本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體地講，涉及天花粉蛋白在增強(qiáng)疫苗特異性抗體中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

每年流感病毒流行除引發(fā)較高致死率，對(duì)于世界大流行病的發(fā)生也是一個(gè)重大威脅，對(duì)于兒童與老年人，發(fā)病率與死亡率更高。接種流感疫苗是預(yù)防和控制流感發(fā)生的主要措施之一，接種季節(jié)性流感疫苗對(duì)于控制流感的發(fā)生發(fā)揮著舉足輕重的作用。目前，被批準(zhǔn)使用的流感疫苗分為兩大類：滅活流感疫苗和減毒流感活疫苗。滅活流感疫苗主要分為以下幾類：全病毒滅活疫苗、滅活病毒裂解產(chǎn)物疫苗和滅活亞單位疫苗?，F(xiàn)階段較為廣泛應(yīng)用的是三價(jià)滅活裂解疫苗。而利用雞胚生產(chǎn)、對(duì)每年新流行的毒株的疫苗至少需要6個(gè)月。雖然在過去的三十年里，生產(chǎn)重組蛋白的速度、效率的提高為開發(fā)亞單位疫苗提供了新的機(jī)遇。然而，與傳統(tǒng)的減毒或滅活疫苗相比，亞單位疫苗免疫原性比較低，缺少安全有效的人用佐劑嚴(yán)重制約了該類的疫苗開發(fā)，疫苗的產(chǎn)能不足問題在流感大爆發(fā)時(shí)尤顯突兀。因此，提高流感疫苗產(chǎn)能，控制流感大流行的根本在于尋找能提高流感疫苗特異性抗體的方法，相關(guān)研究亦是當(dāng)前疫苗研究的熱點(diǎn)之一，比如可通過提高疫苗抗原的免疫原性，從而降低每劑疫苗的抗原用量最終提高疫苗產(chǎn)能。

流行性腦脊髓膜炎(epidemiccerebrospinalmeningitis)是最常見的傳染病之一，具有傳染性強(qiáng)、人群隱性感染多的特點(diǎn)，主要分為普通型和爆發(fā)型兩種?；颊吲R床表現(xiàn)為劇烈頭痛、頻繁嘔吐、高熱不退等癥狀，常留下腦實(shí)質(zhì)損害的后遺癥。病情嚴(yán)重的發(fā)生敗血癥并累及呼吸和循環(huán)系統(tǒng)造成其功能衰竭，危及生命。

流腦的高發(fā)地區(qū)是非洲、亞洲和南美洲，平均每年發(fā)生30-50萬病例，對(duì)兒童和老年人危害尤為嚴(yán)重，爆發(fā)型流腦感染兒童其病死率可高達(dá)40％-60％，老年人為17.6％。我國(guó)曾出現(xiàn)過5次全國(guó)性流腦大流行，其中在1967年春季的流腦流行創(chuàng)造了我國(guó)有史以來最強(qiáng)的發(fā)病高峰，發(fā)病率高達(dá)403/10萬，病死率5.49％。

因此，流腦疫苗接種是預(yù)防和控制流腦發(fā)生的關(guān)鍵措施，我國(guó)自1980年起正式批準(zhǔn)生產(chǎn)a群流腦多糖疫苗，極大地控制了流腦的全國(guó)爆發(fā)。但是根據(jù)近20年來的數(shù)據(jù)，我國(guó)每年流腦發(fā)病人數(shù)都會(huì)達(dá)到上千人，而且1994年、2003年流腦發(fā)生了兩次較明顯的發(fā)病率反彈現(xiàn)象，2003年度全國(guó)報(bào)告2490例，與去年同期上升0.53％，死亡134例，死亡數(shù)增加8.06％，統(tǒng)計(jì)顯示其毒力存在著8-10年一個(gè)周期的爆發(fā)規(guī)律，預(yù)計(jì)下一個(gè)發(fā)病人數(shù)反彈高峰即將到來。造成這一現(xiàn)象的主要原因主要包括兩個(gè)方面：

首先，a群流腦流行的優(yōu)勢(shì)基因型周期性的變換，導(dǎo)致此病周期性流行；

其次，免疫實(shí)踐證明，多糖類抗原大都屬于t細(xì)胞非依賴性抗原，不能有效激活輔助性t細(xì)胞(th)和t記憶細(xì)胞，不能誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫記憶功能，免疫保護(hù)時(shí)間短暫，再次免疫接種不能產(chǎn)生加強(qiáng)免疫反應(yīng)。而現(xiàn)行流腦疫苗恰恰為多糖類疫苗，其免疫原性差，刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的效率低下甚至?xí)a(chǎn)生異常應(yīng)答。

資料顯示，腦膜炎球菌多糖抗原雖能誘導(dǎo)產(chǎn)生igm和igg抗體，但人類所產(chǎn)生的igg主要是igg2亞類，而人血清igg2亞類抗體出現(xiàn)較遲，一般到8-12歲才能上升至成人水平，故而嬰幼兒接種該多糖疫苗后，產(chǎn)生的抗體以具有短暫作用的igm抗體為主，這就導(dǎo)致了流腦疫苗尤其對(duì)兩歲以下的嬰幼兒保護(hù)能力弱、保護(hù)周期短的問題。

因此，一方面加強(qiáng)推廣接種流腦疫苗，另一方面提高流腦疫苗免疫原性即增強(qiáng)其保護(hù)效果對(duì)預(yù)防和控制流腦發(fā)病及流行有重要意義。

另外，目前按照國(guó)家接種流腦疫苗免疫程序的規(guī)定，完整接種該疫苗共需接種4劑，第1、2劑為基礎(chǔ)免疫，第3、4劑次為加強(qiáng)免疫，兒童自6月齡接種第1劑，2劑次間隔不少于3個(gè)月，3歲時(shí)接種第3劑，與第2劑間隔時(shí)間不少于1年；6歲時(shí)接種第4劑，與第3劑接種間隔不少于3年。

不難看出，現(xiàn)有免疫程序較其他疫苗接種繁瑣和復(fù)雜，具有接種次數(shù)多和流動(dòng)兒童疫苗漏接率高的缺點(diǎn)，直接影響到疫苗的免疫效果。

針對(duì)以上流腦疫苗免疫原性差、接種繁瑣等實(shí)際問題，如果我們能夠研發(fā)出更好的可以增強(qiáng)現(xiàn)有疫苗的免疫原性，誘導(dǎo)高水平的特異性保護(hù)抗體的策略和技術(shù)方法，就有希望可以解決現(xiàn)有流腦疫苗尤其對(duì)嬰幼兒的低免疫原性、誘導(dǎo)免疫記憶、免疫應(yīng)答能力弱和僅有短期保護(hù)作用等問題。

國(guó)外最新研究表明多糖與蛋白質(zhì)結(jié)合成為結(jié)合疫苗可以部分改善多糖疫苗的缺陷。參考b型流感嗜血桿菌(hib)結(jié)合疫苗研發(fā)成功的經(jīng)驗(yàn)，各國(guó)學(xué)者均在積極探索用相似的方式改進(jìn)流腦疫苗的保護(hù)效果、減少接種不良反應(yīng)。

已有經(jīng)驗(yàn)中，佐劑是非特異性地增強(qiáng)機(jī)體對(duì)特異性抗原的特異性免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型，而本身無抗原性的物質(zhì)，可先于或與抗原同時(shí)應(yīng)用。佐劑作為免疫增強(qiáng)劑應(yīng)用于流感疫苗，對(duì)于增強(qiáng)疫苗的免疫原性、提高疫苗的免疫效果有十分重要的意義。目前，在商品化的三價(jià)滅活流感疫苗(tiv)中已有鋁佐劑使用，并證明可以增強(qiáng)抗原的免疫原性，減少有效的免疫應(yīng)答所需要的抗原。但鋁佐劑的缺點(diǎn)在于，它不能誘導(dǎo)產(chǎn)生th1型反應(yīng)，干擾細(xì)胞免疫，并阻斷cd8+ctl的激活，使得疫苗的免疫保護(hù)作用不全面，不持久，并且也有一些不良反應(yīng)。但由于鋁佐劑的應(yīng)用歷史較長(zhǎng)，安全性相對(duì)新型佐劑較為可靠，故目前還無法被完全取代。雖然其它許多疫苗佐劑都曾用于增強(qiáng)流感疫苗免疫原性的研究，但只有mf59(鯊烯水乳液)等水包油乳劑顯示了較強(qiáng)的佐劑效應(yīng)并最終在歐洲被批準(zhǔn)在流感疫苗中使用，但該種佐劑在增加免疫原性的同時(shí)，也增強(qiáng)反應(yīng)原性，在成年人中可見輕微局部疼痛、發(fā)熱、紅斑、硬結(jié)、肌痛等癥狀增加。

鑒于以上疫苗與佐劑的缺點(diǎn)，尋找新的、可特異性增強(qiáng)流感和流腦病毒抗體水平和時(shí)間的佐劑類物質(zhì)是當(dāng)務(wù)之急。

在這方面，我國(guó)寶貴的中草藥庫有著天然的優(yōu)勢(shì)。天花粉蛋白(trichosanthin，tcs)是從葫蘆科栝樓屬植物栝樓的根塊中提取出來的一種堿性蛋白，入藥已有兩千年的歷史。tcs臨床主要用于抗早孕及宮外孕、葡萄胎、絨癌等的治療，同時(shí)其也是唯一被臨床用于抗艾滋的中藥，對(duì)hiv病毒有明顯抑制作用，并且這種抑制作用與tcs的濃度呈正相關(guān)。天花粉蛋白作為一種植物蛋白，有廉價(jià)、易獲得、生物作用廣泛等特點(diǎn)，使其具有了良好的研究前景及實(shí)用價(jià)值。

從80年代起，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者開始從多角度觀察了天花粉蛋白對(duì)免疫系統(tǒng)的影響。不同研究小組的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)天花粉蛋白具有免疫抑制和免疫增強(qiáng)兩種免疫調(diào)節(jié)作用：tcs可誘發(fā)人體t細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制，即tcs對(duì)可溶性抗原和多克隆激活劑誘發(fā)的t細(xì)胞增殖具有強(qiáng)烈的抑制作用。對(duì)其作用機(jī)制的結(jié)果表明tcs誘導(dǎo)免疫抑制需要抗原遞呈細(xì)胞參與，涉及抗原加工遞呈和hla-dq分子的功能性表達(dá)，低劑量的tcs還可直接干擾t淋巴細(xì)胞發(fā)揮正常的功能。這些結(jié)果都說明tcs可能對(duì)同種異基因免疫應(yīng)答有抑制效應(yīng)。但是一定濃度的tcs也能促進(jìn)植物血凝素刺激下的正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)分泌il-2和il-6，由于il-2可作用于tc細(xì)胞，產(chǎn)生殺傷和細(xì)胞毒效應(yīng)，參與細(xì)胞免疫應(yīng)答；il-6則刺激b細(xì)胞增殖產(chǎn)生抗體，介導(dǎo)機(jī)體的體液免疫應(yīng)答。因此tcs通過促進(jìn)il-2和il-6的分泌，起到增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答的作用。tcs可促使小鼠唾液腺內(nèi)igg分泌增多，促進(jìn)小鼠脾臟免疫細(xì)胞的形成和分化，使b淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞數(shù)量明顯增多，增強(qiáng)體液免疫。一定濃度的天花粉蛋白增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)作用提示天花粉可能具有類似佐劑的作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供天花粉蛋白在增強(qiáng)疫苗特異性抗體中的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明公開以下技術(shù)方案：天花粉蛋白在增強(qiáng)疫苗特異性抗體中的應(yīng)用。

作為一個(gè)優(yōu)選方案，所述天花粉蛋白的使用量為0.004－0.04mg/kg。

作為一個(gè)優(yōu)選方案，所述疫苗指流感疫苗和流行性腦脊髓膜炎疫苗。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：極低劑量中藥天花粉蛋白可顯著增強(qiáng)疫苗特異性抗體免疫應(yīng)答水平，為研制免疫效果增強(qiáng)的新佐劑流感疫苗和解決流感疫苗產(chǎn)能不足的問題提供有力解決方案。只需使用原有疫苗十分之一的量，即可達(dá)到保護(hù)作用，抗體的滴度和維持時(shí)間顯著增加，降低90％疫苗的使用量。國(guó)內(nèi)外尚無研究報(bào)道，天花粉蛋白源自中藥，極具中國(guó)特色。

附圖說明

圖1天花粉蛋白誘導(dǎo)ova特異性體液免疫應(yīng)答，利用模式抗原-卵清白蛋白(ova)與天花粉蛋白混合免疫小鼠，在免疫后的1、2、3周采血，用ova以1ug/ml的濃度包被96孔板，將初免的血清稀釋100倍，再免之后的血清稀釋10000倍后，測(cè)定血清中ova特異性免疫球蛋白igg的含量，同時(shí)設(shè)立不同對(duì)照組，確定天花粉蛋白可誘導(dǎo)ova特異性體液免疫應(yīng)答。

圖2血清中抗ova特異性igg1與igg2a表達(dá)格局，用ova以1ug/ml的濃度包被96孔板，將初免的血清稀釋100倍，再免之后的血清稀釋10000倍后，測(cè)定稀釋后的血清中抗原特異性的igg1與igg2a，表明tcs誘導(dǎo)了th2主導(dǎo)的特異性體液免疫應(yīng)答。

圖3tcs顯著增強(qiáng)細(xì)胞因子ifn-r和il-5顯著升高，a圖，tcs顯著增強(qiáng)抗ova特異性igg1抗體水平；b圖tcs顯著增強(qiáng)抗病毒和抗體生成有關(guān)的細(xì)胞因子ifn-r和il-5分泌水平，通過血清中特異性抗體亞型的測(cè)定，證明tcs可顯著增強(qiáng)th2主導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答，同時(shí)用elisa驗(yàn)證tcs實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞因子的格局變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與抗病毒和抗體生成有關(guān)的細(xì)胞因子ifn-r和il-5顯著升高。

圖4tcs顯著增強(qiáng)血清中特異性抗流感病毒igg水平，劑量范圍實(shí)驗(yàn)確定了tcs的最適劑量為1μg/小鼠，將葛蘭素史克生產(chǎn)的流感疫苗fluarix(gsk)100μl與1μg天花粉蛋白混合免疫小鼠，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照和鋁佐劑對(duì)照，發(fā)現(xiàn)，1μg天花粉蛋白顯著增強(qiáng)小鼠血清中抗flu特異性抗體水平，與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。

圖5tcs顯著降低流感疫苗fluarix的用量，仍然可到達(dá)等同的抗體水平。將流感疫苗fluarix按照倍比稀釋后(5μl，10μl，50μl，100μl)，分別與1μg天花粉蛋白混合免疫小鼠，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，通過eilsa檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，如果加入天花粉蛋白，即使僅僅取用疫苗常用劑量的十分之一，10μl，仍然可以達(dá)到100μl疫苗劑量同等范圍內(nèi)的抗體水平，兩者相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖6小鼠血清中抗流腦抗體滴度隨免疫時(shí)間的變化，tcs能夠顯著增強(qiáng)血清中抗流腦病毒的特異性抗體，提高流腦疫苗mccv的免疫應(yīng)答，實(shí)驗(yàn)組(mccv+tcs)血清中特異性抗體滴度顯著高于對(duì)照組(mccv)(p＜0.01)，連續(xù)觀察7周，組間差異從第2周起開始，從第4周開始，在第5周差異最為顯著，抗體滴度到達(dá)最高值，表明天花粉蛋白可顯著增強(qiáng)a群流腦疫苗特異性抗體的滴度。

圖7小鼠血清中抗流腦抗體滴度隨免疫時(shí)間的變化，tcs能夠顯著延長(zhǎng)mc特異性抗體在體內(nèi)時(shí)間，由此增強(qiáng)流腦疫苗對(duì)小鼠的保護(hù)時(shí)間。通常多糖類流腦疫苗常規(guī)接種后保護(hù)時(shí)間約為3個(gè)月。我們發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，第13周后，對(duì)照組血清中已檢測(cè)不到特異性抗體，而實(shí)驗(yàn)組血清中特異性抗體在30周時(shí)依然維持著較高的水平，仍然可以達(dá)到最高滴度時(shí)的一半。說明tcs通過某種機(jī)制使得小鼠對(duì)多糖類流腦疫苗的免疫應(yīng)答更加持久，有效延長(zhǎng)了疫苗的保護(hù)時(shí)間。

圖8a顯示對(duì)照組小鼠脾臟b2細(xì)胞(b220+cd11b-)比例為38.9％,圖8b顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠脾臟b2細(xì)胞比例為57.5％，實(shí)驗(yàn)組b2細(xì)胞比對(duì)照組增加了18.6％，提示tcs可顯著提升小鼠體內(nèi)b2細(xì)胞百分比。

圖9a顯示對(duì)照組小鼠骨髓b2祖細(xì)胞(b220⁺cd11b^-)比例為12.9％,圖圖9b顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠骨髓b2祖細(xì)胞比例為29.6％，實(shí)驗(yàn)組b2細(xì)胞比對(duì)照組增加了16.7％，提示tcs可顯著提升小鼠體內(nèi)b2祖細(xì)胞百分比。

圖10a為對(duì)照組小鼠腹膜腔b1細(xì)胞的流式結(jié)果圖，橫坐標(biāo)為cd11b，縱坐標(biāo)為ssc，對(duì)照組小鼠腹膜腔cd11b+比例為54.8％；圖10b橫坐標(biāo)為b220，縱坐標(biāo)為igm，以cd11b+設(shè)門，顯示對(duì)照組小鼠b220lowigmhigh比例為84.3％，圖10a、圖10b表明對(duì)照組小鼠b1細(xì)胞(cd11b+b220lowigmhigh)比例為54.8％*84.3％＝46.2％。

圖11a為實(shí)驗(yàn)組小鼠腹膜腔b1細(xì)胞的流式結(jié)果圖，橫坐標(biāo)為cd11b，縱坐標(biāo)為ssc，實(shí)驗(yàn)組小鼠腹膜腔cd11b+比例為70.0％；圖11b橫坐標(biāo)為b220，縱坐標(biāo)為igm，以cd11b+設(shè)門，顯示對(duì)照組小鼠b220lowigmhigh比例為80.2％，圖11a、圖11b表明實(shí)驗(yàn)組小鼠b1細(xì)胞(cd11b+b220lowigmhigh)比例為70.0％*80.2％＝56.1％。

圖12為足墊免疫以及采血流程與說明。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)中藥天花粉蛋白可顯著增強(qiáng)疫苗(亞單位流感及多糖類流腦疫苗)特異性抗體的水平：

(1)提供天花粉蛋白增強(qiáng)疫苗特異性抗體的有效濃度；

(2)提供其增強(qiáng)的應(yīng)用效果與部分機(jī)制。

tcs增強(qiáng)亞單位流感疫苗特異性抗體的水平技術(shù)方法：

(1)利用模式抗原-卵清白蛋白(ova)與天花粉蛋白混合免疫小鼠，在免疫后的1、2、3周采血，測(cè)定血清中ova特異性免疫球蛋白igg的含量，同時(shí)設(shè)立不同對(duì)照組，確定天花粉蛋白可以誘導(dǎo)ova特異性體液免疫應(yīng)答(圖1)。

(2)確定天花粉蛋白發(fā)揮作用的最適劑量，在最佳劑量條件下，天花粉蛋白可以同時(shí)誘導(dǎo)體液與細(xì)胞免疫反應(yīng)。首先，將ova與不同濃度的天花粉蛋白混合免疫小鼠，elisa測(cè)定小鼠血清中ova-specificiggantibody來確定天花粉蛋白的最適劑量為1μg/只小鼠，換算為0.004－0.04mg/kg(圖2)。

(3)按最適劑量tcs與ova混合免疫小鼠，同時(shí)設(shè)立不同對(duì)照組，在初次免疫與再次免疫后的不同時(shí)間點(diǎn)，用ova體外刺激小鼠脾細(xì)胞，elisa檢測(cè)th1型細(xì)胞因子的分泌情況；同時(shí)用mhc-i四聚體染色法檢測(cè)cd8t細(xì)胞數(shù)量變化，并進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，流式細(xì)胞儀分析cd8t細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

(4)驗(yàn)證天花粉蛋白增強(qiáng)流感病毒抗原特異性免疫反應(yīng)。采用肌肉注射免疫途徑，檢測(cè)天花粉蛋白輔助流感疫苗誘導(dǎo)小鼠抗原特異性的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。參考o(jì)va免疫應(yīng)答強(qiáng)度確定tcs的最適劑量(圖3)，elisa測(cè)定流感病毒抗原特異性的總igg和iga以及igg亞型抗體(圖4)；流感病毒血凝抑制實(shí)驗(yàn)(hia)評(píng)價(jià)體液免疫的保護(hù)效果；噬斑試驗(yàn)測(cè)定血清中抗流感病毒的中和抗體滴度，進(jìn)一步評(píng)價(jià)體液免疫保護(hù)效果；采用elispot分析測(cè)定免疫小鼠流感病毒抗原特異性的cd4andcd8tcells分泌ifn-γ的水平；流感抗原體外刺激免疫小鼠脾細(xì)胞，elisa測(cè)定細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子，如il-2，ifn-gamma，il-4，il-5和il-13等，確定免疫應(yīng)答格局。

(5)流感疫苗與天花粉蛋白混合免疫小鼠后，通過攻毒試驗(yàn)，驗(yàn)證天花粉蛋白增強(qiáng)流感疫苗誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的保護(hù)作用。同時(shí)，分別用流感疫苗或?qū)⒘鞲幸呙缗c天花粉蛋白混合免疫小鼠，將加強(qiáng)免疫小鼠的血清過繼轉(zhuǎn)移回輸?shù)秸Ｐ∈篌w內(nèi)，然后對(duì)回輸血清的小鼠進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，驗(yàn)證tcs增強(qiáng)的特異性抗體的過繼保護(hù)作用。

tcs增強(qiáng)多糖類流腦疫苗特異性抗體的水平技術(shù)方法：

(1)8-10周齡的c57bl/6雌鼠按隨機(jī)分成2組(另設(shè)一組空白對(duì)照)，參照tcs增強(qiáng)流感疫苗特異性抗體的使用劑量，按照以下流程(表1)驗(yàn)證tcs增強(qiáng)a群流腦疫苗(a-mccv)特異性抗體滴度。發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組小鼠血清中抗流腦抗體滴度明顯低于疫苗中添加tcs的實(shí)驗(yàn)組(圖5)。

實(shí)驗(yàn)設(shè)組如表1：

足墊免疫以及采血流程與說明如圖12。

足墊免疫

①90μg/瓶的a群腦膜炎球菌多糖疫苗(a-mccv)分為兩組，每瓶加1.5ml緩沖生理鹽水配制成60μg/ml的a-mccv。其中一組備用，另一組按照1μg/50μl的濃度加入tcs混勻后備用。

②用胰島素注射針將配置好的免疫試劑對(duì)雌鼠分別進(jìn)行足墊初次免疫，左右足墊各50μl，每只小鼠共注射0.1ml的試劑。在第24天按照初次免疫劑量加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)免疫劑量與初次免疫劑量相同。

③根據(jù)結(jié)果會(huì)再設(shè)置兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，一個(gè)在其他條件不變的情況下，適當(dāng)降低注射疫苗的劑量；另一個(gè)取消第21天的加強(qiáng)免疫。觀察與其他實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的區(qū)別。

采血：

①免疫6天后，進(jìn)行第一周的眼眶采血。預(yù)估得到每只小鼠血清100μl。其中每一份血清取5-10μl進(jìn)行elisa實(shí)驗(yàn)(10μl則做副孔)，觀察抗體的顯著增加。將其余血清及時(shí)保存于-80℃冰箱。

②第一次免疫后第13天，進(jìn)行第二周眼眶采血。

③第一次免疫后第20天，進(jìn)行第三周眼眶采血。

④第一次免疫后第23天，進(jìn)行將強(qiáng)免疫，免疫劑量同第一次免疫。

⑤加強(qiáng)免疫后讓小鼠休息3天。

⑥第一次免疫后第26天，進(jìn)行第四周眼眶采血。

⑦第一次免疫后第33天，進(jìn)行第五周眼眶采血。

⑧第一次免疫后第40天，摘除小鼠眼球，盡可能地收集血液，處死小鼠。

(2)設(shè)計(jì)單一變量實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證添加tcs的流腦疫苗能夠降低免疫原劑量、減少免疫次數(shù)等條件下達(dá)到等同或更好的保護(hù)效果。

(3)構(gòu)建小鼠感染腦膜炎奈瑟菌模型，從接種疫苗開始每周監(jiān)測(cè)小鼠的體重?cái)?shù)據(jù)，同時(shí)驗(yàn)證tcs增強(qiáng)疫苗的保護(hù)作用。

天花粉蛋白與流腦疫苗(mpv)混合后，足墊免疫小鼠，分別于第2、6、7、9、10天眶周靜脈叢取血，持續(xù)多周收集血清，用流腦疫苗以20ug/ml的濃度包被96孔板，將血清以1:10稀釋，igm酶標(biāo)二抗以1：1000稀釋。用elisa法測(cè)定稀釋后的血清中抗原特異性抗體、分析天花粉蛋白對(duì)骨髓b2祖細(xì)胞及脾臟b2細(xì)胞的比例、腹膜腔b1細(xì)胞的比例的變化(圖8—圖11)。

圖8—圖11顯示tcs能夠顯著增加個(gè)體脾臟b2細(xì)胞，骨髓b2祖細(xì)胞，腹膜腔b1細(xì)胞的百分比，提示特異性抗體的增長(zhǎng)與b細(xì)胞百分比同時(shí)出現(xiàn)。取小鼠脾臟細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、腹膜腔細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)小鼠脾臟b2細(xì)胞，骨髓b2祖細(xì)胞，腹膜腔b1細(xì)胞的百分比，天花粉蛋白能提高骨髓b2祖細(xì)胞及脾臟b2細(xì)胞的比例，同時(shí)腹膜腔b1細(xì)胞的比例也增加，提示b2由b1轉(zhuǎn)化而來的可能性比較低，與elisa結(jié)果相一致。

從免疫學(xué)角度來講，流感和流腦疫苗基本可以代表全部的疫苗，從疫苗抗原分類來講為蛋白或多糖類，而以上兩者分別是蛋白和多糖，因此以上效果可以概括到所對(duì)應(yīng)抗原分類的所有疫苗。

本發(fā)明涉及的主要試劑與器材：

主要試劑：天花粉蛋白注射液(上海金山制藥有限公司)，a群腦膜炎球菌多糖疫苗(北京天壇生物制品股份有限公司)，elisa小鼠細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒(ebioscience)，堿性磷酸酶底物片劑(sigma)，淋巴細(xì)胞分離液，胎牛血清(hyclonelab，inc)，rpmi1640培養(yǎng)液(invitrogencorp),anti-mouseigg2a(gamma2achain)(rabbit)antibodyalkalinephosphataseconjugated(rockland),anti-mouseigg(h&l)(goat)antibodyalkalinephosphataseconjugated(rockland),anti-mouseigg1(gamma1chain)(rabbit)antibodyalkalinephosphataseconjuated(rockland)。

主要器材96孔培養(yǎng)板和24孔培養(yǎng)板，co2細(xì)胞培養(yǎng)箱(heraeus)，thermoscientificsorvalllegendr+臺(tái)式離心機(jī)，max250全波自動(dòng)酶標(biāo)檢測(cè)儀(moleculardevice)。

流感疫苗：商品名：福祿立適(fluarix)，成分(每0.5ml疫苗含以下病毒株的純化抗原：)a3型流行性感冒病毒裂解血凝素抗原15ug(2011/2012年度：甲/珀斯/16/2009(h3n2)-類似株：甲/維多利亞/210/2009nymcx-187)a1型流行性感冒病毒裂解血凝素抗原15ug(2011/2012年度：甲/加利福尼亞/7/2009(h1n1)-類似株：甲/加利福尼亞/7/2009nymcx-181)b型流行性感冒病毒裂解血凝素抗原15ug(2011/2012年度：乙/布里斯班/60/2008)。

流腦疫苗：07052571(mccv)，流腦-武生-d-a多糖，a群腦膜炎灰奈瑟菌培養(yǎng)液，經(jīng)提取獲得莢膜多糖抗原，純化后加入適宜穩(wěn)定劑凍干制成。

本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在：(1)通過中藥天花粉誘導(dǎo)t細(xì)胞亞群分化增強(qiáng)流感及流腦疫苗特異性抗體水平，體現(xiàn)中國(guó)資源特色，取材的中藥已入藥兩千多年，具有安全、廉價(jià)、易得的特點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外未見相關(guān)報(bào)道。

(2)目前流感病毒變異多，產(chǎn)能不足；流腦疫苗多針次、長(zhǎng)間隔的繁瑣接種程序使得“漏接”現(xiàn)象日益頻繁，尤其是對(duì)于流動(dòng)兒童，這一問題十分嚴(yán)重。這讓疫苗保護(hù)效果大大降低。本發(fā)明可以提高疫苗使用效率，同時(shí)在減少疫苗接種次數(shù)、劑量的情況下使受接種人群獲得相同的持久保護(hù)。

(3)tk通過改變細(xì)胞因子格局和t細(xì)胞亞群偏移提高體液免疫應(yīng)答水平的方法，有助于從分子和細(xì)胞水平全面了解我國(guó)中藥制劑天花粉蛋白的特性，及其發(fā)揮多種生物學(xué)活性的機(jī)制，為這一植物蛋白用于治療更大范圍的臨床疾病展示新的前景，并可能為發(fā)展新的疫苗提供思路。

本發(fā)明簡(jiǎn)單易行，只需與疫苗簡(jiǎn)單混合，即可達(dá)到特異性抗體和效能增加的作用。極低劑量中藥天花粉蛋白具有良好的增強(qiáng)疫苗效能的作用，可作為疫苗效能增強(qiáng)劑。將極低劑量天花粉蛋白與季節(jié)性流感疫苗聯(lián)合應(yīng)用，可加速誘導(dǎo)抗體免答，將低劑量天花粉蛋白與流腦疫苗聯(lián)合應(yīng)用，可顯著增強(qiáng)特異性抗體免答，提高疫苗免原性，并顯著降低抗用量同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞與體液應(yīng)答，達(dá)到更好的保護(hù)效果，為研制新型佐劑流感疫苗與解決產(chǎn)能不足問題提供新思路，開拓了疫苗增強(qiáng)劑研究的發(fā)展空間。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。