本發(fā)明涉及重組人血管內(nèi)皮抑制素藥物組合物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
20世紀(jì)60年代，美國哈佛醫(yī)學(xué)院的folkman博士提出“腫瘤生長依賴血管生長”這一假設(shè)，即血管生成在實(shí)體瘤生長和轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用，并于1971年提出“餓死腫瘤療法”理論。為了刺激血管的生成，腫瘤細(xì)胞會上調(diào)一系列血管生成因子，同時也會產(chǎn)生一些血管生成抑制因子。組織中血管生成表型的開放與關(guān)閉將取決于組織局部區(qū)域血管生成刺激因子和抑制因子之間的動態(tài)平衡(folkman，j.nat.med.1:27-31,1995；hanahan,d.,etal.cell.86:353-364,1996)。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性的血管生成抑制因子，如血管緊張素(angiostatin)，血管內(nèi)皮抑制素(endostatin)等，均能夠抑制小鼠體內(nèi)腫瘤的生長(o’relly，m.s.,etal.cell.88:277-285,1997)。
血管內(nèi)皮抑制素(endostatin)是o’relly于1997年從小鼠內(nèi)皮細(xì)胞系eomad的培養(yǎng)液中分離得到的一種具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的物質(zhì)(o’relly，m.s.,etal.cell.88:299-285,1997)。氨基酸序列分析該物質(zhì)為膠原蛋白xviii的羧基末端的降解片段，分子量為20kd左右。
重組人血管內(nèi)皮抑制素(rhendosratin)與重組鼠血管內(nèi)皮抑制素在氨基酸序列上有85％的同源性。1996年美國entremed公司采用酵母作為表達(dá)體系生產(chǎn)了重組人血管內(nèi)皮抑制素。以重組dna技術(shù)生產(chǎn)，以大腸桿菌為表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)出的重組人血管內(nèi)皮抑制素與先前的endostatin相比較，表達(dá)水平更高，療效更強(qiáng)，并且沒有因?yàn)楦郊觧端序列而導(dǎo)致體內(nèi)免疫原性。
但是利用傳統(tǒng)的大腸桿菌表達(dá)方法得到的重組人血管內(nèi)皮抑制素難以復(fù)性并且易于形成沉淀，而用巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)所耗費(fèi)的生產(chǎn)成本巨大，兩種方法均未能解決將重組人血管內(nèi)皮抑制素進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)的問題。為此研究人員通過修飾人血管內(nèi)皮抑制素的核苷酸編碼序列，生產(chǎn)出n末端帶有附件氨基酸序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素(rhendostatin,商品名
mggshhhhhhshrdfqpvlhlvalnsplsggmrgirgadfqcfqqaravglagtfraflssrlqdlysivrradraavpivnlkdellfpswealfsgsegplkpgarifsfdgkdvlrhptwpqksvwhgsdpngrrltesycetwrteapsatgqassllggrllgqsaaschhayivlciensfmtask
一般來說，目前進(jìn)入臨床研究的重組人血管內(nèi)皮抑制素均使用靜脈給藥，或者皮下注射給藥。以目前市場銷售的恩度注射液為例，其規(guī)格為15mg/3ml/支，臨床使用時將本品加入250～500ml生理鹽水中，勻速靜脈點(diǎn)滴，滴注時間3～4小時。本品在與np化療方案聯(lián)合給藥時，在治療周期的第1～14日，每天給藥一次，連續(xù)給藥14天，休息一周，再繼續(xù)下一治療周期。通?？蛇M(jìn)行2～4個治療周期。
鑒于重組人血管內(nèi)皮抑制素在抗腫瘤藥物領(lǐng)域中的重要作用，對于研究穩(wěn)定性更優(yōu)越的重組人血管內(nèi)皮抑制素藥物組合物是非常必要的。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種具有良好穩(wěn)定性的重組人血管內(nèi)皮抑制素藥物組合物，該藥物組合物由重組人血管內(nèi)皮抑制素、醋酸-醋酸鈉緩沖液組成。
所述組合物的ph值為5.0-6.5、優(yōu)選5.0-6.0、5.0-5.5，更優(yōu)選為5.5±0.2
所述組合物中的醋酸鈉濃度為優(yōu)選為30-180mm，更優(yōu)選為30mm，60.mm，120mm，180mm。
所述組合物中的重組人血管內(nèi)皮抑制素的濃度優(yōu)選為2.0-10.0mg/ml優(yōu)選2.0-6.0mg/ml，更優(yōu)選為4.0mg/ml或5.0mg/ml。
所述組合物中的重組人血管內(nèi)皮抑制素為rhendostatin(恩度，endostar)。本發(fā)明所述的是基因重組蛋白質(zhì)類藥物，通過對其物理化學(xué)性質(zhì)、化學(xué)穩(wěn)定性和生物學(xué)穩(wěn)定性的初步測定，來作為制定處方的依據(jù)。經(jīng)測定，rhendostatin堿性氨基酸占16.6％酸性氨基酸占7.8％，理論等電點(diǎn)為9.3，實(shí)測為9.1，偏堿性。
所述的組合物可以加入其它藥學(xué)上可接受的藥物輔料進(jìn)一步制備成為注射液，也可進(jìn)一步制備成為凍干粉針以供臨床需要。
本發(fā)明所述的組合物具有良好的穩(wěn)定性，特別的，對于多聚體而言，可以很好的控制其作為雜質(zhì)的產(chǎn)生。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1緩沖體系的篩選
人體ph值為7.4，一般要求注射液ph值在4—9之間。另外，為確保成品在貯藏期內(nèi)藥液質(zhì)量穩(wěn)定，需確定藥液合理的ph值范圍，本發(fā)明人分別用10mm檸檬酸鈉—檸檬酸緩沖體系、30mm醋酸鈉緩沖體系，用naoh、hcl調(diào)節(jié)ph為6.0—6.5、5.0—5.5，rhendostatin含量為5.0mg/ml，灌封于西林瓶中2—8℃貯藏三個月，考察本品的澄明度、含量、純度等指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果見表1。
表1不同緩沖體系對rhendostatin制劑質(zhì)量的影響
表1中各項指標(biāo)的檢測方法均參照如下：非還原型sds-page電泳法按照《中國藥典》進(jìn)行；hplc法的色譜柱為c18反相柱，以0.1％三氟乙酸的水溶液為流動相a液，以0.1％三氟乙酸的乙腈容易為流動相b液，梯度洗脫24min(a液從64％-40％，b液從36％-60％)，流速為1.3ml/min，檢測波長為214nm。
根據(jù)表1可見在ph5.0—6.5范圍內(nèi)兩種緩沖體系下,rhendostatin穩(wěn)定性均好，但在加速試驗(yàn)時，37℃下檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖體系第十天時蛋白均出現(xiàn)沉淀，而醋酸鈉則無沉淀產(chǎn)生(試驗(yàn)結(jié)果見表2)。
rhendostatin具有肝素親和區(qū)，在ph5.5的條件下帶有大量正電荷易于和帶負(fù)電的離子結(jié)合，醋酸鈉的pka為4.75，在ph5.5的條件下，大多數(shù)帶負(fù)電，能和rhendostatin形成鹽鍵從而穩(wěn)定rhendostatin。因而本發(fā)明可選用ph5.0—6.0的醋酸鈉緩沖體系。
表2.37℃下rhendostatin穩(wěn)定性試驗(yàn)
實(shí)施例2醋酸鈉濃度對rhendostatin的影響試驗(yàn)
確定選用醋酸鈉緩沖體系后需研究濃度對rhendostatin穩(wěn)定性的影響，因?yàn)槔碚撋希x子強(qiáng)度對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性有影響。因而選用了5種醋酸鈉濃度做45℃加速試驗(yàn)研究rhendostatin多聚體形成速度與濃度之間的關(guān)系。醋酸鈉濃度依次為10mm，30mm，60mm，120mm，180mm；rhendostatin濃度為4.0mg/ml每支2ml，45℃水浴中加速試驗(yàn)(試驗(yàn)結(jié)果見表3)，在1小時，2小時，4小時末取樣做非還原sds-page檢測多聚體量，電泳結(jié)果經(jīng)kodak120凝膠成相儀分析，結(jié)果表明，隨醋酸鈉濃度的增加多聚體的形成速度無較大差別。我們選用30mm醋酸鈉作為最終制劑用量，因?yàn)?0mm的醋酸鈉不足以抗衡在加入其它輔料引起的ph改變，30mm則足以滿足要求。
表3.醋酸鈉濃度對rhendostatin的影響試驗(yàn)
實(shí)施例3不同蛋白濃度制劑的穩(wěn)定性
通過對rhendostatin含量為4.0mg/ml的制劑進(jìn)行加速試驗(yàn)考察后，發(fā)現(xiàn)其在醋酸鈉30mm，ph5.5體系中是穩(wěn)定的；于是又在該濃度的周圍選擇了兩個蛋白濃度：2.0mg/ml，6.0mg/ml做37℃加速試驗(yàn)來考察添加成分對蛋白的穩(wěn)定作用是否依賴于蛋白含量，試驗(yàn)結(jié)果表明，上述兩種濃度的rhendostatin制劑穩(wěn)定性與4.0mg/mlrhendostatin制劑是一致的。
實(shí)施例4不同劑型的比較試驗(yàn)
在rhendostatin醋酸鈉30mmph5.5體系中，制成凍干粉針，2～8℃保存3個月，測定各項指標(biāo)，并與注射液進(jìn)行比較，結(jié)果基本一致。
以上試驗(yàn)結(jié)果表明，rhendostatin在30mm醋酸鈉ph5.5體系中具有較高的穩(wěn)定性。