本發(fā)明涉及醫(yī)藥領用領域，具體是一種二十二碳六烯酸結膜下注射液的制備方法及其應用。

背景技術：

dha(docosahexaenoicacid，二十二碳六烯酸，學名：全順一4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸，是一種重要的長鏈多元不飽和脂肪酸(c22h32o2)，屬于ω-3系列多元不飽和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacids，pufas)。由于缺乏δ9以上的去飽和酶，人和其他的哺乳動物無法自身合成dha，必須通過食物獲得，由此dha又被成為多不飽和必需脂肪酸。

dha是大腦和視網(wǎng)膜中含量最高的必需脂肪酸，其占多不飽和脂肪酸的比例分別為：大腦40％，視網(wǎng)膜60％，而神經元細胞膜中50％的重量是來自于dha。dha對于大腦的發(fā)育、注意力的培養(yǎng)以及視力的改善具有重要的影響，因此，國際脂肪酸及脂質研究學會建議孕婦及哺乳婦女每日的dha攝入量為300mg。dha的營養(yǎng)干預對嬰幼兒健康成長極為重要，孕期合理進行dha營養(yǎng)補充有利于優(yōu)生優(yōu)育。在人體各組織細胞中，視網(wǎng)膜細胞中的dha含量最高，能有效保護視網(wǎng)膜、顯著改善視力。充足的dha能防止視網(wǎng)膜血栓的形成，阻止脂質滲出，從而有效抑制視網(wǎng)膜微血管病變。近期大量流行病學研究調查顯示，dha的攝取可以有效降低炎癥疾病及自身免疫疾病的發(fā)生率，由此推斷，dha具有抗炎、免疫抑制的作用。

干眼癥是指由于淚水質、量或動力學發(fā)生異常而導致的淚膜穩(wěn)定性下降，繼而引發(fā)眼部不適和(或)眼球表面損害為特征的多種疾病的總稱，又稱為角結膜干燥癥。2007年國際干眼專題研究報告指出：干眼是一種多方面因素(淚液和眼表)誘發(fā)的眼表疾病，其可以引起患者眼部不適、淚膜不穩(wěn)定、視力障礙，嚴重者可以造成眼球表面損傷，同時干眼伴有淚膜滲透性增加以及眼表免疫炎癥反應。根據(jù)美國婦女健康研究項目(whs)、醫(yī)師健康研究項目(phs)以及其他研究項目統(tǒng)計，在美國，約有共計491萬50歲以上的老年干眼病患者(323萬女性和168萬男性)，根據(jù)流行病學統(tǒng)計研究分析估測，目前約有5％-35％以上不同年齡段的干眼病患者。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種用于干眼病的治療與預防的二十二碳六烯酸結膜下注射液的制備方法及其應用，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：

一種二十二碳六烯酸結膜下注射液的制備方法，取濃度為250mg/ml的二十二碳六烯酸原液溶于乙醇中，用液氮氣流緩慢蒸發(fā)乙醇至液體完全消失，加入生理鹽水稀釋二十二碳六烯酸原液溶至8～12μg/ml，即得。

一種所述的二十二碳六烯酸結膜下注射液的應用，將濃度為8～12μg/ml的二十二碳六烯酸結膜下注射液用于治療和預防眼表干眼癥疾病，每次注射量為4～6μl。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明經動物實驗驗證，二十二碳六烯酸通過結膜下注射給藥，能夠有效抑制效應t細胞(th1輔助細胞和th17輔助細胞)的激活，進而有效調控眼表面的免疫炎癥反應以及促進淚腺組織功能恢復，顯著緩解眼表角結膜炎癥損傷等干燥癥狀，從而達到預防和治療干眼癥的目的。

附圖說明

圖1為二十二碳六烯酸的結構式圖。

圖2為二十二碳六烯酸結膜下注射液注射后的效果示范圖。

圖3為小鼠角膜熒光素鈉染色觀察圖。

圖4為小鼠角膜熒光素鈉染色評分值和角膜淚液分泌值比較圖。

圖5為結膜組織的pas染色對照圖。

圖6為結膜組織中杯狀細胞計數(shù)對照圖。

圖7為效應th1輔助細胞表達的陽性率比較圖。

圖8為效應th1輔助細胞表達的陽性率的效果圖。

圖9為效應th17輔助細胞表達的陽性率比較圖。

圖10為效應th17輔助細胞表達的陽性率效果圖。

具體實施方式

下面將結合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

實施例1

見圖2，dha注射液結膜下注射后效果示范圖。20只健康c57bl/6j黑色雌性小鼠(18～20g)分為實驗組(10只)與對照組(10只)，使用鹽酸氯胺酮和甲苯噻嗪的混合液將小鼠麻醉后，充分暴露眼球球結膜，使用3號(30g)針頭以水平方向與眼球成約15°角，將針 頭刺入距小鼠眼角膜緣約1～2mm顳側的球結膜下，輕挑起球結膜，后使用hamilton701rntlc注射器(10μl，針頭26sg)進針約2毫mm，緩慢將5μl(實驗組：dha注射液；對照組：生理鹽水注射液)注射液注入眼角，該處可見球結膜成透明魚泡樣隆起。注射完畢后滴少量不含防腐劑的人工淚液，將小鼠放回籠中。結膜下注射分別在干眼造模前24小時、造模后72小時(3天)、造模后192小時(7天)進行。

實施例2

見圖3-4，結膜下注射dha注射液后小鼠眼表干眼評估的實驗組與對照組的比較。將實驗組(10只)與對照組(10只)小鼠在進行結膜注射24小時后，使用濃度為0.5mg/ml的氫溴酸東莨菪堿注射液大腿兩側交替進行皮下注射(1ml/次，3次/日)，并將小鼠暴露在持續(xù)的氣流中(濕度＜30％，每天至少18h)，以此進行小鼠干眼模型誘導。持續(xù)10天后，對各組小鼠進行角膜上皮熒光素鈉染色及淚液分泌試驗。

圖3，角膜上皮熒光素鈉染色，小鼠結膜囊內滴入5μl液態(tài)熒光素鈉(10mg/ml)60s后，在顯微鏡鈷藍光下觀察角膜上皮熒光素鈉著色情況并評分，評分結果見圖4(a)。

圖4(a)，將角膜平均分為4個象限并分別評分，將角膜四個象限及鼻、顳側球結膜所有分值相加即得最后分值。評分標準：無著色：0分；點狀著色，1分；片狀著色，2分。將每個區(qū)域的分值相加得到最后的分值(總分：12分)。結果證實：dha注射液組角膜上皮熒光素鈉染色顯著低于對照組，dha注射液顯著緩解角膜上皮損傷。

圖4(b)，淚液分泌試驗，輕輕拉開小鼠下眼瞼，用鑷子夾持酚紅棉線，置于小鼠眼外眥部下結膜囊中，停留15s后取出。測量被淚液浸濕的紅色部分長度，每只眼重復測試3次取平均值(每次測試間隔30min)，實驗中應避免接觸或劃傷小鼠角膜上皮。結果證實：dha注射液組淚液分泌顯著高于對照組，dha注射液明顯促進小鼠淚液分泌。

實施例3

見圖5-7，測量結束后，頸椎脫白法處死小鼠，取整個眼球，冰凍切片，進行pas染色，光鏡下觀察。并取小鼠新鮮頸部淋巴結進行消化、分離并行流式細胞計數(shù)，檢測干眼小鼠頸部淋巴結th1輔助細胞和th17輔助細胞數(shù)量的變化。

圖5和圖6，結膜組織的pas染色和杯狀細胞計數(shù)：將包括上下眼瞼在內的整個眼球放入組織冰凍切片oct包埋劑中，迅速放入-80℃冰箱中凍存至少2小時，取出后冰凍切片為5μm厚的標本，用細毛筆將切片均勻整齊地平鋪在載玻片上，使用4％多聚甲醛進行固定后，參照試劑操作說明進行pas染色，即用0.5％強氧化劑過碘酸氧化后用席夫試劑進一步處理，以胞質染色深粉紅者確認為結膜杯狀細胞，分別計數(shù)并取平均值。結果證實： dha注射液組結膜杯狀細胞密度顯著高于對照組，dha注射液顯著提高結膜杯狀細胞密度。

圖7-10，效應th1(圖7和圖8)、th17(圖9和圖10)輔助細胞表達的陽性率比較：分離實驗組和對照組的小鼠頸部淋巴結，制備成細胞懸浮液，用直接熒光標記法測定，采用異硫氫酸熒光黃(fitc)和藻紅蛋白(pe)熒光素。每份標本分3管分別標記cd4-fitc、ifnγ-pe或il17-pe及陰性對照管，各管加相應的單克隆抗體10μl(美國bd公司)及染色緩沖液，反應30min，1000轉離心5min，棄上清液，pbs液洗滌2～3次，加pbs緩沖液400μl，混勻后使用流式細胞儀(lsrii，美國bd公司)檢測。結果證實：dha注射液組效應th1、th17輔助細胞表達的陽性率顯著低于對照組，dha注射液顯著抑制效應t細胞的激活。

綜上所述，以上結果表明，二十二碳六烯酸(dha)結膜下注射液通過降低效應t細胞的激活進而有效調控眼表面的免疫炎癥反應，通過促進淚液分泌、提高杯狀細胞密度進而促進淚腺組織功能恢復，從而對眼表角結膜干眼癥引發(fā)的角膜上皮損傷等干燥癥狀具有預防與治療的效果。

對于本領域技術人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和范圍內的所有變化囊括在本發(fā)明內。不應將權利要求中的任何附圖標記視為限制所涉及的權利要求。