本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及封裝及靶向輸送藥物和選擇性釋放藥物的藥物設(shè)計(jì)方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

癌癥已經(jīng)成為當(dāng)今在全球范圍內(nèi)威脅人類生命的頭號疾病。目前對于腫瘤治療方向，可分為手術(shù)治療方法及非手術(shù)治療方法。腫瘤的非手術(shù)治療方法包括化療和放療，但由于腫瘤細(xì)胞在與正常細(xì)胞具有很高的相似性的同時(shí)還具有更高的生命力，對腫瘤細(xì)胞的特異性藥物設(shè)計(jì)成為現(xiàn)有非手術(shù)療法的一項(xiàng)首要議題，也就是說，要求抗癌藥物具有更高的選擇性或靶向傳遞系統(tǒng)。當(dāng)治療效果選擇性地集中在腫瘤組織、腫瘤細(xì)胞或腫瘤基因時(shí)，就形成了對于腫瘤的靶向治療，從而降低對正常組織的副作用。這其中，腫瘤靶向治療最重要組成部分之一就是抗腫瘤靶向給藥系統(tǒng)，這種系統(tǒng)可以把有效抗癌藥物選擇性或?qū)Ｒ恍缘剌斔偷侥[瘤組織，同時(shí)，通過控制特定生理部位的藥物劑量，從而達(dá)到降低抗癌藥對非靶點(diǎn)部位的副作用和毒性的效果。

近年來，可以有效封裝藥物并實(shí)現(xiàn)靶向腫瘤組織快速釋放的藥物輸送系統(tǒng)（dds）越來越多地引起科研人員的廣泛關(guān)注，其中，最引人注目的就是智能藥物輸送系統(tǒng)（sdds）。一般情況下，一個(gè)理想的智能藥物傳遞設(shè)計(jì)包括生物相容性材料具有可忽略的毒性，對腫瘤細(xì)胞具有顯著的靶向性，穩(wěn)定的藥物封裝率和在不同條件下精確可控釋放的幾個(gè)基本要素。與傳統(tǒng)的藥物輸送系統(tǒng)相比，智能藥物輸送系統(tǒng)具有對于特定的外界環(huán)境刺激信號如物理信號（應(yīng)力、溫度、電荷、超聲、光等）、化學(xué)（離子強(qiáng)度、ph等）、生物因素信號（生物分子、酶類）特異釋放治療藥物這一顯著優(yōu)點(diǎn)。目前，智能藥物輸送系統(tǒng)已被應(yīng)用于抗腫瘤載體及藥物的研究，但一方面由于其表面不具有良好的包覆和特異的靶向功能性分子，故納米技術(shù)現(xiàn)階段在改善藥物輸送過程的同時(shí)，也明顯提高其他正常組織器官對藥物的攝取量，具有很大的毒副作用。另一方面，現(xiàn)階段對于靶向腫瘤的藥物輸送載體還存在載藥率低及合成工藝復(fù)雜等諸多問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種簡便的基于結(jié)合帶有強(qiáng)電荷的肽鏈結(jié)構(gòu)修飾的靶向基團(tuán)作為藥物載體包覆劑的設(shè)計(jì)方法，能夠同時(shí)實(shí)現(xiàn)對癌細(xì)胞靶向成像，靶向治療且在腫瘤部位特異釋放藥物三種功能。

本發(fā)明的技術(shù)方案提出一種簡便的利用靶向基團(tuán)結(jié)合帶有強(qiáng)電荷的多肽鏈通過靜電作用包覆帶電的藥物或光學(xué)信號結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)方案，可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞靶向成像，靶向治療且在腫瘤部位特異釋放藥物三種功能。

本發(fā)明提出的針對癌細(xì)胞的靶向輸送藥物并檢測治療響應(yīng)和特異性釋放的藥物

，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1）所述有強(qiáng)電荷的肽鏈結(jié)構(gòu)同時(shí)具有有效封裝藥物并實(shí)現(xiàn)靶向腫瘤組織快速釋放的雙重功能，有效減少正常組織器官對藥物的攝取量。

2）本發(fā)明合成方法簡便，易于調(diào)控，合成出的藥物載體生物相容性好。

附圖說明

圖1為基于結(jié)合帶有強(qiáng)電荷的肽鏈結(jié)構(gòu)修飾的靶向基團(tuán)作為藥物載體包覆劑的設(shè)計(jì)方案圖。

圖2為實(shí)施例中靶向癌細(xì)胞特異受體（egfr）雙響應(yīng)顯像且表征藥物釋放的細(xì)胞圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例（但不限于所舉實(shí)施例）進(jìn)一步描述本發(fā)明：

以已經(jīng)合成的帶有強(qiáng)電荷的肽鏈為例，描述帶有強(qiáng)電荷的肽鏈在納米復(fù)合物合成及腫瘤靶向成像、靶向給藥中的作用:

以帶有強(qiáng)正電荷的，通過6個(gè)精氨酸修飾的6-精氨酸-affibody肽鏈為例：

所述帶有強(qiáng)正電荷的通過6個(gè)精氨酸修飾的6-精氨酸-affibody肽鏈?zhǔn)抢么竽c桿菌發(fā)酵的生物合成方法獲得。大腸桿菌通過發(fā)酵、分離、提純、凍干后可獲得帶有能夠表達(dá)帶有強(qiáng)正電荷的通過6個(gè)精氨酸修飾的6-精氨酸-affibody重組蛋白。

所述通過6個(gè)精氨酸修飾的6-精氨酸-affibody肽鏈，除可以通過靜電相互作用包覆藥物外，其還具有在胰腺癌細(xì)胞中被胰酶特異性識別并切斷的特征，從而達(dá)到在胰酶作用下選擇性釋放藥物的功能。

以包覆載藥金納米量子點(diǎn)為例對其功能進(jìn)行說明：

1.6-精氨酸-affibody-巰基十一酸金納米量子點(diǎn)的合成及表征。

4mg6-精氨酸-affibody溶解于4ml巰基十一酸金納米量子點(diǎn)(mua-auncs)溶液中震蕩攪拌24小時(shí)，將所獲溶液通過截獲分子量為12kda的透析袋去離子水流動透析后獲得6-精氨酸-affibody-巰基十一酸金納米量子點(diǎn)。

在所述6-精氨酸-affibody-巰基十一酸金納米量子點(diǎn)中,包覆劑巰基十一酸在金原子表面形成很強(qiáng)的金-硫共價(jià)鍵,在水溶液中可以使6-精氨酸-affibody-金納米量子點(diǎn)更加穩(wěn)定。透射電鏡（tem）顯示所述巰基十一酸金納米量子點(diǎn)在水溶液中具有1.65-2，25納米的晶體尺寸并呈勻質(zhì)分布,當(dāng)加入靶向的6-精氨酸-affibody對其官能化后,所述6-精氨酸-affibody-巰基十一酸金納米量子點(diǎn)的晶體尺寸增大到20納米左右，從而證實(shí)靶向的6-精氨酸-affibody的確實(shí)修飾到了巰基十一酸金納米量子點(diǎn)的表面。

ζ電位是判斷粒子之間的靜電排斥作用的一個(gè)很好的指標(biāo)，因此，它可以用于表征液體中材料的表面電荷。當(dāng)加入靶向的6-精氨酸-affibody對其官能化后,所述6-精氨酸-affibody-巰基十一酸金納米量子點(diǎn)的減少到-30mv左右，從而證實(shí)所述6-精氨酸-affibody-巰基十一酸金納米量子點(diǎn)帶有強(qiáng)正電性。ζ電位高于30的絕對值說明所述修飾了帶有強(qiáng)正電荷的6-精氨酸-affibody的巰基十一酸金納米量子點(diǎn)是比普通的巰基十一酸金納米量子點(diǎn)更加穩(wěn)定的一種結(jié)構(gòu)。

所述6-精氨酸-affibody-巰基十一酸金納米量子點(diǎn)1650cm^-1(ν-co-nh-),1590cm^-1(ν^ascoo-),1210cm^-1(νcn)and1100cm^-1(νcn)處存在特殊的紅外（ir）吸收譜帶。

所述6-精氨酸-affibody-巰基十一酸金納米量子點(diǎn)具有很強(qiáng)的光學(xué)信號響應(yīng)，其最大吸收波長在280nm處，熒光發(fā)射波長在616nm處，在紫外光激發(fā)下顯紅色熒光。

2.6-精氨酸-affibody-巰基十一酸金納米量子點(diǎn)的應(yīng)用

下面結(jié)合實(shí)施例（但不限于所舉實(shí)施例）進(jìn)一步描述所述6-精氨酸-affibody-巰基十一酸金納米量子點(diǎn)的幾種用途：

實(shí)施例一：6-精氨酸-affibody-巰基十一酸金納米量子點(diǎn)用于癌細(xì)胞顯像

以靶向高表達(dá)表皮生長因子受體（egfr）的癌細(xì)胞顯像為例：

步驟一：高表達(dá)表皮生長因子受體（egfr）的癌細(xì)胞hepg2，bxpc3和幾乎不表達(dá)表皮生長因子受體（egfr）的癌細(xì)胞a549分別以5×10⁴個(gè)細(xì)胞/板的濃度在35毫米共焦板上接種并過夜培養(yǎng)。

步驟二：以每100微升所述6-精氨酸-affibody-巰基十一酸金納米量子點(diǎn)加入到900微升的細(xì)胞培養(yǎng)基為孵育濃度對上述細(xì)胞在37℃下溫育三十分鐘。

步驟三：將上述細(xì)胞用含有4％磷酸鹽緩沖液的多聚甲醛固定三十分鐘。

步驟四：將上述細(xì)胞用4'6二脒基-2-苯基吲哚（dapi）染色十分鐘。

步驟五：在激光共聚焦顯微鏡下觀察對上述高表達(dá)表皮生長因子受體（egfr）的癌細(xì)胞的顯像結(jié)果。

激光共聚焦顯微結(jié)果顯示，高表達(dá)表皮生長因子受體（egfr）的癌細(xì)胞hepg2的細(xì)胞輪廓迅速轉(zhuǎn)身鮮艷的紅色，是bxpc3細(xì)胞亮度的2.18倍，而幾乎不表達(dá)表皮生長因子受體（egfr）的癌細(xì)胞a549只有微弱的紅色，從而說明，所述靶向高表達(dá)表皮生長因子受體（egfr）的6-精氨酸-affibody-巰基十一酸金納米量子點(diǎn)可以通過特異性抗體在體外檢測特異性細(xì)胞表面上不同量的表皮生長因子受體（egfr），從而對hepg2，a549和bxpc3細(xì)胞的表皮生長因子受體的表達(dá)水平進(jìn)行簡便并準(zhǔn)確定量。

所述利用靶向高表達(dá)表皮生長因子受體（egfr）的6-精氨酸-affibody-巰基十一酸金納米量子點(diǎn)顯像方法同傳統(tǒng)方法相比，避免了傳統(tǒng)通過免疫組織化學(xué)方法定量評價(jià)細(xì)胞表面受體狀態(tài)時(shí)復(fù)雜和不敏感等缺陷，所述6-精氨酸-affibody-巰基十一酸金納米量子點(diǎn)為定量評價(jià)細(xì)胞表面受體狀態(tài)提供了一種直接，快速，方便的檢測方法。

實(shí)施例二：6-精氨酸-affibody-巰基十一酸金納米量子點(diǎn)用于藥物載體

以負(fù)載帶有負(fù)電荷的藥物甲氨蝶呤（mtx）為例：

步驟一：將上述巰基十一酸金納米量子點(diǎn)取2ml加入到2ml(1mmol/l)的mtx溶液中，攪拌四小時(shí)。

步驟二:將所獲溶液通過截獲分子量為3kda的透析袋去離子水流動透析后獲得巰基十一酸-mtx金納米量子點(diǎn)。

步驟三:將4mg6-精氨酸-affibody加入到4ml上述巰基十一酸-mtx金納米量子點(diǎn)中,攪拌24小時(shí)。

步驟四：將所獲溶液通過截獲分子量為12kda的透析袋去離子水流動透析后獲得6-精氨酸-affibody-巰基十一酸-mtx金納米量子點(diǎn)。

所述巰基十一酸-mtx金納米量子點(diǎn)24小時(shí)后在ph7.4和ph6.6時(shí)的釋藥效率分別為66%和66.67%，當(dāng)帶有強(qiáng)正電荷的affibody肽鏈修飾后，其在ph7.4和ph6.6時(shí)的釋藥效率分別降低至33.65%和20.38%，從而說明所述帶有強(qiáng)正電荷的affibody肽鏈具有通過靜電相互作用有效封裝與其電荷相反的藥物的功能。

所述6-精氨酸-affibody-巰基十一酸-mtx金納米量子點(diǎn)當(dāng)環(huán)境條件從中性ph7.4向弱酸性ph6.6變化時(shí)，mtx的釋放率增高，從而說明所述affibody-巰基十一酸-mtx金納米量子點(diǎn)在癌細(xì)胞生存環(huán)境（弱酸性）中比在正常人體液環(huán)境（中性）中釋藥效果更好，從而能夠有效減少正常組織器官對藥物的攝取量，實(shí)現(xiàn)靶向腫瘤組織釋放的理想效果。

所述6-精氨酸-affibody-巰基十一酸-mtx金納米量子點(diǎn)當(dāng)外界溶液中谷胱甘肽（gsh）的濃度由1mm向10mm變化時(shí)，mtx的釋放率增高，從而說明所述affibody-巰基十一酸-mtx金納米量子點(diǎn)在癌細(xì)胞生存環(huán)境（谷胱甘肽濃度高）中比在正常人體液環(huán)境（谷胱甘肽濃度低）中釋藥效果更好，從而也能夠有效減少正常組織器官對藥物的攝取量，實(shí)現(xiàn)靶向腫瘤組織釋放的理想效果。

所述6-精氨酸-affibody-巰基十一酸-mtx金納米量子點(diǎn)當(dāng)外界溶液中胰酶的濃度由0.5μg/ml向5μg/ml變化時(shí)，mtx的釋放率增高，從而說明所述affibody-巰基十一酸-mtx金納米量子點(diǎn)在胰腺癌細(xì)胞（bxpc3)生存環(huán)境（胰酶濃度高）中比在正常人體液環(huán)境（胰酶濃度低）中釋藥效果更好，從而也能夠有效減少正常組織器官對藥物的攝取量，實(shí)現(xiàn)靶向胰腺腫瘤組織釋放的理想效果。