本發(fā)明屬制藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及抗腦出血藥物，具體涉及血管性血友病因子vwf在制備抗腦出血藥物靶點(diǎn)中的用途。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)顯示抑制vwf活性有助于減輕腦出血后的炎癥反應(yīng)并減輕腦水腫，所述vwf可作為減輕腦出血損傷的有效靶點(diǎn)，進(jìn)一步用于制備抗腦出血藥物。

背景技術(shù)：

現(xiàn)有技術(shù)公開了血管性血友病因子(vwf)是一種超聚體糖蛋白，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受損或者受到刺激時(shí)，vwf從內(nèi)皮細(xì)胞的weibel-palade小體釋放到血管中；當(dāng)血管受損時(shí)，血流剪切力升高，vwf在血小板粘附和聚集中起到關(guān)鍵作用。近來，有研究發(fā)現(xiàn)vwf能夠調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的浸潤和炎癥反應(yīng)；動(dòng)物研究證明，敲除vwf基因能夠抑制炎癥細(xì)胞富集，減輕動(dòng)脈粥樣硬化病變和缺血后大腦損傷，而給予抗vwf抗體能夠抑制腹膜炎中性粒細(xì)胞的浸潤，并能減輕心肌缺血造成的損傷。

腦出血通常指非外傷性腦血管破裂引起的出血，約占腦中風(fēng)的10-15％。研究顯示，腦出血能激活免疫細(xì)胞，促進(jìn)炎癥調(diào)節(jié)介質(zhì)的釋放；炎癥細(xì)胞侵入大腦實(shí)質(zhì)會(huì)加重血腦屏障(bbb，blood-brainbarrier)的損傷，進(jìn)而引起繼發(fā)性腦水腫和腦實(shí)質(zhì)損傷；腦出血引發(fā)的炎癥反應(yīng)對(duì)腦損傷的形成起到重要作用，上述結(jié)果提示，抗炎干 預(yù)可能減輕腦出血造成的不良后果。

迄今為止，血管性血友病因子(vwf)在腦出血后是否發(fā)揮重要的病理生理作用尚未闡明，因此，本申請的發(fā)明人擬通過對(duì)vwf是否加重腦出血后炎癥應(yīng)答、bbb損傷和繼發(fā)性腦損傷的研究，提供血管性血友病因子vwf在制備抗腦出血藥物靶點(diǎn)中的用途，進(jìn)一步用于制備抗腦出血藥物。

與本發(fā)明有關(guān)的參考文獻(xiàn)：

1.vischer,u.m.&demoerloose,p.vonwillebrandfactor:fromcellbiologytotheclinicalmanagementofvonwillebrand'sdisease.crit.rev.oncol.hematol.30,93-109(1999).

2.nieswandt,b.&stoll,g.thesmaller,thebetter:vwfinstroke.blood.115,1477-1478(2010).

3.ruggeri,z.m.vonwillebrandfactor,plateletsandendothelialcellinteractions.j.thromb.haemost.1,1335-1342(2003).

4.chauhan,a.k.,etal.adamts13:anewlinkbetweenthrombosisandinflammation.j.exp.med.205,2065-2074(2008).

5.gandhi,c.,khan,m.m.,lentz,s.r.&chauhan,a.k.adamts13reducesvascularinflammationandthedevelopmentofearlyatherosclerosisinmice.blood.119,2385-2391(2012).

6.zhao,b.q.,etal.vonwillebrandfactor-cleavingproteaseadamts13reducesischemicbraininjuryinexperimentalstroke.blood.114,3329-3334(2009).

7.petri,b.,etal.vonwillebrandfactorpromotesleukocyteextravasation.blood.116,4712-4719(2010).

8.keep,r.f.,hua,y.&xi,g.intracerebralhaemorrhage:mechanismsofinjuryandtherapeutictargets.lancet.neurol.11,720-731(2012).

9.ziai,w.c.hematologyandinflammatorysignalingofintracerebralhemorrhage.stroke.44,s74-78(2013).

10.fernandez-klett,f.,etal.earlylossofpericytesandperivascularstromalcell-inducedscarformationafterstroke.j.cereb.blood.flow.metab.33,428-439(2013).

11.bell,r.d.,etal.apolipoproteinecontrolscerebrovascularintegrityviacyclophilina.nature.485,512-516(2012).

12.zhao,x.,zhang,y.,strong,r.,grotta,j.c.&aronowski,j.15d-prostaglandinj2activatesperoxisomeproliferator-activatedreceptor-gamma,promotesexpressionofcatalase,andreducesinflammation,behavioraldysfunction,andneuronallossafterintracerebralhemorrhageinrats.j.cereb.blood.flow.metab.26,811-820(2006).

13.muller,w.a.mechanismsofleukocytetransendothelialmigration.annu.rev.pathol.6,323-344(2011).

14.hernandez-guillamon,m.,etal.mmp-2/mmp-9plasmalevelandbrainexpressionincerebralamyloidangiopathy-associatedhemorrhagicstroke.brain.pathol.22,133-141(2012).

15.fan,x.,lo,e.h.&wang,x.effectsofminocyclineplustissueplasminogenactivatorcombinationtherapyafterfocalembolicstrokeintype1diabeticrats.stroke.44,745-752(2013).

16.xi,g.,strahle,j.,hua,y.&keep,r.f.progressintranslationalresearchonintracerebralhemorrhage:isthereanendinsight？prog.neurobiol.115,45-63(2014).

17.bernardo,a.,etal.plateletsadheredtoendothelialcell-boundultra-largevonwillebrandfactorstringssupportleukocytetetheringandrollingunderhighshearstress.j.thromb.haemost.3,562-570(2005).

18.andre,p.,etal.plateletsadheretoandtranslocateonvonwillebrandfactorpresentedbyendotheliuminstimulatedveins.blood.96,3322-3328(2000).

19.dole,v.s.,bergmeier,w.,mitchell,h.a.,eichenberger,s.c.&wagner,d.d.activatedplateletsinduceweibel-palade-bodysecretionandleukocyterollinginvivo:roleofp-selectin.blood.106,2334-2339(2005).

20.bath,p.m.,blann,a.,smith,n.&butterworth,r.j.vonwillebrandfactor,p-selectinandfibrinogenlevelsinpatientswithacuteischaemicandhaemorrhagicstroke,andtheirrelationshipwithstrokesub-typeandfunctionaloutcome.platelets.9,155-159(1998).

21.vergouwen,m.d.,etal.reducedadamts13activityindelayedcerebralischemiaafteraneurysmalsubarachnoidhemorrhage.j.cereb.blood.flow.metab.29,1734-1741(2009).

22.gandhi,c.,motto,d.g.,jensen,m.,lentz,s.r.&chauhan,a.k.adamts13deficiencyexacerbatesvwf-dependentacutemyocardialischemia/reperfusioninjuryinmice.blood.120,5224-5230(2012).

23.hillgruber,c.,etal.blockingvonwillebrandfactorfortreatmentofcutaneousinflammation.j.invest.dermatol.134,77-86(2014).

24.zhang,l.,etal.multitargetedeffectsofstatin-enhancedthrombolytictherapyforstrokewithrecombinanthumantissue-typeplasminogenactivatorintherat.circulation.112,3486-3494(2005).

25.ma,q.,etal.vascularadhesionprotein-1inhibitionprovidesantiinflammatoryprotectionafteranintracerebralhemorrhagicstrokeinmice.j.cereb.blood.flow.metab.31,881-893(2011).

26.pfefferkorn,t.&rosenberg,g.a.closureoftheblood-brainbarrierbymatrixmetalloproteinaseinhibitionreducesrtpa-mediatedmortalityincerebralischemiawithdelayedreperfusion.stroke.34,2025-2030(2003).

27.amenta,p.s.,jallo,j.i.,tuma,r.f.,hooper,d.c.&elliott,m.b.cannabinoidreceptortype-2stimulation,blockade,anddeletionalterthevascularinflammatoryresponsestotraumaticbraininjury.j.neuroinflammation.11,191(2014).

28.yang,y.&rosenberg,g.a.blood-brainbarrierbreakdowninacuteandchroniccerebrovasculardisease.stroke.42,3323-3328(2011).

29.rynkowski,m.a.,etal.amousemodelofintracerebralhemorrhageusingautologousbloodinfusion.nat.protoc.3,122-128(2008).

30.garrett,m.c.,etal.synergisticneuroprotectiveeffectsofc3aandc5areceptorblockadefollowingintracerebralhemorrhage.brain.res.1298,171-177(2009).

31.wang,l.,etal.recombinantadamts13reducestissueplasminogenactivator-inducedhemorrhageafterstrokeinmice.ann.neurol.73,189-198(2013).

32.lenting,p.j.,etal.anexperimentalmodeltostudytheinvivosurvivalofvonwillebrandfactor.basicaspectsandapplicationtother1205hmutation.j.biol.chem.279,12102-12109(2004).

33.cai,p.,etal.recombinantadamts13attenuatesbraininjuryafterintracerebralhemorrhage.stroke.(2015).

34.fan,w.,etal.caspase-3modulatesregenerativeresponseafterstroke.stem.cells.32,473-486(2014).

35.zhao,b.q.,etal.essentialroleofendogenoustissueplasminogenactivatorthroughmatrixmetalloproteinase9inductionandexpressiononheparin-producedcerebralhemorrhageaftercerebralischemiainmice.blood.103,2610-2616(2004).

36.zhao,b.q.,etal.roleofmatrixmetalloproteinasesindelayedcorticalresponsesafterstroke.nat.med.12,441-445(2006).。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供抗腦出血藥物，涉及血管性血友病因子vwf 在制物中的新用途。具體涉及血管性血友病因子vwf在制備抗腦出血藥物靶點(diǎn)中的用途。本發(fā)明經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，抑制vwf活性有助于減輕腦出血后的炎癥反應(yīng)并減輕腦水腫，所述vwf可作為減輕腦出血損傷的有效靶點(diǎn)，進(jìn)一步用于制備抗腦出血藥物。

本發(fā)明中，進(jìn)行了vwf在實(shí)驗(yàn)性腦出血后的病理生理作用實(shí)驗(yàn)：采用小鼠自體血建造腦出血模型，檢測造模后小鼠行為功能、腦水腫、血腦屏障通透性、大腦炎癥反應(yīng)、細(xì)胞粘附分子-1(icam-1)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(mmp-9)等指標(biāo)；結(jié)果顯示，腦出血的小鼠血漿中vwf的含量明顯增加，且vwf在血腫周邊大量累積；注射vwf會(huì)增加促炎介質(zhì)的表達(dá)并引起icam-1和mmp-9的激活，同時(shí)伴有髓過氧化物酶活性升高、中性粒細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞聚集；

與對(duì)照組小鼠相比，給予vwf的小鼠周細(xì)胞明顯減少，血腦屏障損傷加重，腦水腫增加，且神經(jīng)元的損傷加重；相反，給予抗vwf抗體干預(yù)后能減少血腦屏障通透性，改善小鼠的神經(jīng)功能；

本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，與對(duì)照組小鼠相比，給予vwf會(huì)使腦出血后腦水腫增加；尤其是，結(jié)果表明，使用抗vwf抗體抑制vwf能夠減小bbb通透性，并保護(hù)小鼠引起額外出血；實(shí)驗(yàn)結(jié)果明顯表明vwf在腦出血中的重要的病理生理作用；揭示了腦出血后出現(xiàn)臨床惡化表現(xiàn)，其中不僅僅只是因?yàn)檠[周邊形成的水腫，但是水腫是腦出血的重要進(jìn)程。

本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，所述血管性血友病因子vwf能加重腦出血后的腦損傷；實(shí)驗(yàn)小鼠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，以vwf調(diào)節(jié)的炎癥反應(yīng)和bbb功能失調(diào)為靶點(diǎn)，將為治療腦出血提供極具前景的新干預(yù)方 案。

本發(fā)明經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，血管性血友病因子vwf能加重腦出血后大腦炎癥反應(yīng)和血腦屏障破壞，而抑制血管性血友病因vwf活性明顯有助于減輕腦出血后的炎癥反應(yīng)并減輕腦水腫，因此，所述的血管性血友病因子vwf可作為減輕腦出血損傷的有效藥物靶點(diǎn)，進(jìn)一步用于制備抗腦出血的藥物。

(本申請研究受到以下基金資助：國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(批準(zhǔn)號(hào)：81530034)；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(批準(zhǔn)號(hào)：30971014，81071062和81271457)；上海市自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào)：14zr1401800)。)

附圖說明

圖1.自體血出血造模后分泌的vwf；其中，(a)在假手術(shù)組或者腦出血(ich)組小鼠手術(shù)后24h，采集血漿分析檢測vwf含量，數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n＝6)，*p<0.05；(b)vwf免疫熒光染色的代表性照片，在腦內(nèi)出血區(qū)域，尤其在血腫周邊，vwf的含量上調(diào)；標(biāo)尺＝200μm；(c)血腫周邊vwf和內(nèi)皮細(xì)胞(cd31)雙染照片；；標(biāo)尺＝20μm；lv，lateralventricle，側(cè)腦室；ctx，cortex，皮層。

圖2.vwf加重腦出血后bbb破壞、腦水腫和神經(jīng)元損傷；其中，(a)使用抗vwf抗體追蹤注射到體內(nèi)的vwf蛋白在腦內(nèi)的分布；lv，lateralventricle，側(cè)腦室；ctx，cortex，皮層；(b)cd-13陽性 的周細(xì)胞(綠色)和cd-31陽性的大腦內(nèi)皮細(xì)胞(紅色)雙染，展示對(duì)照組和給予vwf小鼠腦出血后24h血腫周邊毛細(xì)血管、周細(xì)胞的分布；標(biāo)尺＝30μm；(c)定量檢測血腫周邊區(qū)域同cd-31陽性的毛細(xì)血管共標(biāo)的cd-13陽性的周細(xì)胞；數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n＝5)；(d)對(duì)照組及給予vwf小鼠腦出血后24h腦內(nèi)滲出尹文思藍(lán)(藍(lán)色)的代表性大腦冠狀切片照片；(e)紫外分光光度計(jì)檢測尹文思藍(lán)滲出量；數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n＝8)，*p<0.05；(f)野生型及vwf敲除小鼠腦出血(用膠原酶造模)24h后腦內(nèi)滲出尹文思藍(lán)(藍(lán)色)的代表性大腦冠狀切片照片；(g)紫外分光光度計(jì)檢測尹文思藍(lán)滲出量；數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n＝8)，*p<0.05；(h)對(duì)照組及給予vwf小鼠腦出血后72h腦水腫含量；ipsi,ipsilateralhemisphere，損傷側(cè)；contral,contralateralhemisphere，對(duì)側(cè)；cereb,cerebellum，小腦；數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n＝8)，*p<0.05；(i,g)對(duì)照組及給予vwf小鼠在腦出血72h后腦片fluoro-jadeb染色的代表性照片(i)和fjb-陽性神經(jīng)元的定量檢測；標(biāo)尺＝20μm；數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n＝5)，*p<0.05；(k)野生型及vwf敲除小鼠腦出血(用膠原酶造模)72h后腦水腫含量；數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n＝8)，*p<0.05。

圖3.vwf增加腦出血后大腦內(nèi)炎癥調(diào)節(jié)因子的表達(dá)；其中，(a-c)對(duì)照組小鼠、給予vwf組小鼠以及假手術(shù)組小鼠腦內(nèi)cxcl1、cx3cl1和ccr1相關(guān)基因的表達(dá)；(d-f)對(duì)照組小鼠、給予vwf組小鼠以及假手術(shù)組小鼠腦內(nèi)mpo活性及il-6和il-1β的含量；數(shù)值用平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n＝5)，*p<0.05；(g)ldh檢測證實(shí)給予vwf沒有誘發(fā)培養(yǎng)的大腦內(nèi)皮細(xì)胞死亡；呈現(xiàn)的是3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中有代表性的數(shù)據(jù)；(h)用he染色檢測發(fā)現(xiàn)腦室內(nèi)注射vwf72h后未引起神經(jīng)損傷；(i)用tunel染色檢測發(fā)現(xiàn)向正常小鼠腦室內(nèi)注射vwf72h后未誘導(dǎo)產(chǎn)生神經(jīng)毒性；lv，lateralventricle，側(cè)腦室；ctx，cortex，皮層。

圖4.vwf促進(jìn)腦出血后炎癥細(xì)胞聚集以及icam-1和mmp-9水平升高；其中，(a,c)對(duì)照組小鼠、腦室注射vwf組小鼠和股靜脈注射vwf組小鼠腦出血后24h，小膠質(zhì)細(xì)胞和中性粒細(xì)胞免疫熒光染色的代表性照片；使用dapi染細(xì)胞核；標(biāo)尺＝15μm；(b,d)血腫周邊激活型小膠質(zhì)細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的定量分析；數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n＝5)，*p<0.05；將突起回縮、胞體相對(duì)增大的小膠質(zhì)細(xì)胞認(rèn)為是激活型的；(e)對(duì)照組小鼠及給予vwf組小鼠腦出血24h后腦內(nèi)icam-1定量數(shù)據(jù)和有代表性的免疫印跡照片；數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n＝5)；(f)對(duì)照組小鼠及給予vwf組小鼠腦出血24h后腦內(nèi)mmp-9定量數(shù)據(jù)和有代表性的明膠酶譜照片；數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n＝5)。

圖5.抗vwf抗體能改善腦出血后神經(jīng)功能和腦水腫；其中，(a)用抗兔的二抗標(biāo)記注射到體內(nèi)的抗vwf抗體在腦內(nèi)的的分布；(b)給予陰性對(duì)照兔igg、兔抗vwf抗體的小鼠腦出血后24h滲出的尹文思藍(lán)(藍(lán)色)的有代表性的大腦冠狀切片照片；(c)紫外分光光度計(jì)檢測尹文思藍(lán)滲出量；數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n＝8)，*p<0.05； (d)給予陰性對(duì)照兔igg、兔抗vwf抗體的小鼠腦出血后72h的腦水腫含量；ipsi,ipsilateralhemisphere，損傷側(cè)；contral,contralateralhemisphere，對(duì)側(cè)；cereb,cerebellum，小腦。數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n＝8)，*p<0.05；(e)給予陰性對(duì)照兔igg、兔抗vwf抗體的小鼠腦出血后72h的神經(jīng)功能得分；數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n＝8)，*p<0.05。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1、材料和方法

(1)腦出血造模和給藥方法

成年雄性c57/bl6小鼠，10到12周齡，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。以c57/bl6小鼠為背景的vwf敲除鼠購自jackson實(shí)驗(yàn)室；(所有的實(shí)驗(yàn)步驟已得到復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物關(guān)愛和使用委員會(huì)的批準(zhǔn))。

采用1-1.5％異氟烷將小鼠麻醉，根據(jù)文獻(xiàn)采用小鼠自體血二次注入法構(gòu)建腦出血模型；為了誘導(dǎo)產(chǎn)生大小適當(dāng)、可重復(fù)的腦水腫及明顯的神經(jīng)功能缺失；注入30μl小鼠自體血造模，在小鼠顱骨左側(cè)鉆一個(gè)直徑1mm的小孔，自小鼠尾動(dòng)脈取30μl自體血，用26g針頭沿鉆孔中心按坐標(biāo)：前囟前0.2mm，向左旁開2.3mm，垂直緩慢進(jìn)針，深2.8mm；用微量注射泵以2ul/min的速度注入5ul，再落針0.7mm，停針7min，然后將其余25ul血以2ul/min的速度注入，停針10min后，將針緩慢移出，用骨蠟封閉鉆孔；腦出血造模30min后，通過腦 室注射純化的人源vwf(270ng溶于3μlpbs；haematologictechnologies,essexjunction,vt,usa)或pbs；為了檢測不同的指標(biāo)，在腦出血造模30min通過股靜脈注射vwf(5μg/mouse)或pbs，兔抗vwf抗體(6μg/g體重,clonea0082；dako)或陰性對(duì)照兔igg在腦出血后10min注射；為檢測敲除vwf對(duì)bbb通透性和腦水含量是否有影響，采用膠原酶構(gòu)建腦出血模型，將小鼠置于立體定位儀，按如下坐標(biāo)：前囟前0.2mm，向左旁開2.3mm，深3.5mm，緩緩注入0.5μ含0.025u膠原酶vii(sigma-aldrich)的生理鹽水；(2)vwf、白細(xì)胞介素6(il-6)、白細(xì)胞介素1β(il-1β)水平測定

腦出血后24h，預(yù)先在離心管內(nèi)加入100ul3.8％檸檬酸鈉，用毛細(xì)管從小鼠眼眶中取血。將血液離心后吸取血漿，儲(chǔ)存于-80℃冰箱；將兔抗人vwf抗體(1:600；a0082,dako,carpinteria,ca,usa)用1×pbs稀釋，加100ul稀釋液到96孔板內(nèi)，置于4℃冰箱過夜待用；次日將96孔板內(nèi)的抗體倒出，用含0.1％tween20和0.3％牛血清(bsa；sigma-aldrich,stlouis,mo,usa)的pbst洗去多余抗體；向每個(gè)孔內(nèi)加100ul血漿稀釋液(按1:40比例用含3％bsa的pbs稀釋)，室溫孵育2h。在洗后，加100ulhrp-vwf抗體稀液(按1:2000比例用含3％bsa的pbs稀釋；dako)到96孔板內(nèi)，室溫孵育1h；洗去多余二抗，加入100ul的tmb底物反應(yīng)體系(sigma-aldrich)，室溫避光反應(yīng)15min；加入100μl2nhcl終止反應(yīng)；用酶標(biāo)儀(bio-rad,hercules,ca,usa)測定od450值；取15只正常小鼠取 血制備血漿，再將血漿混勻進(jìn)一步制備標(biāo)準(zhǔn)曲線；使用elisa試劑盒(r&dsystems)檢測il-6和il-1β的表達(dá)水平；

(3)腦水腫含量測定

腦出血造模后72h，用水合氯醛將小鼠深麻，迅速取腦，將腦組織分為左右半球及小腦三部分，每個(gè)大腦半球圍繞針眼取4mm厚的組織，在電子分析天平(mettlertoledo,columbus,oh,usa)稱取濕重，再置于100℃烘箱內(nèi)烘干24h，稱取干重后計(jì)算腦含水量；其中，腦含水量(％)＝(濕重-干重)/濕重×100％

(4)細(xì)胞培養(yǎng)

采用小鼠大腦內(nèi)皮細(xì)胞系(bend.3)(americantypeculturecollection,manassas,va)，細(xì)胞在含10％胎牛血清(invitrogen)的dmem培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于加濕的37攝氏度培養(yǎng)箱，并通入5％co2；在細(xì)胞中加入vwf(10μg/ml)孵育24h；使用ldh檢測試劑盒(roche,indianapolis,in)檢測ldh釋放量以評(píng)測細(xì)胞毒性(共檢測三組，每組測定三次)

(5)fluoro-jadeb染色

按照現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)進(jìn)行fluoro-jadeb染色，制備20μm厚大腦冰凍切片，腦片依次經(jīng)過100％乙醇和70％乙醇脫水，再在0.06％的高錳酸鉀中孵育10分鐘，腦片經(jīng)雙蒸水洗后，再在0.0004％fluoro-jadeb染液(溶于0.1％的乙酸)中孵育15分鐘；所述腦片再經(jīng)水洗，脫水，二甲苯中透明，用olympusfv1000共聚焦顯微鏡拍照；選取40x物鏡下血腫周邊4個(gè)位置統(tǒng)計(jì)fluoro-jadeb陽性細(xì) 胞數(shù)

(6)實(shí)時(shí)定量熒光pcr

在損傷側(cè)大腦半球加入trizol試劑(invitrogen,camarillo,ca,usa)提取總rna，用分光光度計(jì)定量檢測od值；采用revertaidfirststrandcdnasynthesiskit(fermentas,glenburnie,md,usa)將rna反轉(zhuǎn)錄；在abi7300pcr儀(appliedbiosystems,fostercity,usa)上進(jìn)行pcr反應(yīng)；將β-actin作為內(nèi)參。

本實(shí)施例中：cxcl1、ccr1和gapdh的引物序列如下：

cxcl1(forward,5′-actgcacccaaaccgaagtc-3′,reverse,5′-caagggagcttcagggt-caa-3′),

cx3cl1(forward,5′-gcacaggatgcagggcttac-3′,reverse,5′-tgtcagccgcctcaaa-act-3′),

ccr1(forward,5′-ctgagggcccgaactgttac-3′,reverse,5′-ggctagggcccaggtgat-3′),

gapdh(forward,5′-aatgtgtccgtcgtggatctga-3′,reverse,5′-gatgcctgcttcaccaccttct-3′)；

(7)mpo活性測定

取損傷側(cè)腦組織，加入500μl50mmol/l磷酸鹽緩沖液(ph7.0)勻漿；勻漿液經(jīng)過離心，棄上清，加入1％htab，凍融三次；離心后，取40ul上清加入到96孔板中，然后加入100ultmb試劑(sigma-aldrich)，用2nhcl終止反應(yīng)，用450nm波長測定od值；使用純化的mpo建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，將od450值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算mpo 值；

(8)明膠酶譜實(shí)驗(yàn)

按照現(xiàn)有文獻(xiàn)進(jìn)行明膠酶譜實(shí)驗(yàn)，將40μg蛋白樣品與sds上樣緩沖液混勻，加到含0.1％明膠的10％tris-glycine凝膠上；電泳結(jié)束后，凝膠用含2.5％tritonx-100的緩沖液洗30min，再加入(50mmtrisph7.6,0.2mmnacl,5mmcacl2,0.02％brij-35)，37℃孵育48h，孵育完成，加入100ml含0.1％考馬斯亮藍(lán)的染液染色，反應(yīng)3h，均勻脫色；掃描凝膠后，使用quantityone軟件進(jìn)行分析(bio-rad)；

(9)免疫熒光染色

腦出血造模后24h，用水合氯醛將小鼠深麻，使用涼的pbs和4％多聚甲醛(pfa，ph7.4；sigma-aldrich)灌流；腦組織在4％pfa中后固定，再在30％蔗糖中4℃浸泡過夜；使用切片機(jī)(leicamicrosystemsinc.,buffalogrove,il,usa)制備20μm厚的冠狀冰凍切片；按常規(guī)進(jìn)行免疫組化染色；使用olympusbx51顯微和olympusfv1,000共聚焦顯微鏡采集照片；使用olympusfv10-asw軟件處理共聚焦照片；使用的一抗為：兔抗vwf(ab154193,abcam)，兔抗人vwf(dako)，大鼠抗cd31(pecam-1,bdpharmingen,sandiego,ca,usa)，大鼠抗小鼠ly-6b.2(abdserotec,raleigh,nc,usa)，山羊抗iba1(abcam,cambridge,ma,usa)和fitc-conjugated大鼠抗小鼠aminopeptidasen(cd13)(bdpharmingen)；二抗：alexafluor488驢抗兔immunoglobuling(igg)，alexafluor594驢 抗大鼠igg，alexafluor594驢抗山羊igg和alexafluor594驢抗兔igg(invitrogen)；采用dapi染細(xì)胞核，在40x物鏡下，選取血腫周邊4個(gè)位置，對(duì)血腫周邊ly6b和iba-1標(biāo)記的細(xì)胞定量檢測；使用imagej軟件計(jì)數(shù)，單位以個(gè)/mm²表示。選取0.42mm²區(qū)域，以cd13陽性信號(hào)面積與cd31陽性信號(hào)的面積比值表示周細(xì)胞的量；每只動(dòng)物，選取3張腦片(間隔400μm)進(jìn)行檢測分析；

(10)westernblotting實(shí)驗(yàn)

出血造模后24h，將小鼠灌流取腦，把大腦分為出血側(cè)和出血對(duì)側(cè)；圍繞針眼，將出血側(cè)大腦切出4mm，加入含蛋白酶抑制劑cocktails(rochediagnosticsgmbh,mannheim,germany)的ripa裂解液勻漿；將等量的蛋白樣品加到10％sds凝膠中，電泳后，轉(zhuǎn)到pvdf膜，加入含0.1％tween20的5％脫脂奶粉封閉，不同的檢測指標(biāo)分別用山羊抗小鼠icam-1(intercellularadhesionmolecule-1,r&dsystems)，山羊抗小鼠vcam-1(vascularcelladhesionmolecule-1,r&dsystems)和兔抗β-actin(cellsignalingtechnology)抗體孵育，然后用hrp標(biāo)記的二抗孵育；加入ecl試劑(millipore)顯影，使用bio-imageanalysissystem(bio-rad)掃描，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；

(11)bbb通透性

在出血造模后21h，給小鼠注射2％的尹文思藍(lán)(溶于pbs，4ml/kg，sigma-aldrich)，循環(huán)3h后灌流；將出血側(cè)的大腦組織在甲酰胺中浸泡72h,在620nm波長測od，測定尹文思藍(lán)滲出量；

(12)神經(jīng)功能評(píng)分

在出血造模后24h和72h，采用雙盲法，對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行神經(jīng)損傷評(píng)分；為量化分析神經(jīng)功能損傷，采用5分法評(píng)分：0分，無神經(jīng)功能損傷體征；1分，不能完全伸直對(duì)側(cè)前爪；2分，對(duì)側(cè)方推力的抵抗力減弱；3分，自發(fā)性地向左轉(zhuǎn)圈；4分，無自主活動(dòng)或意識(shí)水平低；5分小鼠死亡；

本實(shí)驗(yàn)的所有數(shù)據(jù)均采用mean±sd表示；在經(jīng)過bonferroni’s多重比較檢測后，采用單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；兩組比較時(shí)，采用未配對(duì)雙尾studentt檢驗(yàn)，行為學(xué)數(shù)據(jù)使用mannwhitneyu檢驗(yàn)分析，p<0.05被認(rèn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義；

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：

(1)腦出血導(dǎo)致血漿vwf表達(dá)上調(diào)

對(duì)小鼠腦出血后24hvwf的表達(dá)水平進(jìn)行檢測；酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(elisa)分析表明，與假手術(shù)組小鼠相比，腦出血組小鼠血漿中vwf的量明顯上升(如圖1a所示,p<0.05)，上述結(jié)果表明腦出血后內(nèi)皮細(xì)胞被激活，釋放出大量vwf；通過免疫染色，結(jié)果顯示，腦出血后，在血腫區(qū)域，尤其在血腫周邊區(qū)域有大量vwf存在(如圖1b所示)；免疫雙標(biāo)的照片證明vwf與內(nèi)皮細(xì)胞部分共標(biāo)(如圖1c所示)；

(2)vwf增加bbb通透性并加重腦水腫

采用抗vwf抗體(不與鼠的vwf反應(yīng))追蹤注射到小鼠體內(nèi)的vwf在腦內(nèi)的分布；通過vwf染色，在腦室內(nèi)(數(shù)據(jù)未展示)和大腦實(shí)質(zhì)均能檢測到vwf(如圖2a所示)；采用周細(xì)胞的標(biāo)志物cd13，對(duì) 腦出血后24小時(shí)血腫周邊的周細(xì)胞進(jìn)行定量檢測，與對(duì)照組相比，注射vwf的小鼠周細(xì)胞數(shù)量明顯減少(如圖2b、2c所示,p<0.05)；通過測定尹文思藍(lán)滲出量檢測bbb通透性：注射vwf的小鼠損傷側(cè)大腦半球尹文思藍(lán)滲出量增加了79％(如圖2d、2e所示,p<0.05)；對(duì)照組小鼠損傷側(cè)腦水腫是80.21±1.31％，給予vwf組小鼠損傷側(cè)腦水腫是81.84±0.83％(如圖2h所示,p<0.05)，與之對(duì)應(yīng)的對(duì)側(cè)的腦水腫，對(duì)照組是77.50±0.43％，給予vwf組的是77.03±1.05％(p>0.05)，上述數(shù)據(jù)表明vwf明顯加重出血側(cè)的腦水腫；在膠原酶誘導(dǎo)的腦出血模型中，結(jié)果進(jìn)一步顯示，與野生型小鼠相比，vwf敲除的小鼠bbb通透性和腦水腫都顯著減少(如圖2f、2g、2k所示)；除此之外，通過fluoro-jadeb染色，結(jié)果顯示，給予vwf的小鼠損傷側(cè)大腦退行變性的神經(jīng)元明顯增加(如圖2i、2j所示，p<0.05)；

(3)vwf加重腦出血后大腦炎癥反應(yīng)

對(duì)腦出血后24h出血側(cè)大腦內(nèi)幾種炎癥因子的基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，腦出血后cxcl1、cxcl13和趨化因子受體ccr1的水平顯著升高(如圖3a-c所示,p<0.05)；與對(duì)照組相比，給予vwf后進(jìn)一步增加了上述因子的表達(dá)水平(p<0.05)；所述髓過氧化物酶(mpo)，為一種炎癥細(xì)胞—髓細(xì)胞的特異性標(biāo)志，在腦出血后活性大幅升高(如圖3d所示)；實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腦出血后給予vwf的小鼠比對(duì)照組小鼠的mpo活性明顯高(p<0.05)，與之對(duì)應(yīng)，與假手術(shù)組小鼠相比，在腦出血后24小時(shí)，促炎因子il-6和 il-1β表達(dá)水平都顯著增加，且給予vwf的實(shí)驗(yàn)組更高(如圖3e、3f所示)；本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)也通過免疫組化對(duì)腦出血后大腦內(nèi)炎癥細(xì)胞進(jìn)行定量檢測，與對(duì)照組相比，腦出血造模后通過腦室給予vwf或者股靜脈注射vwf均能促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活(如圖4a、4b所示,p<0.05)和中興粒細(xì)胞聚集(如圖4c、4d所示,p<0.05)；在假手術(shù)組，均未檢測到激活的小膠質(zhì)細(xì)胞和浸潤的中性粒細(xì)胞(數(shù)據(jù)未展示)；

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，所述vwf能加重腦出血后大腦炎癥反應(yīng)；因icam-1和vcam-1等粘附因子通過bbb調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的侵入，檢測vwf對(duì)icam-1和vcam-1的表達(dá)是否有影響；通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，給予vwf的小鼠在腦出血后24hicam-1的表達(dá)水平顯著增高(如圖4e所示,p<0.05)，對(duì)照組和給予vwf組vcam-1的表達(dá)沒有顯著差異(數(shù)據(jù)未展示)；金屬基質(zhì)蛋白酶-9(mmp-9)調(diào)節(jié)腦出血后的炎癥反應(yīng)；采用明膠酶譜法測定腦出血后腦組織mmp-9活性變化，結(jié)果表明，給予vwf能夠提高腦出血后mmp-9活性；

(4)抑制vwf改善腦出血后功能結(jié)果、bbb通透性并減少腦水腫

本實(shí)施例進(jìn)一步研究腦出血后使用抗vwf抗體抑制vwf后產(chǎn)生的影響；通過股靜脈注射vwf抗體后，使用抗兔的二抗標(biāo)記抗體在腦內(nèi)的分布；在大腦實(shí)質(zhì)中檢測到熒光標(biāo)記的vwf抗體(如圖5a所示)；注射抗vwf抗體的小鼠均存活，結(jié)果顯示，與igg對(duì)照組相比，vwf抗體能顯著減小損傷側(cè)bbb通透性、減輕腦水腫(如圖5b-d所示,p<0.05)，但未改變對(duì)側(cè)的腦水腫；此外，與igg對(duì)照組相比，給予vwf 抗體的小鼠神經(jīng)功能損傷減輕(如圖5b所示)。

本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，(1)腦出血后血漿中vwf含量上調(diào)，并積累在血腫周邊的內(nèi)皮細(xì)胞中；(2)vwf加重腦出血后大腦炎癥反應(yīng)、bbb破壞和神經(jīng)元損傷；(3)抑制vwf能夠明顯減輕腦出血后腦水腫以及改善腦出血后功能結(jié)果；

基于有關(guān)基礎(chǔ)研究表明的，局部促炎因子的釋放和內(nèi)皮粘附分子的表達(dá)上調(diào)是腦出血后早期的反應(yīng)，繼而內(nèi)皮細(xì)胞受損、炎癥細(xì)胞侵入，進(jìn)一步造成腦損傷；以及炎癥反應(yīng)刺激vwf分泌，引起vwf在血管壁呈線狀沉積，進(jìn)而調(diào)節(jié)血小板的粘附；以及血小板結(jié)合到vwf會(huì)促進(jìn)白細(xì)胞的粘附和遷移，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加重及擴(kuò)散等；揭示了在腦出血及蛛網(wǎng)膜下腔出血的病人血漿中發(fā)現(xiàn)vwf的含量升高；本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組小鼠相比，腦出血組的小鼠血漿和大腦中vwf的表達(dá)明顯升高；給予vwf能加重腦出血后的大腦中炎癥反應(yīng)，本發(fā)明的結(jié)果與已報(bào)道的在諸如免疫復(fù)合體所致的血管炎、動(dòng)脈粥樣硬化和心肌缺血疾病中，vwf敲除的小鼠浸潤的中性粒細(xì)胞減少結(jié)論一致；

本發(fā)明還基于有關(guān)基礎(chǔ)研究表明的，icam-1和mmp-9在腦出血、蛛網(wǎng)膜下腔出血和腦缺血中調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，icam-1和mmp-9在腦損傷引發(fā)的bbb破裂的病理機(jī)制中發(fā)揮重要作用等，本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予vwf能顯著增加icam-1的表達(dá)并提高mmp-9的活性，同時(shí)伴隨著周細(xì)胞明顯缺失和加重的bbb損傷；上述結(jié)果表明，icam-1和mmp-9可能是vwf的下游信號(hào)分子和可能的bbb調(diào)節(jié)因子；治療腦出血的一個(gè)重要目標(biāo)是抑制腦水腫形成，因腦水可能對(duì)腦出血后出現(xiàn) 的不良后果有極大的影響；本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組小鼠相比，給予vwf會(huì)使腦出血后腦水腫增加；使用抗vwf抗體抑制vwf能減小bbb通透性，并保護(hù)小鼠引起額外出血。

sequencelisting

<110>復(fù)旦大學(xué)

<120>血管性血友病因子vwf在制備抗腦出血藥物靶點(diǎn)中的用途

<130>20160120

<160>8

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>cxcl1-forward

<400>1

actgcacccaaaccgaagtc20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>cxcl1-reverse

<400>2

caagggagcttcagggtcaa20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>cx3cl1-forward

<400>3

gcacaggatgcagggcttac20

<210>4

<211>19

<212>dna

<213>cx3cl1-reverse

<400>4

tgtcagccgcctcaaaact19

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>ccr1-forward

<400>5

ctgagggcccgaactgttac20

<210>6

<211>18

<212>dna

<213>ccr1-reverse

<400>6

ggctagggcccaggtgat18

<210>7

<211>22

<212>dna

<213>gapdh-forward

<400>7

aatgtgtccgtcgtggatctga22

<210>8

<211>22

<212>dna

<213>gapdh-reverse

<400>8

gatgcctgcttcaccaccttct22