本發(fā)明涉及分子生物學和生物醫(yī)藥領域，具體地說，涉及metrnl蛋白或基因以及它們的調節(jié)劑在防治膿毒血癥方面的應用。

背景技術：

metrnl蛋白共由311個氨基酸組成，由metrnl基因編碼，大小為30kda左右。人metrnl蛋白的氨基酸序列見np_001004431.1。

中國專利申請cn200980137344.4，發(fā)明名稱為“生長因子metrnl的治療用途”，申請公布號：cn102164611a，公開了metrnl是一種具有神經(jīng)元保護和/或神經(jīng)發(fā)生作用的神經(jīng)生存和生長因子，可用于治療神經(jīng)系統(tǒng)的疾病、疾患或損害；中國專利zl201310525184.9，公開了metrnl蛋白在制備降血糖藥物或保健食品中的應用；中國專利zl201310525181.5，公開了metrnl蛋白在制備降血脂藥物或保健食品中的應用。

然而，關于metrnl在膿毒血癥治療和/或預防方面的作用目前還未見任何報道。

膿毒血癥是由病原微生物侵入血液后，在其中大量繁殖，引起的全身炎癥反應綜合征，由于宿主對感染反應失調，導致致命性器官功能衰竭的綜合征。當循環(huán)系統(tǒng)出現(xiàn)急性衰竭時，稱為感染性/中毒性/膿毒癥休克。膿毒血癥病情兇險，病死率高，也是嚴重創(chuàng)傷、燒傷、中暑、休克、大手術后等常見并發(fā)癥，是導致重癥患者死亡的主要原因之一。然而，近二十年醫(yī)療技術的發(fā)展未能對膿毒血癥產(chǎn)生新的特異性治療方法，也沒有獲得實質性進展。發(fā)展新的預防和治療膿毒血癥藥物以及新的生物標志物，一直是藥物開發(fā)和臨床診斷中的熱點和重點。

目前國內(nèi)外尚無有關metrnl蛋白在防治膿毒血癥方面的文獻報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中的不足，提供metrnl蛋白或基因的一種新用途。

在本發(fā)明的第一方面，提供了metrnl蛋白或基因或它們的增效劑在制備防治膿毒血癥的藥物中的應用。

作為一種優(yōu)選實施方式，所述的增效劑可選自激動劑、上調劑或穩(wěn)定劑等。

在本發(fā)明的第二方面，提供了metrnl蛋白或基因作為膿毒血癥生物標志物中的應用。

在本發(fā)明的第三方面，提供了檢測血清中metrnl蛋白水平的試劑在制備膿毒血癥診斷試劑中的應用。

在本發(fā)明的第四方面，提供了一種篩選防治膿毒血癥的潛在物質的方法，包括以下步驟：

a)將候選物質與含有metrnl蛋白或基因的體系接觸；

b)觀察候選物質對于metrnl蛋白或基因表達及活性的影響，其中，若所述候選物質能夠促進metrnl基因表達或提高metrnl蛋白活性，則所述候選物質是防治膿毒血癥的潛在物質。

本發(fā)明優(yōu)點在于：本發(fā)明通過給予內(nèi)毒素誘導膿毒血癥小鼠模型，發(fā)現(xiàn)膿毒血癥動物血液中的metrnl水平升高；采用metrnl基因敲除小鼠，內(nèi)毒素或盲腸結扎穿孔術誘導膿毒血癥模型，檢測模型動物死亡率，證明了metrnl能降低膿毒血癥死亡率，提高存活率。以上結果表明metrnl蛋白可作為膿毒血癥新的生物標志物用于早期診斷，并可作為防治膿毒血癥新的更有效的藥物和/或靶點。本發(fā)明為膿毒血癥的診斷和防治提供了一種新方法，且由于metrnl蛋白本身是一種人體的內(nèi)源性蛋白質，其對人體可能的副作用很小，因此作為潛在藥物的安全性很高。

附圖說明

圖1.腹腔注射內(nèi)毒素lps升高了血清metrnl蛋白的濃度(每點小鼠n＝4-5)。*表示metrnl蛋白的血液濃度與溶劑對照相比，有顯著統(tǒng)計學差異(p<0.05)；**表示metrnl蛋白的血液濃度與溶劑對照相比，有非常顯著的統(tǒng)計學差異(p<0.01)。

圖2.注射內(nèi)毒素lps后metrnl全身敲除小鼠的存活率降低(每組小鼠n＝9-10)。

圖3.盲腸結扎穿孔術后metrnl全身敲除小鼠的存活率降低(每組小鼠n＝10)。

具體實施方式

metrnl蛋白及基因

本文中，術語“metrnl蛋白”等同于“metrnl多肽”，二者可互換使用。

本文中，所用的metrnl蛋白可以是天然存在的，比如其可被分離純化自哺 乳動物。此外，所述metrnl蛋白也可以是人工制備的，比如根據(jù)常規(guī)基因工程技術來制備得到。任何合適的metrnl蛋白均可適用于本發(fā)明。所述metrnl蛋白包括全長的metrnl蛋白或其生物活性片段。作為一種具體實施方式，所述metrnl蛋白可以是一種人metrnl蛋白，大小為30kda，氨基酸序列見np_001004431.1。

經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的metrnl蛋白的氨基酸序列也包括在本發(fā)明中。metrnl蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述氨基酸替代的序列并不影響其活性或保留了其部分活性。適當替換氨基酸是本領域內(nèi)的公知技術，所述技術可以很容易地被實施并且確保不改變已知分子的生物活性。這些技術使本領域人員認識到，一般來說，在一種多肽的非必需氨基酸區(qū)域改變單個氨基酸并不會改變生物活性。

任何一種metrnl蛋白的生物活性片段均可以應用到本發(fā)明中。在這里，metrnl蛋白的生物活性片段的含義是指一種多肽，其仍然能保持全長的metrnl蛋白的全部或部分功能。通常情況下，所述的生物活性片段至少保持50％、60％至99％或者100％的全長metrnl蛋白的活性。

本發(fā)明也可以采用經(jīng)修飾或改良的全部或部分氨基酸的metrnl蛋白，比如，可以為了促進半衰期、有效性、代謝和/或蛋白的效力而加以修飾或改良的metrnl蛋白。所述經(jīng)過修飾或改良的metrnl蛋白可以是一種metrnl蛋白的共軛物，或其可被取代的或人工的氨基酸。所述經(jīng)過修飾或改良的metrnl蛋白或基因可以與天然metrnl蛋白或基因有一定的不同點，但也具有本發(fā)明所述的功能，且不會帶來其它不良反應或毒性。也就是說，任何不影響metrnl蛋白的生物活性或者說是基因的生物學功能的變化形式都可用于本發(fā)明中。

metrnl增效劑及其用途

所述的“metrnl增效劑”包括了激動劑、上調劑、穩(wěn)定劑等，是指任何可提高metrnl的活性、提高metrnl的穩(wěn)定性、上調metrnl的表達、增加metrnl有效作用時間的物質，這些物質均可用于本發(fā)明。它們可以是化合物、化學小分子、生物分子等。所述的生物分子可以是核酸水平(包括dna、rna)的，蛋白水平的，也可以是上調metrnl表達的病毒產(chǎn)品等。

藥物組合物

依據(jù)本發(fā)明的方法，可以制備防治膿毒血癥的藥物組合物，所述的藥物組合物可由藥物活性成分metrnl蛋白或基因或它們的增效劑和藥學上可接受的 載體組成。

所述的藥物組合物可采用醫(yī)學領域常規(guī)的方法，將metrnl蛋白或基因或它們的增效劑作為活性成分，與藥學上可接受的輔料制成各種劑型。當用于腹腔注射時，可將其制備成常規(guī)的固體制劑如片劑、粉劑或膠囊劑等；用于注射時，可將其制備成注射液。在各種制劑中，活性成分的重量含量為0.01％～99.9％。

所述的藥物組合物可以用于治療膿毒血癥?？梢园磩┬屯ㄟ^腹腔注射、皮下注射、靜脈注射、肌肉注射、淋巴結內(nèi)注射、粘膜用藥等途徑應用于需要治療的個體。個體可以是人或動物。

診斷試劑

依據(jù)本發(fā)明的方法，可以通過測定血清中metrnl蛋白含量來診斷膿毒血癥或預后，因此任何可以測定血清中metrnl蛋白含量的試劑均可用作膿毒血癥的診斷試劑。血清中metrnl蛋白含量的測定方法包括紫外分光光度法、凱氏定氮法、雙縮脲法、lowry法、bca法、考馬斯亮藍染色法、銀染法、免疫學方法等。

下面結合附圖對本發(fā)明提供的具體實施方式作詳細說明。本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得或可按文獻方法制備。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。

下列實施例中，正常型小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。野生型小鼠和metrnl全身敲除純合子小鼠為metrnl敲除雜合子的同窩后代(可參考期刊文獻：diabetes2015；64:4011-4022)。

實施例1：metrnl血清水平在內(nèi)毒素誘導的膿毒血癥模型中升高

細菌脂多糖(lps，sigma公司，貨號l2880)腹腔注射12周齡小鼠，劑量為1.3mg/kg，分別在給溶劑對照(生理鹽水)或給lps后0.5、1、2、4、8小時，取血，檢測血清中metrnl蛋白的濃度。血清濃度通過elisa檢測試劑盒(r&dsystems，貨號dy6679)檢測。結果詳見表1與圖1?？梢娔摱狙Y早期metrnl血清水平明顯升高。

表1.lps刺激后metrnl血清濃度的變化

實施例2：metrnl敲除增加lps誘導的膿毒血癥動物模型的死亡率

對約12周齡的正常野生型小鼠和metrnl全身敲除小鼠均使用相同劑量的lps，給藥方法為腹腔注射，具體方法如下：12周齡的野生型小鼠和metrnl全身敲除小鼠，腹腔注射lps，劑量為10mg/kg。隨后監(jiān)測小鼠死亡情況。結果詳見表2與圖2?？梢姼骨蛔⑸鋖ps后metrnl全身敲除小鼠的存活率顯著低于野生型小鼠。

表2.metrnl敲除惡化了lps誘導的膿毒血癥死亡

實施例3：metrnl敲除增加盲腸結扎穿孔術誘導的膿毒血癥動物模型的死亡率

對約12周齡的正常野生型小鼠和metrnl全身敲除小鼠均實施盲腸結扎穿孔術，具體方法如下：在麻醉小鼠的腹壁正中切口，輕輕拉出盲腸，并輕輕地擠壓盲腸上端糞便，使盲腸末梢充盈，分離腸系膜表面血管；用無菌4號絲線在盲瓣與盲腸中點進行結扎，并用21g無菌針頭在結扎部位與盲腸頂端的中點處貫通穿刺盲腸壁，造成穿孔；輕輕擠壓盲腸，擠出少許內(nèi)容物以確保穿孔通暢，將擠出的內(nèi)容物擦凈，然后把盲腸推回腹腔，關閉腹腔，逐層縫合；手術后用生理鹽水進行液體復蘇并應用丁丙諾啡止痛。隨后監(jiān)測小鼠死亡情況。結果詳見表3與圖3?？梢妋etrnl全身敲除小鼠的存活率顯著低于野生型小鼠。

表3.metrnl敲除惡化了盲腸結扎穿孔術誘導的膿毒血癥死亡

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為本發(fā)明的保護范圍。