本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶或他們的突變體在制備或篩選治療腫瘤的藥物中的用途，所述治療腫瘤的藥物為口服給藥藥物。

背景技術(shù)：

80年代以來，在世界各地癌癥研究領(lǐng)域大量研究表明乙酰膽堿酶酶(ache)和丁酰膽堿酯酶(bche)在癌癥相關(guān)組織中表達(dá)量降低或活性降低。在各種癌癥中如神經(jīng)系統(tǒng)，呼吸道，消化道，肝，胰腺相關(guān)癌癥中都伴隨乙酰膽堿酯酶表達(dá)量下降或活性降低；生殖泌尿系統(tǒng)如腎，膀胱，宮頸，卵巢，乳房，前列腺癌，皮膚，軟組織和血液系統(tǒng)相關(guān)腫瘤，ache或bche酶活性或其基因結(jié)構(gòu)功能是缺損的；血液腫瘤病人組織中ache，bche酶活性越低，病人預(yù)后越差。

近年研究表明乙酰膽堿除了神經(jīng)遞質(zhì)的功能外還是一種內(nèi)源性的生長激素，乙酰膽堿受體的過量表達(dá)或激動(dòng)效應(yīng)會(huì)誘導(dǎo)癌癥的發(fā)生，這一現(xiàn)象在吸煙引發(fā)的癌癥中尤其顯著，這提示我們乙酰膽堿過分積累或乙酰膽堿受體的過分激動(dòng)效應(yīng)會(huì)引發(fā)癌癥。

乙酰膽堿酯酶在神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的循環(huán)過程中起到了非常重要的作用，可以迅速水解神經(jīng)突觸中積累的乙酰膽堿從而維持正常的神經(jīng)傳遞功能；近代的研究表明乙酰膽堿酯酶參與了眾多的細(xì)胞功能，如細(xì)胞黏附、細(xì)胞分化和細(xì)胞增殖等；乙酰膽堿酯酶是一種細(xì)胞凋亡的標(biāo)志物，提示乙酰膽堿酯酶可能參與了細(xì)胞的凋亡；通過基因敲減的方式降低乙酰膽堿酯酶表達(dá)可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的抗凋亡和增殖活性；乙酰膽堿酯酶的抑制劑可以降低細(xì)胞凋亡和促進(jìn)增殖，這些研究結(jié)果表明乙酰膽堿酯酶在細(xì)胞的凋亡和增殖過程中起到了非常重要的作用。乙酰膽堿酯酶是一個(gè)抑癌基因，在很多癌種細(xì)胞系中表達(dá)乙酰膽堿酯酶可以抑制癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡。乙酰膽堿酯酶參與凋亡小體的形成，2004年，park等人揭示了乙酰膽堿酯酶在凋亡小體的形成過程中的作用。

基于以上事實(shí)，2008年沈等人提出乙酰膽堿酯酶表達(dá)量降低或活性降低導(dǎo)致乙酰膽堿在不同的組織和器官中積累引起微環(huán)境的平衡失調(diào)可能是造成癌癥發(fā)生的原因。因此，通過補(bǔ)充外源性的乙酰膽堿酯酶來調(diào)整乙酰膽堿的平衡來達(dá)到預(yù)防和治療癌癥的方法是科學(xué)的和可驗(yàn)證的。乙酰膽堿酯酶價(jià)格昂貴，并且只能通過靜脈注射；本發(fā)明提出一種利用殼聚糖納米顆粒作為表達(dá)乙酰膽堿酯酶的載體，通過口服的方式來達(dá)到預(yù)防和治療癌癥的方法，價(jià)格便宜，通過口服的方式提高了病人的依從性。

現(xiàn)有技術(shù)中有利用病毒將乙酰膽堿酯酶在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，從而對(duì)腫瘤有抑制的作用。但是通過病毒引進(jìn)外源基因表達(dá)，需要將基因在動(dòng)物體內(nèi)的染色體內(nèi)進(jìn)行重組插入，從而存在破壞動(dòng)物體自身基因，甚至引發(fā)動(dòng)物致癌基因突變的可能性。同時(shí)，病毒作為基因載體，有很多不安全的因素，例如免疫原性、病毒傳染性，病毒重組性等問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶或他們的突變體在制備或篩選治療腫瘤的藥物中的用途，所述治療腫瘤的藥物為口服給藥藥物，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明第一方面提供乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶或他們的突變體在制備或篩選治療腫瘤的藥物中的用途，所述治療腫瘤的藥物為口服給藥藥物。

乙酰膽堿酯酶在臨床上顯示出和腫瘤惡性程度有很強(qiáng)的相關(guān)性，同時(shí)現(xiàn)有技術(shù)中也有文章表明在體內(nèi)增加乙酰膽堿酯酶可以起到預(yù)防和治療腫瘤的效果。但是由于乙酰膽堿酯酶蛋白的極度不穩(wěn)定，所以體內(nèi)基因表達(dá)的方式成為了唯一可以增加蛋白量的途徑。現(xiàn)有技術(shù)中通過病毒的方式把乙酰膽堿酯酶基因引入小鼠體內(nèi)并觀察到了腫瘤的抑制。但是，病毒因?yàn)槠涓腥拘裕庖咴?，重組性等問題，被認(rèn)為不是一個(gè)好的基因載體。本發(fā)明將乙酰膽堿酯酶基因克隆到表達(dá)載體中，并通過口服的方式在體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，提供了一種更安全，方便的給藥方式。

本發(fā)明所提供的用途中，治療一詞包括可導(dǎo)致欲求的藥學(xué)和/或生理效果的防止性(即，預(yù)防性)、治愈性或緩和性處置。該效果較佳是指醫(yī)療上可減少腫瘤的一種或多種癥狀或者完全消除腫瘤，或阻滯、延遲腫瘤發(fā)生(即腫瘤臨床表現(xiàn)前的階段)和/或降低腫瘤發(fā)展或惡化的風(fēng)險(xiǎn)。

本發(fā)明所提供的用途中，口服給藥是指藥物經(jīng)口服后被胃腸道吸收入血，通過血液循環(huán)到達(dá)局部或全身組織，達(dá)到治療疾病的目的。對(duì)于口服藥物，藥物吸收可以始于口腔和胃，但大部分由小腸吸收，藥物必須通過小腸壁及肝臟方能進(jìn)入全身血循環(huán)?？诜o藥藥物具有使用簡便、費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn)，通常也最安全。

具體的，所述乙酰膽堿酯酶的突變體指與乙酰膽堿酯酶具有80％以上同源性，優(yōu)選具有90％以上同源性，更優(yōu)選具有95％以上同源性，且具有乙酰膽堿酯酶的功能、或更優(yōu)于乙酰膽堿酯酶的功能的多肽。

具體的，所述丁酰膽堿酯酶的突變體指與丁酰膽堿酯酶具有80％以上同源性，優(yōu)選具有 90％以上同源性，更優(yōu)選具有95％以上同源性，且具有丁酰膽堿酯酶的功能、或更優(yōu)于乙酰膽堿酯酶的功能的多肽。

由于天然的乙酰膽堿酯酶的活性在部分腫瘤細(xì)胞上沒法滿足腫瘤的完全消退，所以本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)乙酰膽堿酯酶進(jìn)行突變體的篩選，選取活性更高的突變體，以獲得更好的腫瘤預(yù)防和抑制的效果。

本發(fā)明所提供的用途中，所述用途更具體為乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶或他們的突變體的重組表達(dá)載體在制備或篩選治療腫瘤的藥物中的用途。

乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶或他們的突變體的重組表達(dá)載體為包含有對(duì)應(yīng)的乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶或他們的突變體編碼序列的表達(dá)載體。所述表達(dá)載體可選用各種適用于乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶或他們的突變體的基因表達(dá)的表達(dá)載體。具體可適用的表達(dá)載體包括但不限于帶有cmv/pgk/ef-1等啟動(dòng)子、sv40/orip等真核復(fù)制起點(diǎn)、原核復(fù)制起點(diǎn)(來源于puc、pbr322ori等)的非整合型載體(episomalplasmid)，例如pgs、prccmv。本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇合適的載體，或進(jìn)一步對(duì)現(xiàn)有的載體進(jìn)行修飾改造，以構(gòu)建所述乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶或他們的突變體的重組表達(dá)載體，從而獲得適用于口服給藥、并能夠達(dá)到期望的表達(dá)水平的乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶或他們的突變體的重組表達(dá)載體。所述期望的表達(dá)水平可以是更高的蛋白表達(dá)水平，以達(dá)到更好的腫瘤抑制效果，也可以是一個(gè)相對(duì)合理的蛋白表達(dá)水平，以針對(duì)不同個(gè)體給予合理的給藥量。

具體的，所述腫瘤選自非小細(xì)胞肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、腦膠質(zhì)瘤、頭頸癌、血液瘤等腫瘤。

本發(fā)明第二方面提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包括治療有效量的乙酰膽堿酯酶、乙酰膽堿酯酶突變體、丁酰膽堿酯酶或丁酰膽堿酯酶突變體的重組表達(dá)載體，所述藥物組合物為口服制劑。

治療有效量對(duì)應(yīng)于治療腫瘤的目的，具體指一用量在經(jīng)過適當(dāng)?shù)慕o藥期間后，能夠達(dá)到治療腫瘤的欲求效果。在本文中，若能減少一或多個(gè)病征或臨床指標(biāo)即代表該治療是“有效”的。

更具體的，所述治療腫瘤的藥物還包括藥學(xué)上可接受的載體。

具體的，藥學(xué)上可接受的載體指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體：它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在remington'spharmaceuticalsciences(mackpub.co.，n.j.1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的賦形劑的充分討論。在組合物中藥學(xué)上可 接受的載體可包括液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如崩解劑、潤濕劑、乳化劑、ph緩沖物質(zhì)、海藻膠、果膠、羧甲基纖維素鈉(cmc)、黃原膠、結(jié)冷膠、瓜爾膠、卡拉膠、蔗糖、麥芽糖醇、甜菊糖苷等。

優(yōu)選的，所述載體為各種能夠輔助消化道吸收的藥學(xué)上可接受的載體。在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述藥學(xué)上可接受的載體為殼聚糖溶液，更具體為季銨鹽殼聚糖的pbs溶液。

本發(fā)明所提供的藥物組合物中，所述表達(dá)載體可選用各種適用于乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶或他們的突變體的基因表達(dá)的表達(dá)載體。具體可適用的表達(dá)載體包括但不限于帶有cmv/pgk/ef-1等啟動(dòng)子、sv40/orip復(fù)制起點(diǎn)等、原核復(fù)制起點(diǎn)(來源于puc、pbr322ori等)的非整合型載體(episomalplasmid)，例如pgs、prccmv。

具體的，所述藥物組合物用于治療腫瘤，所述腫瘤選自非小細(xì)胞肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、腦膠質(zhì)瘤、頭頸癌、血液瘤等腫瘤。

本發(fā)明第三方面提供一種腫瘤的治療方法，通過將所述藥物組合物通過口服給藥的方式施用于個(gè)體，抑制腫瘤的增殖。

所述個(gè)體是指可接受所述藥物組合物和/或治療方法的動(dòng)物(包括人類)，在此涵蓋了雄性與雌性兩種性別，除非另有具體說明。因此，所述個(gè)體至少包含任何哺乳類動(dòng)物，包括但不限于：人類、非人類的靈長類，如哺乳動(dòng)物、狗、貓、馬、羊、豬、牛等，其可因利用所述藥物組合物進(jìn)行治療而獲益。

具體的，所述腫瘤選自非小細(xì)胞肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、腦膠質(zhì)瘤、頭頸癌、血液瘤等腫瘤。

本發(fā)明利用乙酰膽堿酯酶質(zhì)粒、丁酰膽堿酯酶質(zhì)粒口服的方式，將乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶基因游離在動(dòng)物體染色體外進(jìn)行表達(dá)，從而提高了安全性、方便性，并有更好的腫瘤預(yù)防和治療的效果。從體外細(xì)胞和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可以看到乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶表達(dá)對(duì)非小細(xì)胞肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、腦膠質(zhì)瘤、頭頸癌、血液瘤等腫瘤細(xì)胞株都有抑制的效果。此外，本發(fā)明進(jìn)一步通過引入乙酰膽堿酯酶的活性突變體，提高了所表達(dá)的乙酰膽堿酯酶的活性，從而大大提高了其在體外腫瘤細(xì)胞生長抑制和體內(nèi)動(dòng)物核瘤實(shí)驗(yàn)中的藥效。

附圖說明

圖1顯示為本發(fā)明實(shí)施例1中乙酰膽堿酯酶對(duì)12株腫瘤細(xì)胞系增殖實(shí)驗(yàn)示意圖。

圖2顯示為本發(fā)明實(shí)施例2中丁酰膽堿酯酶對(duì)5株腫瘤細(xì)胞系增殖實(shí)驗(yàn)示意圖。

圖3顯示為本發(fā)明實(shí)施例3中乙酰膽堿酯酶/丁酰膽堿酯酶腫瘤生長抑制實(shí)驗(yàn)示意圖。

具體實(shí)施方式

以下通過特定的具體實(shí)例說明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實(shí)施方式加以實(shí)施或應(yīng)用，本說明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。

在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實(shí)施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍；在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，除非文中另外明確指出，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一”和“這個(gè)”包括復(fù)數(shù)形式。

當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。

除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組dna技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說明，具體可參見sambrook等molecularcloning：alaboratorymanual，secondedition，coldspringharborlaboratorypress，1989andthirdedition，2001；ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology，academicpress，sandiego；wolffe，chromatinstructureandfunction，thirdedition，academicpress，sandiego，1998；methodsinenzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe，eds.)，academicpress，sandiego，1999；和methodsinmolecularbiology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humanapress，totowa，1999等。

實(shí)施例1

乙酰膽堿酯酶在腫瘤細(xì)胞系中的過表達(dá)實(shí)驗(yàn)：

將乙酰膽堿酯酶-pgs載體在如下細(xì)胞系(u87mg、cal27、a549、hepg2、mcf7、mda-mb-468、sw620、ht29、rko、u373、k562、lncap)中過表達(dá)，72小時(shí)后測(cè)試細(xì)胞增殖(celltiterglo,promega)，計(jì)算乙酰膽堿酯酶過表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的抑制。將上述12株細(xì)胞，按照4000細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板中過夜培養(yǎng)(cal27、rko、sw620、lncap、k562細(xì)胞培養(yǎng)在1640培養(yǎng)基+10％胎牛血清，5％co2培養(yǎng)箱中；u87mg、a549、ht29、mcf7、u373、mda-mb-468細(xì)胞培養(yǎng)在dmem高糖培養(yǎng)基+10％胎牛血清，5％co2培養(yǎng)箱)；將乙酰膽堿酯酶-pgs載體(將ache(transcriptvariant5nm_001302622)通過pcr的方法在兩段接上hindiii和xbai酶切位點(diǎn)后，將乙酰膽堿酯酶酶切片段通過分子克隆的方法鏈接至pgs載體，構(gòu)建成ache-pgs)按照300ng，100ng，30ng，10ng每孔量，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(lipofectimine3000，lifetechnology)方式瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至目的細(xì)胞株中。培養(yǎng)72小時(shí)后，向培養(yǎng)板加入50ul/孔celltiterglo檢測(cè)細(xì)胞的增殖狀況，具體結(jié)果如圖1所示。圖1中，每四個(gè)柱形條對(duì)應(yīng)一種細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，各組柱形條中，從左至右四個(gè)柱形條分別對(duì)應(yīng)300ng、100ng、30ng、10ng乙酰膽堿酯酶-pgs載體/孔的加入量。

實(shí)施例2

丁酰膽堿酯酶在腫瘤細(xì)胞系中的過表達(dá)實(shí)驗(yàn)：

將丁酰膽堿酯酶-prccmv載體在如下細(xì)胞系(a549、hela、hct116、u87mg、rko)中過表達(dá)，48小時(shí)后檢測(cè)細(xì)胞增殖(celltiterglo,promega)，計(jì)算丁酰膽堿酯酶過表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的抑制。將上述5株細(xì)胞，按照4000細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板中過夜培養(yǎng)(a549、hela、u87mg培養(yǎng)在dmem培養(yǎng)基+10％胎牛血清，5％co2培養(yǎng)箱中；hct116、rko細(xì)胞培養(yǎng)在1640培養(yǎng)基+10％胎牛血清，5％co2培養(yǎng)箱中)，將丁酰膽堿酯酶-prccmv載體(將丁酰膽堿酯酶bche(nm_000055)通過pcr方法向兩端添加bglii和bamhi酶切位點(diǎn)，將丁酰膽堿酯酶酶切片段通過分子克隆的方法鏈接至prccmv載體，構(gòu)建成bche-prccmv)按照300ng，100ng，30ng，10ng每孔量，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方式瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至目的細(xì)胞株中。培養(yǎng)72小時(shí)后，向培養(yǎng)板中加入50ul/孔celltiterglo檢測(cè)細(xì)胞的增殖狀況，具體結(jié)果如圖2所示。圖2中，每四個(gè)柱形條對(duì)應(yīng)一種細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，各組柱形條中，從左至右四個(gè)柱形條分別對(duì)應(yīng)300ng、100ng、30ng、10ng丁酰膽堿酯酶-prccmv載體/孔的加入量。

實(shí)施例3

乙酰膽堿酯酶腫瘤生長抑制實(shí)驗(yàn)：

雄性balb/c裸鼠(四周大，16-20g)通過皮下接種5*10⁶個(gè)a549細(xì)胞，當(dāng)腫瘤體積達(dá)到 100mm³，取出腫瘤剪成大小均一的組織塊，將腫瘤組織塊接種至新的裸鼠，接種后裸鼠隨機(jī)分組saline(生理鹽水)、achegroup(乙酰膽堿酯酶處理組)、bchegroup(丁酰膽堿酯酶處理組)每組8只；當(dāng)腫瘤體積達(dá)到100mm³時(shí)，通過灌胃方式給予ache-pgs、bche-prccmv殼聚糖混合物(季銨鹽殼聚糖溶于pbs，配制成0.5％(w/v)溶液，ph7.6；ache和bche質(zhì)粒溶于te緩沖液，配制成0.1mg/ml溶液；將殼聚糖溶液和質(zhì)粒溶液按照體積比1：1配制)，每日400ul，連續(xù)給藥4周，每周測(cè)量體重和腫瘤體積變化，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

綜上所述，本發(fā)明有效克服了現(xiàn)有技術(shù)中的種種缺點(diǎn)而具高度產(chǎn)業(yè)利用價(jià)值。

上述實(shí)施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。