發(fā)明領域本發(fā)明涉及預防或治療哺乳動物的結(jié)核分枝桿菌感染的復活感染的方法，也涉及縮短抗結(jié)核分枝桿菌感染的化療時程的方法。發(fā)明背景結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)和其它分枝桿菌感染引起的慢性傳染病。它是發(fā)展中國家的主要疾病，在世界發(fā)達地區(qū)也逐漸增加，每年約新增八百萬病例，有三百萬例死亡。盡管感染可在相當長時期內(nèi)無癥狀，但該病最常見的表現(xiàn)為急性肺炎，引起發(fā)熱及干咳。如不治療，就會引起嚴重并發(fā)癥乃至死亡。雖然結(jié)核病通?？赏ㄟ^使用延長抗生素療法加以控制，但這種治療方法對預防疾病傳播是不夠的。感染者可能無癥狀，但在一段時間內(nèi)具有傳染性。另外，盡管治療方案的順應性至關重要，但患者行為難以監(jiān)控。一些患者沒有完成治療過程，導致無效治療并產(chǎn)生耐藥性。即使完成了整個療程，但是結(jié)核分枝桿菌感染并未從感染者體內(nèi)根除而是保持仍可復發(fā)的潛伏感染狀態(tài)。為了控制結(jié)核病的傳播，有效的疫苗接種和準確的早期疾病診斷至關重要。目前，接種活菌是誘導產(chǎn)生保護性免疫的最有效方法。用于該目的的最常見分枝桿菌就是卡介苗(BCG)，是牛分枝桿菌(M.bovis)的減毒株。然而，卡介苗的安全性和有效性常常引發(fā)爭論，諸如美國等一些國家就不用這種制劑為公眾接種。結(jié)核病的診斷通常用皮試來完成，包括皮內(nèi)接觸結(jié)核菌素PPD(純化蛋白衍生物)。注射后48-72小時，抗原特異性T細胞反應在注射部位產(chǎn)生可測量的硬結(jié)，表示接觸分枝桿菌抗原。然而，該試驗的敏感性和特異性一直都是個問題，無法將接種卡介苗的個體與感染個體區(qū)別開來。盡管已知巨噬細胞是分枝桿菌免疫性的主要效應物，但T細胞卻是這種免疫性的主要誘導物。艾滋病患者因耗盡人免疫缺陷病毒(HIV)感染相關CD4+T細胞而頻繁發(fā)生分枝桿菌感染，這證明T細胞在保護機體免遭分枝桿菌感染中的重要作用。已經(jīng)知道分支桿菌反應性CD4+T細胞是γ干擾素(IFN-γ)的有效生產(chǎn)者，而已知γ干擾素又可觸發(fā)小鼠巨噬細胞的抗分枝桿菌反應。盡管IFN-γ在人體內(nèi)的作用尚不清楚，但研究表明1,25-二羥基-維生素D3，無論是單用還是與IFN-γ或腫瘤壞死因子α聯(lián)用，都可激活人巨噬細胞抑制結(jié)核分枝桿菌感染。而且，已知IFN-γ刺激人體巨噬細胞產(chǎn)生1,25-二羥基-維生素D3。同樣，也已知道白介素12(IL-12)在刺激抗結(jié)核分枝桿菌感染中的作用。有關結(jié)核分枝桿菌感染免疫學的綜述參見Chan和Kaufmann,Tuberculosis:Pathogenesis,ProtectionandControl(Bloom編著,1994)、Tuberculosis(第2版,Rom和Garay編著,2003)和Harrison的PrinciplesofInternalMedicine,第150章,第953-966頁(第16版,Braunwald等編著,2005)。對于活動性和潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染而言，都需要預防復活感染的有效治療策略。本發(fā)明即可滿足這一目的和其它目的。序列表的描述SEQIDNO:1：N-端具有6個組氨酸標記的Mtb72f(DNA)。SEQIDNO:2：N-端具有6個組氨酸標記的Mtb72f(蛋白質(zhì))。SEQIDNO:3：N-端具有2個組氨酸插入的M72(Mtb72f變異體)(DNA)。SEQIDNO:4：N-端具有2個組氨酸插入的M72(Mtb72f變異體)(蛋白質(zhì))。SEQIDNO:5：N-端沒有插入組氨酸的Mtb72f(DNA)。SEQIDNO:6:N-端沒有插入組氨酸的Mtb72f(蛋白質(zhì))。發(fā)明概述本發(fā)明提供藥物組合物，其包含來自結(jié)核分枝桿菌復合群菌種的Mtb72f融合蛋白或其免疫原性片段，以及例如一種或多種佐劑(包括AS01B和AS02A)。本發(fā)明部分基于發(fā)明人的以下發(fā)現(xiàn)：給予Mtb72f融合蛋白或其免疫原性片段、以及例如一種或多種佐劑或者編碼Mtb72f融合蛋白或其免疫原性片段的核酸，可預防或治療活動性或非活動性結(jié)核分枝桿菌感染的復活感染。在一個優(yōu)選實施方案中，將Mtb72f融合蛋白或核酸與一種或多種抗結(jié)核分枝桿菌感染的有效化療藥聯(lián)合用藥。一方面，該組合物用于預防或治療患者的結(jié)核病復活的方法，該方法包括給予已感染結(jié)核分枝桿菌的哺乳動物免疫學有效量的藥物組合物的步驟，該組合物包含來自結(jié)核分枝桿菌復合群菌種的Mtb72f融合蛋白或其免疫原性片段以及佐劑，其中Mtb72f融合蛋白誘導抗結(jié)核分枝桿菌的免疫應答，因而預防或治療結(jié)核病復活。另一方面，該組合物用于預防患者的結(jié)核病復活的方法，該方法包括給予已感染結(jié)核分枝桿菌的哺乳動物免疫學有效量的藥物組合物的步驟，該組合物包含來自結(jié)核分枝桿菌復合群菌種的Mtb72f融合蛋白或其免疫原性片段的編碼核酸，其中所表達的Mtb72f融合蛋白誘導抗結(jié)核分枝桿菌的免疫應答，因而預防或治療結(jié)核病復活。另一方面，該組合物用于縮短抗結(jié)核分枝桿菌感染的化療時程的方法，該方法包括給予已感染結(jié)核分枝桿菌的哺乳動物一種或多種抗結(jié)核分枝桿菌感染的有效化療藥和免疫學有效量的藥物組合物，該藥物組合物包含來自結(jié)核分枝桿菌復合群菌種的Mtb72f融合蛋白或其免疫原性片段以及佐劑，其中所述Mtb72f融合蛋白或其免疫原性片段誘導抗結(jié)核分枝桿菌的免疫應答，因而可縮短抗結(jié)核分枝桿菌感染的化療時程。通過縮短抗結(jié)核分枝桿菌感染的化療時程，本發(fā)明方法也能有效增加正在接受抗結(jié)核分枝桿菌感染治療個體的順應性，以完成整個療程。附圖簡述圖1顯示SwissWebster小鼠(SWR/J)的結(jié)核分枝桿菌復活感染模型的示意圖。該圖顯示感染、化療(每升飲用水含50mg利福平/85mg異煙肼)、免疫接種以及細菌載量計數(shù)/菌落形成單位(CFU)的時間點。圖2顯示在已感染結(jié)核分枝桿菌的SWR/J小鼠中先化療、再接種Mtb72f的IgG1和IgG2a抗體反應免疫應答。小鼠未接受治療、接受化療(每升飲用水含50mg利福平/85mg異煙肼)或者接受化療并用無佐劑的8μg/劑Mtb72f肌內(nèi)接種3次。最后一次接種后10天給小鼠放血，通過ELISA測定血清IgG1(紅)和IgG2a(黑)同種型的抗Mtb72f抗體反應。圖3顯示在已感染結(jié)核分枝桿菌的SWR/J小鼠中先化療、再接種Mtb72f的IgG1和IgG2a抗體反應免疫應答。小鼠未接受治療、接受化療(每升飲用水含50mg利福平/85mg異煙肼)或者接受化療并用含佐劑AS01B的8μg/劑Mtb72f肌內(nèi)接種3次。最后一次接種后10天給小鼠放血，通過ELISA測定血清IgG1(紅)和IgG2a(黑)同種型的抗Mtb72f抗體反應。圖4顯示在已感染結(jié)核分枝桿菌的SWR/J小鼠中先化療、再接種Mtb72f的干擾素-γ(IFN-γ)反應。在不同時間點獲取小鼠脾細胞，用10μg/mlrMtb72f或所示成分(Mtb32c和Mtb39)在體外刺激3天。作為對照，脾細胞培養(yǎng)物也用PPD(3μg/ml)、BCG裂解物(10μg/ml)、conA(3μg/ml)中的一種來刺激或者單用培養(yǎng)基刺激。隨后通過ELISA測定產(chǎn)生的IFN-γ。圖5顯示在已感染結(jié)核分枝桿菌的SWR/J小鼠中先化療、再接種Mtb72f的IFN-γ反應。在不同時間點獲取小鼠脾細胞，用10μg/mlrMtb72f或所示成分(Mtb32c和Mtb39)在體外刺激3天。作為對照，脾細胞培養(yǎng)物也用PPD(3μg/ml)、BCG裂解物(10μg/ml)、conA(3μg/ml)中的一種來刺激或者單用培養(yǎng)基刺激。隨后通過ELISA測定產(chǎn)生的IFN-γ。圖6顯示在已感染結(jié)核分枝桿菌的SWR/J小鼠中先化療、再接種Mtb72f的CD4+T細胞和IFN-γ細胞因子反應。在不同時間點獲取小鼠脾細胞，用10μg/mlrMtb72f在體外刺激過夜。針對CD4和IFN-γ給細胞染色。作為對照，也單用培養(yǎng)基來刺激脾細胞培養(yǎng)物。隨后通過胞內(nèi)細胞因子染色(ICS)測定產(chǎn)生的CD4+T細胞特異性IFN-γ+。圖7顯示在Mtb感染后第120天CD4+和CD8+T細胞特異性IFN-γ+產(chǎn)值列表。從未經(jīng)治療小鼠組、用30、60或90天聯(lián)合化療組、或用聯(lián)合化療并輔以Mtb72f疫苗組獲取脾細胞。脾細胞用10μg/mlrMtb72f在體外刺激過夜。針對CD4、CD8或IFN-γ給細胞染色。作為對照，也單用培養(yǎng)基來刺激脾細胞培養(yǎng)物。隨后通過胞內(nèi)細胞因子染色(ICS)測定產(chǎn)生的CD4+和CD8+T細胞特異性IFN-γ+。圖8顯示在已感染結(jié)核分枝桿菌的SWR/J小鼠中先化療、再接種Mtb72f的存活率。用50-100CFU的MtbH37Rv通過氣溶膠感染小鼠，30天后對其中一組小鼠開始進行化療(每升飲用水含50mg利福平/85mg異煙肼)。化療持續(xù)60天。半數(shù)接受化療的小鼠用含佐劑AS01B的8μg/劑Mtb72f肌內(nèi)接種3次。圖9顯示在已感染結(jié)核分枝桿菌的SWR/J小鼠中先化療、再接種Mtb72f的存活率。用50-100CFU的MtbH37Rv通過氣溶膠感染小鼠，30天后對其中一組小鼠開始進行化療(每升飲用水含50mg利福平/85mg異煙肼)。在不同小鼠組中，化療持續(xù)30、60或90天。半數(shù)接受化療的小鼠用含佐劑AS01B的8μg/劑Mtb72f肌內(nèi)接種3次。具體實施方案的詳細描述本發(fā)明涉及用于治療、預防或延遲活動性或非活動性(即潛伏性)分枝桿菌感染的復活感染并且包含Mtb72f核酸或融合蛋白以及佐劑的組合物及其使用方法。更具體地講，本發(fā)明的組合物包含來自結(jié)核分枝桿菌復合群菌種的Mtb72f融合多肽或其免疫原性片段或者編碼Mtb72f融合多肽或其免疫原性片段的核酸，所述結(jié)核分枝桿菌復合群菌種例如結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)、牛分枝桿菌(M.bovis)或非洲分枝桿菌(M.africanum)，或者在免疫缺損宿主(例如艾滋病患者)中引起機會感染(例如肺部感染)的環(huán)境或機會性分枝桿菌，例如卡介苗(BCG)、鳥分枝桿菌(M.avium)、胞內(nèi)分枝桿菌(M.intracellulare)、隱藏分枝桿菌(M.celatum)、日內(nèi)瓦分枝桿菌(M.genavense)、嗜血分枝桿菌(M.haemophilum)、堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)、猿分枝桿菌(M.simiae)、母牛分枝桿菌(M.vaccae)、偶發(fā)分枝桿菌(M.fortuitum)和瘰疬分枝桿菌(M.scrofulaceum)(參見例如Harrison的PrinciplesofInternalMedicine,第150章,第953-966頁(第16版,Braunwald等編著,2005)。本申請的發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，包含Mtb72f融合多肽或編碼Mtb72f融合多肽的核酸或其免疫原性片段的組合物可用于治療、預防或延遲結(jié)核分枝桿菌感染的復活感染。在一個優(yōu)選實施方案中，將Mtb72f融合多肽或核酸與一種或多種化療藥聯(lián)合用藥。因此，這些組合物、多肽及其編碼核酸可用于誘導哺乳動物保護機體免遭疾病癥狀復活感染的免疫應答。本發(fā)明的Mtb72f核酸和融合多肽還可包含設計用于增加其抗原性或在其它方面改進這些抗原的其它成分。例如，可以通過在抗原一端添加一段組氨酸殘基，以便更好地進行融合多肽抗原的分離。本發(fā)明的組合物、多肽和核酸可包含來自分枝桿菌的額外抗原拷貝或額外異源多肽，例如MTB8.4抗原、MTB9.8抗原、MTB9.9抗原、MTB40抗原、MTB41抗原、ESAT-6抗原、MTB85復合抗原、α-結(jié)晶抗原或NS1抗原?；蛘撸景l(fā)明的組合物、多肽和核酸可包含來自分枝桿菌其它抗原的額外拷貝，例如Ag85B或MTCC#2。本發(fā)明的組合物、多肽和核酸也可包含來自其它來源的額外多肽。例如，本發(fā)明的組合物和融合蛋白可包含多肽或編碼多肽的核酸，其中多肽增強抗原例如NS1(一種流感病毒蛋白)的表達，參見例如WO99/40188和WO93/04175。本發(fā)明的核酸可根據(jù)物種(例如人)選擇的密碼子偏好進行改造。Mtb72f融合蛋白組合物通常包含一種或多種佐劑，例如在脂質(zhì)體制劑中的AS01B(單磷酰脂質(zhì)A(MPL)和QS21；參見美國專利公布號2003/0143240)；AS02A(3D-MPL和QS21和水包油乳劑；參見Bojang等,Lancet(2001)358:1927)；ENHANZYN(Detox)；3D-MPL；皂苷類，包括QuilA及其組分，例如QS21和皂苷模擬物；CWS；TDM；AGP；免疫刺激性寡核苷酸，例如CPG；Leif；及其衍生物。在一個優(yōu)選實施方案中，將Mtb72f融合多肽與一種或多種佐劑一起給予，所述佐劑選自在脂質(zhì)體制劑(例如AS01B)中的3D-MPL和QS21以及MPL和QS21和水包油乳劑(例如AS02A)。佐劑AS01B和AS02A的詳細描述參見Pichyangkul等,Vaccine(2004)22:3831-40。當以核酸形式遞送Mtb72f抗原時，可以在例如病毒載體(即腺病毒載體)或突變型細菌宿主細胞(即突變體、減毒的分枝桿菌屬(Mycobacterium)、乳桿菌屬(Lactobacillus)或芽孢桿菌屬(Bacillus)宿主細胞(包括卡介苗(BCG)和乳酸乳球菌(Lactococcuslactis))中遞送。一方面，該組合物用于預防或治療患者的結(jié)核病復活的方法，該方法包括給予已感染結(jié)核分枝桿菌的哺乳動物免疫學有效量的藥物組合物的步驟，該組合物包含來自結(jié)核分枝桿菌復合群菌種的Mtb72f融合蛋白或其免疫原性片段以及佐劑，其中Mtb72f融合蛋白誘導抗結(jié)核分枝桿菌的免疫應答，因而預防或治療結(jié)核病復活。通過實施本發(fā)明的方法，可延遲結(jié)核分枝桿菌感染的復活感染(例如幾個月、幾年或不定期)。一方面，該組合物用于預防或治療患者的結(jié)核病復活的方法，該方法包括給予已感染結(jié)核分枝桿菌的哺乳動物免疫學有效量的藥物組合物的步驟，該組合物包含來自結(jié)核分枝桿菌復合群菌種的Mtb72f融合蛋白或其免疫原性片段的編碼核酸，其中所表達的Mtb72f融合蛋白誘導抗結(jié)核分枝桿菌的免疫應答，因而預防結(jié)核病復活。在一個實施方案中，將Mtb72f核酸或融合蛋白給予活動性結(jié)核分枝桿菌感染個體。在一個實施方案中，將Mtb72f核酸或融合蛋白給予非活動性即潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染個體。在一個實施方案中，將Mtb72f核酸或融合蛋白給予已感染結(jié)核分枝桿菌多藥耐藥性菌株的個體。在一個實施方案中，將Mtb72f核酸或融合蛋白給予先前已接種卡介苗(BCG)的個體。在某些實施方案中，將Mtb72f核酸或融合蛋白與一種或多種抗結(jié)核分枝桿菌感染的有效化療藥聯(lián)合用藥。這些化療藥的實例包括但不限于：阿米卡星、氨基水楊酸、卷曲霉素、環(huán)絲氨酸、乙胺丁醇、乙硫異煙胺、異煙肼、卡那霉素、吡嗪酰胺、利福霉素(即利福平、利福噴汀和利福布汀)、鏈霉素、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、克拉霉素、阿奇霉素和氟喹諾酮類。由主治醫(yī)師經(jīng)判斷采用優(yōu)選藥物聯(lián)用來確定這類化療?！耙痪€”化療藥用于治療無耐藥性的結(jié)核分枝桿菌感染，包括異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素和吡嗪酰胺。“二線”化療藥用于治療已知對一種或多種“一線”藥物具有耐藥性的結(jié)核分枝桿菌感染，包括氧氟沙星、環(huán)丙沙星、乙硫異煙胺、氨基水楊酸、環(huán)絲氨酸、阿米卡星、卡那霉素和卷曲霉素。Mtb72f核酸或融合蛋白可在給予一種或多種抗結(jié)核分枝桿菌感染的有效化療藥之前、同時或之后給予。在一個實施方案中，Mtb72f核酸或融合蛋在開始給予一種或多種化療藥之后約兩周給予。通常在一段時間內(nèi)給予一種或多種化療藥，例如約1、2、3或4周，2、3、4、5、6或8個月，一年或者更長時間。在某些實施方案中，給予卡介苗(BCG)會加強Mtb72f核酸或融合蛋白的效果。在某些實施方案中，初次給予Mtb72f核酸或融合多肽后，再給予一次或多次“加強”即后續(xù)Mtb72f核酸或融合多肽(“初次和加強”方法)。例如，初次給予Mtb72f核酸或融合多肽后，再給予一次或多次后續(xù)Mtb72f核酸或融合蛋白。在一個實施方案中，初次給予Mtb72f核酸或融合多肽后，再給予一次或多次后續(xù)Mtb72f融合多肽。在一個實施方案中，初次給予Mtb72f核酸或融合多肽后，再給予一次或多次后續(xù)Mtb72f融合核酸。通常，首次即“初次”給藥和第二次即“加強”給藥之間的間隔時間約2-12周，或者長達4-6個月。后續(xù)“加強”給藥之間的間隔時間約6個月，或者長達1、2、3、4或5年。常規(guī)加強治療(例如初次給予蛋白質(zhì)后，再加強給予蛋白質(zhì))也可用于抗結(jié)核分枝桿菌復活感染的預防或治療。另一方面，該組合物用于減少或縮短抗結(jié)核分枝桿菌感染的化療時程的方法，該方法包括給予已感染結(jié)核分枝桿菌的哺乳動物一種或多種抗結(jié)核分枝桿菌感染的有效化療藥和免疫學有效量的藥物組合物，該藥物組合物包含來自結(jié)核分枝桿菌復合群菌種的Mtb72f融合多肽或其免疫原性片段以及佐劑，其中所述Mtb72f融合多肽誘導抗結(jié)核分枝桿菌的免疫應答，因而可減少或縮短抗結(jié)核分枝桿菌感染的化療時程。通常，給予Mtb72f核酸或融合多肽可允許在6、5、4、3個月或更短時間內(nèi)的抗結(jié)核分枝桿菌感染的有效化學治療。Mtb72f組合物通常給予人類，但對馴養(yǎng)哺乳動物(即狗、貓、兔、大鼠、小鼠、豚鼠、倉鼠、南美栗鼠)和農(nóng)用哺乳動物(即牛、豬、綿羊、山羊、馬)等其它哺乳動物也有效。在其最普通的一面，本發(fā)明的Mtb72f融合蛋白是包含3個抗原Ra12-TbH9-Ra35中的每種至少一個免疫原性片段的蛋白質(zhì)。在本申請的命名法中，Ra35是指Mtb32A(Ra35FL)的N-端，包含來自結(jié)核分枝桿菌Mtb32A的至少約前205個氨基酸(其核苷酸序列和氨基酸序列在美國專利申請?zhí)?9/597,796號的圖4中公開)或者來自其它分枝桿菌的相應區(qū)域。最典型的Ra35是指本申請公開的SEQIDNO:2的一部分，對應于殘基535-729?；蛘?，它是指Ra35的變異體，其中對應于SEQIDNO:2氨基酸710的絲氨酸被Ala取代。Ra12是指Mtb32A(Ra35FL)的C端，包含來自結(jié)核分枝桿菌MTB32A的至少約最后132個氨基酸(其序列在美國專利申請?zhí)?9/072,967號的SEQIDNO:4(DNA)和SEQIDNO:66(預測氨基酸序列)中公開)，或者來自其它分枝桿菌的相應區(qū)域。最典型的Ra12是指本申請公開的SEQIDNO:2的一部分，對應于殘基8-139。Mtb39(TbH9)是指基本上在美國專利申請?zhí)?8/658,800、08/659,683、08/818,112和08/818,111以及WO97/09428和WO97/09429申請中公開為SEQIDNO:106(cDNA全長)和SEQIDNO:107(蛋白質(zhì)全長)的序列。該序列也在美國專利申請?zhí)?9/056,559中公開為SEQIDNO:33(DNA)和SEQIDNO:91(氨基酸)。最典型的TbH9是指本申請公開的SEQIDNO:2的一部分，對應于殘基143-532。下面提供本發(fā)明的組合物和融合蛋白所用的一些單個抗原的序列：Mtb32A(TbRa35FL或Ra35FL)，其序列在美國專利申請?zhí)?8/523,436、08/523,435、08/658,800、08/659,683、08/818,112、09/056,556和08/818,111以及WO97/09428和WO97/09429申請中公開為SEQIDNO:17(cDNA)和SEQIDNO:79(蛋白質(zhì))，另見Skeiky等,InfectionandImmunity67:3998-4007(1999)；下面提供本發(fā)明的一些融合蛋白的序列：TbH9-Ra35(Mtb59F)，其序列在美國專利申請?zhí)?9/287,849和PCT/US99/07717申請中公開為SEQIDNO:23(cDNA)和SEQIDNO:24(蛋白質(zhì))；Ral2-TbH9-Ra35(Mtb72f)，其序列在本申請以及美國專利申請?zhí)?9/223,040和PCT/US99/07717中公開為SEQIDNO:1或SEQIDNO:5(DNA)和SEQIDNO:2或SEQIDNO:6(蛋白質(zhì))。SEQIDNO:1和SEQIDNO:2序列包含6個His殘基的His標記。M72是Mtb72f的突變體，其中在SEQIDNO:2相應位置710氨基酸的絲氨酸殘基已由Ala取代(以及N端His標記上有4個His殘基已除去)，其序列在本文中公開為SEQIDNO:3(DNA)和SEQIDNO:4(蛋白質(zhì))。其中蛋白質(zhì)具有6個His殘基的His標記的這些序列的變異體公開于美國專利申請?zhí)?9/597,796和PCT/US01/19959。鑒于Ser710被Ala取代，所以認為M72比Mtb72f而言更能抵抗自溶。下面提供本發(fā)明組合物和融合蛋白所用的一些額外抗原的序列：Mtb8.4(DPV)，其序列在美國專利申請?zhí)?8/658,800、08/659,683、08/818,112和08/818,111以及WO97/09428和WO97/09429申請中公開為SEQIDNO:101(cDNA)和SEQIDNO:102(蛋白質(zhì))。Mtb9.8(MSL)，其序列在美國專利申請?zhí)?8/859,381、08/858,998、09/073,009和09/073,010以及PCT/US98/10407和PCT/US98/10514申請中公開為SEQIDNO:12(DNA)、SEQIDNO:109(預測氨基酸序列)和SEQIDNO:110-124(肽)；Mtb9.9A(MTI,亦稱MTI-A)，其序列在美國專利申請?zhí)?8/859,381、08/858,998、09/073,009和v09/073,010以及PCT/US98/10407和PCT/US98/10514申請中公開為SEQIDNO:3和SEQIDNO:4(DNA)和SEQIDNO:29和SEQIDNO:51-66(MTI的ORF肽)。也存在另外兩個MTI變異體，稱為MTI-B和MTI-C；Mtb40(HTCC#1)，其序列在美國專利申請?zhí)?9/073,009和09/073,010以及PCT/US98/10407和PCT/US98/10514申請中公開為SEQIDNO:137(cDNA)和138(預測氨基酸序列)；Mtb41(MTCC#2)，其序列在美國專利申請?zhí)?9/073,009和09/073,010以及PCT/US98/10407和PCT/US98/10514申請中公開為SEQIDNO:140(cDNA)和SEQIDNO:142(預測氨基酸序列)；ESAT-6，其序列在美國專利申請?zhí)?9/072,967中公開為SEQIDNO:103(DNA)和SEQIDNO:104(預測氨基酸序列)。ESAT-6序列也公開于美國專利號5,955,077；α-結(jié)晶抗原，其序列公開于Verbon等,J.Bact.174:1352-1359(1992)；85復合抗原，其序列公開于Content等,Infect.&Immunol.59:3205-3212(1991)。上述各序列也公開于Cole等,Nature393:537(1998)，也可參見例如http://www.sanger.ac.uk和http:/www.pasteur.fr/mycdb/。上述序列公開于以下文獻：美國專利申請?zhí)?8/523,435、08/523,436、08/658,800、08/659,683、08/818,111、08/818,112、08/942,341、08/942,578、08/858,998、08/859,381、09/056,556、09/072,596、09/072,967、09/073,009、09/073,010、09/223,040、09/287,849以及PCT專利申請PCT/US98/10407、PCT/US98/10514、PCT/US99/03265、PCT/US99/03268、PCT/US99/07717、WO97/09428和WO97/09429、WO98/16645、WO98/16646，所述文獻各自通過引用結(jié)合到本文中。本文所述的抗原包括多態(tài)變異體和保守修飾變異體，以及菌株間和種間分枝桿菌同源物。另外，本文所述的抗原包括亞序列或截短序列。融合蛋白也可含有額外多肽，任選來自分枝桿菌或其它來源的異源多肽?？赏ㄟ^例如添加如下所述的接頭肽序列來修飾這些抗原?？蓪⑦@些接頭肽插入到構成每個融合蛋白的一個或多個組分之間。定義術語“結(jié)核病復活(tuberculosisreactivation)”是指結(jié)核菌素試驗呈陽性、但沒有明顯疾病癥狀的個體在以后表現(xiàn)出疾病癥狀。個體感染結(jié)核分枝桿菌，并且經(jīng)足以使結(jié)核病轉(zhuǎn)變成非活動性即潛伏狀態(tài)的治療，可具有或沒有先前表現(xiàn)的活動性疾病癥狀。然而，在表現(xiàn)出活動性疾病癥狀的個體中可以啟動結(jié)核病復活的預防或治療方法?！霸l(fā)性結(jié)核病”是指結(jié)核分枝桿菌感染后的臨床疾病(表現(xiàn)出疾病癥狀)。參見Harrison的PrinciplesofInternalMedicine,第150章,第953-966頁(第16版,Braunwald等編著,2005)?！袄^發(fā)性結(jié)核病”或“原發(fā)后結(jié)核病(postprimarytuberculosis)”是指休眠性、非活動性或潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染的復活感染。參見Harrison的PrinciplesofInternalMedicine,出處同上?！盎顒有越Y(jié)核分枝桿菌感染”是指表現(xiàn)出疾病癥狀的結(jié)核分枝桿菌感染?！胺腔顒有浴⑿菝咝曰驖摲越Y(jié)核分枝桿菌感染”是指沒有表現(xiàn)出疾病癥狀的結(jié)核分枝桿菌感染?！澳退幮浴苯Y(jié)核分枝桿菌感染是指一種或多種能有效治療結(jié)核分枝桿菌感染的所謂“一線”化療藥(例如異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素和吡嗪酰胺)不能抑制或殺傷的感染菌株(具有耐藥性)所引起的結(jié)核分枝桿菌感染。“多藥耐藥性”結(jié)核分枝桿菌感染是指感染菌株對兩種以上能有效治療結(jié)核分枝桿菌感染的“一線”化療藥具有耐藥性的結(jié)核分枝桿菌感染。“有效治療結(jié)核分枝桿菌感染的化療藥”是指本領域已知并用于治療結(jié)核分枝桿菌感染的藥物。用于治療結(jié)核分枝桿菌感染的示例性藥物包括但不限于阿米卡星、氨基水楊酸、卷曲霉素、環(huán)絲氨酸、乙胺丁醇、乙硫異煙胺、異煙肼、卡那霉素、吡嗪酰胺、利福霉素(即利福平、利福噴汀和利福布汀)、鏈霉素、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、克拉霉素、阿奇霉素和氟喹諾酮類。用于治療無耐藥性的結(jié)核分枝桿菌感染的“一線”化療藥包括異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素和吡嗪酰胺。用于治療已知對一種或多種“一線”藥物具有耐藥性的結(jié)核分枝桿菌感染的“二線”化療藥包括氧氟沙星、環(huán)丙沙星、乙硫異煙胺、氨基水楊酸、環(huán)絲氨酸(cycloserine)、阿米卡星、卡那霉素和卷曲霉素。有關這類藥物的綜述可參見Goodman和Gilman的ThePharmacologicalBasisofTheraputics,第48章，Hardman和Limbird編著,2001。“FL”是指全長，即與野生型多肽長度相同的多肽?！癏is標記”是指插入在N端的一串His殘基，通常為6個殘基，常常緊接著起始Met殘基后或在C-端。它們對天然序列而言通常是異源的，但還是要摻入進去，因為它們通過提高蛋白質(zhì)與固定化金屬親和色譜樹脂(IMAC)的結(jié)合而有助于分離。一般而言，對于引起針對抗原性蛋白的有用免疫應答來說，His標記的存在與否并不重要。假如誘導針對His標記本身的不利免疫反應，人們認為最好將His標記的長度減少至4個或更少殘基，尤其是2個殘基。術語“其免疫原性片段”是指包含能被細胞毒T淋巴細胞、輔助T淋巴細胞或B細胞識別的表位的多肽。通常，Mtb72f的免疫原性片段是含有500個以上氨基酸(例如600個以上氨基酸、例如700個以上氨基酸)的多肽。本發(fā)明也包括多個片段，例如共同覆蓋Mtb72F融合蛋白序列的全部或基本上全部(例如500個以上氨基酸、例如600個以上氨基酸、例如700個以上氨基酸)的重疊片段。術語“結(jié)核分枝桿菌復合群菌種(Mycobacteriumspeciesofthetuberculosiscomplex)”包括傳統(tǒng)上被認為是引起結(jié)核病的分枝桿菌，以及在免疫缺損患者(例如艾滋病患者)中引起結(jié)核病和肺部疾病的環(huán)境或機會性分枝桿菌，例如結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌或非洲分枝桿菌、BCG、鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、隱藏分枝桿菌、日內(nèi)瓦分枝桿菌、嗜血分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、猿分枝桿菌、母牛分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌和瘰疬分枝桿菌(參見例如Harrison的PrinciplesofInternalMedicine,第150章,第953-966頁(第16版,Braunwald等編著,2005)。佐劑是指在疫苗或治療性組合物中能加強針對抗原的特異性免疫應答的成分(參見例如Edelman,AIDSRes.HumRetroviruses8:1409-1411(1992))。佐劑誘導Th1型和Th2型反應的免疫應答。Th1型細胞因子(例如IFN-γ、IL-2和IL-12)傾向于誘導針對所給予抗原的細胞介導免疫應答，而Th-2型細胞因子(例如IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和TNF-β)傾向于誘導體液免疫應答。能優(yōu)先刺激Th-1細胞介導免疫應答的佐劑可參見WO94/00153和WO95/17209。“核酸”是指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其多聚體。該術語包括含有已知核苷酸類似物或修飾主鏈殘基或鍵的核酸，可以是合成的、天然的和非天然的，它們與參考核酸具有相似的結(jié)合特性，而且與參考核苷酸以相似方式代謝。這些類似物的實例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸甲酯、手性-磷酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。除非另有說明，否則特定核酸序列也包括其保守修飾變異體(例如簡并密碼子取代)和互補序列，以及所指定的序列。具體地講，通過產(chǎn)生一個或多個所選(或全部)密碼子的第3位置被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列，可完成簡并密碼子取代(Batzer等,NucleicAcidRes.19:5081(1991)；Ohtsuka等,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；Rossolini等,Mol.Cell.Probes8:91-98(1994))。術語核酸與基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸可互換使用。術語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，是指氨基酸殘基的多聚體。該術語適用于一個或多個氨基酸殘基是相應天然氨基酸的人工化學模擬物的氨基酸多聚體，也用于天然氨基酸多聚體和非天然氨基酸多聚體。術語“氨基酸”是指天然和合成氨基酸，以及與天然氨基酸作用方式相似的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然氨基酸是由遺傳密碼編碼的氨基酸，以及隨后被修飾的氨基酸，例如羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物是指與天然氨基酸具有相同基本化學結(jié)構的化合物，即α碳與氫、羧基、氨基和R基團結(jié)合，例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜(methioninesulfoxide)、甲硫氨酸甲基锍(methioninemethylsulfonium)。這些類似物具有修飾R基團(例如正亮氨酸)或修飾肽主鏈，但保留與天然氨基酸相同的基本化學結(jié)構。氨基酸模擬物是指化學結(jié)構與氨基酸通用化學結(jié)構不同、但與天然氨基酸作用方式相似的化合物。氨基酸在本文中可用它們公知的三字母符號表示，或者可用IUPAC-IUB生物化學命名委員會(BiochemicalNomenclatureCommission)所推薦的單字母符號來表示。同樣，核苷酸也可用它們公知的單字母編碼來表示?！氨Ｊ匦揎椬儺愺w”用于氨基酸序列和核酸序列。對于特定核酸序列而言，保守修飾變異體是指編碼相同或基本相同氨基酸序列的核酸，換句話說，不同的核酸可以編碼序列基本相同的氨基酸序列。因為遺傳密碼的簡并性，所以大量功能相同的核酸編碼任何給定蛋白質(zhì)。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼丙氨酸。因此，在密碼子指定為丙氨酸的每個位置，可將密碼子改為任何相應密碼子，但不改變所編碼的多肽。這樣的核酸變異就是“沉默變異”，屬于保守修飾變異中的一種。在此編碼多肽的每個核酸序列也都描述了每種可能的核酸沉默變異。技術人員將會知道核酸中的各密碼子(除了AUG通常僅是甲硫氨酸的密碼子之外，而且除了TGG通常僅是色氨酸的密碼子之外)都可以修飾，以得到功能相同的分子。因此，編碼多肽的核酸中的每個沉默變異在每個所述序列中都是隱含的。對于氨基酸序列，技術人員將會知道，在編碼序列中改變、添加或缺失一個氨基酸或少部分氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列的單個取代、缺失或添加就是“保守修飾變異體”，其中改變導致氨基酸被化學相似的氨基酸取代。提供功能相似氨基酸的保守取代表是本領域眾所周知的。這樣的保守修飾變異體除了多態(tài)變異體之外(且不排除多態(tài)變異體)，還是本發(fā)明的種間同源物和等位基因。下列8組分別包括可彼此保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)；(參見例如Creighton,Proteins(1984))。術語“異源”當用于核酸部分時，是指包含在自然界沒有彼此間相同關系的兩個或更多個亞序列的核酸。例如，核酸通常是重組產(chǎn)生的，具有兩個或更多個來自無關基因的序列排列成新功能核酸，例如一個來源的啟動子與另一來源的編碼區(qū)。同樣，異源蛋白是指包含在自然界沒有彼此間相同關系的兩個或更多個亞序列的蛋白質(zhì)(例如融合蛋白)。“融合多肽”或“融合蛋白”是指具有直接或通過氨基酸接頭共價連接的至少兩個異源分枝桿菌多肽的蛋白質(zhì)。多肽形成融合蛋白通常是C-端與N-端連接，盡管它們也可以是C-端與C-端、N-端與N-端、或N-端與C-端連接。融合蛋白的多肽可以按任何順序。該術語也指構成融合蛋白的抗原的保守修飾變異體、多態(tài)變異體、等位基因、突變體、亞序列和種間同源物。結(jié)核分枝桿菌抗原可參見Cole等,Nature393:537(1998)，該文獻公開了完整的結(jié)核分枝桿菌基因組。結(jié)核分枝桿菌完整序列也可參見http://www.sanger.ac.uk和http://www.pasteur.fr/mycdb/(MycDB)?？梢允褂帽疚乃龅男蛄斜容^算法或本領域技術人員已知的其它方法(例如雜交測定和抗體結(jié)合測定)，鑒定來自其它分枝桿菌的、對應于結(jié)核分枝桿菌抗原的抗原。本發(fā)明所用的示例性Mtb72f融合蛋白包括：包含SEQIDNO:2序列中殘基8-729的蛋白質(zhì)；包含SEQIDNO:2序列(＝Mtb72f)、任選所述序列沒有His標記形成殘基2-7或具有不同長度His標記的蛋白質(zhì)或者由其組成的蛋白質(zhì)；包含SEQIDNO:2序列、任選所述序列沒有His標記形成殘基2-7或具有不同長度His標記(例如包含SEQIDNO:2序列中殘基8-729的蛋白質(zhì))以及一種或多種結(jié)核分枝桿菌抗原(例如以上段落[0045]至[0052]所列出的一種或多種蛋白質(zhì)或其任何免疫原性片段)的融合蛋白；包含SEQIDNO:4序列(＝M72)中殘基4-725的蛋白質(zhì)；包含SEQIDNO:4序列(＝M72)、任選所述序列沒有His標記形成殘基2-3或具有不同長度His標記的蛋白質(zhì)；和包含SEQIDNO:4序列、任選所述序列沒有His標記形成殘基2-3或具有不同長度His標記(例如包含SEQIDNO:4序列中殘基4-725的蛋白質(zhì))以及一種或多種結(jié)核分枝桿菌抗原(例如以上段落[0045]至[0052]所列出的一種或多種蛋白質(zhì)或其任何免疫原性片段)的融合蛋白；本發(fā)明所用的Mtb72f融合蛋白的示例性免疫原性片段包括：包含TbH9-Ra35(Mtb59F)、或TbH9、或Ra35、或Ral2序列的蛋白質(zhì)或者由其組成的蛋白質(zhì)；和包含所述序列以及一種或多種結(jié)核分枝桿菌抗原(例如以上段落[0045]至[0052]所列出的一種或多種蛋白質(zhì)或其任何免疫原性片段)的融合蛋白。本發(fā)明所用的Mtb72f融合蛋白的更多示例性免疫原性片段包括：包含TbH9-Ra35(Mtb59F)或Ra35序列的蛋白質(zhì)或者由其組成的蛋白質(zhì)，其中SEQIDNO:2中對應于Ser710的位置已經(jīng)變?yōu)锳la；和包含所述序列以及一種或多種結(jié)核分枝桿菌抗原(例如以上段落[0045]至[0052]所列出的一種或多種蛋白質(zhì)或其任何免疫原性片段)的融合蛋白。更具體地講，Mtb72f是：包含SEQIDNO:2中殘基8-729的多肽；或包含SEQIDNO:2中殘基1和8-729、任選在起始Met殘基后插入His標記的多肽；或SEQIDNO:2多肽；或包含SEQIDNO:4中殘基4-725的多肽；或包含SEQIDNO:4中殘基1和4-725、任選在起始Met殘基后插入His標記的多肽；或SEQIDNO:4多肽；或SEQIDNO:6多肽。更多示例性Mtb72f融合蛋白及其免疫原性片段包括上述蛋白質(zhì)中N-端和/或C-端已截短例如5或4或3或2或1個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。更多示例性Mtb72f融合蛋白及其免疫原性片段包括上述蛋白質(zhì)中至多10％氨基酸、例如至多5％氨基酸(例如至多10個、例如至多5個氨基酸)已經(jīng)如本文所述被保守取代的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所用的示例性Mtb72f核酸包括編碼上述示例性Mtb72f融合蛋白及其免疫原性片段的核酸(例如DNA分子)?？商峒暗囊唤M特異DNA分子包括SEQIDNO:1中的核苷酸63-2228?？商峒暗牧硪唤M特異DNA分子包括SEQIDNO:3中的核苷酸10-2175。可提及的特異DNA分子包括SEQIDNO:1或SEQIDNO:3或SEQIDNO:5或者由SEQIDNO:1或SEQIDNO:3或SEQIDNO:5組成。術語“融合”是指融合蛋白的兩個多肽間的共價連接。通常，多肽通過肽鍵直接彼此連接或通過氨基酸接頭連接。任選肽可通過本領域技術人員已知的非肽共價鍵連接。術語“選擇性(或特異性)雜交”是指在嚴格性雜交條件下分子僅與特定核苷酸序列連接、雙鏈化或雜交，當該序列存在于復雜混合物(例如總細胞或文庫DNA或RNA)中。術語“嚴格性雜交條件”是指探針與其靶亞序列(通常是在復雜的核酸混合物中)雜交、而不與其它序列雜交的條件。嚴格性條件是序列依賴性的，因不同條件而異。較長序列在較高溫度下特異性雜交。有關核酸雜交的詳細指南可參見Tijssen,TechniquesinBiochemistryandMolecularBiology--HybridizationwithNucleicProbes,"OverviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofNucleicAcidassays"(1993)。通常，嚴格性條件選擇在限定的離子強度、pH下比特定序列熱解鏈溫度Tm低約5-10℃。Tm是(在限定的離子強度、pH和核酸濃度時)在平衡條件下50％與靶互補的探針能與靶序列雜交的溫度(當靶序列過量存在下，在Tm時，50％探針在平衡條件下被占用)。嚴格性條件是這樣的條件：pH7.0-8.3，鹽濃度低于約1.0M鈉離子、通常約0.01-1.0M鈉離子濃度(或其它鹽)，溫度至少約30℃(對短探針而言，例如10-50個核苷酸)和至少約60℃(對長探針而言，例如超過50個核苷酸)。嚴格性條件也可以通過加入去穩(wěn)定劑例如甲酰胺來達到。為了選擇性或特異性雜交，陽性信號至少是背景的兩倍，任選為背景的10倍雜交。示例性的嚴格性雜交條件如下：50％甲酰胺,5xSSC和1％SDS,于42℃保溫，或者5xSSC,1％SDS,于65℃保溫，在0.2xSSC和0.1％SDS中于65℃洗滌。如果核酸所編碼的多肽基本相同，則在嚴格性條件下彼此不雜交的核酸仍然會基本相同。例如當用遺傳密碼所允許的最大密碼子簡并性產(chǎn)生核酸拷貝時，就會出現(xiàn)這樣的現(xiàn)象。在此情況下，核酸通常在中等嚴格性雜交條件下雜交。示例性的“中等嚴格性雜交條件”包括在40％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS緩沖液中于37℃雜交，然后在1XSSC中于45℃洗滌。陽性雜交至少是背景的兩倍。普通技術人員將會容易地知道可以采用替代雜交和洗滌條件以提供類似嚴格性的條件?！翱贵w”是指包含來自特異性結(jié)合和識別抗原的免疫球蛋白基因或其片段的構架區(qū)的多肽。公知的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定區(qū)基因，以及無數(shù)免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈分為κ或λ。重鏈分為γ、μ、α、δ或ε，它們反過來又限定免疫球蛋白類別分別為IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。示例性的免疫球蛋白(抗體)結(jié)構單元包括四聚體。每個四聚體由兩條相同多肽鏈對組成，每對都具有一條“輕”鏈(約25kDa)和一條“重”鏈(約50-70kDa)。各鏈的N-端限定約100-110個或更多個氨基酸的可變區(qū)，主要擔負抗原識別的任務。術語輕鏈可變區(qū)(VL)和重鏈可變區(qū)(VH)分別是指這些輕鏈和重鏈?？贵w以例如完整免疫球蛋白形式存在或以不同肽酶消化而產(chǎn)生的各種充分表征的片段形式存在。因此，例如胃蛋白酶在鉸鏈區(qū)二硫鍵下消化抗體，產(chǎn)生F(ab)'2，F(xiàn)(ab)'2是Fab的二聚體，其本身是通過二硫鍵與VH-CH1連接在一起的輕鏈。在溫和條件下可將F(ab)'2還原，以打斷鉸鏈區(qū)的二硫鍵，因此將F(ab)'2二聚體轉(zhuǎn)化成Fab'單體。Fab'單體本質(zhì)上是帶有鉸鏈區(qū)部分的Fab(參見FundamentalImmunology(Paul編著,第3版,1993)。盡管根據(jù)完整抗體的消化來定義不同抗體片段，但是技術人員將會知道這些片段可以通過化學方法或通過重組DNA方法來從頭合成。因此，本文所用的術語抗體也包括通過完整抗體修飾而產(chǎn)生的抗體片段，或用重組DNA方法從頭合成的抗體(例如單鏈Fv)或用噬菌體展示文庫鑒定的抗體(參見例如McCafferty等,Nature348:552-554(1990))。為了制備單克隆或多克隆抗體，可采用本領域已知的任何技術(參見例如Kohler和Milstein,Nature256:495-497(1975)；Kozbor等,ImmunologyToday4:72(1983)；Cole等,載于MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy，第77-96頁(1985))。用于產(chǎn)生單鏈抗體的技術(美國專利4,946,778)也可用于產(chǎn)生針對本發(fā)明多肽的抗體。另外，轉(zhuǎn)基因小鼠或其它生物體例如其它哺乳動物也可用于表達人源化抗體。或者，噬菌體展示技術可用于鑒定特異性結(jié)合所選抗原的抗體和異聚Fab片段(參見例如McCafferty等,Nature348:552-554(1990)；Marks等,Biotechnology10:779-783(1992))。術語“特異性(或選擇性)結(jié)合”抗體或“特異性(或選擇性)免疫反應”當用于蛋白質(zhì)或肽時，是指決定蛋白質(zhì)異質(zhì)群體和其它生物學中蛋白質(zhì)存在的結(jié)合反應。因此，在指定免疫測定條件下，特異抗體與特定蛋白質(zhì)結(jié)合至少比背景高兩倍，而且基本上不與樣品中存在的其它蛋白質(zhì)大量結(jié)合。在這類條件下與抗體的特異性結(jié)合需要選擇抗體對特定蛋白質(zhì)的特異性。例如，可以選擇針對融合蛋白產(chǎn)生的多克隆抗體，以獲取僅能與融合蛋白發(fā)生特異性免疫反應、而不與融合蛋白各成分發(fā)生特異性免疫反應的多克隆抗體?？赏ㄟ^扣除與各個抗原交叉反應的抗體，來完成這樣的選擇。各種免疫測定形式都可用于選擇與特定蛋白質(zhì)發(fā)生特異性免疫反應的抗體。例如，固相ELISA免疫測定常規(guī)用于選擇與蛋白質(zhì)發(fā)生特異性免疫反應的抗體(參見例如Harlow和Lane,Antibodies,ALaboratoryManual(1988)和UsingAntibodies:ALaboratoryManual(1998)，描述了可用于測定特異性免疫反應的免疫測定形式和條件)。通常，特異性或選擇性反應要比背景信號或噪聲至少高2倍，更通常比背景高10-100倍。多核苷酸可包含天然序列(即編碼單個抗原或其部分的內(nèi)源序列)或可包含這類序列的變異體。多核苷酸變異體可含有一個或多個取代、添加、缺失和/或插入，使得所編碼的融合多肽的生物活性相對于包含天然抗原的融合多肽來說不會降低。與編碼天然多肽或其部分的多核苷酸序列相比，變異體優(yōu)選表現(xiàn)出至少約70％同一性，更優(yōu)選至少約80％同一性，最優(yōu)選至少約90％同一性。就兩個或更多個核酸序列或多肽序列而言，術語“相同”或“同一性”百分比是指當使用以下序列比較算法或者人工比對和目測檢查，在比較窗或指定區(qū)域進行比較和比對而測定最大對應性時，兩個或更多個序列或亞序列相同或具有指定％的相同氨基酸殘基或核苷酸(即在指定區(qū)有70％同一性、任選75％、80％、85％、90％或95％同一性)。這樣的序列就可以稱為“基本相同”。該定義也指待測序列的比較。任選同一性存在于長度至少約25個至約50個氨基酸或核苷酸的區(qū)域，或任選在長度為75-100個氨基酸或核苷酸的區(qū)域內(nèi)。對于序列比較，通常將一個序列作為參比序列，將待測序列與其進行比較。當使用序列比較算法時，將待測序列和參比序列都輸入計算機中，必要時指定亞序列坐標，并且指定序列算法程序參數(shù)?？梢允褂萌笔〕绦騾?shù)，或者可以指定替代參數(shù)。然后根據(jù)程序參數(shù)，用序列比較算法計算出待測序列相對于參比序列的序列同一性百分比。本文所用的“比較窗”包括選自以下任一數(shù)目的連續(xù)位置的區(qū)段：25-500個、通常約50個至約200個、更通常約100個至約150個，其中在將一個序列與參比序列優(yōu)化比對之后，可將相同數(shù)目的連續(xù)位置的序列與參比序列進行比較。用于比較的序列比對方法是本領域眾所周知的?？梢园凑罩T如以下的方法進行用于比較的序列最佳比對：局部同源性算法，Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)；同源性比對算法，Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)；相似性搜索方法，Pearson和Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA85:2444(1988)；這些算法的計算機工具(WisconsinGenetics軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,WI)；或者人工比對和目測檢查(參見例如CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubel等編著,1995增刊))。有用算法的另一個實例是PILEUP。PILEUP運用漸近配對序列比對，由一組相關序列創(chuàng)建多序列比對，以顯示相關性和序列同一性百分比。它也繪出進化樹或分枝圖(dendogram)，以顯示用來創(chuàng)建所述序列比對的聚類關系。PILEUP采用Feng和Doolittle,J.Mol.Evol.35:351-360(1987)的漸近序列比對方法的簡化方法。所使用的方法類似于Higgins和Sharp,CABIOS5:151-153(1989)描述的方法。所述程序可以比對多達300個序列，每個序列最大長度為5,000個核苷酸或氨基酸。所述多序列比對法始于兩個最為相似序列的配對比對，產(chǎn)生一組兩個經(jīng)比對的序列。然后該組序列與下一個最相關的序列或下一組經(jīng)比對的序列進行比對。通過兩個個別序列的配對比對的簡單延伸，將兩組序列進行比對。通過一系列漸近配對序列比對，完成最終的序列比對。通過指定具體序列及其序列比較區(qū)的氨基酸或核苷酸坐標并且指定程序參數(shù)，運行該程序。例如，運用PILEUP，采用以下參數(shù)：缺省空位加權(defaultgapweight)(3.00)、缺省空位長度加權(defaultgaplengthweight)(0.10)和加權末端空位(weightedendgap)，可以將參比序列與其它待測序列進行比較，以確定序列同一性關系百分比。可以從GCG序列分析軟件包得到PILEUP，例如7.0版本(Devereaux等,Nuc.AcidsRes.12:387-395(1984)。適用于測定序列同一性和序列相似性百分比的另一個優(yōu)選的算法實例是BLAST和BLAST2.0算法，它們分別在Altschul等,Nuc.AcidsRes.25:3389-3402(1977)和Altschul等,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中有描述。用于進行BLAST分析的軟件公眾可通過theNationalCenterforBiotechnologyInformation(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)得到。該算法包括首先通過鑒定在查詢序列中與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字串比對時或者匹配或者滿足某些正數(shù)值最低分值T的長度W的短字串，來鑒定高分序列配對(HSP)。T被稱為鄰近字串最低分值(Altschul等,出處同上)。這些原始鄰近字串命中作為起始搜索以發(fā)現(xiàn)含有它們的更長HSP的種子。只要累積序列比對分值可以增加，字串命中則以兩個方向沿每個序列延伸。對于核苷酸序列，使用參數(shù)M(一對匹配殘基的獎分(rewardscore)；總是>0)和N(錯配殘基的罰分(penaltyscore)；總是<0)，計算累積分值。對于氨基酸序列，使用打分矩陣來計算累積分值。字串命中在每個方向的延伸當遇到下述情況之一時終止：累積序列比對分值比其獲得的最大值低數(shù)量X；累積分值為零或零以下，這是由于一個或多個負打分殘基比對的累積所致；或者到達任一序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定所述比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用的缺省字長(wordlength)(W)為11，期望值(expectation)(E)為10,M＝5，N＝-4，并且比較兩條鏈。對于氨基酸序列而言，BLASTP程序使用的缺省字長(W)為3，期望值(E)為10，使用BLOSUM62打分矩陣(參見Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:10915(1989))序列比對(B)為50，期望值(E)為10,M＝5，N＝-4，并且比較兩條鏈。BLAST算法也進行兩個序列之間相似性的統(tǒng)計學分析(參見例如Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一種相似性測定是最小和概率(P(N))，它提供兩個核苷酸序列或氨基酸序列可能偶然發(fā)生匹配的概率的指標。例如，如果待測核酸與參比核酸比較中的最小和概率大約小于0.2，更優(yōu)選大約小于0.01，最優(yōu)選大約小于0.001，則認為待測核酸與參比序列相似。多核苷酸組成本文所用的術語“DNA區(qū)段”和“多核苷酸”是指已經(jīng)分離的、不含特定物種總基因組DNA的DNA分子。因此，編碼多肽的DNA區(qū)段是指含有一個或多個編碼序列、但基本上從獲取DNA區(qū)段的物種總基因組DNA中分離或純化以至不含總基因組DNA的DNA區(qū)段。術語“DNA區(qū)段”和“多核苷酸”包括DNA區(qū)段和這些區(qū)段的較小片段以及重組載體，包括例如質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒、噬菌體、病毒等。本領域技術人員將會知道，本發(fā)明的DNA區(qū)段可包括基因組序列、基因組外序列和質(zhì)粒編碼的序列以及較小的基因工程基因區(qū)段，它們表達或適于表達蛋白質(zhì)、多肽、肽等。這些區(qū)段可以是天然分離的，或人工合成修飾的。本文所用的“分離”是指基本上與其它編碼序列分開的多核苷酸和不含大部分無關編碼DNA(例如大染色體片段或其它功能基因或多肽編碼區(qū))的DNA區(qū)段。當然，它是指原來分離的DNA區(qū)段，并不排除以后通過人工向該區(qū)段添加的基因或編碼區(qū)。本領域技術人員將會知道，多核苷酸可以是單鏈(編碼或反義)或雙鏈，并且可以是DNA(基因組、cDNA或合成)或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子(含有內(nèi)含子并以一對一方式對應于DNA分子)和mRNA分子(不含內(nèi)含子)。額外的編碼或非編碼序列可以、但并非必需存在于本發(fā)明的多核苷酸內(nèi)，并且多核苷酸可以、但并非必需與其它分子和/或支持材料連接。多核苷酸可包含天然序列(即編碼分枝桿菌抗原或其部分的內(nèi)源序列)或可包含所述序列的變異體或者生物學等同物或抗原性功能等同物。如下文進一步描述，多核苷酸變異體可含有一個或多個取代、添加、缺失和/或插入，相對于天然腫瘤蛋白來說，優(yōu)選使得所編碼多肽的免疫原性并未減少。對所編碼多肽的免疫原性的作用通常按本文所述進行評價。術語“變異體”也包括異種來源的同源基因。在另外的實施方案中，本發(fā)明提供分離的多核苷酸和多肽，其包含與本文所公開的一個或多個序列相同或互補的不同長度的連續(xù)序列段。例如，本發(fā)明提供的多核苷酸包括一個或多個本文所公開的序列的至少約15、20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500或1000個或更多個連續(xù)核苷酸以及它們之間的所有中間長度。容易理解，在此情況下，“中間長度”是指所給出的數(shù)值間的任何長度，例如16、17、18、19等；21、22、23等；30、31、32等；50、51、52、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包括200-500；500-1,000等的所有整數(shù)。本發(fā)明的多核苷酸或其片段，無論其編碼序列長度如何，都可與例如以下的其它DNA序列組合：啟動子、聚腺苷酸化信號、另外的限制酶位點、多克隆位點、其它編碼區(qū)段等，使得它們總長度差異很大。因此，預期幾乎任何長度的核酸片段都可以使用，其中總長度優(yōu)選受到制備的容易性的限制，并且用于既定的重組DNA方案。例如，總長度約10,000、約5000、約3000、約2,000、約1,000、約500、約200、約100、約50堿基對等(包括所有中間長度)的說明性DNA區(qū)段可用于實施本發(fā)明。此外，本領域普通技術人員將會知道，作為遺傳密碼簡并性的結(jié)果，有許多核苷酸序列都編碼本文所述的多肽。這些多核苷酸中的某些具有與任何天然基因的核苷酸序列的最小同源性。盡管如此，因密碼子使用差異而不同的多核苷酸都明確包括在本發(fā)明之內(nèi)，例如人和/或靈長類密碼子選擇優(yōu)化的多核苷酸。此外，包含本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。等位基因是因一個或多個突變而產(chǎn)生的內(nèi)源基因，所述突變例如核苷酸的缺失、添加和/或取代。所得mRNA和蛋白質(zhì)可以、但并非必需具有改變的結(jié)構或功能。等位基因可以用標準技術(例如雜交、擴增和/或數(shù)據(jù)庫序列比較)進行鑒定。多核苷酸的鑒定和表征用任何已充分確定的多種技術，可以鑒定、制備和/或操作多核苷酸。例如，可以按照以下詳述來鑒定多核苷酸：通過cDNA微陣列篩選腫瘤相關表達(即按照本文提供的代表性測定，腫瘤的表達比正常組織至少高兩倍)。例如按照生產(chǎn)商的說明書(以及基本上按照以下文獻所述：Schena等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:10614-10619(1996)和Heller等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:2150-2155(1997))，使用Synteni微陣列(PaloAlto,CA)，可以進行這樣的篩選?；蛘?，可以從表達本文所述蛋白質(zhì)的細胞(例如結(jié)核分枝桿菌細胞)制備的cDNA中擴增多核苷酸?？梢酝ㄟ^聚合酶鏈式反應(PCR)擴增這樣的多核苷酸。對于該方法，可以根據(jù)本文提供的序列來設計序列特異性引物，也可購買或合成引物。使用眾所周知的技術，可以使用本發(fā)明多核苷酸的擴增部分從合適文庫(例如結(jié)核分枝桿菌cDNA文庫)中分離出全長基因。在這樣的技術中，用適合擴增的一個或多個多核苷酸探針或引物篩選文庫(cDNA或基因組)。優(yōu)選的文庫經(jīng)大小選擇以包含較大分子。也優(yōu)選隨機引物文庫用于鑒定基因的5'和上游區(qū)。優(yōu)選基因組文庫用于獲取內(nèi)含子和延長5'序列。對于雜交技術，可以使用眾所周知的技術標記部分序列(例如通過切口平移或用32P進行末端標記)。一般通過含有變性菌落(或含有噬斑的菌苔)及帶標記探針的雜交濾膜，篩選細菌文庫或噬菌體文庫(參見Sambrook等,MolecularCloning:ALaboratoryManual(2000))。選擇并擴增雜交菌落或噬斑，分離DNA用于進一步分析。通過例如PCR，使用來自部分序列的引物和來自載體的引物，分析cDNA克隆以確定額外序列的數(shù)量。可得到限制圖譜和部分序列，以鑒定一個或多個重疊克隆。然后用包括產(chǎn)生系列缺失克隆的標準技術，可確定完整序列。然后可將所得重疊序列裝配成單個連續(xù)序列。使用眾所周知的技術，通過連接合適片段產(chǎn)生全長cDNA分子?；蛘?，有大量的擴增技術用于從部分cDNA序列中獲取全長編碼序列。這些技術中，一般通過PCR進行擴增。任何不同的市售試劑盒都可用于進行擴增步驟?？梢允褂美绫绢I域眾所周知的軟件來設計引物。引物優(yōu)選長度為22-30個核苷酸，GC含量至少為50％并且在約68℃-72℃的溫度時退火到靶序列上。如上所述，可以對擴增區(qū)測序，并將重疊序列裝配成連續(xù)序列。一個這樣的擴增技術是反向PCR(參見Triglia等,Nucl.AcidsRes.16:8186(1988))，該技術使用限制酶在基因已知區(qū)內(nèi)產(chǎn)生片段。再通過分子內(nèi)連接使片段環(huán)化，用作PCR模板，并使用來自已知區(qū)的多種引物。在替代方法中，鄰近部分序列的序列可以通過用接頭序列的引物和對已知區(qū)具有特異性的引物擴增來得到。擴增的序列通常經(jīng)過第2輪擴增，用同樣的接頭引物和對已知區(qū)具有特異性的第二引物。該方法的一個改動就是使用沿已知序列的相反方向進行延伸的兩個引物，參見WO96/38591。另一個這樣的技術稱為“cDNA末端快速擴增”即RACE。該技術包括使用內(nèi)部引物和外部引物，能與polyA區(qū)或載體序列雜交，以鑒定已知序列的5'和3'序列。另外的技術包括捕獲PCR(Lagerstrom等,PCRMehtodsApplic.1:111-19(1991))和步移PCR(Parker等,Nucl.Acids.Res.19:3055-60(1991))。使用擴增的其它方法也可用于獲取全長cDNA序列。在某些情況下，可通過例如得自GenBank的表達序列標記(EST)數(shù)據(jù)庫提供的序列分析，獲取全長cDNA序列。通常用眾所周知的程序(例如NCBIBLAST搜索)進行重疊EST的搜索，這樣的EST可用于產(chǎn)生連續(xù)全長序列。也可通過基因組片段分析獲取全長DNA序列。在宿主細胞中表達多核苷酸在本發(fā)明的其它實施方案中，編碼本發(fā)明多肽或融合蛋白或其功能等同物的多核苷酸序列或其片段可用于重組DNA分子，以在合適宿主細胞中指導多肽表達。因為遺傳密碼的固有簡并性，可產(chǎn)生編碼基本相同或功能等同氨基酸序列的其它DNA序列，這些序列可用于克隆和表達給定多肽。本領域技術人員將會知道，在某些情況下最好產(chǎn)生具有非天然密碼子的編碼多肽的核苷酸序列。例如，可以選擇特定原核或真核宿主偏好的密碼子，以增加蛋白質(zhì)表達速率或產(chǎn)生具有所需特性(例如半衰期比天然序列所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物的長)的重組RNA轉(zhuǎn)錄物。此外，可以使用本領域公知的方法改造本發(fā)明多核苷酸序列，以便為了各種原因改變多肽的編碼序列，包括但不限于修飾克隆、加工和/或表達基因產(chǎn)物的改變。例如，通過隨機片段的DNA改組以及基因片段和合成寡核苷酸的PCR裝配，可用于改造核苷酸序列。另外，定點誘變可用于插入新限制位點，改變糖基化模式，改變密碼子偏好，產(chǎn)生剪接變異體或引入突變等。在本發(fā)明的另一個實施方案中，可將天然、修飾或重組核酸序列與異源序列連接，以編碼融合蛋白。例如，為了篩選肽文庫的多肽活性抑制劑，它可用于編碼可被市售抗體識別的嵌合蛋白。也可改造融合蛋白，以便在多肽編碼序列與異源蛋白序列之間含有切割位點，使得可以切割多肽并經(jīng)純化而與異源部分分開。采用本領域眾所周知的化學方法，可以合成編碼所需多肽的全部或部分序列(參見Caruthers,M.H.等,Nucl.AcidsRes.Symp.Ser.第215-223頁(1980),Horn等,Nucl.AcidsRes.Symp.Ser.第225-232頁(1980))?；蛘撸梢杂没瘜W方法合成多肽氨基酸序列或其部分，產(chǎn)生蛋白質(zhì)本身。例如，可以使用不同固相技術進行肽合成(Roberge等,Science269:202-204(1995))，而且可進行自動化合成，例如使用ABI43IA肽合成儀(PerkinElmer,PaloAlto,CA)?？赏ㄟ^制備型高效液相色譜(例如Creighton,Proteins,StructuresandMolecularPrinciples(1983))或本領域可用的其它類似技術，基本上純化新合成的肽。合成肽的組成可通過氨基酸分析或測序(例如Edman降解法)得以證實。另外，在直接合成和/或用化學方法與來自其它蛋白質(zhì)或其部分的序列組合期間，可以改變多肽或其部分的氨基酸序列，產(chǎn)生變異體多肽。為了表達所需多肽，可以將編碼多肽或功能等同物的核苷酸序列插入到合適表達載體中，即含有所插入編碼序列轉(zhuǎn)錄和翻譯的必要元件的載體?？梢杂帽绢I域技術人員眾所周知的方法來構建含有目標多肽編碼序列及合適轉(zhuǎn)錄和翻譯控制元件的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、合成技術和體內(nèi)遺傳重組。這些技術參見Sambrook等,MolecularCloning,ALaboratoryManual(2000)和Ausubel等,CurrentProtocolsinMolecularBiology(每年更新)。各種表達載體/宿主系統(tǒng)可用于含有和表達多核苷酸序列。它們包括但不限于微生物，例如用重組噬菌體、質(zhì)?；蛘沉NA表達載體轉(zhuǎn)化的細菌；用酵母表達載體轉(zhuǎn)化的酵母菌；用病毒表達載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統(tǒng)；用病毒表達載體(例如花椰菜花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒，TMV)或用細菌表達載體(例如Ti或pBR322質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細胞系統(tǒng)；或動物細胞系統(tǒng)。表達載體中存在的“控制元件”或“調(diào)節(jié)序列”是載體的非翻譯區(qū)——增強子、啟動子、5'和3'非翻譯區(qū)，它們與宿主細胞蛋白相互作用，進行轉(zhuǎn)錄和翻譯。這些元件的強度和特異性各異。根據(jù)所用的載體系統(tǒng)和宿主，可以使用任何數(shù)量的合適轉(zhuǎn)錄和翻譯元件，包括組成型和誘導型啟動子。例如，當在細菌系統(tǒng)中克隆時，可以使用誘導型啟動子，例如PBLUESCRIPT噬菌粒(Stratagene,LaJolla,Calif.)或PSPORT1質(zhì)粒(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)的雜合lacZ啟動子等。在哺乳動物細胞系統(tǒng)中，通常優(yōu)選來自哺乳動物基因或來自哺乳動物病毒的啟動子。如果需要產(chǎn)生含有編碼多肽的多拷貝序列的細胞系，最好使用帶有合適選擇標記的基于SV40或EBV的載體。在細菌系統(tǒng)中，可以根據(jù)所表達多肽的預期用途，選擇各種表達載體。例如，當需要大量時，例如對于誘導抗體而言，可以使用指導融合蛋白高水平表達并容易純化的載體。這樣的載體包括但不限于多功能大腸桿菌克隆載體和表達載體，例如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中編碼目標多肽的序列可以與氨基端Met和β-半乳糖苷酶亞序列7個殘基的序列一起符合讀框地連接到載體中，以便產(chǎn)生雜合蛋白；pIN載體(VanHeeke和Schuster,J.Biol.Chem.264:5503-5509(1989))；等等。pGEX載體(Promega,Madison,Wis.)也可用于表達谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白形式的外源多肽。一般而言，這樣的融合蛋白是可溶性的，通過先吸附到谷胱甘肽-瓊脂糖珠上、再在游離谷胱甘肽存在下進行洗脫，可以從裂解細胞中容易地純化該融合蛋白?？梢栽O計在這種系統(tǒng)中制備的蛋白質(zhì)，使其包含肝素、凝血酶或因子XA蛋白酶切割位點，使得克隆的目標多肽能夠從GST部分任意釋放出來。在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中，可以使用各種含有組成型或誘導型啟動子(例如α因子、醇氧化酶和PGH)的載體。有關綜述可參見Ausubel等(出處同上)和Grant等,MethodsEnzymol.153:516-544(1987)。在使用植物表達載體的情況下，多肽編碼序列的表達可由任何不同啟動子驅(qū)動。例如，病毒啟動子(例如CaMV的35S和19S啟動子)可單獨使用，或者與來自TMV的Ω前導序列一起使用(Takamatsu,EMBOJ.6:307-311(1987))?；蛘撸梢允褂弥参飭幼永鏡UBISCO的小亞基或熱激啟動子(Coruzzi等,EMBOJ.3:1671-1680(1984)；Broglie等,Science224:838-843(1984)；和Winter等,ResultsProbl.CellDiffer.17:85-105(1991))。可通過直接DNA轉(zhuǎn)化或病原體介導的轉(zhuǎn)染，將這些構建體導入植物細胞中。這類技術可參見大量普遍可得的綜述(參見例如Hobbs，載于McGrawHillYearbookofScienceandTechnology，第191-196頁(1992))。昆蟲系統(tǒng)也可用于表達目標多肽。例如，在一個這樣的系統(tǒng)中，苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographacalifornicanuclearpolyhedrosisvirus，AcNPV)用作載體，以在草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)細胞或粉紋夜蛾(Trichoplusia)幼蟲中表達外源基因。多肽編碼序列可克隆至該病毒的非必需區(qū)，例如多角體蛋白基因，并處于多角體蛋白啟動子的控制之下。多肽編碼序列的成功插入，將會使多角體蛋白基因失活，并產(chǎn)生缺乏外殼蛋白的重組病毒。再將重組病毒用于感染例如草地夜蛾細胞或粉紋夜蛾幼蟲(在草地夜蛾細胞中或粉紋夜蛾幼蟲體內(nèi)可表達目標多肽)(Engelhard等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91:3224-3227(1994))。在哺乳動物宿主細胞中，通常可以使用各種基于病毒的表達系統(tǒng)。例如，在腺病毒用作表達載體的情況下，可將目標多肽的編碼序列連接到由晚期啟動子和三聯(lián)前導序列組成的腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯復合物中。病毒基因組的非必需E1或E3區(qū)的插入，可用于獲得在受感染的宿主細胞中能表達目標多肽的活病毒(Logan和Shenk,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:3655-3659(1984))。另外，轉(zhuǎn)錄增強子(例如勞斯肉瘤病毒(RSV)增強子)可用于增加在哺乳動物宿主細胞內(nèi)的表達。采用腺病毒載體的方法和方案的綜述參見Wold,AdenovirusMethodsandProtocols,1998。使用腺病毒載體的其它參考文獻可參見Adenovirus:AMedicalDictionary,Bibliography,andAnnotatedResearchGuidetoInternetReferences,2004。也可以使用特定起始信號，使目標多肽編碼序列的翻譯更加有效。這類信號包括ATG起始密碼子和鄰近序列。在多肽編碼序列的情況下，其起始密碼子和上游序列插入到合適表達載體中，不需要其它轉(zhuǎn)錄或翻譯控制信號。然而，在僅插入編碼序列或其部分的情況下，應提供外源翻譯控制信號，包括ATG起始密碼子。此外，起始密碼子應處于正確讀框中，以確保完整插入序列的翻譯。外源翻譯元件和起始密碼子可以來自不同來源，天然和合成均可?？梢虬m于所用特定細胞系統(tǒng)的增強子而提高表達效率，可參見以下文獻：Scharf等,ResultsProbl.CellDiffer.20:125-162(1994)。另外，可以選擇宿主細胞株按所需方式調(diào)節(jié)所插入序列或加工所表達蛋白的能力。這樣的多肽修飾包括但不限于乙?；Ⅳ然?、糖基化、磷酸化、脂質(zhì)化(lipidation)和?；Ｒ部刹捎们懈畹鞍踪|(zhì)“前原(prepro)”形式的翻譯后加工，以便正確插入、折疊和/或行使功能。也可以選擇對這類翻譯后活性具有特定細胞機器和特征性機制的不同宿主細胞(例如CHO、HeLa、MDCK、HEK293和WI38)，以確保外源蛋白的正確修飾和加工。對于長期而高收率地制備重組蛋白而言，通常優(yōu)選穩(wěn)定表達。例如，可用在相同或不同載體上含有病毒復制起點和/或內(nèi)源表達元件和選擇標記基因的表達載體，轉(zhuǎn)化穩(wěn)定表達目標多核苷酸的細胞系。導入載體后，可讓細胞在富集培養(yǎng)基上生長1-2天，然后換到選擇培養(yǎng)基上。選擇標記的目的是賦予對選擇的抗性，它的存在便于對成功表達所導入序列的細胞進行生長和回收。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細胞的抗性克隆可以用適于該細胞類型的組織培養(yǎng)技術進行增殖?？梢允褂枚喾N選擇系統(tǒng)來回收轉(zhuǎn)化細胞系。這些系統(tǒng)包括但不限于單純皰疹病毒胸苷激酶基因(Wigler等,Cell11:223-32(1977))和腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Lowy等,Cell22:817-23(1990))基因，這兩者可分別用于tk.sup.-或aprt.sup.-細胞。同樣，對抗代謝藥、抗生素或除草劑的抗性也可用作選擇基礎；例如，賦予甲氨蝶呤抗性的dhfr(Wigler等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77:3567-70(1980))；賦予氨基糖苷類、新霉素和G-418抗性的npt(Colbere-Garapin等,J.Mol.Biol.150:1-14(1981))；和分別賦予氯磺隆(chlorsulfuron)和膦絲菌素(phosphinotricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶抗性的als或pat(Murry,出處同上)。例如，允許細胞利用吲哚代替色氨酸的trpB、或者使細胞利用histinol代替組氨酸的hisD等其它選擇基因已有描述(Hartman和Mulligan,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:8047-51(1988))。近來，越來越多地使用可見標記，這樣的標記例如花色素苷、β-葡糖醛酸糖苷酶及其底物GUS、螢光素酶及其底物螢光素，不僅廣泛用于鑒定轉(zhuǎn)化子，而且用于定量測定特定載體系統(tǒng)的瞬時或穩(wěn)定蛋白表達的數(shù)量(Rhodes等,MethodsMol.Biol.55:121-131(1995))。盡管標記基因表達的存在/不存在表明目標基因也存在，但它的存在和表達還需要證實。例如，如果將編碼多肽的序列插入到標記基因序列內(nèi)，可根據(jù)標記基因功能缺失，鑒定含有該序列的重組細胞?；蛘撸瑯擞浕蚩膳c多肽的編碼序列串聯(lián)起來并且處于一個啟動子控制之下。標記基因響應誘導或選擇而表達，通常表示串聯(lián)基因也表達?；蛘撸梢酝ㄟ^各種本領域技術人員已知方法鑒定含有并表達所需多核苷酸序列的宿主細胞。這些方法包括但不限于DNA-DNA或DNA-RNA雜交和蛋白質(zhì)生物測定或免疫測定技術，包括基于膜、溶液或芯片的技術，用于檢測和/或定量測定核酸或蛋白質(zhì)。使用對產(chǎn)物具有特異性的多克隆或單克隆抗體特異性，來檢測和測定多核苷酸編碼產(chǎn)物的許多方案都是本領域已知的。實例包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放免測定(RIA)和熒光激活細胞分選術(FACS)。對于某些應用來說，優(yōu)選使用兩位點的基于單克隆的免疫測定(使用對給定多肽的兩個非干擾表位具有反應性的單克隆抗體)，但也可以使用競爭性結(jié)合測定。這些測定和其它地方所用的其它測定可參見Hampton等,SerologicalMethods,aLaboratoryManual(1990)和Maddox等,J.Exp.Med.158:1211-1216(1983)。本領域已知各種各樣的標記和綴合技術，可用于各種核酸和氨基酸測定。產(chǎn)生標記雜交或用于檢測多核苷酸相關序列的PCR探針的方法包括寡核苷酸標記、切口平移、末端標記或PCR擴增(使用標記核苷酸)?；蛘?，可將序列或其任何部分克隆到載體中，以產(chǎn)生mRNA探針。這類載體是本領域已知的，是市售的，可通過添加適當?shù)腞NA聚合酶(例如T7、T3或SP6)和標記核苷酸，將這類載體用于體外合成RNA探針?？捎酶鞣N市售試劑盒實施這些方法?？梢允褂玫暮线m報道分子或標記包括放射性核素、酶、熒光劑、化學發(fā)光劑或發(fā)色劑及其底物、輔因子、抑制劑、磁性顆粒等。可以將經(jīng)目標多核苷酸序列轉(zhuǎn)化的宿主細胞在適于表達并從細胞培養(yǎng)物中回收蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)。重組細胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可以是分泌型的或者包含在細胞內(nèi)，這因所用序列和/或載體而定。本領域技術人員知道，可以設計含有本發(fā)明多核苷酸的表達載體，使其含有指導所編碼多肽穿過原核或真核細胞膜而分泌的信號序列。其它的重組構建可用于使編碼目標多肽的序列與編碼多肽結(jié)構域的核苷酸序列連接起來，便于可溶性蛋白質(zhì)的純化。這樣的便于純化的結(jié)構域包括但不限于金屬螯合肽(例如允許在固定化金屬上純化的組氨酸-色氨酸組件)、允許在固定化免疫球蛋白上純化的蛋白A結(jié)構域、以及用于FLAGS延伸/親和純化系統(tǒng)(ImmunexCorp.,Seattle,Wash.)的結(jié)構域。可以使用在純化結(jié)構域與所編碼多肽之間包含的可切割接頭序列(包括例如對因子XA或腸激酶具有特異性的序列(Invitrogen.SanDiego,Calif.))，以便純化。一個這種表達載體用于這樣的融合蛋白的表達：所述融合蛋白含有目標多肽和位于硫氧還蛋白或腸激酶切割位點之前的編碼6個組氨酸殘基的核酸。組氨酸殘基有助于在IMIAC(固定化金屬離子親和色譜)上進行純化，參見Porath等,Prot.Exp.Purif.3:263-281(1992)，而腸激酶切割位點則提供用于從融合蛋白中純化所需多肽的方法。有關含有融合蛋白的載體的論述參見Kroll等,DNACellBiol.12:441-453(1993))。除了重組制備方法之外，還可以通過直接肽合成，使用固相技術，制備本發(fā)明多肽及其片段(Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154(1963))。可用人工技術或自動化方法進行蛋白質(zhì)合成。使用例如AppliedBiosystems43IA肽合成儀(PerkinElmer)可以進行自動化合成?；蛘?，可以用化學方法單獨合成不同片段再連接在一起，得到全長分子。體內(nèi)多核苷酸遞送技術在另外的實施方案中，將包含本發(fā)明的一個或多個多核苷酸的遺傳構建體導入細胞內(nèi)。這可用各種眾所周知的方法來完成，其中的一些方法概述如下，用于說明的目的。1.腺病毒用于體內(nèi)遞送一個或多個核酸序列的一個優(yōu)選方法包括使用腺病毒表達載體?！跋俨《颈磉_載體”包括足以執(zhí)行以下功能并含有腺病毒序列的構建體：(a)支持構建體的包裝和(b)表達已按有義或反義方向克隆在其中的多核苷酸。當然，在反義構建體的情況下，表達并不需要合成該基因產(chǎn)物。表達載體包括腺病毒的基因工程形式。腺病毒遺傳構成(36kb，線狀雙鏈DNA病毒)的知識允許用多達7kb的外源序列替代大片段腺病毒DNA(Grunhaus和Horwitz,1992)。與逆轉(zhuǎn)錄病毒相反，腺病毒感染宿主細胞不導致染色體整合，因為腺病毒DNA可以按附加體方式復制，沒有潛在基因毒性。并且，腺病毒結(jié)構穩(wěn)定，在大量擴增后沒有檢出基因組重排。腺病毒事實上可感染所有上皮細胞，無論它們處于細胞周期的哪個時相。迄今為止，腺病毒感染看來僅引起輕微疾病，例如人的急性呼吸道疾病。腺病毒尤其適用于作為基因傳遞載體，這是因為它的基因組大小適中，易操作，滴度高，靶細胞范圍廣，感染性高。病毒基因組兩端含有100-200堿基對反向重復序列(ITR)，是病毒DNA復制和包裝所需的順式組件?；蚪M早期(E)和晚期(L)區(qū)域含有不同轉(zhuǎn)錄單元，它們是按病毒DNA復制開始時間來劃分的。E1區(qū)(E1A和E1B)編碼負責調(diào)節(jié)病毒基因組轉(zhuǎn)錄和少量細胞基因的蛋白質(zhì)。E2區(qū)(E2A和E2B)的表達導致合成用于病毒DNA復制的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)涉及DNA復制、晚期基因表達和宿主細胞關閉(Renan,1990)。包括大部分病毒衣殼蛋白在內(nèi)的晚期基因產(chǎn)物僅在由主要晚期啟動子(MLP)驅(qū)動的單一初級轉(zhuǎn)錄物明顯加工之后才表達。MLP(位于16.8m.u.)在感染晚期特別有效，該啟動子產(chǎn)生的所有mRNA都具有5'-三聯(lián)前導(TPL)序列，該序列使它們成為翻譯的優(yōu)選mRNA。在目前的系統(tǒng)中，重組腺病毒是由穿梭載體與原病毒載體間同源重組而產(chǎn)生。因為兩種原病毒載體可能重組，所以該過程可能產(chǎn)生野生型腺病毒。因此，從單個噬斑分離出病毒單克隆并檢查其基因組結(jié)構是至關重要的。目前復制缺損型腺病毒載體的產(chǎn)生和擴增，取決于獨特的輔助細胞系(稱為293)，該細胞系是Ad5DNA片段轉(zhuǎn)化的人胚腎細胞，能組成型地表達E1蛋白質(zhì)(Graham等,1977)。因為E3區(qū)并非腺病毒基因組所必需的(Jones和Shenk,1978)，所以目前的腺病毒載體，在293細胞輔助下，在E1、D3或這兩個區(qū)域攜帶外源DNA(Graham和Prevec,1991)。在自然界，腺病毒可包裝約105％的野生型基因組(Ghosh-Choudhury等,1987)，提供約2kB的額外DNA容量。與在E1和E3區(qū)可替代的約5.5kBDNA組合，目前腺病毒載體的最大容量小于7.5kB，或約載體總長的15％。超過80％腺病毒基因組保留載體主鏈，是載體衍生的細胞毒性的來源。而且，缺失E1的病毒的復制缺損是不完全的，例如，以高感染復數(shù)(MOI)用目前可用載體可觀察到病毒基因表達的滲漏(Mulligan,1993)。輔助細胞系可來自人體細胞，例如人胚腎細胞、肌細胞、造血細胞或其它人體胚胎間充質(zhì)細胞或上皮細胞?；蛘?，輔助細胞可來自與人腺病毒相容的其它各種哺乳動物細胞。這類細胞包括例如Vero細胞或其它猴胚胎間充質(zhì)細胞或上皮細胞。如上所述，目前優(yōu)選的輔助細胞系是293。近來，Racher等(1995)公開了培養(yǎng)293細胞和增殖腺病毒的改良方法。在一種形式中，將單個細胞接種到含有100-200ml培養(yǎng)基的1升硅化轉(zhuǎn)瓶(Techne,Cambridge,UK)中，培養(yǎng)天然細胞聚集物。在40rpm攪拌后，用錐蟲藍評價細胞活力。在另一種形式中，F(xiàn)ibra-Cel微載體(BibbySterlin,Stone,UK)(5g/1)使用如下。在250ml錐形瓶中，將重懸于5ml培養(yǎng)基中的細胞接種物加入到載體(50ml)中，靜置1-4小時，偶爾攪拌。然后培養(yǎng)基用50ml新鮮培養(yǎng)基置換，開始振搖。對于病毒制備，讓細胞培養(yǎng)至約80％長滿，然后更換培養(yǎng)基(至25％的終體積)并加入腺病毒，MOI為0.05。讓培養(yǎng)基靜置過夜，然后將體積增加至100％并開始振搖72h。除了需要腺病毒載體是復制缺損型或者至少是條件缺損型之外，腺病毒載體的特性對本發(fā)明的成功實施來說并非是至關重要的。腺病毒可以是42種不同已知血清型或A-F亞群中的任一種。腺病毒C亞群5型是獲得用于本發(fā)明的條件復制缺損型腺病毒載體的優(yōu)選原料，因為腺病毒5型是人腺病毒，它的許多生化和遺傳信息是已知的，而且它曾用于大多數(shù)以腺病毒為載體的構建體。如上所述，典型的本發(fā)明載體是復制缺損型，沒有腺病毒E1區(qū)。因此，將會最方便將目標基因的編碼多核苷酸引入到已去除E1-編碼序列的位置上。然而，腺病毒序列內(nèi)構建體的插入位置對本發(fā)明而言并非至關重要。目標基因的編碼多核苷酸也可插入到E3置換型載體中的缺失的E3區(qū)(參見Karlsson等(1986))或E4區(qū)(其中輔助細胞系或輔助病毒補充E4的缺損)。腺病毒容易培養(yǎng)和操作，體外和體內(nèi)均具有廣泛宿主范圍。該類病毒可以高滴度獲取，例如109-1011噬斑形成單位/ml，而且是高感染性的。腺病毒生命周期不需要整合到宿主細胞基因組中。腺病毒載體所遞送的外源基因是附加體，因此對宿主細胞的基因毒性較低。在野生型腺病毒接種研究中，未報道副作用(Couch等,1963；Top等,1971)，證明它作為體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移載體具有安全性和治療潛力。腺病毒載體已用于真核基因表達(Levrero等,1991；Gomez-Foix等,1992)和疫苗開發(fā)(Grunhaus和Horwitz,1992；Graham和Prevec,1992)。近來，動物研究表明重組腺病毒可用于基因治療(Stratford-Perricaudet和Perricaudet,1991；Stratford-Perricaudet等,1990；Rich等,1993)。將重組腺病毒給予不同組織的研究包括氣管滴注(Rosenfeld等,1991；Rosenfeld等,1992)、肌注(Ragot等,1993)、外周靜脈內(nèi)注射(Herz和Gerard,1993)和立體定位接種到腦部(LeGalLaSalle等,1993)。腺病毒載體可來源于人腺病毒?；蛘?，它們可來源于黑猩猩等其它物種的腺病毒，其優(yōu)點是病毒載體不被許多人類受試者體內(nèi)循環(huán)的針對人腺病毒的抗體所中和(參見例如:TatsisN等(2005)GeneTher.Dec1；[待發(fā)表])。2.逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒是一類單鏈RNA病毒，特征是在感染細胞中通過逆轉(zhuǎn)錄過程能將其RNA轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA(Coffin,1990)。所得DNA再穩(wěn)定整合在細胞染色體中成為原病毒，指導病毒蛋白質(zhì)合成。整合使病毒基因序列保留在受體細胞及其后代中。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組含有gag、pol和env三種基因，它們分別編碼衣殼蛋白、聚合酶和包膜組分。在gag基因上游發(fā)現(xiàn)的序列含有將基因組包裝在病毒粒子中的信號。兩個長末端重復(LTR)序列存在于病毒基因組的5'和3'端。它們含有強啟動子和增強子序列，也是整合到宿主細胞基因組中所需要的(Coffin,1990)。為了構建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將編碼一種或多種目標寡核苷酸或多核苷酸序列的核酸插入到病毒基因組內(nèi)某些病毒序列的位置上，以產(chǎn)生復制缺損型病毒。為了產(chǎn)生病毒粒子，構建含有gag、pol和env基因、但不含LTR和包裝組分的包裝細胞系(Mann等,1983)。當將含有cDNA、以及逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR和包裝序列的重組質(zhì)粒導入該細胞系(通過例如磷酸鈣沉淀)時，包裝序列允許將重組質(zhì)粒的RNA轉(zhuǎn)錄物包裝到病毒顆粒中，隨后再將它們分泌到培養(yǎng)基中(Nicolas和Rubenstein,1988；Temin,1986；Mann等,1983)。然后收集含有重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)基，任選濃縮，用于基因轉(zhuǎn)移。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能夠感染各種各樣的細胞類型。然而，整合和穩(wěn)定表達則需要宿主細胞分裂(Paskind等,1975)。目前，通過使乳糖殘基經(jīng)化學方法添加到病毒包膜上而對逆轉(zhuǎn)錄病毒進行化學修飾，開發(fā)了允許逆轉(zhuǎn)錄病毒載體特異性打靶的新方法。該修飾通過唾液酸糖蛋白受體可允許特異性感染肝細胞。設計了重組逆轉(zhuǎn)錄病毒打靶的另一種不同方法，該方法中使用針對逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白和特異性細胞受體的生物素化抗體。經(jīng)使用鏈霉抗生物素，該抗體通過生物素組分進行偶聯(lián)(Roux等,1989)。Roux等人使用針對I類和II類主要組織相容性復合體抗原的抗體，證明了攜帶這些表面抗原的各種人體細胞在體外可被親嗜性病毒感染(Roux等,1989)。3.腺伴隨病毒AAV(Ridgeway,1988；Hermonat和Muzycska,1984)是parovirus，是作為腺病毒貯液的污染物而發(fā)現(xiàn)的。它是與任何疾病無關的普遍存在的病毒(美國人口中有85％都存在抗體)。它也屬于依賴病毒，因為它的復制依賴于腺病毒等輔助病毒的存在。已經(jīng)分離出5個血清型，其中已充分表征了AAV-2。AAV具有單鏈線狀DNA，包裹在衣殼蛋白VPl、VP2和VP3中，形成直徑20-24nm的二十面體病毒粒子(Muzyczka和McLaughlin,1988)。AAVDNA長度約為4.7千堿基，含有兩個可讀框，側(cè)接兩個ITR。AAV基因組中有兩個主要基因：rep和cap。rep基因編碼負責病毒復制的蛋白質(zhì)，而cap編碼衣殼蛋白VP1-3。每個ITR構成T-形發(fā)夾結(jié)構。這些末端重復序列是AAV僅有的、用于染色體整合的主要順式組分。因此，AAV可用作載體，其中所有病毒編碼序列都被除去并用遞送基因盒替代。根據(jù)圖譜位置，鑒定并命名了p5、p19和p40三個病毒啟動子。從p5和p19轉(zhuǎn)錄導致產(chǎn)生rep蛋白，而從p40轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生衣殼蛋白(Hermonat和Muzyczka,1984)。有若干因素促使研究人員研究使用rAAV作為表達載體的可行性。一個因素就是對遞送基因以整合到宿主染色體的需求令人驚奇的少。需要具有145bpITR，它們僅占AAV基因組的6％。這在載體中留下裝配4.5kbDNA插入序列的空間。盡管這樣的攜帶容量可阻止AAV遞送大基因，但是這完全適合遞送本發(fā)明的反義構建體。因為AAV具有安全性，所以也是遞送載體的良好選擇。有相當復雜的拯救機制：為了動員rAAV，不僅需要野生型腺病毒而且需要AAV基因。同樣，AAV不是病原體，與任何疾病無關。除去病毒編碼序列可盡量減少針對病毒基因表達的免疫反應，因此，rAAV不會引起炎癥反應。4.作為表達構建體的其它病毒載體其它病毒載體可用作本發(fā)明的表達構建體，用于將寡核苷酸或多核苷酸序列遞送給宿主細胞?？梢允褂脕碜远幻绮《?Ridgeway,1988；Coupar等,1988)、慢病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒和皰疹病毒等病毒的載體。它們給各種哺乳動物細胞帶來一些有吸引力的特性(Friedmann,1989；Ridgeway,1988；Coupar等,1988；Horwich等,1990)。隨著目前對缺陷型乙肝病毒的識別，獲得了有關不同病毒序列的結(jié)構-功能關系的新知識。體外研究表明，病毒能保留輔助-依賴包裝和逆轉(zhuǎn)錄的能力，盡管其基因組缺失高達80％(Horwich等,1990)。這表明基因組的大部分都可以被外源遺傳物質(zhì)替換。嗜肝性和持久性(整合)對于定向肝臟的基因轉(zhuǎn)移而言是特別有吸引力的特性。Chang等(1991)將氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因?qū)滕喴腋尾《净蚪M，替代聚合酶編碼序列、表面編碼序列和前表面編碼序列。它與野生型病毒共轉(zhuǎn)染到禽類肝癌細胞系中。用含有高滴度重組病毒的培養(yǎng)基來感染原代小鴨肝細胞。轉(zhuǎn)染后至少24天檢測到穩(wěn)定的CAT基因表達(Chang等,1991)。5.非病毒載體為了實現(xiàn)本發(fā)明寡核苷酸或多核苷酸序列的表達，可將表達構建體遞送到細胞中。這樣的遞送可按照轉(zhuǎn)化細胞系的實驗室方法在體外完成，或者在某些疾病狀態(tài)的治療中在體內(nèi)或離體完成這樣的遞送。如上所述，一個優(yōu)選的遞送機制是通過病毒感染，其中表達構建體包裹在感染性病毒顆粒之內(nèi)。一旦將表達構建體遞送到細胞中，編碼所需寡核苷酸或多核苷酸序列的核酸可在不同位置定位和表達。在某些實施方案中，編碼構建體的核酸可穩(wěn)定整合到細胞基因組中。這樣的整合可以通過同源重組(基因置換)在特定位置上以特定方向，或者可以整合在隨機的非特異性位置上(基因增強)。在再一個實施方案中，核酸可以穩(wěn)定保留在細胞中，作為單獨的附加體DNA區(qū)段。這類核酸區(qū)段或“附加體”編碼序列足以允許獨立保留和復制或者與宿主細胞周期同步。表達構建體如何遞送給細胞，以及核酸保留在細胞的何處，取決于所用表達構建體的類型。在本發(fā)明的某些實施方案中，包含一個或多個寡核苷酸或多核苷酸序列的表達構建體可僅由裸的重組DNA或質(zhì)粒組成。構建體的轉(zhuǎn)移可通過任何上述方法(經(jīng)物理或化學方法透過細胞膜)來進行。這尤其適用于體外轉(zhuǎn)移，但也可用于體內(nèi)使用。Dubensky等(1984)成功地將多瘤病毒DNA以磷酸鈣沉淀形式注入成年小鼠和新生小鼠肝臟和脾臟，表現(xiàn)出活性病毒復制和急性感染。Benvenisty和Reshef(1986)也證明將磷酸鈣沉淀的質(zhì)粒直接進行腹膜內(nèi)注射，導致所轉(zhuǎn)移基因的表達。預期也可用類似方法將目標基因的編碼DNA轉(zhuǎn)移至體內(nèi)并表達基因產(chǎn)物。將裸DNA表達構建體轉(zhuǎn)入細胞的本發(fā)明的另一個實施方案涉及粒子轟擊。該方法依賴于使包被DNA的微彈加速到高速并讓其刺穿細胞膜、進入細胞而不殺死細胞的能力(Klein等,1987)。已經(jīng)開發(fā)了用于小顆粒加速的一些裝置。一個這樣的裝置依靠高壓放電產(chǎn)生電流，這樣的電流又提供原動力(Yang等,1990)。所用的微彈由鎢珠或金珠等生物惰性物質(zhì)組成。已經(jīng)對包括大鼠和小鼠的肝、皮膚和肌肉組織在內(nèi)的所選器官進行體內(nèi)轟擊(Yang等,1990；Zelenin等,1991)。這可能需要經(jīng)手術暴露組織或細胞，以去掉槍和靶器官之間的中間組織，即離體治療。此外，特定基因的編碼DNA可通過該方法遞送，這也包括在本發(fā)明中。多肽組合物在其它方面，本發(fā)明提供多肽組合物。通常，本發(fā)明多肽應為來自各種哺乳動物的分離的多肽(或其表位、變異體或活性片段)。優(yōu)選的多肽是由本文所公開的多核苷酸序列來編碼，或由在中等嚴格性條件下與本文所公開的多核苷酸序列雜交的序列來編碼?；蛘?，多肽可定義為包括來自本文所公開的氨基酸序列的連續(xù)氨基酸序列的多肽，或者包括本文所公開的完整氨基酸序列的多肽。通常用例如以下文獻及其引用文獻中概述的眾所周知技術鑒定免疫原性部分：Paul,FundamentalImmunology,第3版,243-247(1993)。這類技術包括篩選能與抗原特異性抗體、抗血清和/或T-細胞系或克隆發(fā)生反應的多肽。如果本文所用的抗血清和抗體與抗原特異性結(jié)合(即：它們在ELISA或其它免疫測定中與目標蛋白發(fā)生反應，而與無關蛋白沒有可檢測的反應)，則它們就是“抗原特異性”的?？梢园幢疚乃?，使用眾所周知的技術制備這樣的抗血清和抗體。分枝桿菌蛋白的免疫原性部分是與所述抗血清和/或T細胞在基本上不高于全長多肽反應性的水平上發(fā)生反應的部分(例如在ELISA和/或T細胞反應測定中)。在所述測定中，這樣的免疫原性部分可以類似于或高于全長多肽反應的水平發(fā)生反應。這樣的篩選通常用本領域普通技術人員熟知的方法來進行，例如參見Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratoryManual(1988)和UsingAntibodies:ALaboratoryManual(1998)。例如，可將多肽固定在固相支持物上，與患者血清接觸，以便讓血清內(nèi)抗體與固定化多肽結(jié)合。然后除去未結(jié)合血清，用例如125I-標記的蛋白A檢測結(jié)合抗體。多肽可用各種眾所周知的技術來制備。如上所述，可以用本領域普通技術人員已知的各種表達載體中的任一種，從DNA序列制備由DNA序列編碼的重組多肽?？稍诮?jīng)含編碼重組多肽的DNA分子的表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的任何合適宿主細胞中進行表達。合適宿主細胞包括原核細胞、酵母細胞和高等真核細胞，例如哺乳動物細胞和植物細胞。優(yōu)選使用的宿主細胞是大腸桿菌、酵母菌或哺乳動物細胞系，例如COS或CHO?？梢韵扔檬惺蹫V器濃縮合適宿主/載體系統(tǒng)的培養(yǎng)基上清液，其中含有合適宿主/載體系統(tǒng)所分泌的重組多肽或多肽。濃縮后，將濃縮物用于合適的純化基質(zhì)，例如親和基質(zhì)或離子交換樹脂。最后，使用一個或多個反相HPLC步驟，進一步純化重組多肽。也可通過合成方法，使用本領域普通技術人員熟知的技術，產(chǎn)生約100個以下氨基酸、通常約50個以下氨基酸的本發(fā)明多肽、其免疫原性片段和其它變異體。例如，可以用任何市售固相技術合成這樣的多肽，所述技術例如Merrifield固相合成方法，其中將氨基酸序貫添加到逐漸加長的氨基酸鏈上。參見Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2146(1963)。多肽的自動化合成儀器是市售的，供應商是例如PerkinElmer/AppliedBioSystemsDivision(FosterCity,CA)，可以按照生產(chǎn)商的說明書進行操作。在某些具體的實施方案中，多肽可以是包含本文所述的多種多肽的融合蛋白，或者是包含至少一個本文所述多肽和無關序列(例如已知腫瘤蛋白)的融合蛋白。融合配偶體可以是例如有助于提供T輔助細胞表位(免疫融合配偶體)、優(yōu)選由人識別的T輔助細胞表位，或者與天然重組蛋白收率相比，可有助于更高收率地表達蛋白質(zhì)(表達增強子)。某些優(yōu)選的融合配偶體同時是免疫原性融合配偶體和表達增強型融合配偶體?？梢赃x擇其它融合配偶體，以增加蛋白質(zhì)溶解度或者使該蛋白質(zhì)能夠靶向所需胞內(nèi)區(qū)室。再一些融合配偶體包含便于蛋白質(zhì)純化的親和標記。通?？刹捎冒ɑ瘜W綴合在內(nèi)的標準技術制備融合蛋白。優(yōu)選以重組蛋白的形式表達融合蛋白，允許在表達系統(tǒng)中比非融合蛋白產(chǎn)生的水平高。簡而言之，編碼多肽組分的DNA序列可以分別裝配，再連接到合適表達載體中。將編碼一種多肽組分的DNA序列的3'端，通過或不通過肽接頭，與編碼第二種多肽組分的DNA序列的5'端連接，使得該序列的讀框同相(inphase)。這允許翻譯成同時保留兩種多肽組分的生物活性的單一融合蛋白?？梢允褂秒慕宇^序列來間隔開第一和第二多肽組分，其間距足以保證各多肽折疊成其二級和三級結(jié)構。使用本領域眾所周知的標準技術將這種肽接頭序列摻入到融合蛋白中?？梢愿鶕?jù)以下因素選擇合適的肽接頭序列：(1)它們能采用柔性延伸構象；(2)它們不能采用會影響第一和第二多肽功能性表位的第二結(jié)構；和(3)缺乏可與多肽功能性表位反應的疏水性或帶電荷殘基。優(yōu)選的肽接頭序列含有Gly、Asn和Ser殘基。其它近中性氨基酸(例如Thr和Ala)也可用于接頭序列?？捎米鹘宇^的氨基酸序列包括以下文獻中公開的序列：Maratea等,Gene40:39-46(1985)；Murphy等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:8258-8262(1986)；美國專利號4,935,233和美國專利號4,751,180。接頭序列的長度通常為1個至約50個氨基酸。當?shù)谝缓偷诙嚯木哂锌捎糜陂g隔開功能性結(jié)構域并能防止空間位阻的非必需N-端氨基酸區(qū)時，則不需要接頭序列。連接的DNA序列與合適的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)元件操作性連接。負責DNA表達的調(diào)節(jié)元件僅位于編碼第一多肽的DNA序列的5'。同樣，結(jié)束翻譯和轉(zhuǎn)錄終止信號所需的終止密碼子僅存在于編碼第二多肽的DNA序列的3'。也提供融合蛋白。這類蛋白質(zhì)包含如本文所述的多肽以及無關的免疫原性蛋白。優(yōu)選的免疫原性蛋白能誘導記憶應答。這類蛋白質(zhì)的實例包括破傷風蛋白、結(jié)核病蛋白和肝炎蛋白(參見例如Stoute等,NewEnglJ.Med.336:86-91(1997))。在優(yōu)選實施方案中，免疫融合配偶體來源于蛋白D，一種革蘭氏陰性菌嗜血流感桿菌B(HaemophilusinfluenzaB)的表面蛋白(WO91/18926)。優(yōu)選蛋白D衍生物包含約最初第3個蛋白(例如N-端的前100-110個氨基酸)，并且蛋白D衍生物可以被脂質(zhì)化。在某些優(yōu)選實施方案中，脂蛋白D融合配偶體的前109個殘基包含在N-端，以提供具有額外外源T細胞表位的多肽并提高在大腸桿菌中的表達水平(因此起到表達增強子的作用)。脂質(zhì)尾確保將抗原優(yōu)化呈遞給抗原呈遞細胞。其它融合配偶體包含來自流感病毒的非結(jié)構蛋白NS1(血凝素)。通常使用N-端81個氨基酸，雖然也可以使用包括T輔助細胞表位在內(nèi)的不同片段。在另一個實施方案中，免疫融合配偶體是稱為LYTA的蛋白質(zhì)或其部分(優(yōu)選C-端部分)。LYTA來自肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)，能合成N-乙?；?L-丙氨酸酰胺酶，稱為酰胺酶LYTA(由LytA基因編碼；Gene43:265-292(1986))。LYTA是一種特異性降解肽聚糖主鏈某些鍵的自溶素。LYTA蛋白C-端結(jié)構域負責針對膽堿或某些膽堿類似物例如DEAE的親和性。該特性已經(jīng)用于開發(fā)大腸桿菌C-LYTA表達質(zhì)粒，用于表達融合蛋白。在氨基端含有C-LYTA片段的雜合蛋白的純化方法已有描述(參見Biotechnology10:795-798(1992))。在一個優(yōu)選的實施方案中，可將LYTA的重復部分摻入到融合蛋白中。在C-端區(qū)自殘基178開始發(fā)現(xiàn)重復部分。特別優(yōu)選的重復部分包括殘基188-305。一般而言，本文所述的多肽(包括融合蛋白)和多核苷酸是分離的?！胺蛛x的”多肽或多核苷酸是從其原有環(huán)境中分離出來的多肽或多核苷酸。例如，當天然存在的蛋白質(zhì)從天然系統(tǒng)中共同存在的某些或所有材料中分離出來時，就稱之為分離的。優(yōu)選這類多肽的純度為至少約90％，更優(yōu)選至少約95％，最優(yōu)選至少約99％。當多核苷酸例如克隆到并非其天然環(huán)境組成部分的載體中時，就稱之為分離的。T細胞另一方面，免疫治療組合物也可以包含對分枝桿菌抗原具有特異性的T細胞。通常用標準方法在體外或離體制備這類細胞。例如，可以使用市售細胞分離系統(tǒng)(例如IsolexTMSystem，得自NexellTherapeutics,Inc.(Irvine,CA)；另見美國專利號5,240,856；美國專利號5,215,926；WO89/06280；WO91/16116和WO92/07243)，從患者的骨髓、外周血或者部分骨髓或外周血中分離出T細胞。或者，T細胞可來自相關或無關的人、非人類哺乳動物的細胞系或培養(yǎng)物。可用本發(fā)明多肽、編碼所述多肽的多核苷酸、和/或表達所述多肽的抗原呈遞細胞(APC)刺激T細胞。在允許產(chǎn)生對多肽具有特異性的T細胞的條件下和足夠時間內(nèi)進行這樣的刺激。優(yōu)選多肽或多核苷酸存在于遞送載體(例如微球體)中，以便產(chǎn)生特異性T細胞。當T細胞特異性增殖、分泌細胞因子或殺傷攜帶本發(fā)明多肽或表達本發(fā)明多肽編碼基因的靶細胞時，就認為這樣的T細胞對本發(fā)明的多肽是特異性的。可以采用各種標準進行的任一種來評價T細胞特異性。例如，在釋放鉻的測定或增殖測定中，與陰性對照相比，在溶解和/或增殖上刺激指數(shù)增加超過兩倍，表明T細胞特異性?？梢园凑绽缫韵挛墨I進行這些測定：Chen等,CancerRes.54:1065-1070(1994)?；蛘?，可以通過各種已知技術進行T細胞增殖的測定。例如，可以通過測定DNA合成的增加速率來檢測T細胞增殖(例如通過用氚化胸苷脈沖標記的T細胞培養(yǎng)物并測定摻入DNA的氚化胸苷的數(shù)量)。與本發(fā)明多肽接觸(100ng/ml-100μg/ml、優(yōu)選200ng/ml-25μg/ml)3-7天，將使T細胞增殖至少增加兩倍。按照標準細胞因子測定進行檢測，如上所述接觸2-3小時將會活化T細胞，其中細胞因子(例如TNF或IFN-γ)釋放水平提高兩倍，表明T細胞活化(參見Coligan等,CurrentProtocolsinImmunology,第1卷(1998))。響應多肽、多核苷酸或表達多肽的APC而活化T的細胞可以是CD4+和/或CD8+。用標準技術可擴增蛋白質(zhì)特異性T細胞。在優(yōu)選的實施方案中，T細胞來自患者、相關供體或無關供體，并且可在刺激和擴增后給予患者。為了治療目的，可以在體外或體內(nèi)大量擴增響應多肽、多核苷酸或APC而增殖的CD4+或CD8+T細胞。可以按照不同方式進行這類T細胞的體外增殖。例如，可使T細胞重新暴露給多肽或該多肽相應免疫原性部分的短肽，添加或不添加T細胞生長因子(例如白介素-2)，和/或合成多肽的刺激細胞?；蛘?，可以通過克隆，大量擴增在蛋白質(zhì)存在下增殖的一種或多種T細胞。細胞克隆方法是本領域眾所周知的，包括有限稀釋。藥物組合物在另外的實施方案中，本發(fā)明涉及本文所公開的一種或多種多核苷酸、多肽、T細胞、抗體和化療組合物的藥學上可接受的溶液的制劑，用于單獨或者與一種或多種其它治療模式聯(lián)合給予細胞或動物。也可理解，如有必要，可將表達本文所公開多肽的核酸區(qū)段(例如RNA或DNA)與其它活性劑聯(lián)合給予，所述活性劑例如其它蛋白質(zhì)或多肽或各種藥理活性劑，包括抗結(jié)核分枝桿菌感染的化療藥。事實上，對于也可包括在內(nèi)的其它成分并未限制，只要其它活性劑在與靶細胞或宿主組織接觸時不會引起明顯不良反應即可。因此，在具體的情況下，可視需要將組合物與各種其它藥物聯(lián)合用藥。可將這類組合物從宿主細胞或其它生物來源中純化出來，或者可以按如本文所述的化學方法合成這類組合物。同樣，這類組合物還可包括取代或衍生RNA或DNA組合物。藥學上可接受的賦形劑和載體溶液的配制是本領域技術人員眾所周知的，用于本文所述的具體組合物按照各種治療方案開發(fā)合適劑量和治療方案，包括例如口服、胃腸外、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)和肌內(nèi)給藥和配制。通常，包含治療有效量的制劑每次給予約2μg至約50μgMtb72f多肽，通常每次給予約5μg至約40μgMtb72f多肽。1.口服給藥在某些應用中，本文所公開的藥物組合物可經(jīng)口服給予動物。同樣，這些組合物可與惰性稀釋劑或可同化的食用載體配制在一起，或者可將它們包封在硬殼或軟殼明膠膠囊中，或者可將它們壓制成片劑，或者可將它們直接摻入食物中。活性化合物還可與賦形劑一起摻入，用于可吸收片劑、口含片劑、糖錠劑、膠囊劑、酏劑、混懸劑、糖漿劑、糯米紙囊劑等形式(Mathiowitz等,1997；Hwang等,1998；美國專利5,641,515；美國專利5,580,579和美國專利5,792,451，所述文獻各自通過引用全部結(jié)合到本文中)。片劑、糖錠劑、丸劑、膠囊劑等也可含有以下成分：粘合劑，例如西黃蓍膠、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑，例如磷酸鈣；崩解劑，例如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、海藻酸等；潤滑劑，例如硬脂酸鎂；和甜味劑，例如可添加蔗糖、乳糖或糖精；或者矯味劑，例如薄荷、冬青油或櫻桃香料。當單位劑型是膠囊劑時，除了上述材料之外，還可含有液體載體?？珊懈鞣N其它材料，作為包衣材料或其它改變單位劑型的物理形式的材料。例如，片劑、丸劑或膠囊劑可以包蟲膠衣、糖衣或同時用這兩種材料來包衣。酏劑糖漿可含有活性化合物、作為甜味劑的蔗糖、作為防腐劑的對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯、著色劑和矯味劑，例如櫻桃或橘子香料。當然制備任何單位劑量所用的任何材料都應該是藥物純的，所使用的量基本無毒。另外，活性化合物可摻入緩釋制品和制劑中。通常，這些制劑常含有2μg～50μgMtb72f多肽。當然，可以按照在任何給定單位劑量的所述化合物中都可得到合適劑量的方式，制備各治療用組合物中活性化合物含量。諸如溶解度、生物利用度、生物半壽期、給藥途徑、產(chǎn)品貨架期及其它藥理學考慮等因素都是制備藥物制劑領域技術人員將會考慮的，同樣，不同劑量和治療方案也是想要的。對于口服給藥，本發(fā)明的組合物還可與一種或多種賦形劑配制成以下形式：漱口劑、潔齒劑、口含片劑、口腔噴霧劑或舌下口服制劑。例如，可將所需量的活性成分摻入到合適溶劑(例如硼酸鈉溶液(Dobell溶液))中，制備漱口劑。或者，可將活性成分摻入到口服溶液劑(例如含硼酸鈉、甘油和碳酸氫鉀的溶液劑)或分散到潔齒劑中，或者以治療有效量添加到含有水、粘合劑、摩擦劑、矯味劑、發(fā)泡劑和保濕劑的組合物中?；蛘?，將組合物制成可放在舌下或在口腔內(nèi)溶解的其它形式的片劑或溶液劑形式。2.注射給藥在某些情況下，最好經(jīng)胃腸外、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、或甚至腹膜內(nèi)給予本文所公開的藥物組合物，參見美國專利5,543,158；美國專利5,641,515和美國專利5,399,363(所述各文獻通過引用全部結(jié)合到本文內(nèi))。可用適當混有表面活性劑(例如羥丙基纖維素)的水制備呈游離堿或藥理學上可接受的鹽形式的活性化合物溶液劑。也可用甘油、液態(tài)聚乙二醇及其混合物和油中制備分散劑。在常規(guī)貯藏和使用的情況下，這些制劑含有防腐劑，防止微生物生長。適于注射用的藥物形式包括無菌水溶液劑或分散劑以及臨用前配制成無菌注射溶液劑或分散劑的無菌粉針劑(美國專利5,466,468，該文獻通過引用全部結(jié)合到本文中)。在所有情況下，各形式都必須無菌而且必須是便于注射的流體。在生產(chǎn)和貯藏條件下必須穩(wěn)定，而且必須防止細菌和真菌等微生物作用的污染。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)、其合適混合物、和/或植物油。通過例如使用涂層(例如卵磷脂)，通過在分散劑的情況下保持所需粒徑以及通過使用表面活性劑，可維持適當流動性。通過各種抗細菌藥和抗真菌藥可以預防微生物作用，例如對羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在許多情況下，優(yōu)選包含等滲劑，例如糖或氯化鈉。通過在組合物中使用延遲吸收劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)可延遲吸收注射用組合物。對于例如胃腸外給予水溶液劑，必要時溶液劑可含適當緩沖劑，液體稀釋劑先用足夠鹽水或葡萄糖賦予等滲性。這些特定水溶液劑尤其合適靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)給予。就此而論，根據(jù)本說明書，可使用的無菌含水介質(zhì)是本領域技術人員已知的。例如，將一個劑量可溶于1ml等滲NaCl溶液中，加入到1000ml皮下灌注流體中或者注射在所需輸注部位(參見例如Remington'sPharmaceuticalSciences,第15版,第1035-1038和1570-1580頁)。根據(jù)所治療患者的情況，需要對劑量作出某些改動。給藥人員將會在任何情況下確定給予每個患者的合適劑量。此外，對于人用而言，制劑應當滿足FDA生物標準辦公室的無菌、熱源和基本安全性和純度標準。按照需要，將所需量的活性化合物摻入具有上述各種其它成分的合適溶劑中，可制備無菌注射用溶液劑，然后過濾除菌。一般通過將各種滅過菌的活性成分摻入到含有基礎分散介質(zhì)和所需上述其它成分的無菌溶媒中，制備分散劑。在無菌粉針劑用于制備無菌注射用溶液劑的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術，自先前無菌過濾溶液得到活性成分粉末以及任何額外所需成分。本文所公開的組合物可配制成中性或鹽形式。藥學上可接受的鹽，包括酸加成鹽(與蛋白質(zhì)的游離氨基生成)和與無機酸(例如鹽酸或磷酸)生成的鹽，或者與有機酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)生成的鹽。與游離羧基生成的鹽也可來自無機堿(例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵)和有機堿(例如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因等)。一旦配制好，以劑量制劑相容的方式和以治療有效量給予溶液劑。容易以不同劑型給予制劑，所述劑型例如注射用溶液劑、藥物釋放膠囊劑等。本文所用的“載體”包括任何及所有溶劑、分散介質(zhì)、溶媒、包衣劑、稀釋劑、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑、緩沖劑、載體溶液劑、懸浮劑、膠體等。這些介質(zhì)和試劑在藥物活性物質(zhì)中的應用是本領域眾所周知的。除非任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與活性成分不相容，否則考慮它們在治療性組合物中的應用。補充活性成分也可摻入組合物中。術語“藥學上可接受的”是指當分子實體和組合物給予人體后不會產(chǎn)生變態(tài)反應或類似不良反應。本領域充分了解含蛋白質(zhì)活性成分的含水組合物的制備。通常這類組合物制備成注射用液體溶液劑或混懸劑；也可制備在注射前制成溶液劑或混懸劑的合適固體形式。制劑也可以乳化。3.鼻腔和口腔給藥在某些實施方案中，可通過鼻內(nèi)噴霧、口腔噴霧、吸入和/或其它氣溶膠給藥溶媒而給予藥物組合物。將基因、核酸和肽組合物直接給予肺部的方法(例如通過鼻腔和口腔氣溶膠噴霧)已有描述，例如參見美國專利5,756,353和美國專利5,804,212(所述各文獻通過引用全部結(jié)合到本文中)。同樣，用鼻內(nèi)微粒樹脂(Takenaga等,1998)和溶血磷脂酰-甘油化合物(美國專利5,725,871，所述文獻通過引用全部結(jié)合到本文中)給予藥物，也是藥學領域眾所周知的。同樣，以聚四氟乙烯支持基質(zhì)形式經(jīng)粘膜給藥，可參見美國專利5,780,045(所述文獻通過引用全部結(jié)合到本文中)。4.脂質(zhì)體、納米囊和微粒介導的遞藥在某些實施方案中，本發(fā)明人考慮到使用脂質(zhì)體、納米囊、微粒、微球體、脂質(zhì)粒、囊泡等，用于將本發(fā)明組合物導入合適宿主細胞中。具體地講，可將本發(fā)明組合物包入脂質(zhì)粒、脂質(zhì)體、囊泡、納米球或納米粒等中進行遞送。優(yōu)選這樣的制劑用于引入藥學上可接受的本文所公開的核酸或構建體制劑。脂質(zhì)體的形成和使用是本領域技術人員公知的(參見例如Couvreur等,1977；Couvreur,1988；Lasic,1998；所述文獻描述了在針對胞內(nèi)細菌感染和疾病的靶向抗生素治療中使用脂質(zhì)體和納米囊)。近來，開發(fā)出具有改善的血清穩(wěn)定性和循環(huán)半衰期的脂質(zhì)體(Gabizon和Papahadjopoulos,1988；Allen和Choun,1987；美國專利5,741,516，所述文獻通過引用全部結(jié)合到本文中)。此外，有關脂質(zhì)體和脂質(zhì)體樣制劑作為潛在藥物載體的各種方法已有綜述(Takakura,1998；Chandran等,1997；Margalit,1995；美國專利5,567,434；美國專利5,552,157；美國專利5,565,213；美國專利5,738,868和美國專利5,795,587，所述各文獻通過引用全部結(jié)合到本文中)。脂質(zhì)體已成功用于通常難以通過其它方法進行轉(zhuǎn)染的大量細胞類型，包括T細胞懸液、原代肝細胞培養(yǎng)物和PC12細胞(Renneisen等,1990；Muller等,1990)。另外，脂質(zhì)體對DNA長度不限，而這通常在基于病毒的遞送系統(tǒng)中會受到限制。脂質(zhì)體已有效用于將基因、藥物(Heath和Martin,1986；Heath等,1986；Balazsovits等,1989；Fresta和Puglisi,1996)、放射性治療藥(Pikul等,1987)、酶(Imaizumi等,1990a；Imaizumi等,1990b)、病毒(Faller和Baltimore,1984)、轉(zhuǎn)錄因子和別構效應物(Nicolau和Gersonde,1979)導入各種培養(yǎng)細胞系和動物體內(nèi)。另外，已經(jīng)完成了檢查脂質(zhì)體介導藥物遞送的若干成功的臨床試驗(Lopez-Berestein等,1985a；1985b；Coune,1988；Sculier等,1988)。此外，一些研究表明，使用脂質(zhì)體與系統(tǒng)給藥后的自身免疫應答、毒性或生殖腺定位無關(Mori和Fukatsu,1992)。脂質(zhì)體由磷脂制成，磷脂分散在含水介質(zhì)中并自發(fā)形成多層同心雙層囊泡(亦稱多層囊泡(MLV)。MLV的直徑通常為25nm至4μm。超聲處理MLV導致形成直徑范圍為的小單層囊泡(SUV)，其核心含有水溶液。脂質(zhì)體與細胞膜有類似之處，在本發(fā)明中可考慮用作肽組合物的載體。它們可廣泛應用，因為可包被水溶性和脂溶性物質(zhì)，即分別在含水空間和在雙層本身之內(nèi)。通過選擇性修飾脂質(zhì)體制劑，載藥脂質(zhì)體可能用于活性藥物的定點特異性遞送。除了Couvreur等(1977；1988)的描述之外，以下信息可用于制備脂質(zhì)體制劑。當分散在水中，磷脂可形成并非脂質(zhì)體的多種結(jié)構，這取決于脂質(zhì)和水的摩爾比。在低比率時，脂質(zhì)體是優(yōu)選結(jié)構。脂質(zhì)體的物理特性取決于pH、離子強度和二價陽離子的存在。脂質(zhì)體可表現(xiàn)出對離子和極性物質(zhì)的低通透性，但是在提高溫度時經(jīng)歷相變，這明顯改變了它們的通透性。相變包括從緊密包裝的有序結(jié)構(稱為凝膠態(tài))轉(zhuǎn)變?yōu)樗缮b的無序結(jié)構(稱為流態(tài))。這在特征性相變溫度下發(fā)生，導致對離子、糖和藥物的通透性增加。除了溫度之外，接觸蛋白質(zhì)也可改變脂質(zhì)體通透性。某些可溶性蛋白質(zhì)例如細胞色素c與雙層結(jié)合，使之變形并穿透它，因而引起通透性變化。膽固醇抑制這樣的蛋白質(zhì)穿透，顯然是因為更緊密地包裝磷脂。考慮到形成遞送抗生素和抑制劑的最有用脂質(zhì)體將會含有膽固醇。不同脂質(zhì)體類型包封溶質(zhì)的能力不同。例如，MLV對包封溶質(zhì)而言是中等有效，但SUV非常低效。SUV的優(yōu)點是大小分布的同質(zhì)性和再現(xiàn)性，然而，大單層囊泡(LUV)提供了大小與包封效率間的折衷關系。通過醚蒸發(fā)制備它們，它們在溶質(zhì)包封方面比MLV的效率高3-4倍。除了脂質(zhì)體的特征之外，包封化合物的重要決定因素是所述化合物本身的理化性質(zhì)。在含水空間包封極性化合物，而非極性化合物與囊泡脂質(zhì)雙層結(jié)合。極性化合物通過滲透而釋放或當雙層破裂時釋放，但非極性化合物仍然與雙層結(jié)合，除非因溫度或接觸脂蛋白而斷裂。這兩類在相變溫度時都表現(xiàn)出最大流出率。脂質(zhì)體通過四種不同機制影響細胞：通過網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞吞噬細胞(例如巨噬細胞和嗜中性粒細胞)的胞吞作用；通過非特異性微弱疏水力或靜電力，或者通過與細胞表面組分的特異性相互作用，而吸附到細胞表面；通過將脂質(zhì)體脂質(zhì)雙層插入到質(zhì)膜中，與細胞質(zhì)膜融合，同時將脂質(zhì)體內(nèi)容物釋放到細胞質(zhì)內(nèi)；和通過將脂質(zhì)體脂質(zhì)轉(zhuǎn)移給細胞膜或亞細胞膜(或反之亦然)，而與脂質(zhì)體內(nèi)容物無關。通常難以確定是何種機制起作用，可能不止一種機制同時起作用。靜脈內(nèi)注射脂質(zhì)體的命運和分布取決于其物理性質(zhì)，例如大小、流動性和表面電荷。它們可在組織中保持幾小時或幾日，這取決于其組成和血液半衰期(范圍為幾分鐘至幾小時)。大脂質(zhì)體例如MLV和LUV由網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬細胞快速接納，但循環(huán)系統(tǒng)生理學在大多數(shù)部位都限制這類大脂質(zhì)體的存在。它們僅可在毛細管內(nèi)皮大開口或孔隙(例如肝或脾血竇)的位置上存在。因此，這些器官是主要攝取部位。另一方面，SUV表現(xiàn)出更廣泛的組織分布，但在肝和脾中仍然是高分布。一般而言，這樣的體內(nèi)行為限制脂質(zhì)體僅僅潛在靶向其大尺寸容易接近的這些器官和組織。它們包括血、肝、脾、骨髓和淋巴器官。本發(fā)明通常不限制靶向。然而，最好應該是特異性靶向，可采用達到這一目的的方法?？贵w可用于與脂質(zhì)體表面結(jié)合并將抗體及其藥物內(nèi)容物導向位于特定細胞類型表面的特異性抗原性受體。碳水化合物決定簇(在細胞-細胞識別、相互作用和粘附方面起作用的糖蛋白或糖脂細胞表面組分)也可用作識別位點，因為它們具有將脂質(zhì)體導向特定細胞類型的潛力。通常，考慮到可以采用靜脈內(nèi)注射脂質(zhì)體制劑，但是也可考慮其它給藥途徑?；蛘?，本發(fā)明提供藥學上可接受的本發(fā)明組合物的納米囊制劑。納米囊通常以穩(wěn)定和可重現(xiàn)的方式包封化合物(Henry-Michelland等,1987；Quintanar-Guerrero等,1998；Douglas等,1987)。為了避免胞內(nèi)聚合物過載的副作用，應當用體內(nèi)可降解聚合物設計這類超細顆粒(大小約0.1μm)。滿足這些要求的生物可降解聚烷基-氰基丙烯酸酯納米?？煽紤]用于本發(fā)明。這類顆粒應當易于制備(參見Couvreur等,1980；1988；zurMuhlen等,1998；Zambaux等1998；Pinto-Alphandry等,1995和美國專利5,145,684，所述文獻通過引用全部結(jié)合到本文中)。疫苗在本發(fā)明某些優(yōu)選的實施方案中提供疫苗。疫苗通常包含一種或多種藥物組合物(例如上述組合物)以及免疫刺激劑。免疫刺激劑可以是提高或加強針對外源抗原的免疫應答(抗體和/或細胞-介導的)的任何物質(zhì)。免疫刺激劑的實例包括佐劑、生物可降解微球體(例如丙交酯乙交酯共聚物(polylacticgalactide))和脂質(zhì)體(其中摻入所述化合物；參見例如Fullerton,美國專利號4,235,877)。疫苗制劑的一般性描述參見例如Powell和Newman主編,VaccineDesign(thesubunitandadjuvantapproach)(1995)。本發(fā)明范圍內(nèi)的藥物組合物和疫苗也可含有生物活性或無活性的其它化合物。例如，該組合物或疫苗中可含有其它腫瘤抗原的一種或多種免疫原性部分，無論是摻入融合多肽中還是作為分離的化合物。說明性疫苗可含有編碼一種或多種上述多肽的DNA，使得在原位產(chǎn)生多肽。如上所述，DNA可存在于本領域普通技術人員已知的多種遞送系統(tǒng)的任何一種中，包括核酸表達系統(tǒng)、細菌表達系統(tǒng)和病毒表達系統(tǒng)。各種基因遞送技術是本領域眾所周知的，例如參見Rolland,Crit.Rev.Therap.DrugCarrierSystems15:143-198(1998)以及所引用的參考文獻。合適的核酸表達系統(tǒng)含有在患者中表達所需的DNA序列(例如合適的啟動子和終止信號)。細菌遞送系統(tǒng)涉及給予細菌宿主細胞(例如分枝桿菌屬、芽孢桿菌屬或乳桿菌屬菌株，包括卡介苗或乳酸乳球菌)，所述細胞在其細胞表面表達多肽免疫原性部分或分泌這樣的表位(參見例如Ferreira等,AnAcadBrasCienc(2005)77:113-124；和Raha等,ApplMicrobiolBiotechnol(2005)PubMedID15635459)。在一個優(yōu)選的實施方案中，使用病毒表達系統(tǒng)(例如痘苗病毒或其它痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒)可引入DNA，該方法包括使用非致病性(缺陷型)、可復制型病毒。合適系統(tǒng)已經(jīng)公開，參見例如Fisher-Hoch等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:317-321(1989)；Flexner等,Ann.NY.Acad.Sci.569:86-103(1989)；Flexner等,Vaccine8:17-21(1990)；美國專利號4,603,112、4,769,330和5,017,487；WO89/01973；美國專利號4,777,127；GB2,200,651；EP0,345,242；WO91/02805；Berkner,Biotechniques6:616-627(1988)；Rosenfeld等,Science252:431-434(1991)；Kolls等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:215-219(1994)；Kass-Eisler等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:11498-11502(1993)；Guzman等,Circulation88:2838-2848(1993)；和Guzman等,Cir.Res.73:1202-1207(1993)。將DNA摻入表達系統(tǒng)的技術是本領域普通技術人員眾所周知的。DNA也可以是“裸”的，參見例如Ulmer等,Science259:1745-1749(1993)，有關綜述可參見Cohen,Science259:1691-1692(1993)。將裸DNA包被在生物可降解珠上，可增加對裸DNA的攝取，將其有效轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)。顯而易見，疫苗可包含多核苷酸和多肽組分。這類疫苗可加強免疫應答。顯而易見，疫苗可含有本文所述多核苷酸和多肽的藥學上可接受的鹽。可自藥學上可接受的無毒堿制備這些鹽，所述堿包括有機堿(例如伯、仲、叔胺的鹽，以及堿性氨基酸的鹽)和無機堿(例如鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽、鈣鹽和鎂鹽)。盡管本領域普通技術人員已知的任何合適載體都可用于本發(fā)明的疫苗組合物，但是載體類型因給藥模式而異?？蓪⒈景l(fā)明組合物配制成用于任何合適給藥方式，包括例如局部、口服、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、顱內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下或肌內(nèi)給藥。對于胃腸外給藥例如皮下注射，載體優(yōu)選包括水、鹽水、醇、脂肪、蠟或緩沖劑。對于口服給藥，可以使用任何上述載體或固體載體，例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖維素、葡萄糖、蔗糖和碳酸鎂。生物可降解微球體(例如丙交酯和乙交酯的共聚物(polylactatepolyglycolate))也可用作載體，用于本發(fā)明的藥物組合物。合適的生物可降解微球體已經(jīng)公開，參見例如美國專利號4,897,268、5,075,109、5,928,647、5,811,128、5,820,883、5,853,763、5,814,344和5,942,252。也可以使用一種包含微粒-蛋白質(zhì)復合物的載體，參見美國專利號5,928,647，該載體能誘導宿主的I類-限制性細胞毒T淋巴細胞反應。這類組合物也可包含緩沖液(例如中性緩沖鹽水或磷酸緩沖鹽溶液)，碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)，甘露醇，蛋白質(zhì)，多肽或氨基酸(例如甘氨酸)，抗氧化劑，抑菌劑，螯合劑(例如EDTA或谷胱甘肽)，佐劑(例如氫氧化鋁)，賦予制劑與受體血液等滲、低滲或弱高滲的溶質(zhì)，懸浮劑，增稠劑和/或防腐劑?；蛘撸景l(fā)明的組合物可配制成凍干物。也可以使用眾所周知的技術，將化合物包裹在脂質(zhì)體中。各種免疫刺激劑的任一種都可用于本發(fā)明疫苗中。例如，可包含佐劑。大多數(shù)佐劑含有用于保護抗原不被快速代謝的物質(zhì)(例如氫氧化鋁或礦物油)以及免疫應答刺激劑(例如脂質(zhì)A、百日咳博德特氏菌(Bortadellapertussis)蛋白或分枝桿菌蛋白或分枝桿菌衍生蛋白)。例如，可以使用脫脂質(zhì)化、脫糖脂化母牛分枝桿菌(“pVac”)。合適佐劑是市售的，例如弗氏不完全佐劑和弗氏完全佐劑(DifcoLaboratories,Detroit,MI)；MerckAdjuvant65(MerckandCompany,Inc.,Rahway,NJ)；AS01B、AS02A、AS15、AS-2及其衍生物(GlaxoSmithKline,Philadelphia,PA)；CWS、TDM、Leif、鋁鹽例如氫氧化鋁凝膠(alum)或磷酸鋁；鈣鹽、鐵鹽或鋅鹽；?；野彼岬牟蝗苄詰腋货；牵魂栯x子或陰離子衍生的多糖；聚磷腈；生物可降解微球體；單磷酰脂質(zhì)A和quilA。細胞因子(例如GM-CSF或白介素-2、白介素-7或白介素-12)也都可用作佐劑。在本文所述的疫苗中，優(yōu)選設計佐劑組合物，以誘導以Th1型為主的免疫應答。高水平Th1型細胞因子(例如IFN-γ、TNFα、IL-2和IL-12)傾向于促進誘導針對所給予抗原的細胞介導免疫應答。相比之下，高水平Th2型細胞因子(例如IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)傾向于促進誘導體液免疫應答。使用本文所述的疫苗之后，患者會產(chǎn)生包括Th1型和Th2型反應在內(nèi)的免疫應答。在反應主要為Th1型的一個優(yōu)選實施方案中，Th1型細胞因子的水平將會增加到超過Th2型細胞因子的水平。使用標準測定，可以容易地評價這些細胞因子的水平。有關這些細胞因子家族的綜述可參見Janeway等,Immunobiology,第5版,2001。用于誘導占優(yōu)勢Th1型反應的優(yōu)選佐劑包括例如以下組合：單磷酰脂質(zhì)A(優(yōu)選3-O-脫?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A(3D-MPL))，任選鋁鹽(參見例如Ribi等,1986,ImmunologyandImmunopharmacologyofBacterialEndotoxins,PlenumPubl.Corp.,NY,第407-419頁；GB2122204B；GB2220211；和US4,912,094)。3D-MPL的優(yōu)選形式是含有直徑小于0.2mm的小粒徑乳劑形式，其制備方法公開于WO94/21292。含有單磷酰脂質(zhì)A和表面活性劑的含水制劑可參見WO98/43670。示例性的優(yōu)選佐劑包括AS01B(MPL和QS21的脂質(zhì)體制劑)、3D-MPL和QS21的脂質(zhì)體制劑、AS02A(MPL和QS21和水包油乳劑)、3D-MPL和QS21和水包油乳劑，以及AS15(得自GlaxoSmithKline)。MPL佐劑得自GlaxoSmithKline,Seattle,WA(參見美國專利號4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094)。含有CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸未甲基化)也誘導占優(yōu)勢的Th1反應。CpG是DNA中存在的胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸基序的縮寫。這樣的寡核苷酸是眾所周知的，參見例如WO96/02555、WO99/33488和美國專利號6,008,200和5,856,462。免疫調(diào)節(jié)DNA序列也參見例如Sato等,Science273:352(1996)。當CpG配制在疫苗內(nèi)，CpG通常以游離溶液形式與游離抗原一起給予(WO96/02555；McCluskie和Davis,出處同上)或者與抗原共價綴合(WO98/16247)，或者與載體例如氫氧化鋁配制在一起((肝炎表面抗原)Davis等，出處同上；Brazolot-Millan等,Proc.Natl.Acad.Sci,USA,1998,95(26),15553-8)。CpG是本領域已知可作為佐劑，既可系統(tǒng)給予也可經(jīng)粘膜途徑給予(WO96/02555、EP468520、Davis等,J.Immunol,1998,160(2):870-876；McCluskie和Davis,J.Immunol.,1998,161(9):4463-6)。另一優(yōu)選佐劑是皂苷或皂苷模擬物或衍生物，優(yōu)選QS21(AquilaBiopharmaceuticalsInc.,Framingham,MA)，其可單獨使用或者與其它佐劑聯(lián)用。例如，一個增強的系統(tǒng)包括單磷酰脂質(zhì)A和皂苷衍生物的組合，例如QS21和3D-MPL的組合(參見WO94/00153)或QS21被膽固醇猝滅的更低反應原性組合物(參見WO96/33739)。其它優(yōu)選制劑包括水包油乳劑和生育酚。包含QS21、3D-MPL和生育酚的水包油乳劑的特別有效的佐劑制劑參見WO95/17210。另外用于本發(fā)明的皂苷佐劑包括QS7(參見WO96/33739和WO96/11711)和QS17(參見美國專利號5,057,540和EP0362279B1)。其它優(yōu)選佐劑包括MontanideISA720(Seppic,France)、SAF(Chiron,California,UnitedStates)、ISCOMS(CSL)、MF-59(Chiron)、SBAS系列佐劑(例如SBAS-2、AS2’、AS2"、SBAS-4或SBAS6，得自GlaxoSmithKline,Rixensart,Belgium)、Detox(Corixa,Hamilton,MT)、RC-529(Corixa,Hamilton,MT)和其它氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸(AGP)，例如參見待審的美國專利申請順序號08/853,826和09/074,720，所述文獻的全部公開內(nèi)容都通過引用全部結(jié)合到本文中。更多佐劑實例包括合成MPL和基于志賀毒素B亞基的佐劑(參見WO2005/112991)。用眾所周知的方法可制備本文所述的任何疫苗，產(chǎn)生抗原、免疫應答增強子和合適載體或賦形劑的組合。可作為緩釋制劑的組成部分給予本文所述的組合物(即在給藥后使化合物緩慢釋放的膠囊劑、海綿劑或凝膠劑(例如由多糖組成)等制劑)。這樣的制劑通常用眾所周知的技術來制備(參見例如Coombes等,Vaccine14:1429-1438(1996))并通過例如口服、直腸或皮下植入而給予，或通過在所需靶部位植入而給予。緩釋制劑可含有分散在載體基質(zhì)中和/或包含在周圍包被速率控制膜的貯庫內(nèi)的多肽、多核苷酸或抗體。用于這類制劑的載體是生物相容的，也可以是生物可降解的；優(yōu)選的制劑提供相對恒定的活性成分釋放水平。這類載體包括丙交酯-乙交酯共聚物(poly(lactide-co-glycolide))、聚丙烯酸酯、乳膠、淀粉、纖維素、葡聚糖等的微粒。其它延遲釋放載體包括超分子生物載體，其包括非脂質(zhì)親水核心(例如交聯(lián)多糖或寡糖)，并任選包括兩親化合物的外層，例如磷脂(參見例如美國專利號5,151,254和PCT申請WO94/20078、WO94/23701和WO96/06638)。緩釋制劑中活性化合物含量取決于植入部位，釋放速率和預期持續(xù)時間以及待治療或預防的疾病的特性。任何不同遞送載體都可用于藥物組合物和疫苗，以便產(chǎn)生靶向腫瘤細胞的抗原特異性免疫應答。遞送載體包括抗原呈遞細胞(APC)，例如樹突細胞、巨噬細胞、B細胞、單核細胞和經(jīng)改造成為有效APC的其它細胞。這些細胞可以、但并非必需經(jīng)過遺傳修飾，以增加呈遞抗原的容量，改善T細胞反應的激活和/或維持，本身具有抗腫瘤效應和/或與受體是免疫學上相容的(即匹配的HLA單倍體)。APC通?？蓮娜魏尾煌锪黧w和器官(包括腫瘤和腫瘤周圍組織)中分離得到，可以是自體細胞、同種異體細胞、同源細胞或異種細胞。本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案使用樹突細胞或其祖先作為抗原呈遞細胞。樹突細胞是高度有效的APC(Banchereau和Steinman,Nature392:245-251(1998))，已知在誘導預防性或治療性抗腫瘤免疫中是有效的生理佐劑(參見Timmerman和Levy,Ann.Rev.Med.50:507-529(1999))。一般而言，可按照樹突細胞的典型形狀(在原位星形，在體外可見明顯胞質(zhì)突(樹突))，其高效攝取、加工和呈遞抗原的能力以及它們激活天然T細胞反應的能力，來鑒定樹突細胞。當然，樹突細胞可經(jīng)改造以表達在體內(nèi)或離體的樹突細胞并非常見的特異性細胞表面受體或配體，而且這樣修飾的樹突細胞包括在本發(fā)明之內(nèi)。作為樹突細胞的替代物，裝載分泌型囊泡抗原的樹突細胞(稱為外來體)可用于疫苗(參見Zitvogel等,NatureMed.4:594-600(1998))。樹突細胞及其祖先可得自外周血、骨髓、腫瘤浸潤細胞、腫瘤周圍組織浸潤細胞、淋巴結(jié)、脾、皮膚、臍帶血或任何其它合適組織或流體。例如，可通過將GM-CSF、IL-4、IL-13和/或TNFα等細胞因子的組合添加到從外周血中收獲的單核細胞培養(yǎng)物中，可使樹突細胞離體分化?；蛘撸ㄟ^將GM-CSF、IL-3、TNFα、CD40配體、LPS、flt3配體和/或誘導樹突細胞分化、成熟和增殖的其它化合物的組合添加到培養(yǎng)基中，可使從外周血、臍帶血或骨髓中收獲的CD34陽性細胞分化成樹突細胞。樹突細胞可方便地分為“未成熟”和“成熟”細胞，這允許用簡單方法區(qū)分兩種良好表征的表型。然而，這樣的命名不應限制在排除所有可能的分化中間時相。未成熟樹突細胞的特征是對抗原攝取和加工具有高能力的APC，這與Fcγ受體和甘露糖受體的高度表達相關。成熟表型的典型特征是較少表達這些標記，但高度表達負責T細胞激活的細胞表面分子，例如I類和II類MHC、粘附分子(例如CD54和CD11)和共刺激分子(例如CD40、CD80、CD86和4-1BB)。通常用編碼蛋白質(zhì)(或其部分或其它變異體)的多核苷酸轉(zhuǎn)染APC，使得多肽或其免疫原性部分在細胞表面上表達。這類轉(zhuǎn)染可離體發(fā)生，包含這類轉(zhuǎn)染細胞的組合物或疫苗可用于本文所述的治療性目的?；蛘?，可將靶向樹突細胞或其它抗原呈遞細胞的基因遞送載體給予患者，結(jié)果在體內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)染。通?？梢允褂帽绢I域已知的任何方法，進行樹突細胞的體內(nèi)和離體轉(zhuǎn)染，所述方法例如參見WO97/24447或基因槍方法，參見Mahvi等,ImmunologyandCellBiology75:456-460(1997)。將樹突細胞或祖先細胞與多肽、DNA(裸的或在質(zhì)粒載體內(nèi))或RNA一起孵育；或者與表達抗原的重組細菌或病毒(例如痘苗病毒、禽痘病毒、腺病毒或慢病毒載體)一起孵育，可給樹突細胞加載抗原。加載之前，將多肽與提供T輔助細胞的免疫配偶體(例如載體分子)共價綴合?；蛘?，可用未綴合的免疫配偶體，單獨、或在多肽存在下脈沖刺激樹突細胞。疫苗和藥物組合物可以單位劑量或多劑量容器(例如密封安瓿或小瓶)中存在。這樣的容器優(yōu)選是氣密性的，以保證制劑的無菌性，直至使用。一般而言，制劑可以混懸劑、溶液劑或乳劑的油或含水溶媒形式貯存。或者，疫苗或藥物組合物可貯存在凍干條件下，臨用前僅需要加入無菌液體載體即可。本說明書引用的所有出版物和專利申請都結(jié)合到本文中，其程度與每篇出版物和專利申請具體而單獨指明通過引用全部結(jié)合到本文中一樣。盡管為了清楚理解的目的，通過說明和實例方式具體描述了上述發(fā)明，但是本領域普通技術人員顯而易見的是，根據(jù)本發(fā)明的描述，可對其作出某些改動和修飾而不偏離所附權利要求書的精神和范圍。實施例僅以說明的方式而非限制性方式提供以下實施例。本領域技術人員容易理解，各種非關鍵性參數(shù)都可以改動或修改并得到基本類似的結(jié)果。實施例1：Mtb72f(無His標記)(SEOIDNO:6)的制備Mtb72f表達載體的構建Mtb72f是由2種結(jié)核分枝桿菌蛋白Mtb32和Mtb39構成的融合蛋白。將Mtb39與Mtb32的N端和C端部分融合而構建如下的Mtb72f：Mtb32C-末端-Mtb39-Mtb32N-末端。具體地講，通過將編碼～14kDaMtb32的C-端片段的可讀框(ORF)(殘基192-323；132個氨基酸)與Mtb39全長ORF串聯(lián)，在C-端再串聯(lián)～20kDaMtb32N-端序列(殘基1-195)，產(chǎn)生Mtb72f蛋白。使用含有獨特限制位點(EcoRI和EcoRV)且在C-端缺乏終止密碼子(就Mtb32-C和Mtb39而言)的序列特異性寡核苷酸，用于對來自結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株的基因組DNA進行聚合酶鏈式反應(PCR)，可完成以上串聯(lián)步驟。方法細節(jié)如下：首先，使用以下寡核苷酸，經(jīng)PCR克隆編碼Mtb32C端部分的DNA(Mtb32C)：5'(5'-CAA-TTA-CAT-ATG-CAT-CAC-CAT-CAC-CAT-CAC-ACG-GCC-GCG-TCC-GAT-AAC-TTC-3')和3'(5'-CTA-ATC-GAA-TCC-GGC-CGG-GGG-TCC-CTC-GGC-CAA-3')。5'寡核苷酸含有包含ATG起始密碼子的NdeI限制位點(下劃線)。3'寡核苷酸含有EcoRI限制位點(下劃線)。這些寡核苷酸用于擴增Mtb32C(Mtb32的396個核苷酸部分)，將所得產(chǎn)物亞克隆到表達載體的Ndel和EcoRI位點。隨后用EcoRI和EcoRV消化，使Mtb32C質(zhì)粒變?yōu)榫€狀。對于Mtb39，以下寡核苷酸用于PCR擴增和克隆：5'-(5'-CTA-ATC-GAA-TTC-ATG-GTG-GAT-TTC-GGG-GCG-TTA-3')和3'(5'-CTA-ATC-GAT-ATC-GCC-GGC-TGC-CGG-AGA-ATG-CGG-3')。5'寡核苷酸含有EcoRI限制位點(下劃線)，而3'寡核苷酸含有EcoRV限制位點(下劃線)。擴增Mtb39全長編碼序列，消化，然后亞克隆到Mtb32c下游讀框中，使用來自第一步的預消化質(zhì)粒。Mtb32N-端片段的5'和3'寡核苷酸設計如下：5'-(5'-CTA-ATC-GAT-ATC-GCC-CCG-CCG-GCC-TTG-TCG-CAG-GAC-3')和3'-(5'-CTA-ATC-GAT-ATC-CTA-GGA-CGC-GGC-CGT-GTT-CAT-AC-3')。這兩組寡核苷酸都含EcoRV限制位點(下劃線)，而3'寡核苷酸也包括終止密碼子(斜體)。設計寡核苷酸，以擴增編碼該蛋白質(zhì)的預測N-端結(jié)構域的Mtb32的585bp部分。將所得PCR產(chǎn)物亞克隆到Mtb32c-Mtb39融合質(zhì)粒中。然后通過DNA測序證實插入片段的合適方向，并證實沒有突變。對于用于制備母細胞庫(MasterCellBank)和制備工作細胞庫(WorkingCellBank)的最終構建體，經(jīng)PCR除去6xHis親和標記，將Mtb72f的可讀框(ORF)亞克隆到pPDM(pET衍生的表達載體)中。ORF編碼約72kDa的多蛋白(Mtb72f)，其結(jié)構域按線性順序排列：Mtb32C-Mtb39-Mtb32N。再將該DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌HMS174pLysS菌株，用于試驗、制備細胞庫和制備。Mtb72f批量藥物的生產(chǎn)產(chǎn)生Mtb72f的制備方法概述如下：-發(fā)酵，然后離心收獲細胞，細胞破碎(微流化儀(microfluidizer))和離心，得到包含體沉淀；-純化包含體沉淀，即通過8M尿素提取，接著用QSepharoseFastFlow(QFF)色譜、陶瓷羥基磷灰石(CHT)色譜、滲濾和無菌過濾，得到純化的批量藥物。發(fā)酵在10L工作體積中進行發(fā)酵。向發(fā)酵罐中接種37℃培養(yǎng)過夜的工作種子細胞的300ml搖瓶培養(yǎng)物。接種和發(fā)酵都用半確定成分培養(yǎng)基，用植物來源的甘油作為主要碳源。培養(yǎng)基組成見下表。所有培養(yǎng)基成分都經(jīng)121℃加熱滅菌20分鐘或通過過濾除菌。發(fā)酵期間，發(fā)酵罐的溫度保持在37℃。按照5標準升/分鐘(SLPM)的速率通入空氣。通過自動添加酸(H2SO4)或堿(NaOH)使培養(yǎng)基的pH保持在7.0。通過自動調(diào)節(jié)攪拌，按程序控制發(fā)酵罐的溶解氧為30％，同時維持最低200rpm的攪拌。通過自動添加1.05％SAG-471硅酮消泡劑(WitcoCorp.)實施對發(fā)酵罐內(nèi)泡沫的控制。當細胞密度達光密度(600nm)約3.5時，將異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)加入到發(fā)酵罐中，濃度為1.0mM。IPTG誘導編碼Mtb72f蛋白的重組基因表達。在誘導后3.0小時，冷卻發(fā)酵罐，在1L離心瓶中離心收獲細胞。發(fā)酵培養(yǎng)基的組成材料濃度酵母浸膏15g/L甘油30g/L七水硫酸鎂(MgSO4)0.5g/L磷酸二氫鉀(KH2PO4)2.4g/L磷酸氫二鈉(Na2HPO4)3.2g/L氯化銨(NH4Cl)1.0g/L氯化鈉(NaCl)0.5g/L硫酸卡那霉素30mg/L氯霉素34mg/LSAG-471硅酮消泡劑(Witco公司)0.0005％(v/v)(不包括在內(nèi))包含體的分離將細胞沉淀重懸在2.3L裂解緩沖液(50mMNaCl,10mMTrispH8.0)中并混合，然后用M-110Y破碎細胞。將細胞通過Microfluidizer5次，壓力為11,000±1,000psi。懸液裝在500ml瓶中，以8000xg離心。在這些條件下，沉淀中含有Mtb72f蛋白的包含體(IB)，而大多數(shù)細胞碎片保留在上清液中。將IB沉淀重懸于洗滌緩沖液(2M尿素、50mMNaCl、10mMTrispH8.0)中，以8,000g離心。棄去上清液部分，將IB沉淀貯存在-70℃至-80℃直到用于進一步純化。多蛋白的純化冷凍IB制劑在37℃融化15分鐘，重懸于8M尿素、50mMNaCl、20mMBis-tris丙烷,pH7.0(緩沖液A)中，用溫和機械攪拌。然后在室溫下用磁力攪拌棒以300rpm攪拌重懸的IB達2小時。再將IB提取物進行高速離心，所得上清液部分通過0.45μm濾器(Pall,Supor)過濾，然后進行色譜分離。將IB提取物上樣到事先用1NNaOH清洗并用緩沖液A平衡的含QSepharoseFastFlow(QFF)陰離子交換樹脂的柱子(10x12.5cmAmersham/PharmaciaBPG；1L填充床)上。該柱以60cm/hr的線性流速用緩沖液A來展層，將含有主要低分子量污染物的流分收集起來用作參考。批量Mtb72f用8M尿素、90mMNaCl、20mMBis-tris丙烷(pH7.0)一步洗脫下來，根據(jù)吸光度進行收集單一大峰。QFF樹脂是高度交聯(lián)瓊脂糖樹脂，在純化期間所用的條件中具有帶正電荷的季銨官能團。帶電荷的基質(zhì)允許結(jié)合不同陰離子，然后可用鹽梯度進行選擇性洗脫。該陰離子交換色譜用于從蛋白質(zhì)中分離出與樹脂緊密結(jié)合的核酸和內(nèi)毒素，該蛋白質(zhì)結(jié)合較弱并且在這些污染物洗脫下來之前可先洗脫下來。另外，該步驟除去不帶電荷的污染物和大部分蛋白質(zhì)雜質(zhì)。將來自QFF柱的90mMNaCl洗脫峰上樣到事先用1NNaOH清洗并用緩沖液C(8M尿素,250mMNaCl和20mMBis-tris丙烷,pH7.0)平衡的含有陶瓷羥基磷灰石(CHT)(I型,40μM,BioRad)的柱子(2.6x12cmAmersham/PharmaciaXK26/20；63ml填充床)上。收集含有大部分Mtb72f、而不含污染物的流出物(FT1)。用緩沖液C洗滌該柱，收集任何所得UV-吸收材料。最后，將該柱用緩沖液D(8M尿素、200mM磷酸鈉,pH7.4)洗脫。CHT是球形大孔形式的羥基磷灰石[Ca5(PO4)3OH]2。CHT色譜可以是高度選擇性的純化方法，如果發(fā)現(xiàn)合適結(jié)合和洗脫條件的話。結(jié)合方式包括與帶電荷鈣離子和磷酸離子的離子交換型結(jié)合以及分子的螯合。DNA與該樹脂結(jié)合，可達到對單個蛋白質(zhì)的高度選擇性。純化Mtb72f所用的條件起到精致步驟的作用，允許實際完成可檢測宿主細胞污染物的去除。在色譜分離期間，監(jiān)測并記錄紫外(UV)吸光度、電導率、壓力、pH、流速和環(huán)境溫度。起始CHT流出物(FTl)用于進一步下游處理。滲濾和過濾除菌滲濾在CHTFT1池上進行，以除去尿素并用20mMTrispH7.5更換緩沖液。用PallMinimTM系統(tǒng)，使用帶有超濾膜的LV-CentramateTM切向流過濾裝置(30kDa分子量截止值(MWCO))進行滲濾。用0.2μm除菌濾膜(Millipak40)對Mtb72f的20mMTrispH7.5溶液進行過濾除菌。50ml溶液分布在無菌60mlPETG(聚對苯二甲酸乙二酯共聚物)培養(yǎng)瓶中，然后冷凍并貯存于-70℃。該材料就是Mtb72f純化的批量藥物。實施例2：Mtb72f(6HisTag)(SEOIDNO:2)的制備可以按照實施例1的方法，除了亞克隆到pPDM中以便除去HisTag的步驟可省略之外。實施例3：M72(2HisTag)(SEQIDNO:4)的制備M72表達載體的構建構建M72抗原的原料是重組質(zhì)粒6His-Mtb72fmut。通過定向誘變，使用6his-Mtb72f重組質(zhì)粒(參見實施例1)作為模板，制備6His-Mtb72fmut，定向誘變包括用Ala的密碼子取代SEQIDNO:1位置710的Ser密碼子。用“基因定制定向誘變系統(tǒng)(GeneTailorSite-DirectedmutagenesisSystem)”(Invitrogen)可使6His-Mtb72fmut構建體(Corixa質(zhì)粒)上存在的4個N-端組氨酸缺失，產(chǎn)生預期的2His-Mtb72Fmut構建體。序列經(jīng)證實后，從質(zhì)粒上切下2His-Mtb72fmut編碼序列(通過限制酶切)，凝膠純化并連接到pET29a表達載體中，產(chǎn)生最終重組質(zhì)粒pET29a/2His-Mtb72fmut。序列經(jīng)證實后，給重組質(zhì)粒指定正式名稱pRIT15497，并用于轉(zhuǎn)化HMS174(DE3)宿主細胞。pRIT15497編碼725個氨基酸的蛋白質(zhì)，稱為M72。M72蛋白的產(chǎn)生可以采用Mtb72f所述的類似生產(chǎn)方法(參見實施例1)，除了對于M72生產(chǎn)，發(fā)酵培養(yǎng)基中不含氯霉素之外。生物實施例1：非活動性/潛伏狀態(tài)的結(jié)核分枝桿菌感染的小鼠模型為了建立潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染的小鼠模型，使用SWR品系。SWR小鼠不是免疫缺陷型的，但是對補體成分C5的分泌是缺陷型的(參見Ooi和Colten,Nature(1979)282:207-8)。SWR小鼠不能建立慢性狀態(tài)的Mtb感染，但是發(fā)展彌散性肉芽腫性肺炎，其特征是具有結(jié)晶狀內(nèi)含物(已經(jīng)被吞噬的嗜中性粒細胞或嗜酸性粒細胞衍生的顆粒)的大上皮狀和泡沫狀巨噬細胞、多病灶壞死、嗜中性粒細胞積累和缺乏淋巴細胞(參見Turner等,JSubmicroscCytolPathol.(2001)33(l-2):217-9；和Turner等,InfectImmun.(2003)71(9):5266-72)。按照該方案，使用潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染模型的SwissWebster(SWR/J)小鼠品系，以評價與AS01B佐劑一起配制的Mtb72f(SEQIDNO:6)的療效。將QS21(5μg)添加到含有膽固醇(25μg)的二油酰磷脂酰膽堿(100μg)的小單層囊泡(SUV)中，制備雙重強度的AS01B(WO96/33739)和在膜中的單磷酰脂質(zhì)A(MPL)(5μg)(參見美國專利公布號2003/0143240)。通過將4μg蛋白質(zhì)的緩沖液(PBSpH6.8)與50μl雙重強度的AS01B混合，制備注射用等分試樣(50μl)。每只小鼠接受兩次注射50μl(即8μg蛋白質(zhì))。建立潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染模型的代表性時間表，見圖1。第1天：用50-100菌落形成單位(CFU)結(jié)核分枝桿菌有機體通過氣溶膠感染第30-90天：用每升飲用水含50mg利福平/85mg異煙肼治療其中一組小鼠第61天：接受候選疫苗5的所有小鼠應當接種rMtb72f+AS01B第82天：接受候選疫苗的所有小鼠應當接種rMtb72f+AS01B第103天：接受候選疫苗的所有小鼠應當接種rMtb72f+AS01B第113天：放血用于IgG測定不同時間點：取出脾和肺，用于CFU計數(shù)和免疫原性。改動1→化學治療60天。在第30天開始→休息3、4、5個月→每個時間點2只小鼠的CFU，留下4-7只小鼠進行存活研究改動2→化學治療90天。在第30天開始→休息4、5個月→每個時間點2只小鼠的CFU，留下7只小鼠進行存活研究改動3→休息4、5、6個月→每個時間點2只小鼠的CFU，留下4只小鼠進行存活研究改動4→化學治療60天。在第30天開始→3次肌內(nèi)(i.m.)免疫接種r72F+AS01B，在第60天開始→休息3、4、5個月→每個時間點2只小鼠的CFU，留下4-7只小鼠進行存活研究改動5→化學治療90天。在第30天開始→3次肌肉免疫接種r72F+AS01B，在第60天開始→休息4、5個月→每個時間點2只小鼠的CFU，留下4-7只小鼠進行存活研究。用rMtb72f包被ELISA板對感染后抗體反應進行分析表明，與未治療或僅接受化療的小鼠(OD小于0.5)相比，這些接受化療和Mtb72f+AS01B免疫接種組合的各組具有更高抗體反應(OD高達2.0)(圖2)。接種Mtb72f的小鼠都產(chǎn)生相當大的Mtb72f特異性抗體反應(OD介于1.5-2.5之間)，無論它們接受60天還是90天化療(圖3)。在小鼠感染結(jié)核分枝桿菌后的不同時間間隔，從小鼠收獲脾細胞。脾細胞在體外用重組抗原重新刺激，測定IFN-γ的分泌。在第1組(未治療)和第2組(僅化療)中，在第60天時，這些細胞產(chǎn)生IFN-γ的水平一律可忽略不計，除Mtb39之外。用conA、PPD和BCG裂解物的陽性對照刺激，表明細胞能合成和分泌IFN-γ，以響應其它刺激分子(圖4)。在接受Mtb72f+AS01B的各組中IFN-γ水平高，但是在未接種Mtb72f+AS01B的各組中則很低或可忽略不計，無論它們是否接受過化療(圖5)。在結(jié)核病感染和后續(xù)治療過程中，特異性T細胞發(fā)生反應。用胞內(nèi)細胞因子對IFN-γ進行染色，測定特異性CD4+細胞對Mtb72F的反應百分率(圖6)。在單用化療期間的任何時間點，通過該測定進行檢測，Mtb72F特異性CD4+IFNγ+T細胞反應看來都沒有變化(圖7)。在Mtb感染后第120天，在接受Mtb72f+AS01B疫苗的各組中，針對Mtb72F的CD4+IFNγ+反應趨勢在這段化療時間內(nèi)看來是上升的(圖7)。我們的實驗結(jié)果證明，SWR小鼠對結(jié)核分枝桿菌感染易感。如果不治療，SWR小鼠在Mtb感染后115天就會死亡(圖8和9)。接受60天聯(lián)合化療的小鼠的平均存活時間為170天(圖8和9)。接受60天聯(lián)合化療和3次接種Mtb72f/AS01B的小鼠的平均存活時間為215天(圖8和9)。接受化療小鼠組的存活率與接受化療加上Mtb72f/AS01B疫苗的小鼠組相比有顯著性差異(95％置信區(qū)間(p＝0.0067))。當前第1頁1 2 3