本發(fā)明涉及天然藥物領(lǐng)域，涉及異喹啉生物堿的鹽及晶型的醫(yī)藥用途，具體涉及黃柏堿的鹽及晶型的醫(yī)藥用途。

背景技術(shù)：

糖尿病是一種由于胰島素分泌缺陷及(或)其生物學(xué)作用障礙引起的以高血糖為特征的代謝疾病，是在遺傳基礎(chǔ)上，有環(huán)境因素參與的遺傳易感性疾病，是一種慢性全身性代謝疾病，嚴重危害人類健康，積極開展糖尿病的防治工作已成為主要的社會公共衛(wèi)生問題。

i型糖尿病的發(fā)病原因主要是由于胰島素分泌絕對缺少，ii型糖尿病是從胰島素抵抗為主伴胰島素相對不足到胰島素分泌不足為主伴胰島素抵抗的病理過程。目前公認ii型糖尿病是一種在環(huán)境因素、生活方式的改變的作用下由多個基因分別或相互作用所導(dǎo)致的復(fù)雜遺傳病，但是ii型糖尿病的病因尚未完全闡明。

西醫(yī)目前常采用飲食、運動療法磺酰脲類、雙胍類、噻唑烷二酮類、α-葡萄糖苷酶抑制劑、瑞格列奈、胰島素等來治療ii型糖尿病，僅噻唑烷二酮類可改善胰島素抵抗。病人在用西藥治療的同時，又不斷地出現(xiàn)動脈硬化、冠心病和高血壓等并發(fā)癥，ii型糖尿病的復(fù)雜機制及其導(dǎo)致的全身病變是西藥治療的薄弱環(huán)節(jié)。不論是磺脈類的促泌劑還是噻唑烷二酮類的增敏劑在實驗和臨床研究中都不具備明顯的減肥功效，而肥胖是2型糖尿病乃至代謝綜合征的重要病理基礎(chǔ)。

ii型糖尿病不僅是糖代謝紊亂疾病，還是脂肪代謝紊亂疾病。肥胖引起的ii型糖尿病患者通常都有高糖和高脂飲食，并常伴有高脂血癥。有研究表明提示血糖“正?！钡姆逝只颊咭延笑录毎置诠δ艿漠惓！５牵蟛糠值姆逝终卟⒉话l(fā)展為糖尿病，說明機體的自身狀況起重要作用。在同樣的毒性作用下，易感人群很容易發(fā)展成ii型糖尿病，而不敏感人群可能終身不發(fā)病，或者延遲發(fā)病?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)并不能夠改變機體的易感性，但可以通過改變生活方式，減肥等手段來盡可能地減少早期的誘因，盡量的延長代償期，從而延遲2型糖尿病的發(fā)生，甚至避免發(fā)病。

現(xiàn)代ii型糖尿病的治療觀點已從已往的單純控制血糖轉(zhuǎn)為降糖、降脂、降壓、改善胰島素抵抗等多環(huán)節(jié)治療。但是，對于ii型糖尿病患者，藥量需逐漸增加，投藥種類也常由單一用藥逐漸變?yōu)槁?lián)合用藥，這不可避免地要考慮藥物代謝對肝腎的副作用。故從傳統(tǒng)中藥中尋找低毒、療效肯定的天然藥物來治療是目前研糖尿病究熱點之一。

衛(wèi)生部制定頒布的《中藥新藥治療消渴病(糖尿病)的臨床研究指導(dǎo)原則》中所制定的分類標(biāo)準(zhǔn)是目前采用最廣泛的分類方法，即陰虛熱盛證、氣陰兩虛證、陰陽兩虛證和血疲氣滯證四型。

非酒精性脂肪肝是一種無過量飲酒史，由各種原因引起的肝細胞內(nèi)脂肪堆積，以肝細胞脂肪變性和脂質(zhì)蓄積為主要特征的臨床病理綜合征，也是一種臨床常見病癥。

糖尿病腎病(diabeticnephropathy，dn)是糖尿病最重要的并發(fā)癥之一，我國的發(fā)病率亦呈上升趨勢，目前已成為終末期腎病的第二位，僅次于腎小球腎炎，由于存在復(fù)雜的代謝紊亂，糖尿病發(fā)生腎臟損害，特別是一旦進入臨床蛋白尿期，病情一般不可逆轉(zhuǎn)，往往呈進行性發(fā)展直至終末期腎病，往往比其他腎臟疾病的治療更加困難，是引起糖尿病患者死亡的主要原因之一，dn的發(fā)病機制和治療藥物的研制受到了醫(yī)學(xué)界極大的重視?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)上多從飲食控制、血糖控制、降壓、調(diào)整脂代謝等方面著手，或是采用透析、腎移植等治療手段，尚無療效確切的西藥能阻止dn腎功能損害的進程。臨床其主要診斷的特征為白蛋白排泄率，和白蛋白肌酐比值。

黃柏為我國常用的傳統(tǒng)中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，原名“檗木”，列為上品，其性味苦、寒，主歸腎、膀胱經(jīng)，具有清熱燥濕，灣火除蒸，解毒療疫之功效，用于濕熱汚痢，黃疸尿赤，帶下陰癢，熱淋淫痛，腳氣痿蹵，骨蒸勞熱，盜汗，遺精，腫毒，濕疹?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃柏具有抗菌、抗真菌、抗炎、抗肝炎、抗腎炎、抗?jié)⒉?、抗氧化、抗痛風(fēng)、降血壓、降血糖、抗腫瘤、抗心力衰竭、抑制細胞免疫等作用。目前黃柏制劑在臨床上已經(jīng)廣泛運用，如治療鼻竇炎、急慢性膿耳、急慢性骨髓炎、慢性結(jié)腸炎、皮膚糜爛、膿拖性皮損、濕疫皮炎、潰竊性口腔炎、外痔腫痛、肛痛以及術(shù)后外洗、治療軟組織挫傷、消腫等病癥。(《黃柏中黃柏堿的提取純化工藝研究》，《西南交通大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文》，羅鴻，2012年)。

黃柏堿(phellodendrine)是從蕓香科植物黃柏(phelhdendronchinensisschneid.)、威氏黃柏的莖皮中提取分離出來的一種異喹啉生物堿，其具有降血壓、抗腎炎、抑制細胞免疫反應(yīng)、中樞神經(jīng)抑制等作用。

黃柏堿的藥理作用主要有：降壓作用，主要表現(xiàn)為靜注于貓和鼠和犬均可引起降壓，并能增強腎上腺素和去甲腎上腺素的升壓反應(yīng)，抑制人工窒息及刺激迷走神經(jīng)向中端的升壓反應(yīng)，抑制刺激節(jié)前纖維而起的貓瞬膜收縮。隨劑量增大，降壓作用強度及持續(xù)時間也增加；植物神經(jīng)阻斷作用，表現(xiàn)為黃柏堿對中樞神經(jīng)有抑制作用，能抑制小鼠的自發(fā)活動和各種反射；肌肉松馳作用；對細胞免疫應(yīng)答期的誘導(dǎo)期有抑制作用。

《黃柏中幾種生物堿的分離、鑒定及促胰島素分泌活性篩選》(《中國醫(yī)藥指南》，2011年3月，第9卷，第7期，第54-55頁，周明偉、范明松、季宇斌、唐意紅)記載了：從黃柏的生物堿部分分離得到3個化合物，分別為小檗堿、藥根堿、黃柏堿。研究發(fā)現(xiàn)，在葡萄糖濃度為5.6mmol/l時，黃柏總堿中的3種生物堿對胰島素的分泌均無明顯的促進作用；而當(dāng)葡萄糖濃度為16.7mmol/l時，小檗堿能夠明顯的促進細胞的胰島素分泌。陽性藥格列美脲在低糖濃度和高糖濃度時，都能夠促進胰島素分泌。

未見有關(guān)黃柏堿晶型的報道。

未見有關(guān)黃柏堿晶型及其鹽對于糖尿病有預(yù)防或治療作用的報道。

未見有關(guān)黃柏堿晶型及其鹽對于高脂血癥有預(yù)防或治療作用的報道。

未見有關(guān)黃柏堿晶型及其鹽對于非酒精性脂肪肝有預(yù)防或治療作用的報道。

未見有關(guān)黃柏堿晶型及其鹽對于糖尿病腎病有預(yù)防或治療作用的報道。

未見有關(guān)黃柏堿晶型及其鹽的制備工藝的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

異喹啉生物堿的鹽或晶型用于制備治療或預(yù)防糖尿病的組合物。

異喹啉生物堿的鹽或晶型用于制備保護胰島細胞、或、修復(fù)受損胰島細胞的組合物，或，用于制備對抗胰島素抵抗的組合物。

異喹啉生物堿的鹽或晶型用于制備治療或預(yù)防非酒精性脂肪肝的組合物。

異喹啉生物堿的鹽或晶型用于制備治療或預(yù)防糖尿病腎病的組合物。

異喹啉生物堿為黃柏堿。

為市售或按已知方法制備的黃柏堿或其藥用鹽、水合物或無水物、或晶型。

黃柏堿藥用鹽包括：無機酸鹽例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽和磷酸鹽；有機酸鹽例如乙酸鹽，苯甲酸鹽，馬來酸鹽，富馬酸鹽，蘋果酸鹽，檸檬酸鹽，草酸鹽，乳酸鹽，琥珀酸鹽，酒石酸鹽，烷基磺酸鹽或芳基磺酸鹽，半胱氨酸鹽或其它氨基酸鹽；還包括堿式鹽如鈉鹽、鉀鹽和鈣鹽；

黃柏堿藥用鹽包括，其晶型。

本發(fā)明的組合物，其特征為：藥物、保健品、或功能性食品，賦形劑或載體為制藥或食品領(lǐng)域中常用的賦形劑或載體，如稀釋劑，崩解劑，潤滑劑等。

本發(fā)明的組合物，其特征為：為通過口服或注射形式使用

本發(fā)明的組合物，其特征為：預(yù)防或治療i、或ii型糖尿病。

在黃柏堿的藥理活性研究中，本發(fā)明意外地發(fā)現(xiàn)黃柏堿具有顯著的減低血糖作用。本發(fā)明通過(1)stz造模的糖尿病小鼠，通過(2)高脂誘導(dǎo)的2型糖尿病動物模型(dio小鼠)，進行了禁食血糖檢測(fbg)。

在黃柏堿的藥理活性研究中，本發(fā)明意外地發(fā)現(xiàn)黃柏堿具有顯著的減低血脂作用，意外地發(fā)現(xiàn)黃柏堿能降低膽固醇，甘油三酯和低密度脂蛋白的水平，出人意料地發(fā)現(xiàn)黃柏堿能提升高密度脂蛋白的水平，從而可用于預(yù)防和、或治療與高血脂有關(guān)的疾病或癥狀。

在黃柏堿的藥理活性研究中，本發(fā)明意外地發(fā)現(xiàn)黃柏堿具有顯著的治療或預(yù)防非酒精性脂肪肝作用，意外地發(fā)現(xiàn)黃柏堿有效緩解高脂飼料引起的非酒精性脂肪肝變性，改善因脂肪變性而導(dǎo)致的肝功能損害。

黃柏堿藥用鹽按照本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)制備、或、

黃柏堿藥用鹽按照如下方式制備，取黃柏堿單體，用氯仿溶解，加入氯仿的酸溶液，析出沉淀，過濾干燥，得到黃柏堿的藥用鹽單體，用乙醇溶解，置冰箱放置，析晶，過濾干燥，得到黃柏堿的藥用鹽，純度達到98％以上；

本發(fā)明所述的黃柏堿(phellodendrine)，cas號為6873-13-18，其分子式是c20h24no4，相對分子質(zhì)量342，具有式如下的結(jié)構(gòu)：

本發(fā)明所述的鹽酸黃柏堿的結(jié)構(gòu)式如下：

本發(fā)明所述的檸檬酸黃柏堿鹽結(jié)構(gòu)式如下：

黃柏堿的鹽酸鹽、檸檬酸鹽的優(yōu)選的制備方法

(1)總生物堿的提取

配制質(zhì)量分數(shù)為3.0％的nacl溶液，調(diào)其ph為3.0；干燥黃柏藥材用該溶液以料液比1∶8浸泡提取2次，每次48h，合并提取液；

(2)黃柏堿的粗分

將合并提取液通過hpd100型大孔吸附樹脂柱層析吸附，干燥的黃柏藥材與大孔吸附樹脂的質(zhì)量比為1∶5，上樣速度控制在2.0ml/min，上樣完畢后靜止吸附2.0h；吸附完畢后，先用3.0bv的水洗脫除雜；再用30％乙醇洗脫3.0bv，收集洗脫液，于50℃減壓濃縮得浸膏；

(3)黃柏堿的純化精制

將浸膏通過10％氨水堿化的200-300目硅膠柱層析：浸膏與填料堿化硅膠的重量比為1∶30，先采用三氯甲烷-甲醇30∶1洗脫5.0bv，再用5.0bv甲醇洗脫，收集合并甲醇洗脫部分；將甲醇洗脫液于45℃條件下減壓濃縮干燥，得黃柏堿粗品；

(4)鹽酸黃柏堿結(jié)晶的制備

將黃柏堿粗品先用少量乙醇溶解，再滴加濃hcl調(diào)溶液ph至3.0，置冰箱4℃條件下放置24h，析晶，過濾干燥，上述方法反復(fù)重結(jié)晶得到純度達到98％的鹽酸黃柏堿。

(5)檸檬酸黃柏堿鹽結(jié)晶的制備

將黃柏堿粗品先用少量乙醇溶解，再滴加檸檬酸調(diào)溶液ph至3.0，置冰箱4℃條件下放置24h，析晶，過濾干燥，上述方法反復(fù)重結(jié)晶得到純度達到98％的檸檬酸黃柏堿鹽。

黃柏堿晶型鑒定報告

本品外觀為白色粉末，為了鑒定晶型對其進行了如下表征：

由黃柏堿的拉曼譜圖可知：黃柏堿該晶型的出峰位置在3027.98，2934.40，1612.19，1454.43，1346.48，803.70，757.01，710.76，670.10，594.22，447.83，418.96，400.67，283.32，221.56，176.72，103.27，83.85cm^-1。

由黃柏堿的dsc圖譜可知：黃柏堿該晶型在升溫到250℃左右開始熔化。

由黃柏堿的tga圖譜可知：黃柏堿該晶型的分解溫度是270.13℃。

黃柏堿的xrd圖譜及數(shù)據(jù)

黃柏堿x射線衍射數(shù)據(jù)

anodecu，wavelength11.5406a°，wavelength21.54443a°

generator40kv，generator40ma

step0.02°，steptime0.3s，startangle3.00°

endangle40.00°，slit1.0/1.0/ni/0.2，datemar-26-2015

黃柏堿的紅外圖譜

由該譜圖可知，其出峰位置為3404.71，3058.97，2835.29，2739.91，1612.26，1529.37，1456.07，1336.58，1451.80，1355.27，1262.70，1356.27，1262.70，1226.76，1210.56，1180.94，1114.01，1122.24，1027.05，1009.90，878.82，848.68，837.53，802.99，733.58，698.08cm-1。

在3404.71cm-1位置出現(xiàn)一個強而且較寬的峰，此峰應(yīng)該為黃柏堿酚羥基與結(jié)構(gòu)中形成氫鍵的羥基伸縮振動，

3058.97cm-1出現(xiàn)的則是其結(jié)構(gòu)中苯環(huán)c-h的伸縮振動，

2835.29cm-1和2739.91cm-1對應(yīng)的則是其結(jié)構(gòu)中烷基c-h的伸縮振動。

在2500cm-1到2300cm-1存在的峰有可能是叔胺鹽r3nh+的n-h伸縮振動。

峰1612.26cm-1和1529.37cm-1極有可能是結(jié)構(gòu)中苯環(huán)的c＝c伸縮振動。

其余的峰對應(yīng)的可能是烷基c-h彎曲振動、c-n的伸縮振動以及苯環(huán)c-h的面外彎曲振動。

基于上述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明現(xiàn)已完成。為了便于理解，下面通過附圖和具體實施例對本發(fā)明的黃柏堿在治療糖尿病藥物中的用途進行詳細的描述。需要特別指出的是，具體實施例和附圖僅是為了說明，顯然本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)本文說明，對本發(fā)明進行各種修正或改變，這些修正和改變也將納入本發(fā)明范圍之內(nèi)。

附圖說明

圖1.黃柏堿對i型糖尿病小鼠胰腺組織的影響

圖2.黃柏堿對ii型糖尿病小鼠口服糖耐量的影響

圖3.黃柏堿對ii型糖尿病小鼠胰島素耐量的影響

圖4.黃柏堿對非酒精性脂肪肝小鼠肝臟組織的影響

圖5：腎臟he染色

圖6：腎臟pas染色

圖7.黃柏堿的拉曼圖譜

圖8.黃柏堿的dsc圖譜

圖9.黃柏堿的tga圖譜

圖10.黃柏堿的xrd圖譜及數(shù)據(jù)

圖11.黃柏堿的紅外圖譜

圖12.黃柏堿的鹽酸鹽的cnmr圖

圖13.黃柏堿的鹽酸鹽的hnmr圖

圖14.黃柏堿的鹽酸鹽的ms圖

圖15.黃柏堿的檸檬酸鹽的cnmr圖

圖16黃柏堿的檸檬酸鹽的hnmr圖

圖17黃柏堿的檸檬酸鹽的ms圖

圖1的詳細說明

圖1通過上中下三個部分展示黃柏堿對i型糖尿病小鼠胰腺組織的影響；

圖1的上部展示正常組小鼠胰腺組織；

圖1的中部展示stz組小鼠胰腺組織；

圖1的下部展示stz+黃柏堿組小鼠胰腺組織。

圖2的詳細說明

圖2展示黃柏堿對ii型糖尿病小鼠口服糖耐量的影響；

圖2中，control為正常飲食組，hfd為高脂飲食組，hfd+phellodendrine為高脂+phellodendrine組。

圖3的詳細說明

圖3展示黃柏堿對ii型糖尿病小鼠胰島素耐量的影響

圖3中，control為正常飲食組，hfd為高脂飲食組，hfd+phellodendrine為高脂+phellodendrine組。

圖4的詳細說明

圖4通過左上、右上、左下、右下四個部分展示黃柏堿對非酒精性脂肪肝小鼠肝臟組織的影響；

圖4的左上部展示正常組小鼠肝臟組織；

圖4的右上部展示高脂組小鼠肝臟組織；

圖4的左下部展示洛伐他汀組小鼠肝臟組織；

圖4的右下部展示黃柏堿小鼠肝臟組織。

圖5的詳細說明

圖5通過上中下三個部分展示腎臟he染色；

圖5的上部展示正常組小鼠腎臟組織；

圖5的中部展示stz組小鼠腎臟組織；

圖5的下部展示stz+黃柏堿組小鼠腎臟組織。

圖6的詳細說明

圖6通過上中下三個部分展示腎臟pas染色；

圖6的上部展示正常組小鼠腎臟組織；

圖6的中部展示stz組小鼠腎臟組織；

圖6的下部展示stz+黃柏堿組小鼠腎臟組織。

圖8的詳細說明

樣品是：phellodendrine，用量2.0440mg

橫坐標(biāo)單位是溫度(℃)；

圖9的詳細說明

樣品是：phellodendrine，用量6.3330mg

橫坐標(biāo)單位是溫度(℃)；

圖10的詳細說明

橫軸：2thetascale；

本發(fā)明涉及如下表格

表1.黃柏堿對stz造模的i型糖尿病小鼠的禁食血糖的影響。

表2.黃柏堿對stz造模的小鼠胰島數(shù)目的影響

表3.黃柏堿對高脂造模的ii型糖尿病禁食血糖的影響

表4.正常組小鼠糖耐量原始數(shù)據(jù)及相應(yīng)線下面積

表5.高脂組小鼠糖耐量原始數(shù)據(jù)及相應(yīng)線下面積

表6.黃柏堿治療高脂飲食小鼠糖耐量原始數(shù)據(jù)及線下面積

表7.黃柏堿對口服糖耐量線下面積數(shù)據(jù)分析

表8.正常組小鼠糖胰島素耐量原始數(shù)據(jù)及線下面積

表9.高脂組小鼠糖胰島素耐量原始數(shù)據(jù)及線下面積

表10.黃柏堿治療高脂飲食小鼠糖胰島素耐量原始數(shù)據(jù)

表11.黃柏堿對高脂飲食小鼠糖胰島素耐量線下統(tǒng)計分析

表12.各組小鼠血脂指標(biāo)的變化

表13.各組小鼠肝功能相關(guān)指標(biāo)的變化

表14.黃柏堿對stz造模的糖尿病腎病的血糖的影響

表15.黃柏堿對stz造模的糖尿病腎病的尿量的影響

表16.黃柏堿對stz造模的糖尿病腎病的uae(24h尿白蛋白排泄率)的影響.

表17.黃柏堿對stz造模的糖尿病腎病的uacr(ug尿白蛋白/mg肌酐比值)的影響.

具體實施方式

實施例1

為了研究黃柏堿對i型糖尿病血糖影響，本實驗采用經(jīng)典的i型糖尿病模型，使用c57bl小鼠隨機分為3組，正常對照組(10只)，stz組(20只)。stz組連續(xù)腹腔注射stz(50mg/kg)5天，兩周后測定禁食血糖，血糖大于等于13.8mmol/l為造模成功。然后將stz組隨機分為stz組和黃柏堿治療組，每組10只，黃柏堿治療組采用口服灌胃(15mg/kg)10周后，禁食4h后測定禁食血糖結(jié)果如圖1所示，具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。

動物的一般情況：

胰島組織病理學(xué)檢查：石蠟切片、he染色，觀察病理變化

表1.黃柏堿對stz造模的i型糖尿病血糖的影響.

注：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，與stz組相比。

結(jié)果表明黃柏堿能夠有效的降低stz造成的i型糖尿病的血糖

表2.黃柏堿對stz造模的小鼠胰島數(shù)目的影響

注：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，與stz組相比。

隨機選取胰腺病理切片9個視野進行統(tǒng)計。附圖1的結(jié)果顯示stz造模后胰腺萎縮，組織結(jié)構(gòu)壞死，通過黃柏堿治療后胰島組織形態(tài)結(jié)構(gòu)恢復(fù)明顯。注：標(biāo)尺為20μm，放大倍數(shù)400倍。

實施例2

為了研究黃柏堿對ii型糖尿病的影響，本實驗采用經(jīng)典的ii型糖尿病模型，使用c57bl小鼠隨機分為3組，正常對照組(10只)，模型組(10只)，黃柏堿治療組(10只)，其中模型組和黃柏堿治療組采用高脂飲食(基礎(chǔ)飼料加入20％豬油)造模8周，黃柏堿治療組在高脂飲食同時采用口服灌胃(50mg/kg)方式給藥，給藥結(jié)束后測定禁食過夜測定、空腹血糖、葡萄糖耐量和胰島素耐量。實驗數(shù)據(jù)進行方差分析，結(jié)果以x±s表示。結(jié)果顯示，黃柏堿治療效果明顯，具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。

實驗結(jié)果：

表3.黃柏堿對高脂造模的ii型糖尿病禁食血糖的影響

注：***p＜0.001，與正常組相比；*p＜0.05，***p＜0.001，與高脂組相比

糖耐量試驗是一種口服葡萄糖負荷試驗，用以了解機體對進食葡萄糖后的血糖調(diào)節(jié)能力。通過糖耐量試驗，可以早期發(fā)現(xiàn)糖代謝異常，是目前公認的診斷糖尿病的金標(biāo)準(zhǔn)，在血糖增高但尚未達到糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)時，為明確是否患糖尿病，可以采用ogtt進行鑒別診斷。正常情況下，機體有一套維持血糖的機制，口服葡萄糖，血糖短暫升高后迅速恢復(fù)正常，即糖耐量正常，相應(yīng)的口服糖耐量曲線線下面積較小，糖尿病患者糖的利用障礙，口服葡萄糖后血糖迅速升高，血糖下降速度較慢，即糖耐量減退相應(yīng)的線下面積較大，該實驗中糖耐量減退，

如圖2所示黃柏堿治療組和正常組的糖耐量曲線均在模型組曲線下，相應(yīng)的線下面積也均低于模型組，且具有統(tǒng)計意義。

糖耐量實驗方法：小鼠禁食過夜，小鼠口服血糖2g/kg后分別在0，15，30，60，90，120min時，尾尖采血測定相應(yīng)血糖，使用graphpadprism軟件計算相應(yīng)線下面積(auc)

胰島素耐受實驗方法：小鼠禁食過夜，小鼠腹腔注射胰島素0.75iu/kg后分別在0，30，60，90，120，150min時，尾尖采血測定相應(yīng)血糖，使用graphpadprism軟件計算相應(yīng)線下面積(auc)

糖耐量原始數(shù)據(jù)如下：

表4.正常組小鼠糖耐量原始數(shù)據(jù)

表5.高脂組小鼠糖耐量原始數(shù)及相應(yīng)線下面積

表6.黃柏堿治療高脂飲食小鼠糖耐量原始數(shù)及線下面積

圖2.黃柏堿對ii型糖尿病小鼠口服糖耐量的影響

注：control為正常飲食組，hfd為高脂飲食組，hfd+phellodendrine組為高脂

表7.黃柏堿對口服糖耐量線下面積數(shù)據(jù)分析

胰島素耐量試驗是反映機體對胰島素敏感性的實驗，ii型糖尿病的主要特征為胰島素抵抗，對胰島素敏感性降低，即注射相同胰島素相同時間內(nèi)血糖高于正常機體，如圖3所示，高脂造模后對胰島素敏感性降低，注射相同量的胰島素后各個點的血糖值均高于正常組，其相應(yīng)的線下面積也高于正常組，給予黃柏堿治療后各個時間點的血糖數(shù)值低于模型組，相應(yīng)線下面積低于高脂誘導(dǎo)的模型組。結(jié)果表明黃柏堿能夠有效的增加胰島素敏感性改善糖尿病。

表8.正常組小鼠糖胰島素耐量原始數(shù)據(jù)

表9.高脂組小鼠糖胰島素耐量原始數(shù)據(jù)

表10.黃柏堿治療組小鼠糖胰島素耐量原始數(shù)據(jù)

圖3.黃柏堿對ii型糖尿病小鼠胰島素耐量的影響

表11.黃柏堿對ii型糖尿病小鼠糖胰島素耐量線下統(tǒng)計分析

注：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，與高脂組比較

可見：與正常組相比，模型組小鼠空腹血糖值顯著升高，說明ii型糖尿病模型造模成功。同時，與模型組相比，黃柏堿有顯著的降低空腹血糖的作用和增加葡萄糖耐受、增強胰島素敏感性。

實施例3

黃柏堿對高脂血癥和非酒精性脂肪肝的治療作用，

1、實驗動物及方法：

c57bl小鼠，spf級，雄性，體重(20±2)g，隨機分成兩組，第一組12只，為正常組，給與正常飼料，其余小鼠(44只)分為第二組，給與高脂飼料(基礎(chǔ)飼料加入20％豬油，1.25％膽固醇，0.5％的膽酸鈉)自由攝食、飲水。連續(xù)喂養(yǎng)8周后，從正常對照組和脂肪肝模型組分別處死4只小鼠，比較兩組小鼠的血清和肝臟生化指標(biāo)，以及肝臟組織病理切片，判斷非酒精性脂肪肝模型小鼠是否建立成功。

將造模成功小鼠32只隨機分為4組，分別為正常對照組(8只)，模型組(8只)，黃柏堿治療組(8只)，陽性對照組(洛伐他汀組8只)，連續(xù)灌胃給藥8周。給藥期間，除正常對照組標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)外，其余各組繼續(xù)給予高脂飲食，直到實驗結(jié)束。黃柏堿治療組在高脂飲食同時采用口服灌胃(50mg/kg)方式給藥，陽性對照組在高脂飲食同時采用口服灌胃洛伐他汀(60mg/kg)方式給藥)

2、觀察指標(biāo)：

a動物的一般情況

實驗動物在spf動物房中飼養(yǎng)，12h光照12h黑夜，自由飲食飲水，實驗期間動物狀態(tài)正常。

b肝功能相關(guān)指標(biāo)：血清alt、ast，

c血脂相關(guān)指標(biāo)：tc、tg、hdl、ldl

d病理學(xué)檢查：he染色

3、實驗結(jié)果：

結(jié)果表明：黃柏堿均可明顯降低血漿中的總膽固醇(tc)和甘油三酯(tg)，升高高密度脂蛋白(hdl)，降低低密度脂蛋白(ldl)，降低血漿中天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ast)，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alt)，病理切片結(jié)果顯示有效緩解高脂飼料引起的非酒精性脂肪肝變性，改善因脂肪變性而導(dǎo)致的肝功能損害。

給藥結(jié)束后測定小鼠、血脂水平。實驗數(shù)據(jù)進行方差分析，結(jié)果以x±s表示。結(jié)果顯示，黃柏堿對降低高脂效果明顯，具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。

表12.各組小鼠血脂指標(biāo)的變化

表13各組小鼠肝功能相關(guān)指標(biāo)的變化

實施例4

為了研究黃柏堿對糖尿病腎病血糖影響，使用c57bl小鼠隨機分為3組，正常對照組(10只)，stz組(20只)。stz組連續(xù)腹腔注射stz(50mg/kg)5天，兩周后測定禁食血糖，血糖大于等于13.8mm為糖尿病造模成功。然后將stz組隨機分為stz組和黃柏堿治療組，stz組僅正常飼養(yǎng)，黃柏堿治療組采用口服灌胃(15mg/kg)，12周后，將小鼠放入小鼠代謝籠中，自由飲食飲水，將尿液用于分析，所測指標(biāo)均為臨床上糖尿病腎病的檢測的經(jīng)典指標(biāo)，如表14-16所示stz組相比空白對照組，顯著升高均在10倍以上，說明糖尿病小鼠腎功能出現(xiàn)嚴重損傷，如圖1、2所示stz組相比正常組器官損傷明顯。綜合以上表圖可以得出糖尿病腎病造模成功。

表14.結(jié)果表明黃柏堿能夠有效的降低stz造成的血糖升高，逆轉(zhuǎn)由糖尿病腎病引起的尿量增加(表15)，有效的降低糖尿病腎病引起的24h蛋白排泄率升高(表16)。臨床上常用尿液中白蛋白和肌酐的比值評估腎功能，黃柏堿的有效的降低糖尿腎病引起的白蛋白和肌酐的比值升高(表17)。尿量、24h蛋白排泄率白蛋白和肌酐的比值的結(jié)果表明黃柏堿治療很好的改善了腎功能。

為了更進一步的評估腎臟器官性損傷的改變，本發(fā)明對腎臟進行pas染色和he染色。圖5，6顯示：黃柏堿能夠有效的修復(fù)糖尿病腎病的器官性損傷逆轉(zhuǎn)，如圖所示stz組腎小球系膜區(qū)增寬，基質(zhì)增加，腎小球基膜增厚，腎小管基膜增厚及分裂，呈現(xiàn)出極為典型的糖尿病腎病特征，顯示造模良好，而黃柏堿在一定程度上修復(fù)，系膜區(qū)相對縮小，改善了基質(zhì)增生以及腎小管基膜增厚，說明治療作用明顯效果顯著。

表14.黃柏堿對stz造模的糖尿病腎病的血糖的影響(單位：mm).

注：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，與stz組相比。

表15.黃柏堿對stz造模的糖尿病腎病的尿量的影響(單位：g).

表16.黃柏堿對stz造模的糖尿病腎病的uae(24h尿白蛋白排泄率，單位：μg)的影響.

表17.黃柏堿對stz造模的糖尿病腎病的uacr(μg尿白蛋白/mg肌酐比值)的影響.

注：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，與stz組相比。

實施例5

黃柏堿的制劑

黃柏堿片劑

黃柏堿10mg，淀粉88g，硬脂酸鎂3g

制備工藝：取黃柏堿過100目篩，加淀粉、硬脂酸鎂混合均勻，制成顆粒，干燥，壓片，即得。

黃柏堿膠囊

黃柏堿10mg，淀粉88g，硬脂酸鎂3g

制備工藝：取黃柏堿過100目篩，加淀粉、硬脂酸鎂混合均勻，制成顆粒，干燥，裝膠囊，即得。

黃柏堿注射液

黃柏堿47mg，注射用氯化鈉7mg

制備工藝：取黃柏堿過100目篩，加1.9ml注射用水溶解，加入注射用氯化鈉至等滲，調(diào)節(jié)ph值至7～7.1，濾過，冷藏24小時，加注射用水至規(guī)定量，濾過，灌封，滅菌，即得。

實施例6

黃柏堿的食品制劑

干酵母5g、溫水90ml、水少許、面粉150g、黃柏堿5mg，植物油10g、低鈉鹽少許

餅干做法：把酵母撒在溫水里攪拌倒溶化，加入黃柏堿。加入面粉攪拌，再加入植物油，揉成光滑的面團；面團制成0.2cm厚的薄片；壓出造型，刺洞，表面撒上水，撒上一點低鈉鹽，室溫發(fā)酵10分鐘；烤箱預(yù)熱120度，放在上層，烤約10分鐘，得到含黃柏堿的食品。

實施例7

黃柏堿單體(純度在91％～92％)100mg，先用10ml氯仿溶解，加入10ml0.1mhcl氯仿溶液，析出沉淀，過濾干燥，得到鹽酸黃柏堿單體，用1ml乙醇溶解，置冰箱4℃條件下放置24h，析晶，過濾干燥，得到鹽酸黃柏堿單體，純度達到98％以上。

黃柏堿單體(純度在91％～92％)100mg，先用10ml氯仿溶解，加入10ml0.1mh2so4氯仿溶液，析出沉淀，過濾干燥，得到硫酸黃柏堿單體，用1ml乙醇溶解，過濾，濾液置冰箱4℃條件下放置24h，析晶，過濾干燥，得到硫酸黃柏堿單體，純度達到98％以上。

黃柏堿單體(純度在91％～92％)100mg，先用10ml氯仿溶解，加入10ml0.1m磷酸氯仿溶液，析出沉淀，過濾干燥，得到磷酸黃柏堿單體，用1ml乙醇溶解，過濾，濾液置冰箱4℃條件下放置24h，析晶，過濾干燥，得到磷酸黃柏堿單體，純度達到98％以上。

黃柏堿單體(純度在91％～92％)100mg，先用10ml氯仿溶解，加入10ml0.1m果酸氯仿溶液，析出沉淀，過濾干燥，得到果酸黃柏堿單體，用1ml乙醇溶解，過濾，濾液置冰箱4℃條件下放置24h，析晶，過濾干燥，得到果酸黃柏堿單體，純度達到98％以上。

黃柏堿單體(純度在91％～92％)100mg，先用10ml氯仿溶解，加入10ml0.1m草酸氯仿溶液，析出沉淀，過濾干燥，得到草酸黃柏堿單體，用1ml乙醇溶解，過濾，濾液置冰箱4℃條件下放置24h，析晶，過濾干燥，得到草酸黃柏堿單體，純度達到98％以上。

黃柏堿單體(純度在91％～92％)100mg，先用10ml氯仿溶解，加入10ml0.1m琥珀酸氯仿溶液，析出沉淀，過濾干燥，得到琥珀酸黃柏堿單體，用1ml乙醇溶解，過濾，濾液置冰箱4℃條件下放置24h，析晶，過濾干燥，得到琥珀酸黃柏堿單體，純度達到98％以上。

黃柏堿單體(純度在91％～92％)100mg，先用10ml氯仿溶解，加入10ml0.1m醋酸氯仿溶液，析出沉淀，過濾干燥，得到醋酸黃柏堿單體，用1ml乙醇溶解，過濾，濾液置冰箱4℃條件下放置24h，析晶，過濾干燥，得到醋酸黃柏堿單體，純度達到98％以上。

黃柏堿單體(純度在91％～92％)100mg，先用10ml氯仿溶解，加入10ml0.1m丙酸氯仿溶液，析出沉淀，過濾干燥，得到丙酸黃柏堿單體，用1ml乙醇溶解，過濾，濾液置冰箱4℃條件下放置24h，析晶，過濾干燥，得到丙酸黃柏堿單體，純度達到98％以上。

實施例8

鹽酸黃柏堿的制備方法

(1)總生物堿的提取

配制質(zhì)量分數(shù)為3.0％的nacl溶液，調(diào)其ph為3.0；干燥黃柏藥材用該溶液以料液比1∶8浸泡提取2次，每次48h，合并提取液；

(2)黃柏堿的粗分

將合并提取液通過hpd100型大孔吸附樹脂柱層析吸附，干燥的黃柏藥材與大孔吸附樹脂的質(zhì)量比為1∶5，上樣速度控制在2.0ml/min，上樣完畢后靜止吸附2.0h；吸附完畢后，先用3.0bv的水洗脫除雜；再用30％乙醇洗脫3.0bv，收集洗脫液，于50℃減壓濃縮得浸膏；

(3)黃柏堿的純化精制

將浸膏通過10％氨水堿化的200-300目硅膠柱層析：浸膏與填料堿化硅膠的重量比為1∶30，先采用三氯甲烷-甲醇30∶1洗脫5.0bv，再用5.0bv甲醇洗脫，收集合并甲醇洗脫部分；將甲醇洗脫液于45℃條件下減壓濃縮干燥，得黃柏堿粗品；

(6)鹽酸黃柏堿結(jié)晶的制備

將黃柏堿粗品先用少量乙醇溶解，再滴加濃hcl調(diào)溶液ph至3.0，置冰箱4℃條件下放置24h，析晶，過濾干燥，上述方法反復(fù)重結(jié)晶得到純度達到98％的鹽酸黃柏堿。

(5)鹽酸黃柏堿的結(jié)構(gòu)鑒定

測試儀器及條件：核磁共振譜測試采用brukeravance400型核磁共振儀(瑞士)，按超導(dǎo)脈沖傅里葉變換核磁共振波譜方法通則。溶劑采用氘代二甲基亞砜(dmso-d6)，tms為內(nèi)標(biāo)。對¹h核，觀察頻率為400.1mhz，對¹³c核，觀察頻率為100.6mhz。質(zhì)譜測試采用bruckeramazonsl型離子阱質(zhì)譜儀(瑞士)，

樣品用水溶解，直接進樣分析。

positiveesi-ms：m/z342.1[m+h]⁺，推斷本品的分子式為c20h24no4。¹h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ：6.85，6.73，6.72，6.66(4h，s，c-2，3，10，11)，4.77(1h，d，j＝10.0hz，h-8b)，4.70(1h，m，h-14)，4.58(1h，d，j＝15.2hz，h-8a)，3.77(3h，s，och3)，3.75(3h，s，och3)，3.66(1h，m，h-6)，3.60(1h，m，h-6)，3.28(1h，dd，j＝5.6，18.4hz，h-13a)，3.16(3h，n-ch3)，3.14(2h，m，h-5)，2.96(1h，dd，j＝10，18.6hz，h-13b)。¹³c-nmr(100mhz，dmso-d6)，δ：22.6(c-5)，33.0(c-13)，49.2(n-ch3)，51.6(c-6)，55.7(och3atc-3)，55.7(och3atc-10)，62.0(c-8)，64.3(c-14)，109.9(c-1)，112.5(c-9)，113.4(c-4)，114.7(c-12)，116.4(c-13)，118.8(c-4a)，121.8(c-12a)，124.1(c-8a)，145.5(c-11)，146.8(c-2)，147.1(c-3)，147.9(c-10)。綜合¹h，¹³c-nmr及esi-ms等波譜數(shù)據(jù)，與文獻對照，確定本品為鹽酸黃柏堿。

實施例9檸檬酸黃柏堿鹽的制備方法

(1)總生物堿的提取

配制質(zhì)量分數(shù)為3.0％的nacl溶液，調(diào)其ph為3.0；干燥黃柏藥材用該溶液以料液比1∶8浸泡提取2次，每次48h，合并提取液；

(2)黃柏堿的粗分

將合并提取液通過hpd100型大孔吸附樹脂柱層析吸附，干燥的黃柏藥材與大孔吸附樹脂的質(zhì)量比為1∶5，上樣速度控制在2.0ml/min，上樣完畢后靜止吸附2.0h；吸附完畢后，先用3.0bv的水洗脫除雜；再用30％乙醇洗脫3.0bv，收集洗脫液，于50℃減壓濃縮得浸膏；

(3)黃柏堿的純化精制

將浸膏通過10％氨水堿化的200-300目硅膠柱層析：浸膏與填料堿化硅膠的重量比為1∶30，先采用二氯甲烷-甲醇30∶1洗脫5.0bv，再用5.0bv甲醇洗脫，收集合并甲醇洗脫部分；將甲醇洗脫液于45℃條件下減壓濃縮干燥，得黃柏堿粗品；

(7)鹽酸黃柏堿結(jié)晶的制備

將黃柏堿粗品先用少量乙醇溶解，再滴加檸檬酸調(diào)溶液ph至3.0，置冰箱4℃條件下放置24h，析晶，過濾干燥，上述方法反復(fù)重結(jié)晶得到純度達到98％的檸檬酸黃柏堿鹽。

(6)檸檬酸黃柏堿鹽的的結(jié)構(gòu)鑒定

測試儀器及條件：核磁共振譜測試采用brukeravance400型核磁共振儀(瑞士)，按超導(dǎo)脈沖傅里葉變換核磁共振波譜方法通則。溶劑采用氘代二甲基亞砜(dmso-d6)，tms為內(nèi)標(biāo)。對¹h核，觀察頻率為400.1mhz，對¹³c核，觀察頻率為100.6mhz。質(zhì)譜測試采用brukeramazonsl型離子阱質(zhì)譜儀(瑞士)，

樣品用水溶解，直接進樣分析。

positiveesi-ms：m/z342.1[m+h]⁺，negativeesi-ms：190.9[m-h]^-，推斷本品的分子式為c20h24no4·c6h8o7；¹h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ：6.85，6.73，6.71，6.65(4h，s，h-2，3，10，11)，4.74(1h，d，j＝10.0hz，h-8b)，4.71(1h，m，h-14)，4.57(1h，d，j＝15.2hz，h-8a)，3.77(3h，s，och3)，3.75(3h，s，och3)，3.66(1h，m，h-6)，3.60(1h，m，h-6)，3.29(1h，dd，j＝4.8，18.0hz，h-13a)，3.14(3h，n-ch3，c-5)，2.95(1h，dd，j＝9.6，18.0hz，h-13b)，2.51(0.5h，s，h-2′，4′)；¹³c-nmr(100mhz，dmso-d6)，δ：22.7(c-5)，33.0(c-13)，49.3(n-ch3)，51.6(c-6)，55.7(och3atc-3)，55.7(och3atc-10)，62.0(c-8)，64.4(c-13a)，109.9(c-1)，112.5(c-9)，113.4(c-4)，114.7(c-12)，116.4(c-13)，118.9(c-4a)，121.8(c-12a)，124.1(c-8a)，145.5(c-11)，146.8(c-2)，147.1(c-3)，147.9(c-10)，44.6(c-2′，4′)，71.1(c-3′)，171.4(c-1′，5′)，177.2(c-6′)。綜合¹h，¹³c-nmr及esi-ms等波譜數(shù)據(jù)，與文獻對照，確定本品為檸檬酸黃柏堿鹽。