本發(fā)明涉及一種異甘草素或異甘草苷的新用途，特別涉及異甘草素或異甘草苷在抑制人體皮膚成纖維細(xì)胞凋亡，促進(jìn)人體皮膚成纖維細(xì)胞中膠原蛋白合成中的用途，屬于化妝品技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

甘草(glycyrrhizauralensisfisch)素有“美白皇后”之稱，在化妝品中的應(yīng)用廣泛，市場(chǎng)需求巨大，其不僅可以抑制酪氨酸酶、清除自由基，抑制組胺釋放，從而達(dá)到美白、抗衰老、抗炎的功效，同時(shí)可以改善皮膚粗糙、缺水等問題。甘草美白在國(guó)外很多美白類化妝品專利中報(bào)道較多，多直接應(yīng)用甘草提取物添加。眾多宣稱美白功效的化妝品中含有甘草提取物。由于甘草提取物一般顏色較深，在化妝品中用量受到限制。所以，其粗提物應(yīng)用于化妝品存在很大的局限。甘草主要成分為：多糖類、三萜類、黃酮類化合物、少量生物堿、木質(zhì)素、香豆素。其中報(bào)道黃酮類化合物106個(gè)，苷元73個(gè)。目前為止從甘草中分離出的化合物有甘草甜素、甘草次酸、甘草甙、光甘草定、異甘草甙、新甘草甙、新異甘草甙、甘草素、異甘草素以及甘草西定、甘草醇、異甘草醇、7-甲基香豆精、傘形花內(nèi)酯等數(shù)十種化合物，光甘草定(glabridin)為國(guó)際公認(rèn)甘草美白活性成分，但本發(fā)明在研究過程中發(fā)現(xiàn)光甘草定對(duì)黑素細(xì)胞及成纖維細(xì)胞具有毒性，且能夠刺激mmps的表達(dá)，提示光甘草定作為美白成分對(duì)人體存在一定的安全隱患，因此尋找甘草中具有高安全性的，且同時(shí)具有美白及抗衰老活性的其他成分成為一種迫切的需要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種甘草中具有高安全性的，且同時(shí)具有美白及抗衰老活性的單體成分。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：

本發(fā)明通過對(duì)主要甘草單體(包括甘草素、異甘草素、異甘草苷、光甘草定、甘草酸以及甘草查爾酮a)在促進(jìn)膠原蛋白合成、抑制mmp1mrna表達(dá)以及對(duì)細(xì) 胞的毒性等方面進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然光甘草定(glabridin)為國(guó)際公認(rèn)甘草美白活性成分，但其對(duì)成纖維細(xì)胞具有毒性，并且能夠刺激mmps的表達(dá)，因此作為美白成分添加到化妝品中會(huì)對(duì)人體存在一定的安全隱患。另外兩種物質(zhì)，即異甘草素(isoliquiritigenin)以及異甘草苷(isoliquiritoside)，經(jīng)研究證實(shí)，其對(duì)前ⅰ型膠原α1鏈(col1a1)以及沉默信息調(diào)節(jié)因子1(sirt1)具有顯著促進(jìn)作用，且可以抑制mmp1的表達(dá)，是有助于皮膚真皮層改善的物質(zhì)，而且二者的細(xì)胞毒性低，安全性高，因此，異甘草素(isoliquiritigenin)以及異甘草苷(isoliquiritoside)在制備抗衰老化妝品中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

異甘草素(isoliquiritigenin)以及異甘草苷(isoliquiritoside)的分子結(jié)構(gòu)式分別如下所示：

本發(fā)明在上述研究的基礎(chǔ)上，提出了異甘草素或異甘草苷在制備高安全性的，且具有抗衰老效果的化妝品中的用途。以及

異甘草素或異甘草苷在抑制人體皮膚成纖維細(xì)胞凋亡，促進(jìn)人體皮膚成纖維細(xì)胞中膠原蛋白合成中的用途。

所述的異甘草素或異甘草苷通過提高人體皮膚成纖維細(xì)胞中前ⅰ型膠原α1鏈(col1a1)的表達(dá)水平、降低基質(zhì)金屬蛋白酶1(mmp1)的表達(dá)水平，以及促進(jìn)沉默信息調(diào)節(jié)因子1(sirt1)的表達(dá)水平來抑制人體皮膚成纖維細(xì)胞凋亡，促進(jìn)人體皮膚成纖維細(xì)胞中膠原蛋白合成，進(jìn)而達(dá)到抗衰老的目的。

附圖說明

圖1為甘草單體對(duì)sirt1活性的影響。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

實(shí)施例1甘草單體的細(xì)胞毒性

為了確定甘草發(fā)酵液中各甘草單體的細(xì)胞毒性，本發(fā)明通過wst-1法測(cè)試了6種甘草單體對(duì)人體皮膚成纖維細(xì)胞(dermalfibroblast，nhdfs)的細(xì)胞毒性，測(cè)試結(jié)果如表1所示。

表1不同濃度的甘草活性單體對(duì)成纖維細(xì)胞毒性

實(shí)施例2甘草單體對(duì)colla1、mmp1mrna的表達(dá)的影響

1、儀器與試劑

2、試驗(yàn)方法

利用實(shí)時(shí)熒光定量pcr(qrt-pcr)分析法測(cè)定1型膠原蛋白和分解1型膠原的膠原蛋白酶代表基因的mrna數(shù)量的變化從而確定1型膠原蛋白和膠原蛋白酶的變化。在60mm培養(yǎng)板中把人體皮膚成纖維細(xì)胞(nhdf)細(xì)胞分株為3x10⁵個(gè)/孔后，進(jìn)行24小時(shí)的培養(yǎng)。然后，添加一定濃度樣品溶液再進(jìn)行24小時(shí)的培養(yǎng)。收獲培養(yǎng)好的細(xì)胞后，添加1mltrizol試劑(lifetechnology)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行溶解并提取其總mrna。利用超微量分光光度計(jì)檢驗(yàn)了總mrna的濃度和純度，(其中只選用純度在2.0以上的總mrna)。利用反轉(zhuǎn)錄酶(m-mlv反轉(zhuǎn)錄酶)，把總mrna反轉(zhuǎn)錄為cdna，用于qrt-pcr。利用hotfirepolevagreenpcrmixplus進(jìn)行了qrt-pcr，利用steponeplusrt-pcr系統(tǒng)分析了該基因的表達(dá)。pcr的反應(yīng)條件是在94℃進(jìn)行5分鐘的變性后，94℃變性30秒，60℃退火30秒,72℃延伸30秒，共進(jìn)行了40個(gè)循環(huán)。基因表達(dá)的變化通過比較β-actin對(duì)照組基因表達(dá)量來測(cè)定。

2、試驗(yàn)結(jié)果

評(píng)價(jià)甘草單體對(duì)nhdf細(xì)胞col1a1和mmp1的影響是通過測(cè)定col1a1和mmp1的mrna的表達(dá)量來實(shí)現(xiàn)的。結(jié)果如表2。

表212h后甘草各單體對(duì)col1a1和mmp1的mrna的影響

根據(jù)上述試驗(yàn)進(jìn)行了對(duì)異甘草素和異甘草苷不同濃度下對(duì)col1a1和mmp1的mrna的表達(dá)影響的研究，其數(shù)據(jù)結(jié)果如表3所示：

表324h后甘草各單體對(duì)col1a1和mmp1的mrna的影響

綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，可以判斷從甘草中提取的異甘草素、異甘草苷、甘草查爾酮具有增加col1a1的功效；異甘草素、異甘草苷可降低mmp1的含量。所以，異甘草素和異甘草苷可以使col1a1增加，減少mmp1的表達(dá)，是有助于皮膚真皮層改善的物質(zhì)。光甘草定在降低col1a1含量的同時(shí)增加mmp-1的表達(dá)。又因細(xì)胞毒性大，存在安全隱患。光甘草素、光甘草苷在較低濃度下，對(duì)col1a1具有顯著促進(jìn)作用，且可以抑制mmp1的表達(dá)，且其細(xì)胞毒性低、安全性高，在促進(jìn)膠原蛋白合成、抗衰老化妝品中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

實(shí)施例3甘草單體對(duì)sirt1活性的影響

1、儀器與試劑

2、試驗(yàn)方法

為了測(cè)定甘草活性單體在抗衰老領(lǐng)域的應(yīng)用前景，對(duì)各單體在促進(jìn)不老基因(sirt1)活性方面進(jìn)行了分析。

沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silentinformationregulatortype1,sirt1)是nad⁺依賴性的脫乙?；福追Q為不老基因，是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物中sirtuin蛋白家族成員。sirt1是哺乳動(dòng)物延緩衰老、延長(zhǎng)壽命的關(guān)鍵分子，可以與染色質(zhì)、許多重要的轉(zhuǎn)錄因子及轉(zhuǎn)錄共調(diào)控因子相互作用,通過去乙酰化作用調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、染色體穩(wěn)定性和靶蛋白活性，在細(xì)胞周期、代謝、分化等方面發(fā)揮廣泛調(diào)節(jié)作用。研究表明sirt1的高表達(dá)可以抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)基因、膠原蛋白的表達(dá)。

按照使用說明書的方法，運(yùn)用sit1試劑盒測(cè)定sirt1脫乙酰酶的活性。這個(gè) 方法是通過兩步酶促反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)的。第一步，sirt1在sirt1底物的乙?；嚢彼醾?cè)鏈處反應(yīng)，在脫乙酰作用過程中發(fā)生作用。第二步，根據(jù)顯象劑，通過切割脫去乙?；孜锏玫綗晒饣鶊F(tuán)，得到的熒光利用熒光光度計(jì)測(cè)定sirt1的活性。

具體實(shí)驗(yàn)方法為：在細(xì)胞培養(yǎng)基中分別加入白藜蘆醇(sir1激動(dòng)劑，作為陽性對(duì)照)、煙酰胺(sirt1抑制劑，作為陰性對(duì)照)、不同濃度的甘草素、異甘草素、異甘草苷、光甘草定、甘草酸、甘草查爾酮a，取細(xì)胞基質(zhì)，在37℃的條件下反應(yīng)30分鐘。此時(shí)，通過充分的反應(yīng)使凈化的sirt1酶盡量接近1.5ug。加入顯象劑充分混合后，以37℃反應(yīng)10分鐘后，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)在366nm、435nm下的吸光度。

3、統(tǒng)計(jì)分析方法

本實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)處理利用excel進(jìn)行了分析。為了對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，在反復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果中使用了平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、百分比等；為了分析清除細(xì)胞毒性和活性氧的機(jī)器測(cè)定結(jié)果是否為有意義的變化，使用student’st-test分析(條件：兩側(cè)分析、等方差性)。

4、試驗(yàn)結(jié)果

sirt1在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和活性受到精細(xì)的調(diào)節(jié)，現(xiàn)采用體外測(cè)定sirt1活性的方法，對(duì)異甘草素和異甘草苷以及其他四種甘草主要單體對(duì)sirt1活性調(diào)節(jié)變化的影響進(jìn)行研究，結(jié)果如圖1所示。

以上研究表明，異甘草素和異甘草苷可以實(shí)現(xiàn)sirt1的高表達(dá)，因此具有抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)基因以及膠原蛋白的表達(dá)的作用。