相關申請的交叉引用

本申請引用美國臨時申請61/231,365，并要求所述申請的優(yōu)先權的權益，所述申請于2009年8月5日提交至美國專利及商標局，出于各種目的，其內容通過引用全文并入本文。

發(fā)明領域

本申請涉及用于控制釋放與可生物降解聚合物組合的脂質運載蛋白突變蛋白或其綴合物的藥物組合物。本發(fā)明還涉及用于控制遞送脂質運載蛋白突變蛋白及其綴合物的方法、用于生產控制釋放制劑的方法以及由此生產的制劑。最后，本發(fā)明涉及本發(fā)明的用于控制遞送脂質運載蛋白突變蛋白的制劑用于延長脂質運載蛋白突變蛋白的體內半衰期、提高脂質運載蛋白突變蛋白的生物利用度、或降低脂質運載蛋白突變蛋白給予受試者后的免疫原性的用途，以及涉及用于治療疾病或障礙的方法，所述方法包括給予有其需要的受試者本發(fā)明的制劑。

發(fā)明背景

脂質運載蛋白家族成員(Pervaiz、S.和Brew、K.(1987)FASEB J.1、209-214)通常為小的分泌蛋白，其特征在于一系列不同的分子識別特性：主要是它們結合多種疏水分子(例如類視黃醇、脂肪酸、膽固醇、前列腺素、膽綠素、信息素、促味劑和添味劑)的能力、它們與特異細胞表面受體并形成大分子復合物的結合。盡管過去將它們主要分類為轉運蛋白，但是現在明確了脂質運載蛋白完成多種生理功能。這些功能包括在視黃醇轉運、嗅覺、信息素信號傳遞以及前列腺素生物合成中的作用。還表明脂質運載蛋白參與免疫應答的調節(jié)和細胞內環(huán)境穩(wěn)定的介導(例如Flower,D.R.(1996)Biochem.J.318、1-14和Flower,D.R.等人(2000)Biochim.Biophys.Acta 1482、9-24綜述)。

脂質運載蛋白之間的全序列保守性非常低，經常具有低于20％的序列同一性。形成強烈對比的是，其整體折疊模式高度保守。脂質運載蛋白結構的中心部分由單個八股反平行β折疊組成，所述β折疊自身閉合形成連續(xù)的氫鍵β桶。桶的一個末端被穿過其底部的N端肽段以及連接β折疊股的三個肽環(huán)立體封閉。β桶的另一個末端暴露于溶劑并包括靶標結合位點，其由四個肽環(huán)形成。在其它剛性脂質運載蛋白骨架中，正是這種環(huán)的多樣性產生不同的結合模式，每一種模式能容納不同大小、形狀和化學特征的靶標(例如上文的Flower,D.R.(1996)；上文的Flower,D.R.等人(2000)，或Skerra,A.(2000)Biochim.Biophys.Acta 1482,337-350中的綜述)。

脂質運載蛋白家族成員已成為關于具有確定的配體結合特性的蛋白質的研究對象。PCT公開文本WO 99/16873公開了在四個肽環(huán)區(qū)域具有突變氨基酸的脂質運載蛋白家族的多肽，所述四個肽環(huán)排列于包圍結合口袋的圓柱狀β桶結構的末端，并且與包含大菜粉蝶(Pieris brassicae)后膽色素結合蛋白的氨基酸位置28至45、58至69、86至99、和114至129的線性多肽序列中的那些區(qū)段對應。

PCT公開文本WO 00/75308公開了后膽色素結合蛋白的突變蛋白，其特異地結合洋地黃毒苷，而國際專利申請WO 03/029463和WO 03/029471分別涉及人中性粒細胞明膠酶結合的脂質運載蛋白(hNGAL)和載脂蛋白D的突變蛋白。為進一步提高和優(yōu)化脂質運載蛋白變體的配體親和力、特異性以及折疊穩(wěn)定性，已經提出了使用脂質運載蛋白家族的不同成員的多種方法(Skerra,A.(2001)Rev.Mol.Biotechnol.74,257-275；Schlehuber、S.,和Skerra,A.(2002)Biophys.Chem.96、213-228)，例如替換其它氨基酸殘基。PCT公開文本WO 2006/56464公開了人中性粒細胞明膠酶結合的脂質運載蛋白的突變蛋白，其具有對低納摩爾范圍的CTLA-4結合親和力。

PCT公開文本WO 2005/19256公開了對不同或相同靶標配體具有至少一個結合位點的淚脂質運載蛋白的突變蛋白，并且提供了用于生成此類人淚脂質運載蛋白的突變蛋白的方法。根據該PCT專利申請，使淚脂質運載蛋白的一級序列中的某些氨基酸延伸序列(特別是包含成熟人淚脂質運載蛋白的氨基酸7-14、24-36、41-49、53-66、69-77、79-84、87-98和103-110的環(huán)區(qū)域)進行突變，從而生成對給定配體具有高結合親和力的突變蛋白。所得的突變蛋白對納摩爾范圍內，多數情況下<100nM的所選配體(K_D)具有結合親和力。

PCT公開文本WO 2008/015239公開了人淚脂質運載蛋白的突變蛋白，其具有非天然配體，包括IL-4受體、VEGF和VEGF受體的至少一個結合位點，并且提供了用于制備此類脂質運載蛋白突變蛋白的方法。該申請公開了可以對人淚脂質運載蛋白一級序列中的某些氨基酸延伸序列進行突變以生成突變蛋白，所述突變蛋白對給定靶標具有高結合親和力。所報導的結合親和力在納摩爾范圍內。所述突變位置在環(huán)區(qū)域中且在天然的成熟人淚脂質運載蛋白線性多肽序列的氨基酸序列位置26-34、56-58、80、83、104-106和108中任意處具有至少一個突變，并在天然的成熟人淚脂質運載蛋白線性多肽序列的氨基酸序列位置61和153中任意處具有至少一個突變。或者，所公開的突變蛋白在天然的成熟人淚脂質運載蛋白線性多肽序列的氨基酸序列位置34、80和104中任意處具有至少一個突變。

理想的是擁有這樣的組合物和制劑，所述組合物和制劑能夠控制遞送這些脂質運載蛋白突變蛋白、提高體內半衰期、降低突變蛋白的免疫原性和/或提高突變蛋白的生物利用度，從而進一步改善脂質運載蛋白的突變蛋白在治療應用中的適用性。

因此，本發(fā)明的目的是提供滿足該需求的脂質運載蛋白突變蛋白綴合物和制劑。

發(fā)明概述

通過具有獨立權利要求的特征的綴合物、藥物制劑和控制釋放制劑實現了該目的。

第一方面，本申請?zhí)峁┚Y合物，所述綴合物包含脂質運載蛋白突變蛋白和選自蛋白質、蛋白質結構域、肽、脂肪酸、脂質、多糖和/或有機聚合物的部分。

在一個實施方式中，所述綴合物包含脂質運載蛋白突變蛋白和蛋白質、蛋白質結構域、肽、脂肪酸、脂質、多糖和/或有機聚合物部分，所述綴合物基本上由脂質運載蛋白突變蛋白和蛋白質、蛋白質結構域、肽、脂肪酸、脂質、多糖和/或有機聚合物部分組成，或所述綴合物由脂質運載蛋白突變蛋白和蛋白質、蛋白質結構域、肽、脂肪酸、脂質、多糖和/或有機聚合物部分組成。所述部分還可以包含前述化合物的組合，例如糖肽、脂質修飾的肽和蛋白質、糖脂、用有機基團修飾的多糖，例如烷基化的多糖等。

在本發(fā)明的一個實施方式中，使脂質運載蛋白突變蛋白和選自蛋白質、蛋白質結構域、肽、脂肪酸、脂質、多糖和/或有機聚合物及其組合的部分彼此共價地連接。此連接可以經由脂質運載蛋白突變蛋白或氨基酸側鏈的N-或C-末端。在一個具體實施方式中，所述連接經由突變的氨基酸殘基形成，所述突變的氨基酸殘基例如半胱氨酸或賴氨酸殘基。

發(fā)明詳述

在本發(fā)明的綴合物中，所述部分可以促進控制遞送脂質運載蛋白突變蛋白，延長脂質運載蛋白突變蛋白的體內半衰期，提高脂質運載蛋白突變蛋白的生物利用度和/或降低脂質運載蛋白突變蛋白的免疫原性。

延長血清半衰期的部分可以是親水聚合物、脂肪酸分子(例如棕櫚酸(Vajo&Duckworth 2000,Pharmacol.Rev.52,1-9)、免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3結構域、免疫球蛋白的CH4結構域、白蛋白或其片段、白蛋白結合肽、或白蛋白結合蛋白質、泛素、源自泛素的肽、轉鐵蛋白等等。

白蛋白結合蛋白質可以是細菌白蛋白結合蛋白質、抗體、抗體片段(包括結構域抗體，例如見US專利6,696,245)、或對白蛋白具有結合活性的脂質運載蛋白突變蛋白。相應地，用于延長本發(fā)明脂質運載蛋白突變蛋白的半衰期的適合的綴合配偶體包括白蛋白(Osborn,B.L.等人(2002)Pharmacokinetic and pharmacodynamic studies of a human serum albumin-interferon-alpha fusion protein in cynomolgus monkeys J.Pharmacol.Exp.Ther.303,540-548)，或白蛋白結合蛋白質，例如細菌白蛋白結合結構域，例如一種鏈球菌蛋白G(T.和Skerra,A.(1998)Use of an albumin-binding domain for the selective immobilisation of recombinant capture antibody fragments on ELISA plates.J.Immunol.Methods 218,73-83)?？梢杂米骶Y合配偶體的白蛋白結合肽的其它實例例如具有Cys-Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Xaa₄-Cys共有序列的那些，其中Xaa₁是Asp、Asn、Ser、Thr或Trp；Xaa₂是Asn、Gln、His、Ile、Leu或Lys；Xaa₃是Ala、Asp、Phe、Trp或Tyr；Xaa₄是Asp、Gly、Leu、Phe、Ser或Thr，如US專利申請2003/0069395或Dennis等人(Dennis,M.S.,Zhang,M.,Meng,Y.G.,Kadkhodayan,M.,Kirchhofer,D.,Combs,D.&Damico,L.A.(2002).，，Albumin binding as a general strategy for improving the pharmacokinetics of proteins.”J Biol Chem 277,35035-35043)所述。

在其它實施方式中，可以將白蛋白自身或白蛋白的生物活性片段用作本發(fā)明的脂質運載蛋白突變蛋白的綴合配偶體。術語“白蛋白”包括所有的哺乳動物白蛋白，例如人血清白蛋白或牛血清白蛋白或大鼠白蛋白?？梢砸灾亟M方式生成白蛋白或其片段，如US專利5,728,553或歐洲專利申請EP 0330451和EP 0361991中所述?？梢詫⒅亟M的人白蛋白Novozymes Delta Ltd.(Nottingham,UK)綴合或融合至脂質運載蛋白突變蛋白，從而延長突變蛋白的半衰期。

如果白蛋白結合蛋白質是抗體片段，其可以是結構域抗體。涉及結構域抗體(dAbs)從而能夠精確控制生物物理特性和體內半衰期，獲得最佳安全性和有效產物特征。結構域抗體例如可從Domantis Ltd.(Cambridge,UK and MA,USA)商購獲得。

將轉鐵蛋白用作延長本發(fā)明突變蛋白的血清半衰期的部分，可以以基因工程方式將所述突變蛋白融合至非糖基化的轉鐵蛋白的N或C末端或二者。非糖基化的轉鐵蛋白的半衰期為14-17天，而轉鐵蛋白融合蛋白將類似地具有延長的半衰期。轉鐵蛋白載體還具有高的生物利用度、生物學分布和循環(huán)穩(wěn)定性。此技術可從BioRexis(BioRexis Pharmaceutical Corporation,PA,USA)商購獲得。用作蛋白質穩(wěn)定劑/半衰期延長配偶體的重組人轉鐵蛋白(DeltaFerrin^TM)也可從Novozymes Delta Ltd.(Nottingham,UK)商購獲得。

如果將免疫球蛋白的Fc部分用于延長本發(fā)明突變蛋白的血清半衰期的目的，可以使用可從Syntonix Pharmaceuticals,Inc(MA,USA)商購獲得的SynFusion^TM技術。使用此Fc-融合技術能夠產生長效作用的生物藥劑，并且可以例如由連接至抗體的Fc區(qū)域的兩個拷貝的突變蛋白組成，以改善藥代動力學、溶解性和生產效率。

又一個延長本發(fā)明突變蛋白的半衰期的選擇是將長的非結構化的柔性富甘氨酸序列(例如具有約20至80個連續(xù)甘氨酸殘基的多甘氨酸)融合至本發(fā)明的突變蛋白的N或C末端。此方法例如公開于WO2007/038619，還具有術語“rPEG”(重組PEG)。

本文使用的術語“親水聚合物”是指任何水溶性的線性、分支、分叉、支叉、枝狀、多臂或星形聚合物，包括但不限于聚乙二醇和聚乙二醇/聚丙二醇共聚物，聚氧乙烯化丙三醇和類似聚合物。優(yōu)選地，所述聚合物的分子量范圍為約300道爾頓至約70,000道爾頓，更優(yōu)選約500道爾頓至約50,000道爾頓，更優(yōu)選約5,000道爾頓至約30,000道爾頓。

用于本發(fā)明的親水聚合物通常具有至少一個引入的反應性基團，以通過氨基、羧基、巰基、磷酸酯或羥基官能團連接至目標生物活性分子?？梢愿鶕藴什僮鞒绦蛑苽溆糜诒旧暾埖挠H水聚合物(例如聚乙二醇)，其中其一端以甲氧基封端，另一端被活化以便于綴合至生物活性分子的活性基團。例如，US專利6,113,906描述了使用“U形”(即分支的)形式的聚乙二醇上的琥珀酰亞胺琥珀酸酯或琥珀酰亞胺碳酸酯反應性基團與蛋白質的氨基反應。US專利5,650,234描述了使用聚乙二醇的N-羥基苯并三唑碳酸酯、2-羥基嘧啶碳酸酯和N-羥基-2-吡咯烷酮碳酸酯衍生物與蛋白質的氨基反應，從而形成穩(wěn)定的氨基甲酸酯鍵。US專利5,672,661描述了使用丙酸和丁酸取代的聚乙二醇的琥珀酰亞胺酯與蛋白質的氨基反應，從而形成穩(wěn)定的酰胺鍵。US專利5,446,090描述了使用聚乙二醇的乙烯基-砜衍生物，從而與蛋白質的巰基形成穩(wěn)定的硫醚鍵。US專利5,880,255描述使用聚乙二醇的tresyl(2,2,2-三氟代乙烷-磺?；?衍生物與蛋白質的氨基反應，從而形成簡單且穩(wěn)定的仲胺連接。US專利5,252,714描述了使用聚乙二醇的丙醛衍生物與蛋白質的氨基反應，形成穩(wěn)定的仲胺鍵?？梢杂幸獾貙⒂纱祟愑H水聚合物連接至生物活性分子形成的鍵設計成穩(wěn)定的或不穩(wěn)定的(即可逆的)。此外，可以根據標準操作程序制備用于本申請的親水聚合物，使其具有兩個相似的(例如同質雙功能的)或不相似的(例如異質雙功能的)官能團，所述官能團可用于促進綴合至生物活性分子的活性基團。例如，WO 01/26692A1描述了使用異質雙功能的聚乙二醇衍生物來進行蛋白質修飾。這些專利的全部內容都通過引用并入本文。

因此，用于本發(fā)明的綴合物的示例性親水聚合物包括但不限于聚亞烷基二醇、聚氧乙烯化多元醇、羥乙基淀粉、多羥基酸、聚乳酸、聚乙醇酸、及其共聚物以及其線性、分支和活化的衍生物。

聚亞烷基二醇可以是取代的、未取代的、線性或分支的。它們還可以是活化的聚亞烷基衍生物。聚亞烷基二醇包括但不限于聚乙二醇、聚丙二醇、和聚乙二醇/聚丙二醇共聚物。

在本發(fā)明的一個實施方式中，所述親水聚合物是聚乙二醇(PEG)。

PEG是指線性或分支的中性聚醚，其化學式為HO-(CH₂CH₂O)_n-H。PEG高度溶解于水和許多有機溶劑(例如二氯甲烷、乙醇、甲苯、丙酮和氯仿)，并且易于以多種大小(分子量)和官能化的結構(例如氨基-、羧基-、巰基-封端的)得到。已發(fā)現PEG無毒，已被FDA批準用于藥物(腸胃外藥物、局部藥物、栓劑、鼻部噴劑)、食品和化妝品中。在溶液中，PEG是高度水合的聚合物，其中每個單體(環(huán)氧乙烷單元)可以結合多達三個水分子。并且，據信PEG具有影響數層更松散地結合的水合水分子的結構的能力。水中單個表面結合鏈的行為的分子模擬顯示，該聚合物顯示出具有極大程度的區(qū)段柔性。因此，推測聚合物在水性環(huán)境中占有極大的流體動力學體積。這些發(fā)現用于解釋PEG顯著有效地排除其它聚合物(天然的和合成的)存在的原因。對其它聚合物的排除是支持PEG排斥蛋白質，與其它合成聚合物形成兩相體系的能力的主要驅動力，并且使得該聚合物為非免疫原性而不產生抗原。當PEG共價地連接至蛋白質時，它通常將聚合物的許多有利性質轉移給所得的綴合物。由于上述多個有利特性，PEG非常適合用于蛋白質修飾。

本文使用的術語“PEG”包括任何PEG聚合物，包括PEG的氨基-反應性衍生物(“PEG反應物”)。已知多種用于蛋白質綴合的PEG反應物。典型的PEG反應物為一端以醚鍵封端(例如O-甲基)且另一端用反應性基團官能化的線性PEG聚合物。其它PEG反應物是分支的或枝狀的，同樣具有非反應性末端和反應性官能團的組合以連接至蛋白質?；蛘撸梢允褂镁哂邢嗨苹虿幌嗨频姆磻怨倌軋F的同質或異質雙官能PEG反應物以連接至蛋白質。

PEG反應物的實例包括但不限于，醛、N-羥基琥珀酰亞胺碳酸酯、N-羥基琥珀酰亞胺丙酸酯、對硝基苯基-碳酸酯、N-馬來酰亞胺、N-琥珀酰亞胺、硫醇或苯并三唑-碳酸酯封端的一類或其它氨基-反應性的活化的PEG類。

PEG聚合物的分子量可以在例如300至70,000Da的范圍內。可以通過接頭基團將反應性官能團與PEG鏈分開。任選地，聚合物在PEG和接頭之間具有可降解的內部的鍵。相應地，在本發(fā)明的一個實施方式中，可以以親電方式活化PEG聚合物的反應性基團以與蛋白質親核試劑反應。親電基團的實例是n-羥基琥珀酰亞胺碳酸酯、tresyl和醛官能團。具有這些官能團的PEG反應物會反應形成與蛋白質的氨基的共價鍵。用于PEG綴合至蛋白質氨基的優(yōu)選PEG反應物是丙酸接頭mPEG-SPA的mPEG琥珀酰亞胺活性酯。另一個優(yōu)選的PEG反應物是單甲氧基PEG-醛(mPEG-Ald)。

上文已提及適合的聚乙二醇(PEG)分子。其它實例描述于WO 99/64016、US專利6,177,074或涉及干擾素的US專利6,403,564中，或者已針對其它蛋白質例如PEG-修飾的天冬酰胺酶、PEG-腺苷脫氨酶(PEG-ADA)或PEG-超氧化物歧化酶進行了描述(例如參見Fuertges et al.(1990)The Clinical Efficacy of Poly(Ethylene Glycol)-Modified Proteins J.Control.Release 11,139-148)。其它實例例如可見于US專利4,179,337、US專利5,446,090和US專利5,880,255。本領域已知，這種連接可以使得分子量明顯增加和使得改性治療性蛋白質的血液清除率降低(例如參加US專利5,320,840)，以及使得免疫原性減弱、從可生物降解聚合物藥物遞送體系的釋放持續(xù)時間延長、在可生物降解藥物遞送體系中可實現的藥物載量提高(相對于未聚乙二醇化的藥物)、和藥物突釋降低(相對于未聚乙二醇化的藥物)(例如參見PCT公布WO 02/036169)。這些專利和專利申請的內容通過引用全文并入本文。

所述聚氧乙烯化多元醇包括但不限于聚氧乙烯化丙三醇、聚氧乙烯化的山梨糖醇、聚氧乙烯化葡萄糖及其衍生物，例如酯。

活化的衍生物可以包括氨基-反應性衍生物，所述氨基-反應性衍生物包括選自醛、硫醇、N-羥基琥珀酰亞胺、琥珀酰亞胺、馬來酰亞胺、PNP-碳酸酯和苯并三唑封端的親水聚合物。在一個具體實施方式中，親水聚合物的活化的衍生物是馬來酰亞胺-衍生的PEG，其然后與突變蛋白的半胱氨酸殘基的自由硫醇基團反應，其中這些半胱氨酸側鏈可以天然的存在于蛋白質中或可以通過突變人工引入。為了使這些硫醇基團可用于偶聯化學，可以使蛋白質經歷還原步驟，以還原形成胱氨酸橋的半胱氨酸殘基。在一個實施方式中，此步驟使用還原劑，例如三(2-羧乙基)鹽酸膦(TCEP)或β-巰基乙醇。

聚合物的分子量范圍可以是約300至約70000道爾頓，包括例如聚亞烷基二醇，例如分子量為約5、7、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70kDa的聚乙二醇。

并且，例如如在US專利6,500,930或6,620,413所述，出于血清半衰期延長的目的，可以將碳水化合物低聚物和聚合物例如淀粉或羥乙基淀粉(HES)綴合至本發(fā)明的突變蛋白。

在本發(fā)明的綴合物中，脂質運載蛋白突變蛋白可以選自屬于蛋白質的脂質運載蛋白家族的蛋白質的任何突變蛋白。已在上文提及了示例性脂質運載蛋白，并且包括但不限于視黃醇結合蛋白質(RBP)、后膽色素結合蛋白(BBP)、載脂蛋白D(APO D)、中性粒細胞明膠酶結合的脂質運載蛋白(NGAL)、淚脂質運載蛋白(TLPC)、α₂-微球蛋白相關蛋白質(A2m)、24p3/uterocalin(24p3)、von Ebners腺蛋白質1(VEGP 1)、von Ebners腺蛋白質2(VEGP 2)和主要變應原Can f1前體(ALL-1)。優(yōu)選的脂質運載蛋白突變蛋白包括人中性粒細胞明膠酶結合的脂質運載蛋白(hNGAL)、人淚脂質運載蛋白(hTLPC)、人載脂蛋白D(APO D)和大菜粉蝶后膽色素結合蛋白的突變蛋白。

人淚前白蛋白，目前稱為淚脂質運載蛋白(TLPC或Tlc；SWISS-PROT數據庫登記號P31025)最開始被描述為人淚液的主要蛋白質(約為總蛋白質含量的三分之一)，但是近來已在數種其它分泌組織中被鑒定到，所述分泌組織包括前列腺、鼻粘膜和氣道粘膜。已在大鼠、豬、狗和馬中發(fā)現了同源的蛋白質。

人中性粒細胞明膠酶結合的脂質運載蛋白(hNGAL，也稱作Lcn2，SWISS-PROT數據庫登記號P80188)為富含于人血漿中的178個氨基酸的糖蛋白。人Lcn2的動物同源物為大鼠α₂-微球蛋白相關蛋白質(A2m；SWISS-PROT數據庫登記號P31052)和小鼠24p3/uterocalin(24p3；SWISS-PROT數據庫登記號P11672)。

人載脂蛋白D(Apo-D；SWISS-PROT數據庫登記號P05090)為與其它載脂蛋白序列無顯著相似性的高密度脂蛋白的組分。其與血漿視黃醇結合蛋白質和載體蛋白質的α2微球蛋白超家族(也稱作脂質運載蛋白)的其它成員具有高度同源性。

后膽色素結合蛋白(BBP；SWISS-PROT數據庫登記號P09464)為富含于大菜粉蝶中的藍色色素蛋白。

在本發(fā)明的一個實施方式中，所述脂質運載蛋白突變蛋白與下述蛋白的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同源性：人淚脂質運載蛋白、人中性粒細胞明膠酶結合的脂質運載蛋白、大鼠α₂-微球蛋白相關蛋白質、小鼠24p3/uterocalin、后膽色素結合蛋白、人載脂蛋白D、視黃醇結合蛋白質、von Ebners腺蛋白質1(VEGP 1)、von Ebners腺蛋白質2(VEGP 2)或主要變應原Can f1前體(ALL-1)。

在另一個實施方式中，所述脂質運載蛋白突變蛋白可以與下述蛋白的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性：人淚脂質運載蛋白、人中性粒細胞明膠酶結合的脂質運載蛋白、大鼠α₂-微球蛋白相關蛋白質、小鼠24p3/uterocalin、后膽色素結合蛋白、人載脂蛋白D、視黃醇結合蛋白質、von Ebners腺蛋白質1(VEGP 1)、von Ebners腺蛋白質2(VEGP 2)或主要變應原Can f1前體(ALL-1)。

術語“同源性”以其通常的含義在本文中使用，并且包括相同氨基酸以及認為是在兩個互相比較的蛋白質線性氨基酸序列等價位置的保守替換氨基酸(例如天冬氨酸殘基交換谷氨酸殘基)?！巴恍浴被颉靶蛄型恍浴北硎玖慷人鼈兊南嗨菩曰蜿P系的序列特性。本發(fā)明所用的術語“序列同一性”或“同一性”表示本發(fā)明多肽序列與有關序列(同源性)比對之后，形成配對的相同殘基相對于這兩個序列較長一個的殘基數量的百分比。通過將相同殘基的數量除以殘基總數再使其結果乘以100來量度同一性。

本文中，例如可以使用程序BLASTP，blastp 2.2.5版(2002年11月16日；參見Altschul、S.F.等人(1997)Nucl.Acids Res.25、3389-3402)測定序列同源性或序列同一性百分比。在此實施方式中，同源性百分比基于包括前肽序列的完整多肽序列比對(matrix:BLOSUM 62；gap costs:11.1；cutoff value set to 10^-3)，在配對比較中使用人淚脂質運載蛋白作為參考。其計算為，以BLASTP程序輸出的結果表示的“陽性氨基酸”(同源氨基酸)除以程序選擇用于比對的氨基酸總數的百分比。在這方面應注意，所選擇的氨基酸的總數可以與人脂質運載蛋白2的長度不同。

在本發(fā)明的綴合物中，所述脂質運載蛋白突變蛋白以可檢測的親和力結合給定的非天然靶標。所述靶標可以是蛋白質、蛋白質結構域、蛋白質片段或肽。

在本發(fā)明的一個實施方式中，被淚脂質運載蛋白突變蛋白結合的靶標為選自下述的蛋白質或其片段：血管內皮生長因子(VEGF)、血管內皮生長因子受體2(VEGF-R2)、干擾素4受體α鏈(IL-4Rα)、細胞毒性T淋巴細胞抗原-4(CTLA-4)、受體酪氨酸激酶c-Met或其片段。還包括VEGF-R2、IL-4Rα、CTLA-4或c-Met的胞外區(qū)域或結構域作為配體。所述配體通常為哺乳動物來源的。在一個實施方式中，這些配體為人來源的，但是作為示例性實例，它們還可以是小鼠、大鼠、豬、馬、犬、貓、牛、絨猴或獼猴來源的等等。

在本發(fā)明的綴合物中，所述脂質運載蛋白突變蛋白可以在包圍天然脂質運載蛋白結合口袋的四個肽環(huán)AB、CD、EF和GH中的任意序列位置包含至少一個突變氨基酸殘基。這些環(huán)形成所述脂質運載蛋白的已知結合位點(因此被稱為開放末端)。在人淚脂質運載蛋白(hTLPC；SWISS-PROT數據庫登記號P31025)中，AB環(huán)包含天然的成熟人淚脂質運載蛋白的線性多肽序列的位置24-36，CD環(huán)包含位置53-66，EF環(huán)包含位置69-77，GH環(huán)包含位置103-110。本文使用的這四個環(huán)的定義根據Flower(上文的Flower,D.R.(1996)和上文的Flower,D.R.等人(2000))。在大菜粉蝶后膽色素結合蛋白中，這四個肽環(huán)排列于包圍結合口袋的圓柱形β桶結構的末端，對應于包含大菜粉蝶后膽色素結合蛋白的線性多肽序列的氨基酸位置28-45、58-69、86-99和114-129的線性多肽序列中的區(qū)段。

在其它實施方式中，所述脂質運載蛋白突變蛋白在包圍天然的脂質運載蛋白結合口袋的四個肽環(huán)AB、CD、EF和GH中的任意序列位置具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或41個突變氨基酸殘基。

在其它實施方式中，所述脂質運載蛋白突變蛋白在對應于天然的成熟人淚脂質運載蛋白(SWISS-PROT數據庫登記號P31025)的線性多肽序列的序列位置24-36、53-66、79-84和103-110的任意序列位置具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或41個突變的氨基酸殘基。在優(yōu)選實施方式中，所述脂質運載蛋白突變蛋白在對應于天然的成熟人淚脂質運載蛋白的線性多肽序列的序列位置26-34、56-58、80、83、104-106和108的任意序列位置具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18突變氨基酸殘基。技術人員使用本領域熟知的技術和程序可以容易地確定蛋白質的脂質運載蛋白家族其他成員的相應序列位置。

本發(fā)明的脂質運載蛋白突變蛋白可以包括突變氨基酸序列位置以外的野生型(天然的)氨基酸序列。另一方面，本文公開的脂質運載蛋白突變蛋白還可含有進行突變的環(huán)區(qū)域中序列位置以外的氨基酸突變，只要這些突變不干擾突變蛋白的結合活性和折疊即可。使用已建立的標準方法(Sambrook,J.等人(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)可以非常容易地在DNA水平上實現此類突變。氨基酸序列的可能改變?yōu)椴迦牖蛉笔б约鞍被崽鎿Q。此類替換可以是保守的，即氨基酸殘基被化學上相似的氨基酸殘基替代。保守替換的實例為以下組成員的替代：1)丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸；2)天冬氨酸和谷氨酸；3)天冬酰胺和谷氨酰胺；4)精氨酸和賴氨酸；5)異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和纈氨酸；和6)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。另一方面，也可以在氨基酸序列中引入非保守改變。此外，除了替代單一的氨基酸殘基，還可以插入或缺失淚脂質運載蛋白一級結構的一個或多個連續(xù)的氨基酸，只要這些缺失或插入產生穩(wěn)定的折疊/功能突變蛋白(例如參見，其中產生N和C末端截短的突變蛋白的實驗部分)。

氨基酸序列的此類修飾包括單一氨基酸位置的定點突變，以便通過摻入特定限制性酶的切割位點而簡化突變脂質運載蛋白基因或其部分的亞克隆。此外，可摻入這些突變以進一步提高脂質運載蛋白突變蛋白與給定靶標的親和力。并且，可以引入突變，以便調節(jié)突變蛋白的某些特征，例如以改善折疊穩(wěn)定性、血清穩(wěn)定性、蛋白質抗性或水溶解性，或者如果必要的話以降低聚集傾向。例如，天然存在的半胱氨酸殘基可以突變成其它氨基酸，以防止二硫鍵的形成。然而，還可以有意地將其它氨基酸序列位置突變成半胱氨酸，以便引入新的反應性基團，例如用于綴合至本申請的部分或用于形成非天然存在的二硫鍵。

本申請還包括如上文定義的截短的脂質運載蛋白突變蛋白，所述突變蛋白中缺失了一個或多個N末端和/或C末端氨基酸，例如成熟脂質運載蛋白的序列的前四個N末端氨基酸殘基和/或后兩個C末端氨基酸殘基。

在本發(fā)明綴合物的一個具體實施方式中，所述脂質運載蛋白突變蛋白包含SEQ ID No.1–110中任一項所述的氨基酸序列、基本上由SEQ ID No.1–110中任一項所述的氨基酸序列組成、或由SEQ ID No.1–110中任一項所述的氨基酸序列組成。所述脂質運載蛋白突變蛋白可以與SEQ ID No.1-110中任一項的脂質運載蛋白突變蛋白具有70、75、80、85、88、90、92、94、96或98％序列同一性。

上述部分之一綴合至脂質運載蛋白突變蛋白可以經由所述脂質運載蛋白突變蛋白的N末端、C末端或氨基酸側鏈進行。為促進綴合，所述部分可以包含反應性基團，例如上文描述的那些。適合的氨基酸側鏈可以天然存在于各脂質運載蛋白的氨基酸序列中，或者可以通過突變引入。在經由突變引入適合的結合位點的情況下，一種可選方法是在適當的位置用半胱氨酸殘基替代氨基酸。在一個實施方式中，該突變包括下述的至少一種：針對人淚脂質運載蛋白(SWISS PROT數據庫條目P31025)的線性多肽序列的Thr 40→Cys、Glu 73→Cys、Arg 90→Cys、Asp 95→Cys或Glu 131→Cys替換，或者蛋白質的脂質運載蛋白家族其它成員的相應替換。之后可以將在這些位置任意處新產生的半胱氨酸殘基用于將突變蛋白綴合至延長突變蛋白的血清半衰期的部分上，所述部分例如PEG或其活化的衍生物。

在這些任意序列位置引入半胱氨酸的人淚脂質運載蛋白突變蛋白的一個示例性實例是VEGF結合人淚脂質運載蛋白突變蛋白S236.1-A22(SEQ ID NO:22)。本領域已知此類突變的其它實例，且包括下述文獻公開的那些：PCT公開文本WO 99/16873、WO 00/75308、WO 03/029471、WO 03/029462、WO03/029463、WO 2005/019254、WO 2005/019255、WO 2005/019256、WO2006/56464、和WO 2008/015239，所述文獻的內容通過引用全文并入本文。

在另一個實施方式中，為了提供用于將上述部分之一綴合至本發(fā)明的突變蛋白的適合的氨基酸側鏈，可以通過突變引入人工氨基酸。通常，可以將此類人工氨基酸設計成更有反應性，因此促進期望部分的綴合?？梢越浻扇斯RNA引入的這樣的人工氨基酸的一個實例是對乙?；?苯基丙氨酸。

在一些實施方式中，可以將脂質運載蛋白突變蛋白及其綴合的部分用于形成融合蛋白。在此類實施例中，以其N末端或C末端將脂質運載蛋白突變蛋白融合至蛋白質、蛋白質結構域或肽部分。

在其它實施方式中，可以將所述脂質運載蛋白突變蛋白融合至另一個蛋白質、蛋白質結構域或肽，例如具有相同或不同結合特異性的第二脂質運載蛋白突變蛋白(這造成“Duocalins”的形成，參見Schlehuber,S.,and Skerra,A.(2001),Duocalins,engineered ligand-binding proteins with dual specificity derived from the lipocalin fold.Biol.Chem.382,1335-1342)，并且可以將所得的包含所述脂質運載蛋白突變蛋白的融合蛋白綴合至上述部分。

本領域已知用于產生脂質運載蛋白突變蛋白的技術(例如參見上文的Flower,D.R.(1996)；上文的Flower,D.R.等人(2000)，上文的Skerra,A.(2000)，上文的Skerra,A.(2001)；上文的Schlehuber,S.,和上文的Skerra,A.(2002)；以及PCT公開文本WO 99/16873、WO 00/75308、WO 03/029471、WO 03/029462、WO 03/029463、WO 2005/019254、WO 2005/019255、WO2005/019256、WO 2006/56464和WO 2008/015239)。這些專利申請每一個的內容都通過引用全文并入本文。

本文可互換地使用的術語“非天然配體”、“非天然結合配偶體”或“非天然靶標”是指這樣的化合物：所述化合物在生理條件下不結合各天然的脂質運載蛋白。所述靶標(配體)可以是任何游離的或綴合形式的化合物，其顯示具有下述物質的特征：免疫半抗原、激素例如類固醇激素或其任意生物聚合物或片段，例如蛋白質或蛋白質結構域、肽、脫氧寡核苷酸、核酸、寡糖或多糖或其綴合物、脂質或類似的大分子。

包含于本發(fā)明綴合物中的脂質運載蛋白突變蛋白保留了它們以可檢測的親和力結合期望靶標的能力，所述可檢測的親和力例如具有至少200nM的解離常數。當前在一些實施方式中優(yōu)選這樣的脂質運載蛋白突變蛋白，其以對給定靶標的至少100、20、1nM或甚至更低的解離常數結合期望靶標?？梢酝ㄟ^多種方法測量突變蛋白與期望靶標的結合親和力，所述方法例如熒光滴定法、競爭ELISA或表面等離子共振(BIAcore)。

本發(fā)明還涉及用于控制釋放脂質運載蛋白突變蛋白的藥物制劑，所述制劑包含與聚合物、脂質或脂質體以及任選的藥學上可接受的賦形劑組合的脂質運載蛋白突變蛋白或其綴合物。

術語“控制釋放”或“持續(xù)釋放”是指對根據本發(fā)明的藥物遞送制劑遞送的脂質運載蛋白突變蛋白分子的速率和/或數量的控制?？刂漆尫趴梢允沁B續(xù)的或不連續(xù)的、和/或線性或非線性的。這可以通過一種或多種類型的聚合物組成、藥物載量、包含賦形劑或降解促進劑，單獨、組合或順序使用以產生期望效果而得以實現?！傲阈颉被颉熬€性釋放”通常理解為，表示在期望的時間段期間，作為量/單位時間的函數，釋放的生物活性分子的量隨時間變化保持相對恒定?！岸嘞唷蓖ǔ＠斫鉃楸硎踞尫虐l(fā)生一次以上的“突釋”。

在一個實施方式中，脂質體包封脂質運載蛋白突變蛋白或其綴合物。在一個具體實施方式中，所述脂質體分散或乳化于水性基礎介質中。

在一個實施方式中，所述聚合物為可生物降解聚合物。在一個這樣的實施方式中，所述可生物降解聚合物選自聚丙交酯、聚乙交酯、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚乳酸、聚乙醇酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚己內酯、聚碳酸酯、聚酯酰胺、聚酸酐、聚(氨基酸)、聚原酸酯、聚縮醛(polyacetyls)、聚氰基丙烯酸酯、聚醚酯、聚二噁烷酮、聚亞烷基烷基酯(polyalkylen alkylate)、聚乙二醇和聚丙交酯或聚(丙交酯-共-乙交酯)的共聚物、可生物降解的聚氨酯和某些類型的蛋白質和多糖聚合物、以及其共混物和共聚物。在另一個實施方式中，所述可生物降解聚合物選自多羥基酸、聚乳酸、聚丙交酯、聚乙交酯、聚乙醇酸、和其共聚物以及其衍生物。所述可生物降解聚合物還可以包括聚酸酐、聚原酸酯和多糖聚合物，或者由聚酸酐、聚原酸酯和多糖聚合物組成。一種適合的聚酸酐共聚物是雙(對羧基苯氧基)丙烷和癸二酸的共聚物。其它適合的可生物降解的親水聚合物包括生物聚合物，例如上述蛋白質和多糖聚合物，包括但不限于透明質酸、殼聚糖、明膠、膠原、淀粉、糊精和纖維素。這些生物大分子可以交聯，以形成三維水凝膠。

在一個實施方式中，所述可生物降解聚合物為聚-(D,L-丙交酯-共-乙交酯)。如果選擇聚-(D、L-丙交酯-共-乙交酯)作為聚合物以形成本發(fā)明的藥物制劑，則所述聚-(D,L-丙交酯-共-乙交酯)可以含有約55至約80摩爾％丙交酯單體和約45至約20摩爾％乙交酯。所述聚-(D、L-丙交酯-共-乙交酯)還可以含有約65至約75摩爾％丙交酯單體和約35至約25摩爾％乙交酯。所用的聚-(D、L-丙交酯-共-乙交酯)可以含有末端酸基團。

在另一個實施方式中，所述可生物降解聚合物為包含用烷基部分取代的丙交酯單元的聚乳酸聚合物或共聚物。所述可生物降解聚合物可以例如包含聚(己基-取代的丙交酯)或聚(二己基-取代的丙交酯)、基本上由聚(己基-取代的丙交酯)或聚(二己基-取代的丙交酯)組成、或由聚(己基-取代的丙交酯)或聚(二己基-取代的丙交酯)組成。

在藥物制劑的另一個實施方式中，將所述可生物降解聚合物配制成包封所述綴合物的微?；蚣{米粒子。在此類實施方式中，本發(fā)明的制劑可以基于由可生物降解聚合物和本發(fā)明的脂質運載蛋白突變蛋白或綴合物的組合形成的微?；蚣{米粒子，以提供控制釋放；所述可生物降解聚合物例如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、及其共聚物，所述綴合物例如脂質運載蛋白突變蛋白與親水聚合物的綴合物，所述親水聚合物例如聚乙二醇或聚丙二醇。

在另一個實施方式中，所述藥物制劑可以是植入物或可植入裝置的形式。所述植入物或可植入裝置可以具有任何形狀，并且包括但不限于可植入的棒、塞、盤、粒、膜或片。可以通過已知方法生產此類可植入裝置，所述已知方法例如由合適聚合物模塑、擠出和膜制備。如果所述藥物制劑為植入物或可植入裝置，植入物材料可以是可生物降解的或不可生物降解的，例如可生物降解或不可生物降解聚合物。適合的可生物降解聚合物包括但不限于上文所述的那些。

不可生物降解聚合物可以在活生物體中保持較長的時間周期，例如數年，而無顯著降解。此類物質包括聚乙烯醇(PVA)和乙烯醋酸乙烯酯(EVA)的聚合物等等。

所述藥物制劑、特別是可植入裝置還可以含有例如抗代謝物，以防止植入部位的纖維化。

在一個實施方式中，本發(fā)明采用可生物降解的微粒用于控制釋放脂質運載蛋白突變蛋白或聚合物綴合的脂質運載蛋白突變蛋白。

本文使用的“微?！笔侵钢睆絻?yōu)選小于1.0mm、通常為1.0至200.0微米且更優(yōu)選1.0至100.0微米的顆粒。微?？梢跃哂腥魏芜m合的粒徑，只要同樣提供另人滿意的目標脂質運載蛋白突變蛋白的持續(xù)釋放即可。在示例性實施例中，微粒的平均粒徑(直徑)可以小于100微米，例如在約20至約80微米的范圍內或平均粒徑(直徑)在約40至約50微米的范圍內。術語“微?！卑ㄍǔ楣腆w球形微粒的微球。術語“微?！边€包括微膠囊，其通常為具有不同于圍繞的外殼的組合物核心的球形微粒。為了本發(fā)明的目的，可互換地使用術語“微球”、“微粒”和“微膠囊”。

應該選擇用于制備本發(fā)明的藥物組合物/制劑的脂質運載蛋白突變蛋白的質量與聚合物的質量的比率，使得實現另人滿意的控制持續(xù)釋放。在示例性實施例中，脂質運載蛋白突變蛋白的質量占用于制備制劑(例如微粒或納米粒子)的聚合物質量的15％或更少。在其它實施方式中，藥物組合物中突變蛋白的質量占聚合物質量的10％或更少。

可以使用多種本領域中熟知的用于控制釋放制劑的可生物降解聚合物來制備用于本申請的微粒。如上文所述，合適聚合物例如包括但不限于聚丙交酯、聚乙交酯、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚乳酸、聚乙醇酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚己內酯、聚碳酸酯、聚酯酰胺、聚酸酐、聚氨基酸、聚原酸酯、聚縮醛、聚氰基丙烯酸酯、聚醚酯、聚二噁烷酮、聚烷基亞烷基酯、聚乙二醇和聚丙交酯或聚(丙交酯-共-乙交酯)的共聚物、可生物降解的聚氨酯和某些類型的蛋白質和多糖聚合物、以及其共混物和共聚物。上文已公開了蛋白質和多糖聚合物的實例，且包括但不限于透明質酸、殼聚糖、明膠、膠原、淀粉、糊精和纖維素。

為了本申請的目的，術語“可生物降解的”是指在具體治療情況下可接受的某時間段內體內溶解或降解的聚合物。這種溶解或降解的產物可以包括較小的化學物質?？梢岳缤ㄟ^酶、化學和/或物理過程形成降解。生物降解通常在暴露于生理pH和溫度的少于五年且通常少于一年發(fā)生，所述生理pH和溫度例如在6至9范圍內的pH和在22℃至38℃范圍內的溫度。

優(yōu)選的聚合物包括聚(羥基酸)，尤其是聚(乳酸-共-乙醇酸)(聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)；“PLGA”)、聚乙交酯(PGA)和聚丙交酯(PLA)或其衍生物，它們在暴露于生理pH，例如身體水性環(huán)境后，通過水解降解。然后所述聚合物水解產生乳酸和乙醇酸單體，這些單體是細胞代謝的正常副產物。聚合物分解的速率可以從數周至超過一年的時間段變化，這取決于數個因素，包括聚合物分子量、聚合物鏈中丙交酯與乙交酯單體的比率和單體亞單元的立構規(guī)整度(L和D立體異構體的混合物破壞聚合物結晶度，從而促進聚合物降解)。在示例性實施例中，用于制備制劑(例如本發(fā)明的微粒)的聚-(D,L-丙交酯-共-乙交酯)可以含有約55至80摩爾％丙交酯單體和約45至20摩爾％乙交酯醇酸。或者，所述聚-(D、L-丙交酯-共-乙交酯)可以含有約65至75摩爾％丙交酯單體和約35至25摩爾％乙交酯。使用的聚-(D、L-丙交酯-共-乙交酯)可以含有末端酸基團。微球也可含有兩種或更多種具有不同分子量和/或單體比率的可生物降解聚合物的共混物。

衍生的可生物降解聚合物也適用于本申請，包括連接至PLGA的親水聚合物等。在具體實施方式中，所述親水聚合物選自但不限于聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物、和聚乙烯吡咯烷酮。

具體而言，可以使用本領域熟知的多種技術以形成微球。這些技術包括，例如單或雙乳化步驟，然后去除溶劑?？梢酝ㄟ^萃取、蒸發(fā)或噴霧干燥以及其它方法實現溶劑去除。

在溶劑萃取方法中，將所述聚合物溶解于有機溶劑中，所述有機溶劑可至少部分溶解于萃取溶劑例如水中。然后將可溶形式或分散成細小顆粒的脂質運載蛋白突變蛋白綴合物加入到聚合物溶液中，并將混合物分散到含有表面活性劑的水相中，所述表面活性劑例如聚乙烯醇。將所得的乳液加入到更大體積的水中，在水中，將有機溶劑從聚合物/生物活性劑中去除以形成硬化的微粒。

在溶劑蒸發(fā)方法中，將所述聚合物溶解于揮發(fā)性的有機溶劑中。然后將可溶形式或分散成細小顆粒的生物活性分子(即脂質運載蛋白突變蛋白綴合物)加入到聚合物溶液中，并且將混合物懸浮于含有表面活性劑的水相中，所述表面活性劑例如聚乙烯醇。攪拌所得的乳液直到大部分有機溶劑蒸發(fā)，從而留下固體微球。

在噴霧干燥方法中，將所述聚合物溶解于適合的溶劑中，例如二氯甲烷(例如0.04g/ml)。然后將已知量的脂質運載蛋白突變蛋白綴合物懸浮(如果不可溶)或共溶(如果可溶)于聚合物溶液中。然后噴霧干燥溶液或分散液。可以獲得具有形態(tài)的直徑范圍為1至10微米的微球，所述形態(tài)取決于聚合物的選擇。

本領域已知其它已知方法，例如相分離和凝聚以及上述方法的變形也可在本申請中采用。

在另一個實施方式中，本發(fā)明采用可生物降解的納米粒子用于控制釋放脂質運載蛋白突變蛋白和聚合物綴合的脂質運載蛋白突變蛋白。本文使用的術語“納米粒子”是指直徑優(yōu)選為約20.0納米至約2.0微米、通常約100納米至1.0微米的顆粒。

可以如上文針對微粒所述實現納米粒子的配制，不同之處在于使用高速混合或勻質化以將聚合物/生物活性劑乳液的尺寸降低至約2.0微米以下，優(yōu)選地約1.0微米以下。例如，WO 97/04747中描述了用于制備納米粒子的適合的技術，所述專利申請的全部內容通過引用并入本文。

可以通過注射、通過吸入、經鼻或口服而給予這些控制釋放制劑。

通常，藥劑包封于可生物降解聚合物微球和納米球中可以比給予藥物自身延長保持治療藥物水平。取決于制劑和包封的活性分子，可將持續(xù)釋放延長長達數月。然而，由于治療性蛋白質易于被將它們包封于聚合物載體中所需的程序造成損壞，一些蛋白質的極性性質可限制在聚合物藥物載體中包封的程度，且可導致所包封的生物活性分子的部分在首次給予時迅速損失(“突釋”)，因此，有利的是，將親水聚合物連接至這些治療性蛋白質以在包封于藥物載體中的條件下保護它們免于降解和變性。此外，相對于未經修飾的蛋白質，這會提高可以被包封的經修飾的蛋白質的量。并且，相對于載體中的未聚乙二醇化的蛋白質，降低了包封于可生物降解聚合物藥物遞送載體中的聚乙二醇化的治療性蛋白質的免疫原性，特別是當通過皮下或肌內注射或吸入或粘膜遞送(例如口服或經鼻遞送)給予時。當可生物降解聚合物用于口服遞送時，這種降低的免疫原性是特別有利的。并且，已報道了通過以可生物降解聚合物體系、特別納米球給予，可以使得通常情況下不能從胃腸道吸收的聚乙二醇化的蛋白質、肽、寡糖和寡核苷酸可生物利用。在PCT公開文本WO 02/36169中更詳細地描述了這些益處，所述專利申請的內容通過引用全文并入本文。

可以將本申請的藥物組合物用于在數個方面改善脂質運載蛋白突變蛋白或其綴合物的體內遞送，所述方面例如免疫原性降低、生物利用度提高、持續(xù)時間增加、穩(wěn)定性提高、突釋減少和/或脂質運載蛋白突變蛋白體內的控制持續(xù)釋放。

本申請的藥物組合物可以包含未綴合形式的脂質運載蛋白突變蛋白或上述脂質運載蛋白突變蛋白的綴合物。如果脂質運載蛋白突變蛋白不綴合至另一個部分，則所述脂質運載蛋白突變蛋白定義為上文公開的與本發(fā)明的綴合物相關的脂質運載蛋白突變蛋白。

在本發(fā)明制劑的一個實施方式中，所述脂質運載蛋白突變蛋白綴合至親水聚合物，優(yōu)選聚乙二醇部分。所述聚乙二醇可以是線性或分支的或者可以是活化的PEG衍生物，且可具有約5、7、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70kDa的分子量，優(yōu)選約5至約40kDa，更優(yōu)選約15至25kDa，例如20kDa。在具體實施方式中，將該綴合的脂質運載蛋白突變蛋白與聚丙交酯、聚乙交酯或其共聚物例如聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯，包括丙交酯和乙交酯的烷基化衍生物一起配制。所述聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)可以含有約55至80摩爾％丙交酯單體和約45至20摩爾％乙交酯。所述聚-(D,L-丙交酯-共-乙交酯)還可以含有約65至75摩爾％丙交酯單體和約35至25摩爾％乙交酯。優(yōu)選地，這種制劑為微?；蚣{米粒子的形式。在一個具體實施方式中，所述突變蛋白為人淚脂質運載蛋白或hNGAL突變蛋白。

在其它實施方式中，將未綴合形式的脂質運載蛋白突變蛋白與聚丙交酯、聚乙交酯或其共聚物，包括丙交酯和乙交酯的烷基化衍生物一起配制。這種制劑可以是微?；蚣{米粒子的形式，且所述突變蛋白為人淚脂質運載蛋白或hNGAL突變蛋白。

在本發(fā)明制劑的一個實施方式中，約30至90％、優(yōu)選地40至70％的脂質運載蛋白突變蛋白以活性形式釋放，即保持它們結合給定配體的能力。取決于制劑的實際組成，所述釋放可以經過一定時間段。所述時間段可以包括一天或多天，例如2至約70天，優(yōu)選20至60天。

在另一個方面，本申請表征了用于將脂質運載蛋白突變蛋白全身性或局部控制遞送至受試者的方法，所述方法包括給予所述受試者本發(fā)明的綴合物或藥物制劑。

在此類方法中，通過給予至受試者的限定的身體腔室或器官，可以促進脂質運載蛋白突變蛋白的局部控制遞送。已發(fā)現，將脂質運載蛋白突變蛋白制劑給予至受試者(例如哺乳動物，優(yōu)選人)的限定的身體腔室或器官，可以促進持續(xù)釋放效果，這是因為脂質運載蛋白突變蛋白在相應身體腔室或器官中的半衰期可以與全身半衰期不同。因此，通過局部給予本發(fā)明的脂質運載蛋白突變蛋白綴合物或制劑，可實現局部持續(xù)釋放，同時避免全身性暴露的延長。這可以歸因于下述事實：在不同的身體腔室或器官之間，脂質運載蛋白突變蛋白的代謝性降解或分泌不同。例如，相比血清半衰期，脂質運載蛋白突變蛋白在眼內腔中的半衰期延長約150倍。因此，釋放的突變蛋白在相應的身體腔室或器官中的半衰期可以比血清中的半衰期長，從而離開限定的身體腔室或器官的脂質運載蛋白突變蛋白迅速被腎過濾降解或清除，而它們在身體腔室或器官內的半衰期足夠長以達到期望的藥理效果。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述限定的身體腔室為眼、關節(jié)、腦、脊椎、腫瘤，或身體腔、室。

在這些方法的一個實施方式中，口服、通過吸入、粘膜遞送、皮內注射、皮下注射、肌內注射、靜脈內注射、玻璃體內注射、關節(jié)內注射、顱骨內注射、脊椎內注射、腫瘤內注射或植入給予所述綴合物或制劑。

在這些方法中，所述受試者可以是哺乳動物，優(yōu)選人。

在另一個方面，本申請還包括用于制備脂質運載蛋白突變蛋白-聚合物綴合物的方法，所述方法包括在至少一種有機溶劑和至少一種金屬螯合劑存在下，在促進突變蛋白和聚合物的綴合物形成的條件下，使脂質運載蛋白突變蛋白與親水聚合物接觸；以及分離所述綴合物。可以使用多種標準技術例如柱色譜法分離所述綴合物。

在本發(fā)明的具體實施方式中，所述親水聚合物選自聚乙二醇、聚乙二醇/聚丙二醇共聚物、聚氧乙烯化丙三醇、以及其線性、分支的和氨基-反應性衍生物。適合的氨基-反應性衍生物包括，例如醛、PEG-羧酸的N-羥基琥珀酰亞胺酯、PNP-碳酸酯和苯并三唑封端的親水聚合物衍生物。其它優(yōu)選的PEG的活化衍生物包括但不限于N-馬來酰亞胺PEG衍生物。通常，所述親水聚合物和脂質運載蛋白突變蛋白以約10:1-1:1、優(yōu)選3:1至1.2:1、更優(yōu)選1.7:1至1.5:1的摩爾比接觸。

適合用于本發(fā)明的有機溶劑包括多種已知溶劑，包括但不限于水可混溶的有機溶劑，例如二氯甲烷、乙醇、甲醇、DMSO、二噁烷、DMF和NMP。通常，所述有機溶劑(優(yōu)選二噁烷)以約0至25％、優(yōu)選2-20％、更優(yōu)選5-15％或0.1-10％的濃度(v/v)存在。

適合用于本發(fā)明的金屬螯合劑也包括多種已知化合物，包括但不限于氨基多羧酸，例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、氨三乙酸(NTA)、N-2-乙酰氨基-2-亞氨基二乙酸(ADA)、雙(氨基乙基)乙二醇醚-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)、反式-二氨基環(huán)己烷四乙酸(DCTA)、谷氨酸和天冬氨酸；和羥基氨基羧酸，例如N-羥基乙基亞氨基二乙酸(HIMDA)、N,N-雙-羥基乙基甘氨酸(bicine)和N-(三羥基甲基甲基)甘氨酸(tricine)；和N-取代的甘氨酸，例如雙甘氨肽。其它適合的螯合劑包括2-(2-氨基-2-氧代乙基)氨基乙烷磺酸(BES)和去鐵胺(DEF)。本申請方法中使用的適合的螯合劑包括，例如在溶液中結合金屬離子的那些，從而使得金屬離子無法與可用的氧反應，由此防止與蛋白質反應和降解蛋白質的自由-OH殘基的產生，或者使所述自由-OH殘基最少化。此類螯合劑可以降低或防止在無螯合試劑保護下配制的蛋白質的降解。

用于本發(fā)明的螯合試劑可以以其鹽的形式存在，所述鹽的形式例如前述螯合劑的羧基或其它酸性官能團。此類鹽的實例包括與鈉、鉀、鈣和其它弱結合的金屬離子形成的鹽。如本領域已知，鹽的性質和要中和的電荷的數量將取決于存在的羧基的數量和提供穩(wěn)定化螯合劑時的pH。同樣如本領域已知，螯合試劑以不同的強度與具體靶標結合。通常，重金屬離子比類似電荷的較低分子量的金屬離子的結合力更強。

用于本申請方法的螯合劑也可選自EDTA、EGTA和本領域已知的其它多價陽離子螯合劑。

在一個實施方式中，所述螯合劑選自EDTA、去鐵胺(DEF)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)和雙(氨基乙基)乙二醇醚-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)。

通常，所述螯合劑(優(yōu)選EDTA)以約0.1-10mM、優(yōu)選1-5mM、更優(yōu)選1-3mM的濃度存在。

在本發(fā)明的具體實施方式中，所述脂質運載蛋白突變蛋白和親水聚合物(例如PEG)在蛋白質濃度為約0.1-5重量％、優(yōu)選0.5-1.5％的水性溶液中接觸(即反應或綴合)。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述脂質運載蛋白突變蛋白和親水聚合物在pH為約5.0-7.5、優(yōu)選pH 6.5至7.2、更優(yōu)選約7.0的水性溶液中接觸?？梢酝ㄟ^包括緩沖鹽、加入有機酸/堿、或加入常用的無機酸/堿來控制pH。在另一個具體實施方式中，所述親水聚合物和脂質運載蛋白突變蛋白在約4℃至50℃、優(yōu)選約15℃至25℃的溫度下接觸。

形成后，從不期望的反應副產物和未反應的脂質運載蛋白突變蛋白中分離所述蛋白質-聚合物綴合物。這可以使用多種已知技術、例如色譜法得以實現。在具體實施方式中，采用離子交換色譜(例如陽離子交換)，并且可以收集、濃縮、脫鹽和干燥期望的綴合物。

在另一個實施方式中，本申請的方法還包括在分離綴合產物之前淬滅所述脂質運載蛋白突變蛋白和親水聚合物的反應(即綴合)的步驟。在具體實施方式中，這通過將反應的pH降低至約1-4、優(yōu)選約2-3、更優(yōu)選約2.4至2.6得以實現。

在一個方面，本申請還涉及根據前述用于制備脂質運載蛋白突變蛋白聚合物-綴合物的方法獲得的綴合物。

通過本申請的方法生成的具體蛋白質-聚合物綴合物包括，例如脂質運載蛋白突變蛋白-聚合物綴合物，優(yōu)選脂質運載蛋白突變蛋白-PEG綴合物(聚乙二醇化的脂質運載蛋白突變蛋白)。其可以包括任何上述脂質運載蛋白突變蛋白。在具體實施方式中，所述脂質運載蛋白突變蛋白特異地在脂質運載蛋白突變蛋白的N末端、C末端或氨基酸側鏈反應(聚乙二醇化)。為了促進綴合，PEG部分可包含反應性基團。如上文所述，適合的氨基酸側鏈可天然存在于各脂質運載蛋白的氨基酸序列中，或者可以通過突變引入。在經由突變引入適合的結合位點的情況下，一種可選方法是在適當的位置用半胱氨酸殘基進行替代。在一個實施方式中，該突變包括下述的至少一種：針對人淚脂質運載蛋白(SWISS PROT數據庫條目P31025)的線性多肽序列的Thr40→Cys、Glu 73→Cys、Arg 90→Cys、Asp 95→Cys或Glu 131→Cys替換，或者蛋白質的脂質運載蛋白家族其它成員的相應替換。可以在如本領域熟知的任何合適制劑中治療性地給予所得的聚乙二醇化的脂質運載蛋白突變蛋白。在具體實施方式中，通過例如在給予前將綴合物包封于可生物降解聚合物中而給予在持續(xù)釋放制劑中的綴合物。

此單步驟方法能夠迅速且有效地制備脂質運載蛋白突變蛋白-聚合物綴合物。在PCT公開文本WO 2004/091494中針對胰島素更詳細地公開了所述制備方法，所述專利申請通過引用全文并入本文。

在另一方面，本申請還涉及制備控制釋放組合物的方法，所述方法包括：合并包含脂質運載蛋白突變蛋白和聚合物的有機相與水相；以及回收所述組合物。在一個實施方式中，所述水相可以包含有機離子，其中存在所述有機離子從而降低可能的脂質運載蛋白突變蛋白的降解。

為了本申請的目的，術語“有機相”和“不連續(xù)相”可以互換，并且是指在本申請方法中產生的溶劑、聚合物和脂質運載蛋白突變蛋白的溶液，所述溶液之后通過乳化法與水相接觸，以便產生本申請的控制釋放組合物。

為了本申請的目的，術語“降解”是指對所述脂質運載蛋白突變蛋白的任何不期望的修飾，例如?；换驅λ鼍酆衔锏娜魏尾黄谕男揎?，例如分解。

為了本申請的目的，術語“水相”和“連續(xù)相”可互換，并且是指在本申請方法中產生的水和有機離子試劑的溶液，所述溶液之后通過乳化法與有機相接觸，以便產生本申請的控制釋放組合物。

為了本申請的目的，術語“合并”是指將兩種或更多種物質放在一起的任何方法。此類方法包括但不限于，混合、共混、摻和、調制、勻質化、摻入、互混、融合、接合、弄混、攪拌、聯合、并入、混入、接合、一體化等等。

為了本申請的目的，本文可以以從“約”或“大致”一個具體數值和/或至“約”或“大致”另一個具體數值來表示范圍。當表示這樣的范圍時，另一個實施方式包括從一個具體數值和/或至另一個具體數值。類似地，當通過使用前綴“約”表示數值為近似值時，將被理解的是，該具體數值形成另一個實施方式。還將被理解的是，每個范圍的端點的意義既與另一個端點相關也與另一個端點獨立。通常，術語“約”包括給定數值的±10％。

為了本申請的目的，術語“有機離子”是指陽離子和陰離子物質。示例性有機離子包括撲酸鹽、萘甲酸鹽、膽酸鹽等等。有機離子可以以其鹽或酸形式存在。用于本申請的有機離子包括陰離子和陽離子物質。陰離子物質包括但不限于下述有機酸及其鹽：十二烷基硫酸、膽酸、三氟甲基對苯甲酸、2-萘磺酸、2,3-萘二羧酸、1-羥基-2-萘甲酸、3-羥基-2-萘甲酸、2-萘甲酸和雙水楊酸。此外，硫酸鹽、磺酸鹽、磷酸鹽和膦酸鹽的有機形式是適合的有機離子。陰離子物質的鹽形式可以包括鈉、銨、鎂、鈣等等。陽離子分子包括但不限于具有銨或胍基團或取代的銨基團的那些。和生物活性劑一起使用有機陰離子試劑，所述生物活性劑具有一個或多個帶有或能夠獲得正電荷的官能團，例如銨或胍基團?？梢耘c生物活性劑一起使用有機陽離子，所述生物活性劑具有一個或多個帶有或能夠獲得負電荷的官能團，例如羧基、硫酸鹽、磺酸鹽、磷酸鹽或膦酸鹽基團。用于本申請的有機離子試劑可以溶解于水和有機相中達到提高包封效率和藥物載量的程度。在具體實施方式中，經由生物活性劑的降解降低而實現包封效率和藥物載量提高。在具體實施方式中，有機離子試劑在水相中的濃度范圍為約0.5至100mM。在另一個具體實施方式中，所述有機離子范圍為約5至40mM。

為了本申請的目的，“控制釋放組合物”應指具有與天然生物活性劑不同的釋放曲線(release profile)的任何制劑。通常釋放曲線將包括生物活性劑經至少一周、至少一個月、至少45天或長于45天的時間段的生理可檢測濃度。

在該方法的一個實施方式中，所述方法還包括在有機相中合并脂質運載蛋白突變蛋白和聚合物和/或在水相中合并有機離子的步驟。

在所述方法的另一個實施方式中，在乳化法中合并有機相和水相以產生控制釋放組合物。乳液可包含分散于水相中的有機相的小滴。之后可以從乳液小滴中去除溶劑以形成硬化的微粒。在具體實施方式中，通過蒸發(fā)去除所述溶劑。在另一個具體實施方式，通過萃取到萃取液中去除溶劑；例如，所述萃取液可以是水。在另一個具體實施方式中，通過過濾去除溶劑。

然后可以從水相回收硬化的微粒并干燥。

在另一個實施方式中，通過攪拌有機相和水相產生乳液。在另一個實施方式中，通過使用混合器產生乳液。在具體實施方式中，所述混合器為靜態(tài)混合器。在某些實施方式中，通過采用紊流混合產生乳液。在另一個實施方式中，不經紊流混合而產生乳液。

可以在組分的沸點至凝固點的任何溫度實施所述乳化法。在一個實施方式中，溫度范圍為約0℃至約100℃，且通常為5℃至75℃。在具體實施方式中，在約15℃至約60℃實施所述乳化法。

在某些實施方式中，所述方法包括使包含聚合物和生物活性劑的有機相與包含有機離子的水相接觸，其中有效量的有機離子離開水相并進入有機相。

在一個實施方式中，所述有機相包含溶劑，所述溶劑選自但不限于二氯甲烷、乙酸乙酯、芐醇、丙酮、乙酸和碳酸丙烯酯。所述有機相還可以包含可生物降解聚合物在其中可溶的其它溶劑。在優(yōu)選的實施方式中，所述溶劑是乙酸乙酯或二氯甲烷。

在具體實施方式中，所述有機相還包括共溶劑。任選地將它們用于提高生物活性劑在有機相中的溶解性。

所述共溶劑可以選自但不限于二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、PEG200、PEG400、甲醇、乙醇、異丙醇、芐醇和水。

在另一個具體實施方式中，所述共溶劑可以以有機相的溶劑的0至90％w/w存在。在另一個具體實施方式中，所述共溶劑可以以有機相的溶劑的0至50％w/w存在。

可以先將脂質運載蛋白突變蛋白溶于適當體積的共溶劑，然后將其加入到任選其中具有溶解的可生物降解聚合物的有機相的溶劑中，以形成有機相所有組分的溶液。普通技術人員可以調整加入的體積和順序，以實現脂質運載蛋白突變蛋白和可生物降解聚合物的溶液。在具體實施方式中，所述可生物降解聚合物將以2-40％w/w的濃度存在于有機相中。在另一個具體實施方式中，所述可生物降解聚合物將以5-20％w/w的濃度存在于有機相中。

在另一個實施方式中，所述水相還包括乳化劑。所述乳化劑可以選自但不限于，聚(乙烯基醇)、白蛋白、卵磷脂、維生素E-D-α-生育酚聚乙二醇(TPGS)和聚山梨醇酯。在具體實施方式中，所述乳化劑可以以終濃度范圍為約0.1至10％(w/w)、終濃度為約1.0％至約8％(w/w)、約1.0％至約6％(w/w)、約1.5％至約5％(w/w)、或0.5至5％(w/w)的濃度存在。

在制備本發(fā)明的控制釋放組合物的乳化法的某些實施方式中，含有脂質運載蛋白突變蛋白的有機相包含選自二氯甲烷、乙酸乙酯、芐醇、丙酮、乙酸和碳酸丙烯酯的溶劑。

在其它實施方式中，所述有機溶劑包含作為溶劑的二氯甲烷以及作為共溶劑的甲醇、乙酸和H₂O(參加實施例6)。在其它實施方式中，所述有機溶劑由二氯甲烷(僅)組成且包含作為共溶劑的甲醇、乙酸和H₂O(參見實施例6)。

在有機溶劑包含作為溶劑的二氯甲烷以及作為共溶劑的甲醇、乙酸和H₂O或者在有機溶劑由作為溶劑的二氯甲烷以及作為共溶劑的甲醇、乙酸和H₂O組成的實施方式中，有機相包含占有機相總體積的約70％至約85％(v/v)的二氯甲烷、約10％至約15％(v/v)的甲醇、約5至約10％的乙酸(v/v)和約0.1％至約1.0％(v/v)的水。在其它此類實施方式中，有機相包含占有機相總體積的約75％至82％(v/v)的二氯甲烷、約11％至約14％(v/v)的甲醇、約6％至約8.5％的甲醇和約0.1％至約0.8％(v/v)的水。在此方面，應注意，在有機相僅含有作為溶劑/共溶劑的二氯甲烷、甲醇、乙酸和H₂O的情況下，當然可以選擇它們以上述范圍給出的相應體積，使得總體積總共是100％(同樣參見實施例6)。

在某個實施方式中，所述有機離子的終濃度范圍為約0.1至1000mM。在具體實施方式中，它們以1至100mM的濃度溶解?？梢哉{整每個具體有機離子試劑和生物活性劑的濃度，以實現期望的藥物載量和包封效率。

在某個實施方式中，所述控制釋放組合物選自但不限于微粒和納米粒子。在具體實施方式中，所述微粒和納米粒子是可生物降解的。

在另一個實施方式中，所述聚合物可以選自但不限于，聚丙交酯、聚乙交酯、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚己內酯、聚碳酸酯、聚酯酰胺、聚酸酐、聚(氨基酸)、聚原酸酯、聚縮醛、聚氰基丙烯酸酯、聚醚酯、聚二噁烷酮、聚亞烷基烷基酯、聚乙二醇和聚原酸酯的共聚物、可生物降解的聚氨酯、及其共混物和共聚物。

在某個實施方式中，所述乳化法選自水包油和油包水。

在具體實施方式中，可以用任何已知的乳化法實施本申請的方法。

在具體實施方式中，所述有機離子選自陰離子和陽離子物質。在一個實施方式中，所述有機離子是有機酸的鹽。在具體實施方式中，所述有機離子選自三氟甲基對苯甲酸鹽、膽酸鹽、2-萘磺酸鹽、2,3-萘二羧酸鹽、1-羥基-2-萘甲酸鹽、3-羥基-2-萘甲酸鹽、2-萘甲酸鹽和雙水楊酸或硫酸鹽、磺酸鹽、磷酸鹽和膦酸鹽的有機衍生物。

在另一個實施方式中，降解包括酰化。在具體實施方式中，所述?；磻婕爸|運載蛋白突變蛋白的氨基(例如氨基酸側鏈的N末端氨基或氨基)指向聚酯(例如聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯))的羰基碳的親核進攻。在所制備的組合物中，通過促進潛在親核試劑(例如氨基)的質子化，由此使得親核試劑較不易于參與和PLGA聚合物骨架或其片段的?；磻?，來防止或降低脂質運載蛋白突變蛋白的降解。

在另一個實施方式中，降解包括聚合物的分解。過度分解會導致聚合物分子量的損失和生物活性劑過早釋放。

在另一個特定實施方式中，本申請?zhí)峁┛刂漆尫沤M合物，所述控制釋放組合物包括聚合物和與有機離子的復合物形式的脂質運載蛋白突變蛋白。當有機離子和脂質運載蛋白突變蛋白形成緊密的物理結合時，可以形成這樣的復合物。

在另一個實施方式中，在不存在有機離子的情況下，可以相對于通過本申請方法制備的生物活性劑的含量，提高脂質運載蛋白突變蛋白的含量。

在另一方面，本申請涉及通過上述方法制備的控制釋放組合物。

在又一方面，本申請包括根據本發(fā)明的綴合物、藥物制劑或控制釋放組合物用于控制遞送脂質運載蛋白突變蛋白、延長脂質運載蛋白突變蛋白的體內半衰期、提高脂質運載蛋白突變蛋白的生物利用度、或降低脂質運載蛋白突變蛋白給予受試者后的免疫免疫原性的用途。

可以經由任何治療上有效用于蛋白質類藥物的腸胃外或非腸胃外(腸)途徑給予根據本發(fā)明的脂質運載蛋白突變蛋白綴合物、藥物制劑或控制釋放組合物。腸胃外應用方法包括，例如皮內、皮下、肌內、氣道內、鼻內、玻璃體內、關節(jié)內、顱骨內、脊椎內、腫瘤內或靜脈內注射和輸注技術，例如以注射液、輸注液或酊劑的形式；以及氣溶膠裝置和吸入，例如以氣溶膠混合物、噴霧或粉末的形式。例如J.S.Patton等人(The lungs as a portal of entry for systemic drug delivery.Proc.Amer.Thoracic Soc.2004Vol.1pages338-344)提供了關于肺部藥物遞送即經由吸入氣溶膠(還可用于鼻內施用)或氣道內滴注的綜述。肺部是全身性藥物遞送的入口(例如Proc.Amer.Thoracic Soc.2004Vol.1pages 338-344)。非腸胃外遞送模式例如口服，例如以丸劑、片劑、膠囊、溶液或懸浮液的形式，或者經直腸，例如以栓劑的形式?？梢砸院谐Ｒ?guī)非毒性的藥學上可接受的賦形劑或載體、如期望的添加劑和溶媒的制劑全身性或局部給予本發(fā)明的脂質運載蛋白突變蛋白綴合物、藥物制劑或控制釋放組合物。

在本申請的一個實施方式中，所述脂質運載蛋白突變蛋白綴合物、藥物制劑或控制釋放組合物經腸胃外給予哺乳動物，特別是人。相應的給予方法包括但不限于，例如皮內、皮下、肌內、氣道內或靜脈內注射和輸注技術，例如以注射液、輸注液或酊劑的形式，以及氣溶膠裝置和吸入，例如以氣溶膠混合物、噴霧或粉末的形式。在化合物的血清半衰期相對較短的情況下，靜脈內和皮下輸注和/或注射的組合可能是最方便的。藥物組合物可以是水性溶液、水包油的乳液或油包水的乳液。

在此方面，應注意如Meidan VM和Michniak BB 2004Am.J.Ther.11(4):312-316中描述的經皮遞送技術，例如離子滲透、超聲滲透或微針促進遞送，也可用于經皮遞送本文描述的突變蛋白。非腸胃外遞送模式是，例如口服，如以丸劑、片劑、膠囊、溶液或懸浮液的形式，或者直腸施用，例如以栓劑的形式?？梢栽诤卸喾N常規(guī)的非毒性藥學上可接受的賦形劑或載體、添加劑和溶媒的制劑中全身性或局部遞送本發(fā)明的脂質運載蛋白突變蛋白綴合物、藥物制劑或控制釋放組合物。

給予的突變蛋白的劑量可在寬泛的限值內變化，以實現期望的預防作用或治療反應。這將取決于例如化合物對于所選配體的親和力以及突變蛋白和配體的復合物的體內半衰期。此外，理想的劑量將取決于突變蛋白或其融合蛋白或其綴合物的生物學分布、給予模式、要治療疾病/障礙的嚴重性以及患者的健康狀況。例如，當用于局部給予的膏劑時，可以使用高濃度的脂質運載蛋白突變蛋白。然而，如果需要，還可以在持續(xù)釋放制劑中提供本發(fā)明的脂質運載蛋白突變蛋白綴合物，所述持續(xù)釋放制劑例如脂質體分散體或水凝膠基聚合物微球，如PolyActive^TM或OctoDEX^TM(參見Bos等人，Business Briefing:Pharmatech 2003:1-6)。可得的其它持續(xù)釋放制劑例如PLA-PEG基水凝膠(Medincell)和PEA基聚合物(Medivas)。

因此，使用藥學上可接受的成分以及已建立的制備方法，可以將本申請的突變蛋白配制成組合物(Gennaro,A.L.和Gennaro,A.R.(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,20th Ed.,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA)。為制備本發(fā)明的制劑或組合物，可以使用藥學上惰性的無機或有機賦形劑。為制備例如丸劑、粉末、明膠膠囊或栓劑，可以使用例如乳糖、滑石、硬脂酸及其鹽、脂肪、蠟、固體或液體多元醇、天然的和硬化油。用于制備溶液、懸浮液、乳液、氣溶膠混合物或者在使用前重配成溶液或氣溶膠混合物的粉末的適合的賦形劑包括水、醇、甘油、多元醇、及其適合的混合物以及植物油。

制劑或組合物還可含有添加劑，例如填料、粘合劑、潤濕劑、助流劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、乳化劑以及其它溶劑或助溶劑。

可以通過多種方式對制劑進行滅菌，所述方式包括以細菌阻留濾器進行過濾或通過摻入無菌固體組合物形式的滅菌劑，所述無菌固體組合物可以在臨使用之前溶解或分散于無菌水或其它無菌介質中。

本申請的另一個方面涉及治療疾病或障礙的方法，所述方法給予有其需要的受試者上述本發(fā)明的脂質運載蛋白突變蛋白綴合物、藥物制劑或控制釋放組合物。

有此治療需要的受試者可以是哺乳動物，示例性實例例如人、狗、小鼠、大鼠、豬、猿例如cymologous等等。

要根據本發(fā)明方法治療的疾病和障礙的確切性質取決于所利用的突變蛋白預期要結合的配體。因此，本申請的突變蛋白可以用于治療任何疾病，只要已知所述疾病或障礙發(fā)展中涉及的靶標分子可以顯示為本申請的核酸文庫的表達產物，或者顯示為以其它方式獲得的脂質運載蛋白的突變蛋白。

在一個具體實施方式中，用于本發(fā)明的綴合物、制劑和組合物的脂質運載蛋白突變蛋白是以高親和力結合VEGF的人淚脂質運載蛋白突變蛋白。在另一個示例性實施方式中，所述脂質運載蛋白突變蛋白具有SEQ ID NO:22中所述的氨基酸序列。在一個實施方式中，該脂質運載蛋白突變蛋白綴合至親水聚合物，例如聚乙二醇，優(yōu)選大致20kDa的分子量，且任選與可生物降解聚合物一起配制，所述可生物降解的合物為聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)聚合物。在一個實施方式中，所述制劑為微粒或納米粒子的形式。

該綴合物、制劑或組合物可用于疾病或障礙、例如VEGF相關的疾病或障礙的治療方法中。在一個實施方式中，所述疾病或障礙，例如VEGF相關的疾病或障礙與血管化增加有關，例如癌癥、哮喘、關節(jié)炎(包括骨關節(jié)炎和類風濕關節(jié)炎)、炎癥、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺動脈高血壓、新生血管性濕性年齡相關性黃斑變性(neovascular wet age-related macular degeneration，AMD)、糖尿病性視網膜病變或黃斑水腫、早產兒視網膜病變或視網膜靜脈阻塞。所述癌癥可選自下述示例性實例：胃腸道癌、直腸癌、結腸癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、乳癌、膀胱癌、腎癌、子宮內膜癌、和肺癌、白血病以及黑素瘤等。

附圖簡述

通過下述非限制性實施例和所附的附圖進一步說明本發(fā)明，其中：

圖1示出了對VEGF具有結合親和力的人淚脂質運載蛋白突變蛋白(SEQ ID NO:22)的溶液的RP-HPLC色譜圖。

圖2示出了對VEGF具有結合親和力且綴合至分子量為20kDa的線性PEG的人淚脂質運載蛋白突變蛋白(SEQ ID NO:22#2PEG20)的RP-HPLC色譜圖。

圖3示出了對VEGF具有結合親和力且綴合至分子量為40kDa的分支的PEG的人淚脂質運載蛋白突變蛋白(SEQ ID NO:22#2PEG40)的RP-HPLC色譜圖。

圖4示出了對VEGF具有結合親和力且綴合至分子量為5kDa的線性PEG的人淚脂質運載蛋白突變蛋白(SEQ ID NO:22#2PEG05)的RP-HPLC色譜圖。

圖5示出了對VEGF具有結合親和力且綴合至分子量為10kDa的線性PEG的人淚脂質運載蛋白突變蛋白(SEQ ID NO:22#2PEG10)的RP-HPLC色譜圖。

圖6示出了對VEGF具有結合親和力且綴合至分子量為5kDa的線性PEG的人淚脂質運載蛋白突變蛋白(SEQ ID NO:22#2PEG5)的RP-HPLC色譜圖，所述人淚脂質運載蛋白突變蛋白從微球顆粒中萃取。

圖7示出了對VEGF具有結合親和力且綴合至分子量為10kDa的線性PEG的人淚脂質運載蛋白突變蛋白(SEQ ID NO:22#2PEG10)的RP-HPLC色譜圖，所述人淚脂質運載蛋白突變蛋白從微球顆粒中萃取。

圖8示出了對VEGF具有結合親和力且綴合至分子量為20kDa的線性PEG的人淚脂質運載蛋白突變蛋白(SEQ ID NO:22#2PEG20)的RP-HPLC色譜圖，所述人淚脂質運載蛋白突變蛋白從微球顆粒中提取。

圖9示出了對VEGF具有結合親和力且綴合至分子量為40kDa的分支的PEG的人淚脂質運載蛋白突變蛋白(SEQ ID NO:22#2PEG5)的RP-HPLC色譜圖，所述人淚脂質運載蛋白突變蛋白從微球顆粒中萃取。

圖10示出了對VEGF具有結合親和力且綴合至分子量為20kDa的線性PEG的人淚脂質運載蛋白突變蛋白(SEQ ID NO:22#2PEG20)的RP-HPLC色譜圖，所述人淚脂質運載蛋白突變蛋白經24小時從微球顆粒中釋放。

圖11示出了對VEGF具有結合親和力且綴合至分子量為40kDa的分支的PEG的人淚脂質運載蛋白突變蛋白(SEQ ID NO:22#2PEG40)的RP-HPLC色譜圖，所述人淚脂質運載蛋白突變蛋白經24小時從微球粒子中釋放。

圖12示出了本發(fā)明的微球制劑體外經3周的時間段釋放的脂質運載蛋白突變蛋白的絕對量。

圖13示出了本發(fā)明的微球制劑體外經3周的時間段的脂質運載蛋白突變蛋白的每日釋放。

圖14示出了來自本發(fā)明的3個控制釋放制劑(批次372-56、372-57和372-58)的活性VEGF結合的人淚脂質運載蛋白突變蛋白的經計算體外每日釋放，所述VEGF結合的人淚脂質運載蛋白突變蛋白對VEGF具有結合親和力且綴合至分子量為20kDa的線性PEG(SEQ ID NO:22#2PEG20)。以深灰色條示出了從批次372-56的制劑釋放的突變蛋白SEQ ID NO:22#2PEG20的活性脂質運載蛋白突變蛋白的量(以ng/天計)，以中等灰色條示出了從批次372-57的制劑釋放的活性脂質運載蛋白突變蛋白的量，以淺灰色條示出了從批次372-58的制劑釋放的活性脂質運載蛋白突變蛋白的量。

圖15示出了來自3個控制釋放制劑(批次372-56、372-57和372-58)的活性VEGF結合的人淚脂質運載蛋白突變蛋白的累積體外釋放，所述VEGF結合的人淚脂質運載蛋白突變蛋白對VEGF具有結合親和力且綴合至分子量為20kDa的線性PEG(SEQ ID NO:22#2PEG20)。以深灰色三角形示出了從批次372-56的制劑釋放的突變蛋白SEQ ID NO:22#2PEG20的活性脂質運載蛋白突變蛋白的量(相比于突變蛋白的初始量)，以中等灰色三角形示出了從批次372-57的制劑釋放的活性脂質運載蛋白突變蛋白的量(以百分比計)，以淺灰色三角形示出了從批次372-58的制劑釋放的活性脂質運載蛋白突變蛋白的量(以百分比計)。

圖16示出了來自3個控制釋放制劑(批次372-56、372-57和372-58)的總人淚脂質運載蛋白突變蛋白的經計算體外每日釋放，所述人淚脂質運載蛋白突變蛋白對VEGF具有結合親和力且綴合至分子量為20kDa的線性PEG(SEQ ID NO:22#2PEG20)。如圖14所示，以深灰色條示出了從批次372-56的制劑釋放的突變蛋白SEQ ID NO:22#2PEG20的活性脂質運載蛋白突變蛋白的量(以ng/天計)，以中等灰色條示出了從批次372-57的制劑釋放的活性脂質運載蛋白突變蛋白的量，以淺灰色條示出了從批次372-58的制劑釋放的活性脂質運載蛋白突變蛋白的量。

圖17示出了來自3個控制釋放制劑(批次372-56、372-57和372-58)的總人淚脂質運載蛋白突變蛋白的累積體外釋放，所述人淚脂質運載蛋白突變蛋白對VEGF具有結合親和力且綴合至分子量為20kDa的線性PEG(SEQ ID NO:22#2PEG20)。如圖15所示，以深灰色三角形示出了從批次372-56的制劑釋放的突變蛋白SEQ ID NO:22#2PEG20的活性脂質運載蛋白突變蛋白的量(相比于突變蛋白的初始量)，以中等灰色三角形示出了從批次372-57的制劑釋放的活性脂質運載蛋白突變蛋白的量(以百分比計)，以淺灰色三角形示出了從批次372-58的制劑釋放的活性脂質運載蛋白突變蛋白的量(以百分比計)。

圖18示出了從控制釋放制劑(批次372-56、372-57和372-58)釋放的活性VEGF結合人淚脂質運載蛋白突變蛋白相比于經84天釋放的總脂質運載蛋白突變蛋白的百分比，所述人淚脂質運載蛋白突變蛋白對VEGF具有結合親和力且綴合至分子量為20kDa的線性PEG(SEQ ID NO:22#2PEG20)。使用和圖14和16相同的標記以示出從控制釋放制劑(372-56、372-57和372-58)釋放的脂質運載蛋白突變蛋白的量。

圖19示出了從3個控制釋放制劑(批次372-56、372-57和372-58)釋放的總人淚脂質運載蛋白突變蛋白的血漿水平，所述人淚脂質運載蛋白突變蛋白對VEGF具有結合親和力且綴合至分子量為20kDa的線性PEG(SEQ ID NO:22#2PEG20)。使用和圖14和16相同的標記以示出從控制釋放制劑(372-56、372-57和372-58)釋放的脂質運載蛋白突變蛋白的量。

實施例

包括下述實施例來說明本發(fā)明的具體實施方式。本領域技術人員應該理解，在下文實施例中公開的技術表示由本發(fā)明人發(fā)現的在實施本發(fā)明中良好應用的技術，并且因此可以被認為組成具體的方式以用于其實踐。但是，見于本公開內容，本領域技術人員應該理解可以在公開的具體實施方式中作出很多變化，并且仍獲得類似或相似的結果，為沒有脫離本發(fā)明的精神和范圍。

除非另有說明，使用已建立的重組基因技術方法，例如如Sambrook等人(上文)所述。

實施例1：人淚脂質運載蛋白的聚乙二醇化的突變蛋白的制備

將對人VEGF具有納摩爾結合親和力的SEQ ID NO:22的人淚脂質運載蛋白突變蛋白綴合至聚乙二醇聚合物(PEG)。

通過點突變引入未配對的半胱氨酸殘基來代替SEQ ID NO:22突變蛋白的位置91的氨基酸Asp，以便提供用于偶合活化的PEG的反應性基團。然后如前所述在E.coli中生成攜帶自由Cys殘基的重組突變蛋白(例如參見PCT公布WO 2008/015239)。

將三(2-羧乙基)鹽酸膦(TCEP)用作還原劑，以獲得SEQ ID NO:22的自由半胱氨酸91殘基，以用于用PEG修飾。TCEP濃度是關鍵因素，因為TCEP過量可以導致PRS-055的分子間二硫鍵的還原。該經還原的SEQ ID NO:22突變蛋白的存在可以通過RP HPLC和通過離子交換HPLC進行檢測。如果二硫鍵被打開，則半胱氨酸的所有巰基都可以被聚乙二醇化，從而導致期望的PEG-SEQ ID NO:22物質與誤聚乙二醇化的和寡聚乙二醇化的SEQ ID NO:22突變蛋白的混合物。如果TCEP濃度過低，則SEQ ID NO:22突變蛋白的活化不完全，從而導致聚乙二醇化產量降低。通過混合含SEQ ID NO:22突變蛋白的溶液與TCEP溶液進行活化。在室溫下通過輕柔混合約2至3h孵育活化批次。

通過混合活化批次與馬來酰亞胺偶聯的PEG(平均分子量2、5、10、20kDa，線性碳鏈；或平均分子量40kDa，分支的碳鏈(例如PEG40Sunbright GL2-400MA01；NOF,Singapore))而進行聚乙二醇化。在活化時間段最后結束時立即加入PEG?；赟EQ ID NO:22突變蛋白的量計算PEG的量。SEQ ID NO:22突變蛋白與PEG的靶標摩爾比為1:2。

聚乙二醇化之后，進行另一次離子交換色譜步驟(Macro cap)以改善聚乙二醇化的蛋白質的純度，并且去除游離PEG和未反應的SEQ ID NO:22突變蛋白。

由此獲得的產物稱為SEQ ID NO:22#1(SEQ ID NO:22；未綴合的突變蛋白)、SEQ ID NO:22#002PEG05(綴合至分子量為5kDa的線性PEG的突變蛋白)、SEQ ID NO:22#002PEG 10(綴合至分子量為10kDa的線性PEG的突變蛋白)、SEQ ID NO:22#002PEG20(綴合至分子量為20kDa的線性PEG的突變蛋白)、和SEQ ID NO:22#002PEG40(綴合至分子量為40kDa的分支的PEG的突變蛋白)。

實施例2：SEQ ID NO:22突變蛋白及其PEG綴合物的凍干

在嘗試將SEQ ID NO:22突變蛋白溶解于有機溶劑中之前，需要從蛋白質溶液中去除鹽并且凍干該物質。選擇透析作為去除鹽的方法。在含有碳酸氫銨的揮發(fā)性緩沖液中透析蛋白質，以在凍干后產生相對不含鹽的粉末。

用0.02％碳酸氫銨將已知體積的藥物儲液(300μL PRS-055,2mL SEQ ID NO:22#002PEG20,3mL SEQ ID NO:22#002PEG40)稀釋為10mL的體積。將經稀釋的溶液轉移到透析管(SpectraPor 3500MWCO)中，然后在4℃下同時以105rpm攪拌針對3L體積的0.02％碳酸氫銨進行透析。排空0.02％碳酸氫銨體積，然后以3小時的間隔用新鮮緩沖液替換2次。在第3次替換后，使透析持續(xù)過夜。之后將溶液轉移到50mL Falcon管中，然后置于–80℃冷藏室中。溶液冷凍后，將所述管凍干大致72小時。

在確認活性后，透析SEQ ID NO:22#002PEG20和SEQ ID NO:22#002PEG40的剩余藥物溶液。用0.02％碳酸氫銨將大致5mL的SEQ ID NO:22#002PEG20和6.5mL的SEQ ID NO:22#002PEG40分別稀釋成20mL和25mL的體積。將經稀釋的溶液轉移到透析管中，然后在4℃下同時以105rpm攪拌針對4L體積的0.02％碳酸氫銨進行透析。排空0.02％碳酸氫銨體積，然后以2小時的間隔用新鮮緩沖液替換2次。之后將溶液轉移到50mL Falcon管中，然后置于–80℃冷藏室中。溶液冷凍后，將所述管凍干大致45小時。

用0.02％碳酸氫銨將大致25mL的SEQ ID NO:22#002PEG05和40mL的SEQ ID NO:22#002PEG10分別稀釋成50mL和40mL的體積。將經稀釋的溶液轉移到透析管中，然后在4℃下同時以105rpm攪拌針對4L體積的0.02％碳酸氫銨進行透析。排空0.02％碳酸氫銨體積，然后以2小時的間隔用新鮮緩沖液替換2次。之后將溶液轉移到50mL Falcon管中，然后置于–80℃冷藏室中。溶液冷凍后，將所述管凍干大致45小時。將SEQ ID NO:22#002PEG05和SEQ ID NO:22#002PEG10的一部分再次透析，將32.5mg SEQ ID NO:22-PEG05和31.6mg SEQ ID NO:22-PEG10分別溶解于大致37.5mL和35mL的0.02％碳酸氫銨中。將溶液和4L的0.02％碳酸氫銨放在透析管中，置于4℃下16小時，然后將碳酸氫銨替換為新鮮的。2小時后，在多個50mL falcon管中收集樣品，冷凍，然后凍干大致48小時。

實施例3：SEQ ID NO:22突變蛋白及其PEG綴合物的溶解性

測定SEQ ID NO:22及其PEG綴合物在有機溶劑中的溶解性。精確稱量少量SEQ ID NO:22或相應的綴合物，加入4或6mL玻璃管中。以小體積增量(微量移液器)加入所選的有機溶劑。旋轉所述管，然后目測觀察澄清度。加入其余體積的溶劑直到獲得澄清的溶液。

實施例4：綴合物的RP-HPLC分析

在PBS中稀釋三種不同化合物(SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:22#002-PEG20、和SEQ ID NO:22#002-PEG40)的溶液，使得所述溶液的濃度為～0.1mg/mL。通過反相HPLC(RP-HPLC)分析這些溶液。在HP/Agilent系統(tǒng)上，使用Waters xBridge BEH300C183.5μm,(4.6x250mm)柱進行所述反相方法。使用梯度法，在30℃下以1ml/min(表1)開始。使用15μl注射體積。

表1：反相梯度法

表2具有得到的結果。RP-HPLC濃度基于作為標準物的突變蛋白SEQ ID NO:22，以測定脂質運載蛋白突變蛋白含量，分子量用于測定聚乙二醇化的類似物的濃度。每種化合物的注入溶液的色譜圖示于圖1、2和3。

表2：RP-HPLC測定的樣品的濃度

在凍干和重懸于PBS后獲得SEQID NO:22#002PEG05和SEQ ID NO:22#002PEG10的色譜圖(圖4和5)。

實施例5：SEQ ID NO:22及其PEG綴合物在有機溶劑中的溶解性

微球制劑的制備需要將藥物和聚合物(PLGA)共溶于有機溶劑中。在二氯甲烷(DCM)中進行SEQ ID NO:22綴合物的初始測試。由于SEQ ID NO:22和綴合物在該溶劑中的溶解性很差，在二甲基亞砜(DMSO)，DCM與芐醇(BnOH)，DCM/乙酸(AcOH)，DCM/甲醇(MeOH)，乙酸乙酯(EtOAc)，EtOAc/AcOH，和DCM、MeOH、AcOH、和H2O的溶劑體系中進行SEQ ID NO:22和綴合物的其它溶解性測試。

將PLGA聚合物加入到這些溶液中的一些中，以測定藥物的溶解性在聚合物存在下是否會改變。加入聚合物使得聚乙二醇化的藥物/聚合物的所得重量/重量比率是15/85。在一些情況下，聚合物的加入得到不透明溶液，因此加入更多溶劑直到混合物變得澄清。

SEQ ID NO:22#001在測試的所有溶劑中的溶解性都很差(<3mg/mL)(表3)。

表3：SEQ ID NO:22#001溶解性

SEQ ID NO:22#002PEG20和SEQ ID NO:22#002PEG40均在由DCM/MeOH/AcOH/H2O組成的溶劑體系中溶解性最高(表4和5)。

表4：SEQ ID NO:22#002PEG20溶解性

表5：SEQ ID NO:22#002PEG40溶解性

當將聚合物加入到SEQ ID NO:22#002PEG20溶液中時，所述溶解性保持大約相同。當將聚合物加入到SEQ ID NO:22#002PEG40溶液中時，所述溶液渾濁，不得不稀釋幾乎2倍以使藥物變得可溶。所述綴合物在更簡單的DCM/AcOH或DCM/MeOH的溶劑體系中的溶解性不比在DCM/MeOH/AcOH/H2O中好。

還可在含有DCM、MeOH、AcOH、和H2O的溶劑體系中測試SEQ ID NO:22#002PEG05和SEQ ID NO:22#002PEG10。在表6中比較了這些綴合物與更高分子量綴合物的溶解性。

表6：SEQ ID NO:22綴合物在79％DCM、12.8％MeOH、7.9％AcOH、0.3％diH2O和PLGA聚合物中的溶解性比較

SEQ ID NO:22#002-PEG05和SEQ ID NO:22#002PEG20綴合物在具有PLGA聚合物的該溶劑混合物中具有最高溶解性(基于蛋白質)。

實施例6：SEQ ID NO:22突變蛋白的綴合物與微球產生技術的相容性

為確定SEQ ID NO:22突變蛋白的綴合物是否與微球形成技術相容，通過微球方法制備樣品。然后通過將綴合物從微球中萃取出來，或者通過將釋放自微球的綴合物收集到PBS中，而制備用于活性分析的樣品。

將每種SEQ ID NO:22突變蛋白的綴合物溶解于由79％DCM、12.8％MeOH、7.9％AcOH、0.3％H2O和聚合物組成的溶劑體系中。獲得用于制備微球的澄清的勻質油相溶液。通過合并油相與由1％聚乙烯醇(PVA)和1％DCM組成的水相而制備乳液。在0.3％PVA中收集乳液，然后使DCM蒸發(fā)以便硬化微粒。然后通過過濾收集硬化的顆粒，用水洗滌然后凍干。

當顆粒干燥時，通過將微球樣品溶解于乙腈(ACN)中然后用0.1％TFA(在水中)沉淀聚合物而測定藥物含量。離心含有萃取的藥物的溶液，然后通過RP-HPLC(圖6-9)分析上清液。

SEQ ID NO:22#002PEG05和SEQ ID NO:22#002PEG10的色譜圖具有寬偏移的保留時間，說明它們在某些方面已經改變。從微球中萃取的SEQ ID NO:22#002PEG20和SEQ ID NO:22#002PEG40的色譜圖含有額外的峰，暫時將此歸因于PEG結構的一個分支的部分損失(參見Guiotto、A.等人(2004)Bioorg.Med.Chem.12,5031-5037)。40kDa PEG綴合物的新峰的洗脫時間(31.8分鐘)類似于完整的20kDa PEG SEQ ID NO:22的洗脫時間(例如32.8分鐘)，如果該額外的峰還具有連接的20kDa of PEG的話，這是所期待的。

不僅將從微球中萃取的綴合物樣品暴露于用于生產微球的條件，還暴露于用于從微球中萃取蛋白質的嚴格條件。為獲得已暴露于微球法的更具有代表性的樣品，將微球樣品在離心管中懸浮于1.5mL PBS中，并放在37℃孵育箱的架子上。24小時后，以3000rpm離心該離心管3分鐘。通過RP-HPLC分析所得的含釋放的綴合物的上清液(圖10-11)。因為24小時時SEQ ID NO:22#002PEG05和SEQ ID NO:22#002PEG10不具有可檢測水平的釋放的藥物，本文僅示出SEQ ID NO:22#002PEG20和SEQ ID NO:22#002PEG40的色譜圖。

從微球中釋放的聚乙二醇化的脂質運載蛋白突變蛋白的色譜圖(圖10和11)類似于萃取的蛋白質樣品的色譜圖(圖8和9)。

測定了藥物含量和藥物從微球中的初始24小時釋放。結果示于表7，為通過使用所有蛋白質相關峰的面積而進行的測定。

表7：藥物含量和SEQ ID NO:22微球的初始釋放

ND＝未檢測

實施例7：SEQ ID NO:22突變蛋白的綴合物在PLG微球中的包封

期望的產品情況是以1-5μg/天的范圍持續(xù)釋放SEQ ID NO:22至少3個月且通過不大于25號針遞送、體積不超過100μL的可生物降解PLG微球懸浮液。

平均直徑小于50μm的微球可通過25號針注射。

取決于注射介質的設計，微球懸浮于注射介質的顯示可通過25號針注射的百分比范圍為10％至30％。對于100μL注射使用1注射介質中20％微球的平均值，將遞送20mg微球。

在微球中，包封是聚(丙交酯-共-乙交酯)聚合物的多達13.5重量％的SEQ ID NO:22-PEG20。假設注射20mg微球，則每次注射將施用2.7mg活性藥物。將總質量除以3個月的天數(90天)，可以持續(xù)30μg/天的最大遞送速率。通過改變微球注射質量，可以降低該遞送速率。結合當前參數，可以獲得指定遞送速率的持續(xù)時間。

實施例8：體外釋放研究

施用300mg聚乙二醇化的SEQ ID NO:22(SEQ ID NO:22#002PEG20)，制備1個批次的微球以進行體外釋放研究。

評估了SEQ ID NO:22PEG20含量、粒徑分析和殘留溶劑(通過TGA)(表8)。

表8：所述批次的微球的總結數據

通過SEC和RP-HPLC二者評估含量。這些測量值在分析技術之間是一致的，并且測量值低于之前的觀察。

通過檢測活性藥物在37℃下漏槽條件(sink condition)緩沖液中的量，進行SEQ ID NO:22-PEG20裝載微球的體外釋放溶解。簡而言之，將大致10mg微球(記載準確質量)稱量并加入14mL聚丙烯測試管中。將4mL體積磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(1x PBS，無菌過濾，HyClone)加入每個管中。代替離心，使用血清分離濾器。

將牢固封蓋的體外釋放組件水平放入37℃、120rpm運行的Fisher水填充搖床水浴中。在記錄的間隔，使用16x 100mm血清分離濾器(Fisher，目錄號02-681-52)從微球中分離上清液。使用轉移移液器，去除接近4mL上清液，部分體積直接轉移到HPLC玻璃管中。棄除過量上清液。離心HPLC管中收集的樣品，直至48小時內通過HPLC進行分析。將4mL體積的新PBS直接加入到聚丙烯管中，然后將管再次牢固封蓋。把管放回搖床水浴中。這些實驗的結果示于圖12和13。

初始突釋顯著大于之前的觀察。7天后，該制劑持續(xù)釋放7至14天，近似的質量釋放速率為約5μg/天。釋放百分比的范圍為0.28％/天至0.42％/天。

釋放從2至3周提高，其速率提高至10μg/天。隨著聚合物降解而速率可能迅速提高的這一可能，能夠由制劑方法解決，所述制劑方法例如包括酯端基聚合物與酸端基的混合物。

實施例9：37℃下在50％大鼠血漿中3個不同微粒制劑的體外釋放

針對在設計的溶劑體系(描述于實施例6，有機相由79％DCM,12.8％MeOH,7.9％AcOH,0.3％H2O和聚合物組成，含水相即水相由1％聚乙烯醇(PVA)和1％DCM組成)中的高溶解性將蛋白質凍干循環(huán)進行優(yōu)化后，使用各300mg聚乙二醇化的SEQ ID NO:22(SEQ ID NO:22#002PEG20)，制備3個批次的微球，以進行體外和體內釋放研究。

評估了SEQ ID NO:22PEG20含量、24小時突釋、殘余溶劑(通過TGA)、粒徑和粒徑分布(表9)。

表9：3個批次的微球的總結數據

來自3個不同顆粒批次(372-56、372-57和372-58)的微粒含有大致1.6mg的人淚脂質運載蛋白突變蛋白，所述人淚脂質運載蛋白突變蛋白對VEGF具有結合親和力且綴合至分子量為20kDa的線性PEG(SEQ ID NO:22#2PEG20)(400μl，5％溶液、～8％載量)，使用頂置式攪拌器，在40rpm下將所述微球在50％大鼠Li-肝素血漿中于37℃下孵育。通過定量ECL ELISA分析結合活性脂質運載蛋白突變蛋白經前84天釋放到槽中的量。對于批次372-56和372-58，使用具有75摩爾％DL丙交酯單體和25mol％乙交酯且具有末端酸基團和0.45至0.55Dl/g固有粘度的聚(DL-丙交酯-乙交酯)聚合物。此外，對于批次#371-58，使用棕櫚酸作為成孔劑。對于批次372-57，使用具有65摩爾％DL丙交酯單體和35mol％乙交酯且具有末端酸基團和0.4至0.55Dl/g固有粘度的聚(DL-丙交酯-乙交酯)聚合物(使用25型號Cannon-Fenske玻璃毛細管粘度計，在30℃下以CHCL3中0.5％w/v測量所述粘度)。

所有3個制劑都能觀察到功能活性脂質運載蛋白突變蛋白的延長的釋放。初始釋放后為低平臺期(28-56天)，然后為向上的從63天開始的更高釋放(圖14和15)。擴散的控制初始釋放相對較慢，并延長經過數天。鄰苯二甲酸的加入確實將批次372-58的初始釋放顯著提高至～25％，推測是由于微粒的孔隙度提高。所有3個制劑的平臺釋放速率都相當類似。

為進行比較，還測定了總脂質運載蛋白突變蛋白的釋放(圖16和17)。比較活性脂質運載蛋白突變蛋白和總脂質運載蛋白突變蛋白的釋放水平結果，經測定，40-65％的初始釋放的脂質運載蛋白突變蛋白看起來在整個釋放時間段中是有活性的(圖17)。微球批次之一的活性和總脂質運載蛋白突變蛋白的比率最穩(wěn)定(批次00372-58)。

實施例10：3個不同微粒制劑在單次皮下施用于雌性RNU大鼠的藥代動力學

此實驗的目的是，通過測量釋放的脂質運載蛋白突變蛋白在4個月內的血漿水平而測定延長的體內釋放曲線并且將其與體外釋放相關聯。

從經皮下注射給藥150mg/kg微球溶液(5％,3ml/kg)的裸鼠獲得2-78天血漿樣品，通過定量ECL ELISA分析所述血漿樣品，測量結合活性脂質運載蛋白突變蛋白?？梢栽谘獫{中檢測到從皮下注射的微球釋放的活性SEQ ID NO:22-PEG20，并且初始釋放后為恒定的低平臺期。直到43天的初始體內釋放譜與體外觀察到的譜都非常對應。

示于圖19的此研究的結果顯示，在43天后血漿水平遠低于1ng/ml，這指示了體內釋放可能以比體外釋放更快的速率發(fā)生。在單獨的研究中，以實驗方法測定了SEQ ID NO:22-PEG20的皮下注射生物利用度為30％，清除率為18ml/h/kg?？梢杂嬎銥橄俾实捏w內釋放速率等于穩(wěn)定狀態(tài)的釋放速率(輸注)(Css＝k0/Cl，k0為釋放/輸注的速率常數，Cl為清除率(Cl＝18ml h-1kg-1)，Css為穩(wěn)定狀態(tài)血漿濃度(在平臺期，Css＝0.015μg/ml))。因此，SEQ ID NO:22-PEG20微球緩釋劑型(depot)的釋放速率為，k0＝Css*Cl＝0.015μg/ml*18ml h-1kg-1＝270ng h-1kg-1或k0＝6.48μg/天*kg＝1.3μg/天*大鼠。對于在200g大鼠施用3個月～2,4mg(150mg/kg，8％載量)緩釋劑型，可以預測26μg/天的恒定釋放速率，這是目前觀察到的釋放速率的10倍(還考慮到，脂質運載蛋白突變蛋白的總釋放是活性濃度的～2倍)。

本文示例性描述的發(fā)明可以在不存在任何未在本文具體公開的元素、限制的情況下適當地進行實施。因此，例如術語“包含”、“包括”、“含有”等應該廣泛理解而無限制。并且，本文采用的術語和表達方式用作描述的而非限制的術語，并且無意使用排除所示和所描述特征的任何等同方式或其部分的術語和表達方式，但是應理解，在本發(fā)明要求保護的范圍內，多種修飾方式是可行的。因此，應該理解，接管本發(fā)明已經通過優(yōu)選實施方式和任何特征予以具體公開，但是本領域技術人員可以獲得本文在此公開的實施發(fā)明的修飾方式和改變，并且認為此類修飾方式和改變在本發(fā)明的范圍內。本文已經廣泛和通用地描述了本發(fā)明。落在通用公開內容之內的每個較窄種類和亞集也形成本發(fā)明的部分。這包括具有從該通類去除任何主題的負面限制的本發(fā)明的通用描述，無論該排除的物質是否在本文具體描述。并且，在本發(fā)明的特征或方面以馬庫什基團的方式進行描述的情況下，本領域技術人員將認識到，本發(fā)明還由此以任何單獨的成員或馬庫什基團成員的子集進行了描述。從下述權利要求來看，本發(fā)明的其它實施方式將是顯而易見的。