本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地說，涉及metrnl蛋白或基因在治療內(nèi)皮功能受損中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

內(nèi)皮細(xì)胞(endothelialcells，縮寫ecs)是一薄層的專門上皮細(xì)胞，由一層扁平細(xì)胞所組成，呈多邊形，細(xì)胞的邊緣呈鋸齒狀，相互嵌合。它位于血液與血管組織之間，形成血管的內(nèi)壁，是血管管腔內(nèi)血液與血管壁的接口。內(nèi)皮細(xì)胞沿著整個循環(huán)系統(tǒng)，由心臟直至最小的微血管。

內(nèi)皮細(xì)胞提供血液與血管壁之間的屏障，并能完成血漿和組織液的代謝交換，還能合成和分泌多種生物活性物質(zhì)，以保證血管正常的收縮和舒張，起到維持血管張力，調(diào)節(jié)血壓以及凝血與抗凝平衡等特殊功能，進(jìn)而保持血液的正常流動和血管的長期通暢。其中，血管舒張有兩種形式：①內(nèi)皮依賴性血管舒張：指內(nèi)皮細(xì)胞在藥物(如乙酰膽堿)和生理性刺激(如血流切應(yīng)力)的作用下釋放內(nèi)皮依賴性舒張因子(edrf)，作用于血管平滑肌引起血管擴(kuò)張，這依賴于結(jié)構(gòu)和功能正常的血管內(nèi)皮，內(nèi)皮細(xì)胞受損或功能異常時，no釋放減少，血管擴(kuò)張能力降低；②非內(nèi)皮依賴性血管舒張：指不依賴于血管內(nèi)皮的外源性no供體(如硝酸甘油、硝普鈉等)注入體內(nèi)則直接作用于血管平滑肌引起血管舒張。

正常內(nèi)皮功能包括抑制血管平滑肌收縮、血小板聚集、血管平滑肌細(xì)胞增生、白細(xì)胞粘附和血栓形成等。內(nèi)皮功能障礙主要表現(xiàn)為：內(nèi)皮依賴性血管舒張功能下降，血管通透性增加，白細(xì)胞粘附，炎癥反應(yīng)，內(nèi)皮結(jié)構(gòu)性損害，內(nèi)皮細(xì)胞脫落等。

近年來，越來越多的研究表明內(nèi)皮功能的改變與諸多疾病的發(fā)生、發(fā)展有密切的聯(lián)系，諸多疾病發(fā)生的早期均有血管內(nèi)皮功能受損。其中，高血壓、冠心病、糖尿病、高膽固醇血癥、動脈粥樣硬化、血栓、缺血性心腦血管疾病均存在內(nèi)皮依賴性血管舒張功能障礙，血脂異常、肥胖及長期吸煙者也存在內(nèi)皮依賴性血管舒張功能障礙。同樣地，在以上心腦血管疾病的發(fā)生過程中，伴有內(nèi)皮細(xì)胞的異常生長。

metrnl在ncbi中的小鼠、大鼠、人基因號分別為210029、316842和 284207。小鼠metrnl位于第11號染色體qe2位點(diǎn)，人metrnl位于第17號染色體q25.3位點(diǎn)，二者蛋白序列具有77％的同源性。metrnl開放閱讀框架包含四個外顯子，由936個堿基對編碼311個氨基酸，其中包括由45個氨基酸構(gòu)成的n端信號肽序列和由266個氨基酸構(gòu)成的分子量約為30kda的成熟蛋白分子，整個蛋白分子沒有跨膜區(qū)域。metrnl在白色脂肪等組織中具有較高的表達(dá)(cnsneuroscither.2014apr；20(4):344-54)，在胰島素敏感性調(diào)節(jié)等過程中具有重要作用(diabetes.2015dec；64(12):4011-22；中國專利號zl201310525181.5&zl201310525184.9)。

目前關(guān)于metrnl蛋白和基因的功能研究報道極少，尤其是與內(nèi)皮功能之間的關(guān)系尚無報告。因此，進(jìn)一步探索metrnl蛋白和基因的用途，將有助于相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究和治療藥物的開發(fā)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供metrnl蛋白或基因在治療內(nèi)皮功能受損中的應(yīng)用。

在本發(fā)明的第一方面，提供了一種metrnl蛋白或基因及其增效劑的用途，用于制備治療或改善內(nèi)皮功能受損相關(guān)疾病的藥物。

所述的內(nèi)皮功能受損相關(guān)疾病為內(nèi)皮依賴性血管舒張功能障礙相關(guān)疾病或內(nèi)皮細(xì)胞損傷相關(guān)疾病等。

所述的內(nèi)皮細(xì)胞損傷相關(guān)疾病伴有內(nèi)皮細(xì)胞生長異常。

所述的內(nèi)皮功能損傷相關(guān)疾病包括高血壓、冠心病、糖尿病、高膽固醇血癥、動脈粥樣硬化、血栓、缺血性心腦血管疾病、血脂異常、肥胖、吸煙損害等。

作為本發(fā)明的一種具體實施方式，所述metrnl蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示。

在本發(fā)明的第二方面，提供了一種metrnl蛋白或基因及其增效劑的用途，用于：

a)制備治療或改善內(nèi)皮依賴性血管舒張功能障礙的試劑；或

b)用于制備促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的試劑。

作為本發(fā)明的一種具體實施方式，所述metrnl蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示。

在本發(fā)明的第三方面，提供了一種篩選治療或改善內(nèi)皮依賴性血管舒張功 能障礙的潛在物質(zhì)的方法，包括以下步驟：

a)將候選物質(zhì)與含有metrnl蛋白或基因的體系接觸，

b)觀察候選物質(zhì)對于metrnl蛋白或基因表達(dá)及活性的影響，其中，若所述候選物質(zhì)能夠促進(jìn)metrnl基因表達(dá)或提高metrnl蛋白活性，則所述候選物質(zhì)是治療或改善內(nèi)皮依賴性血管舒張功能障礙的潛在物質(zhì)。

在本發(fā)明的第四方面，提供了一種非診斷和治療目的的調(diào)節(jié)內(nèi)皮依賴性血管舒張功能的方法，包括以下步驟：促進(jìn)或抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞中metrnl基因的表達(dá)或metrnl蛋白的活性。

在本發(fā)明的第五方面，提供了一種治療或改善內(nèi)皮功能受損相關(guān)疾病的藥物組合物，所述的藥物組合物含有metrnl蛋白、基因或它們的增效劑，以及常規(guī)藥用載體。

本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：

一方面，發(fā)明人首次建立了metrnl內(nèi)皮特異性敲除小鼠模型，基于該模型證實血管內(nèi)皮缺乏metrnl引起內(nèi)皮依賴性舒張功能下降，metrnl具有擴(kuò)張血管的功能；另一方面，發(fā)明人基于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(huvec)和metrnl內(nèi)皮特異性敲除小鼠原代內(nèi)皮細(xì)胞，證實了敲減血管內(nèi)皮metrnl后，細(xì)胞增殖下降，表明metrnl具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用。因此，metrnl蛋白或基因及其增效劑可用于制備治療或改善內(nèi)皮依賴性血管舒張功能障礙的試劑，制備調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的試劑，并用于內(nèi)皮功能受損相關(guān)疾病藥物的開發(fā)。

附圖說明

圖1.人、大鼠、小鼠metrnl氨基酸序列全長比對圖。

圖2.野生小鼠胸主動脈免疫組化染色顯示內(nèi)皮metrnl。

圖3.野生小鼠胸主動脈免疫熒光染色顯示內(nèi)皮metrnl。

圖4.原代小鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞生長圖片。

圖5.原代小鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞cd31的流式鑒定結(jié)果。

圖6.原代小鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞cd31的免疫熒光染色鑒定結(jié)果。

圖7.原代培養(yǎng)小鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(maec)中metrnl表達(dá)的定量分析結(jié)果。

圖8.metrnl內(nèi)皮特異性敲除小鼠構(gòu)建流程圖。

圖9.metrnl內(nèi)皮特異性敲除小鼠基因組dna的tek-cre以及metrnl-flox基因型鑒定電泳圖。

圖10.metrnl內(nèi)皮特異性敲除小鼠(ec-metrnl^-/-)免疫熒光染色顯示內(nèi)皮缺乏metrnl。

圖11.metrnl內(nèi)皮特異性敲除小鼠原代內(nèi)皮細(xì)胞metrnl的表達(dá)。

圖12.metrnl內(nèi)皮特異性敲除小鼠(ec-metrnl^-/-)及同窩對照小鼠(wt)對去氧腎上腺素(phe)引起的血管收縮反應(yīng)檢測結(jié)果。

圖13.metrnl內(nèi)皮特異性敲除小鼠(ec-metrnl^-/-)及同窩對照小鼠(wt)對乙酰膽堿(ach)引起的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)檢測結(jié)果。

圖14.metrnl內(nèi)皮特異性敲除小鼠(ec-metrnl^-/-)及同窩對照小鼠(wt)對硝普鈉(snp)引起的內(nèi)皮非依賴性血管舒張反應(yīng)檢測結(jié)果。

圖15.huvec細(xì)胞轉(zhuǎn)染熒光圖片。

圖16.metrnl敲減效率的驗證結(jié)果。

圖17.huvec的細(xì)胞增殖實驗結(jié)果。

圖18.metrnl內(nèi)皮特異性敲除小鼠原代內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞增殖實驗結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的具體實施方式作詳細(xì)說明。

metrnl蛋白及基因

本文中，術(shù)語“metrnl蛋白”、“metrnl多肽”可互換使用。人、大鼠、小鼠metrnl氨基酸序列全長比對圖見圖1?？蓞⒖嘉墨I(xiàn)：cnsneuroscither.2014apr；20(4):344-354。

在本文中，所用的metrnl蛋白可以是天然存在的，比如其可被分離純化自哺乳動物。此外，所述metrnl蛋白也可以是人工制備的，比如根據(jù)常規(guī)基因工程技術(shù)來制備得到。任何合適的metrnl蛋白均可適用于本發(fā)明。所述metrnl蛋白包括全長的metrnl蛋白或其生物活性片段。優(yōu)選地，可以與seqidno.1所示的氨基酸序列基本相同。

經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的metrnl蛋白的氨基酸序列也包括在本發(fā)明中。metrnl蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述氨基酸替代的序列并不影響其活性或保留了其部分活性。適當(dāng)替換氨基酸是本領(lǐng)域內(nèi)的公知技術(shù)，所述技術(shù)可以很容易地被實施并且確保不改變已知分子的生物活性。這些技術(shù)使本領(lǐng)域人員認(rèn)識到，一般來說，在一種多肽的非必需氨基酸區(qū)域改變單個氨基酸并不會改變生物活性。

任何一種metrnl蛋白的生物活性片段均可以應(yīng)用到本發(fā)明中。在這里， metrnl蛋白的生物活性片段的含義是指一種多肽，其仍然能保持全長的metrnl蛋白的全部或部分功能。通常情況下，所述的生物活性片段至少保持50％、60％至99％或者100％的全長metrnl蛋白的活性。

本發(fā)明也可以采用經(jīng)修飾或改良的全部或部分氨基酸的metrnl蛋白，比如，可以為了促進(jìn)半衰期、有效性、代謝和/或蛋白的效力而加以修飾或改良的metrnl蛋白。所述經(jīng)過修飾或改良的metrnl蛋白可以是一種metrnl蛋白的共軛物，或其可被取代的或人工的氨基酸。所述經(jīng)過修飾或改良的metrnl蛋白或基因可以與天然metrnl蛋白或基因有一定的不同點(diǎn)，但也能夠擴(kuò)張血管，且不會帶來其它不良反應(yīng)或毒性。也就是說，任何不影響metrnl蛋白的生物活性或者說是基因的生物學(xué)功能的變化形式都可用于本發(fā)明中。

metrnl增效劑及其用途

所述的“metrnl增效劑”包括了激動劑、上調(diào)劑、穩(wěn)定劑等，是指任何可提高metrnl的活性、提高metrnl的穩(wěn)定性、上調(diào)metrnl的表達(dá)、增加metrnl有效作用時間的物質(zhì)，這些物質(zhì)均可用于本發(fā)明。它們可以是化合物、化學(xué)小分子、生物分子等。所述的生物分子可以是核酸水平(包括dna、rna)的，蛋白水平的，也可以是上調(diào)metrnl表達(dá)的病毒產(chǎn)品等。

實施例1metrnl在野生小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)分布研究

1實驗材料

c57小鼠：購于上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司。

一抗metrnl：購于abcam公司。

一抗cd31：購于武漢谷歌生物科技有限公司。

二抗羊抗兔，二抗驢抗山羊：購于jackson公司。

山羊血清：購于武漢博士德。

dapi：購于碧云天公司。

抗熒光淬滅劑：購于碧云天公司。

高糖dmem：購于hyclone公司。

ⅰ型膠原酶：購于invitrogen公司。

egm-2內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基：購于lonza公司。

胰酶：購于gibco公司。

帶有fitc熒光標(biāo)記的cd31抗體：購于ebioscience。

trizol：購于invitrogen公司。

2實驗方法

2.1免疫組化染色觀察metrnl在血管內(nèi)皮的表達(dá)分布

分離c57小鼠胸主動脈，將主動脈剪成3mm一段，其中一段使用彎鑷去除主動脈內(nèi)皮細(xì)胞層(e-f+)，另一段保證內(nèi)皮細(xì)胞層的完整性(e+f+)。使用多聚甲醛脫水完全后用石蠟包埋樣本制成石蠟切片；石蠟切片60℃烤片后脫蠟水化，使用3％過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶；選擇高壓鍋處理技術(shù)對片子進(jìn)行抗原修復(fù)；使用山羊血清37℃封閉15min；分別在標(biāo)本上滴加一抗metrnl、一抗cd31，4℃過夜孵育；漂洗片子后滴加生物素化的二抗，37℃孵育40min；漂洗后滴加sab復(fù)合物，37℃孵育40min，漂洗后進(jìn)行dab顯色觀察。

2.2免疫熒光技術(shù)觀察metrnl在血管內(nèi)皮的表達(dá)分布

分離c57小鼠胸主動脈，去除主動脈外膜脂肪，剪成約2-3mm一段，浸泡于4％多聚甲醛溶液中脫水直至樣本沉底；將脫水處理后的主動脈取出，使用包埋劑豎直固定于凍臺上并將樣本連凍臺一起置于-80℃冷凍約30min；取出固定有樣本的凍臺，將其固定于冰凍切片機(jī)樣品固定臺上開始切片，每張片子厚度為10μm，采用貼片法將片子固定于防脫載玻片上，一個樣本切片約20張；將切好的片子放置于37℃烘箱中烤片2小時；使用1×pbs靜置漂洗片子3次，每次5min；使用檸檬酸三鈉對片子進(jìn)行熱修復(fù)10min；使用1×pbs靜置漂洗片子3次，每次5min；將片子周圍水跡擦干，使用油筆在樣本周圍劃一圈；使用山羊血清室溫封閉樣本1小時；甩去山羊血清加入一抗(cd311:50，metrnl1:50)，4℃孵育過夜；使用1×pbs靜置漂洗片子3次，每次5min；二抗孵育(1:200)室溫避光孵育1小時；使用1×pbs靜置漂洗片子3次，每次5min；dapi復(fù)染室溫3-5min；使用1×pbs靜置漂洗片子3次，每次5min；滴加抗熒光淬滅劑，封片拍照呈像。

2.3原代小鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(maec)的培養(yǎng)鑒定

2.3.1原代小鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)

4-5周齡c57小鼠麻醉處死；打開胸腔腹腔，將主動脈兩頭連著心臟、腎臟完整剪下將其放置于1×pbs中，置于冰上短時間保存；在解剖鏡下將主動脈外膜脂肪及筋膜剔除干凈，視野下僅剩下完整的主動脈連著心臟和腎臟部分；剪去心臟心尖部分，使用1ml注射器針頭從心臟剪口處插入主動脈，使用1×pbs將主動脈中血液沖干凈；再使用高糖dmem配制的2mg/mlⅰ型膠 原酶溶液注射入主動脈，使主動脈內(nèi)充滿ⅰ型膠原酶，使用兩個蝴蝶夾將主動脈兩頭夾死，將主動脈放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱消化45min；打開蝴蝶夾，使用1ml注射器分多次吸取15ml含有20％血清的dmem培養(yǎng)基反復(fù)從心臟沖洗主動脈，將主動脈內(nèi)層內(nèi)皮細(xì)胞吹下；收集所有吹下的溶液，使用70μm細(xì)胞篩網(wǎng)過濾至離心管中；1200rpm，5min離心收集細(xì)胞；使用20％血清的dmem培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞種板于鋪有fibronectin(corning)的細(xì)胞平皿中；2小時后將培養(yǎng)基換成egm-2內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基，隔天換液直至細(xì)胞長至融合。

2.3.2內(nèi)皮細(xì)胞的流式鑒定

將原代內(nèi)皮細(xì)胞使用胰酶消化，于離心管中離心1000rpm，5min；棄上清，使用100μl1×pbs重懸細(xì)胞沉淀，按抗體說明書要求向其中加入一定體積帶有fitc熒光標(biāo)記的cd31抗體，避光孵育30min；離心沉淀細(xì)胞后再加入300μl1×pbs重懸細(xì)胞，流式檢測。

2.3.3內(nèi)皮細(xì)胞的免疫熒光染色鑒定

吸棄細(xì)胞培養(yǎng)基，使用1×pbs漂洗細(xì)胞三次，使用4％多聚甲醛固定細(xì)胞10min；使用山羊血清室溫封閉細(xì)胞1小時；吸棄山羊血清加入一抗cd31(1:50)，4℃孵育過夜；使用1×pbs靜置漂洗細(xì)胞3次，每次5min；二抗孵育(1:200)室溫避光孵育1小時；使用1×pbs靜置漂洗細(xì)胞3次，每次5min；dapi復(fù)染室溫3-5min；使用1×pbs靜置漂洗細(xì)胞3次，每次5min；拍照呈像。

2.4原代培養(yǎng)c57小鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中metrnl的表達(dá)檢測

使用trizol提取原代培養(yǎng)maec以及成熟脂肪細(xì)胞(matureadipocyte)的mrna，將其逆轉(zhuǎn)錄為cdna；使用metrnl基因上下游引物對細(xì)胞內(nèi)的metrnl進(jìn)行定量分析。

引物序列如下所示：

上游引物：ctggagcagggaggcttattt(seqidno.2)，

下游引物：ggacaacaaagtcactggtacag(seqidno.3)。

3實驗結(jié)果

3.1免疫組化染色結(jié)果

結(jié)果見圖2，在內(nèi)皮細(xì)胞層完整的主動脈血管環(huán)上(e+f+)可見metrnl與內(nèi)皮特異性表面標(biāo)記分子cd31一樣，沿內(nèi)皮層呈連續(xù)分布；而去除內(nèi)皮細(xì) 胞層的血管環(huán)上(e-f+)cd31與metrnl均沒有明顯連續(xù)的表達(dá)。說明metrnl在小鼠胸主動脈內(nèi)皮中具有較高的表達(dá)。

3.2免疫熒光染色結(jié)果

結(jié)果見圖3，我們發(fā)現(xiàn)metrnl與cd31共定位于主動脈內(nèi)皮細(xì)胞層，進(jìn)一步證實metrnl可在血管內(nèi)皮中表達(dá)。

3.3原代小鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定結(jié)果

結(jié)果見圖4-6，我們進(jìn)行了maec的原代培養(yǎng)，并對體外培養(yǎng)的maec進(jìn)行了內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志分子cd31的流式鑒定，結(jié)果顯示原代培養(yǎng)的細(xì)胞95.52％呈現(xiàn)cd31陽性，即為內(nèi)皮細(xì)胞；我們對體外培養(yǎng)的maec進(jìn)一步進(jìn)行cd31染色，證實原代培養(yǎng)的細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞。

3.4原代培養(yǎng)c57小鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中metrnl的表達(dá)檢測結(jié)果

結(jié)果見圖7，可見metrnl在成熟脂肪細(xì)胞中具有較高的表達(dá)(cnsneuroscither.2014apr；20(4):344-354)，將maec與成熟脂肪細(xì)胞中metrnl表達(dá)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)maec中metrnl也具有較高的表達(dá)。

實施例2metrnl內(nèi)皮特異性敲除小鼠構(gòu)建和鑒定

1實驗材料

tek-cre小鼠：購自thejacksonlaboratory，b6.cg-tg(tek-cre)12flv/j(stocknumber：004128)。

鼠尾基因組提取試劑盒：購于zymo公司。

2實驗方法

2.1metrnl內(nèi)皮特異性敲除小鼠培育

2.1.1metrnl^loxp/loxp小鼠培育

metrnl^loxp/loxp小鼠為實驗室早期構(gòu)建，已用于培育多種組織特異性敲除小鼠，具體培育方法可參見參考文獻(xiàn)：diabetes.2015dec；64(12):4011-22，也可從中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)購買。

2.1.2metrnl^loxp/loxptek-cre培育

將metrnl^loxp/loxp小鼠與tek-cre小鼠雜交，得到的metrnl^loxp/wttek-cre小鼠再與metrnl^loxp/loxp小鼠進(jìn)行回交，得到的metrnl^loxp/loxptek-cre即為metrnl內(nèi)皮特異性敲除小鼠(ec-metrnl^-/-)，培育流程見圖8。

2.2metrnl內(nèi)皮特異性敲除小鼠的基因型鑒定

使用鼠尾基因組提取試劑盒提取小鼠鼠尾基因組dna，使用tek-cre以及 metrnl-flox基因上下游引物對提取的基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分別在100bp以及243bp同時出現(xiàn)目的條帶才能確定為metrnl內(nèi)皮特異性敲除小鼠。

tek-cre以及metrnl-flox基因引物序列為：

tek-cre上游引物：gcggtctggcagtaaaaactatc(seqidno.4)，

tek-cre下游引物：gtgaaacagcattgctgtcactt(seqidno.5)，

metrnl-flox上游引物：tgagggttggaggctcctagc(seqidno.6)，

metrnl-flox下游引物：ggatgagcgtttgagcacagc(seqidno.7)。2.3metrnl內(nèi)皮特異性敲除小鼠表型驗證(一)

取metrnl內(nèi)皮特異性敲除小鼠(ec-metrnl^-/-)及同窩對照小鼠(wt)主動脈做冰凍切片并進(jìn)行組織免疫熒光染色(具體操作同實施例1中的記載)。2.4metrnl內(nèi)皮特異性敲除小鼠表型驗證(二)

提取metrnl內(nèi)皮特異性敲除小鼠(ec-metrnl^-/-)及同窩對照小鼠(wt)主動脈內(nèi)皮細(xì)胞maec(具體操作同實施例1中的記載)，提取maec的mrna逆轉(zhuǎn)成cdna后使用metrnl基因上下游引物對細(xì)胞內(nèi)的metrnl表達(dá)進(jìn)行定量分析。

3實驗結(jié)果

3.1metrnl內(nèi)皮特異性敲除小鼠的基因型鑒定結(jié)果

結(jié)果見圖9，可見在100bp以及243bp同時出現(xiàn)目的條帶，確定metrnl內(nèi)皮特異性敲除小鼠模型構(gòu)建成功。

3.2metrnl內(nèi)皮特異性敲除小鼠表型驗證結(jié)果

結(jié)果見圖10，可見與同窩野生型小鼠內(nèi)皮層明顯的metrnl熒光染色相比，ec-metrnl^-/-內(nèi)皮層無明顯的metrnl表達(dá)，進(jìn)一步證明metrnl內(nèi)皮特異性敲除小鼠模型構(gòu)建成功。

3.3metrnl內(nèi)皮特異性敲除小鼠原代內(nèi)皮細(xì)胞metrnl表達(dá)

如圖11所示，metrnl內(nèi)皮特異性敲除小鼠(ko)的maec較同窩對照小鼠(wt)相比，metrnl的表達(dá)下降了99％以上。

實施例3metrnl內(nèi)皮特異性敲除小鼠血管舒張功能檢測

1實驗材料

氯化鉀：購于國藥集團(tuán)。

乙酰膽堿：購于sigma公司。

去氧腎上腺素：購于sigma公司。

硝普鈉：購于sigma公司。

2實驗方法

metrnl內(nèi)皮特異性敲除小鼠(ec-metrnl^-/-)及同窩對照小鼠(wt)在戊巴比妥鈉麻醉下開胸，剪開心臟放血后迅速分離、剪取胸主動脈段，去除血管外膜脂肪后，制備成長度約為3mm血管環(huán)2個，并小心連接于張力換能器，通過記錄系統(tǒng)連續(xù)記錄血管張力變化。調(diào)節(jié)靜息張力至預(yù)定值1.5g；穩(wěn)定1小時，使靜息張力保持1.5g，30min時更換一次k-h液(37℃，含95％o2+5％co2)，使各個浴槽中k-h液為20ml；采用kcl60mm引起血管收縮，5min后用k-h液(37℃，含95％o2+5％co2)沖洗標(biāo)本3-5次，最后一次加入k-h液20ml。穩(wěn)定15min，調(diào)節(jié)使靜息張力保持1.5g，再次采用kcl60mm引起血管收縮，5min后用k-h液(37℃，含95％o2+5％co2)沖洗標(biāo)本3-5次，最后一次加入k-h液20ml。穩(wěn)定30min，調(diào)節(jié)使靜息張力保持1.5g，采用單劑量去氧腎上腺素(phe)3×10^-7m引起血管預(yù)收縮，當(dāng)血管收縮反應(yīng)達(dá)到坪值時，采用乙酰膽堿(ach)1×10^-8,3×10^-8,1×10^-7,3×10^-7,1×10^-6,3×10^-6,1×10^-5,3×10^-5,1×10^-4,3×10^-4m由低劑量到高劑量累積給藥檢測血管舒張功能，在每一劑量引起的血管舒張反應(yīng)達(dá)到最大值時立即累加下一劑量。然后用k-h液(37℃，含95％o2+5％co2)沖洗標(biāo)本3-5次，最后一次加入k-h液20ml。穩(wěn)定30min，調(diào)節(jié)使靜息張力保持1.5g，采用單劑量phe3×10^-7m引起血管預(yù)收縮，當(dāng)血管收縮反應(yīng)達(dá)到坪值時，采用硝普鈉(snp)1×10^-10,3×10^-10,1×10^-9,3×10^-9,1×10^-8,3×10^-8,1×10^-7,3×10^-7,1×10^-6,3×10^-6,1×10^-5,3×10^-5,1×10^-4m由低劑量到高劑量累積給藥，在每一劑量引起的血管舒張反應(yīng)達(dá)到最大值時，立即累加下一劑量，記錄snp引起血管舒張反應(yīng)時張力的最小值。最后，儲存、分析結(jié)果。

3實驗結(jié)果

見圖12-14，可見metrnl內(nèi)皮特異性敲除小鼠(ec-metrnl^-/-)及同窩對照小鼠(wt)對phe引起的血管收縮反應(yīng)沒有顯著性差別，而ec-metrnl^-/-對ach引起的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)明顯低于wt，ec-metrnl^-/-及wt對snp引起的內(nèi)皮非依賴性血管舒張功能無明顯差異。因此證實ec-metrnl^-/-對ach引起的內(nèi)皮依賴性舒張功能下降是由于血管內(nèi)皮缺乏metrnl引起的，metrnl具有擴(kuò)張血管的功能。

實施例4內(nèi)皮細(xì)胞敲減metrnl后細(xì)胞增殖減慢

(一)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(huvec)

1實驗方法

1.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(huvec)按照1×10⁵個/孔的密度鋪板于六孔板中，待細(xì)胞貼壁10-12小時后按照moi＝20的滴度分別轉(zhuǎn)入對照病毒(scramble)和metrnl敲減病毒(metrnlshrna)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞24小時后，吸棄含有病毒的培養(yǎng)基，加入新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，48小時后可在鏡下觀察細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度，估測細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。

metrnlshrna干擾序列為：caggtgctctcatcgttaacc(seqidno.8)。

1.2metrnl敲減效率的驗證

使用trizol提取經(jīng)對照病毒(scramble)和metrnl敲減病毒(metrnlshrna)轉(zhuǎn)染huvec細(xì)胞的mrna，將其逆轉(zhuǎn)錄為cdna；使用人源metrnl基因上下游引物對細(xì)胞內(nèi)的metrnl進(jìn)行定量分析。

引物序列如下所示：

上游引物：tggagaactgagactgctggt(seqidno.9)，

下游引物：tactggaagcctgtggtcct(seqidno.10)。

1.3細(xì)胞增殖實驗

將對照病毒(scramble)和metrnl敲減病毒(metrnlshrna)轉(zhuǎn)染后的huvec細(xì)胞按照1×10⁵個/孔的密度鋪板于六孔板中，使用完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)。細(xì)胞生長48小時后拍照，記錄細(xì)胞的增殖情況。

2實驗結(jié)果

2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果

結(jié)果見圖15，表明兩種病毒的轉(zhuǎn)染效率均非常高。

2.2metrnl敲減效率的驗證結(jié)果

結(jié)果見圖16，表明使用metrnlshrna對huvec細(xì)胞中metrnl敲減效率大于80％，因此說明慢病毒介導(dǎo)的metrnl敲減細(xì)胞模型成功構(gòu)建。

2.3細(xì)胞增殖實驗結(jié)果

結(jié)果見圖17，表明huvec細(xì)胞敲減metrnl后增殖速度明顯慢于對照組細(xì)胞。

(二)metrnl內(nèi)皮特異性敲除小鼠原代內(nèi)皮細(xì)胞增殖減慢

1實驗方法

1.1metrnl內(nèi)皮特異性敲除小鼠原代內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)

提取metrnl內(nèi)皮特異性敲除小鼠(ec-metrnl^-/-)及同窩對照小鼠(wt)主動脈內(nèi)皮細(xì)胞maec(具體操作同實施例1中的記載)，隔天換液直至細(xì)胞長至融合。

1.2細(xì)胞增殖實驗

將metrnl內(nèi)皮特異性敲除小鼠(ec-metrnl^-/-)及同窩對照小鼠(wt)主動脈內(nèi)皮細(xì)胞maec按照1×10⁵個/孔的密度鋪板于六孔板中，使用完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)。細(xì)胞生長48小時后拍照，記錄細(xì)胞的增殖情況。

2實驗結(jié)果

如圖18所示，metrnl內(nèi)皮特異性敲除小鼠(ko)的maec增殖速度明顯慢于野生型小鼠maec。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。