一種長效促卵泡素的緩釋藥物制劑的制作方法
【專利說明】一種長效促卵泡素的緩釋藥物制劑 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種以促卵泡素為主要藥效成分的緩釋藥物制劑，屬于藥物學、分子 醫(yī)學和疾病防治領(lǐng)域。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 促卵泡素(Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)是一種由動物腦垂體前葉分泌 的糖蛋白類促性腺激素。具有調(diào)節(jié)機體的生長、性成熟和繁殖等作用。
[0003] FSH在雌性動物可促進子宮內(nèi)膜生長、排卵、刺激多卵泡發(fā)育等。靶細胞上存在著 FSH的特異性受體，F(xiàn)SH與細胞膜上的卵泡刺激素受體結(jié)合后，通過G蛋白偶聯(lián)機制激活腺苷 酸環(huán)化酶，使細胞內(nèi)cAMP增加或引起鈣離子內(nèi)流，從而對細胞的代謝或功能活動產(chǎn)生影響。 FSH與受體結(jié)合后產(chǎn)生兩種作用。一方面活化芳香化酶，另一方面誘導LH受體形成。內(nèi)膜細 胞在LH的作用下提供19碳底物-雄烯二酮或睪酮這些底物通過基底膜進入顆粒細胞，活化 的芳香化酶把它們轉(zhuǎn)變?yōu)?7-β雌二醇(E2)，而卵泡內(nèi)膜本身只能產(chǎn)生很少量的雌激素。雌 激素協(xié)同F(xiàn)SH使顆粒細胞增生，內(nèi)膜細胞分化，卵泡液形成卵泡腔擴大，從而使卵泡生長和 發(fā)育。
[0004] 繁殖是影響畜牧業(yè)整體效益的一個關(guān)鍵因素。如何提高動物繁殖率一直都是畜牧 領(lǐng)域攻關(guān)的一個重點。在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中，種畜的人工授精已經(jīng)非常普遍，特別是在奶牛(所有 受精類型的75%)及豬(所有受精類型的85%)上的應(yīng)用。胚胎移植技術(shù)是家畜繁殖領(lǐng)域中 的一次重大革命，它能夠提高優(yōu)秀種畜的繁殖率，充分利用優(yōu)質(zhì)遺傳基因，對家畜的育種、 保種、引種及經(jīng)濟效益的提高都具有非常重要的意義。然而，通過各種手段進行家畜擴繁的 前提條件是動物的適時發(fā)情和大量優(yōu)質(zhì)卵子來源。給種畜注射適量的動物激素則可以滿足 這些前提條件：目前國際上通用的同類產(chǎn)品有Ovagen(促卵泡素源于羊垂體提取物，新西蘭 產(chǎn)）和F 〇lltr〇pin-V(促卵泡素源于豬垂體提取物，加拿大產(chǎn)），可用于超數(shù)排卵（即增加成 熟卵泡數(shù)目，每次排卵數(shù)目可達10個以上)和配合同期發(fā)情(人工授精、胚胎移植之前的關(guān) 鍵技術(shù)）。為了能夠達到超數(shù)排卵，Ovagen和Folltropin-V均需注射八次。國內(nèi)近年由浙江 寧波第二激素廠生產(chǎn)以及杭州動物藥品廠生產(chǎn)的注射用垂體促卵泡素，每療程注射2-5次， 能促進卵巢卵泡生長發(fā)育和雌激素的分泌，引起動物正常發(fā)情，但尚不推薦用于超數(shù)排卵。 目前的各種同類產(chǎn)品，均需多次注射，不僅人工成本高，更因多次驚擾動物而影響效果。多 年來，行業(yè)內(nèi)紛紛研究長效促卵泡素，包括基因重組、緩釋制劑、改變給藥途徑等不同方法， 試圖減少注射次數(shù)，但至今尚未有獸用長效促卵泡素的產(chǎn)品面市。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題，在于提供一種長效促卵泡素的緩釋藥物制劑，可應(yīng)用 于動物的超數(shù)排卵和誘導發(fā)情。
[0006] 本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：
[0007] -種長效促卵泡素的緩釋藥物制劑，所述緩釋藥物制劑的組分如下:促卵泡素、枸 櫞酸鈉-枸櫞酸緩沖液、肝素以及魚精蛋白。
[0008] 進一步地，所述促卵泡素為垂體促卵泡素，或基因重組促卵泡素。
[0009] 進一步地，所述緩釋藥物制劑劑型為注射劑或凍干粉針。
[0010] 進一步地，所述緩釋藥物制劑中肝素與魚精蛋白的比例為10:1至1:10。
[0011] 進一步地，所述緩釋藥物制劑的注射劑處方中肝素與魚精蛋白的比例為1:1，每 Iml生理鹽水或注射用水中加入促卵泡素100~1000IU，枸櫞酸鈉10~50mg，枸櫞酸0.1~ I .Omg，肝素2~10mg，魚精蛋白2~10mg。
[0012]進一步地，所述肝素與魚精蛋白的終濃度為4mg/ml。
[0013]進一步地，所述緩釋藥物制劑的凍干粉針處方中肝素與魚精蛋白的比例為1:1，每 Iml生理鹽水或注射用水中加入促卵泡素100~1000IU，枸櫞酸鈉10~50mg，枸櫞酸0.1~ 1.0 mg，甘露醇50~500mg，肝素4~40mg，魚精蛋白4~40mg。
[0014]進一步地，所述肝素為低分子肝素，其分子量為5000。
[0015] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點：
[0016] 本發(fā)明長效促卵泡素緩釋藥物制劑中含有具有緩控釋作用的低分子肝素(分子量 5000)和魚精蛋白，通過調(diào)整低分子肝素和魚精蛋白比例，可以調(diào)節(jié)藥物釋放速率。本發(fā)明 藥物可應(yīng)用于畜牧業(yè)的超數(shù)排卵和誘導發(fā)情。 【【附圖說明】】
[0017] 下面參照附圖結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
[0018] 圖1是本發(fā)明實施例垂體促卵泡素長效注射劑A1-3的體外溶出實驗結(jié)果曲線圖。
[0019] 圖2是本發(fā)明實施例垂體促卵泡素長效注射劑B1-3的體外溶出實驗結(jié)果曲線圖。 【【具體實施方式】】
[0020] 請參閱圖1和圖2所示，對本發(fā)明的實施例進行詳細的說明。
[0021] 本發(fā)明所涉及的一種長效促卵泡素的緩釋藥物制劑，所述緩釋藥物制劑的組分如 下：促卵泡素、枸櫞酸鈉-枸櫞酸緩沖液、肝素以及魚精蛋白。所述促卵泡素為垂體促卵泡 素，或基因重組促卵泡素。所述緩釋藥物制劑劑型為注射劑或凍干粉針。所述緩釋藥物制劑 中肝素與魚精蛋白的比例為10:1至1:10。
[0022] 所述緩釋藥物制劑的注射劑處方中肝素與魚精蛋白的比例為1:1，每1ml生理鹽水 或注射用水中加入促卵泡素100~1000IU，枸櫞酸鈉10~50mg，枸櫞酸0.1~l.Omg，肝素2~ 10mg，魚精蛋白2~10mg。所述肝素與魚精蛋白的終濃度為4mg/ml。
[0023] 所述緩釋藥物制劑的凍干粉針處方中肝素與魚精蛋白的比例為1:1，每1ml生理鹽 水或注射用水中加入促卵泡素100~1000IU，枸櫞酸鈉10~50mg，枸櫞酸0.1~l.Omg，甘露 醇50~500mg，肝素4~40mg，魚精蛋白4~40mg。
[0024]所述肝素為低分子肝素，其分子量為5000。
[0025]以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
[0026] 實施例1
[0027]基因重組促卵泡素的制備：
[0028] 將穩(wěn)定高表達FSH的CHO細胞接入搖瓶，逐步擴增，至密度I X IO6Ail，記為培養(yǎng)第1 天。連續(xù)14天后，取細胞培養(yǎng)液，用于純化表達產(chǎn)物。
[0029]將CHO細胞培養(yǎng)液離心，轉(zhuǎn)速9000g，4°C低溫離心20min，收集培養(yǎng)上清。采用截留 分子量為IOkDa膜超濾，收集超濾濃縮液。用Protein A親和層析柱，對濃縮液純化，得到高 純度FSH蛋白，純度約98%，比活性為WOOOIU/mg?！絶8°C儲存?zhèn)溆谩?br>[0030] 實施例2
[0031 ]垂體促卵泡素長效注射劑的制備：
[0032]取垂體促卵泡素(購自寧波第二激素廠HOOOOOIU，溶于200ml枸櫞酸鈉-枸櫞酸緩 沖液(PH6.8-7.2)中。每1毫升枸櫞酸鈉-枸櫞酸緩沖液(pH6.8-7.2)含枸櫞酸鈉30mg，枸櫞 酸0.6mg。取濃度為10mg/ml的低分子肝素(分子量5000)溶液(200、或400、或600ml)，與上述 垂體促卵泡素溶液混合。再取濃度為I 〇mg/ml的魚精蛋白溶液(600、或400、或200ml )，與上 述垂體促卵泡素與低分子肝素的溶液混合。補充枸櫞酸鈉-枸櫞酸緩沖液至1000ml。所有配 制過程需在百級無菌區(qū)內(nèi)進行。所有溶液均經(jīng)無菌過濾后使用。在攪拌下，將所得到的溶液 分裝至西林瓶中，每瓶IOml，得到垂體促卵泡素長效注射劑。
[0033] 根據(jù)所加入低分子肝素與魚精蛋白的體積，將所得到的制劑命名為垂體促卵泡素 長效注射劑Al，A2和A3。2~8°C儲存?zhèn)溆谩Ｖ苿┲懈鹘M分濃度如下表1所示：
[0034] 表1垂體促卵泡素長效注射劑A1-3的制備
[0036] 實施例3 [0037] 體外溶出實驗：
[0038] 取實施例2得到的制劑A1-3,分別置IOml離心管中，置37°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)放置，于 第6，12，24，36，48，72，96小時離心（3000rpm)，取上清200微升，ELISA方法測定FSH濃度。在 每次取樣后，離心管內(nèi)補充200微升枸櫞酸鈉-枸櫞酸緩沖液(pH6.8-7.2)。根據(jù)測定結(jié)果， 得到溶出曲線，如圖1所示。由圖1可知，制劑A2(肝素與魚精蛋白用量比例為1:1)的溶出速 率明顯慢于另外兩種，且更接近零級釋放速率。
[0039] 實施例4
[0040] 低分子肝素與魚精蛋白用量對溶出速率的影響：
[0041] 按照實施例2方法制備垂體促卵泡素長效注射劑B1-3A1-3采用低分子肝素與魚 精蛋白用量比例固定為1:1，所不同的是終濃度，具體見表2。
[0042]表2垂體促卵泡素長效注射劑B1-3的制備
[0044] 按照實施例3方法進行體外溶出實驗，結(jié)果見圖2。由圖2可知，溶出速率與肝素與 魚精蛋白的用量呈線性關(guān)系，可見隨著低分子肝素與魚精蛋白用量的增加，溶出速率逐漸 減小。說明可以通過調(diào)整低分子肝素與魚精蛋白用量，調(diào)節(jié)溶出速率。
[0045] 實施例5
[0046] 重組促卵泡素長效注射劑的制備：
[0047] 取重組促卵泡素1百萬IU，溶于200ml枸橡酸鈉-枸橡酸緩沖液(pH6.8-7.2)中。每1 毫升枸櫞酸鈉 -枸櫞酸緩沖液(PH6.8-7.2)含枸櫞酸鈉30mg，枸櫞酸0.6mg。取濃度為IOmg/ ml的低分子肝素（分子量5000)溶液400ml，與上述垂體促卵泡素溶液混合。再取濃度為 10mg/ml的魚精蛋白溶液400ml，與上述垂體促卵泡素與低分子肝素的溶液混合。補充枸櫞 酸鈉-枸櫞酸緩沖液至1000、4000、10000!111。所有配制過程需在百級無菌區(qū)內(nèi)進行。所有溶 液均經(jīng)無菌過濾后使用。在攪拌下，將所得到的溶液分裝至西林瓶中，每瓶lml，得到重組促 卵泡素長效注射劑。
[0048] 根據(jù)最終溶液的體積，將所得到的制劑命名為重組促卵泡素長效注射劑C1-3,如 下表3所示。2 - 8°C儲存?zhèn)溆谩?br>[0049] 表3重組促卵泡素長效注射劑的制備
[0051] 按照實施例3方法進行體外溶出實驗，結(jié)果與圖1-2中肝素與魚精蛋白用量比例為 1:1的A2及B2的結(jié)果類似。說明溶出曲線取決于肝素與魚精蛋白用量與比例，而與FSH種類 及終濃度無關(guān)。
[0052] 實施例6
[0053] 注射用長效重組垂體促卵泡素的制備：
[0054] 按照第Cl 一 3號制劑處方配制重組促卵泡素注射劑，在處方中另外加入甘露醇，每 制劑單位（即每支注射液）中含甘露醇100、250、500mg。按照常規(guī)凍干工藝冷凍干燥，得到凍 干粉針DI-3。室溫條件保存。
[0055]取凍干粉針D1-3,溶于IOml枸櫞酸鈉-枸櫞酸緩沖液。按照實施例3方法進行體外 溶出實驗。結(jié)果與圖1-2中肝素與魚精蛋白用量比例為1:1的A2及B2的結(jié)果類似。說明溶出 曲線取決于肝素與魚精蛋白用量與比例，而與FSH劑型無關(guān)。
[0056] 實施例7 [0057]體內(nèi)活性實驗
[0058]參照《中華人民共和國藥典》2010版二部，附錄"卵泡刺激素生物測定法"，測定所 制備FSH制劑的生物學活性。
[0059] (1)實驗動物:未成熟Sprague Dawley雌性大鼠，40 ± 2g，19-22日齡，每組8只；
[0060] (2)稀釋溶液：以lmg/ml BSA溶液溶解中人絨毛膜促性腺激素(hCG)，配制成20IU/ ml hCG溶液，混勻備用；
[0061] (3)標準品溶液:試驗當日，取190IU/瓶FSH標準品1支，用上面稀釋溶液配制成高 中低三個濃度，分別為：lOIU/ml、5IU/ml、2.5IU/ml;
[0062] (4)供試品溶液:試驗當日，用上述溶劑上面稀釋溶液按標示效價將供試品配制成 高中低三個濃度，分別為:30IU/ml、15IU/ml、7.5IU/ml;
[0063] (5)測定法:在每日大致相同時間，分別給每組大鼠皮下注射相應(yīng)藥物，標準品溶 液或供試品溶液〇.5ml。標準品溶液連續(xù)注射三天，每天一次。供試品僅于試驗第一天注射 一次，后兩天注射稀釋溶液。于最后一次注入24h后，處死大鼠，摘出卵巢，剝離附著組織，去 除輸卵管稱重。按照藥典（附錄XIV)生物檢定統(tǒng)計法中量反應(yīng)測定法計算供試品長效FSH 生物活性。
[0064] 所測試制劑為4232丄2、02，結(jié)果說明所有測試的四種制劑，注射一次的體內(nèi)生物 學活性，與連續(xù)注射3次的相同劑量的標準品一致。說明這四種制劑均可以發(fā)揮FSH緩釋作 用，可作為長效FSH使用。
[0065] 本發(fā)明長效促卵泡素緩釋藥物制劑中含有具有緩控釋作用的低分子肝素(分子量 5000)和魚精蛋白，通過調(diào)整低分子肝素和魚精蛋白比例，可以調(diào)節(jié)藥物釋放速率。本發(fā)明 藥物可應(yīng)用于畜牧業(yè)的超數(shù)排卵和誘導發(fā)情。
[0066] 雖然以上描述了本發(fā)明的【具體實施方式】，但是熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當理 解，我們所描述的具體的實施例只是說明性的，而不是用于對本發(fā)明的范圍的限定，熟悉本 領(lǐng)域的技術(shù)人員在依照本發(fā)明的精神所作的等效的修飾以及變化，都應(yīng)當涵蓋在本發(fā)明的 權(quán)利要求所保護的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種長效促卵泡素的緩釋藥物制劑，其特征在于:所述緩釋藥物制劑的組分如下:促 卵泡素、枸橡酸鈉-枸橡酸緩沖液、肝素以及魚精蛋白。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種長效促卵泡素的緩釋藥物制劑，其特征在于:所述促卵泡 素為垂體促卵泡素，或基因重組促卵泡素。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種長效促卵泡素的緩釋藥物制劑，其特征在于:所述緩釋藥 物制劑劑型為注射劑或凍干粉針。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種長效促卵泡素的緩釋藥物制劑，其特征在于:所述緩釋藥 物制劑中肝素與魚精蛋白的比例為10:1至1:10。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種長效促卵泡素的緩釋藥物制劑，其特征在于:所述緩釋藥 物制劑的注射劑處方中肝素與魚精蛋白的比例為1:1，每lml生理鹽水或注射用水中加入促 卵泡素100~1000IU，枸橡酸鈉10~50mg，枸橡酸0· 1~1 .Omg，肝素2~10mg，魚精蛋白2~ 10mg〇6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種長效促卵泡素的緩釋藥物制劑，其特征在于:所述肝素與 魚精蛋白的終濃度為4mg/ml。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種長效促卵泡素的緩釋藥物制劑，其特征在于:所述緩釋藥 物制劑的凍干粉針處方中肝素與魚精蛋白的比例為1:1，每lml生理鹽水或注射用水中加入 促卵泡素100~1000IU，枸櫞酸鈉10~50mg，枸櫞酸0.1~l.Omg，甘露醇50~500mg，肝素4~ 40mg，魚精蛋白4~40mg。8. 根據(jù)權(quán)利要求1~7任一項所述的一種長效促卵泡素的緩釋藥物制劑，其特征在于： 所述肝素為低分子肝素，其分子量為5000。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種長效促卵泡素的緩釋藥物制劑，所述緩釋藥物制劑的組分如下：促卵泡素、枸櫞酸鈉?枸櫞酸緩沖液、肝素以及魚精蛋白；所述促卵泡素為垂體促卵泡素，或基因重組促卵泡素，所述緩釋藥物制劑劑型為注射劑或凍干粉針，所述緩釋藥物制劑中肝素與魚精蛋白的比例為10:1至1:10，每1ml生理鹽水或注射用水中加入促卵泡素100～1000IU，枸櫞酸鈉10～50mg，枸櫞酸0.1～1.0mg，肝素2～10mg，魚精蛋白2～10mg。本發(fā)明可應(yīng)用于動物的超數(shù)排卵和誘導發(fā)情。
【IPC分類】A61P15/08, A61K38/24, A61K47/42, A61K47/36
【公開號】CN105709214
【申請?zhí)枴緾N201610074872
【發(fā)明人】刁勇
【申請人】華僑大學