本發(fā)明屬植物及中藥提取物領(lǐng)域，特別涉及高純度丁香葉總環(huán)烯醚萜苷提取物及其制劑的制備方法及用途。

背景技術(shù)：

細(xì)菌感染性炎癥是一種高發(fā)性、普遍性的疾病，臨床主要采取抗菌消炎的方法進(jìn)行治療。作為治療細(xì)菌感染性疾病主要藥物，抗生素是世界上應(yīng)用最廣、發(fā)展最快、品種最多的一類藥物。調(diào)查結(jié)果顯示，在歐美發(fā)達(dá)國(guó)家，抗生素的使用量大致占到所有藥品的10%左右，而我國(guó)三甲醫(yī)院占到30%，基層醫(yī)院可能高達(dá)50%，由此可見(jiàn)抗生素在我國(guó)的使用頻率非常之高【http://drug.sosyao.com】。然而，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌耐藥性問(wèn)題也日益突出。尤其是醫(yī)生無(wú)指征用藥、用藥時(shí)間長(zhǎng)、選擇抗生素類藥物不合理等，造成細(xì)菌耐藥、多藥耐藥菌、超級(jí)細(xì)菌等現(xiàn)象，引起了醫(yī)學(xué)界的高度關(guān)注。中藥抗菌具有不易產(chǎn)生耐藥性、不良反應(yīng)低、與抗生素聯(lián)用可逆轉(zhuǎn)抗生素耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，從抗細(xì)菌、真菌、支原體、衣原體等方面尋求中藥天然抗生素已成為解決細(xì)菌耐藥的新途徑。因而，開(kāi)發(fā)高效抗菌、毒副作用低的中草藥資源，進(jìn)而研制成抗菌消炎新藥，具有重要意義。

丁香葉foliumsyringae來(lái)源于木犀科(oleaceaceae)丁香屬(syringa)植物紫丁香(syringaoblatelindl)、朝鮮丁香(syringadiatatanakai)、洋丁香（syringavulgarisl.）的干燥葉，味苦，性寒，具有清熱解毒，消炎止痢之功效，已收載于中國(guó)藥典2005年版一部附錄【國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典.一部.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005】。丁香葉在東北地區(qū)分布極廣,易于栽培，資源豐富,是庭院綠化的主要樹(shù)種?，F(xiàn)代藥理研究表明，丁香葉具有廣譜抗菌消炎，抗病毒，保肝利膽，增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫，降溫，降壓，鎮(zhèn)咳祛痰等作用，對(duì)金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、變形桿菌、綠膿桿菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌、甲乙型副傷寒桿菌、鼠傷寒桿菌、食物中毒沙門氏菌等22個(gè)種屬的細(xì)菌均有較強(qiáng)的抗菌作用，經(jīng)臨床觀察，對(duì)314例細(xì)菌性痢疾治愈率為90.5%以上，對(duì)30例西藥抗菌素治療無(wú)效病例有效率為79.0%【陳奇.中成藥名方藥理與臨床.北京：人民衛(wèi)生出版社，1998.；王丹丹，劉盛泉，陳英杰，吳立軍等.紫丁香有效成分的研究.藥學(xué)學(xué)報(bào).1982,17(12):951-954；盧丹，李平亞．丁香屬植物的化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展．長(zhǎng)春中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001,17(4):58-59】。采用丁香葉單方制劑的炎立消片，治療小兒急性感染的400例臨床病例的療效驗(yàn)證，對(duì)于大多數(shù)病毒引起的上呼吸道感染、扁桃體炎、肺炎在使用炎立消片治療后，總有效率可達(dá)100%【白青，梁偉．炎立消片治療小兒急性感染400例療效觀察及臨床對(duì)照．中華醫(yī)學(xué)寫(xiě)作雜志，2005,12(1):32-33】。另有報(bào)道證實(shí)，丁香葉提取物對(duì)單純皰疹病毒、腺病毒(afv3、afv7)、副流感病毒、呼吸道合胞病毒(rsv)、柯薩基病毒(coxb1、coxb2、coxb3、coxb4、coxb5、coxb6)和乙肝病毒所致細(xì)胞病變有有明顯抑制作用，且與抗生素和抗病毒藥物相比較，療效有顯著差異，進(jìn)而證明了丁香葉的抗菌、抗病毒作用確切可靠【楊唯唯，邢美玉．紫丁香葉制劑對(duì)單皰病毒性角膜炎治療前后的免疫學(xué)測(cè)定．實(shí)用眼科雜志，1990,8(4):225-226；李博，朱俊訪.丁香葉中所含有效成份的種類及藥理作用研究進(jìn)展.黑龍江醫(yī)藥，2009,22(4):510-511；高士奇，牛俊奇，王峰等．紫丁香葉提取物及干擾素、肝炎靈抗乙型肝炎的比較研究．細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2003,19(4):385-386】。

中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)第九冊(cè)第100頁(yè)和第二十冊(cè)第176頁(yè)，分別收載了以丁香葉為原料生產(chǎn)的炎立消片劑和炎立消膠囊劑兩種劑型【衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn).第九冊(cè).北京：人民衛(wèi)生出版社，1990；衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn).第二十冊(cè).北京：人民衛(wèi)生出版社，1990】，臨床上用于治療上呼吸道感染、急慢性支氣管炎、細(xì)菌性痢疾、急性腸胃炎、急性黃疸性肝炎、急性乳腺炎等感染性疾病，均收到較好的療效【朱友呂，主編．東北藥用植物志．黑龍江科技出版社，1989,4(1):883；xinliu,jianmingwang.anti-inflammatoryeffectsofiridoidglycosidespurifiedfromfoliumsyringaeleavesontnbs-inducedcolitisinrats.journalofethnopharmacology2011,133(2):780-787；xinliu,jianmingwang.iridoidglycosidesoffoliumsyringaeleavesmodulatesnf-κbsignalpathwayandintestinalepithelialcellsapoptosisinexperimentalcolitis.plosone.2011,6(9):e24740,1-12】，新劑型腸溶微丸和結(jié)腸定位制劑對(duì)腸道感染性疾病有良好療效【劉欣，周長(zhǎng)新.一種丁香葉總環(huán)烯醚萜苷的制備方法及用途，中國(guó)，zl200910100317.1，2011年12月21日；劉欣．博士研究論文，炎立消結(jié)腸定位包衣片的制備和作用機(jī)理研究．哈爾濱：黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)．2008】?；瘜W(xué)研究證明，三種丁香葉有效部位的化學(xué)成分基本相同，主要為環(huán)烯醚萜苷類和酚酸類成分，其中含量最大的環(huán)烯醚萜苷類成分是丁香葉抗菌消炎、抗病毒的主要有效部位【xinliu,jianmingwang,changxinzhou,lishegan.preparativeseparationandenrichmentofsyringopicrosidefromfoliumsyringaeleaveswithmacroporousresins.journalofbiomedicineandbiotechnology.2010,articleid572570,doi:10.1155/2010/572570】。丁香葉總環(huán)烯醚萜苷治療細(xì)菌性感染性疾病，療效確切，奏效快，療程相對(duì)較短，無(wú)任何毒副作用，是一種理想的廣譜抗菌消炎藥，在新藥開(kāi)發(fā)方面具有極高的實(shí)用價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種利用動(dòng)態(tài)超聲逆流提取或加熱回流提取，結(jié)合大孔吸附樹(shù)脂柱層析、動(dòng)態(tài)軸向壓縮工業(yè)色譜或高速逆流色譜分離制備高純度丁香葉總環(huán)烯醚萜苷提取物的方法，該工藝過(guò)程簡(jiǎn)單，質(zhì)量可控。用這種方法制備出的高純度丁香葉總環(huán)烯醚萜苷，可通過(guò)添加藥用輔料制成醫(yī)學(xué)上可接受的各種劑型，用于臨床治療上呼吸道感染、急慢性支氣管炎、細(xì)菌性痢疾、急性腸胃炎、急性黃疸性肝炎、急性乳腺炎等感染性疾病。

本發(fā)明方法通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)：將丁香葉粉碎至10～20目，加6～20倍體積水或體積百分比濃度為10%～80%的醇溶液，或丙酮溶液，或異丙醇溶液，動(dòng)態(tài)超聲逆流提取或加熱回流提取2～3次，每次0.5～2h，過(guò)濾，合并提取液，減壓回收提取溶劑，適當(dāng)濃縮至濃度為0.4～2.0g生藥/ml，離心或過(guò)濾后，加稀鹽酸調(diào)節(jié)ph至2.0～6.0得上柱溶液，上柱溶液以2bv/h～4bv/h的流速通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂層析柱，上柱溶液按照固形物與干樹(shù)脂的比例為1：5～10，先用4～6bv的蒸餾水洗滌樹(shù)脂柱床，洗脫流速為2bv/h～4bv/h，棄去水洗脫液；再用體積百分比濃度為10%～80%的醇洗脫劑洗脫，洗脫流速為2bv/h～4bv/h，合并洗脫液減壓回收醇，減壓濃縮至相對(duì)密度為1.05～1.30，加入200～300目的柱層析硅膠填料，加甲醇拌勻后烘干，過(guò)動(dòng)態(tài)軸向壓縮反向工業(yè)制備色譜柱，二氯甲烷-甲醇、氯仿-甲醇或甲醇-水(20：1～10：1)為流動(dòng)相梯度洗脫，分別收集含丁香葉總環(huán)烯醚萜苷類成分的主段洗脫液，合并，減壓濃縮，過(guò)濾，減壓回收溶劑，冷凍干燥、噴霧干燥或減壓干燥，即得高純度丁香葉總環(huán)烯醚萜苷（hplc檢測(cè)純度≥80%）。

或取丁香葉的大孔樹(shù)脂粗提物，加入氯仿-正丁醇-甲醇/乙醇-水系統(tǒng)或正己烷-乙酸乙酯-正丁醇-水系統(tǒng)的下相中，震蕩使完全溶解，進(jìn)行高速逆流色譜(hsccc)分離制備。高速逆流色譜分離條件：根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道丁香葉抗菌消炎有效成分紫外吸收波長(zhǎng)丁香苦苷和橄欖苦苷(221nm～223nm)、原兒茶酸(258nm)、酪醇(278nm)、酚酸類成分(323nm)，故檢測(cè)波長(zhǎng)梯度為210～360nm，主機(jī)溫度為25℃～30℃，氯仿-正丁醇-甲醇/乙醇-水（5：4：2：4～6）或正己烷-乙酸乙酯-正丁醇-水系統(tǒng)（1：2：1：3～5或2：1：2～4：2～4）為溶劑系統(tǒng)，氯仿-正丁醇或正己烷-乙酸乙酯（固定相）為上相，甲醇/乙醇-水或正丁醇-水（流動(dòng)相）為下相。將固定相以10～40ml/min流速裝滿色譜分離柱，調(diào)整高速逆流色譜儀主機(jī)轉(zhuǎn)速為600～900rpm/min，同時(shí)以2.0～6.0ml/min的流速泵入流動(dòng)相，待兩相達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，開(kāi)啟進(jìn)樣閥，樣品液進(jìn)樣，采集數(shù)據(jù)并記錄紫外色譜圖，在210～360nm波長(zhǎng)下回收目的流分，減壓回收溶劑，冷凍或噴霧干燥，得高純度丁香葉總環(huán)烯醚萜苷提取物（hplc檢測(cè)純度≥80%）。

本發(fā)明所述的大孔吸附樹(shù)脂為聚苯乙烯類型中極性、弱極性和非極性大孔樹(shù)脂，包括ab-8、ads-17、ads-750、lsa-21、lx-26、xda-6、d101、d113、d141、d151、d152、d3520、h103、hpd100a、hpd-300、hpd400、hpd450、hpd-600、hpd-650、hpd-700、hpd-750、hpd-800、hpd-820、dm301、x-5、s-8、sp825、cad45、860021、nka-ⅱ或nka-9的一種或幾種，優(yōu)選大孔吸附樹(shù)脂d141、hpd-400或hpd-600型。離心分離時(shí)，離心速度在3000～10000轉(zhuǎn)/分鐘范圍內(nèi)。動(dòng)態(tài)軸向壓縮(dac)工業(yè)制備色譜填料為100～300目的柱層析硅膠，洗脫流動(dòng)相為二氯甲烷-甲醇、氯仿-甲醇或甲醇-水(25：1～10：1)梯度洗脫。高速逆流色譜(hsccc)所用洗脫溶劑為氯仿-正丁醇-甲醇/乙醇-水系統(tǒng)或正己烷-乙酸乙酯-正丁醇-水系統(tǒng)。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：

1．本發(fā)明首次利用動(dòng)態(tài)超聲逆流提取工藝，結(jié)合大孔吸附樹(shù)脂柱層析和動(dòng)態(tài)軸向壓縮工業(yè)制備色譜或高速逆流色譜分離技術(shù)，制備純度高達(dá)80％以上丁香葉總環(huán)烯醚萜苷提取物，并可通過(guò)添加各種藥用輔料制成多種劑型，為開(kāi)發(fā)出治療上呼吸道感染、急慢性支氣管炎、細(xì)菌性痢疾、急性腸胃炎、急性黃疸性肝炎、急性乳腺炎等感染性疾病的中藥五類新藥提供了物質(zhì)基礎(chǔ)；

2．本發(fā)明設(shè)計(jì)合理，工藝簡(jiǎn)單，采用動(dòng)態(tài)超聲醇提取法，大孔吸附樹(shù)脂柱層析結(jié)合動(dòng)態(tài)軸向壓縮工業(yè)色譜或高速逆流色譜分離技術(shù)，獲得高純度的丁香葉總環(huán)烯醚萜苷提取物，無(wú)環(huán)境污染，操作簡(jiǎn)便快捷，成本較低，非常適合工業(yè)化生產(chǎn)；

3．本發(fā)明所選用的大孔吸附樹(shù)脂純化方法，具有吸附量大，解吸率高，樹(shù)脂再生后可反復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)；動(dòng)態(tài)軸向壓縮(dac)工業(yè)制備色譜是一種高效的分離技術(shù)，與傳統(tǒng)制備色譜相比，具有負(fù)載樣品量大，裝填填料時(shí)間短、色譜柱效高、分離速度快等特點(diǎn)，可達(dá)到接近分析柱的柱效；高速逆流色譜分離技術(shù)(hsccc)具有無(wú)載體快速高效分離、回收率高、分離量大、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)被廣泛地應(yīng)用于天然活性成分的分離制備，因此具有很好的應(yīng)用前景。

所得到的高純度丁香葉總環(huán)烯醚萜苷提取物，通過(guò)添加各種藥用輔料可制成普通片劑、薄膜包衣片、膠囊劑、分散片、滴丸劑、顆粒劑、緩控釋制劑等固體口服制劑，以及噴霧劑、氣霧劑、注射用凍干粉針等劑型。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明高純度丁香葉總環(huán)烯醚萜苷提取物的制備工藝流程圖。

圖2是精制純化后樣品中丁香葉總環(huán)烯醚萜苷的hplc色譜圖。

圖3是采用高純度丁香葉總環(huán)烯醚萜苷為原料制備的片劑。

圖4是采用高純度丁香葉總環(huán)烯醚萜苷為原料制備的結(jié)腸定位片劑。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。

實(shí)施例1動(dòng)態(tài)超聲逆流提取結(jié)合大孔吸附樹(shù)脂柱層析和動(dòng)態(tài)軸向壓縮工業(yè)制備色譜分離技術(shù)制備高純度丁香葉總環(huán)烯醚萜苷提取物：

將丁香葉藥材10kg粉碎至20～30目，加8倍量體積百分比濃度為70%的乙醇，于頻率30khz，超聲功率20kw連續(xù)逆流提取3，每次40min，過(guò)濾，合并提取液，減壓回收提取溶劑，適當(dāng)濃縮至濃度為0.6g生藥/ml，加1mol/l鹽酸調(diào)ph值至4，以2bv/h的流速通過(guò)hpd650大孔吸附樹(shù)脂層析柱，上樣液按固形物質(zhì)量與干樹(shù)脂的比例為1：6，徑高比為1：8，先用4bv的蒸餾水洗滌樹(shù)脂柱床，洗脫流速為2bv/h，棄去水洗脫液；再用體積百分比濃度為50%的乙醇洗脫，洗脫流速為2bv/h，洗脫液減壓回收乙醇，濃縮至相對(duì)密度為1.15(50℃測(cè)得)，加入200～300目的柱層析硅膠填料，加甲醇拌勻后烘干，過(guò)動(dòng)態(tài)軸向壓縮反向工業(yè)制備色譜柱，二氯甲烷-甲醇(15：1～10：1)為流動(dòng)相梯度洗脫，分別收集含丁香葉總環(huán)烯醚萜苷的主段洗脫液，合并，減壓濃縮，過(guò)濾，減壓回收溶劑，冷凍干燥或噴霧干燥，測(cè)得丁香葉總環(huán)烯醚萜苷含量≥80%（hplc法，重量百分比）。

實(shí)施例2加熱回流提取結(jié)合大孔吸附樹(shù)脂柱層析和高速逆流色譜分離制備高純度丁香葉總環(huán)烯醚萜苷提取物：

在粉碎至20～30目的2kg丁香葉藥材中，加15倍量體積百分比濃度為80%的乙醇，加熱回流提取3次，每次1.5h，過(guò)濾，合并提取液，濃縮至濃度為1.0g生藥/ml，過(guò)濾后加1mol/l鹽酸調(diào)ph值至4～5，以3bv/h的流速通過(guò)d101大孔吸附樹(shù)脂層析柱，上樣液按固形物質(zhì)量與干樹(shù)脂的比例為1：8，徑高比為1：10，先用6bv的水洗滌樹(shù)脂，洗脫流速為4bv/h，棄去水洗脫液；再用體積百分比濃度為60%的甲醇洗脫，洗脫流速為3bv/h，洗脫液減壓回收甲醇，濃縮至相對(duì)密度為1.25(50℃測(cè)得)，減壓干燥，加入氯仿-正丁醇-甲醇/乙醇-水系統(tǒng)或正己烷-乙酸乙酯-正丁醇-水系統(tǒng)的下相中，震蕩使完全溶解，進(jìn)行高速逆流色譜(hsccc)分離制備。高速逆流色譜分離條件：檢測(cè)波長(zhǎng)210～360nm，主機(jī)溫度為30℃，正己烷-乙酸乙酯-正丁醇-水為溶劑系統(tǒng)（1：2：1：3～5或2：1：2～4：2～4），正己烷-乙酸乙酯（固定相）為上相，正丁醇-水（流動(dòng)相）為下相。將固定相以10ml/min流速裝滿色譜分離柱，調(diào)整高速逆流色譜儀主機(jī)轉(zhuǎn)速為900rpm/min，同時(shí)以2.0ml/min的流速泵入流動(dòng)相，待兩相達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，開(kāi)啟進(jìn)樣閥，樣品液進(jìn)樣，采集數(shù)據(jù)并記錄紫外色譜圖，在210～360nm波長(zhǎng)下回收目的流分，減壓回收溶劑，冷凍或噴霧干燥，測(cè)得丁香葉總環(huán)烯醚萜苷含量78%（hplc法，重量百分比）。

實(shí)施例3加熱回流提取結(jié)合大孔吸附樹(shù)脂柱層析和動(dòng)態(tài)軸向壓縮工業(yè)制備色譜分離技術(shù)制備高純度丁香葉總環(huán)烯醚萜苷提取物：

丁香葉5kg適度粉碎，加10倍量的60%甲醇，于頻率30khz，超聲功率20kw連續(xù)超聲逆流提取3次，每次0.5h，過(guò)濾，合并提取液，減壓回收甲醇，加水調(diào)節(jié)濃度至1.5g生藥/ml，加1mol/l鹽酸調(diào)ph值至6，以2bv/h的流速通過(guò)hpd400大孔吸附樹(shù)脂層析柱2次，上樣液按固形物質(zhì)量與干樹(shù)脂的比例為1：9，徑高比為1：8，先用4bv的水洗滌樹(shù)脂，洗脫流速為2bv/h，棄去水洗脫液；再用體積百分比濃度為70%的乙醇洗脫，洗脫流速為3bv/h，洗脫液減壓回收乙醇，濃縮至相對(duì)密度為1.15(50℃測(cè)得)，加入200～300目的柱層析硅膠填料，加甲醇拌勻后烘干，過(guò)動(dòng)態(tài)軸向壓縮反向工業(yè)制備色譜柱，氯仿-甲醇(20：1～10：1)為流動(dòng)相梯度洗脫，分別收集含丁香葉總環(huán)烯醚萜苷的主段洗脫液，合并，減壓濃縮，過(guò)濾，減壓回收溶劑，冷凍干燥或噴霧干燥，測(cè)得丁香葉總環(huán)烯醚萜苷含量82%（hplc法，重量百分比）。

實(shí)施例4動(dòng)態(tài)超聲逆流提取結(jié)合大孔吸附樹(shù)脂柱層析和高速逆流色譜分離制備高純度丁香葉總環(huán)烯醚萜苷提取物：

丁香葉5kg適度粉碎，加12倍量的50%乙醇，于頻率30khz，超聲功率20kw連續(xù)超聲逆流提取3次，每次1.5h，過(guò)濾，合并提取液，減壓回收乙醇，加水調(diào)節(jié)濃度至1.2g生藥/ml，加1mol/l鹽酸調(diào)ph值至3～5，以3bv/h的流速通過(guò)d141大孔吸附樹(shù)脂層析柱2次，上樣液按固形物質(zhì)量與干樹(shù)脂的比例為1：10，徑高比為1：8，先用4bv的水洗滌樹(shù)脂，洗脫流速為2bv/h，棄去水洗脫液；再用體積百分比濃度為50%的乙醇洗脫，洗脫流速為3bv/h，洗脫液減壓回收乙醇，濃縮至相對(duì)密度為1.15(50℃測(cè)得)，減壓干燥，加入氯仿-正丁醇-甲醇/乙醇-水系統(tǒng)的下相中，震蕩使完全溶解，進(jìn)行高速逆流色譜(hsccc)分離制備。高速逆流色譜分離條件：檢測(cè)波長(zhǎng)為210～360nm，主機(jī)溫度為25℃，氯仿-正丁醇-甲醇/乙醇-水為溶劑系統(tǒng)（5：4：2：4～6），氯仿-正丁醇（固定相）為上相，甲醇/乙醇-水（流動(dòng)相）為下相。將固定相以20ml/min流速裝滿色譜分離柱，調(diào)整高速逆流色譜儀主機(jī)轉(zhuǎn)速為600rpm/min，同時(shí)以3.0ml/min的流速泵入流動(dòng)相，待兩相達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，開(kāi)啟進(jìn)樣閥，樣品液進(jìn)樣，采集數(shù)據(jù)并記錄紫外色譜圖，在210～360nm波長(zhǎng)下回收目的流分，減壓回收溶劑，冷凍或噴霧干燥，測(cè)得丁香葉總環(huán)烯醚萜苷含量75%（hplc法，重量百分比）。

實(shí)施例5

丁香葉5kg適度粉碎，加13倍量的30%乙醇，加熱回流提取3次，每次2.0h，過(guò)濾，合并提取液，減壓回收乙醇，加水調(diào)節(jié)濃度至0.8g生藥/ml，加1mol/l鹽酸調(diào)ph值至6.5，以2bv/h的流速通過(guò)hpd700大孔吸附樹(shù)脂層析柱2次，上樣液按固形物質(zhì)量與干樹(shù)脂的比例為1：6，徑高比為1：8，先用4bv的水洗滌樹(shù)脂，洗脫流速為2bv/h，棄去水洗脫液；再用體積百分比濃度為70%的乙醇洗脫，洗脫流速為3bv/h，洗脫液減壓回收乙醇，濃縮至相對(duì)密度為1.20(50℃測(cè)得)，加入200～300目的柱層析硅膠填料，加甲醇拌勻后烘干，過(guò)動(dòng)態(tài)軸向壓縮反向工業(yè)制備色譜柱，二氯甲烷-甲醇(25：1～8：1)為流動(dòng)相梯度洗脫，分別收集含丁香葉總環(huán)烯醚萜苷的主段洗脫液，合并，減壓濃縮，過(guò)濾，減壓回收溶劑，冷凍干燥或噴霧干燥，測(cè)得丁香葉總環(huán)烯醚萜苷含量85%（hplc法，重量百分比）。

實(shí)施例6

丁香葉5kg適度粉碎，加10倍量的20%乙醇，加熱回流提取2次，每次2h，過(guò)濾，合并提取液，減壓回收乙醇，加水調(diào)節(jié)濃度至0.5g生藥/ml，加1mol/l鹽酸調(diào)ph值至7.0，以3bv/h的流速通過(guò)ab-8大孔吸附樹(shù)脂層析柱2次，上樣液按固形物質(zhì)量與干樹(shù)脂的比例為1：6，徑高比為1：8，先用4bv的水洗滌樹(shù)脂，洗脫流速為2bv/h，棄去水洗脫液；再用體積百分比濃度為60%的乙醇洗脫，洗脫流速為3bv/h，洗脫液減壓回收乙醇，濃縮至相對(duì)密度為1.20(50℃測(cè)得)，加入200～300目的柱層析硅膠填料，加甲醇拌勻后烘干，過(guò)動(dòng)態(tài)軸向壓縮反向工業(yè)制備色譜柱，二氯甲烷-甲醇(20：1～6：1)為流動(dòng)相洗脫，分別收集含丁香葉總環(huán)烯醚萜苷的主段洗脫液，合并，減壓濃縮，過(guò)濾，減壓回收溶劑，冷凍干燥或噴霧干燥，測(cè)得總環(huán)烯醚萜苷含量81%（hplc法，重量百分比）。

高純度丁香葉總環(huán)烯醚萜苷提取物制劑的制備

實(shí)施例7丁香葉總環(huán)烯醚萜苷滴丸的制備

高純度丁香葉總環(huán)烯醚萜苷提取物25g，加入75g的熔融混合基質(zhì)peg6000：peg4000(1:1)，攪拌均勻后轉(zhuǎn)移至貯液瓶中，密閉并保溫在75℃，用定量泵滴丸機(jī)由上往下滴制，冷卻劑為二甲基硅油，滴頭口徑（內(nèi)/外徑）：2.1/2.5mm，滴速：30丸/分鐘，滴距：8cm，每丸25mg，收集滴丸，吸去表面冷卻劑，干燥，即得。

實(shí)施例8丁香葉總環(huán)烯醚萜苷分散片的制備

分散片處方：

原料藥100g(25%)

乳糖50g（12.5%）

可壓性淀粉82.5g(20.63%)

微晶纖維素（mcc）100g(25%)

羧甲基淀粉鈉（cms-na）27.5g(6.87%)

交聯(lián)聚維酮(pvpp)37.5g(9.38%)

微粉硅膠2.5g(0.63%)

95%乙醇溶液適量

制成1000片(0.4g/片)

取高純度丁香葉總環(huán)烯醚萜苷提取物100g，與可壓性淀粉82.5g、微晶纖維素100g、乳糖50g、羧甲基淀粉鈉27.5g、交聯(lián)聚維酮37.5g混勻，加95％乙醇適量制成軟材，24目篩制粒，60℃干燥，加入微粉硅膠2.5g混勻后，22目篩整粒，壓制成片，片重400mg，每片含環(huán)烯醚萜苷100mg。

實(shí)施例9丁香葉總環(huán)烯醚萜苷注射用凍干粉針的制備

高純度丁香葉總環(huán)烯醚萜苷15g，加入20g甘露醇，加注射用水至200ml溶解，用1mol/l的naoh溶液調(diào)ph至7.5，加入0.5%活性炭，保持ph至7.5，加熱微沸15分鐘，在此過(guò)程中不斷攪拌，冷卻至50℃左右濾過(guò)，冷卻至室溫后經(jīng)0.45mm微孔濾膜過(guò)濾，按每瓶2ml分裝于5ml的西林瓶?jī)?nèi)，115℃流通蒸汽滅菌30分鐘，冷凍干燥，取出后壓蓋包裝即得。

實(shí)施例10丁香葉總環(huán)烯醚萜苷膠囊劑的制備

取高純度丁香葉總環(huán)烯醚萜苷提取物40g，與乳糖20g、淀粉60g混勻，加95％乙醇制成軟材，用14目篩制粒后，置60℃～70℃干燥后于12目篩整粒，套入1號(hào)空心膠囊中即得，每粒膠囊含藥80mg。

實(shí)施例11丁香葉總環(huán)烯醚萜苷普通片劑的制備

取高純度丁香葉總環(huán)烯醚萜苷25g，與淀粉45g、微晶纖維素15g、乳糖12g、羧甲基淀粉鈉8g混勻，加10％淀粉漿適量制成軟材，加入微粉硅膠0.5g，混勻后30目篩制粒，24目篩整粒，壓制成片，理論片重400mg，每片含藥100mg。

實(shí)施例12丁香葉總環(huán)烯醚萜苷腸溶片的制備

將實(shí)施例11制備的片劑作為片芯，另取丙烯酸樹(shù)脂ⅱ號(hào)20g，丙烯酸樹(shù)脂ⅲ號(hào)8g，加入95%乙醇溶解，配制成濃度為5%的溶液，加入適量鄰苯二甲酸二乙酯、滑石粉分別作為增塑劑和抗粘劑，制得腸溶包衣液。片芯在包衣鍋內(nèi)預(yù)熱至40～45℃，轉(zhuǎn)速50轉(zhuǎn)/分鐘，噴霧包衣，包衣增重5%～7%。

高純度丁香葉總環(huán)烯醚萜苷提取物的藥理活性研究

實(shí)施例13丁香葉總環(huán)烯醚萜苷對(duì)大鼠炎性腸病(ibd)的保護(hù)作用

1.實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)藥物

丁香葉總環(huán)烯醚萜苷(自制，純度＞75%)，柳氮磺胺吡啶sasp（上海信誼嘉華藥業(yè)有限公司）批號(hào)：20070204。使用前以0.5%cmc溶液配成0.25g/kg濃度；

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康sd大鼠，體重：180～220g；（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供）

1.3實(shí)驗(yàn)試劑

水合氯醛(上海山浦化工公司)

nacl注射液(哈藥集團(tuán)制藥六廠)

10%水合氯醛配制：稱取10g水合氯醛，溶解于100ml生理鹽水中；

葡聚糖硫酸鈉(dss)(mw=36～50kda)，美國(guó)mpbiomedicals公司

髓過(guò)氧化物酶(mpo)試劑盒，超氧化物歧化酶(sod)試劑盒，丙二醛(mda)試劑盒，一氧化氮(no)試劑盒（南京建成生物工程研究所）

腫瘤壞死因子(tnf-α)試劑盒，白細(xì)胞介素-8(il-8)試劑盒，環(huán)氧合酶-2(cox-2)試劑盒，nf-кbp65試劑盒（北京中杉金橋生物工程有限公司）

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：

健康sd大鼠50只，體重：180～220g（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供）。購(gòu)入后適應(yīng)性飼養(yǎng)7天，自由進(jìn)食飲水，每日更換飼料、飲水，保持大鼠生活環(huán)境、通風(fēng)和清潔衛(wèi)生。觀察進(jìn)食、飲水、行為活動(dòng)、大小便情況，確認(rèn)為健康大鼠后，隨機(jī)分為5組，即模型組、柳氮磺吡啶組、環(huán)烯醚萜苷高劑量組（1.0g/kg）、環(huán)烯醚萜苷中劑量組（0.5g/kg）、環(huán)烯醚萜苷低劑量組（0.25g/kg），每組10只，雌雄各半，各組體重統(tǒng)計(jì)學(xué)比較無(wú)顯著差異（p>0.05）；

3.模型建立：

參照文獻(xiàn)[1-3]，將大鼠在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)條件下飼養(yǎng)一周后，模型組給予4%葡聚糖硫酸鈉(dss)溶液替代飲用水誘導(dǎo)結(jié)腸炎，對(duì)照組飲用濾過(guò)除菌水。飲用前后每日檢測(cè)小鼠體重、大便性狀及隱血情況；

4.結(jié)腸組織中mpo、sod、mda、no含量的測(cè)定

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定結(jié)腸組織中的mpo、sod、mda、no含量。sod的測(cè)定用黃嘌呤氧化酶法按操作步驟進(jìn)行,于550nm處,用分光光度計(jì)測(cè)吸光度。mda的測(cè)定用硫代巴比妥酸法按操作步驟進(jìn)行,于532nm處,用分光光度計(jì)測(cè)吸光度。no的測(cè)定用硝酸還原酶法,于550nm處,用分光光度計(jì)測(cè)吸光度；

5.結(jié)腸組織中tnf-α、il-8、cox-2、nf-кbp65含量的測(cè)定

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用sabc免疫組化方法測(cè)定腦組織中的tnf-α、il-8、cox-2、nf-кbp65含量；

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包spss17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。資料用±s表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析；

7.實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

7.1丁香葉總環(huán)烯醚萜苷對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸損傷清況的影響

造模第7天，大鼠開(kāi)始禁食24h后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，背位固定，剖開(kāi)腹部，取出全結(jié)腸(從回盲部至恥骨聯(lián)合上乙狀結(jié)腸部分，冰上操作)，縱向剪開(kāi)，以冰生理鹽水沖洗掉腸內(nèi)污物，測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度及最大寬度，肉眼觀察結(jié)腸損傷的情況，結(jié)腸稱重，考察總環(huán)烯醚萜苷對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸損傷情況的影響；

表1丁香葉總環(huán)烯醚萜苷對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸損傷清況的影響(±s)

注:與正常組比較，△p<0.05，△△p<0.01;

與模型組比較，*p<0.05，**p<0.01

7.2丁香葉總環(huán)烯醚萜苷對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠mpo、sod、mda、no的影響

mpo在中性粒細(xì)胞中含量較高，其含量的增高可以反映中性粒細(xì)胞在某一組織中的增高，mpo活性可以提示組織炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)程度。sod、mda、no是衡量炎癥程度最敏感和可靠的指標(biāo)，對(duì)于潰瘍性結(jié)腸炎病情發(fā)展的評(píng)估及藥物治療效果的判斷，具有潛在的指導(dǎo)意義；

表2丁香葉總環(huán)烯醚萜苷對(duì)結(jié)腸炎大鼠sod、mda和no含量的影響(±s)

注:與正常組比較，△p<0.05，△△p<0.01;

與模型組比較，*p<0.05，**p<0.01

7.3丁香葉總環(huán)烯醚萜苷對(duì)結(jié)腸炎大鼠tnf-α、il-8、cox-2、nf-кbp65的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常組比較，腸炎模型組大鼠結(jié)腸組織中的tnf-α、il-8、cox-2、nf-кbp65含量明顯增加。與模型組比較，丁香葉總環(huán)烯醚萜苷高、中、低劑量組的大鼠結(jié)腸組織中tnf-α、il-8、cox-2、nf-кbp65含量明顯降低；與陽(yáng)性對(duì)照柳氮磺胺吡啶(sasp)組比較,丁香葉總環(huán)烯醚萜苷高、中劑量組大鼠腦組織mda、no含量顯著降低；

表3丁香葉總環(huán)烯醚萜苷對(duì)結(jié)腸炎大鼠tnf-α、il-8、cox-2、nf-кbp65含量的影響(±s)

注:與正常組比較，△p<0.05，△△p<0.01;

與模型組比較，*p<0.05，**p<0.01

【參考文獻(xiàn)】

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