本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域，具體而言，涉及一種藥物組合物及其應用。

背景技術(shù)：

1980年，nusslein-volhard等在研究果蠅胚胎發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)了toll樣受體基因[nusslein-volhardc,wieschause.,nature,1980,287(5785):795-801]，目前，在哺乳動物及人類中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的人tirs家族成員有11個。機體最強的抗原呈遞細胞—樹突細胞可表達tlr。借助tlr識別lps、gpg-dna、肽聚糖、脂蛋白以及分支桿菌的細胞壁成分等具有pamp的分子，樹突細胞被活化而成熟，提供獲得性免疫的共刺激信號。因此tlr是微生物成分引起樹突細胞活化的橋梁。toll樣受體對獲得性免疫應答類型具有調(diào)控作用。多數(shù)tlrs活化后可以誘導抗微生物防御系統(tǒng)，產(chǎn)生il-1β、il-6和tnf以及趨化型細胞因子，從而調(diào)節(jié)機體th1和th2兩種方面的平衡。

具體地說，tlr3、tlr7/tlr8、tlr9在病毒核酸成份的刺激下，誘導機體產(chǎn)生i型干擾素，后者發(fā)揮抗病毒免疫作用。tlr3受體的配基為dsrna，具體為polyic，tlr7，tlr8的配基為ssrna，tlr9的配基為單鏈dna序列，包含有未甲基化的cpg序列。

tlr3可通過myd88依賴途徑誘導炎癥性細胞因子如il-1、tnf-α、il-6和il-12的表達，參與非特異性抗病毒反應，同時通過myd88非依賴途徑誘導共刺激分子cd80和cd86以及ifn-β、ip-10等抗病毒性細胞因子的表達，參與誘導dc的分化成熟以及抗病毒免疫反應[doylese,o'connellr,vaidyasa,chowek,yeek,chengg.toll-likereceptor3mediatesamorepotentantiviralresponsethantoll-likereceptor4.jimmunol.2003；170(7):3565-71.]。tlr3在樹突狀細胞的某些亞群里表達，如單核細胞來源的樹突狀細胞，和t細胞或自然殺傷細胞，在某些上皮細胞中也有表達，并在頭頸部鱗癌細胞中高表達，tlr3受體在不同細胞中的表達定位不一樣，在人肺上皮細胞，頭頸部鱗癌細胞，dc細胞中的tlr3受體只表達在細胞內(nèi)部，所以它的配體外源性dsrna(polyic)必須內(nèi)在化后才能與toll3受體作用[muziom,bosisiod,polentaruttin,etaljimmunol2000,164(11):5998-6004]。

tlr9是治療病毒感染、癌癥、自身免疫性疾病等的一個有前景的藥物靶點。tlr9存在于溶酶體的能識別細菌和病毒的未甲基化的胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤二核苷酸序列(unmethylatedcpgdinucleotides，cpg—dna)的免疫模式受體(patternrecognitionrecep.tors，prrs)，引起樹突樣細胞(dcs)、巨噬細胞和b淋巴細胞產(chǎn)生早期免疫反應。tlr9相關(guān)cpg序列寡dna分為3種，a型，b型和c型，a型以含有cpg二核苷酸的回文序列為核心，兩端為polyg尾巴，這類cpg能夠通過回文序列和polyg形成高級結(jié)構(gòu)，能夠活化pdc(plasmacytoiddendriticcell,漿細胞樣樹突狀細胞)誘生大量的i型干擾素(ifn-α)，但對b細胞作用較弱。b型cpg-odn以含有tcgtcg和gtcgtt為 特點，對b細胞有很強的免疫刺激活性，但不能活化pdc。c型cpg序列功能處于兩者之間，既能活化pdc又能活化b細胞。

各種各樣的dna和rna，包括天然的或合成的cpg序列，polyic序列，容易在體內(nèi)被各種核酸酶降解，且本身帶有負電荷，難于達到位于細胞內(nèi)的tlr3及tlr9。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種藥物組合物，本發(fā)明經(jīng)過大量試驗發(fā)現(xiàn)，抗菌肽枯草穎肽素具有促進tlr3、tlr9配基免疫刺激功能的作用，包括其抗腫瘤、抗病毒、佐劑和免疫抑制治療方面的功能；抗菌肽枯草穎肽素能和各種核酸序列相作用，包括人工合成任意分子量大小的核酸序列，單鏈核酸或雙鏈核酸，人工合成的無化學修飾的核酸序列(由天然核苷酸組成)，人工合成的包含有非天然核苷酸的核酸序列，包括磷酸酯的硫代修飾，微生物中分離的基因組核酸，質(zhì)粒核酸等，均可促進其免疫調(diào)節(jié)功能，促進其與tlr相互作用(包括促進作用和抑制作用)；應用動物免疫模型對枯草穎肽素樣品進行了免疫學初步評價，發(fā)現(xiàn)實驗樣品枯草穎肽素具有較好的促進cpg序列的免疫調(diào)節(jié)作用。

本發(fā)明的第二目的在于提供所述的藥物組合物的應用，該藥物組合物可以與其他抗腫瘤活性成分、疫苗一起使用，其中，該藥物組合物可以作為佐劑或者佐劑復合物中的成分使用；也可制成食品、飲料和保健品，用以治療癌癥、病毒感染性疾病以及提高免疫力。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

一種藥物組合物，主要由枯草穎肽素和核酸類物質(zhì)組成；

所述枯草穎肽素在所述組合物中的質(zhì)量百分含量為0.01％～98％；

所述枯草穎肽素的結(jié)構(gòu)如下所示：

其中，n為半胱氨酸、絲氨酸、天冬酰胺中的任一種；r為單糖結(jié)構(gòu)或二糖結(jié)構(gòu)；

第1，2，3，5，8，9，10，12，15，17，18，20，21，23，25，26，27，28位的氨基酸分別為gly，ala，ile，leu，val五種脂肪族氨基酸中的任一種。

枯草穎肽素有兩個二硫鍵，擁有一個糖結(jié)構(gòu)的化合物或類似化合物，類似化合物包括非關(guān)鍵氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸的替代、修飾、缺失和增加，以及單糖結(jié)構(gòu)的替代、修飾、缺失和增加，也包括在多肽鏈或糖上耦聯(lián)其它化學結(jié)構(gòu)單元形成的衍生物。

枯草穎肽素在治療病毒性肝炎、保肝護肝具有非常好的效果；具有非常好的調(diào)節(jié)免疫的功能；還可以應用于食品、飲料和保健品中，能很好的增強人體體質(zhì)，提高人體免疫機能；還可以作為佐劑在病毒滅活疫苗、基因重組疫苗、多糖結(jié)合疫苗中應用，很好的增強了各疫苗的免疫作用。本發(fā)明將枯草穎肽素和核酸類物質(zhì)配合使用發(fā)現(xiàn)，枯草穎肽素具有增強核酸類物質(zhì)的活性的特點，兩者相互配合，可以作為治療癌癥、病毒感染性疾病的藥物，以及疫苗佐劑 相關(guān)的藥物，和/或其它藥物、抗原或佐劑復配形成組合物用于治療相關(guān)疾病達到更好的抗腫瘤和增強免疫的作用；并且與核酸類物質(zhì)的配基相比，枯草穎肽素具有毒性小、效果明顯的特點，說明本發(fā)明提供的藥物組合物還具有毒性小、效果明顯的特點。

另外，枯草穎肽素在藥物組合物中的質(zhì)量百分含量可以為0.01～98％中的任意點值。如枯草穎肽素在藥物組合物中的質(zhì)量百分含量可以為0.01％、0.1％、0.5％、1％、5％、10％、20％、50％、60％、70％、90％、98％等等。

進一步地，r為葡萄糖、半乳糖、乳糖中的任一種。

對枯草穎肽素的結(jié)構(gòu)進行舉例說明，其中，第三位為甘氨酸，第22位為半胱氨酸，r為葡萄糖的結(jié)構(gòu)如圖1所示；第三位為丙氨酸，第22位為半胱氨酸，r為葡萄糖的結(jié)構(gòu)如圖2所示；第三位為甘氨酸，第22位為蘇氨酸，r為葡萄糖的結(jié)構(gòu)如圖3所示；第三位為甘氨酸，第22位為天冬酰胺，r為葡萄糖的結(jié)構(gòu)如圖4所示；第三位為甘氨酸，第22位為半胱氨酸，r為乳糖的結(jié)構(gòu)如圖5所示。

進一步地，第37位精氨酸后還包括一個甘氨酸。其中的一種結(jié)構(gòu)如圖6所示。

將枯草穎肽素與核酸類物質(zhì)以一定的比例配合使用，兩者協(xié)同作用增強，達到更好的抗腫瘤和提高免疫活性的作用。優(yōu)選地，所述枯草穎肽素與所述核酸類物質(zhì)的質(zhì)量比為3-8:1。更優(yōu)選地，所述枯草穎肽素與所述核酸類物質(zhì)的質(zhì)量比為4-5:1。

本發(fā)明將枯草穎肽素和核酸類物質(zhì)配合使用發(fā)現(xiàn)，枯草穎肽素具有促進tlr配基核酸作用強度的特點，與其它化學修飾的tlr3和tlr9配基相比，枯草穎肽素具有毒性小、效果明顯的特點?？莶莘f肽素和tlr9配基cpg序列作用，形成免疫復合物，促進cpg 序列原有刺激功能的提高，該發(fā)明通過動物實驗證實了枯草穎肽素與核酸復合制成的佐劑可作為粘膜佐劑對流感疫苗、乙肝疫苗、hib結(jié)合疫苗以及肺炎結(jié)合疫苗的注射劑型均有免疫增強作用；通過實驗證明其可以通過增強cpg序列的功能而產(chǎn)生抗腫瘤的作用，抗病毒的作用也由于復合佐劑的添加而增強；通過實驗證實枯草穎肽素與核酸復合制成的佐劑能夠和tlr3激動劑單鏈ic序列相互作用，能夠起到提高其免疫佐劑效果的作用。進一步地，所述核酸類物質(zhì)包括聚肌胞、cpg寡核苷酸、tlr9激動劑單鏈ic序列、tlr9抑制序列中的任一種或多種。

本發(fā)明應用細胞及動物模型對枯草穎肽素樣品體內(nèi)外藥效學初步評價，發(fā)現(xiàn)實驗樣品枯草穎肽素具有較好的促進tlr3和tlr9配體活性的功能，其具體序列包括但不僅包括：cpg寡核苷酸：如seqidno.1所示的核酸序列cpg2006、如seqidno.2所示的核酸序列cpg2007、如seqidno.3所示的核酸序列cpg2135、如seqidno.4所示的核酸序列cpg2142、如seqidno.5所示的核酸序列cpg2216、如seqidno.6所示的核酸序列cpg1826、如seqidno.7所示的核酸序列cpg10104、如seqidno.8所示的核酸序列cpgsd-101以及如seqidno.9所示的核酸序列cpg序列m362；

如seqidno.10所示的tlr9激動劑單鏈ic序列，如seqidno.11所示的tlr9抑制序列。

本發(fā)明還提供了所述的藥物組合物在制備治療腫瘤的藥物中的應用。

枯草穎肽素和核酸類物質(zhì)配合使用具有一定的抗腫瘤效果，但與抗腫瘤活性成分配合使用效果更佳。進一步地，所述藥物組合物 還包括抗腫瘤活性成分。即所述治療腫瘤的藥物包括枯草穎肽素、核酸類物質(zhì)和抗腫瘤活性成分。其中，抗腫瘤活性成分的使用量按照正常的使用量、或者減量或者遵醫(yī)囑托使用即可，而枯草穎肽素和核酸類物質(zhì)則作為佐劑使用，使用量按照現(xiàn)有的佐劑的規(guī)定使用量使用即可，一般在動物中的使用量為0.1-1mg/kg，如在小鼠中的使用量一般為1mg/kg，在大鼠和禽類中的使用量為0.1mg/kg。

腫瘤的治療方法，包括給予受試者有效量的抗腫瘤活性成分以及枯草穎肽素和核酸類物質(zhì)。

給藥方式可以為口服、靜脈注射或者是透皮滲透方式，施加于需要治療的患者，具體可根據(jù)病人的病情、年齡等，由醫(yī)師決定。

根據(jù)臨床的要求，藥物組合物可制成各種劑型。進一步地，所述藥物還包括藥學上可接受的輔料。

進一步地，所述藥學可接受的輔料包括稀釋劑、賦形劑、崩解劑、填充劑、粘合劑、潤滑劑、矯味劑、表面活化劑、穩(wěn)定劑中的任一種或多種組合。

進一步地，所述藥物的劑型包括注射劑、針劑、片劑、沖劑、顆粒劑、丸劑、膠囊劑中的任一種。

本發(fā)明提供的藥物組合物的劑型按照本領域的常規(guī)方法制備即可。

進一步地，所述腫瘤為黑色素瘤、結(jié)腸癌及肺癌中的任一種。

如本發(fā)明提供的藥物組合物用于治療黑色素瘤，藥物組合物還包括治療黑色素瘤的活性成分，如順鉑；如本發(fā)明提供的藥物組合物用于治療結(jié)腸癌，藥物組合物還包括治療結(jié)腸癌的活性成分，如阿霉素；如本發(fā)明提供的藥物組合物用于治療肺癌，藥物組合物還包括治療肺癌的活性成分，如環(huán)磷酰胺。

本發(fā)明還提供了所述的藥物組合物作為疫苗佐劑的應用。該藥物組合物可作為佐劑或佐劑復合物的成分在各種疫苗如病毒滅活疫苗、基因重組疫苗、多糖結(jié)合疫苗中使用。

疫苗佐劑分為粘膜免疫佐劑和注射用佐劑。本發(fā)明提供的藥物組合物作為粘膜佐劑和注射用佐劑使用，均具有促進流感病毒、重組乙肝病毒等病毒類疫苗的注射免疫效果以及促進肺炎結(jié)合疫苗、b型流感嗜血桿菌等多糖結(jié)合疫苗的注射免疫效果。

進一步地，所述疫苗為流感疫苗、乙肝疫苗、hib結(jié)合疫苗以及肺炎結(jié)合疫苗中的任一種。

其中，疫苗的使用量按照正常的使用量、或者減量或者遵醫(yī)囑托使用即可，而枯草穎肽素和核酸類物質(zhì)則作為佐劑使用，使用量按照現(xiàn)有的佐劑的規(guī)定使用量使用即可，一般在動物中的使用量為0.1-1mg/kg，如在小鼠中的使用量一般為1mg/kg，在大鼠和禽類中的使用量為0.1mg/kg。

本發(fā)明提供的藥物組合物還可以用于制備治療免疫缺陷性疾病的藥物，或與其它藥物復配用于治療免疫缺陷疾病的組合物。

本發(fā)明還提供了所述的藥物組合物在食品、飲料和保健品中的應用。即本發(fā)明提供的藥物組合物可以添加到面粉中做成各種糕點或面食，或是制成其他的食品；也可以添加各種飲品中制成各種飲料；也可以通過添加一些輔料單獨制成保健品，也可以與其他具有保健作用的材料混合一起制成保健品。食用添加有本發(fā)明提供的藥物組合物的食品、飲料和保健品，能很好的增強人體體質(zhì)，提高人體免疫機能。

優(yōu)選地，所述枯草穎肽素的純度大于等于98％。比如枯草穎肽素的純度可以為98％、98.5％、99％、99.5％、99.8％、99.9％等等。該純度的枯草穎肽素含有的雜質(zhì)少，藥效好。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

(1)本發(fā)明提供了枯草穎肽素和核酸類物質(zhì)配合使用，達到更好的抗腫瘤以及提高免疫力的功效。

(2)本發(fā)明還提供了藥物組合物中枯草穎肽素和核酸類物質(zhì)的配比關(guān)系，以達到更好的抗腫瘤和提高免疫活性的作用。

(3)本發(fā)明還提供了核酸類物質(zhì)的種類，經(jīng)試驗驗證，均達到了更顯著的抗腫瘤和提高免疫活性的效果。

(4)本發(fā)明還提供了枯草穎肽素和核酸類物質(zhì)組成的組合物在抗腫瘤藥物以及作為疫苗佐劑方面的應用。

(5)本發(fā)明提供的藥物組合物還可以應用于食品、飲料和保健品中，能很好的增強人體體質(zhì)，提高人體免疫機能。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，以下將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1為本發(fā)明提供的一種枯草穎肽素的結(jié)構(gòu)圖；

圖2為本發(fā)明提供的另一種枯草穎肽素的結(jié)構(gòu)圖；

圖3為本發(fā)明提供的另一種枯草穎肽素的結(jié)構(gòu)圖；

圖4為本發(fā)明提供的另一種枯草穎肽素的結(jié)構(gòu)圖；

圖5為本發(fā)明提供的另一種枯草穎肽素的結(jié)構(gòu)圖；

圖6為本發(fā)明提供的另一種枯草穎肽素的結(jié)構(gòu)圖；

圖7為本發(fā)明實施例1制得的枯草穎肽素純品hplc色譜圖；

圖8為本發(fā)明實施例1制得的枯草穎肽素純品質(zhì)譜圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實施例1

樣品枯草穎肽素的純化實驗及純度檢測

1.1發(fā)酵液的制備

菌種為枯草芽孢桿菌b.subtiliscvcc20076，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；將接種于固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至菌苔鋪滿培養(yǎng)基表面為第1代；刮取菌苔接種至液體培養(yǎng)基中，搖床振蕩培養(yǎng)至菌液為第2代；將其接種至種子罐，攪拌培養(yǎng)至生產(chǎn)用種子為第3代，將生產(chǎn)用種子接種至培養(yǎng)罐，攪拌培養(yǎng)收獲發(fā)酵液200l。

1.2純化步驟及結(jié)果

離心并過濾：將發(fā)酵液在4℃下置于離心機上離心，10000r/min離心15min，獲得上清液，棄除沉淀。

陰離子交換層析：將上清液用0.45μm陶瓷濾芯過濾以去除芽孢，得到濾液；然后濾液經(jīng)20mmol/ltris-hcl，ph9.0緩沖液平衡好的陰離子層析柱(16×300mm)層析，收集穿透峰，得到樣品溶液。

疏水層析：疏水層析柱(16×300mm)用20mmol/ltris-hcl、1mol/l(nh4)2so4，ph8.0的緩沖液平衡。樣品溶液中先加硫酸銨至濃度為1mol/l，上樣后先用平衡緩沖液洗脫未吸附蛋白，洗至基線后，再分別用含0.9、0.6、0.3、0.1、0mol/l的(nh4)2so4的20mmol/l tris-hcl，ph8.0的緩沖液梯度洗脫，流速為2ml/min。收集活性部分，超濾濃縮。

陽離子交換層析：陽離子交換柱(16×300mm)用20mmol/ltris-hcl，ph7.6的緩沖液平衡。上樣后先用平衡緩沖液洗脫未吸附蛋白，洗至基線后再用不同nacl濃度的20mmol/ltris-hcl，ph7.6緩沖液梯度洗脫，流速3ml/min，收集活性部分，得到收獲液。

超濾、除菌、凍干并進行純度檢測：將收獲液用1kd膜包超濾，使用10倍注射用水換液，之后用0.2μm孔徑的除菌濾膜進行除菌過濾并進行凍干處理，得到枯草穎肽素純化純品。

將純化純品經(jīng)lc-ms檢測，具體實驗條件如下所示，層析柱：agilenteclipseplusc18rrhd1.8μm，2.1*150mm；柱溫：60℃，檢測波長215nm，流動相a：0.1％甲酸水溶液，流動相b：0.085％甲酸+20％水+80％乙腈。得到枯草穎肽素的hplc色譜圖和枯草穎肽素的質(zhì)譜圖，分別如圖1和圖2所示。

從圖1可以看出，枯草穎肽素的純化純品經(jīng)lc-ms檢測達到99％以上。圖8得到的圖譜鑒定得到枯草穎肽素的結(jié)構(gòu)如圖1所示。

實施例2

枯草穎肽素和核酸類物質(zhì)共同作用體內(nèi)抗腫瘤活性實驗

2.1實驗儀器及實驗動物

電子天平(上海精密科學儀器，ja1003n)、小鼠秤(上海友聲衡器有限公司，asc-a)、血細胞分析儀(bt2000-plus)、小鼠灌胃管等。

c57bl/6，balb/c小鼠，全雌；等級spf級；周齡：5-7周；體重：實驗開始時體重均數(shù)18.0～25.0g；來源于上海斯萊克實驗動物有限責任公司(slac)。

2.2實驗動物的分組及模型建立

首先根據(jù)體重隨機分為模型對照組、陽性藥組、枯草穎肽素組、核酸組、枯草穎肽素核酸復合配方組、聯(lián)合給藥組，每組8只。

模型建立：取各種腫瘤細胞用生理鹽水1：3稀釋制成細胞懸液，分別取生長良好的b16-f10黑色素瘤細胞懸液接種于c57bl/6雌性小鼠、ct-26結(jié)腸癌細胞懸液接種于balb/c雌性小鼠及l(fā)lc1肺癌細胞懸液接種于c57bl/6雌性小鼠，接種方式為小鼠右腋皮下0.2ml，接種量為：含瘤細胞2×10⁶。

2.3給藥劑量

模型對照組：生理鹽水，給藥容積為0.1ml·10g^-1d^-1；

陽性藥組：

順鉑(5mg·kg^-1·d^-1)；環(huán)磷酰胺(5mg·kg^-1·d^-1)；阿霉素(2mg·kg^-1·d^-1)；

枯草穎肽素組(gl-01)：10mg·kg^-1·每次；核酸組：均2.5mg·kg^-1·每次，分別使用兩種核酸：cpg2006和cpg1826；

枯草穎肽素核酸復合配方組：枯草穎肽素和兩種核酸聯(lián)合使用，枯草穎肽素和核酸按照5:1的比例混合，所用劑量與單獨用枯草穎肽素組和核酸組相同；

聯(lián)合給藥組：與陽性藥組等劑量陽性藥+枯草穎肽素核酸復合配方組劑量相同，每周稱兩次體重，給藥量根據(jù)最新體重計算。

2.4用藥期限

b16-f10黑色素瘤、ct-26結(jié)腸癌及l(fā)lc1肺癌接種0天后給藥，每種腫瘤均給藥15天。

2.5給藥頻率

陽性藥每天給藥一次，為腹腔給藥；核酸、枯草穎肽素、復合配方組及聯(lián)合給藥組中的核酸及枯草穎肽素每三天給藥一次，為皮下給藥。

2.6檢測指標：小鼠體重，稱瘤重，計算抑瘤率，抑瘤率計算公式為：(模型對照組腫瘤重量-實驗組腫瘤重量)/模型對照組腫瘤重量×100％。

2.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理方法：數(shù)據(jù)使用表示，數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(one-wayanova法檢驗)，組間用lsd法兩兩比較，檢驗水準α＝0.05。具體結(jié)果如表1-3所示。

表1b16-f10各組小鼠瘤重及抑瘤率(n＝6)

表2ct-26各組小鼠瘤重及抑瘤率(n＝6)

表33ll組小鼠瘤重及抑瘤率(n＝6)

從表1的b16-f10荷瘤小鼠中可以看出，枯草穎肽素核酸復合配方組和聯(lián)合給藥組的抑瘤效果明顯高于各個單獨用藥組，說明聯(lián)合用藥有更大的優(yōu)勢。同樣地，從表2的ct-26荷瘤小鼠中可以看 出，枯草穎肽素核酸復合配方組和聯(lián)合給藥組的抑瘤效果明顯高于各個單獨用藥組，說明聯(lián)合用藥有更大的優(yōu)勢。同樣地，從表3的3ll荷瘤小鼠中可以看出，枯草穎肽素核酸復合配方組和聯(lián)合給藥組的抑瘤效果明顯高于各個單獨用藥組，說明聯(lián)合用藥有更大的優(yōu)勢。因此，從表1-3可以看出，在所有的荷瘤小鼠模型中，抗菌肽均能促進核酸的抑瘤作用，并且添加現(xiàn)有的陽性藥物抑瘤效果更佳。

實施例3

枯草穎肽素和核酸類物質(zhì)共同作為疫苗佐劑在重組乙肝疫苗方面的應用

3.1材料

重組酵母乙肝疫苗，深圳康泰，批號c201301003；小鼠乙肝病毒抗體(hbvab)elisa檢測試劑盒。

3.2實驗動物

清潔級balb/c小鼠，雌性小鼠，6-8周齡，體重18-22g。

3.3主要試劑

枯草穎肽素、cpg2006、聚肌胞(購自杭州美亞藥業(yè)有限公司)。

3.4動物分組及免疫檢測

小鼠隨機分為6組，每組10只，分組情況如下：1.生理鹽水對照；2.重組hbsag蛋白疫苗；3.重組hbsag蛋白疫苗60μg+cpg2006(5μg)；4.重組hbsag蛋白疫苗60μg+聚肌胞(5μg)；5.重組hbsag蛋白疫苗60μg+枯草穎肽素(25μg)；6.重組hbsag蛋白疫苗60μg+cpg2006(5μg)+枯草穎肽素(25μg)；7.重組hbsag蛋白疫苗60μg+聚肌胞(5μg)+枯草穎肽素(25μg)；8.重組hbsag蛋白疫苗60μg+cpg2006(5μg)+聚肌胞(5μg)+枯草穎肽素(25μg)。其中各組的有效成分標注用量為1劑用量，每次注射1劑。接種途徑：由 左后肢腓腸肌或脛前肌注射，每只免疫200μl。第0天、14天和21天各免疫一次，末次免疫后1周尾靜脈采血分離血清，應用酶聯(lián)免疫吸附試驗(elisa)試劑盒進行乙型肝炎病毒表面抗體(hbsab)檢測，并解剖小鼠，分離出血清，進行酶聯(lián)免疫吸附試驗(elisa)，具體按照試劑盒說明書操作進行。

elisa法定量檢測免疫后小鼠血清中hbsigg抗體的含量，結(jié)果如表4所示。

表4分組情況及檢測結(jié)果

從表4可以看出，枯草穎肽素能夠顯著促進核酸類物質(zhì)作為佐劑的免疫增強效果。

實施例4

枯草穎肽素和核酸類物質(zhì)聯(lián)用對禽流感疫苗的免疫增強作用

4.1材料

4.1.1疫苗：h9亞型禽流感病毒滅活疫苗

4.1.2實驗動物：15日齡海蘭褐小公雞210只。

4.1.3主要試劑：枯草穎肽素、cpg2006、聚肌胞和滅活禽流感h9抗原。

4.2動物分組及免疫檢測

15日齡海蘭褐小公雞210只隨機分為6組，每組35只，按常規(guī)方法飼養(yǎng)。28日齡時，進行以下處理：1.生理鹽水對照；2.重組禽流感滅活疫苗；3.重組禽流感滅活疫苗0.5ml+cpg2006(5μg)；4.重組禽流感滅活疫苗0.5ml+枯草穎肽素(25μg)；5.重組禽流感滅活疫苗0.5ml+cpg2006(5μg)+枯草穎肽素(25μg)；6.重組禽流感滅活疫苗0.5ml+聚肌胞(5μg)+枯草穎肽素(25μg)；7.重組禽流感滅活疫苗0.5ml+聚肌胞(5μg)+枯草穎肽素(25μg)；8.重組禽流感滅活疫苗0.5ml+cpg2006(5μg)+聚肌胞(5μg)+枯草穎肽素(25μg)。其中各組的有效成分標注用量為1劑用量，每次注射1劑，共免疫一次。

免疫后第三周翅靜脈采血分離血清進行抗體滴度檢測，具體步驟如下：

用微量血凝與血凝抑制法，在微量血凝板上倍比稀釋病毒液，加入等量的1％紅細胞，以紅細胞凝集50％的最高稀釋度，作為判斷血凝價的終點；

計算4單位抗原稀釋倍數(shù)，將病毒液稀釋為4單位血凝價；

待檢血清在微量血凝板上作倍比稀釋，每孔加入等量含4單位血凝價的病毒液，震蕩混勻并靜置3-5分鐘后，每孔加入等量1％紅 細胞懸液，震蕩混勻，室溫放置30min左右觀察結(jié)果。以完全抑制紅細胞凝集的血清稀釋度作為判斷終點。

具體的分組情況以及測定的滴度結(jié)果見表5。

表5分組狀況和滴度結(jié)果

從表5可以看出，枯草穎肽素能夠顯著促進核酸類物質(zhì)作為佐劑的免疫增強效果。

實施例5

抗菌肽作為6b型肺炎結(jié)合疫苗注射劑型的免疫增強作用

5.1材料

5.1.1疫苗：6b型肺炎鏈球菌多糖結(jié)合疫苗。

5.1.2實驗動物：清潔級sd雌性大鼠，5-7周齡，體重150-250g。

5.1.3主要試劑：枯草穎肽素佐劑和磷酸鋁佐劑(濃度均為1mg/ml)。

5.2動物分組及免疫檢測

大鼠隨機分為3組，每組10只，分組情況如下：1.生理鹽水組；2.6b型肺炎結(jié)合疫苗(15μg)；3.6b型肺炎結(jié)合疫苗15μg+cpg2006(5μg)；4.6b型肺炎結(jié)合疫苗15μg+聚肌胞(5μg)；5.6b型肺炎結(jié)合疫苗(15μg)+枯草穎肽素(25μg)；6.6b型肺炎結(jié)合疫苗(15μg+cpg2006(5μg)+枯草穎肽素(25μg)；7.6b型肺炎結(jié)合疫苗(15μg)+聚肌胞(5μg)+枯草穎肽素(25μg)；8.6b型肺炎結(jié)合疫苗(15μg)+cpg2006(5μg)+聚肌胞(5μg)+枯草穎肽素(25μg)。其中各組的有效成分標注用量為1劑用量，每次注射1劑。分別于0天和7天腹腔注射免疫2次，21天采血，收集血清，用elisa方法檢測小鼠血清中的抗肺炎球菌莢膜多糖igg抗體效價。

分組情況以及抗肺炎球菌莢膜多糖igg抗體效價結(jié)果如表6所示。

表6不同組別抗肺炎小鼠球菌莢膜多糖igg抗體效價結(jié)果

從表6可以看出，枯草穎肽素能夠顯著促進核酸類物質(zhì)作為佐劑的免疫增強效果。

實施例6

枯草穎肽素體內(nèi)抗dhbv活性研究

6.1實驗藥物：枯草穎肽素；拉米夫定(3tc)：購于葛蘭素史。克制藥(蘇州)有限公司。

6.2實驗動物：1日齡河南省櫻桃谷鴨，雌雄不拘，體重50±5g。

6.3櫻桃谷鴨感染dhbv動物模型的建立

1-3日齡櫻桃谷鴨100只，通過普通pcr方法篩選出先天dhbv陰性，選擇體況良好基本一致的櫻桃谷鴨供實驗用。

選用3日齡體況良好的陰性鴨90只經(jīng)脛靜脈注射dhbv陽性鴨血清0.2ml(srivastavetal.,2010)。感染后7天經(jīng)脛靜脈采血，分離血清，pcr方法篩選dhbv陽性鴨用于實驗。

6.4動物的分組與給藥

取dhbv陽性鴨80只，隨機分為5組，每組16只。分別為：1.生理鹽水組；2.拉米夫定組(5mg/kg/d)；3.cpg2216(50μg)組；4.聚肌胞(50μg)組；5.枯草穎肽素(250μg)組；6.cpg2216(50μg)+枯 草穎肽素(250μg)復合免疫增加劑組；7.枯草穎肽素(250μg)+聚肌胞(50μg)復合免疫增強劑組；8.cpg2216(50μg)+聚肌胞(50μg)+枯草穎肽素(250μg)復合免疫增強劑組。其中各組的有效成分標注用量為1劑用量，每次注射1劑。

以上各組均在相同飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)，試驗所有給藥組按照各組劑量每天同一時間于飼喂前根據(jù)體重，拉米夫定經(jīng)口腔灌服給藥，其它經(jīng)肌肉注射給藥，共給藥15天。分組情況如表7所示。

表7實驗分組情況

在用藥第5天(t5)，用藥第10天(t10)，用藥第15天(t15)和停藥后第3天(p3)，以無菌操作方法從頸靜脈采血，每次每組各采4只；分離血清，將血清置于-70℃待檢。用已建立的sybrgreenⅰ熒光定量pcr檢測dhbv方法檢測各樣品dhbvdna含量，用已建立的elisa方法檢測血清中dhbsag含量。

根據(jù)公式計算每組鴨用藥后不同時間(t5、t10、t15、p3)血清和肝臟中dhbvdna的抑制率和拷貝數(shù)，比較各組鴨血清dhbvdna的動態(tài)變化，結(jié)果如表8所示。同時檢測樣品在用藥各個時期血清中dhbsag滴度變化，結(jié)果如表9所示。

表8各實驗組鴨不同時間血清中dhbv-dna抑制效果

和對照組相比，*p<0.05，**p<0.01

表9各實驗組鴨不同時間血清中dhbsag抑制效果

采用fq-pcr方法檢測各個時間段每組鴨血清中dhbvdna含量，結(jié)果如表8顯示：模型組鴨血清中dhbvdna含量水平較高，各用藥組和模型組相比dhbvdna含量均有下降，其中cpg2216(50μg)+聚肌胞(50μg)+枯草穎肽素(250μg)復合免疫增強劑組組鴨dhbvdna水平顯著降低。

采用elisa方法檢測各個時間段每組鴨血清中dhbsag含量，結(jié)果如表9顯示：模型組鴨血清中dhbsag含量水平較高，各用藥組和模型組相比dhbsag含量均有下降，其中cpg2216(50μg)+聚肌胞(50μg)+枯草穎肽素(250μg)復合免疫增強劑組鴨dhbsag水平顯著降低。

本發(fā)明還將枯草穎肽素與其他cpg寡核苷酸如cpg2007、cpg2135、cpg2142、cpg2216、cpg10104、cpgsd-101、cpg序列m362以及tlr9激動劑單鏈ic序列和tlr9抑制序列進行配合使用，特別是與相應的抗腫瘤活性成分或者相應的疫苗配合使用，達到了非常好的抗腫瘤、增強免疫活性的功效。

此外，本發(fā)明還將實施例1中得到的枯草穎肽素結(jié)構(gòu)進行了改進，采用fmoc固相合成法合成了如圖1-6所示的結(jié)構(gòu)以及將圖1中的葡萄糖替換為半乳糖，同時進行了如實施例2-6的驗證，結(jié)果同實施例1中得到的枯草穎肽素的效果一致。

進一步地，本發(fā)明采用fmoc固相合成法還合成了如下結(jié)構(gòu)：將圖1中的第1，2，3，5，8，9，10，12，15，17，18，20，21，23，25，26，27，28位的氨基酸替代為gly，ala，ile，leu，val五種脂肪族氨基酸中的任一種得到的枯草穎肽素結(jié)構(gòu)，同時進行了如實施例2-6的驗證，結(jié)果同實施例1中得到的枯草穎肽素的效果一致。

另外，本發(fā)明還將實施例2-6中的枯草穎肽素與所述核酸類物質(zhì)的質(zhì)量比替換為3:1、4:1、6:1、、8:1等等，其中仍以5:1效果更佳，其他結(jié)果比5:1略差。

盡管已用具體實施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應意識到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。