本發(fā)明是關(guān)于使用亞丁基苯酞以預(yù)防及/或治療口腔粘膜下纖維化癥(oralsubmucousfibrosis，osf)的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

口腔粘膜下纖維化癥為一種口腔癌的癌前病變(pre-cancerouscondition)，但并非口腔癌，主要特征在于口腔粘膜下組織和深層結(jié)締組織的發(fā)炎反應(yīng)以及纖維化現(xiàn)象，若是不及時(shí)加以治療，極有可能進(jìn)一步演變成口腔癌。

流行病學(xué)的研究指出，嚼食檳榔是造成口腔粘膜下纖維化癥最主要的原因，病灶常見(jiàn)于頰粘膜、其次是腭部(palatalportion)與臼齒后區(qū)，患部黏膜首先會(huì)變白，接著反復(fù)出現(xiàn)潰瘍或水泡，最后粘膜會(huì)失去彈性，造成患者無(wú)法將口張大，嚴(yán)重影響進(jìn)食、刷牙、口腔檢查與治療等日?？谇还δ堋２≡钊舭l(fā)生于口咽之間的軟腭部位，可能導(dǎo)致吞咽困難、懸雍垂萎縮或變形?；颊呖趦?nèi)常有灼熱、刺痛、干澀的感覺(jué)，對(duì)辛辣、熱等食物極度敏感，但味覺(jué)卻是減退。

目前并沒(méi)有可有效預(yù)防及/或治療口腔粘膜下纖維化癥的藥物，通常系依賴類固醇注射來(lái)減少膠原蛋白在口腔黏膜下組織中的含量、或是經(jīng)由外科手術(shù)或雷射來(lái)切除病變組織。然而，類固醇注射僅可減緩癥狀，并不能治愈口腔粘膜下纖維化癥，且經(jīng)常伴隨著月亮臉、變胖、水牛肩、骨質(zhì)疏松、皮膚變薄、水腫、容 易感染、青春痘、長(zhǎng)不高、血糖上升、感染率增加、口腔霉菌感染、體毛增多、傷口愈合力變差等副作用。此外，經(jīng)由外科手術(shù)或雷射外科手術(shù)及雷射切除較大的病變組織后，傷口愈合時(shí)容易收縮而形成疤痕，需要考量張口受限以及美觀的問(wèn)題，于此，口腔外科醫(yī)師會(huì)考慮以植皮的方式補(bǔ)救，但是植皮的部位會(huì)有遮掩早期復(fù)發(fā)病變的隱憂。以外科手術(shù)或雷射對(duì)年長(zhǎng)的患者或病灶太大的患者進(jìn)行治療時(shí)，更是要考慮手術(shù)的傷害性、病人身體抵抗力與生活品質(zhì)的問(wèn)題。

有鑒于上述關(guān)于口腔粘膜下纖維化癥治療的問(wèn)題，目前醫(yī)藥界仍致力于開(kāi)發(fā)可預(yù)防及/或治療口腔粘膜下纖維化癥的藥物。本案發(fā)明人研究后發(fā)現(xiàn)，亞丁基苯酞可有效抑制口腔粘膜下組織細(xì)胞進(jìn)行上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymaltransition，emt)、抑制口腔粘膜下組織細(xì)胞分化成肌纖維母細(xì)胞(myofibroblasts)、及抑制肌纖維母細(xì)胞的活化，故可抑制口腔粘膜下組織的膠原蛋白累積、抑制口腔粘膜下組織細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)的收縮，用于提供預(yù)防及/或治療口腔粘膜下纖維化癥的藥物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一目的，在于提供一種使用一活性成分于制造一藥劑的用途，其中該活性成分是選自以下群組：亞丁基苯酞(butylidenephthalide，bp)、其醫(yī)藥上可接受的鹽、及前述的組合，且該藥劑是用于預(yù)防及/或治療口腔粘膜下纖維化癥(oralsubmucousfibrosis，osf)。較佳地，該藥劑為一針劑、錠劑、口服液、或涂抹劑。

本發(fā)明的另一目的，在于提供一種使用預(yù)防及/或治療口腔粘膜下纖維化癥(oralsubmucousfibrosis，osf)的醫(yī)藥組合物，其包含一有效量的活性成分以及一醫(yī)藥上可接受的載劑，其中該活性成分是選自以下群組：亞丁基苯酞(butylidenephthalide，bp)、其醫(yī)藥上可接受的鹽、及前述的組合。較佳地，該醫(yī)藥組合物為一針劑、錠劑、口服液、或涂抹劑。

本發(fā)明的又一目的，在于提供一種預(yù)防及/或治療口腔粘膜下纖維化癥(oralsubmucousfibrosis，osf)的方法，其包含于有需要的個(gè)體中投予有效量的活性成分，其中該活性成分是選自以下群組：亞丁基苯酞(bp)、其醫(yī)藥上可接受的鹽、或前述的組合。其中，該活性成分可以一針劑、錠劑、口服液、或涂抹劑的型式施用到該個(gè)體。

本發(fā)明的詳細(xì)技術(shù)內(nèi)容及部分具體實(shí)施態(tài)樣，將描述于以下內(nèi)容中，以供本發(fā)明所屬領(lǐng)域具通常知識(shí)者據(jù)以明了本發(fā)明的特征。

附圖說(shuō)明

圖1為顯示經(jīng)不同濃度的亞丁基苯酞(bp)處理的正?？谇活a粘膜的初代纖維母細(xì)胞(buccalmucosalfibroblasts，bmfs；包括「bmf-1(即，)」及「bmf-2(即，■)」)以及纖維化的口腔頰粘膜的初代纖維母細(xì)胞(fibroticbuccalmucosalfibroblasts，fbmfs；包括「fbmf-1(即，▲)」及「fbmf-2(即，■)」的相對(duì)存活率(％)的曲線圖；

圖2a、2b為顯示以即時(shí)定量聚合酶鏈鎖反應(yīng)(quanititative real-timepolymerasechainreaction，q-pcr)分析經(jīng)不同濃度的亞丁基苯酞(bp)處理的fbmf-1或fbmf-2的twist、snail、及zeb1基因的相對(duì)表現(xiàn)量(倍數(shù))的長(zhǎng)條圖，其中圖2a是fbmf-1的結(jié)果，圖2b則是fbmf-2的結(jié)果；

圖3a為顯示bmfs及經(jīng)不同濃度的亞丁基苯酞(bp)處理的fbmfs自上層盤(pán)移行至下層盤(pán)的情形的照片圖，其中染有紫色的部分即為細(xì)胞；

圖3b為顯示bmfs(包括bmf-1(藍(lán)色長(zhǎng)條)、以及bmf-2(紅色長(zhǎng)條))以及經(jīng)不同濃度的亞丁基苯酞(bp)處理的fbmfs(包括fbmf-1(藍(lán)色長(zhǎng)條)、以及fbmf-2(紅色長(zhǎng)條))的相對(duì)移行能力(％)的長(zhǎng)條圖；

圖4a、4b為顯示以即時(shí)定量聚合酶鏈鎖反應(yīng)(q-pcr)分析經(jīng)不同濃度的亞丁基苯酞(bp)處理的fbmf-1或fbmf-2的α-sma、col1a1、及s100a4基因的相對(duì)表現(xiàn)量(倍數(shù))的長(zhǎng)條圖，其中圖4a是fbmf-1的結(jié)果，圖4b則是fbmf-2的結(jié)果；

圖5a為顯示bmfs以及經(jīng)不同濃度的亞丁基苯酞(bp)處理的fbmfs引起膠體收縮的情形的照片圖，其中，綠色虛線所圈選的范圍即系該膠體；以及

圖5b為顯示膠體經(jīng)由bmfs(包括bmf-1(藍(lán)色長(zhǎng)條)、以及bmf-2(紅色長(zhǎng)條))以及經(jīng)不同濃度的亞丁基苯酞(bp)處理的fbmfs(包括fbmf-1(藍(lán)色長(zhǎng)條)、以及fbmf-2(紅色長(zhǎng)條))誘導(dǎo)收縮后的相對(duì)膠體面積(％)的長(zhǎng)條圖。

具體實(shí)施方式

以下將描述根據(jù)本發(fā)明的部分具體實(shí)施態(tài)樣；但是，在不背 離本發(fā)明精神下，本發(fā)明尚可以多種不同形式的態(tài)樣來(lái)實(shí)踐，不應(yīng)將本發(fā)明保護(hù)范圍解釋為限于說(shuō)明書(shū)所陳述者。此外，除非文中有另外說(shuō)明，于本說(shuō)明書(shū)中(尤其是在后述專利申請(qǐng)范圍中)所使用的「一」、「該」及類似用語(yǔ)應(yīng)理解為包含單數(shù)及復(fù)數(shù)形式。另，本說(shuō)明書(shū)中所使用的「約」、「大約」或「近乎」等詞，實(shí)質(zhì)上代表與所述的數(shù)值相差在20％以內(nèi)者，較佳在10％以內(nèi)者，且更佳在5％以內(nèi)者。

于本說(shuō)明書(shū)中，所謂「預(yù)防(prevention、prevent、preventing、preventive、及prophylaxix)」，是指將在疾病或病癥發(fā)病之前，使其發(fā)病或惡化得以回避、減至最小、或變得困難的能力；所謂「治療」，是指包括根除、去除、逆轉(zhuǎn)、緩和、改善、或控制一疾病或病癥；所謂「有效量」或「治療有效量」，是指投予至個(gè)體時(shí)，可有效至少部分改善懷疑個(gè)體的病情的化合物用量；所謂「?jìng)€(gè)體」是指哺乳動(dòng)物，哺乳動(dòng)物可為人類或非人動(dòng)物。

經(jīng)研究證實(shí)，在口腔粘膜下纖維化的過(guò)程中，口腔粘膜下的組織細(xì)胞會(huì)進(jìn)行上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymaltransition，emt)，并分化成為肌纖維母細(xì)胞(myofibroblasts)。其中，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(emt)時(shí)，細(xì)胞中的twist、snail、及zeb1等基因會(huì)高度表現(xiàn)，同時(shí)細(xì)胞與細(xì)胞之間的極性會(huì)漸漸喪失，且細(xì)胞的移行能力增加而容易爬行及侵襲，參與組織纖維化。肌纖維母細(xì)胞是一種會(huì)表現(xiàn)α-sma、col1a1、及s100a4等標(biāo)記基因且具備高度移動(dòng)性的細(xì)胞，其活化后會(huì)分泌過(guò)多的胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ecm)，例如纖網(wǎng)蛋白(fibronectin)、膠原蛋白(collagen)，并誘導(dǎo)組織細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)的收縮，因而促進(jìn) 組織纖維化。亦經(jīng)證實(shí)，過(guò)多的胞外基質(zhì)累積亦與口腔粘膜下纖維化癥的發(fā)生密切相關(guān)。前述可參見(jiàn)例如：theroleofepithelial-mesenchymaltransitioninoralsquamouscellcarcinomaandoralsubmucousfibrosis.clinchimacta.aug；383(1-2):51-56(2007)、oralsubmucousfibrosis:anupdateonetiologyandpathogenesis-areview.ramaunivjdentsci.mar；2(1):24-33(2015)、oralsubmucousfibrosis:reviewonaetiologyandpathogenesis.oraloncol.jul；42(6):561-568(2006)、以及molecularpathogenesisoforalsubmucousfibrosis-acollagenmetabolicdisorder.joralpatholmed.jul；34(6):321-328(2005)，該等文獻(xiàn)的全文并于此處以供參考。

由于組織細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(emt)及肌纖維母細(xì)胞的活化與口腔粘膜下纖維化密切相關(guān)，咸信若能抑制口腔粘膜下組織細(xì)胞進(jìn)行上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(emt)、抑制口腔粘膜下組織細(xì)胞分化成肌纖維母細(xì)胞、及/或抑制肌纖維母細(xì)胞的活化，即可有效抑制胞外基質(zhì)過(guò)度累積、抑制組織細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)的收縮，而可預(yù)防及/或治療口腔粘膜下纖維化癥。前述可參見(jiàn)例如：betal-drivedalkaloidup-regulateskeratinocytealphavbeta6integrinexpressionandpromotesoralsubmucousfibrosis.jpathol.feb；223(3):366-377(2011)、arecoline-inducedmyofibroblasttransdifferentiationfromhumanbuccalmucosalfibroblastsismediatedbyzeb1.jcellmolmed.apr；18(4):698-708(2014)、以及elevationofs100a4expressioninbuccalmucosalfibroblastsbyarecoline:involvementin thepathogenesisoforalsubmucousfibrosis.plosone.8(1):e55122(2013)，該等文獻(xiàn)之全文并于此處以供參考。

本案發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于纖維化的口腔粘膜下組織細(xì)胞，若以亞丁基苯酞(bp)進(jìn)行處理，可有效抑制該組織中的細(xì)胞進(jìn)行上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(emt)，尤其可抑制該細(xì)胞表現(xiàn)twist、snail、及zeb1等基因、及抑制該細(xì)胞的爬行與侵襲，故可達(dá)到抑制口腔粘膜下組織纖維化的效果。

本案發(fā)明人另發(fā)現(xiàn)，以亞丁基苯酞(bp)對(duì)纖維化的口腔粘膜下組織細(xì)胞進(jìn)行處理，可有效抑制該組織中細(xì)胞分化成肌纖維母細(xì)胞、及抑制肌纖維母細(xì)胞活化，尤其可抑制該組織細(xì)胞表現(xiàn)α-sma、col1a1、及s100a4等基因、及抑制組織細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)的收縮，而可達(dá)到抑制口腔粘膜下組織纖維化的效果。

因此，本發(fā)明是關(guān)于提供預(yù)防及/或治療口腔粘膜下纖維化癥的藥劑、醫(yī)藥組合物、及方法。其中，該藥劑的制造是使用一活性成分，該醫(yī)藥組合物包含一有效量的活性成分以及一醫(yī)藥上可接受的載劑，該方法包含將有效量的活性成分投予至有需要的個(gè)體中。根據(jù)本發(fā)明的藥劑、醫(yī)藥組合物、及方法，該活性成分是選自以下群組：亞丁基苯酞(bp)、其醫(yī)藥上可接受的鹽、或前述的組合。

于本發(fā)明的藥劑、醫(yī)藥組合物、及方法中，該醫(yī)藥上可接受的鹽的例子包含但不限于：堿金屬鹽類，如鈉鹽及鉀鹽；堿土金屬鹽類，如鈣鹽、鎂鹽及鋇鹽；過(guò)渡金屬鹽類，如鋅鹽、銅鹽、鐵鹽、鈷鹽、鈦鹽、釩鹽；鋁鹽；錫鹽；烷醇胺鹽類如二乙醇胺鹽、2-胺基-2-乙基-1,3-丙二醇鹽、及三乙醇胺鹽；雜環(huán)胺鹽類如嗎 福林鹽(morpholinesalts)、哌嗪鹽(piperazinesalts)、及哌啶鹽(piperidinesalts)；以及堿胺鹽類如銨鹽、精胺酸鹽、離胺酸鹽、及組胺酸鹽等。較佳地，于本發(fā)明的藥劑、醫(yī)藥組合物、及方法中所使用的活性成分是亞丁基苯酞(bp)。

當(dāng)使用本發(fā)明的藥劑或醫(yī)藥組合物以預(yù)防及/或治療口腔粘膜下纖維化癥時(shí)，該藥劑或醫(yī)藥組合物可視所欲的投藥形式而呈對(duì)應(yīng)的合宜劑型。舉例言之，但不以此為限，該藥劑或醫(yī)藥組合物可經(jīng)由皮內(nèi)、肌肉、腹膜內(nèi)、靜脈、皮下、口服、皮膚、以及黏膜等投藥途徑而投予至有需要的個(gè)體。

以適于皮內(nèi)、肌肉、腹膜內(nèi)、靜脈、皮下等投藥途徑的劑型為例，本發(fā)明的藥劑或醫(yī)藥組合物可以針劑的型式提供，但不以此為限。舉例言之，該針劑的例子是包括靜脈輸注液、乳劑靜脈輸注液、干粉注射劑、懸液注射劑、以及干粉懸液注射劑，但不以此為限。此外，可將該藥劑或醫(yī)藥組合物制備成一注射前固體，以可溶于其他溶液或懸浮液中的劑型、或可乳化的劑型提供該注射前固體，并于投予至該有需要的個(gè)體之前，將該注射前固體溶于其他溶液或懸浮液中、或?qū)⑵淙榛?，提供所欲的注射劑?/p>

以適于口服投藥的劑型為例，本發(fā)明所提供的藥劑或醫(yī)藥組合物可以例如錠劑、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑等固體型式、或是例如口服液、糖漿劑、醑劑(spirit)、酏劑(elixir)、酊劑(tincture)等液體型式提供，但不以此為限。

以適于皮膚、黏膜等投藥途徑的劑型為例，本發(fā)明藥劑或醫(yī)藥組合物可以例如乳液、乳霜、凝膠(水凝膠)、膏狀物(分散膏、軟膏)等涂抹劑、漱口劑、洗劑、噴霧劑、或是貼劑(貼片)的 型式提供，但不以此為限。

較佳地，本發(fā)明的藥劑及醫(yī)藥組合物是以針劑、錠劑、口服液、或涂抹劑的型式提供。

于本發(fā)明中，視投藥途徑及/或投藥形式而定，可選用合宜的醫(yī)藥上可接受的載劑以提供本發(fā)明藥劑，另外，亦可于本發(fā)明醫(yī)藥組合物中包含一醫(yī)藥上可接受的載劑。舉例言之，該醫(yī)藥上可接受的載劑的例子包含但不限于：溶劑(緩沖液、水、食鹽水、葡萄糖(dextrose)、甘油、乙醇或其類似物、及前述的組合)、油性溶劑、稀釋劑、安定劑、吸收延遲劑、崩散劑、乳化劑、抗氧化劑、粘合劑、結(jié)合劑、增粘劑、增溶劑、分散劑、懸浮化劑、潤(rùn)滑劑、吸濕劑、固體載劑(例如淀粉、及皂土(bentonite))。

視需要地，可將本發(fā)明的藥物或醫(yī)藥組合物封裝于微脂體、微粒子、或微膠囊等藥物輸送系統(tǒng)中，再投予至有需要的個(gè)體，以提高藥物或醫(yī)藥組合物中的活性成分的輸送效率，只要構(gòu)成該藥物輸送系統(tǒng)的成分對(duì)該活性成分(即，亞丁基苯酞(bp)、其醫(yī)藥上可接受的鹽、或前述的組合)的所欲效益沒(méi)有不利的影響即可。

視需要地，亦可于本發(fā)明所提供的藥劑或醫(yī)藥組合物中另含有合宜用量的添加劑，例如可提高該藥劑或醫(yī)藥組合物于服用時(shí)的口適感及視覺(jué)感受的調(diào)味劑(例如蔗糖)、調(diào)色劑、著色劑等，以及可改善該藥劑或醫(yī)藥組合物的穩(wěn)定性及儲(chǔ)存性的緩沖劑、保存劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑等。此外，該藥劑或醫(yī)藥組合物可視需要另含一或多種其他活性成分(例如類固醇)，或者與含該一或多種其他活性成分的藥物并用，以進(jìn)一步加強(qiáng)該藥劑或醫(yī) 藥組合物的功效或增加制劑配方的運(yùn)用靈活性與調(diào)配度，只要該其他活性成分對(duì)本發(fā)明的活性成分(即，亞丁基苯酞(bp)、其醫(yī)藥上可接受的鹽、或前述的組合)的所欲效益沒(méi)有不利的影響即可。

可以一日一次、一日多次、或數(shù)日一次等不同頻率施用本發(fā)明所提供的藥劑或醫(yī)藥組合物，端視投予個(gè)體的年齡、體重、及健康況狀而異。舉例言之，當(dāng)以口服方式施用至一個(gè)體以預(yù)防及/或治療口腔粘膜下纖維化癥時(shí)，以亞丁基苯酞(bp)計(jì)，其用量為每天約5毫克/公斤體重至約500毫克/公斤體重，較佳為每天約10毫克/公斤體重至約120毫克/公斤體重，更佳為每天約20毫克/公斤體重至約90毫克/公斤體重，其中，該單位『毫克/公斤體重』是指每公斤體重個(gè)體所須的投藥量。但是，對(duì)于急性患者而言，其用量可視實(shí)際需要而酌增，例如增加至數(shù)倍或數(shù)十倍。

此外，亦可將本發(fā)明所提供的藥劑或醫(yī)藥組合物與以下之一者并用，以預(yù)防及/或治療口腔粘膜下纖維化癥：外科手術(shù)治療、及雷射治療。

根據(jù)本發(fā)明的預(yù)防及/或治療口腔粘膜下纖維化癥的方法中，有關(guān)該活性成分(即，亞丁基苯酞(bp)、其醫(yī)藥上可接受的鹽、或前述的組合)的投予途徑、投予形式、適用劑量、以及相關(guān)治療的應(yīng)用，均如上述的說(shuō)明。

茲以下列實(shí)施例進(jìn)一步例示說(shuō)明本發(fā)明。其中該等實(shí)施例僅提供作為說(shuō)明，而非用以限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明保護(hù)范圍如權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍所示。

實(shí)施例

[制備實(shí)施例]：

a.細(xì)胞的培養(yǎng)

將二組取自正常口腔頰粘膜的初代纖維母細(xì)胞(buccalmucosalfibroblasts；以下簡(jiǎn)稱為「bmf-1」及「bmf-2」；或統(tǒng)稱為「bmfs」)、以及二組取自纖維化的口腔頰粘膜的初代纖維母細(xì)胞(fibroticbuccalmucosalfibroblasts；以下簡(jiǎn)稱為「fbmf-1」及「fbmf-2」；或統(tǒng)稱為「fbmfs」)，分別進(jìn)行以下處理：以每孔2x10⁴的細(xì)胞數(shù)分別接種(seed)于24孔盤(pán)中，并培養(yǎng)至8分滿(即，達(dá)到80％confluence)，再分別以不同濃度(0、12.5、25、50、100、或200微克/毫升)的亞丁基苯酞(bp)進(jìn)行處理，歷時(shí)48小時(shí)。

b.細(xì)胞總rna(totalrna)的萃取

以胰蛋白酶(trypsin)使[制備實(shí)施例]a所提供的各組細(xì)胞懸浮后，分別進(jìn)行以下步驟：(i)離心(1000rpm、5分鐘)后去除上清液；(ii)加入1毫升的trizol試劑(購(gòu)自invitrogenlifetechnologies公司)，混合均勻后，置于室溫下靜置5分鐘；(iii)加入100微升的bcp(bromochloropropane)并上下?lián)u晃使其混和均勻，再置于室溫下靜置5分鐘；(iv)離心(eppendorf離心機(jī)、f45-30-11轉(zhuǎn)子、4℃、12000rpm、15分鐘)后將上層液體移至新的離心小管，并于其中加入異丙酮(isopropanol)混和均勻，再置于室溫下靜置5分鐘；(v)離心(eppendorf離心機(jī)、f45-30-11轉(zhuǎn)子、4℃、12000rpm、10分鐘)后去除上清液，再以500微升的75％酒精清洗沈淀于管底的rna；(vi)離心(室溫、12000rpm、 5分鐘)后去除酒精層，并置于抽風(fēng)柜中風(fēng)干；以及(vii)以20微升的經(jīng)焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，depc)處理的水回溶rna沉淀物，以測(cè)量其于260奈米波長(zhǎng)下的吸光值，并計(jì)算rna濃度。

實(shí)施例1：評(píng)估亞丁基苯酞(bp)的細(xì)胞毒性

取[制備實(shí)施例]a所提供之各組細(xì)胞，分別進(jìn)行以下步驟：(i)去除24孔盤(pán)中的上清液，再于各孔中加入500微升的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide，簡(jiǎn)稱mtt)緩沖液(最終濃度為0.5毫克/毫升)；(ii)將孔盤(pán)放置于37℃、5％co2的培養(yǎng)箱中作用，歷時(shí)3個(gè)小時(shí)；(iii)去除上清液后，分別于各孔中加入1000微升的異丙醇，并將孔盤(pán)放置于震蕩器(shaker)上搖晃，歷時(shí)10分鐘；以及(iv)從各孔取200微升的混合溶液至96孔盤(pán)中，以分光光度計(jì)測(cè)定其于570奈米波長(zhǎng)下的吸光值，并換算成各組細(xì)胞的相對(duì)存活率(％)，結(jié)果示于圖1。

由圖1可知，于培養(yǎng)液中添加濃度為50微克/毫升以下的亞丁基苯酞(bp)，對(duì)正常頰黏膜的初代纖維母細(xì)胞(bmfs)以及纖維化頰黏膜的初代纖維母細(xì)胞(fbmfs)的生長(zhǎng)皆不會(huì)有影響。因此，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)是以濃度為0至50微克/毫升的亞丁基苯酞(bp)進(jìn)行。

實(shí)施例2：分析亞丁基苯酞(bp)于抑制口腔粘膜下組織細(xì)胞進(jìn)行上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymaltransition，emt)的效益

a.上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(emt)的標(biāo)記基因的表現(xiàn)量

已知細(xì)胞在進(jìn)行上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(emt)的過(guò)程中，twist、snail、及zeb1等基因的表現(xiàn)量會(huì)增加，故該等基因被視為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(emt)的標(biāo)記基因。本實(shí)驗(yàn)是通過(guò)即時(shí)定量聚合酶鏈鎖反應(yīng)(quanititativereal-timepolymerasechainreaction，q-pcr)，探討亞丁基苯酞(bp)是否會(huì)影響twist、snail、及zeb1等基因在口腔頰粘膜組織細(xì)胞中的表現(xiàn)。

首先，取[制備實(shí)施例]b所提供的總rna(各組取1微克)，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄作用，以提供互補(bǔ)去氧核醣核酸(cdna)。接著，以基因定量系統(tǒng)(prismabi7700sequencedetectingsystem，購(gòu)自美國(guó)appliedbiosystems公司)搭配特定基因的引子(如下表1所示)進(jìn)行即時(shí)定量聚合酶鏈鎖反應(yīng)(q-pcr)，以分析twist、snail、及zeb1等基因在經(jīng)不同濃度(0、25、或50微克/毫升)的亞丁基苯酞(bp)處理的fbmfs(包括fbmf-1、fbmf-2)中的表現(xiàn)。最后，以未經(jīng)亞丁基苯酞(bp)處理的細(xì)胞的結(jié)果為基準(zhǔn)，計(jì)算各組的相對(duì)基因表現(xiàn)量(倍數(shù))，結(jié)果示于圖2。

表1

由圖2的結(jié)果可知，不論是fbmf-1或fbmf-2，twist、snail、 及zeb1等基因的表現(xiàn)皆明顯隨著亞丁基苯酞(bp)的濃度提高而下降。前述結(jié)果顯示，亞丁基苯酞(bp)可有效抑制口腔粘膜下組織細(xì)胞進(jìn)行上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(emt)，故可用于預(yù)防及/或治療口腔粘膜下組織的纖維化。

b.口腔粘膜下組織細(xì)胞的爬行能力與侵襲能力

本研究進(jìn)一步以穿透式細(xì)胞移行試驗(yàn)系統(tǒng)(system，購(gòu)自英國(guó)corning公司)搭配孔徑大小為8微米的聚碳酸酯濾膜(polycarbonatemembrane，購(gòu)自英國(guó)corning公司)，探討亞丁基苯酞(bp)是否可抑制口腔粘膜下組織細(xì)胞的爬行能力與侵襲能力。

首先，于下層盤(pán)(lowerchamber)加入含有10％fbs(胎牛血清)的培養(yǎng)液，并將該聚碳酸酯濾膜裝置置于一細(xì)胞培養(yǎng)盤(pán)的底部，此稱為上層盤(pán)(upperchamber)。另一方面，取[制備實(shí)施例]a中的bmf-1、bmf-2、fbmf-1、fbmf-2細(xì)胞(各取2×10⁴個(gè)細(xì)胞)，分別與含有0、25、或50微克/毫升之亞丁基苯酞(bp)但不含血清的培養(yǎng)液(250微升)混合均勻，再將混合溶液注入上層盤(pán)裝置中。接著，將該穿透式細(xì)胞移行試驗(yàn)系統(tǒng)放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，誘使細(xì)胞移行，歷時(shí)24小時(shí)。將該穿透式細(xì)胞移行試驗(yàn)系統(tǒng)取出，將未自上層盤(pán)膜面移行至下層盤(pán)膜面的細(xì)胞移除后，以4％的聚甲醛(paraformaldehyde)固定該聚碳酸酯濾膜(10分鐘)，并以0.1％結(jié)晶紫(crystalviolet)進(jìn)行染色。最后，將該聚碳酸酯濾膜小心切下放置于載玻片上，于顯微鏡下以100倍的放大倍率進(jìn)行觀察(各組皆觀察5個(gè)不同視野)、拍照紀(jì)錄，并以未經(jīng)亞丁基苯酞(bp)進(jìn)行處理的bmfs的結(jié)果為基準(zhǔn)，將該膜上的 細(xì)胞數(shù)目換算成細(xì)胞的相對(duì)移行能力(％)。前述實(shí)驗(yàn)是進(jìn)行三重復(fù)，且結(jié)果是示于圖3a、3b，其中，圖3a中染有紫色的部分即是自上層盤(pán)移行至下層盤(pán)的細(xì)胞，圖3b則是將該三重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果平均而得到的細(xì)胞相對(duì)移行能力(％)。

由圖3a、3b的結(jié)果可知，相較于「bmfs組」，「fbmfs組」自上層盤(pán)移行至下層盤(pán)的細(xì)胞明顯較多。然而，在「fbmfs組」組中，若細(xì)胞是先經(jīng)亞丁基苯酞(bp)處理，則自上層盤(pán)移行至下層盤(pán)的細(xì)胞是明顯隨著亞丁基苯酞(bp)的濃度提高而減少。前述結(jié)果顯示，相較于正常的口腔粘膜下組織細(xì)胞，纖維化的口腔粘膜下組織細(xì)胞具有較強(qiáng)的爬行能力與侵襲能力，容易進(jìn)行上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(emt)，而亞丁基苯酞(bp)可有效抑制口腔粘膜下組織細(xì)胞的爬行能力與侵襲能力。此即，亞丁基苯酞(bp)可有效抑制口腔粘膜下組織細(xì)胞進(jìn)行上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(emt)，故可用于預(yù)防及/或治療口腔粘膜下組織的纖維化。

實(shí)施例3：分析亞丁基苯酞(bp)于抑制口腔粘膜下組織細(xì)胞分化成肌纖維母細(xì)胞的效益

已知在組織發(fā)生纖維化的過(guò)程中，組織中的細(xì)胞會(huì)分化、轉(zhuǎn)變成肌纖維母細(xì)胞，而α-sma、col1a1、及s100a4等基因系肌纖維母細(xì)胞的標(biāo)記基因。因此，本實(shí)驗(yàn)是通過(guò)即時(shí)定量聚合酶鏈鎖反應(yīng)(q-pcr)，探討亞丁基苯酞(bp)是否會(huì)抑制α-sma、col1a1、及s100a4等基因在纖維化口腔頰粘膜組織的細(xì)胞中的表現(xiàn)。

取[制備實(shí)施例]b所提供的總rna(各組取1微克)，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄作用，以提供互補(bǔ)去氧核醣核酸(cdna)。接著，以基因定量系統(tǒng)(prismabi7700sequencedetectingsystem，購(gòu)自美國(guó) appliedbiosystems公司)搭配特定基因的引子(如下表2所示)進(jìn)行即時(shí)定量聚合酶鏈鎖反應(yīng)(q-pcr)，以分析α-sma、col1a1、及s100a4等基因在經(jīng)不同濃度(0、25、或50微克/毫升)的亞丁基苯酞(bp)處理的fbmfs(包括fbmf-1、fbmf-2)中的表現(xiàn)。最后，以未經(jīng)亞丁基苯酞(bp)處理的細(xì)胞的結(jié)果為基準(zhǔn)，計(jì)算各組的相對(duì)基因表現(xiàn)量(倍數(shù))，結(jié)果示于圖4。

表2

由圖4的結(jié)果可知，不論是fbmf-1或fbmf-2，α-sma、col1a1、及s100a4等基因的表現(xiàn)皆明顯隨著亞丁基苯酞(bp)的濃度提高而下降。前述結(jié)果顯示，亞丁基苯酞(bp)具有抑制口腔粘膜下組織細(xì)胞分化成肌纖維母細(xì)胞的效益，故可抑制口腔粘膜下組織的膠原蛋白累積，有效預(yù)防及/或治療口腔粘膜下組織的纖維化。

實(shí)施例4：分析亞丁基苯酞(bp)于抑制口腔黏膜下組織細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)收縮的效益

取[制備實(shí)施例]a中的bmf-1、bmf-2、fbmf-1、fbmf-2細(xì)胞，分別將前述細(xì)胞溶于0.5毫升的濃度為2毫克/毫升的膠原蛋白溶液(購(gòu)自sigma-aldrich)中，再將各該混合溶液移至24孔盤(pán)，并置于37℃、5％co2的培養(yǎng)箱中作用2小時(shí)，使膠原蛋白膠體凝結(jié)， 所獲得的膠體分別稱為「bmfs組」、以及「fbmfs組」。接著，將凝結(jié)的膠體脫離培養(yǎng)盤(pán)，加入0.5毫升的含有不同濃度(0、25、或50微克/毫升)的亞丁基苯酞(bp)的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，歷時(shí)48小時(shí)后，觀察各組膠體收縮的情形、拍照記錄，并使用影像分析軟體imagej(美國(guó)，國(guó)立衛(wèi)生研究院)，以未經(jīng)亞丁基苯酞(bp)處理的「bmfs組」的膠體面積為基準(zhǔn)，計(jì)算各組的相對(duì)膠體面積(％)。結(jié)果示于圖5a、5b，其中，圖5a顯示各組細(xì)胞所引起的膠體收縮的情形，而圖5b是顯示各組的相對(duì)膠體面積(％)。

由圖5a、5b可知，相較于「bmfs組」，「fbmf組」的膠體面積明顯較小，此即，膠體明顯有收縮的現(xiàn)象。然而，在「fbmfs組」當(dāng)中，若膠體中的細(xì)胞是先經(jīng)亞丁基苯酞(bp)處理，則該膠體收縮的現(xiàn)象會(huì)明顯改善，且改善的程度是隨著亞丁基苯酞(bp)的濃度上升而增加。前述結(jié)果顯示，亞丁基苯酞(bp)可有效抑制肌纖維母細(xì)胞的活化，而抑制肌纖維母細(xì)胞誘導(dǎo)的組織細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)收縮。

由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，亞丁基苯酞(bp)可有效抑制口腔粘膜下組織細(xì)胞進(jìn)行上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(emt)、抑制口腔粘膜下組織細(xì)胞分化成肌纖維母細(xì)胞、抑制肌纖維母細(xì)胞的活化，故可抑制口腔粘膜下組織的膠原蛋白累積、抑制口腔粘膜下組織細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)的收縮。

<110>長(zhǎng)弘生物科技股份有限公司

<120>亞丁基苯酞的應(yīng)用

<130>無(wú)

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<170>patentinversion3.5

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