的序列同一性:輕鏈(κ)恒定區(qū),野生型rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seqidno:150)輕鏈(κ)恒定區(qū),v205c″thiomab″rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspctksfnrgec(seqidno:151)本發(fā)明的aac包括半胱氨酸工程化的抗wta抗體,其中野生型或母體抗wta抗體的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被半胱氨酸氨基酸替代。任何形式的抗體都可以如此工程化,即突變。例如,可以將母體fab抗體片段工程化以形成半胱氨酸工程化的fab,在本文中稱為“thiofab”。類似地,母體單克隆抗體可以被工程化以形成“thiomab”。應(yīng)當(dāng)注意,由于igg抗體的二聚體性質(zhì),單一位點(diǎn)突變?cè)趖hiofab中產(chǎn)生單個(gè)工程化的半胱氨酸殘基,而單一位點(diǎn)突變?cè)趖hiomab中產(chǎn)生兩個(gè)工程化的半胱氨酸殘基。對(duì)于新引入的工程化半胱氨酸硫醇基團(tuán)的反應(yīng)性,評(píng)估具有置換的(“工程化”)半胱氨酸(cys)殘基的突變體。本文所述的抗體可以使用培養(yǎng)基中的宿主細(xì)胞產(chǎn)生??梢杂冒幋a本文所述抗體的一種或多種核酸的載體(表達(dá)或克隆載體)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。所述細(xì)胞可以在適于產(chǎn)生抗體的條件下培養(yǎng),細(xì)胞產(chǎn)生的抗體可進(jìn)一步純化。用于產(chǎn)生抗體的合適細(xì)胞可包括原核、酵母或更高級(jí)的真核(例如哺乳動(dòng)物)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中,使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞(人或非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞)。在一些實(shí)施方案中,使用中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(cho)細(xì)胞??梢耘囵B(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞,并且哺乳動(dòng)物細(xì)胞在培養(yǎng)基(組織培養(yǎng)基)中的繁殖已經(jīng)成為常規(guī)方法。哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的實(shí)例可以包括但不限于由sv40轉(zhuǎn)化的猴腎cv1細(xì)胞系(cos-7、atcccrl1651);人胚胎腎細(xì)胞系(亞克隆的293或293細(xì)胞,用于在懸浮培養(yǎng)基中生長(zhǎng),graham等人,j.genvirol.36:59(1977));小倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(bhk,atccccl10);小鼠塞爾托利細(xì)胞(tm4,mather,biol.reprod.23:243-251(1980));猴腎細(xì)胞(cv1atccccl70);非洲綠猴腎細(xì)胞(vero-76,atcccrl-1587);人宮頸癌細(xì)胞(hela,atccccl2);犬腎細(xì)胞(mdck,atccccl34);水牛鼠肝細(xì)胞(brl3a,atcccrl1442);人肺細(xì)胞(w138,atccccl75);人肝細(xì)胞(hepg2,hb8065);小鼠乳腺腫瘤(mmt060562,atccccl51);tri細(xì)胞(mather等人,annalsn.y.acad.sci.383:44-68(1982));mrc5細(xì)胞;fs4細(xì)胞;和人肝癌細(xì)胞系(hepg2)。其它有用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系包括骨髓瘤細(xì)胞系如ns0和sp2/0。對(duì)于適于抗體生成的某些哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的綜述,參見(jiàn)例如yazaki和wu,methodsinmolecularbiology,vol.248(b.k.c.lo,ed.,humanapress,totowa,n.j.,2003),第255-268頁(yè)。棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、牽?;?、番茄、浮萍(leninaceae)、紫花苜蓿(m.truncatula)和煙草的植物細(xì)胞培養(yǎng)物也可以用作宿主。用于此目的的合適的原核細(xì)胞包括細(xì)菌,如革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性菌,例如腸桿菌科,如埃希氏菌屬,例如大腸桿菌,腸桿菌屬、歐文氏菌屬、克雷伯菌屬、變形桿菌屬、沙門菌屬,如鼠傷寒沙門菌,沙雷菌屬,如粘質(zhì)沙雷氏菌,和志賀菌屬,以及桿菌,例如枯草桿菌和地衣芽孢桿菌(如1989年4月12日出版的dd266,710中公開(kāi)的地衣芽孢桿菌41p),假單胞菌屬例如銅綠假單胞菌,和鏈霉菌屬。一種優(yōu)選的大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294(atcc31,446),但其它菌株例如大腸桿菌b、大腸桿菌x1776(atcc31,537)和大腸桿菌w3110(atcc27,325)也是適合的。這些實(shí)例是說(shuō)明性而非限制性的。除了原核生物之外,真核微生物如絲狀真菌或酵母是用于編碼抗體的載體的合適的克隆或表達(dá)宿主。釀酒酵母或普通面包酵母是較低級(jí)真核宿主微生物中最常用的酵母。然而,許多其它屬、種和菌株通常是可獲得的和在本文中有用的,例如粟酒裂殖酵母菌(schizosaccharomycesprombe);克魯維酵母屬宿主,例如乳酸克魯維酵母(k.lactis)、脆壁克魯維酵母(k.fragilis)(atcc12,424)、保加利亞克魯維酵母(k.bulgaricus)(atcc16,045)、威克克魯維酵母(k.wickeramii)(atcc24,178)、k.waltii(atcc56,500)、果蠅克魯維酵母(k.drosophilarum)(atcc36,906)、耐熱克魯維酵母(k.thermotolerans)和馬克思克魯維酵母(k.marxianus);子囊菌酵母屬(ep402,226);畢赤酵母(ep183,070);假絲酵母屬;瑞氏木霉(ep244,234);粗糙脈孢菌;許旺酵母屬,例如許旺酵母;和絲狀真菌,例如鏈孢霉屬、青霉屬、彎頸霉屬和曲霉菌屬的宿主,例如構(gòu)巢曲菌和黑曲霉。利福霉素型抗生素本發(fā)明的抗體-抗生素綴合物(aac)的抗生素部分(abx)是具有細(xì)胞毒性或細(xì)胞抑制作用的利福霉素型抗生素或基團(tuán)。利福霉素是由細(xì)菌地中海諾卡氏菌(nocardiamediterranei)、地中海擬無(wú)枝酸菌(amycolatopsismediterranei)或人工獲得的一組抗生素。它們是抑制細(xì)菌rna聚合酶的較大的安莎霉素家族的亞類(fujii等人(1995)antimicrob.agentschemother.39:1489-1492;feklistov等人(2008)procnatlacadsciusa,105(39):14820-5),并且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和選擇性革蘭氏陰性菌具有效力。利福霉素對(duì)分枝桿菌特別有效,且因此用于治療結(jié)核病、麻風(fēng)病和鳥(niǎo)分枝桿菌復(fù)合體(mac)感染。利福霉素型群組包括“經(jīng)典的”利福霉素藥物以及利福霉素衍生物利福平(rifampicin)(利福平(rifampin),ca登記號(hào)13292-46-1)、利福布汀(ca登記號(hào)72559-06-9;us2011/0178001),利福噴汀和利福拉齊(ca登記號(hào)129791-92-0,rothstein等人(2003)expertopin.investig.drugs12(2):255-271;fujii等人(1994)antimicrob.agentschemother38:1118-1122)。許多利福霉素型抗生素都具有抗發(fā)育的有害性質(zhì)(wichelhaus等人(2001)j.antimicrob.chemother.47:153-156)。在1957年首先從地中海鏈霉菌(streptomycesmediterranei)的發(fā)酵培養(yǎng)物中分離出利福霉素。發(fā)現(xiàn)約七種利福霉素,稱為利福霉素a、b、c、d、e、s和sv(us3150046)。利福霉素b是商業(yè)上首次引入的,且在二十世紀(jì)六十年代可用于治療耐藥性結(jié)核病。利福霉素已被用于治療許多疾病,最重要的是hiv相關(guān)性結(jié)核病。由于大量可用的類似物和衍生物,利福霉素已廣泛用于消除已經(jīng)變得對(duì)常用抗生素具有抗性的致病菌。例如,利福平以其有效作用和預(yù)防耐藥性的能力而聞名。它迅速殺死快速分裂的桿菌菌株以及“耐藥株”細(xì)胞,所述細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間保持生物無(wú)活性來(lái)使其逃避抗生素活性。此外,利福布汀和利福噴汀均已被用于hiv陽(yáng)性患者的獲得性結(jié)核病。式i的抗體-抗生素綴合物的抗生素部分(abx)是具有以下結(jié)構(gòu)的利福霉素型部分:其中:虛線表示任選的鍵;r是h、c1-c12烷基或c(o)ch3;r1是oh;r2是ch=n-(雜環(huán)基),其中所述雜環(huán)基任選地被一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自c(o)ch3、c1-c12烷基、c1-c12雜芳基、c2-c20雜環(huán)基、c6-c20芳基和c3-c12碳環(huán)基的基團(tuán)取代;或r1和r2形成五元或六元稠合雜芳基或雜環(huán)基,并且任選地形成螺或稠合的六元雜芳基、雜環(huán)基、芳基或碳環(huán)基環(huán),其中所述螺或稠合的六元雜芳基、雜環(huán)基、芳基或碳環(huán)基環(huán)任選地被h、f、cl、br、i、c1-c12烷基或oh取代;并且其中非肽類接頭pml共價(jià)連接到r2上。利福霉素型部分的實(shí)施方案是:其中r3獨(dú)立地選自h和c1-c12烷基;r4選自h、f、cl、br、i、c1-c12烷基和oh;且z選自nh、n(c1-c12烷基)、o和s;并且其中非肽類接頭pml共價(jià)連接到n(r3)2的氮原子上。利福平型部分的實(shí)施方案是:其中,r5選自h和c1-c12烷基;并且其中非肽類接頭pml共價(jià)連接到nr5的氮原子上。利福布汀型部分的實(shí)施方案是:其中r5選自h和c1-c12烷基;并且其中非肽類接頭pml共價(jià)連接到nr5的氮原子上。苯并噁嗪并利福霉素型部分的實(shí)施方案是:其中r5選自h和c1-c12烷基;并且其中非肽類接頭pml共價(jià)連接到nr5的氮原子上。本文稱為pipbor的苯并噁嗪并利福霉素型部分的實(shí)施方案是:其中r3獨(dú)立地選自h和c1-c12烷基;并且其中非肽類接頭pml共價(jià)連接到n(r3)2的氮原子上。本文稱為二甲基pipbor的苯并噁嗪并利福霉素型部分的實(shí)施方案是:其中非肽類接頭pml共價(jià)連接到二甲基氨基的氮原子上。半合成衍生物利福霉素s,或還原的鈉鹽型利福霉素sv可以以幾個(gè)步驟轉(zhuǎn)化為利福拉齊型抗生素,其中r為h或ac,r3獨(dú)立地選自h和c1-c12烷基;r4選自h、f、cl、br、i、c1-c12烷基和oh;并且z選自nh、n(c1-c12烷基)、o和s(參見(jiàn),例如wo2014/194247中的圖23a和b,以及圖25a和b)??芍苽浔讲f嗪并(z=o)、苯并噻嗪并(z=s)、苯并二嗪并(z=nh、n(c1-c12)烷基)利福霉素(us7271165)。含有取代基的苯并噁嗪并利福霉素(bor)、苯并噻嗪并利福霉素(btr)和苯并二嗪并利福霉素(bdr)類似物根據(jù)us7271165第28欄式a中提供的編號(hào)方案編號(hào),其通過(guò)引用并入本文?!?5-o-脫乙酰基”利福霉素是指利福霉素類似物,其中25位的乙?;驯怀ァT谠撐恢眠M(jìn)一步衍生化的類似物稱為“25-o-脫乙?;?25-(取代基)利福霉素”,其中在完整化合物名稱中用衍生基團(tuán)的命名替換“取代基”。利福霉素型抗生素部分可以通過(guò)在us4610919;us4983602;us5786349;us5981522;us4859661;us7271165;us2011/0178001;seligson等人,(2001)抗癌藥物(anti-cancerdrugs)12:305-13;chem.pharm.bull.,(1993)41:148中和在wo2014/194247中公開(kāi)的類似方法合成,它們各自通過(guò)引用并入本文。通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)的mic體外測(cè)定,通過(guò)測(cè)量其最小抑菌濃度(mic)篩選利福霉素型抗生素部分的抗微生物活性(tomioka等人,(1993)antimicrob.agentschemother.37:67)。蛋白酶可切割的非肽類接頭“蛋白酶可切割的非肽類接頭”(pml)是雙官能或多官能部分,其共價(jià)連接到一個(gè)或多個(gè)抗生素部分(abx)和抗體單元(ab)以形成式i的抗體-抗生素綴合物(aac)。aac中的蛋白酶可切割的非肽類接頭是用于細(xì)胞內(nèi)蛋白酶切割的底物,包括在溶酶體條件下。蛋白酶包括各種組織蛋白酶和半胱天冬酶。細(xì)胞內(nèi)aac的非肽類接頭的切割可以釋放具有抗菌作用的利福霉素型抗生素??梢允褂镁哂信c抗生素(abx)和抗體(ab)結(jié)合的反應(yīng)官能性的接頭試劑或接頭-抗生素中間體,方便地制備抗體-抗生素綴合物(aac)。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中,半胱氨酸工程化改造的抗體(ab)的半胱氨酸硫醇可以與接頭試劑,抗生素部分或抗生素-接頭中間體的官能團(tuán)形成鍵。aac的pml部分可以包含一個(gè)氨基酸殘基。aac的pml部分包含擬肽單元。一方面,接頭試劑或接頭-抗生素中間體具有反應(yīng)性位點(diǎn),其具有對(duì)存在于抗體上的親核半胱氨酸具有反應(yīng)性的親電子基團(tuán)??贵w的半胱氨酸硫醇與接頭試劑或接頭抗生素上的親電子基團(tuán)反應(yīng),形成共價(jià)鍵。有用的親電子基團(tuán)包括但不限于馬來(lái)酰亞胺和鹵代乙酰胺基團(tuán)。根據(jù)klussman等人(2004),bioconjugatechemistry15(4):765-773第766頁(yè)的綴合方法,且根據(jù)實(shí)施例19的方法,半胱氨酸改造的抗體與接頭試劑或接頭-抗生素中間體,與親電子官能團(tuán)如馬來(lái)酰亞胺或α-鹵代羰基反應(yīng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中,接頭試劑或接頭-抗生素中間體的反應(yīng)性基團(tuán)含有可與抗體的游離半胱氨酸硫醇形成鍵的硫醇反應(yīng)性官能團(tuán)。硫醇反應(yīng)官能團(tuán)的實(shí)例包括但不限于馬來(lái)酰亞胺、α-鹵代乙?;罨ト珑牾啺孵?、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯、酸酐、酰氯、磺酰氯、異氰酸酯和異硫氰酸酯。在另一個(gè)實(shí)施方案中,接頭試劑或抗生素-接頭中間體具有反應(yīng)性官能團(tuán),其具有對(duì)存在于抗體上的親電子基團(tuán)具有反應(yīng)性的親核基團(tuán)。抗體上有用的親電子基團(tuán)包括但不限于吡啶基二硫化物、醛和酮羰基。接頭試劑或抗生素-接頭中間體的親核基團(tuán)的雜原子可以與抗體上的親電子基團(tuán)反應(yīng),并與抗體單元形成共價(jià)鍵。接頭試劑或抗生素-接頭中間體上有用的親核基團(tuán)包括但不限于酰肼、肟、氨基、硫醇、肼、縮氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼??贵w上的親電子基團(tuán)提供了用于連接到接頭試劑或抗生素-接頭中間體的方便位點(diǎn)。pml部分可以包含一個(gè)或多個(gè)接頭組分。示例性的接頭組分包括單個(gè)氨基酸,例如瓜氨酸(“cit”),6-馬來(lái)酰亞胺基己?;?“mc”),馬來(lái)酰亞胺基丙酰基(“mp”)和對(duì)氨基芐氧基羰基(“pab”),n-琥珀酰亞胺基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(“spp”)和4-(n-馬來(lái)酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(“mcc”)。各種接頭組分是本領(lǐng)域已知的,其中一些在下面描述。在另一個(gè)實(shí)施方案中,接頭可以被調(diào)節(jié)溶解度或反應(yīng)性的基團(tuán)取代。例如,帶電荷的取代基如磺酸根(-so3-)或銨可增加試劑的水溶性,且促進(jìn)接頭試劑與抗體或抗生素部分的偶聯(lián)反應(yīng),或促進(jìn)ab-l(抗體-接頭中間體)與abx或abx-l(抗生素-接頭中間體)與ab的偶聯(lián)反應(yīng),這取決于用于制備aac的合成途徑。本發(fā)明的aac明確地考慮但不限于用以下接頭試劑制備的那些:bmpeo、bmps、emcs、gmbs、hbvs、lc-smcc、mbs、mpbh、sbap、sia、siab、smcc、smpb、smph、磺基-emps、磺基-gmbs、磺基-kmos、磺基-mbs、磺基-siab、磺基-smcc、磺基-smpb、svsb(琥珀酰亞胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)和雙馬來(lái)酰亞胺試劑如dtme、bmb、bmdb、bmh、bmoe、bm(peg)2和bm(peg)3。雙馬來(lái)酰亞胺試劑允許半胱氨酸工程化改造的抗體的硫醇基團(tuán)以順序或匯合的方式連接到含硫醇的抗生素部分、標(biāo)記物或接頭中間體。除馬來(lái)酰亞胺之外,與半胱氨酸工程化改造的抗體、抗生素部分或接頭-抗生素中間體的巰基反應(yīng)的其它官能團(tuán)包括碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、異氰酸酯和異硫氰酸酯。還可以通過(guò)其他商業(yè)來(lái)源,例如molecularbiosciencesinc.(boulder,co)獲得有用的接頭試劑,或根據(jù)toki等人(2002)j.org.chem.67:1866-1872;dubowchik等人(1997)tetrahedronletters,38:5257-60;walker,m.a.(1995)j.org.chem.60:5352-5355;frisch等人(1996)bioconjugatechem.7:180-186;us6214345;wo02/088172;us2003130189;us2003096743;wo03/026577;wo03/043583;和wo04/032828中描述的方法合成。在另一個(gè)實(shí)施方案中,aac的pml部分包含樹(shù)突狀接頭,用于將一個(gè)以上的抗生素部分通過(guò)支鏈多官能接頭部分共價(jià)連接至抗體上(sun等人(2002)生物有機(jī)&藥物化學(xué)通訊(bioorganic&medicinalchemistryletters)12:2215;sun等人(2003)生物有機(jī)&藥物化學(xué)(bioorganic&medicinalchemistry)11:1761-1768)。樹(shù)突狀接頭可以增加抗生素與抗體的摩爾比,即負(fù)載,其與aac的效力有關(guān)。因此,當(dāng)半胱氨酸改造的抗體僅具有一個(gè)反應(yīng)性半胱氨酸硫醇基團(tuán)時(shí),多個(gè)抗生素部分可以通過(guò)樹(shù)枝狀接頭連接。在式iaac的某些實(shí)施方案中,蛋白酶可切割的非肽類接頭pml具有下式:-str-pm-y-其中str是延伸單元;pm是擬肽單元,和y是間隔單元;abx是利福霉素型抗生素;并且p是從1到8的整數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方案中,延伸單元“str”具有下式:其中r6選自c1-c12亞烷基、c1-c12亞烷基-c(=o)、c1-c12亞烷基-nh、(ch2ch2o)r、(ch2ch2o)r-c(=o)、(ch2ch2o)r-ch2、和c1-c12亞烷基-nhc(=o)ch2ch(噻吩-3-基),其中r是1至10的整數(shù)。示例性的延伸單元如下所示(其中波浪線表示與抗體共價(jià)連接的位點(diǎn)):在一個(gè)實(shí)施方案中,pm具有下式:其中r7和r8一起形成c3-c7環(huán)烷基環(huán),和aa是選自h、-ch3、-ch2(c6h5)、-ch2ch2ch2ch2nh2、-ch2ch2ch2nhc(nh)nh2、-chch(ch3)ch3、和-ch2ch2ch2nhc(o)nh2的氨基酸側(cè)鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中,間隔單元y包含對(duì)氨基芐基(pab)或?qū)Π被S氧基羰基(pabc)。間隔單元允許釋放抗生素部分而沒(méi)有單獨(dú)的水解步驟。間隔單元可以是“自發(fā)性的(self-immolative)”或“非自發(fā)性的”。在某些實(shí)施方案中,接頭的間隔單元包含對(duì)氨基芐基單元(pab)。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中,對(duì)氨基芐醇通過(guò)對(duì)氨基芐基基團(tuán)和抗生素部分之間的酰胺鍵,氨基甲酸酯,甲基氨基甲酸酯或碳酸酯連接到氨基酸單元上(hamann等人(2005)expertopin.ther.patents(2005)15:1087-1103)。在一個(gè)實(shí)施方案中,間隔單元是對(duì)氨基芐氧基羰基(pab)。在一個(gè)實(shí)施方案中,當(dāng)與非肽類接頭pml的pab間隔單元連接時(shí),抗生素包含季胺,例如二甲基氨基哌啶基基團(tuán)。這種季胺接頭-抗生素中間體(pla)的實(shí)例是來(lái)自表2的pla-1至4。季胺基團(tuán)可調(diào)節(jié)抗生素部分的切割以優(yōu)化aac的抗菌作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中,抗生素與非肽類接頭pml的pabc間隔單元連接,在aac中形成氨基甲酸酯官能團(tuán)。這樣的氨基甲酸酯官能團(tuán)也可以優(yōu)化aac的抗菌作用。pabc氨基甲酸酯接頭-抗生素中間體(pla)的實(shí)例是來(lái)自表2的pla-5和pla-6。自發(fā)性間隔物的其它實(shí)例包括但不限于與pab基團(tuán)電子性相似的芳族化合物,例如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(us7375078;hay等人(1999)bioorg.med.chem.lett.9:2237)和鄰-或?qū)?氨基芐基縮醛。可以使用在酰胺鍵水解后進(jìn)行環(huán)化的間隔物,例如取代和未取代的4-氨基丁酸酰胺(rodrigues等人(1995)chemistrybiology2:223),適當(dāng)取代的雙環(huán)[2.2.1]和雙環(huán)[2.2.2]環(huán)系統(tǒng)(storm等人(1972)j.amer.chem.soc.94:5815)和2-氨基苯基丙酸酰胺(amsberry等人(1990)j.org.chem.55:5867)。在甘氨酸處被取代的含胺藥物的消除(kingsbury等人(1984)j.med.chem.27:1447)也是在aac中有用的自發(fā)性間隔物的示例。從aac切割釋放的活性抗生素的量可以通過(guò)實(shí)施例8的半胱天冬酶釋放試驗(yàn)來(lái)測(cè)量。對(duì)aac有用的接頭-抗生素中間體實(shí)施例11-21通過(guò)將利福霉素型抗生素部分與接頭試劑偶聯(lián)制備式ii和表2的pml接頭-抗生素中間體(pla)。接頭試劑通過(guò)wo2012/113847;us7659241;us7498298;us20090111756;us2009/0018086;us6214345;dubowchik等人(2002)bioconjugatechem.13(4):855-869中描述的方法制備。表2pml接頭-抗生素中間體抗體-抗生素綴合物的實(shí)施方案將半胱氨酸改造的抗wta抗體通過(guò)游離半胱氨酸硫醇基團(tuán)與利福霉素的衍生物(稱為pipbor等)經(jīng)蛋白酶可切割的非肽類接頭連接,形成表3中的抗體-抗生素綴合物化合物(aac)。接頭設(shè)計(jì)為被包括組織蛋白酶b、d等的溶酶體蛋白酶切割。實(shí)施例11-21詳細(xì)描述了由抗生素和pml接頭等組成的接頭-抗生素中間體的產(chǎn)生。設(shè)計(jì)接頭,使得在pab部分處的酰胺鍵的切割將抗體與活性狀態(tài)的抗生素分離。命名為“二甲基pipbor”的aac與“pipbor”aac相同,除了抗生素上的二甲基化的氨基和接頭上的氧羰基。圖3顯示抗體-抗生素綴合物(aac)的藥物活化的可能機(jī)制?;钚钥股?ab)僅在aac在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)內(nèi)化后釋放。aac中抗體的fab部分結(jié)合金黃色葡萄球菌,而aac的fc部分通過(guò)fc受體介導(dǎo)的結(jié)合吞噬細(xì)胞(包括嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)增強(qiáng)細(xì)菌攝取。在內(nèi)化到吞噬溶酶體中后,接頭可以通過(guò)溶解體蛋白酶裂解,釋放吞噬溶酶體內(nèi)部的活性抗生素。本發(fā)明的抗體-抗生素綴合物(aac)化合物的一個(gè)實(shí)施方案包括式i:其中:虛線表示任選的鍵;r是h、c1-c12烷基或c(o)ch3;r1是oh;r2是ch=n-(雜環(huán)基),其中所述雜環(huán)基任選地被一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自c(o)ch3、c1-c12烷基、c1-c12雜芳基、c2-c20雜環(huán)基、c6-c20芳基和c3-c12碳環(huán)基的基團(tuán)取代;或r1和r2形成五元或六元稠合雜芳基或雜環(huán)基,并且任選地形成螺或稠合的六元雜芳基、雜環(huán)基、芳基或碳環(huán)基環(huán),其中所述螺或稠合的六元雜芳基、雜環(huán)基、芳基或碳環(huán)基環(huán)任選地被h、f、cl、br、i、c1-c12烷基或oh取代;pml是連接到r2或由r1和r2形成的稠合雜芳基或雜環(huán)基的蛋白酶可切割的非肽類接頭;ab是抗壁磷壁酸(wta)抗體;并且p是從1到8的整數(shù)。本發(fā)明的抗體-抗生素綴合物(aac)化合物的另一個(gè)實(shí)施方案包括下式:其中,r3獨(dú)立地選自h和c1-c12烷基;n為1或2;r4選自h、f、cl、br、i、c1-c12烷基和oh;和z選自nh、n(c1-c12烷基)、o和s。本發(fā)明的抗體-抗生素綴合物(aac)化合物的另一個(gè)實(shí)施方案包括下式:其中,r5選自h和c1-c12烷基;和n為0或1。本發(fā)明的抗體-抗生素綴合物(aac)化合物的另一個(gè)實(shí)施方案包括下式:其中,r5選自h和c1-c12烷基;和n為0或1。本發(fā)明的抗體-抗生素綴合物(aac)化合物的另一個(gè)實(shí)施方案包括下式:其中,r5選自h和c1-c12烷基;和n為0或1。本發(fā)明的抗體-抗生素綴合物(aac)化合物的另一個(gè)實(shí)施方案包括下式:其中,r3獨(dú)立地選自h和c1-c12烷基;和n為1或2。本發(fā)明的抗體-抗生素綴合物(aac)化合物的另一個(gè)實(shí)施方案包括下式:本發(fā)明的抗體-抗生素綴合物(aac)化合物的另一個(gè)實(shí)施方案包括下式:本發(fā)明的抗體-抗生素綴合物(aac)化合物的另一個(gè)實(shí)施方案包括下式:本發(fā)明的抗體-抗生素綴合物(aac)化合物的另一個(gè)實(shí)施方案包括下式:本發(fā)明的抗體-抗生素綴合物(aac)化合物的另一個(gè)實(shí)施方案包括下式:本發(fā)明的抗體-抗生素綴合物(aac)化合物的另一個(gè)實(shí)施方案包括下式:本發(fā)明的抗體-抗生素綴合物(aac)化合物的另一實(shí)施方案包括下式:aac的抗生素負(fù)載抗生素負(fù)載量由p表示,即,在式i分子中每個(gè)抗體的抗生素(abx)部分的數(shù)??股刎?fù)載量可以為每個(gè)抗體1至20個(gè)抗生素部分(d)。式i的aac包括與1至20個(gè)抗生素部分綴合的抗體集合或一組抗體。來(lái)自綴合反應(yīng)的aac制劑中每個(gè)抗體的抗生素部分的平均數(shù)可以通過(guò)常規(guī)方法表征,例如質(zhì)譜、elisa測(cè)定和hplc。也可以確定aac在p方面的定量分布。在一些情況下,分離、純化和表征均質(zhì)的aac(其中p是來(lái)自具有其它抗生素負(fù)荷的aac的某一值)可以通過(guò)諸如反相hplc或電泳的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。對(duì)于一些抗體-抗生素綴合物,p可能受抗體上附著位點(diǎn)數(shù)目的限制。例如,如上述示例性實(shí)施方案中,當(dāng)附著點(diǎn)是半胱氨酸硫醇,抗體可以僅具有一個(gè)或幾個(gè)半胱氨酸硫醇基團(tuán),或者可以僅具有一個(gè)或幾個(gè)足夠反應(yīng)性的硫醇基團(tuán),通過(guò)其可連接接頭。在某些實(shí)施方案中,較高的抗生素負(fù)載,例如p>5,可能導(dǎo)致某些抗體-抗生素綴合物的聚集、不溶性、毒性或細(xì)胞通透性的喪失。在某些實(shí)施方案中,本發(fā)明的aac的抗生素負(fù)載量為1至約8;約2至約6;約2至約4;或約3至約5;約4;或約2。在某些實(shí)施方案中,在綴合反應(yīng)期間少于抗生素部分的理論最大值與抗體綴合??贵w可以含有例如不與抗生素-接頭中間體或接頭試劑反應(yīng)的賴氨酸殘基,如下所述。通常,抗體不含許多可與抗生素部分連接的游離和反應(yīng)性半胱氨酸硫醇;實(shí)際上,抗體中大多數(shù)半胱氨酸硫醇?xì)埢鳛槎蜴I存在。在某些實(shí)施方案中,可以在部分或全部還原條件下,用還原劑例如二硫蘇糖醇(dtt)或三羰基乙基膦(tcep)還原抗體,以產(chǎn)生反應(yīng)性半胱氨酸硫醇基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中,將抗體進(jìn)行變性條件以顯示反應(yīng)性親核基團(tuán),例如賴氨酸或半胱氨酸。可以以不同的方式控制aac的負(fù)載(抗生素/抗體比例,“aar”),在本文還稱為藥物抗體比例(dar),例如通過(guò):(i)限制抗生素-接頭中間體或接頭試劑相對(duì)于抗體的摩爾過(guò)量,(ii)限制綴合反應(yīng)時(shí)間或溫度,和(iii)部分或限制半胱氨酸硫醇修飾的還原條件。應(yīng)當(dāng)理解,當(dāng)多于一個(gè)親核基團(tuán)與抗生素-接頭中間體反應(yīng)或與接頭試劑、隨后是抗生素部分試劑反應(yīng)時(shí),那么所得產(chǎn)物是具有連接到抗體上的一個(gè)或多個(gè)抗生素部分分布的aac化合物的混合物。每種抗體的平均抗生素?cái)?shù)可以通過(guò)雙重elisa抗體測(cè)定從混合物中計(jì)算出來(lái),該測(cè)定對(duì)于抗體是特異性的并且對(duì)抗生素是特異性的??梢酝ㄟ^(guò)質(zhì)譜在混合物中鑒定單個(gè)aac分子,并通過(guò)hplc分離,例如疏水相互作用層析(參見(jiàn),例如mcdonagh等人(2006)prot.engr.pesign&selection19(7):299-307;hamblett等人(2004)clin.cancerres.10:7063-7070;hamblett,k.j.等人,“藥物負(fù)荷對(duì)抗cd30抗體-藥物綴合物的藥理學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)和毒性的影響(effectofdrugloadingonthepharmacology,pharmacokinetics,andtoxicityofaanti-cd30antibody-drugconjugate)”,abstractno.624,美國(guó)癌癥研究協(xié)會(huì),2004年度會(huì)議(americanassociationforcancerresearch,2004annualmeeting),march27-31,2004,aacr學(xué)報(bào),第45卷,2004年3月(proceedingsoftheaacr,volume45,march2004);alley,s.c.等人,“控制藥物連接在抗體-藥物綴合物中的位置(controllingthelocationofdrugattachmentinantibody-drugconjugates)”,abstractno.627,美國(guó)癌癥研究協(xié)會(huì),2004年度會(huì)議(americanassociationforcancerresearch,2004annualmeeting),march27-31,2004,aacr學(xué)報(bào),第45卷,2004年3月(proceedingsoftheaacr,volume45,march2004))。在某些實(shí)施方案中,可以通過(guò)電泳或色譜從綴合混合物中分離具有單一負(fù)載值的均相aac。本發(fā)明的半胱氨酸改造的抗體能夠?qū)崿F(xiàn)更均質(zhì)的制備,因?yàn)榭贵w上的反應(yīng)位點(diǎn)主要限于改造的半胱氨酸硫醇。在一個(gè)實(shí)施方案中,每個(gè)抗體的抗生素部分的平均數(shù)目在約1至約20的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中,選擇和控制該范圍為約1至4。制備抗體-抗生素綴合物的方法式i的aac可以通過(guò)使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的有機(jī)化學(xué)反應(yīng)、條件和試劑的幾種途徑制備,包括:(1)抗體的親核基團(tuán)與二價(jià)接頭試劑的反應(yīng),通過(guò)共價(jià)鍵形成ab-l,隨后與抗生素部分(abx)反應(yīng);和(2)抗生素部分的親核基團(tuán)與二價(jià)接頭試劑反應(yīng),通過(guò)共價(jià)鍵形成l-abx,隨后與抗體的親核基團(tuán)反應(yīng)。us7498298描述了通過(guò)后一種途徑制備式i的aac的示例性方法,其通過(guò)引用明確地并入本文??贵w上的親核基團(tuán)包括但不限于:(i)n-末端胺基,(ii)側(cè)鏈胺基,例如賴氨酸,(iii)側(cè)鏈硫醇基,例如半胱氨酸,和(iv)抗體被糖基化的糖羥基或氨基。胺、硫醇和羥基是親核基團(tuán),并且能夠與接頭部分和接頭試劑上的親電子基團(tuán)反應(yīng)形成共價(jià)鍵,親電子基團(tuán)包括:(i)活性酯如nhs酯、hobt酯、鹵代甲酸酯和?;u;(ⅱ)烷基和芐基鹵,如鹵代乙酰胺;(iii)醛、酮、羧基和馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)。某些抗體具有可還原的鏈間二硫鍵,即半胱氨酸橋。通過(guò)用還原劑如dtt(二硫蘇糖醇)或三羰基乙基膦(tcep)進(jìn)行處理,使得抗體完全或部分還原,抗體可以與接頭試劑綴合反應(yīng)。因此,每個(gè)半胱氨酸橋在理論上將形成兩個(gè)反應(yīng)性硫醇親核試劑。另外的親核基團(tuán)可以通過(guò)賴氨酸殘基的修飾引入抗體,例如通過(guò)使賴氨酸殘基與2-亞氨基噻吩(traut's試劑)反應(yīng),導(dǎo)致胺轉(zhuǎn)化為硫醇??梢酝ㄟ^(guò)引入一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基(例如通過(guò)制備包含一個(gè)或多個(gè)非天然半胱氨酸氨基酸殘基的變體抗體),將反應(yīng)性硫醇基團(tuán)引入抗體。本發(fā)明的抗體-抗生素綴合物也可以通過(guò)抗體上的親電子基團(tuán),例如醛或酮羰基,與接頭試劑或抗生素上的親核基團(tuán)之間的反應(yīng)產(chǎn)生。接頭試劑上有用的親核基團(tuán)包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、縮氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼。在一個(gè)實(shí)施方案中,修飾抗體以引入能夠與接頭試劑或抗生素上的親核取代基反應(yīng)的親電子部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中,糖基化抗體的糖可被氧化,例如,與高碘酸氧化試劑形成可與連接試劑或抗生素部分的胺基反應(yīng)的醛或酮基。所得到的亞胺希夫堿基可以形成穩(wěn)定的鍵,或可以被還原。例如由硼氫化物試劑形成穩(wěn)定的胺鍵。在一個(gè)實(shí)施方案中,糖基化抗體的碳水化合物部分與半乳糖氧化酶或偏高碘酸鈉反應(yīng),可以在抗體中產(chǎn)生可與抗生素上適當(dāng)基團(tuán)反應(yīng)的羰基(醛和酮)基團(tuán)(hermanson,bioconjugatetechniques)。在另一個(gè)實(shí)施方案中,含有n-末端絲氨酸或蘇氨酸殘基的抗體可與偏高碘酸鈉反應(yīng),導(dǎo)致產(chǎn)生醛而代替第一個(gè)氨基酸(geoghegan&stroh,(1992)bioconjugatechem.3:138-146;us5362852)。這樣的醛可以與抗生素部分或接頭親核試劑反應(yīng)??股夭糠稚系挠H核基團(tuán)包括但不限于:胺、硫醇、羥基、酰肼、肟、肼、縮氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼基團(tuán),其能夠與接頭部分和接頭試劑上的親電子基團(tuán)形成共價(jià)鍵,包括:(i)活性酯如nhs酯、hobt酯、鹵代甲酸酯和?;u;(ii)烷基和芐基鹵,如鹵代乙酰胺;(iii)醛、酮、羧基和馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)。根據(jù)實(shí)施例7中所述的方法,表3中的抗體-抗生素綴合物(aac)通過(guò)所述抗wta抗體與表2的接頭-抗生素中間體綴合制備。通過(guò)體外巨噬細(xì)胞測(cè)定(實(shí)施例9)和體內(nèi)小鼠腎模型(實(shí)施例10)測(cè)試aac的功效。表3wta抗體-pml-抗生素綴合物(aac)*aar=抗生素/抗體比例平均值野生型(“wt”)、半胱氨酸改造的突變抗體(“硫代”)、輕鏈(“l(fā)c”)、重鏈(“hc”)、6-馬來(lái)酰亞胺基己?;?“mc”)、馬來(lái)酰亞胺基丙?;?“mp”)、環(huán)丁基二酮基(“cbdk”)、瓜氨酸(“cit”)、半胱氨酸(“cys”)、對(duì)氨基芐基(“pab”)和對(duì)氨基芐氧羰基(“pabc”)用抗體-抗生素綴合物治療和預(yù)防感染的方法本發(fā)明的抗-wta-aac可用作對(duì)人和獸醫(yī)的葡萄球菌,例如金黃色葡萄球菌、腐生性葡萄球菌(s.saprophyticus)和溶血性葡萄球菌(s.simulans)的有效的抗微生物劑。在具體方面,本發(fā)明的aac可用于治療金黃色葡萄球菌感染。進(jìn)入血液后,金黃色葡萄球菌可以在幾乎任何器官中引起轉(zhuǎn)移性感染。繼發(fā)感染發(fā)生在治療開(kāi)始前約三分之一的病例中(fowler等人,(2003)arch.intern.med.163:2066-2072),甚至在治療開(kāi)始后的10%的患者中(khatib等人(2006)scand.j.infect.dis.,38:7-14)。感染的標(biāo)志是大量的膿液儲(chǔ)庫(kù)、組織破壞和膿瘡的形成(所有這些都含有大量的嗜中性粒細(xì)胞)。如果菌血癥持續(xù)超過(guò)三天,約40%的患者會(huì)發(fā)生并發(fā)癥。上文(在副標(biāo)題抗體-抗生素綴合物下)已經(jīng)描述了提出的aac的作用機(jī)制。本發(fā)明的抗wta抗體-抗生素綴合物(aac)對(duì)于治療細(xì)胞內(nèi)病原體具有顯著的治療優(yōu)勢(shì)。aac接頭通過(guò)暴露于吞噬溶酶體酶而切割,釋放活性抗生素。由于局限的空間和相對(duì)較高的局部抗生素濃度(每個(gè)細(xì)菌約為104個(gè)),結(jié)果是吞噬溶酶體不再支持細(xì)胞內(nèi)病原體的存活。因?yàn)閍ac基本上是無(wú)活性的前藥,抗生素的治療指數(shù)可以相對(duì)于游離(非綴合)形式擴(kuò)展??贵w提供病原體特異性靶向,而可切割接頭在病原體的細(xì)胞內(nèi)位置特定的條件下切割。這種作用可以直接關(guān)系到調(diào)理的病原體以及共定位在吞噬溶酶體中的其他病原體。抗生素耐受性是導(dǎo)致疾病的病原體抵抗抗生素和其他抗菌藥物殺傷的能力,并且在機(jī)制上與多藥耐藥性不同(lewisk(2007).“耐藥株細(xì)胞、休眠和感染性疾病”。自然微生物學(xué)綜述("persistercells,dormancyandinfectiousdisease".naturereviewsmicrobiology)5(1):48-56.doi:10.1038/nrmicro1557)。相反,這種耐受的形式是由稱為耐藥株的一小部分微生物細(xì)胞引起的(biggerjw(1944年10月14日))“通過(guò)間歇性滅菌用青霉素治療葡萄球菌感染”,柳葉刀("treatmentofstaphylococcalinfectionswithpenicillinbyintermittentsterilization".lancet)244(6320):497-500)。這些細(xì)胞在經(jīng)典意義上不是多藥耐藥性的,而是耐受抗生素治療的休眠細(xì)胞,抗生素可以殺死其遺傳上相同的兄弟姐妹。這種抗生素耐受性是由非分裂或非常緩慢分裂的生理狀態(tài)引起的。當(dāng)抗菌治療無(wú)法消除這些耐藥株細(xì)胞時(shí),它們成為復(fù)發(fā)性慢性感染的儲(chǔ)庫(kù)。本發(fā)明的抗體-抗生素綴合物具有殺死這些耐藥株細(xì)胞的獨(dú)特性質(zhì)并且抑制多藥耐藥細(xì)菌群體的出現(xiàn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明的抗wta-aac可用于治療感染,不管病原體是否存活于細(xì)胞內(nèi)區(qū)室中。在另一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明的抗wta-aac也可用于靶向于以浮游生物或生物膜形式的葡萄球菌。用本發(fā)明的抗體-抗生素綴合物(aac)治療的細(xì)菌感染包括治療細(xì)菌性肺部感染,例如金黃色葡萄球菌肺炎、骨髓炎、復(fù)發(fā)性鼻竇炎、細(xì)菌性心內(nèi)膜炎、細(xì)菌性眼部感染如沙眼和結(jié)膜炎、心臟、腦或皮膚感染,胃腸道感染,一般例如旅行者腹瀉、潰瘍性結(jié)腸炎、腸易激綜合征(ibs)、克羅恩病和ibd(炎性腸病),細(xì)菌性腦膜炎、以及任何器官如肌肉、肝、腦膜或肺中的膿腫。細(xì)菌感染可以在身體其他部位,如尿路、血流、傷口或?qū)Ч懿迦氩课?。本發(fā)明的aac可用于涉及生物膜、植入物或避孕區(qū)(例如骨髓炎和假體關(guān)節(jié)感染),以及高死亡率感染例如醫(yī)院獲得性肺炎和菌血癥的難治療的感染??梢灾委熞灶A(yù)防金黃色葡萄球菌感染的易感患者組包括血液透析患者、免疫受損患者、重癥監(jiān)護(hù)病房的患者和某些手術(shù)患者。在另一方面,本發(fā)明提供了殺死、治療或預(yù)防在動(dòng)物,優(yōu)選哺乳動(dòng)物,最優(yōu)選人類中的微生物感染的方法,其包括向所述動(dòng)物施用抗wtaaac或本發(fā)明的aac藥物制劑。本發(fā)明進(jìn)一步特征在于治療或預(yù)防與這種微生物感染相關(guān)或由其機(jī)會(huì)性地引起的疾病。這些治療或預(yù)防的方法可包括本發(fā)明組合物的口服、局部、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下給藥。例如,在手術(shù)或插入iv導(dǎo)管之前、在icu護(hù)理、移植醫(yī)學(xué)、癌癥化療或癌癥化療后,或其它具有高感染風(fēng)險(xiǎn)的活動(dòng)中,可以施用本發(fā)明的aac以預(yù)防感染發(fā)作或傳播。細(xì)菌感染可以由具有活性和非活性形式的細(xì)菌引起,并且aac以治療細(xì)菌感染的活性和非活性潛在形式的量和足夠的持續(xù)時(shí)間施用,后者持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)于需要治療細(xì)菌感染的活性形式。多種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的分析發(fā)現(xiàn)wtaβ在全部金黃色葡萄球菌上表達(dá),包括mrsa和mssa菌株,以及葡萄球菌菌株如腐生性葡萄球菌和溶血性葡萄球菌。wtaα(α-glcnac核糖醇wta)在大多數(shù)但不是全部的金黃色葡萄球菌上存在,并且還在單核細(xì)胞增生利斯特菌上存在。wta不存在于革蘭氏細(xì)菌上。因此,本發(fā)明的一個(gè)方面是通過(guò)施用治療有效量的本發(fā)明的抗wtaβ-aac來(lái)治療感染了金黃色葡萄球菌、腐生性葡萄球菌或溶血性葡萄球菌的一種或多種的患者的方法。本發(fā)明的另一個(gè)方面是通過(guò)施用治療有效量的本發(fā)明的抗wtaα-aac,來(lái)治療感染金黃色葡萄球菌和/或單核細(xì)胞增多利斯特菌的患者的方法。本發(fā)明還考慮了一種通過(guò)在醫(yī)院設(shè)置例如外科手術(shù)、燒傷患者和器官移植中施用治療有效量的本發(fā)明的抗wtaβ-aac,來(lái)預(yù)防金黃色葡萄球菌或腐生性葡萄球菌或溶血性葡萄球菌感染的方法。由本領(lǐng)域有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師確定的需要治療細(xì)菌感染的患者可能已經(jīng)被感染、但不需要用他/她感染的細(xì)菌類型做診斷。由于患有細(xì)菌感染的患者可以在非??斓臅r(shí)間內(nèi)輪流轉(zhuǎn),所以在幾個(gè)小時(shí)內(nèi),進(jìn)入醫(yī)院的患者可以給予本發(fā)明的抗wta-aac以及一種或多種護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)抗生素,如萬(wàn)古霉素或環(huán)丙沙星。當(dāng)診斷結(jié)果變得可用并且指示在感染中存在例如金黃色葡萄球菌時(shí),患者可以繼續(xù)用抗wtaaac進(jìn)行治療。因此,在治療細(xì)菌感染或特別是金黃色葡萄球菌感染的方法的一個(gè)實(shí)施方案中,給予患者治療有效量的抗wtaβaac。在本發(fā)明的治療或預(yù)防方法中,本發(fā)明的aac可以作為唯一的治療劑或與其它藥劑如下述那些聯(lián)合給藥。在臨床前模型中,本發(fā)明的aac顯示優(yōu)于萬(wàn)古霉素對(duì)mrsa的治療。aac與soc的比較可以例如通過(guò)降低死亡率來(lái)測(cè)量。被評(píng)估的患者將通過(guò)各種可測(cè)量因素評(píng)估對(duì)aac治療的反應(yīng)。臨床醫(yī)生可能用來(lái)評(píng)估患者改善的體征和癥狀的例子包括:診斷升高時(shí)白細(xì)胞計(jì)數(shù)的正?;?、診斷升高(發(fā)熱)時(shí)體溫的正?;?、血液培養(yǎng)物的清除、在傷口中可見(jiàn)的改善包括紅斑減少和膿液引流、減少呼吸機(jī)要求、如通氣的患者需要較少氧氣或降低通氣率,如果患者在診斷時(shí)通氣,則完全從呼吸機(jī)中脫氣,如果在診斷時(shí)需要這些藥物,則使用較少的藥物來(lái)支持穩(wěn)定的血壓,如果在診斷時(shí)異常,那么提示終末器官功能衰竭例如升高的肌酐或肝功能測(cè)試的實(shí)驗(yàn)室異常的正常化,和放射學(xué)成像(例如以前建議肺炎顯示分辨率的胸部x片)的改善。在icu的患者中,這些因素可能至少每天測(cè)量一次。密切監(jiān)測(cè)發(fā)燒,包括絕對(duì)嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)的白細(xì)胞計(jì)數(shù)以及“左移”(指示響應(yīng)于主動(dòng)感染的增加的嗜中性粒細(xì)胞產(chǎn)生爆發(fā)的出現(xiàn))的證據(jù)已經(jīng)解決。在本發(fā)明的治療方法的上下文中,如果本領(lǐng)域技術(shù)人員的醫(yī)師評(píng)估在至少兩個(gè)或更多個(gè)以前的因素中與治療前或治療開(kāi)始時(shí)或診斷時(shí)的值、體征或癥狀相比存在顯著的可測(cè)量的改善,則認(rèn)為具有細(xì)菌感染的患者被治療。在一些實(shí)施方案中,在3、4、5、6或更多個(gè)上述因素中存在可測(cè)量的改善。在一些實(shí)施方案中,與治療前的值相比,測(cè)量因素的改善為至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%。通常,如果患者的可測(cè)量的改善包括以下內(nèi)容,則可以將患者視為細(xì)菌感染(例如金黃色葡萄球菌感染)被完全治療:i)重復(fù)了不會(huì)生長(zhǎng)出最初識(shí)別的細(xì)菌的血液或組織培養(yǎng)物(通常為幾種);ii)發(fā)燒正?;籭ii)wbc正?;缓蚷v)對(duì)于患者先前存在的并發(fā)癥,表明終末器官衰竭(心臟、肺、肝、腎、血管塌陷)的證據(jù)已經(jīng)完全或部分地解決。給藥。在任何上述方面中,在治療感染的患者中,aac的劑量通常為約0.001至1000mg/kg/天。在一個(gè)實(shí)施方案中,細(xì)菌感染的患者以約1mg/kg至約150mg/kg范圍內(nèi)的aac劑量治療,通常為約5mg/kg至約150mg/kg,更具體地為約25mg/kg至125mg/kg,50mg/kg至125mg/kg,甚至更具體地為約50mg/kg至100mg/kg。aac可以每天給予(例如,單劑量為5至50mg/kg/天)或較不頻繁(例如,單劑量為5、10、25或50mg/kg/周)。一個(gè)劑量可以分開(kāi)2天,例如一天25mg/kg,第二天25mg/kg?;颊呖梢悦?天服用一次劑量(q3d),每周一次至每隔一周一次(qow),持續(xù)1-8周。在一個(gè)實(shí)施方案中,患者通過(guò)具有護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)(soc)的iv每周一次、持續(xù)2-6周給予本發(fā)明的aac,以治療細(xì)菌感染如金黃色葡萄球菌感染。治療長(zhǎng)度將由患者的狀況或感染的程度決定,例如,不復(fù)雜的菌血癥的治療持續(xù)時(shí)間為2周,或菌血癥伴心內(nèi)膜炎為6周。在一個(gè)實(shí)施方案中,aac以2.5至100mg/kg的初始劑量給藥連續(xù)1-7天,然后每1-7天一次0.005至10mg/kg的維持劑量,持續(xù)一個(gè)月。給藥途徑。為了治療細(xì)菌感染,本發(fā)明的aac可以靜脈內(nèi)(i.v.)或皮下的任何前述劑量給藥。在一個(gè)實(shí)施方案中,靜脈內(nèi)給藥wta-aac。在一個(gè)具體實(shí)施方案中,通過(guò)靜脈內(nèi)給藥wta-aac是wta-βaac,更加具體地是,其中wta-β抗體是選自具有如圖12、圖13a1和a2以及圖13b1-b4、圖14a1-a2和圖14b1-b3和圖15a1-a3和圖15b1-b6中公開(kāi)的氨基酸序列的抗體。聯(lián)合療法。aac可以酌情與一種或多種另外的、例如第二治療或預(yù)防劑一起施用,其由治療患者的醫(yī)師確定。在一個(gè)實(shí)施方案中,與本發(fā)明的抗體-抗生素綴合化合物組合施用的第二抗生素選自以下結(jié)構(gòu)類別:(i)氨基糖苷類;(ii)β-內(nèi)酰胺類;(iii)大環(huán)內(nèi)酯/環(huán)肽;(iv)四環(huán)素;(v)氟喹啉/氟喹諾酮類;(vi)和噁唑烷酮類。參見(jiàn):shaw,k.和barbachyn,m.(2011)ann.n.y.acad.sci.1241:48-70;sutcliffe,j.(2011)ann.n.y.acad.sci.1241:122-152。在一個(gè)實(shí)施方案中,與本發(fā)明的抗體-抗生素綴合化合物組合施用的第二抗生素選自克林霉素、新生霉素、瑞他帕林(retapamulin)、達(dá)托霉素、gsk-2140944、cg-400549、西他沙星、替考拉寧、三氯生、萘啶酮(napthyridone)、雷得唑來(lái)、多柔比星、氨芐西林、萬(wàn)古霉素、亞胺培南、多利培南、吉西他濱、達(dá)巴萬(wàn)星和阿奇霉素。這些另外的治療或預(yù)防劑的其它實(shí)例是抗炎劑(例如非甾體抗炎藥(nsaid,例如detoprofen、雙氯芬酸、二氟尼柳、依托度酸、非諾洛芬、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、甲氯滅酸鹽、甲芬那酸、美洛昔康、nabumeone、萘普生鈉、奧沙普秦、吡羅昔康、舒林酸、托美汀、塞來(lái)昔布、羅非昔布、阿司匹林、水楊酸膽堿、salsalte和水楊酸鈉和水楊酸鎂)和類固醇(例如,可的松、地塞米松、氫化可的松、甲基強(qiáng)的松龍、潑尼松龍、強(qiáng)的松、去炎松))、抗菌藥(例如阿奇霉素、克拉霉素、紅霉素、加替沙星、左氧氟沙星、阿莫西林、甲硝唑、青霉素g、青霉素v、甲氧西林、苯唑西林、氯唑西林、雙氯西林、萘夫西林、氨芐西林、羧芐西林、替卡西林、美洛西林、哌拉西林、阿洛西林、替莫西林、頭孢噻吩、頭孢匹林、頭孢拉定、頭孢噻啶、頭孢唑啉、頭孢羥唑、頭孢呋辛、頭孢氨芐、頭孢丙烯、頭孢克洛、氯碳頭孢、頭孢西丁、頭孢奈唑、頭孢噻肟、頭孢唑肟、頭孢曲松、頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢克肟、頭孢泊肟、頭孢布烯、頭孢地尼、頭孢匹羅、頭孢吡肟、bal5788、bal9141、亞胺培南、厄他培南、美羅培南、氨曲南、克拉維酸、舒巴坦、他唑巴坦、鏈霉素、新霉素、卡那霉素、巴龍霉素、慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星、奈替米星、壯觀霉素、西索米星、dibekalin、異帕米星、四環(huán)素、金霉素、地美環(huán)素、米諾環(huán)素、土霉素、甲烯土霉素、多西環(huán)素、泰利霉素、abt-773、林可霉素、克林霉素、萬(wàn)古霉素、奧利萬(wàn)星、達(dá)巴萬(wàn)星、替考拉寧、奎奴普丁和達(dá)福普汀、磺胺、對(duì)氨基苯甲酸、磺胺嘧啶、磺胺異噁唑、磺胺甲噁唑、酞磺胺噻唑、利奈唑胺、萘啶酸、噁喹酸、諾氟沙星、培氟沙星、依諾沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、替馬沙星、洛美沙星、氟羅沙星、格帕沙星、司帕沙星、曲伐沙星、克林沙星、莫西沙星、吉米沙星、西他沙星、達(dá)托霉素、加雷沙星、雷莫拉寧、法羅培南、多粘菌素、替加環(huán)素、azd2563、甲氧芐氨嘧啶)、抗細(xì)菌抗體,包括來(lái)自aac靶向ag的相同或不同抗原的抗體、血小板聚集抑制劑(例如阿昔單抗、阿司匹林、西洛他唑、氯吡格雷、雙嘧達(dá)莫、依替巴肽、噻氯匹定或替羅非班)、抗凝血?jiǎng)?例如,達(dá)肝素、達(dá)那肝素、依諾肝素、肝素、亭扎肝素或華法林)、退燒藥(例如,對(duì)乙酰氨基酚)或降脂藥(例如,考來(lái)烯胺、考來(lái)替泊、煙酸、吉非貝齊、普羅布考、依澤替米貝或他汀類藥物如阿托伐他汀、瑞舒伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、西立伐他汀和氟伐他汀)。在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明的aac與金黃色葡萄球菌(包括耐甲氧西林和甲氧西林敏感菌株)的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)(soc)一起施用。mssa通常用萘夫西林或苯唑西林治療,mrsa通常用萬(wàn)古霉素或頭孢唑啉治療。這些另外的試劑可以在給予aac的14天、7天、1天、12小時(shí)或1小時(shí)內(nèi)或與其同時(shí)施用。另外的治療劑可以與aac相同或不同的藥物組合物存在。當(dāng)存在于不同的藥物組合物中時(shí),可以使用不同的給藥途徑。例如,aac可以靜脈內(nèi)或皮下給藥,而第二藥劑可以口服給藥。藥物制劑本發(fā)明還提供含有wta-aac的藥物組合物,以及使用含有aac的藥物組合物治療細(xì)菌感染的方法。這樣的組合物可以進(jìn)一步包含合適的賦形劑,例如藥學(xué)上可接受的賦形劑(載體),包括緩沖劑、酸、堿、糖、稀釋劑、助流劑、防腐劑等,這在本領(lǐng)域是公知的并且在本文中描述。本發(fā)明的方法和組合物可以單獨(dú)使用或與其它常規(guī)方法和/或治療感染性疾病的試劑組合使用。在一些實(shí)施方案中,藥物制劑包含:1)本發(fā)明的抗wtaβ-aac,和2)藥學(xué)上可接受的載體。在一些實(shí)施方案中,藥物制劑包含:1)本發(fā)明的aac,和任選的2)至少一種另外的治療劑。通過(guò)將具有所需純度的aac與任選的生理上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(remington'spharmaceuticalsciences,16thedition,osol,a.ed.(1980))以水溶液或凍干的或其他干燥的制劑形式混合,制備包含本發(fā)明的aac的藥物制劑用于儲(chǔ)存??山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所使用的劑量和濃度上對(duì)受者無(wú)毒,并且包括緩沖液如磷酸鹽、檸檬酸鹽、組氨酸和其它有機(jī)酸;抗氧化劑,包括抗壞血酸和甲硫氨酸;防腐劑(如十八烷基二甲基芐基氯化銨、氯化六甲雙銨、苯扎氯銨、芐索氯銨);苯酚、丁基或芐基醇;對(duì)羥基苯甲酸烷基酯如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或丙酯;鄰苯二酚;間苯二酚;環(huán)己醇;3-戊醇;和間甲酚);低分子量(小于約10個(gè)殘基)多肽;蛋白質(zhì),如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白;親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸;單糖、二糖和其他碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合劑如edta;糖類如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇;形成鹽的反荷離子如鈉;金屬絡(luò)合物(例如zn-蛋白復(fù)合物);和/或非離子表面活性劑如吐溫tm、pluronicstm或聚乙二醇(peg)。用于體內(nèi)施用的藥物制劑通常是無(wú)菌的,通過(guò)無(wú)菌過(guò)濾膜過(guò)濾容易地完成。活性成分也可以被包埋在例如通過(guò)凝聚技術(shù)或通過(guò)界面聚合制備的微膠囊中,例如分別在膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如,脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳液、納米顆粒和納米膠囊)或在大乳劑中的羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊。這種技術(shù)在remington'spharmaceuticalsciences第16版,osol,a.ed.(1980)中公開(kāi)??梢灾苽渚忈屩苿?。緩釋制劑的合適實(shí)例包括含有本發(fā)明的抗體或aac的固體疏水性聚合物的半透性基質(zhì),該基質(zhì)是成形制品例如薄膜或微膠囊形式。緩釋基質(zhì)的實(shí)例包括聚酯、水凝膠(例如,聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(u.s.專利號(hào)3,773,919)、l-谷氨酸和γ乙基-l-谷氨酸鹽的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解乳酸-乙醇酸共聚物如luprondepottm(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射微球)和聚-d-(-)-3-羥基丁酸。雖然聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能夠釋放分子超過(guò)100天,但某些水凝膠在較短的時(shí)間段釋放蛋白質(zhì)。當(dāng)封裝的抗體或aac長(zhǎng)時(shí)間保留在體內(nèi)時(shí),由于在37℃暴露于水分中,它們可能會(huì)變性或聚集,導(dǎo)致生物活性的喪失和免疫原性的可能變化。根據(jù)所涉及的機(jī)制,可以設(shè)計(jì)出穩(wěn)定的合理策略。例如,如果發(fā)現(xiàn)聚集機(jī)制是通過(guò)硫醇-二硫化物交換形成分子間s-s鍵,則可以通過(guò)修飾巰基殘基、用酸性溶液凍干、控制含水量、使用合適的添加劑和開(kāi)發(fā)特定的聚合物基質(zhì)組合物來(lái)實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定化。aac可以以任何合適的形式配制以遞送至靶細(xì)胞/組織。例如,aac可以配制成脂質(zhì)體,由各種類型的脂質(zhì)、磷脂和/或表面活性劑組成的小囊泡,其可用于向哺乳動(dòng)物遞送藥物。脂質(zhì)體的組分通常排列成雙層形成,類似于生物膜的脂質(zhì)排列。含有抗體的脂質(zhì)體通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法制備,例如在epstein等人(1985)proc.natl.acad.sci.usa82:3688;hwang等人,(1980)proc.natlacad.sci.usa77:4030;us4485045;us4544545;wo97/38731;us5013556中描述的。特別有用的脂質(zhì)體可以通過(guò)含有磷脂酰膽堿、膽固醇和peg衍生的磷脂酰乙醇胺(peg-pe)的脂質(zhì)組合物的反相蒸發(fā)法產(chǎn)生。脂質(zhì)體通過(guò)限定孔徑的過(guò)濾器擠出以產(chǎn)生具有所需直徑的脂質(zhì)體。材料和方法細(xì)菌菌株:所有實(shí)驗(yàn)都是使用從narsa(http://www.narsa.net/control/member/repositories)獲得的mrsa-usa300nrs384進(jìn)行的,除非另有說(shuō)明。細(xì)胞外細(xì)菌的mic測(cè)定通過(guò)在胰酶解大豆酪蛋白肉湯培養(yǎng)基中連續(xù)2倍稀釋制備的抗生素來(lái)測(cè)定細(xì)胞外細(xì)菌的mic??股氐南♂屢涸?6孔培養(yǎng)皿中一式四份制成。從指數(shù)生長(zhǎng)培養(yǎng)物取mrsa(usa300的nrs384菌株)并稀釋至1×104cfu/ml。細(xì)菌在抗生素存在下培養(yǎng)18-24小時(shí)并在37℃下振蕩,通過(guò)讀取630nm的光密度(od)測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)。mic被確定為將細(xì)菌生長(zhǎng)抑制>90%的抗生素劑量。細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的mic測(cè)定對(duì)鼠腹膜巨噬細(xì)胞內(nèi)隱藏的細(xì)菌測(cè)定細(xì)胞內(nèi)mic(見(jiàn)下文,用于產(chǎn)生鼠腹膜巨噬細(xì)胞)。將巨噬細(xì)胞以4×105個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種在24孔培養(yǎng)皿中,并以每個(gè)巨噬細(xì)胞10-20個(gè)細(xì)菌的比例感染mrsa。將巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物保持在補(bǔ)充有50μg/ml慶大霉素(僅對(duì)細(xì)胞外細(xì)菌有活性的抗生素)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中,以抑制細(xì)胞外細(xì)菌的生長(zhǎng),并在感染后1天將測(cè)試的抗生素加入到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。在加入抗生素后24小時(shí)評(píng)估細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的存活。用補(bǔ)充有0.1%牛血清白蛋白和0.1%triton-x的hanks緩沖鹽水溶液裂解巨噬細(xì)胞,并在含有0.05%吐溫-20的磷酸緩沖鹽水溶液中進(jìn)行裂解物的連續(xù)稀釋。通過(guò)在含有5%去纖維蛋白的羊血的胰酶解大豆瓊脂平板上接種來(lái)確定存活的細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)。分離腹膜巨噬細(xì)胞:從6-8周齡balb/c小鼠(charlesriverlaboratories,hollister,ca)腹膜中分離腹膜巨噬細(xì)胞。為了增加巨噬細(xì)胞的產(chǎn)量,通過(guò)腹膜內(nèi)注射1ml巰基乙酸鹽培養(yǎng)基(bectondickinson)預(yù)處理小鼠。巰基乙酸鹽培養(yǎng)基以4%的濃度在水中制備,通過(guò)高壓滅菌消毒,并在使用前老化20天至6個(gè)月。通過(guò)用冷磷酸鹽緩沖鹽水洗滌腹腔,用巰基乙酸鹽處理4天后收獲腹膜巨噬細(xì)胞。將巨噬細(xì)胞以4x105細(xì)胞/孔的密度在24孔培養(yǎng)盤中接種在補(bǔ)充有10%胎牛血清和10mmhepes(不含抗生素)的dulbecco'smodifiedeagle培養(yǎng)基(dmem)上。將巨噬細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜以使其粘附到平板上。該試驗(yàn)也用于測(cè)試非吞噬細(xì)胞類型中的細(xì)胞內(nèi)殺傷。從atcc獲得mg63(crl-1427)和a549(ccl185)細(xì)胞系,并保持在補(bǔ)充有10mmhepes和10%胎牛血清(rpmi-10)的rpmi1640組織培養(yǎng)基中。huvec細(xì)胞獲自lonza并保持在egm內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基(lonza,walkersville,md)中。用調(diào)理的mrsa感染巨噬細(xì)胞:mrsa的usa300株(nrs384)獲自narsa儲(chǔ)存庫(kù)(chantilly,virginia)。一些實(shí)驗(yàn)使用了金黃色葡萄球菌的newman菌株(atcc25904)。在所有實(shí)驗(yàn)中,將細(xì)菌在胰酶解大豆酪蛋白肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)。為了評(píng)估aac的細(xì)胞內(nèi)殺傷,從指數(shù)生長(zhǎng)的培養(yǎng)物中取出usa300,并在hb(hanks平衡鹽溶液,補(bǔ)充有10mmhepes和0.1%牛血清白蛋白)中洗滌。將aac或抗體在hb中稀釋,并與細(xì)菌一起孵育1小時(shí)以允許抗體與細(xì)菌結(jié)合(調(diào)理),并將該調(diào)理的細(xì)菌用于以每個(gè)巨噬細(xì)胞10-20個(gè)細(xì)菌的比例感染巨噬細(xì)胞(每孔250μl的hb中4x106細(xì)菌)。巨噬細(xì)胞在感染前立即用無(wú)血清dmem培養(yǎng)基進(jìn)行預(yù)洗,并在37℃下在加濕組織培養(yǎng)培養(yǎng)箱中用5%co2孵育進(jìn)行感染以允許細(xì)菌吞噬。2小時(shí)后,移除感染混合物并用正常生長(zhǎng)培養(yǎng)基(補(bǔ)充有10%胎牛血清、10mmhepes的dmem)代替,并加入50μg/ml的慶大霉素以阻止細(xì)胞外細(xì)菌生長(zhǎng)。在孵育期結(jié)束時(shí),用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌巨噬細(xì)胞,并將細(xì)胞在補(bǔ)充有0.1%triton-x的hb中裂解(裂解巨噬細(xì)胞而不損傷細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌)。在一些實(shí)驗(yàn)中,通過(guò)使用ldh細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(產(chǎn)品11644793001,rochediagnosticscorp,indianapolis,in)檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)乳酸脫氫酶(ldh)在培養(yǎng)基上清液中的釋放,從而在培養(yǎng)期結(jié)束時(shí)評(píng)估巨噬細(xì)胞的活力。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū),立即收集和分析上清液。裂解物的系列稀釋液在補(bǔ)充有0.05%tween-20的磷酸鹽緩沖鹽水溶液(以破壞細(xì)菌聚集體)中制備,通過(guò)在具有5%去纖維化羊血的胰蛋白酶大豆瓊脂上接種以測(cè)定存活的細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌總數(shù)。mrsa感染腹膜細(xì)胞的產(chǎn)生。通過(guò)腹膜內(nèi)注射,用1×108cfu的usa300的nrs384菌株感染6-8周齡的雌性a/j小鼠(jaxtm小鼠,jacksonlaboratories)。在感染后1天收獲腹膜洗滌液,并在37℃下用補(bǔ)充了0.1%bsa(hb緩沖液)的hepes緩沖液中稀釋的50μg/ml溶葡萄球菌酶處理感染的腹膜細(xì)胞30分鐘。然后將腹膜細(xì)胞在冰冷的hb緩沖液中洗滌2次。在補(bǔ)充有10mmhepes和10%胎牛血清和5μg/ml萬(wàn)古霉素的rpmi1640組織培養(yǎng)基中將腹膜細(xì)胞稀釋至1×106細(xì)胞/ml。在磷酸鹽緩沖鹽水溶液中,在4℃下將來(lái)自原發(fā)感染的游離mrsa保存過(guò)夜,作為不經(jīng)歷嗜中性粒細(xì)胞殺傷的細(xì)胞外細(xì)菌的對(duì)照。將感染從腹膜細(xì)胞轉(zhuǎn)移到成骨細(xì)胞:mg63成骨細(xì)胞系獲自atcc(crl-1427),并保持在補(bǔ)充有10mmhepes和10%胎牛血清(rpmi-10)的rpmi1640組織培養(yǎng)基中。將成骨細(xì)胞接種在24孔組織培養(yǎng)板中并培養(yǎng)以獲得匯合層。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天,將成骨細(xì)胞在rpmi(無(wú)補(bǔ)充物)中洗滌一次。在完全rpmi-10中稀釋mrsa或感染的腹膜細(xì)胞,并在感染前立即以5μg/ml加入萬(wàn)古霉素。將腹膜細(xì)胞以1×106個(gè)腹膜細(xì)胞/ml加入到成骨細(xì)胞中。用0.1%triton-x裂解細(xì)胞樣品以測(cè)定感染時(shí)活的細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的實(shí)際濃度。所有感染的實(shí)際滴度是通過(guò)用5%去纖維蛋白的羊血的胰蛋白酶大豆瓊脂上的細(xì)菌連續(xù)稀釋液來(lái)測(cè)定。將mg63成骨細(xì)胞接種在4孔玻璃室載玻片中并在補(bǔ)充有10mmhepes和10%胎牛血清(rpmi-10)的rpmi1640組織培養(yǎng)基中培養(yǎng),直到形成匯合層。在感染當(dāng)天,用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌各孔,用感染腹膜細(xì)胞的懸浮液感染,或用補(bǔ)充有5μg/ml萬(wàn)古霉素的完全rpmi-10中稀釋的mrsa的usa300菌株進(jìn)行感染。感染后一天,用磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)洗滌細(xì)胞,并在室溫下用含有2%多聚甲醛的pbs固定30分鐘。將各孔在pbs中洗滌3次,并在室溫下用含有0.1%皂角蛋白的pbs透化30分鐘。感染模型的體內(nèi)轉(zhuǎn)移:制備usa300儲(chǔ)備液用于在胰酶解大豆酪蛋白肉湯培養(yǎng)基中積極生長(zhǎng)培養(yǎng)物的感染。將細(xì)菌在磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中洗滌3次,并將等分試樣在-80℃下在pbs25%甘油中冷凍。細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌感染:選擇a/j小鼠用于這些實(shí)驗(yàn),因?yàn)樗鼈內(nèi)菀妆幌鄬?duì)低劑量的mrsa(2x106cfu/小鼠)感染。從jacksonlab獲得7周齡的雌性a/j小鼠,并用5×107cfu的usa300腹膜內(nèi)注射感染。在感染后1天處死小鼠,用5ml冷pbs沖洗腹膜。在臺(tái)式離心機(jī)中,將腹膜洗滌液在4℃下以1,000rpm離心5分鐘。收集含有腹膜細(xì)胞的細(xì)胞沉淀,并將細(xì)胞用50μg/ml溶葡萄球菌酶(cellsciencesinc.macma,crl309c)在37℃下處理20分鐘以殺死污染的細(xì)胞外細(xì)菌。將腹膜細(xì)胞在冰冷的pbs中洗滌3次以除去溶葡萄球菌酶。匯集來(lái)自供體小鼠的腹膜細(xì)胞,并通過(guò)靜脈注射向受體小鼠的尾靜脈注射來(lái)自每個(gè)受體的5個(gè)供體的細(xì)胞。為了測(cè)定活細(xì)胞內(nèi)cfu的數(shù)量,將腹膜細(xì)胞樣品在含有0.1%triton-x的hb(hanks平衡鹽溶液中補(bǔ)充有10mmhepes和0.1%牛血清白蛋白)中裂解,并在含有0.05%吐溫-20的pbs中制備裂解液的連續(xù)稀釋液。無(wú)細(xì)菌感染:使用用于腹膜注射的甘油儲(chǔ)備液的新鮮等分試樣,將a/j小鼠感染各種劑量的游離細(xì)菌。實(shí)際感染劑量通過(guò)cfu接種確認(rèn)。對(duì)于圖1a所示的數(shù)據(jù),細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的實(shí)際感染劑量為1.8×106cfu/小鼠,無(wú)細(xì)菌的實(shí)際感染劑量為2.9×106cfu/小鼠。選擇的小鼠感染后立即靜脈注射的單劑量100mg/kg萬(wàn)古霉素治療。感染的體外轉(zhuǎn)移到非吞噬細(xì)胞。mrsa感染腹膜細(xì)胞的產(chǎn)生:通過(guò)腹腔注射用1×108cfu的usa300的nrs384菌株感染6-10周齡的雌性a/j小鼠(jacksonlab)。在感染后1天收獲腹膜洗滌液,在37℃下,用補(bǔ)充了0.1%bsa(hb緩沖液)的hepes緩沖液中稀釋的50μg/ml溶葡萄球菌酶處理感染的腹膜細(xì)胞30分鐘。然后將腹膜細(xì)胞在冰冷的hb緩沖液中洗滌2次。在補(bǔ)充有10mmhepes和10%胎牛血清和5μg/ml萬(wàn)古霉素的rpmi1640組織培養(yǎng)基中將腹膜細(xì)胞稀釋至1×106細(xì)胞/ml。將原代感染的游離mrsa在4℃下在磷酸緩沖鹽水溶液中保存過(guò)夜,作為不經(jīng)歷嗜中性粒細(xì)胞殺傷的細(xì)胞外細(xì)菌的對(duì)照。成骨細(xì)胞或hbmec感染。mg63細(xì)胞系獲自atcc(crl-1427),并保持在補(bǔ)充有10mmhepes和10%胎牛血清(rpmi-10)的rpmi1640組織培養(yǎng)基中。從scienccellresearchlabs(carlsbad,ca)獲得hbmec細(xì)胞(目錄號(hào)1000)和ecm培養(yǎng)基(目錄#1001)。將細(xì)胞接種在24孔組織培養(yǎng)板中并培養(yǎng)以獲得匯合層。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天,將細(xì)胞在rpmi(無(wú)補(bǔ)充物)中洗滌一次。將mrsa或感染的腹膜細(xì)胞在完全rpmi-10中稀釋,并在感染前立即以5ug/ml加入萬(wàn)古霉素。將腹膜細(xì)胞以1×106個(gè)腹膜細(xì)胞/ml加入到成骨細(xì)胞中。用0.1%triton-x裂解細(xì)胞樣品以測(cè)定感染時(shí)活細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的實(shí)際濃度。所有感染的實(shí)際滴度通過(guò)在含5%去纖維蛋白的羊血的胰蛋白酶大豆瓊脂上的細(xì)菌連續(xù)稀釋液來(lái)測(cè)定??菇瘘S色葡萄球菌抗體的產(chǎn)生。使用單克隆抗體發(fā)現(xiàn)技術(shù),從金黃色葡萄球菌感染患者的外周b細(xì)胞克隆抗β-glcnacwtamab的人igg抗體,其保護(hù)抗體重鏈和輕鏈的同源配對(duì)38。通過(guò)轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)單個(gè)抗體克隆(meijer,p.j.,nielsen,l.s.,lantto,j.&jensen,a.(2009)humanantibodyrepertoires.methodsmolbiol525,261-277,xiv;meijer,p.j.等人(2006)“isolationofhumanantibodyrepertoireswithpreservationofthenaturalheavyandlightchainpairing.”journalofmolecularbiology358,764-772)。7天后收獲含有全長(zhǎng)igg1抗體的上清液,用于篩選elisa的抗原結(jié)合。這些抗體對(duì)于結(jié)合來(lái)自u(píng)sa300的細(xì)胞壁制備物是陽(yáng)性的。隨后在200-ml瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中產(chǎn)生抗體,并用蛋白a色譜(mabselectsure,gelifesciences,piscataway,nj)純化用于進(jìn)一步測(cè)試。這些抗體的分離和使用被區(qū)域倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)。接頭藥物與抗體的綴合。抗-wta抗體(ab)的thiomab變體的構(gòu)建和制備如下進(jìn)行。在抗-wtaab輕鏈的val205位置處將半胱氨酸殘基工程化,以產(chǎn)生其thiomabtm半胱氨酸工程化的抗體變體。該硫代抗wta與表2中的pml接頭-抗生素中間體綴合。在五十倍摩爾過(guò)量的dtt存在下將抗體還原過(guò)夜。使用hitrapsp-hp柱(gehealthcare)將還原劑和半胱氨酸和谷胱甘肽嵌段純化。在十五倍摩爾過(guò)量脫氫抗壞血酸(mpbiomedical)存在下將抗體再氧化2.5小時(shí)。通過(guò)lc/ms監(jiān)測(cè)鏈間二硫鍵的形成。將超過(guò)蛋白質(zhì)的3倍摩爾過(guò)量的pml接頭抗生素中間體與thiomab孵育1小時(shí)。通過(guò)0.2umsfca過(guò)濾器(millipore)過(guò)濾純化抗體藥物綴合物。通過(guò)過(guò)濾除去過(guò)量的游離接頭藥物。通過(guò)透析將綴合物緩沖液交換成20mm的組氨酸乙酸鹽ph5.5/240mm蔗糖。通過(guò)lc/ms分析將每mab的綴合的利福霉素型抗生素的數(shù)量定量為抗生素/抗體比(aar)。還通過(guò)尺寸排阻色譜法評(píng)估純度。質(zhì)譜分析在6530精確質(zhì)量四極桿飛行時(shí)間(q-tof)lc/ms(agilenttechnologies)上進(jìn)行l(wèi)c/ms分析。將樣品在加熱至80℃的prlp-s柱,8μm(50mm×2.1mm,agilenttechnologies)上進(jìn)行色譜分離。使用4.3分鐘內(nèi)30-60%b的線性梯度(溶劑a,水中0.05%tfa;溶劑b,乙腈中的0.04%tfa),使用電噴霧源直接進(jìn)行洗脫液離子化。使用agilentmasshunter定性分析軟件收集數(shù)據(jù)并進(jìn)行解卷積。在lc/ms分析之前,將抗體藥物綴合物用賴氨酰內(nèi)肽酶(wako)以1:100w/w的酶與抗體比例,在ph8.0和37℃處理30分鐘,產(chǎn)生fab和fc部分以便于分析。使用masshunter軟件計(jì)算的fab和fab+1的豐度計(jì)算抗生素對(duì)抗體比例(aar)(本文中與藥物與抗體比率(dar)可互換使用)。從感染小鼠分離的細(xì)菌分析:通過(guò)靜脈內(nèi)注射1×107cfumrsa(usa300)感染balb/c小鼠,感染后第3天收獲腎。使用m-tubes和程序rna01.01(miltenyibiotec,auburn,ca),使用每2個(gè)腎5ml體積的gentlemacs解離器將腎均質(zhì)化。均質(zhì)化緩沖液是:pbs+0.1%triton-x100、10ug/mldna酶(牛胰腺ii級(jí),roche)和蛋白酶抑制劑(完整的蛋白酶抑制劑雞尾酒,roche11-836-153001)。均質(zhì)化后,將樣品在室溫下孵育10分鐘,然后用冰冷的pbs稀釋,并通過(guò)40um細(xì)胞過(guò)濾器過(guò)濾。將組織勻漿在冰冷的pbs中洗滌2次,然后在hb緩沖液(hanks平衡鹽溶液,補(bǔ)充有10mmhepes和0.1%牛血清白蛋白)中懸浮于每2個(gè)腎0.5ml的體積中。再次過(guò)濾細(xì)胞懸浮液,每次染色反應(yīng)取25μl細(xì)菌懸浮液。用流式細(xì)胞術(shù)比較抗mrsa抗體的表達(dá):將流式細(xì)胞術(shù)的抗體染色細(xì)菌(1x107體外生長(zhǎng)細(xì)菌或25ul上述組織勻漿)懸浮在hb(上述)中,通過(guò)用400μg/ml(微克/毫升)小鼠igg(sigma,i5381)孵育1小時(shí)進(jìn)行阻斷。將熒光標(biāo)記的抗體直接加入到阻斷反應(yīng)中,并在室溫下再孵育10-20分鐘。將細(xì)菌在hb緩沖液中洗滌3次,然后在facs分析前將其固定在pbs2%多聚甲醛中。使用胺反應(yīng)試劑(invitrogen,alexafluor488的琥珀酰亞胺酯,nhs-a488)將測(cè)試抗體(抗βwta:4497、抗αwta:7578或同種型對(duì)照:gd)與alexa-488綴合。將50mm磷酸鈉中的抗體與5-10倍摩爾過(guò)量的nhs-a488在室溫下在黑暗中反應(yīng)2-3小時(shí)。將標(biāo)記混合物施加到在pbs中平衡的gesepharoses200柱上以從綴合抗體中除去過(guò)量的反應(yīng)物。使用制造商所述的uv法測(cè)定a488分子/抗體的數(shù)量。為了分析組織勻漿中的細(xì)菌,使用非競(jìng)爭(zhēng)性抗金黃色葡萄球菌抗體(rf1-hazenbos,w.l.等人(2013))新型葡萄球菌糖基轉(zhuǎn)移酶sdga和sdgb介導(dǎo)了毒力相關(guān)細(xì)胞壁蛋白的免疫原性和保護(hù)作用。plospathog9、e1003653與alexa-647綴合以將金黃色葡萄球菌從相似大小的顆粒中區(qū)分。在80ng/ml至50μg/ml的劑量范圍內(nèi)檢查測(cè)試抗體。使用becktondicksonfacsaria(bdbiosciences,sanjoseca)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù),并使用flowjo分析軟件(flowjollc,ashlandor)進(jìn)行分析。在非復(fù)制細(xì)菌上殺死游離抗生素的時(shí)間:將金黃色葡萄球菌(usa300)從過(guò)夜靜止期培養(yǎng)物中取出,在磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中洗滌一次,并以1×107cfu/ml懸浮于無(wú)抗生素或以1×10-6m抗生素在10ml體積的50ml聚丙烯離心管中的pbs中。將細(xì)菌在37℃下振蕩過(guò)夜。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn),從每個(gè)培養(yǎng)物中取出三個(gè)1ml樣品,并離心收集細(xì)菌。將細(xì)菌用pbs洗滌一次以除去抗生素,并通過(guò)在瓊脂板上接種細(xì)菌的連續(xù)稀釋液來(lái)測(cè)定存活細(xì)菌的總數(shù)。通過(guò)游離抗生素殺死休眠細(xì)胞:將金黃色葡萄球菌(usa300)從過(guò)夜靜止期培養(yǎng)物中取出,在胰酶解大豆酪蛋白肉湯培養(yǎng)基(tsb)中洗滌一次,然后調(diào)節(jié)至在10ml總體積的tsb或含有環(huán)丙沙星(0.05mm)的tsb中1×107cfu/ml的終濃度。將培養(yǎng)物在37℃振蕩培養(yǎng)6小時(shí),然后加入第二種抗生素,利福平(1μg/ml)或另一種利福霉素型抗生素(1μg/ml)。在指定時(shí)間,從每個(gè)培養(yǎng)物中取出樣品,用pbs洗滌一次以除去抗生素并重新懸浮在pbs中。通過(guò)在瓊脂板上接種細(xì)菌的連續(xù)稀釋液來(lái)測(cè)定存活細(xì)菌的總數(shù)。在最后時(shí)間點(diǎn),收集每個(gè)培養(yǎng)物的剩余部分并接種。aac的組織蛋白酶釋放試驗(yàn):為了量化用組織蛋白酶b處理后從aac釋放的活性抗生素的量,將aac在組織蛋白酶緩沖液(20mm乙酸鈉,1mmedta,5mml-半胱氨酸ph5)中稀釋至200ug/ml。以10ug/ml加入組織蛋白酶b(來(lái)自牛脾,sigmac7800),將樣品在37℃下孵育1小時(shí)。作為對(duì)照,將aac在緩沖液中單獨(dú)孵育。通過(guò)加入9體積的細(xì)菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基胰酶解大豆酪蛋白肉湯培養(yǎng)基ph7.4(tsb)來(lái)終止反應(yīng)。為了評(píng)估活性抗生素的總釋放量,將反應(yīng)混合物的系列稀釋液在tsb中在96孔板中一式四份制成,并以2×103cfu/ml的最終密度向每個(gè)孔中加入mrsa(usa300)。將培養(yǎng)物在37℃下振蕩孵育過(guò)夜,并使用平板讀數(shù)器通過(guò)讀取630nm的吸光度來(lái)檢測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)。合成s4497抗體fret綴合物用于吞噬溶酶體處理。合成了馬來(lái)酰亞胺fret肽,并與s4497半胱氨酸工程化的thiomabtm抗體綴合。fret對(duì)使用四甲基羅丹明(tamra)和熒光素(fischer,r.等人(2010)bioconjugchem21,64-73)。通過(guò)使用ps3肽合成儀(proteintechnologies,inc)的標(biāo)準(zhǔn)fmoc固相化學(xué)合成馬來(lái)酰亞胺fret肽。簡(jiǎn)言之,使用0.1mmolrink酰胺樹(shù)脂產(chǎn)生c末端甲酰胺。使用n-和c-末端殘基處的fmoc-lys(mtt)-oh以除去樹(shù)脂上的mtt(單甲氧基三苯甲基)基團(tuán),并進(jìn)行附加的側(cè)鏈化學(xué)以連接tamra和熒光素。作為組織蛋白酶切割間隔物,在fret對(duì)之間添加cbdk-cit肽模擬單元。從樹(shù)脂上切下的粗的馬來(lái)酰亞胺fret肽或馬來(lái)酰亞氨基己?;?k(tamra)-g-cbdk-cit-k(熒光素)通過(guò)反相hplc進(jìn)一步純化,使用jupiter5μmc4柱(5μm,10mmx250mm,phenomenex)。我們的fret探針不僅可以監(jiān)測(cè)抗體綴合物的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸,還可以監(jiān)測(cè)吞噬溶酶體中接頭的處理。由于來(lái)自供體的熒光共振能量轉(zhuǎn)移,完整抗體綴合物僅發(fā)紅色熒光。然而,在吞噬溶酶體中的fret肽的底物切割后,預(yù)期出現(xiàn)來(lái)自供體的綠色熒光。視頻顯微鏡檢測(cè)巨噬細(xì)胞內(nèi)接頭的裂解將小鼠腹膜巨噬細(xì)胞接種在室載玻片(ibidi,verona,wi,目錄80826)上,在如巨噬細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)殺傷試驗(yàn)所述的完整培養(yǎng)基中。通過(guò)在100μg/mlpbs.1%bsa中在37℃下孵育30分鐘,將usa300用celltrackerviolet(invitrogenc10094)標(biāo)記。通過(guò)在hb緩沖液中孵育1小時(shí),用4497-fret探針調(diào)理標(biāo)記的細(xì)菌。立即將巨噬細(xì)胞洗滌一次,然后加入調(diào)理細(xì)菌,且將細(xì)菌以1×107細(xì)菌/ml加入細(xì)胞。對(duì)于無(wú)吞噬作用的對(duì)照,巨噬細(xì)胞在吞噬前和吞噬期間用60nmlatrunculina(calbiochem)預(yù)處理30分鐘。在將細(xì)菌加入細(xì)胞后立即將載玻片放置在顯微鏡上,并用配備有co2環(huán)境室和來(lái)自ludin的溫度控制器的leicasp5共聚焦顯微鏡獲得視頻。使用planapocs40x,n..a:1.25,油浸透鏡和488nm和543nm激光線,分別激發(fā)alexa488和tamra,每分鐘捕獲圖像總共30分鐘。還使用543nm激光線記錄相位圖像。通過(guò)質(zhì)譜法測(cè)定巨噬細(xì)胞內(nèi)釋放的抗生素。將小鼠腹膜巨噬細(xì)胞在24孔組織培養(yǎng)皿中感染,如下所述,用在hb中100μg/ml的aac調(diào)理的mrsa進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)殺傷試驗(yàn)。吞噬完成后,洗滌細(xì)胞,向各孔中加入250μl完全培養(yǎng)基+慶大霉素,將細(xì)胞孵育1小時(shí)或3小時(shí)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集上清液和細(xì)胞組分,并加入乙腈(acn)至最終濃度為75%,孵育30分鐘。細(xì)胞和上清液提取物通過(guò)在n2(turbovap)下蒸發(fā)并冷凍干燥,并在100μl的50%acn中重構(gòu),過(guò)濾和在absciexqtrap6500lc/ms/ms系統(tǒng)上進(jìn)行分析。體外的細(xì)胞內(nèi)殺傷試驗(yàn)。非吞噬細(xì)胞類型:從atcc獲得mg63(crl-1427)和a549(ccl185)細(xì)胞系,并保持在補(bǔ)充有10mmhepes和10%胎牛血清(rpmi-10)的rpmi1640組織培養(yǎng)基中。huvec細(xì)胞獲自lonza并保持在egm內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基(lonza,walkersville,md)中。從scienccellresearchlabs(carlsbad,ca)獲得hbmec細(xì)胞(目錄號(hào)1000)和ecm培養(yǎng)基(目錄#1001)。鼠巨噬細(xì)胞:從6-8周齡balb/c小鼠(charlesriverlaboratories,hollister,ca)腹膜中分離腹膜巨噬細(xì)胞。為了增加巨噬細(xì)胞的產(chǎn)量,通過(guò)腹膜內(nèi)注射1ml巰基乙酸鹽培養(yǎng)基(bectondickinson)預(yù)處理小鼠。巰基乙酸鹽培養(yǎng)基以4%的濃度在水中制備,通過(guò)高壓滅菌消毒,并在使用前老化20天至6個(gè)月。通過(guò)用冷磷酸鹽緩沖鹽水洗滌腹膜,用巰基乙酸鹽處理4天后收獲腹膜巨噬細(xì)胞。將巨噬細(xì)胞接種在補(bǔ)充有10%胎牛血清和10mmhepes的不含抗生素的dulbecco改良的eagle培養(yǎng)基(dmem)中,在24孔培養(yǎng)盤中以4x105細(xì)胞/孔的密度接種。將巨噬細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜使其粘附到平板上。人m2巨噬細(xì)胞:使用單核細(xì)胞分離試劑盒ii(miltenyi,cat130-091-153)從正常人血液中純化cd14+單核細(xì)胞,并以1.5×105細(xì)胞/cm2在預(yù)先涂覆有胎牛血清(fcs)的組織培養(yǎng)皿上接種,并在含有20%fcs+100ng/mlrhm-csf的rpmi1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在第1天和第7天更新培養(yǎng)基,將培養(yǎng)基更換為5%血清+20ng/mlil-4。18小時(shí)后使用巨噬細(xì)胞。試驗(yàn)方案:在所有實(shí)驗(yàn)中,細(xì)菌在胰酶解大豆酪蛋白肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)。為了評(píng)估抗體抗生素綴合物(aac)的細(xì)胞內(nèi)殺傷,將usa300從指數(shù)生長(zhǎng)培養(yǎng)物中取出,并在hb(hanks平衡鹽溶液,補(bǔ)充有10mmhepes和0.1%牛血清白蛋白)中洗滌。將aac或抗體在hb中稀釋并與細(xì)菌一起孵育1小時(shí)以允許抗體與細(xì)菌結(jié)合(調(diào)理),并且調(diào)理細(xì)菌用于以每個(gè)巨噬細(xì)胞10-20個(gè)細(xì)菌的比例(每孔250ulhb中4×106細(xì)菌)感染巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞在感染前立即用無(wú)血清dmem培養(yǎng)基進(jìn)行預(yù)清洗,并在37℃下,在含有5%co2的加濕組織培養(yǎng)箱中孵育,以允許細(xì)菌吞噬。2小時(shí)后,除去感染混合物并用正常生長(zhǎng)培養(yǎng)基(補(bǔ)充有10%胎牛血清、10mmhepes)代替,并將慶大霉素以50ug/ml加入以防止細(xì)胞外細(xì)菌生長(zhǎng)。在孵育期結(jié)束時(shí),用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌巨噬細(xì)胞,并將細(xì)胞在補(bǔ)充有0.1%triton-x的hb中裂解(裂解巨噬細(xì)胞而不損傷細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌)。在補(bǔ)充有0.05%tween-20(破壞細(xì)菌聚集體)的磷酸鹽緩沖鹽水溶液中制備裂解物的系列稀釋液,通過(guò)在含有5%去纖維蛋白的綿羊血的胰蛋白酶大豆瓊脂接種來(lái)測(cè)定存活的細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌總數(shù)。實(shí)施例實(shí)施例1細(xì)胞內(nèi)mrsa受到對(duì)抗常規(guī)抗生素的保護(hù)為了證實(shí)哺乳動(dòng)物細(xì)胞在抗生素治療存在下為金黃色葡萄球菌提供保護(hù)性小環(huán)境的假說(shuō),將目前用作侵入性mrsa感染的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)(soc)的三種主要抗生素(萬(wàn)古霉素、達(dá)托霉素和利奈唑胺)對(duì)細(xì)胞外浮游細(xì)菌與小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)隔離細(xì)菌的效力進(jìn)行比較(表4)。對(duì)于細(xì)胞外細(xì)菌,將mrsa在胰酶解大豆酪蛋白肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜,并確定mic是防止生長(zhǎng)的最小抗生素劑量。對(duì)于細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌,小鼠腹膜巨噬細(xì)胞用mrsa感染并在慶大霉素存在下培養(yǎng),以殺死細(xì)胞外細(xì)菌。感染后一天將測(cè)試抗生素加入到培養(yǎng)基中,24小時(shí)后測(cè)定存活的細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌總數(shù)。臨床相關(guān)抗生素的預(yù)期血清濃度在抗菌藥物(antimicrobialagents),andrebryskier.asmpress,washingtondc(2005)中被報(bào)道。表4:幾種抗生素對(duì)在液體培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的細(xì)胞外細(xì)菌與小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)隔離的細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的最小抑菌濃度(mic)。具有高毒力的社區(qū)獲得性mrsa菌株usa300的分析顯示,雖然細(xì)胞外mrsa對(duì)液體培養(yǎng)中低濃度的萬(wàn)古霉素、達(dá)托霉素和利奈唑胺的生長(zhǎng)抑制高度敏感,但所有三種抗生素都不能殺死暴露于臨床可達(dá)到的抗生素濃度的在巨噬細(xì)胞內(nèi)部隔離的mrsa相同菌株。即使是利福平,被認(rèn)為相對(duì)有效地消除細(xì)胞內(nèi)病原體(vandenbroek,p.v.(1989)抗菌藥物、微生物、吞噬細(xì)胞。傳染病綜述(antimicrobialdrugs,microorganisms,phagocytes.reviewsofinfectiousdiseases)11,213-245),與抑制浮游細(xì)菌生長(zhǎng)(mic)所需的劑量比較,仍需要6,000倍更高的劑量來(lái)消除細(xì)胞內(nèi)mrsa(表1),這與其他研究一致,表明大多數(shù)現(xiàn)有抗生素在體外和體內(nèi)殺死細(xì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌都是無(wú)效的(sandberg,a.,hessler,j.h.,skov,r.l.,blom,j.&frimodt-moller,n.(2009)“鼠腹膜炎模型中抗生素對(duì)金黃色葡萄球菌的細(xì)胞內(nèi)活性(intracellularactivityofantibioticsagainststaphylococcusaureusinamouseperitonitismodel)”antimicrobagentschemother53,1874-1883)。實(shí)施例2細(xì)胞內(nèi)mrsa感染的傳播這些實(shí)驗(yàn)比較了細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌與等量的游離浮游細(xì)菌的毒性,并確定細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌是否能夠在體內(nèi)在萬(wàn)古霉素存在下建立感染。通過(guò)靜脈內(nèi)注射大致相當(dāng)劑量的金黃色葡萄球菌游離細(xì)菌(2.9×106)感染四組小鼠,其細(xì)菌直接從肉湯培養(yǎng)物,或在由供體小鼠腹膜感染產(chǎn)生的宿主巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞內(nèi)隔離的細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌(1.8×106)中取出(圖1a),并且選擇的組在感染后立即用萬(wàn)古霉素處理,然后每天一次。在感染后4天檢查小鼠,細(xì)菌定殖在腎臟中,其是在小鼠中一致地被金黃色葡萄球菌定殖的器官23。在三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中,觀察到感染細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的小鼠腎臟中與那些感染了相同量的浮游細(xì)菌相比的相同或更高的細(xì)菌負(fù)荷(圖1b)。令人驚訝的是,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的感染導(dǎo)致腦的更一致的定殖,這是在該模型中感染浮游細(xì)菌后沒(méi)有有效定殖的器官(圖1c)。此外,在該模型中,細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌而不是浮游細(xì)菌能夠在萬(wàn)古霉素治療的情況下建立感染(圖1b、圖1c)體外的進(jìn)一步分析更定量地解決了細(xì)胞內(nèi)存活促進(jìn)抗生素逃避的程度。為此,在萬(wàn)古霉素存在下,mg63成骨細(xì)胞被浮游mrsa或細(xì)胞內(nèi)mrsa感染。成骨細(xì)胞或hbmec感染。從atcc獲得mg63細(xì)胞系(crl-1427),并保持在補(bǔ)充有10mmhepes和10%胎牛血清的rpmi1640組織培養(yǎng)基(rpmi-10)中。從scienccellresearchlabs(carlsbad,ca)獲得hbmec細(xì)胞(目錄號(hào)#1000)和ecm培養(yǎng)基(目錄號(hào)#1001)。將細(xì)胞接種在24孔組織培養(yǎng)板中并培養(yǎng)以獲得匯合層。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天,細(xì)胞在rpmi(無(wú)補(bǔ)充物)中洗滌一次。將mrsa或感染的腹膜細(xì)胞在完全rpmi-10中稀釋,并在感染前立即加入5ug/ml萬(wàn)古霉素。將腹膜細(xì)胞以1×106個(gè)腹膜細(xì)胞/ml加入到成骨細(xì)胞中。用0.1%triton-x裂解細(xì)胞樣品以確定感染時(shí)活的細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的實(shí)際濃度。所有感染的實(shí)際滴度通過(guò)在含5%去纖維蛋白的羊血的胰酶解大豆瓊脂上連續(xù)稀釋的細(xì)菌接種來(lái)測(cè)定。將mrsa(游離細(xì)菌)接種在培養(yǎng)基、培養(yǎng)基+萬(wàn)古霉素或培養(yǎng)基+萬(wàn)古霉素并接種在單層mg63成骨細(xì)胞(圖1e)或人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(hbmec,圖1f)上。將板離心以促進(jìn)細(xì)菌與單層接觸。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn),收集培養(yǎng)物上清液以回收細(xì)胞外細(xì)菌或裂解粘附細(xì)胞以釋放細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌。暴露于僅有的萬(wàn)古霉素的浮游細(xì)菌被有效地殺死。在培養(yǎng)一天后,存活細(xì)菌未恢復(fù)(圖1d)。當(dāng)將類似數(shù)量的浮游細(xì)菌接種在mg63成骨細(xì)胞上時(shí),回收了通過(guò)入侵成骨細(xì)胞而抵抗萬(wàn)古霉素的感染后一天與mg63細(xì)胞相關(guān)的少量存活細(xì)菌(約0.06%的輸入)。隔離在腹膜細(xì)胞內(nèi)的mrsa在萬(wàn)古霉素存在下顯示出存活率和感染效率的顯著增加。在萬(wàn)古霉素殺死浮游細(xì)菌培養(yǎng)物的相同條件下,白細(xì)胞中約15%的細(xì)胞內(nèi)mrsa存活。在萬(wàn)古霉素存在下,細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌也能更好地感染mg63成骨細(xì)胞的單層,導(dǎo)致在暴露于萬(wàn)古霉素后一天回收的細(xì)菌增加一倍(圖1d)。此外,在mg63細(xì)胞(圖1e)、原代人腦內(nèi)皮細(xì)胞(圖1f)和a549支氣管上皮細(xì)胞(未顯示)中,在持續(xù)暴露于殺死游離活細(xì)菌的萬(wàn)古霉素濃度下,細(xì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌在24小時(shí)內(nèi)能夠增加近10倍。雖然保護(hù)免受抗生素殺傷,但在感染的腹膜巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的培養(yǎng)物中未發(fā)生細(xì)菌生長(zhǎng)(未顯示)。這些數(shù)據(jù)一起支持髓系細(xì)胞中mrsa的細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)庫(kù)可以促進(jìn)感染傳播到新的位點(diǎn),甚至在活性抗生素治療存在的情況下,并且甚至在持續(xù)的抗生素治療的條件下,細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)可以在內(nèi)皮和上皮細(xì)胞中發(fā)生。為了開(kāi)發(fā)特異性殺死細(xì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌的試劑,對(duì)抗體和抗生素組分進(jìn)行謹(jǐn)慎的選擇并優(yōu)化以達(dá)到最大效力。以下實(shí)施例顯示了實(shí)驗(yàn)和結(jié)果,其導(dǎo)致用于綴合形成aac的抗壁磷壁酸β(抗-wtaβ)抗體和某些利福霉素型抗生素的選擇。實(shí)施例3抗-金黃色葡萄球菌單克隆抗體的選擇由aac遞送的抗生素的量及其最終功效受到細(xì)菌表面上的抗體結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量的限制。因此,在體內(nèi)感染的所有期間,選擇與在mrsa上穩(wěn)定表達(dá)的高度豐富的抗原結(jié)合的抗體是重要的。作為初始步驟,從各種金黃色葡萄球菌感染恢復(fù)的患者的外周血b細(xì)胞中克隆并純化了一組超過(guò)40個(gè)抗金黃葡萄球菌抗體,并篩選了與從感染小鼠的腎臟直接分離的與mrsa結(jié)合的抗體。抗體產(chǎn)生、篩選和選擇縮寫(xiě):mrsa(甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌);mssa(甲氧西林敏感性金黃色葡萄球菌);visa(萬(wàn)古霉素中等抗性金黃色葡萄球菌);lta(脂磷壁酸);tsb(胰酶解大豆酪蛋白肉湯培養(yǎng)基);cwp(細(xì)胞壁制備物)。使用symplextm技術(shù)(symphogen,lyngby,丹麥)從金黃色葡萄球菌感染患者的外周b細(xì)胞克隆人igg抗體,所述技術(shù)保護(hù)抗體重鏈和輕鏈的同源配對(duì),如us8,283,294:“methodforcloningcognateantibodies”;meijerpj等人journalofmolecularbiology358:764-772(2006);和lanttoj等人jvirol.85(4):1820-33(feb2011)所述;血漿和記憶細(xì)胞被用作重組全長(zhǎng)igg庫(kù)的基因來(lái)源。通過(guò)轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)單個(gè)抗體克隆,如meijerpj等人methodsinmolecularbiology525:261-277,xiv.(2009)中所述。7天后收集含有全長(zhǎng)igg1抗體的上清液,并用于在初篩中篩選通過(guò)間接elisa的抗原結(jié)合。產(chǎn)生顯示與來(lái)自u(píng)sa300或wood46金黃色葡萄球菌菌株的細(xì)胞壁制備物結(jié)合的陽(yáng)性elisa的單克隆抗體庫(kù)。隨后在200-ml瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中產(chǎn)生抗體,并用蛋白a色譜(mabselectsure,gelifesciences,piscataway,nj)純化用于進(jìn)一步試驗(yàn)。對(duì)于較大規(guī)模的抗體產(chǎn)生,在cho細(xì)胞中產(chǎn)生抗體。將編碼vl和vh的載體轉(zhuǎn)染到cho細(xì)胞中,并通過(guò)蛋白a親和色譜從細(xì)胞培養(yǎng)基中純化igg。表5:用于分離抗體的抗原清單cw#1和cw#3通常在制備elisa包被中混合在一起:圖6總結(jié)了通過(guò)elisa對(duì)抗體的初步篩選。當(dāng)用usa300細(xì)胞壁制備物混合物(鐵消耗:tsb以96:4比例)進(jìn)行篩選時(shí),分離所有抗體(除了4569)。所有g(shù)lcnacβ(除了6259)、sdr和pgn(4479)mab在初次篩選中也對(duì)pgn和wta陽(yáng)性。通過(guò)篩選與usa300cw混合物的結(jié)合,專一地發(fā)現(xiàn)所有g(shù)lcnacα。通過(guò)在wood46cwp上篩選發(fā)現(xiàn)4569(lta特異性)。使用識(shí)別在wta上的β-o-連接的glcnac糖修飾的人igg1發(fā)現(xiàn)抗體結(jié)合的最高水平(表6)。用識(shí)別α-o-連接的glcnac的單克隆抗體獲得較少的結(jié)合;針對(duì)巨細(xì)胞病毒(cmv)gd蛋白的同種型對(duì)照抗體由于在體內(nèi)衍生的金黃色葡萄球菌中表達(dá)的蛋白a而顯示出一些最小反應(yīng)性(圖7a)。通過(guò)遺傳手段確定抗體的抗原特異性,使得針對(duì)wta上的α或β-glcnacs糖修飾的抗體不能結(jié)合缺少其各自糖基轉(zhuǎn)移酶的金黃色葡萄球菌菌株(如圖7b所示)。與抗體結(jié)合到體內(nèi)衍生的mrsa的程度一致,用抗-β-glcnacwta抗體制備的aac顯示出優(yōu)于用抗α-glcnacwta抗體制備的抗體。使用離體流式細(xì)胞術(shù)從庫(kù)中選擇抗wtamab查詢?cè)搸?kù)中的每個(gè)mab有三個(gè)選擇標(biāo)準(zhǔn):(1)與mrsa表面結(jié)合的mab的相對(duì)強(qiáng)度,作為有利于高抗生素遞送的相應(yīng)同源抗原的高表達(dá)的指示;(2)mab與從多種感染組織分離的mrsa結(jié)合的一致性,作為感染期間體內(nèi)mrsa表面上同源抗原穩(wěn)定表達(dá)的指示;和(3)mab與臨床的金黃色葡萄球菌菌株組的結(jié)合能力,作為同源表面抗原表達(dá)保守性的指示。為此,使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)庫(kù)中所有這些預(yù)先選擇的mab培養(yǎng)物上清液,檢測(cè)其與來(lái)自不同感染組織和不同金黃色葡萄球菌菌株的金黃色葡萄球菌的反應(yīng)性。分析了庫(kù)中所有mab結(jié)合來(lái)自感染了mrsausa300的小鼠感染的腎臟、脾臟、肝臟和肺以及在兔心內(nèi)膜炎模型中感染了usa300col的兔子的心臟或腎臟內(nèi)的mrsa的能力??贵w從多種感染組織識(shí)別金黃色葡萄球菌的能力提高了治療性抗體在金黃色葡萄球菌的多種不同臨床感染中有活性的可能性。在收獲器官后立即分析細(xì)菌,即不傳代培養(yǎng),以防止由體外培養(yǎng)條件引起的表型變化。幾種金黃色葡萄球菌表面抗原在體外培養(yǎng)期間表達(dá),但在感染組織中喪失表達(dá)。針對(duì)這些抗原的抗體不太可能用于治療感染。在多種感染組織中對(duì)該mab庫(kù)進(jìn)行分析時(shí),證實(shí)了大量抗體的觀察結(jié)果,這些抗體顯示出與培養(yǎng)物中金黃色葡萄球菌的顯著結(jié)合,但不存在與來(lái)自任何測(cè)試感染組織的細(xì)菌結(jié)合。一些抗體結(jié)合來(lái)自部分但不是全部測(cè)試感染組織的細(xì)菌。因此,選擇了能夠識(shí)別來(lái)自測(cè)試的所有感染條件下的細(xì)菌的抗體。評(píng)估的參數(shù)為:(1)相對(duì)熒光強(qiáng)度,作為抗原豐度的量度;(2)染色陽(yáng)性的器官數(shù)量,作為抗原表達(dá)穩(wěn)定性的量度;和(3)mab對(duì)一組臨床的金黃色葡萄球菌菌株的結(jié)合能力,作為同源表面抗原表達(dá)保守性的指示。測(cè)定試驗(yàn)抗體相對(duì)于針對(duì)非相關(guān)抗原的同種型對(duì)照抗體例如igg1mab抗皰疹病毒gd:5237(參考下文)的熒光強(qiáng)度。針對(duì)wta-β的mab不僅顯示出最高的抗原豐度,而且還顯示出與上述測(cè)試和指定的所有感染組織的mrsa非常一致的結(jié)合。此外,評(píng)估了這些mab與以下金黃色葡萄球菌菌株結(jié)合的能力,并且它們是在體外在tsb中培養(yǎng):usa300(mrsa)、usa400(mrsa)、col(mrsa)、mrsa252(mrsa)、wood46(mssa)、rosenbach(mssa)、newman(mssa)和mu50(visa)。發(fā)現(xiàn)抗wtaβmab而不是抗wtaαmab與所有這些菌株都具有反應(yīng)性。結(jié)合不同菌株的分析表明,wtaβ比wtaα更保守,因此更適合于aac。實(shí)施例4具有對(duì)壁磷壁酸特異性的抗體的表征確認(rèn)ab的wta特異性通過(guò)將40mg沉淀的金黃色葡萄球菌菌株與1ml補(bǔ)充有30%棉子糖、100μg/ml溶葡萄球菌酶(cellsciences,canton,ma)和不含edta的蛋白酶抑制劑混合物(roche,pleasanton,ca)的10mmtris-hcl(ph7.4)在37℃下孵育30分鐘,以產(chǎn)生來(lái)自金黃色葡萄球菌野生型(wt)菌株和缺乏wta的金黃色葡萄球菌突變菌株(δtago;無(wú)wta菌株)的細(xì)胞壁制備物(cwp)。將裂解物以11,600×g離心5分鐘,收集含有細(xì)胞壁成分的上清液。對(duì)于免疫印跡分析,將蛋白質(zhì)在4-12%tris-甘氨酸凝膠上分離,并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(invitrogen,carlsbad,ca)上,然后用針對(duì)wta的指定測(cè)試抗體或用針對(duì)pgn和lta的對(duì)照抗體進(jìn)行印跡法檢測(cè)。免疫印跡顯示針對(duì)wta的抗體結(jié)合來(lái)自wt金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁制備物,但不與缺乏wta的δtago菌株的細(xì)胞壁制備物結(jié)合??闺木厶?抗pgn)和脂磷壁酸(抗lta)的對(duì)照抗體很好地與兩種細(xì)胞壁制備物結(jié)合。這些數(shù)據(jù)表明測(cè)試抗體對(duì)wta的特異性。i)流式細(xì)胞術(shù)確定mab與mrsa表面的結(jié)合程度使用以下方案通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析來(lái)自感染組織的整個(gè)細(xì)菌的表面抗原表達(dá)。對(duì)于來(lái)自感染的小鼠組織的細(xì)菌的抗體染色,將6-8周齡雌性c57bl/6小鼠(charlesriver,wilmington,ma)靜脈內(nèi)注射在pbs中的108cfu的對(duì)數(shù)相生長(zhǎng)的usa300。感染后兩天收獲小鼠器官。如先前在tattevinp.等人,antimicrobialagentsandchemotherapy54:610-613(2010)中描述的那樣建立兔感染性心內(nèi)膜炎(ie)。將兔子靜脈注射5x107cfu的靜止期生長(zhǎng)的mrsa菌株col,并在18小時(shí)后收獲心臟贅生物。用7x107cfu固定相感染18小時(shí)后每日兩次靜脈內(nèi)施用30mg/kg萬(wàn)古霉素治療。為了裂解小鼠或兔細(xì)胞,使用溫和的macs細(xì)胞解離器(miltenyi)在m管(miltenyi,auburn,ca)中將組織勻漿,隨后在含有0.1%triton-x100(thermo)、10μg/mldnasei(roche)和completemini蛋白酶抑制劑混合物(roche)的pbs中在室溫下孵育10分鐘。將懸浮液通過(guò)40微米過(guò)濾器(bd),并用不含酚紅的補(bǔ)充有0.1%不含igg的bsa(sigma)和10mmhepes,ph7.4(hb緩沖液)的hbss洗滌。然后將細(xì)菌懸浮液與300μg/ml的兔igg(sigma)在hb緩沖液中室溫(rt)下孵育1小時(shí),以阻斷非特異性igg結(jié)合。將細(xì)菌用2μg/ml的一抗進(jìn)行染色,包括rf1或同種型對(duì)照igg1mab抗皰疹病毒gd:5237(nakamuragr等人,jvirol67:6179-6191(1993)),接下來(lái)用熒光抗-人igg二抗(jacksonimmunoresearch,westgrove,pa)染色。為了能夠從小鼠或兔器官碎片分辨細(xì)菌,使用20μg/ml小鼠mab702抗金黃色葡萄球菌肽聚糖(abcam,cambridge,ma)和熒光染料標(biāo)記的抗小鼠igg二抗(jacksonimmunoresearch)進(jìn)行雙染色。將細(xì)菌洗滌并通過(guò)facscalibur(bd)分析。在流式細(xì)胞術(shù)分析過(guò)程中,從雙熒光圖中門選mab702染色陽(yáng)性的細(xì)菌。ii)測(cè)量對(duì)金黃色葡萄球菌的結(jié)合親和力和mrsa上的抗原密度表6顯示與newman-δspa菌株結(jié)合的mrsa抗體的平衡結(jié)合分析以及細(xì)菌上的抗原密度。表6mrsa抗體特異性平均kd,nm(n=2)抗原密度,平均位點(diǎn)/細(xì)菌4497b-wta2.550,0004462b-wta3.143,0006263b-wta1.422,0006297b-wta1.121,0007578a-wta0.416,000rf1sdr-glyco0.31600在以下試驗(yàn)條件下,使用放射性配體細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)法得到kd和抗原密度:dmem+2.5%小鼠血清結(jié)合緩沖液;溶液在室溫(rt)下結(jié)合2小時(shí);并使用400,000個(gè)細(xì)菌/孔。ab6263是類似6078的,因?yàn)樾蛄蟹浅O嗨啤3薱drh3中的第二殘基(r相對(duì)于g)之外,所有其它l和h鏈cdr序列是相同的。實(shí)施例5抗wta抗體的氨基酸修飾總之,每個(gè)抗wtaβab的vh區(qū)被克隆出來(lái)并與人h鏈γ1恒定區(qū)連接,vl與κ恒定區(qū)連接以表達(dá)作為igg1的ab。野生型序列在某些位置被改變以提高抗體的穩(wěn)定性,同時(shí)保持如下所述的抗原結(jié)合。然后生成半胱氨酸工程化的ab(thiomabs,也稱為thiomabtm)。i.將可變區(qū)連接到恒定區(qū)從上述人抗體庫(kù)鑒定的wtaβab的vh區(qū)與人γ1恒定區(qū)連接以制備全長(zhǎng)igg1抗體。l鏈?zhǔn)铅蔿鏈。ii.產(chǎn)生穩(wěn)定性變體將圖12中的wtaab(特別參見(jiàn)圖13a、13b、14a、14b)進(jìn)行工程化以改善某些性質(zhì)(避免脫酰胺、天冬氨酸異構(gòu)化、氧化或n-連接的糖基化)并測(cè)試抗原結(jié)合的保留以及氨基酸置換后的化學(xué)穩(wěn)定性。使用qiaprepspinm13試劑盒(qiagen),從生長(zhǎng)在大腸桿菌cj236細(xì)胞中的m13ko7噬菌體顆粒純化編碼重鏈或輕鏈的克隆的單鏈dna。5′磷酸化的合成寡核苷酸具有如下序列:5’-cccagactgcaccagctggatctctgaatgtactccagttgc-3’(seqidno.152)5’-ccagactgcaccagctgcacctctgaatgtactccagttgc-3’(seqidno.153)5’ccagggttccctggccccawtmgtcaagtccascwkcacctcttgcacagtaatagacagc-3’(seqidno.154);和5’-cctggccccagtcgtcaagtcctccttcacctcttgcacagtaatagacagc-3’(seqidno.155)(iupac編碼)其用于按照如下所述方法通過(guò)位點(diǎn)特異性誘變將所述的寡核苷酸定向位點(diǎn)誘變來(lái)突變編碼抗體的克?。簁unkel,t.a.(1985),快速有效的位點(diǎn)特異性誘變且無(wú)表型選擇,proceedingsofthenationalacademyofsciencesusa82(2):488-492。誘變的dna用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌xl1-blue細(xì)胞(agilenttechnologies)并接種在含有50μg/ml羧芐青霉素的luria肉湯平板上。單獨(dú)挑選菌落并在含有50μg/ml羧芐青霉素的液體luria肉湯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。對(duì)miniprepdna進(jìn)行測(cè)序以確認(rèn)是否存在突變。對(duì)于ab6078,vh中的第二個(gè)氨基酸met(met-2)容易氧化。因此met-2突變?yōu)閕le或val,以避免殘基的氧化。由于met-2的改變可能影響結(jié)合親和力,因此通過(guò)elisa測(cè)試突變體與葡萄球菌cwp的結(jié)合。發(fā)現(xiàn)cdrh3“dg”或“dd”基序容易轉(zhuǎn)化為異天冬氨酸。ab4497在cdrh3位點(diǎn)96和97包含dg(參見(jiàn)圖16),并且為了穩(wěn)定性而改變。cdrh3對(duì)于抗原結(jié)合通常是關(guān)鍵的,因此測(cè)試幾種突變體的抗原結(jié)合和化學(xué)穩(wěn)定性。突變體d96e(v8)保留與抗原的結(jié)合,類似于野生型ab4497(圖16),并且是穩(wěn)定的,且不形成異天冬氨酸。葡萄球菌cwp的elisa對(duì)于6078抗體突變體的分析,將溶葡萄球菌酶處理的由1x109細(xì)菌/ml組成的usa300δspa金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁制備物(wt)在0.05碳酸鈉ph9.6中1/100稀釋,并涂覆到384孔elisa板(nunc;neptune,nj)上,在4℃孵育過(guò)夜。用加0.05%吐溫20的pbs洗滌平板,并用0.5%牛血清白蛋白(bsa)的pbs孵育2小時(shí)來(lái)封閉。這次和所有后續(xù)孵育在室溫下輕輕攪拌進(jìn)行。將抗體樣品在樣品/標(biāo)準(zhǔn)稀釋緩沖液(pbs,0.5%bsa,0.05%tween20,0.25%chaps,5mmedta,0.35mnacl,15ppmproclin,(ph7.4))中稀釋,加入洗滌過(guò)的平板中,并孵育1.5-2小時(shí)。用在試驗(yàn)緩沖液(pbs,0.5%bsa,15ppmproclin,0.05%tween20)中稀釋至40ng/ml的過(guò)氧化物酶綴合的山羊抗人igg(fc)f(ab')2片段(jacksonimmunoresearch;westgrove,pa)孵育1小時(shí),期間檢測(cè)到平板結(jié)合的抗金黃色葡萄球菌。最終洗滌后,加入四甲基聯(lián)苯胺(kpl,gaithersburg,md),顯色5-10分鐘,用1m磷酸終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在450nm處讀取平板,以620nm參考。iii.生成cys工程化突變體(thiomab)通過(guò)如前文教導(dǎo)和下文描述的在預(yù)定位置將半胱氨酸引入h鏈(在ch1)或l鏈(cκ)中,從而生成全長(zhǎng)thiomab,以使抗體與接頭-抗生素中間體(半胱氨酸氨基酸可以在抗體的重鏈(hc)或輕鏈(lc)中的反應(yīng)位點(diǎn)處進(jìn)行工程化,并且不形成鏈內(nèi)或分子間二硫鍵(junutula等人,2008bnaturebiotech.,26(8):925-932;dornan等人(2009)blood114(13):2721-2729;us7521541;us7723485;wo2011/156328;wo2009/052249,shen等人(2012)naturebiotech.,30(2):184-191;junutula等人(2008)jourofimmun.methods332:41-52)。然后將h和l鏈克隆到單獨(dú)的質(zhì)粒中,并將編碼h和l的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中,在其中它們被表達(dá)并組裝成完整的ab。h和l鏈也可以克隆到相同的表達(dá)質(zhì)粒中。通過(guò)表達(dá)所需的cys突變體鏈和野生型鏈的組合產(chǎn)生igg1,其具有2個(gè)工程化的cys,每個(gè)h鏈中有一個(gè);或2個(gè)工程化的cys,每個(gè)l鏈中有一個(gè);或每個(gè)h鏈和l鏈(hclccys)中各有一個(gè)工程化cys的組合,導(dǎo)致每個(gè)抗體四聚體4個(gè)工程化cys。圖13a和13b顯示6078wt和具有hccys和lccys的組合的突變體ab。還測(cè)試了6078突變體結(jié)合來(lái)自過(guò)夜培養(yǎng)物的蛋白a缺陷型usa300金黃色葡萄球菌的能力。從facs分析結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)可見(jiàn),與6078wt(未改變)抗體相似,突變體abs與usa300結(jié)合;突變體中的氨基酸改變不影響與金黃色葡萄球菌的結(jié)合。使用gd作為非特異性陰性對(duì)照抗體。實(shí)施例6:抗生素選擇選擇具有以下特點(diǎn)的利福霉素型抗生素:具有高效能、在低吞噬溶酶體ph中未改變的殺菌活性、能夠承受細(xì)胞內(nèi)損傷的能力,以及其可以容易地與適合與抗wta抗體綴合的蛋白酶可切割的非肽類(pml)接頭試劑偶聯(lián)。由于吞噬細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌復(fù)制最為緩慢,因此抗生素的優(yōu)化也要求在從aac釋放時(shí)能夠殺死非復(fù)制性mrsa。從固定相培養(yǎng)物中收集mrsa,并懸浮在不含抗生素或含1×10-6m利福平或利福霉素衍生物(rifalog)的磷酸鹽緩沖鹽水中,并在37℃下孵育。在指定時(shí)間,收集培養(yǎng)物樣品并離心除去抗生素,并通過(guò)接種測(cè)定存活細(xì)菌的總數(shù)。有趣地是,在最少量磷酸鹽緩沖液(pbs)中過(guò)夜孵育后,添加利福霉素型(rifalog)抗生素而不是利福平導(dǎo)致活的但非復(fù)制型細(xì)菌的數(shù)量減少了1,000倍以上(參見(jiàn)圖8)。類似地,利福霉素型抗生素有能力殺死常規(guī)定義的耐藥株細(xì)胞,其是可能進(jìn)入休眠狀態(tài)以在生長(zhǎng)培養(yǎng)物中的抗生素處理(例如環(huán)丙沙星)下存活的細(xì)菌(數(shù)據(jù)未顯示)。與以前的觀察結(jié)果一致,利福平的添加對(duì)其活力沒(méi)有影響(conlon,b.p.等人(2013)nature503,365-370)。相比之下,添加利福霉素型抗生素(rifalog)導(dǎo)致根除了低于檢測(cè)限的耐藥株細(xì)胞。這些結(jié)果表明,利福霉素類抗生素具有顯著的殺死休眠、非分裂細(xì)胞的能力。實(shí)施例7:抗wta抗體-抗生素綴合物的制備抗壁磷酸抗體-抗生素綴合物(aac)表3是通過(guò)將抗wta抗體與pml接頭-抗生素中間體(包括來(lái)自表2的那些)綴合制備的。在綴合之前,根據(jù)wo2004/010957描述的方法的標(biāo)準(zhǔn)方法,使用tcep部分地還原抗wta抗體,為此目的,其教導(dǎo)通過(guò)引用并入本文作為參考。使用例如在doronina等人(2003)nat.biotechnol.21:778-784和us2005/0238649a1中所述的方法的標(biāo)準(zhǔn)方法將部分還原的抗體與接頭-抗生素中間體綴合。簡(jiǎn)言之,將部分還原的抗體與接頭-抗生素中間體合并,以使接頭-抗生素中間體與抗體的還原半胱氨酸殘基綴合。將綴合反應(yīng)淬滅,并純化aac。測(cè)定每個(gè)aac的抗生素負(fù)荷(每個(gè)抗體的抗生素部分的平均數(shù)),對(duì)于用單個(gè)半胱氨酸突變位點(diǎn)工程化的抗壁磷壁酸抗體,其約為1至約2。用于綴合的硫代-單克隆抗體的還原/氧化:將在cho細(xì)胞中表達(dá)的全長(zhǎng)、半胱氨酸工程化單克隆抗體(thiomabs-junutula等人,2008bnaturebiotech.,26(8):925-932;dornan等人(2009)blood114(13):2721-2729;us7521541;us7723485;wo2009/052249,shen等人(2012)naturebiotech.,30(2):184-191;junutula等人(2008)jourofimmun.methods332:41-52)在37℃下用約20-40倍過(guò)量的在50mmtrisph7.5中的含有2mmedta的tcep(三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽或dtt(二硫蘇糖醇))還原3小時(shí),或在室溫下過(guò)夜(getz等人(1999)anal.biochem.vol273:73-80;soltecventures,beverly,ma)。將還原的thiomab稀釋并加載到10mm醋酸鈉ph5的hitraps柱上,并用含有0.3m氯化鈉的pbs洗脫?;蛘?,通過(guò)加入1/20體積的10%乙酸(用10mm琥珀酸鹽ph5稀釋)酸化該抗體,并加載到柱上,然后用10倍柱體積的琥珀酸緩沖液洗滌。將該柱用50mmtrisph7.5,2mmedta洗脫。用15倍摩爾過(guò)量的dhaa(脫氫抗壞血酸)或200nm硫酸銅(cuso4)水溶液處理洗脫的還原的thiomab。鏈間二硫鍵的氧化在約3小時(shí)或以上完成。環(huán)境空氣氧化也是有效的。將再氧化的抗體透析至20mm琥珀酸琥珀酸鈉ph5、150mmnacl、2mmedta中,并在-20℃冷凍保存。硫代-單克隆抗體與接頭-抗生素中間體的綴合:將解封的、再氧化的硫代抗體(thiomab)與6-8倍摩爾過(guò)量的表2的接頭-抗生素中間體(來(lái)自20mm濃度的dmso儲(chǔ)存液)在50mmtris,ph8中反應(yīng)直到反應(yīng)完成(16-24小時(shí)),通過(guò)反應(yīng)混合物的lc-ms分析測(cè)定。然后將粗抗體-抗生素綴合物(aac)在用20mm琥珀酸鈉(ph5)稀釋后施加到陽(yáng)離子交換柱上。用至少10個(gè)柱體積的20mm琥珀酸鈉(ph5)洗滌該柱,并用pbs洗脫。使用凝膠過(guò)濾柱將aac配制到含有240mm蔗糖的20mmhis/乙酸鹽ph5中。通過(guò)uv光譜法對(duì)aac進(jìn)行表征,以測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,在用賴氨酸c內(nèi)肽酶處理前后進(jìn)行分析型sec(尺寸排阻色譜)的聚集分析和lc-ms。使用shodexkw802.5柱,在0.2m磷酸鉀ph6.2中用0.25mm氯化鉀和15%ipa以0.75ml/min的流速進(jìn)行尺寸排阻色譜。aac的聚集狀態(tài)通過(guò)280nm處洗脫的峰面積吸光度的積分來(lái)確定。使用agilentqtof6520esi儀器進(jìn)行l(wèi)c-ms分析。作為一個(gè)實(shí)例,使用該化學(xué)法產(chǎn)生的aac在37℃在tris(ph7.5)中用1:500w/w內(nèi)蛋白酶lysc(promega)處理30分鐘。將所得切割片段加載到加熱至80℃的1000a,8μlplrp-s柱上,并在5分鐘內(nèi)用30%b至40%b的梯度洗脫。流動(dòng)相a:含0.05%tfa的h2o。流動(dòng)相b:含0.04%tfa的乙腈。流速:0.5ml/min。在電噴霧電離和ms分析之前,通過(guò)280nm處的uv吸光度檢測(cè)來(lái)監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)洗脫。通常實(shí)現(xiàn)非綴合fc片段、殘留的非綴合fab和抗生素-fab的色譜拆分。使用masshuntertm軟件(agilenttechnologies)將獲得的m/z光譜解卷積,以計(jì)算抗體片段的質(zhì)量。實(shí)施例8:切割和抗生素的釋放在與抗βwtamab以aac形式連接時(shí),測(cè)試?yán)C顾匦涂股刂苯託⑺兰?xì)胞外細(xì)菌的能力。aac在單獨(dú)的緩沖液中孵育或用組織蛋白酶b處理。將所得反應(yīng)物的系列稀釋液加入到在胰酶解大豆酪蛋白肉湯培養(yǎng)基中含有mrsa的孔中,并培養(yǎng)過(guò)夜,以鑒定含有足夠的活性抗生素以防止生長(zhǎng)的孔。如預(yù)測(cè)的那樣,與完整的抗mrsaaac的過(guò)夜孵育不會(huì)使生長(zhǎng)的浮游細(xì)菌受到傷害,除非aac用組織蛋白酶b預(yù)處理以釋放活性抗生素(圖9)。用組織蛋白酶b預(yù)處理aac釋放了足夠的抗生素活性,防止細(xì)菌在0.6μg/ml的aac中生長(zhǎng),其預(yù)計(jì)含有0.006μg/ml的抗生素。為了測(cè)試抗生素是否僅在將aac調(diào)理的細(xì)菌內(nèi)化到細(xì)胞后才從aac中釋放出來(lái),可以用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)為基礎(chǔ)的探針檢測(cè)接頭的切割,該探針由與兩個(gè)染料分子綴合的同一個(gè)抗mrsa抗體組成,使用與aac中相同的接頭。mrsa用fret綴合物調(diào)理,并加入到巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物中。通過(guò)視頻顯微鏡監(jiān)測(cè)細(xì)菌的攝取和探針的切割。接頭在巨噬細(xì)胞攝取細(xì)菌后幾分鐘內(nèi)被切割,其通過(guò)a488探針的釋放而可視化,類似于在aac上的利福霉素型抗生素的釋放。另一方面,當(dāng)由于巨噬細(xì)胞用latrunculina(一種吞噬作用的抑制劑)處理而使細(xì)菌不被內(nèi)化時(shí),接頭保持完整。也可以使用質(zhì)譜分析來(lái)證實(shí),在攝取用實(shí)際aac涂覆的mrsa后在巨噬細(xì)胞內(nèi)確實(shí)釋放了游離抗生素。實(shí)施例9抗wtaβpmlaac體外效力金黃色葡萄球菌在體外被原代人和小鼠巨噬細(xì)胞和幾種人類細(xì)胞系內(nèi)化時(shí),抗wtaβ-cbdkaac有效地殺死金黃色葡萄球菌。體外巨噬細(xì)胞試驗(yàn)。將金黃色葡萄球菌(usa300nrs384菌株)與各種劑量(100u/ml、10μg/ml、1μg/ml或0.1μg/ml)的抗wtaβ抗體4497,每個(gè)抗體載有2個(gè)抗生素分子(dar2)的ab4497-cbdk-二甲基pipboraac或每個(gè)抗體載有4個(gè)抗生素分子(dar4)的抗-wta-cbdk-二甲基pipboraac持續(xù)孵育1小時(shí),以使抗體與細(xì)菌結(jié)合。將所得的調(diào)理細(xì)菌飼喂鼠巨噬細(xì)胞,并在37℃下孵育以允許吞噬。2小時(shí)后,移除感染混合物,并用補(bǔ)充有50μg/ml慶大霉素的正常生長(zhǎng)培養(yǎng)基替換,以殺死任何剩余的細(xì)胞外細(xì)菌。2天后,通過(guò)將胰蛋白酶大豆瓊脂平板上的巨噬細(xì)胞裂解物的連續(xù)稀釋液接種,測(cè)定存活的細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌總數(shù)。實(shí)施例10抗wtaβ-pmlaac的體內(nèi)功效治療小鼠的金黃色葡萄球菌感染將器官中的細(xì)菌負(fù)荷降低了幾個(gè)數(shù)量級(jí)。為了確定特異性針對(duì)細(xì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌的治療是否會(huì)在感染期間具有療效,在小鼠靜脈感染模型中測(cè)試wta-pmlaac。該實(shí)施例證明,在鼠靜脈感染模型中,wta-pmlaac有效地大幅減少或消除細(xì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌感染。腹膜炎模型。將7周齡的雌性a/j小鼠(jacksonlaboratories)用5×107cfu的usa300腹膜注射感染。在感染后2天處死小鼠,并用5ml冷磷酸鹽緩沖鹽水溶液(pbs)沖洗腹膜。將腎臟在5mlpbs中勻漿,如下文所述,用于靜脈內(nèi)感染模型。將腹膜洗滌物在4℃下以1,000rpm在臺(tái)式離心機(jī)中離心5分鐘。收集上清液作為細(xì)胞外細(xì)菌,收集含有腹膜細(xì)胞的細(xì)胞沉淀作為細(xì)胞內(nèi)組分。將細(xì)胞在37℃下用50μg/ml溶葡萄球菌酶處理20分鐘以殺死污染的細(xì)胞外細(xì)菌。將腹膜細(xì)胞在冰冷的pbs中洗滌3次,以在分析前除去溶葡萄球菌酶。為了計(jì)數(shù)細(xì)胞內(nèi)cfu的數(shù)量,將腹膜細(xì)胞在含有0.1%triton-x的hb(hanks平衡鹽溶液,補(bǔ)充有10mmhepes和0.1%牛血清白蛋白)中裂解,在含有0.05%tween-20的pbs中制備裂解物的連續(xù)稀釋液。鼠靜脈感染模型為了在臨床上相關(guān),aac需要能夠消除已經(jīng)建立的細(xì)胞內(nèi)感染。為了評(píng)估這一點(diǎn),治療延遲到菌血癥開(kāi)始24小時(shí)后,此時(shí)萬(wàn)古霉素治療的效果最低。嗜中性粒細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)感染迅速發(fā)展;在至少一種菌血癥模型中,血液中的95%的細(xì)菌在15分鐘內(nèi)就在嗜中性粒細(xì)胞內(nèi)7,這可能是由于萬(wàn)古霉素的功效下降。在這些條件下,單劑量aac的治療是有效的,并證明優(yōu)于用等量的游離利福霉素型抗生素治療。金黃色葡萄球菌是人類皮膚和粘膜表面的常見(jiàn)定殖者。人血清多種來(lái)源的初步分析,包括igiv-gammagard(來(lái)自~10,000人的合并免疫球蛋白制劑),證明人血清含有約300μg/ml的抗金黃色葡萄球菌抗體,其中~70%是針對(duì)wta的glcnac修飾。小鼠血清中沒(méi)有明顯的抗金黃色葡萄球菌抗體水平。為了確定在正常人血清中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源抗wta抗體是否可能與aac競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合,cb17.scid小鼠(charlesriverlaboratories,hollister,ca)用gammagards/digiv免疫球蛋白(asdhealthcare,brooksky)重構(gòu),其使用優(yōu)化的劑量方案以在血清中達(dá)到至少10mg/ml人igg的恒定血清水平。施用igiv的初始靜脈注射劑量為30mg/小鼠,然后6小時(shí)后通過(guò)腹膜內(nèi)(i.p.)注射15mg/小鼠的第二劑量,隨后連續(xù)3天通過(guò)腹膜內(nèi)注射向每只小鼠每日給藥15mg。與未處理的對(duì)照相比,這些小鼠同樣容易感染mrsa。在第一次施用igiv后4小時(shí),通過(guò)靜脈內(nèi)注射用磷酸鹽緩沖鹽水稀釋的1×107cfumrsa(usa300nrs384菌株)感染小鼠(n=8,對(duì)于每種抗體或aac)。感染的小鼠用表3中的50mg/kgs4497裸抗體或s4497aac處理。感染24小時(shí)后通過(guò)靜脈內(nèi)注射向小鼠施用單次劑量的aac,感染后第4天處死小鼠,并在5ml磷酸鹽緩沖鹽水中收獲腎臟和心臟。使用gentlemacsdissociatortm(miltenyibiotec,auburn,ca)將組織樣品勻漿。通過(guò)將組織勻漿液在pbs0.05%tween中的連續(xù)稀釋液在含有5%去纖維蛋白的羊血的胰蛋白酶大豆瓊脂上接種,測(cè)定每個(gè)器官中回收的細(xì)菌總數(shù)。如圖10的結(jié)果所示,盡管存在潛在的競(jìng)爭(zhēng)性抗體,與裸抗體相比,單劑量的抗-β-glcnacwtaaac(s4497-aac)大大減少或消除感染器官中的細(xì)菌計(jì)數(shù)。圖10b顯示用aac(dar2)處理,腎臟中的細(xì)菌負(fù)荷減少約7,000倍。圖10c顯示用表3中的aac(dar2)處理,心臟中的細(xì)菌負(fù)荷減少大約500倍。與作為aac的抗wta抗體綴合的二甲基pipbor相比,在體內(nèi)感染模型中單獨(dú)用裸抗生素,即二甲基pipbor(與在aac中的二甲基pipbor等摩爾濃度)進(jìn)行處理是無(wú)效的。未綴合的(游離)抗wta抗體在體內(nèi)是無(wú)效的圖17顯示用50mg/kg游離抗體的預(yù)處理對(duì)靜脈內(nèi)感染模型是無(wú)效的。在使用2×107cfu的usa300感染30分鐘之前,通過(guò)靜脈注射向balb/c小鼠施用單劑量的載體對(duì)照(pbs)或50mg/kg抗體。治療組包括不與金黃色葡萄球菌(gd)結(jié)合的同種型對(duì)照抗體、針對(duì)壁磷壁酸(4497)的β修飾的抗體、或針對(duì)壁磷壁酸(7578)的α修飾的抗體。通過(guò)腹膜內(nèi)注射(萬(wàn)古霉素),用110mg/kg的萬(wàn)古霉素每天向?qū)φ招∈笫┯脙纱巍?shí)施例11哌啶基苯并噁嗪并利福霉素(pipbor)5將2-硝基苯-1,3-二醇1在氫氣下用鈀/碳催化劑在乙醇溶劑中氫化,得到2-氨基苯-1,3-二醇2,分離為鹽酸鹽。用叔丁基二甲基硅烷基氯和三乙胺在二氯甲烷/四氫呋喃中單保護(hù)2,得到2-氨基-3-(叔丁基二甲基硅烷氧基)苯酚3。利福霉素s(chemshuttleinc.,fremont,ca,us7342011;us7271165;us7547692)與3通過(guò)用氧化錳或氧氣在甲苯中氧化縮合,在室溫下反應(yīng)得到tbs保護(hù)的苯并噁嗪并利福霉素4。lcms(esi):m+h+=915.41。4與哌啶-4-胺和氧化錳反應(yīng)得到哌啶基苯并噁嗪并利福霉素(pipbor)5。lcms(esi):m+h+=899.40實(shí)施例12二甲基pipbor6n,n-二甲基哌啶-4-胺與tbs-保護(hù)的苯并噁嗪并利福霉素4反應(yīng)得到二甲基哌啶基苯并噁嗪并利福霉素(二甲基pipbor)6或者,(5-氟-2-硝基-1,3-亞苯基)雙(氧基)雙(亞甲基)二苯7在氫氣下用鈀/碳催化劑在四氫呋喃/甲醇溶劑中氫化以除去芐基,得到2-氨基-5-氟苯-1,3-二醇8。lcms(esi):m+h+=144.04。將市售的利福霉素s或利福霉素sv鈉鹽(chemshuttleinc.,fremont,ca)與2-氨基-5-氟苯-1,3-二醇8通過(guò)在乙酸乙酯中在空氣或鐵氰化鉀中氧化縮合而在60℃下反應(yīng),得到氟苯并噁嗪并利福霉素9。用n,n-二甲基哌啶-4-胺置換氟得到二甲基pipbor6。lcms(esi):m+h+=927.43實(shí)施例13(s)-n-(5-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)戊基)-n-(1-(4-(羥甲基)苯基氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)環(huán)丁烷-1,1-二甲酰胺10步驟1:1-(5-氨基戊基)-1h-吡咯-2,5-二酮鹽酸鹽10a的制備將馬來(lái)酸酐、呋喃-2,5-二酮(150g,1.53mol)加入到在hoac(1000ml)中攪拌的6-氨基己酸(201g,1.53mol)溶液中?;旌衔镌谑覝叵聰嚢?小時(shí)后,回流加熱8小時(shí)。在減壓下除去有機(jī)溶劑,并且用etoac(500ml×3)萃取殘余物,用h2o洗滌。將合并的有機(jī)層用na2so4干燥并濃縮,得到粗產(chǎn)物。用石油醚洗滌,得到白色固體狀的6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己酸(250g,77.4%)。將dppa(130g,473mmol)和tea(47.9g,473mmol)加入到在t-buoh(200ml)中的6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己酸(100g,473mmol)溶液中。將混合物在n2下加熱回流8小時(shí)。將混合物濃縮,通過(guò)硅膠柱層析(pe:etoac=3:1)純化殘余物,得到5-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)戊基氨基甲酸叔丁酯(13g,10%)。向5-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)戊基氨基甲酸叔丁酯(28g,992mmol)的無(wú)水etoac(30ml)溶液中逐滴加入hcl/etoac(50ml)?;旌衔镌谑覝叵聰嚢?小時(shí)后,過(guò)濾,將固體干燥,得到1-(5-氨基戊基)-1h-吡咯-2,5-二酮鹽酸鹽10a(16g,73.7%)。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ8.02(s,2h),6.99(s,2h),3.37-3.34(m,2h),2.71-2.64(m,2h),1.56-1.43(m,4h),1.23-1.20(m,2h).步驟2:制備(s)-1-(1-(4-(羥甲基)苯基氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基氨基甲?;?環(huán)丁烷甲酸10b向二噁烷和h2o(50ml/75ml)混合物中的(s)-2-氨基-5-脲基戊酸10g(17.50g,0.10mol)混合物中加入k2co3(34.55g,0.25mol)。在0℃下緩慢加入fmoc-cl(30.96g,0.12mol)。將反應(yīng)混合物歷經(jīng)2小時(shí)溫?zé)嶂潦覝?。減壓下除去有機(jī)溶劑,用6mhcl溶液將水漿體調(diào)至ph=3,用etoac(100ml×3)萃取。有機(jī)層用na2so4干燥,過(guò)濾并減壓濃縮,得到(s)-2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-脲基戊酸10f(38.0g,95.6%)。10f可商購(gòu)。向dcm和meoh(100ml/50ml)混合物中的10f(4g,10mmol)溶液中加入(4-氨基苯基)甲醇(1.6g,13mmol,1.3當(dāng)量)和2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氫喹啉,即eedq、sigma-aldrichcas登記號(hào)16357-59-8(32g,13mmol,1.3當(dāng)量)?;旌衔镌趎2下在室溫?cái)嚢?6小時(shí)后,將其濃縮得到棕色固體。加入mtbe(200ml),在15℃下攪拌2小時(shí)。通過(guò)過(guò)濾收集固體,用mtbe(50ml×2)洗滌,得到(1-((4-(羥甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基甲酸(s)-(9h-芴-9-基)甲基酯10e,為橙色固體(4.2g,84%)。lcms(esi):m/z503.0[m+1]。在室溫下向無(wú)水dmf(20ml)中的10e(4.2g,8.3mmol)攪拌溶液中滴加哌啶(1.65ml,17mmol,2當(dāng)量)。將混合物在室溫下攪拌30分鐘,形成固體沉淀物。加入無(wú)水dcm(50ml),立即使混合物變得透明。將混合物在室溫下攪拌另外30分鐘,lcms顯示10e被消耗。將其在減壓下濃縮至干(確保不存在哌啶),并將殘余物在etoac和h2o(50ml/20ml)之間分配。水相用etoac(50ml×2)洗滌并濃縮,得到油狀殘余物(2.2g,94%)(含少量dmf)的(s)-2-氨基-n-(4-(羥甲基)苯基)-5-脲基戊酰胺10d。將市售的1,1-環(huán)丁烷二甲酸,1,1-二乙基酯(cas登記號(hào)3779-29-1)通過(guò)堿水溶液的限制皂化轉(zhuǎn)化成半酸/酯1,1-環(huán)丁烷二甲酸,1-乙酯(cas登記號(hào)5450-84-9),并用偶聯(lián)試劑如tbtu(o-(苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸鹽,也稱為n,n,n',n'-四甲基-o-(苯并三唑-1-基)脲四氟硼酸鹽(casno.125700-67-6,sigma-aldrichb-2903)和n-羥基琥珀酰亞胺活化為nhs酯,即1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)1-乙基環(huán)丁烷-1,1-二甲酸酯。向dme(50ml)中的1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)1-乙基環(huán)丁烷-1,1-二甲酸酯(8g,29.7mmol)的溶液中加入在水(30ml)中的10d(6.0g,21.4mmol)和nahco3(7.48g,89.0mmol)溶液?;旌衔镌谑覝叵聰嚢?6個(gè)小時(shí)后,減壓濃縮至干,殘余物通過(guò)柱色譜法(dcm:meoh=10:1)純化,得到白色固體(6.4g,68.7%)的(s)-乙基1-((1-(4-(羥甲基)苯基)-2-氧代-6-脲基己烷-3-基)氨基甲?;?環(huán)丁烷甲酸酯10c。lcms(esi):m/z435.0[m+1]在室溫下向thf和meoh(20ml/10ml)混合物中的攪拌的10c(6.4g,14.7mmol)溶液中加入在h2o(20ml)中的lioh·h2o(1.2g,28.6mmol)溶液。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌16小時(shí)后,減壓除去溶劑,所得殘余物通過(guò)制備型hplc純化,得到(s)-1-(1-(4-(羥甲基)苯基氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基氨基甲?;?環(huán)丁烷甲酸10b(3.5g,產(chǎn)率:58.5%)。lcms(esi):m/z406.9[m+1].1hnmr(400mhz,甲醇-d4)δ8.86(d,j=8.4hz,2h),8.51(d,j=8.4hz,2h),5.88-5.85(m,1h),5.78(s,2h),4.54-4.49(m,3h),4.38-4.32(m,1h),3.86-3.75(m,1h),3.84-3.80(m,2h),3.28-3.21(m,1h),3.30-3.24(m,1h),3.00-2.80(m,1h),2.37-2.28(m,2h)。步驟3:s)-n-(5-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)戊基)-n-(1-(4-(羥甲基)苯基氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)環(huán)丁烷-1,1-二甲酰胺10的制備在0℃將二異丙基乙胺、dipea(1.59g,12.3mmol)和雙(2-氧代-3-噁唑烷基)次膦酰氯、bop-cl(cas登記號(hào)68641-49-6,sigma-aldrich,692mg,2.71mmol)加入到dmf(10ml)中的(s)-1-(1-(4-(羥甲基)苯基氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基氨基甲?;?環(huán)丁烷甲酸10b(1g,2.46mmol)溶液中,然后加入1-(5-氨基戊基)-1h-吡咯-2,5-二酮鹽酸鹽10a(592mg,2.71mmol)。將混合物在0℃下攪拌0.5小時(shí)。將反應(yīng)混合物用檸檬酸溶液(10ml)淬滅,用dcm/meoh(10:1)萃取。將有機(jī)層干燥并濃縮,殘余物通過(guò)硅膠柱色譜(dcm:meoh=10:1)純化,得到s)-n-(5-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)戊基)-n-(1-(4-(羥甲基)苯基氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)環(huán)丁烷-1,1-二甲酰胺10(1.0g,71%),也稱為mc-cbdk-cit-pab-oh。lcms(esi):m+h+=571.28。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.00(s,1h),7.82-7.77(m,2h),7.53(d,j=8.4hz,2h),7.19(d,j=8.4hz,2h),6.96(s,2h),5.95(t,j=6.4hz,1h),5.39(s,2h),5.08(t,j=5.6hz,1h),4.40-4.35(m,3h),4.09(d,j=4.8hz,1h),3.01(d,j=3.2hz,2h),3.05-2.72(m,4h),2.68-2.58(m,3h),2.40-2.36(m,4h),1.72-1.70(m,3h),1.44-1.42(m,1h),1.40-1.23(m,6h),1.21-1.16(m,4h)。實(shí)施例14(s)-n-(1-(4-(氯甲基)苯基氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)-n-(5-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)戊基)環(huán)丁烷-1,1-二甲酰胺11向在n,n-二甲基甲酰胺、dmf或n-甲基吡咯烷酮nmp(50ml)中的(s)-n-(5-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)戊基)-n-(1-(4-(羥甲基)苯基氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)環(huán)丁烷-1,1-二甲酰胺10(2.0g,3.5mmol)溶液中,在0℃逐漸滴加亞硫酰氯socl2(1.25g,10.5mmol)。反應(yīng)保持黃色。通過(guò)lc/ms監(jiān)測(cè)反應(yīng),顯示>90%轉(zhuǎn)化。將反應(yīng)混合物在20℃下攪拌30分鐘或數(shù)小時(shí)后,用水(50ml)稀釋,用etoac(50ml×3)萃取。將有機(jī)層干燥,濃縮并通過(guò)快速柱(dcm:meoh=20:1)純化,形成11,也稱為mc-cbdk-cit-pab-cl,為灰色固體。lcms:(5-95,ab,1.5min),0.696min,m/z=589.0[m+1]+。實(shí)施例15(s)-4-(2-(1-(5-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)戊基氨基甲酰基)環(huán)丁烷甲酰胺基)-5-脲基戊酰氨基)芐基4-硝基苯基碳酸酯12向無(wú)水dmf中的(s)-n-(5-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)戊基)-n-(1-(4-(羥基甲基)苯基氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)環(huán)丁烷-1,1-二甲酰胺10的溶液中加入二異丙基乙胺(diea),然后加入pnp碳酸酯(碳酸二(4-硝基苯基)酯)。將反應(yīng)溶液在室溫(r.t.)下攪拌4小時(shí),混合物通過(guò)制備型hplc純化,得到12。lcms(esi):m+h+=736.29。實(shí)施例16mc-(cbdk-cit)-pab-(二甲基,氟代pipbor)-pla-1的制備按照pla-2的方法,使(s)-n-(1-(4-(氯甲基)苯基氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)-n-(5-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)戊基)環(huán)丁烷-1,1-二甲酰胺11和氟代利福霉素衍生物二甲基氟代pipbor13(lcms(esi):m+h+=945.43)反應(yīng)形成mc-(cbdk-cit)-pab-(二甲基,氟代pipbor)-pla-1,表2。lcms(esi):m+h+=1499.7實(shí)施例17mc-(cbdk-cit)-pab-(二甲基pipbor)-pla-2的制備將dmf中的(s)-n-(1-(4-(氯甲基)苯基氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)-n-(5-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)戊基)環(huán)丁烷-1,1-二甲酰胺11(0.035mmol)溶液冷卻至0℃,加入二甲基pipbor6(10mg,0.011mmol)。將混合物用另外0.5ml的dmf稀釋。在空氣中攪拌30分鐘,加入n,n-二異丙基乙胺(diea,10μl,0.05mmol),在空氣中將反應(yīng)物攪拌過(guò)夜。通過(guò)lc/ms觀察到50%的所需產(chǎn)物。加入另外的0.2當(dāng)量n,n-二異丙基乙胺堿,同時(shí)在空氣中將反應(yīng)物再攪拌6小時(shí),直到反應(yīng)停止進(jìn)行。反應(yīng)混合物用dmf稀釋,并在hplc(20-60%acn/hcooh在h2o中)中純化,得到mc-(cbdk-cit)-pab-(二甲基pipbor)-pla-2,表2。lcms(esi):m+h+=1481.8,產(chǎn)率31%。實(shí)施例18mc-((r)-噻吩-3-基-cbdk-cit)-pab-(二甲基pipbor)(pla-3)的制備按照pla-2的方法,將(n-((s)-1-(4-(氯甲基)苯基氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)-n-((r)-5-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)戊基氨基)-3-氧代-1-(噻吩-3-基)丙基)環(huán)丁烷-1,1-二甲酰胺14(lcms(esi):m+h+=742.3)和二甲基pipbor6反應(yīng)得到mc-((r)-噻吩-3-基-cbdk-cit)-pab-(二甲基pipbor)(pla-3,表2)。lcms(esi):m+h+=1633.9實(shí)施例19mc-((s)-噻吩-3-基-cbdk-cit)-pab-(二甲基pipbor)(pla-4)按照pla-2的方法,將(n-((r)-1-(4-(氯甲基)苯基氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)-n-((r)-5-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)戊基氨基)-3-氧代-1-(噻吩-3-基)丙基)環(huán)丁烷-1,1-二甲酰胺15(lcms(esi):m+h+=742.3)和二甲基pipbor6反應(yīng)得到mc-((r)-噻吩-3-基-cbdk-cit)-pab-(二甲基pipbor)(pla-4,表2)。lcms(esi):m+h+=1633.9實(shí)施例20mc-(cbdk-cit)-pabc-(pipbor)(pla-5)的制備哌啶基苯并噁嗪并利福霉素(pipbor)5(15mg,0.0167mmol)、然后(s)-4-(2-(1-(5-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)戊基氨基甲?;?環(huán)丁烷甲酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)芐基4-硝基苯基碳酸酯12(12mg,0.0167mmol)稱重后加入小瓶中。加入二甲基甲酰胺dmf(0.3ml),然后加入二異丙基乙胺diea(0.006ml,0.0334mmol),并將反應(yīng)物在室溫下攪拌2小時(shí)。反應(yīng)溶液通過(guò)hplc(30-70%mecn/水+1%甲酸)直接純化,得到mc-(cbdk-cit)-pabc-(pipbor)(pla-5,表2)。lcms(esi):m+h+=1496.5實(shí)施例21mc-(cbdk-cit)-pabc-(哌嗪btr)(pla-6)的制備按照pla-5的步驟,哌啶利福霉素衍生物即哌嗪bor16(lcms(esi):m+h+=885.4)和(s)-4-(2-(1-(5-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)戊基氨基甲?;?環(huán)丁烷甲酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)芐基4-硝基苯基碳酸酯12反應(yīng),得到mc-(cbdk-cit)-pabc-(哌嗪btr)(pla-6,表2)。lcms(esi):m+h+=1482.5雖然為了清楚理解的目的,已經(jīng)通過(guò)說(shuō)明和示例的方式對(duì)前述發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)描述,但這些描述和實(shí)施例不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明的范圍。在整個(gè)說(shuō)明書(shū)中引用的所有專利、專利申請(qǐng)和參考文獻(xiàn)通過(guò)引用明確地并入本文。當(dāng)前第1頁(yè)12