本發(fā)明涉及由A群鏈球菌細(xì)菌導(dǎo)致的或者與A群鏈球菌細(xì)菌有關(guān)的疾病和病癥的預(yù)防和治療。更具體地，本發(fā)明涉及通過誘導(dǎo)粘膜免疫應(yīng)答來治療或預(yù)防由A群鏈球菌細(xì)菌導(dǎo)致的疾病和病癥的脂質(zhì)體疫苗。發(fā)明背景A群鏈球菌(GAS)主要感染人類的上呼吸道(URT)粘膜以及皮膚，導(dǎo)致廣泛的疾病。感染可以導(dǎo)致中毒性休克綜合征、壞死性筋膜炎以及肌炎。壞死性筋膜炎的發(fā)病率為十萬分之一，致死率高達(dá)70％(1)。鏈球菌感染后的疾病-風(fēng)濕熱(RF)和風(fēng)濕性心臟病(RHD)也受到高度關(guān)注。據(jù)估計(jì)，每年有1.56千萬RHD的流行病例以及約40萬死亡病例(2)。URT定殖后最常見的疾病是咽炎，并且RF和RHD與未治療的原發(fā)性咽部感染密切相關(guān)(3)。GAS感染和相關(guān)的疾病在熱帶地區(qū)、發(fā)展中國家以及發(fā)達(dá)國家的土著群體中流行，導(dǎo)致每年50萬死亡病例(4)，這突出表明對疫苗的迫切需求。GAS疫苗候選物可以分為基于M蛋白和非M蛋白的疫苗(5)。細(xì)胞表面M蛋白是由3個(gè)主要結(jié)構(gòu)域組成的卷曲螺旋蛋白，它是主要的毒力決定簇(6)。該蛋白由高變的氨基末端和用于流行病學(xué)分子分型(emm或M分型)的A-重復(fù)結(jié)構(gòu)域、B-重復(fù)結(jié)構(gòu)域和保守性C-重復(fù)結(jié)構(gòu)域組成(6)。處于臨床研究的主要的亞單位疫苗是基于氨基末端M蛋白的多價(jià)疫苗和保守性C-重復(fù)M蛋白肽疫苗(5)?；谄湓谡T導(dǎo)全身免疫方面的成功，這些GAS疫苗候選物已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)(7)。已經(jīng)證明，全身免疫通過全身部位的血清免疫球蛋白(Ig)在預(yù)防GAS播散到深層組織以及預(yù)防疾病中是有效的，但在預(yù)防粘膜部位的定殖由此預(yù)防人與人之間的傳播方面是無效的(8)。因此，全身疫苗接種對于誘 導(dǎo)抗GAS的免疫不是最佳的途徑。相比之下，經(jīng)鼻給藥的抗多種生物體的粘膜疫苗在誘導(dǎo)全身和粘膜隔室的抗原特異性免疫應(yīng)答方面是有效的(9-11)。由于這種雙層保護(hù)性免疫，粘膜疫苗接種對于抵抗全身性和粘膜GAS感染是理想的策略，其具有的預(yù)防粘膜定殖的益處還會(huì)抑制通過來自URT的飛沫和氣溶膠的傳播(7)。粘膜疫苗接種還具有經(jīng)濟(jì)上的優(yōu)勢，這是疫苗開發(fā)的一個(gè)重要的考量因素。由于通過鼻途徑給予疫苗的便捷性，可以避免使用針具(7)。無痛遞送有助于更好的患者依從性。發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供引發(fā)對A群鏈球菌細(xì)菌的粘膜免疫應(yīng)答的免疫原性劑和遞送系統(tǒng)。在廣義上，本發(fā)明涉及借助還包含諸如白喉類毒素(DT)的載體蛋白的脂質(zhì)囊泡，通過遞送免疫原性蛋白、片段或變體，促進(jìn)或誘發(fā)對A群鏈球菌細(xì)菌的粘膜免疫性。合適地，載體蛋白位于囊泡內(nèi)空隙。本發(fā)明的一方面提供了適于施用于哺乳動(dòng)物的免疫原性劑，所述免疫原性劑包含免疫原性A群鏈球菌細(xì)菌蛋白、其片段、變體或衍生物，脂質(zhì)囊泡和載體蛋白。本發(fā)明的另一方面提供了包含前述方面的免疫原性劑的藥物組合物。優(yōu)選地，藥物組合物包含免疫原性劑以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。在實(shí)施方案中，藥物組合不包含佐劑。本發(fā)明的另一方面提供了根據(jù)前述方面的免疫原性劑在制備用于在哺乳動(dòng)物中引發(fā)針對A群鏈球菌的免疫應(yīng)答的藥物中的用途。本發(fā)明的另一方面提供了根據(jù)前述方面的免疫原性劑在制備用于使哺乳動(dòng)物對A群鏈球菌免疫的藥物中的用途。本發(fā)明的另一方面提供了根據(jù)前述方面的免疫原性劑在制備用于治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中A群鏈球菌感染的藥物中的用途。本發(fā)明的另一方面提供了根據(jù)前述方面的免疫原性劑在制備用于 治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中由A群鏈球菌感染導(dǎo)致的或者與A群鏈球菌感染相關(guān)的疾病的藥物中的用途。在實(shí)施方案中，免疫原性劑可以在缺乏佐劑的情況下施用。合適地，按照前述方面，免疫原性劑能夠引發(fā)粘膜免疫應(yīng)答。典型地，粘膜免疫應(yīng)答包括IgA保護(hù)。在優(yōu)選形式中，免疫原性劑經(jīng)鼻內(nèi)施用。合適地，免疫原性蛋白、其片段或變體展示于脂質(zhì)囊泡的表面上。合適地，載體蛋白位于囊泡中的囊泡內(nèi)空隙。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂質(zhì)囊泡是脂質(zhì)體。合適地，免疫原性蛋白片段或變體是脂質(zhì)化的。在某些實(shí)施方案中，在免疫原性蛋白片段或變體的N-末端的賴氨酸(K)殘基是脂質(zhì)化的。在優(yōu)選形式中，N-末端的賴氨酸(K)殘基通過<和ε氨基團(tuán)被脂質(zhì)化。在一些實(shí)施方案中，每一脂質(zhì)是C16脂肪酸，諸如棕櫚酸。優(yōu)選地，N-末端的賴氨酸(K)殘基位于免疫原性蛋白片段或變體的N-末端的間隔子氨基酸序列中。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，免疫原性蛋白、其片段或變體是A群鏈球菌M蛋白、其片段、變體或衍生物。在另外的或可選的實(shí)施方案中，免疫原性蛋白是促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞活性恢復(fù)或增強(qiáng)的試劑。在具體實(shí)施方案中，M蛋白片段為M蛋白的保守區(qū)域或者包含M蛋白的保守區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述片段是免疫原性片段，其包含p145肽或者包含于p145肽中。在具體實(shí)施方案中，所述免疫原性片段位于J8肽或其變體內(nèi)，或者包含J8肽或其變體。優(yōu)選地，J8肽包含以下氨基酸序列或者基本由以下氨基酸序列組成：QAEDKVKQSREAKKQVEKALKQLEDKVQ(SEQIDNO:1)。在一個(gè)廣泛實(shí)施方案中，促進(jìn)恢復(fù)或增強(qiáng)嗜中性粒細(xì)胞活性的試劑是蛋白SpyCEP或其片段。在優(yōu)選實(shí)施方案中，SpyCEP片段包含以下氨基酸序列或者基本由以下氨基酸序列組成：NSDNIKENQFEDFDEDWENF(SEQIDNO:2)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，SpyCEP片段和M蛋白片段可以融合以形成單一的嵌合肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述嵌合肽為以下氨基酸序列或其變體，可包含以下氨基酸序列或其變體，或者基本由以下氨基酸序列或其變體組成：NSDNIKENQFEDFDEDWENFQAEDKVKQSREAKKQVEKALKQLEDKVQ(SEQIDNO:3)。在一些實(shí)施方案中，免疫原性劑還可以包含先天免疫的激活劑。所述先天免疫激活劑可以靶向C型凝集素，如巨噬細(xì)胞可誘導(dǎo)的Ca2+依賴性(C型)凝集素(“Mincle”)。非限制性實(shí)例包括糖脂，如分枝桿菌核心因子海藻糖-6,6’-二霉菌酸酯(TDM)和/或其合成的類似物海藻糖-6,6′-二山崳酸酯(TDB)。在一些實(shí)施方案中，免疫原性劑還可以包含膽鹽，如脫氧膽酸鈉。除非上下文另外需要，術(shù)語“包含(comprise)”、“包含(comprises)”以及“包含(comprising)”或類似的術(shù)語意圖意為非排他性包含，以使敘述的元素或特征列表不單獨(dú)包含闡明的或列出的那些，而可以包含未列出或闡明的其它元素或特征。在氨基酸序列的背景下，通過“基本由……組成”意為敘述的氨基酸序列以及位于N-或C-端的另外1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)氨基酸。如本文所使用的，在此使用不定冠詞‘一個(gè)/一種(a)’和‘一個(gè)/一種(an)’以指或者包含單數(shù)或復(fù)數(shù)元素或特征，并且不應(yīng)被認(rèn)為意為或者限定“一個(gè)/一種(one)”或“單一”元素或特征。附圖簡述圖1.J8-Lipo-DT的理想化結(jié)構(gòu)。脂質(zhì)體將DT封裝，同時(shí)在N端與間隔子KSS相連的J8與兩個(gè)棕櫚酸分子共價(jià)偶聯(lián)，促進(jìn)J8插入脂質(zhì)體膜。圖2.單只BALB/c小鼠的J8特異性抗體應(yīng)答。平均抗體滴度以bar表示。A)唾液IgA滴度。B)糞便IgA滴度。C)血清IgG滴度。利用單向ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，然后進(jìn)行Tukey事后檢驗(yàn)(ns，p>0.05；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001)。圖3.在BALB/C小鼠中，用M1GAS菌株進(jìn)行鼻內(nèi)激發(fā)之后的細(xì)菌負(fù)荷。A)鼻腔脫落物。B)咽喉拭子。C)NALT的定殖。結(jié)果以下述表示： 對于咽喉拭子、鼻腔脫落物而言，在第1-3天，10只小鼠/組的平均CFU+SEM；對于NALT，在第3天，10只小鼠/組的平均CFU+SEM。利用非參數(shù)、非配對的曼-惠特尼U檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以將測試組與PBS對照組進(jìn)行比較(ns，p>0.05；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001)。圖4.單只B10.BR小鼠的J8特異性抗體應(yīng)答(每組n＝5)。平均抗體滴度以bar表示。A)唾液IgA滴度。B)糞便IgA滴度。C)血清IgG滴度。利用單向ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，然后進(jìn)行Tukey事后檢驗(yàn)(ns，p>0.05；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001)。圖5.評估用M1菌株進(jìn)行鼻內(nèi)激發(fā)之后的細(xì)菌負(fù)荷的URTGAS激發(fā)模型。A)B10.BR小鼠的鼻腔脫落物。B)B10.BR小鼠的咽喉拭子。結(jié)果以第1-3天，5只小鼠/組的平均CFU+SEM表示。利用非參數(shù)、非配對的曼-惠特尼U檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以將測試組與PBS對照組進(jìn)行比較(ns，p>0.05；*，p<0.05)。圖6.單只BALB/c小鼠的J8特異性抗體應(yīng)答。平均抗體滴度以bar表示。A)唾液IgA滴度。B)血清IgG滴度。利用單向ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，然后進(jìn)行Tukey事后檢驗(yàn)(ns，p>0.05；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001)。圖7.免疫的小鼠中抗原特異性分泌的趨化因子和細(xì)胞因子。取出脾細(xì)胞，并如所示添加下述刺激：LPS(2μg/mL)、J8(10μg/mL)或單獨(dú)的培養(yǎng)基。刺激之后72小時(shí)，分離上清液，并利用流式微珠陣列對分泌的趨化因子或細(xì)胞因子的水平進(jìn)行分析(參見材料與方法)。利用學(xué)生t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(ns，p>0.05；*，p<0.05；**，p<0.01)。圖8.在用或未用試劑進(jìn)行治療的情況下，人DC亞群上的表面標(biāo)志物水平。如所示添加下述刺激：聚肌苷酸：聚胞嘧啶核苷酸(pIC，10μg/mL)、J8-Lipo-DT(150μg/mL)或單獨(dú)的培養(yǎng)基。在刺激之后24小時(shí)，通過流式細(xì)胞儀測量細(xì)胞表面標(biāo)志物。A)CD123+類漿細(xì)胞DC。B)CD141+經(jīng)典的1型DC。C)CD1c+經(jīng)典的2型DC。值以來自三個(gè)單獨(dú)供體的混合數(shù)據(jù)的平均熒光強(qiáng)度(MFI)±SEM表示。利用非參數(shù)、非配對的曼-惠特尼U檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以將測試組與媒介物對照組進(jìn)行比較(ns，p>0.05；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001)。圖9.人樹突狀細(xì)胞中由J8-Lipo-DT誘導(dǎo)分泌的趨化因子和細(xì)胞因子。取出樹突狀細(xì)胞，并如所示添加下述刺激：pIC(10μg/mL)、J8-Lipo-DT(150μg/mL)或單獨(dú)的媒介物。刺激之后24小時(shí)分離上清液，并利用流式微珠陣列對分泌的趨化因子或細(xì)胞因子的水平進(jìn)行分析(參見材料和方法)。利用學(xué)生t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(ns，p>0.05；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001)。圖10.SpyCEP肽(S2；SEQIDNO:2)脂質(zhì)體遞送試劑引發(fā)粘膜IgA應(yīng)答。向小鼠鼻內(nèi)施用展示棕櫚酸脂化的S2肽或S2-J8嵌合體(SEQIDNO:3)的脂質(zhì)體以及囊內(nèi)DT，并測量S2特異性IgA滴度。圖11.J8+S2-Lipo-DT免疫原性劑在小鼠中誘導(dǎo)抗原特異性IgA、IgG應(yīng)答。圖12.可以擠壓J8-Lipo-DT免疫原性劑以形成納米或微米尺寸的顆粒。通過Nanosizer(動(dòng)態(tài)光散射或DLS)進(jìn)行脂質(zhì)體尺寸測量。圖13.J8-Lipo-DT免疫原性劑的尺寸不影響全身性IgG應(yīng)答。圖14.更大尺寸的J8-Lipo-DT免疫原性劑誘導(dǎo)的J8特異性粘膜應(yīng)答。圖15.PBS中復(fù)原的冷凍干燥的J8-Lipo-DT粉末的粒徑分布。通過Nanosizer(動(dòng)態(tài)光散射或DLS)進(jìn)行脂質(zhì)體尺寸測量。圖16.在無其它佐劑的情況下，復(fù)原的冷凍干燥的J8-Lipo-DT脂質(zhì)體免疫原性劑誘導(dǎo)的J8特異性全身性應(yīng)答。圖17.復(fù)原的冷凍干燥的J8-Lipo-DT脂質(zhì)體免疫原性劑誘導(dǎo)的J8特異性粘膜應(yīng)答。圖18.包含海藻糖6,6’-二山崳酸酯(TDB)的脂質(zhì)體免疫原性劑的示意圖描述。圖19.包含膽鹽脫氧膽酸鈉的脂質(zhì)體免疫原性劑的示意圖描述。詳細(xì)描述本發(fā)明至少部分依據(jù)下述發(fā)現(xiàn)：用包含展示于脂質(zhì)體表面的免疫原性肽與囊內(nèi)載體蛋白如白喉類毒素(DT)的脂質(zhì)體免疫原性劑進(jìn)行小鼠鼻內(nèi)疫苗接種，導(dǎo)致粘膜和全身性抗體應(yīng)答，該應(yīng)答可與由非人類可兼容 的佐劑CTB誘導(dǎo)的那些應(yīng)當(dāng)相比較。在A群鏈球菌和J8肽的特定背景下，由脂質(zhì)體制劑誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫的水平明顯超過由J8/CTB所誘導(dǎo)的水平。此外，由純化的人樹突狀細(xì)胞(DC)亞群誘導(dǎo)的細(xì)胞因子應(yīng)答表明，此類脂質(zhì)體在誘導(dǎo)人粘膜J8特異性IgA和全身性IgG應(yīng)答中將是有效的。在一些實(shí)施方案中，脂質(zhì)體免疫原性劑可以單獨(dú)包含SpyCEP肽或其其它片段或者還包含J8肽。在具體形式中，脂質(zhì)體免疫原性劑可以適用于治療或預(yù)防由特別強(qiáng)的毒株或?qū)τ糜贏群鏈球菌感染的常用抗生素治療具有抗性的A群鏈球菌隔離群所導(dǎo)致的感染。這些菌株或隔離群通常引起皮膚嚴(yán)重感染(例如壞死性筋膜炎)，以及在一些情況下，可以容納CovR/SCovR/S突變。為本發(fā)明目的，“分離的”意指已經(jīng)從其天然狀態(tài)移出的材料，或已經(jīng)接受人工操作的材料。分離的材料可以基本上或本質(zhì)上不含通常伴隨其天然狀態(tài)的組分，或可以被操作從而與通常伴隨其天然狀態(tài)的組分處于人工狀態(tài)。分離的材料可以為天然、化學(xué)合成或重組形式?！暗鞍踪|(zhì)”意指氨基酸聚合物。如本領(lǐng)域內(nèi)公知，氨基酸可以是天然氨基酸或非天然氨基酸，D-氨基酸或L-氨基酸。術(shù)語“蛋白質(zhì)”包括并涵蓋“肽”和“多肽”，肽通常用于描述具有不超過五十(50)個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，多肽通常用于描述具有多于五十(50)個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)?！捌巍睘榈鞍踪|(zhì)的區(qū)段、結(jié)構(gòu)域、部分或區(qū)域，其構(gòu)成不到所述蛋白質(zhì)100％的氨基酸序列。將認(rèn)識(shí)到，片段可以為單獨(dú)的片段，或可以單獨(dú)重復(fù)，或可以與其他片段重復(fù)。通常，片段可包含全長蛋白質(zhì)的至多5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、100、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550或1600個(gè)氨基酸，基本上由其組成或由其組成。如本文所用，蛋白質(zhì)“變體”與參照氨基酸序列共有可確定的核苷酸或氨基酸序列關(guān)系。“變體”蛋白質(zhì)可以缺失參照氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列，或由不同氨基酸替換。領(lǐng)域內(nèi)公知，一些氨基酸 可以被替換或缺失，而不改變免疫原性片段和/或蛋白質(zhì)的活性(保守型替換)。優(yōu)選地，蛋白質(zhì)突變體與參照氨基酸序列共有至少70％或75％，優(yōu)選至少80％或85％，或更優(yōu)選至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。本文通常使用的描述各個(gè)蛋白質(zhì)和核酸之間的序列關(guān)系的術(shù)語包括“比較窗”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“基本上相同”。由于各個(gè)核酸/蛋白質(zhì)可各自包含(1)由核酸/蛋白質(zhì)共有的完整核酸/蛋白質(zhì)序列的僅一個(gè)或多個(gè)部分，和(2)核酸/蛋白質(zhì)之間不同的一個(gè)或多個(gè)部分，通常通過在“比較窗”比較序列來執(zhí)行序列比較，以鑒定和比較局部區(qū)域的序列相似性。“比較窗”是指與參照序列比較的通常6、9或12個(gè)連續(xù)殘基的概念上的區(qū)段。比較窗可以包含與用于各個(gè)序列的最優(yōu)比對的參照序列相比約20％或更少的添加或刪除(即空位)。用于比對比較窗的序列的最優(yōu)比對可以通過算法的計(jì)算機(jī)運(yùn)行(Wisconsin遺傳學(xué)軟件包發(fā)行版7.0(Intelligenetics的Geneworks程序；GeneticsSoftwarePackageRelease7.0)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,GeneticsComputerGroup,575ScienceDriveMadison,WI,USA，通過引用將其并入本文)或通過目測以及選擇的各種方法的任一種產(chǎn)生的最佳比對(即，產(chǎn)生整個(gè)比較窗的最高同源性百分比)來實(shí)施。例如Altschuletal,1997,Nucl.AcidsRes.25:3389公開的BLAST程序家族也可以作為參考，通過引用將其并入本文。序列分析的詳細(xì)討論可以見于Eds.Ausubel等人編著的分子生物學(xué)通用手冊(CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY)(JohnWiley&SonsIncNY,1995-1999)的19.3單元。本文所用的術(shù)語“序列同一性”以其最寬泛的含義使用，以包括關(guān)于使用標(biāo)準(zhǔn)算法的合適比對，關(guān)于在比較窗相同的序列的程度，精確的核苷酸或氨基酸匹配的數(shù)量。因此，“序列同一性百分比”通過以下來計(jì)算：比較兩個(gè)在比較窗中最優(yōu)比對的序列，確定相同的核酸堿基(例如A、T、C、G、I)在兩條序列中出現(xiàn)的位置的數(shù)目以得到匹配的位置數(shù)，將匹配的位置數(shù)除以比較窗中總位置數(shù)(即，窗大小)，并將得到的結(jié)果乘以100以得到序列同一性百分比。例如，可以理解“序列 同一性”意指通過DNASIS計(jì)算機(jī)程序(windows版，版本2.5；可從HitachiSoftwareengineeringCo.,Ltd.,SouthSanFrancisco,California,USA獲得)計(jì)算的“匹配百分比”。如本文所用，“衍生物”為已被改變的諸如蛋白或其片段或變體的分子，如本領(lǐng)域所理解的，例如通過與其他化學(xué)部分連接或絡(luò)合，通過翻譯后修飾(例如磷酸化、乙酰化等)、糖基化作用修飾(例如添加、去除或改變糖基化)、脂質(zhì)化和/或包含額外的氨基酸序列。在一具體實(shí)施方案中，額外的氨基酸序列可包括在其N端和/或C端的一個(gè)或多個(gè)賴氨酸殘基。多個(gè)賴氨酸殘基(例如，多賴氨酸)可以為賴氨酸殘基的線性序列或賴氨酸殘基的支鏈序列。這些額外的賴氨酸殘基可促進(jìn)增加的肽可溶性。額外的氨基酸序列可包括產(chǎn)生融合蛋白的融合伴侶氨基酸序列。例如，融合伴侶氨基酸序列可輔助分離的融合蛋白的檢測和/或純化。非限制性實(shí)例包括金屬結(jié)合(例如，多組氨酸)融合伴侶、麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)(MBP)、蛋白質(zhì)A、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)、熒光蛋白質(zhì)序列(例如，GFP)、表位標(biāo)記例如myc、FLAG和血球凝集素標(biāo)記。其他額外的氨基酸序列包括間隔子序列。間隔子序列的一個(gè)實(shí)例為在免疫原性蛋白質(zhì)片段或變體的氨基酸序列的N端或C端的氨基酸序列，其包含適于脂質(zhì)化的賴氨酸(K)殘基。通常，間隔子氨基酸序列包括兩個(gè)(2)至十個(gè)(10)氨基酸，例如三個(gè)(3)氨基酸序列KSS。本發(fā)明涵蓋的其他衍生物包括但不限于，側(cè)鏈的修飾，在肽或蛋白質(zhì)合成期間并入非天然氨基酸和/或其衍生物，以及使用交聯(lián)劑，和向本發(fā)明的免疫原性蛋白質(zhì)、片段和變體施加構(gòu)象約束的其他方法。在此方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員可參考Coligan等人編著的蛋白質(zhì)科學(xué)通用手冊(CURRENTPROTOCOLSINPROTEINSCIENCE)(JohnWiley&SonsNY1995-2008)的第15章，用于設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾的更廣泛的方法學(xué)。應(yīng)理解，本文公開的免疫原性蛋白質(zhì)、片段和變體可以單獨(dú)地呈現(xiàn)在脂質(zhì)囊泡的表面，或作為包含多個(gè)拷貝的相同肽或多個(gè)不同肽的嵌合蛋白質(zhì)或融合蛋白質(zhì)呈現(xiàn)。非限制性實(shí)例為SEQIDNO:3的嵌合 肽，將在下文更詳細(xì)地描述。在本發(fā)明語境中，本文所用的術(shù)語“免疫原性”是指在向哺乳動(dòng)物或其他動(dòng)物使用免疫原性劑后產(chǎn)生或引發(fā)免疫應(yīng)答的能力或效力，例如針對病原體或其分子組分的免疫應(yīng)答?！耙l(fā)免疫應(yīng)答”意指產(chǎn)生或刺激免疫系統(tǒng)的一種或多種元件的產(chǎn)生或活性，包括細(xì)胞免疫系統(tǒng)、抗體和/或天然免疫系統(tǒng)。適當(dāng)?shù)?，免疫系統(tǒng)的一種或多種元件包括B淋巴細(xì)胞、抗體、中性白細(xì)胞、包括漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞在內(nèi)的樹突細(xì)胞、細(xì)胞因子和/或趨化因子。細(xì)胞因子的非限制性實(shí)例包括促炎性細(xì)胞因子例如TNF-α、IL-6和IL-1(例如IL-1β)。趨化因子的非限制性實(shí)例為中性白細(xì)胞化學(xué)引誘劑IL-8。適當(dāng)?shù)?，免疫?yīng)答為或包括粘膜免疫應(yīng)答，例如包括IgA產(chǎn)生。優(yōu)選地，由免疫原性劑引發(fā)的免疫應(yīng)答為保護(hù)性的。如本文通用，術(shù)語“免疫”、“接種疫苗”和“疫苗”是指引發(fā)針對病原體的保護(hù)性免疫應(yīng)答，從而該病原體的進(jìn)一步感染被至少部分的預(yù)防或減小的方法和/或制劑。如從本公開所理解的，本發(fā)明提供脂質(zhì)囊泡制劑，其包含配制在脂質(zhì)囊泡中的免疫原性蛋白質(zhì)片段、變體或衍生物，以及載體蛋白質(zhì)。如本文廣泛使用，脂質(zhì)囊泡可以是脂質(zhì)體、微細(xì)胞、多層囊泡、微膠粒、空泡或包含脂雙層的其他囊泡結(jié)構(gòu)，適當(dāng)?shù)?，免疫原性蛋白質(zhì)片段、變體或衍生物經(jīng)衍生以包含促進(jìn)錨定至脂雙層的一種或多種脂質(zhì)，從而免疫原性蛋白質(zhì)片段、變體或衍生物呈現(xiàn)在脂質(zhì)囊泡的表面。在優(yōu)選形式中，通過α和/或ε氨基脂質(zhì)化賴氨酸(K)殘基。為促進(jìn)脂質(zhì)化，免疫原性蛋白質(zhì)片段、變體或衍生物可進(jìn)一步包含N端間隔子，所述N端間隔子包含已被脂質(zhì)化的賴氨酸(K)殘基。間隔子通?？砂?-10個(gè)連續(xù)氨基酸，例如三個(gè)(3)氨基酸的間隔子KSS。在一些實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)或每個(gè)脂質(zhì)為C16脂肪酸，如棕櫚酸。然而，還將理解，諸如具有C12-C22碳鏈的飽和或不飽和(例如，單不飽和)脂肪酸的其他脂質(zhì)可以用于本發(fā)明。適當(dāng)?shù)?，脂質(zhì)囊泡包括能夠形成脂雙層結(jié)構(gòu)的任意脂質(zhì)，或脂質(zhì)的混合物。這些包括磷脂，包括膽固醇、膽固醇酯和植物固醇在內(nèi)的 甾醇類、脂肪酸和/或甘油三酸酯。磷脂的非限制性實(shí)例包括磷脂酰膽堿(PC)(卵磷脂)、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺(PE)(腦磷脂)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)和鞘磷脂(SM)，或其天然或合成的衍生物。天然衍生物包括蛋PC、蛋PG、大豆PC、氫化大豆PC、大豆PG、腦PS、鞘氨醇酯(sphingolipids)、腦SM、半乳糖腦苷脂、神經(jīng)節(jié)苷脂、腦苷脂、腦磷脂、心肌磷脂和雙十六烷基磷酸酯。合成的衍生物包括二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二癸酰磷脂酰膽堿(DDPC)、二芥酰磷脂酰膽堿(DEPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、二月桂酰磷脂酰膽堿(DLPC)、棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿(POPC)、棕櫚酰肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(PMPC)、棕櫚酰硬脂酰磷脂酰膽堿(PSPC)、二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、棕櫚酰油酰磷脂酰甘油(POPG)、二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)、二棕櫚酰磷脂酸(DPPA)、二硬脂酰磷脂酸(DSPA)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰絲氨酸(DMPS)、二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸(DPPS)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二油酰磷脂酰絲氨酸(DOPS)、二棕櫚酰鞘磷脂(DPSM)和二硬脂酰鞘磷脂(DSSM)。磷脂也可以是任一上述磷脂的衍生物或類似物。適當(dāng)?shù)?，脂質(zhì)的混合物可以包含期望摩爾比或期望wt％比的各種磷脂。例如，可以使用摩爾比為7二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC):2膽固醇(CHOL):1L-α-磷脂酰甘油(PG)形成脂質(zhì)體。適當(dāng)?shù)?，脂質(zhì)囊泡還包含載體蛋白質(zhì)。適當(dāng)?shù)?，載體蛋白質(zhì)為免疫原性蛋白質(zhì)，或至少部分地促進(jìn)或增強(qiáng)所述免疫原性劑的免疫原性。通常，將載體蛋白質(zhì)與脂質(zhì)囊泡一起配制使得載體蛋白質(zhì)位于脂質(zhì)囊泡內(nèi)部在內(nèi)部水性空間內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，載體蛋白質(zhì)可以與所述免疫原性蛋白質(zhì)片段或其變體或衍生物融合、結(jié)合或絡(luò)合。這可以包括重組蛋白融合、化學(xué)交聯(lián)和分子間絡(luò)合，例如通過生物素-抗生物 素蛋白或其他分子間結(jié)合劑，盡管不限于此。在這類實(shí)施方案中，所述免疫原性蛋白質(zhì)片段或其變體或衍生物位于脂質(zhì)囊泡內(nèi)部在內(nèi)部水性空間中，與所述載體蛋白質(zhì)融合、結(jié)合或絡(luò)合。該實(shí)施方案可以特別有用于口服遞送免疫活性劑，例如包含膽汁酸鹽的脂質(zhì)體，如本文以下更詳細(xì)地描述的。載體蛋白質(zhì)的非限制性實(shí)例包括白喉類毒素(DT)、破傷風(fēng)類毒素(TT)、諸如CRM197的CRM蛋白質(zhì)、和百日咳毒素突變體，盡管不限于此。還涵蓋載體蛋白質(zhì)的片段和變體。在一具體實(shí)施方案中，載體蛋白質(zhì)為白喉類毒素(DT)或其片段。在一些實(shí)施方案中，脂質(zhì)囊泡還包含先天性免疫的激活劑。先天性免疫的激活劑可靶向與先天性免疫相關(guān)的由一種或多種細(xì)胞表達(dá)的C-型凝集素。優(yōu)選的C-型凝集素為巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的Ca2+-依賴性(C-型)凝集素(“Mincle”)。非限制性實(shí)例包括糖脂，例如分枝桿菌索狀因子海藻糖-6,6′-二霉菌酸酯(TDM)和/或其合成的類似物海藻糖-6,6′-二山崳酸酯(TDB)。盡管不希望被任何特定理論限制，推測先天性免疫的激動(dòng)劑如TDB可增強(qiáng)或改善由免疫原性劑引發(fā)的粘膜免疫。在一些實(shí)施方案中，脂質(zhì)囊泡可以還包含膽汁酸或膽汁酸鹽。膽汁酸通常為具有24個(gè)碳的二羥基化或三羥基化的類固醇，包括膽酸、去氧膽酸、鵝去氧膽酸和熊去氧膽酸。優(yōu)選地，脂質(zhì)囊泡包含膽汁酸鹽，如膽酸鹽、去氧膽酸鹽、鵝去氧膽酸鹽或熊去氧膽酸鹽。優(yōu)選地，膽汁酸鹽為去氧膽酸鈉。在其他實(shí)施方案中，包含免疫原性劑的脂質(zhì)體可以制備為特定、選擇的或期望的顆粒尺寸或尺寸范圍。在一些實(shí)施方案中，較大顆粒尺寸的脂質(zhì)體可引發(fā)較強(qiáng)的粘膜免疫應(yīng)答。在其他實(shí)施方案中，包含免疫原性劑的脂質(zhì)體可被凍干或低壓凍干以促進(jìn)長期存儲(chǔ)。復(fù)原的凍干脂質(zhì)體免疫原性劑引發(fā)與“新鮮”脂質(zhì)體免疫原性劑的免疫應(yīng)答相當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答。如本文所用，術(shù)語“A群鏈球菌”、“A群鏈球菌”和簡稱“GAS”是指蘭氏A血清群的鏈球菌細(xì)菌，其為化膿性鏈球菌(Streptococcuspyogenes)種的革蘭氏陽性的β溶血菌。GAS的重要毒力因子為M蛋白質(zhì)，其為強(qiáng)烈抗吞噬細(xì)胞的并且與血清因子H結(jié)合，破壞C3-轉(zhuǎn)化 酶和阻止C3b的調(diào)理素作用。這些還包括毒性“突變體”，例如，Graham等人,2002,PNASUSA9913855描述的CovR/S或CovRS突變體，盡管不限于此。A群鏈球菌引起的疾病和病況包括蜂窩織炎、丹毒、膿皰病、猩紅熱、喉感染如急性咽炎(“鏈球菌性喉炎”)、菌血癥、中毒性休克綜合征、壞死性筋膜炎、急性風(fēng)濕熱和急性腎小球腎炎，盡管不局限于此。如本文所用，“中性白細(xì)胞”或中性粒細(xì)胞為形成部分多形核細(xì)胞家族(PMN)以及嗜堿性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的細(xì)胞。中性白細(xì)胞為由骨髓干細(xì)胞形成的相對短壽的吞噬細(xì)胞并且通常構(gòu)成哺乳動(dòng)物中的40％至75％的白細(xì)胞。吞噬性的中性白細(xì)胞不但釋放可溶的抗-微生物(例如顆粒蛋白)，而且產(chǎn)生嗜中性粒細(xì)胞胞外菌網(wǎng)。中性白細(xì)胞對諸如白介素-8(IL-8)、C5a、fMLP和白三烯B4的分子有應(yīng)答，所述分子促進(jìn)中性粒細(xì)胞至損傷和/或急性炎癥的部位的趨化性。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原性蛋白可以為M蛋白或其片段或變體。如本文所用，“M蛋白片段”為具有免疫原性和/或能夠結(jié)合抗體或抗體片段的GASM蛋白的任何片段。通常，片段為下述、包含下述或包含在下述內(nèi)：GASM蛋白或其片段的C-重復(fù)區(qū)的氨基酸序列。非限制性實(shí)例包括p145，其為20mer，具有氨基酸序列LRRDLDASREAKKQVEKALE(SEQIDNO:4)。在這方面，p145氨基酸序列的片段可以存在于J8肽中。如本文所用，“J8肽”為包含至少部分來源于或?qū)?yīng)于GASM蛋白C-區(qū)肽的氨基酸序列的肽。J8肽適當(dāng)?shù)匕瑯?gòu)象B-細(xì)胞表位并且不含可能有害的T-細(xì)胞自體表位。優(yōu)選的J8肽氨基酸序列為QAEDKVKQKQLEDKVQ(SEQIDNO:1)或其片段或變體，其中所述加粗的殘基對應(yīng)于GASM蛋白的殘基344至355。在該實(shí)施方案中，J8為還包括側(cè)翼的GCN4DNA-結(jié)合蛋白序列的嵌合肽，所述序列幫助維持J8肽的正確螺旋折疊和構(gòu)象結(jié)構(gòu)。在另一實(shí)施方案中，免疫原性蛋白可以為促進(jìn)中性粒細(xì)胞活性恢復(fù)或增強(qiáng)的試劑。如本文所用，“促進(jìn)中性粒細(xì)胞活性恢復(fù)或增強(qiáng)的試劑”為直接或間接地至少部分增加、增強(qiáng)或恢復(fù)中性白細(xì)胞的產(chǎn)生、遷移和/或趨化性和/或中性白細(xì)胞的一種或多種免疫學(xué)活性的分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑引發(fā)對中性粒細(xì)胞抑制劑的免疫應(yīng)答。在另一實(shí)施方案中，試劑結(jié)合中性粒細(xì)胞抑制劑以及至少部分地使其失活。中性粒細(xì)胞抑制劑可以為來源于或源自A群鏈球菌的分子。在一個(gè)特定形式中，中性粒細(xì)胞抑制劑為蛋白水解切割白介素8的絲氨酸蛋白酶或其片段。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，中性粒細(xì)胞抑制劑為SpyCEP或其片段。SpyCEP化膿性鏈球菌為在人類病原體化膿性鏈球菌(Streptococcuspyogenes)的表面表達(dá)的170-kDa多結(jié)構(gòu)域的絲氨酸蛋白酶，其在通過催化裂解的感染以及中性粒細(xì)胞化學(xué)引誘物白介素-8的失活中起著重要作用。SpyCEP氨基酸序列的非限制性實(shí)例可以見于登錄號YP597949.1和(化膿性鏈球菌MGAS10270)和YP596076.1(化膿性鏈球菌MGAS9429)。因此，在一個(gè)特定實(shí)施方案中，SpyCEP片段為或包含SEQIDNO:2(NSDNIKENQFEDFDEDWENF)中所示的氨基酸序列。提出SEQIDNO:2為或包含SpyCEP上的優(yōu)勢表位，其可以誘導(dǎo)功能性抗體。本文還提供了包含形成單一、連續(xù)的氨基酸序列的M-蛋白氨基酸序列和SpyCEP氨基酸序列的嵌合肽。M-蛋白氨基酸序列可以位于SpyCEP氨基酸序列的C-末端，或反之亦然。在一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合肽可以包含氨基酸序列NSDNIKENQFEDFDEDWENFQAEDKVKQSREAKKQVEKALKQLEDKVQ(SEQIDNO:3)或其變體。在替代實(shí)施方案中，可以產(chǎn)生包含M-蛋白氨基酸序列和SpyCEP氨基酸序列的各個(gè)脂質(zhì)體用于以“混合物”施用。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，變體M蛋白或肽可以在其N和/或C-末端包含一個(gè)或多個(gè)賴氨酸殘基。多個(gè)賴氨酸殘基(例如聚賴氨酸)可以為賴氨酸殘基的線性序列或者可以為賴氨酸殘基的支鏈序列。這些另外的賴氨酸殘基可以促進(jìn)增加的肽的可溶性。J8肽變體的非限制性實(shí)例包括：SREAKKQSREAKKQVEKALKQVEKALC(SEQID NO:5)SREAKKQSREAKKQVEKALKQSREAKC(SEQIDNO:6)SREAKKQVEKALKQSREAKKQVEKALC(SEQIDNO:7)SREAKKQVEKALDASREAKKQVEKALC(SEQIDNO:8)其它變體可以基于諸如Cooperetal.,1997中所述的七肽。舉例來說，如果已知表位位于α-螺旋蛋白結(jié)構(gòu)構(gòu)象內(nèi)，那么可以合成折疊成該構(gòu)象的模式肽。我們基于GCN4亮氨酸拉鏈的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)了模式α-螺旋卷曲螺旋肽(O’Sheaetal.,1991)。第一七肽含有序列MKQLEDK(SEQIDNO:9)，其包含穩(wěn)定卷曲螺旋七肽重復(fù)基序(a-b-c-d-e-f-g)n中存在的若干特征(Cohen&Parry,1990)。這些包括在位置a和d的大的非極性殘基，在位置e和g的酸/堿對(Glu/Lys)(通常有利于鏈間離子相互作用)以及在位置b、c、f的極性基團(tuán)(與Lupasetal.(1991)的預(yù)測相一致)。GCN4肽還在位置a含有共有的纈氨酸。也已注意到，當(dāng)位置a和d被V和L占據(jù)時(shí)，卷曲螺旋二聚體為優(yōu)選的(Harburyetal.,1994)。模式七肽重復(fù)區(qū)來源于GCN4亮氨酸拉鏈肽的這些共有特征：(VKQLEDK；SEQIDNO:10)，其可能形成α-螺旋卷曲螺旋。該肽變?yōu)榭蚣茈?。研究中的?gòu)象表位的重疊片段嵌入模式卷曲螺旋肽中以產(chǎn)生嵌合肽。每當(dāng)在模式肽和表位序列中發(fā)現(xiàn)相同的殘基時(shí)，將設(shè)計(jì)成確保正確的螺旋卷曲螺旋構(gòu)象的氨基酸置換(Cohen&Parry,1990)摻入嵌合肽中。通常使用下述置換：位置a，V至I；b，K至R；c，Q至N；d，L至A；e，E至Q；,f:D至E；g，K至R。所有這些替換殘基通常見于卷曲螺旋蛋白中各自的位置(Lupasetal.,1991)。描述于Oliveetal.,2002,Infect&Immun.702734中的一個(gè)特定的J8肽衍生物為“脂質(zhì)核心肽”。在一個(gè)實(shí)施方案中，脂質(zhì)核心肽可以包含直接在偶聯(lián)至親脂性錨的分枝的聚賴氨酸核心的每個(gè)賴氨酸的兩個(gè)氨基上合成的多個(gè)J8肽(例如四個(gè)J8肽)。M蛋白片段或變體和/或SpyCEP片段或變體可以被衍生化以包含促進(jìn)錨定于上文所述的脂質(zhì)上層的一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)。在另一實(shí)施方案中， 包含M-蛋白氨基酸序列和SpyCEP氨基酸序列的嵌合肽(例如SEQIDNO:3)可以在其N-末端包含間隔子氨基酸序列。因此，在SpyCEP片段或變體包括在脂質(zhì)囊泡的實(shí)施方案中，可以連同M蛋白片段或變體一起分別地脂質(zhì)化或者可以以脂質(zhì)化的嵌合肽存在。本發(fā)明的分離的免疫原性蛋白、片段和/或衍生物可以通過本領(lǐng)域已知的任何手段來產(chǎn)生，所述手段包括但不限于化學(xué)合成、重組DNA技術(shù)和蛋白水解裂解以產(chǎn)生肽片段?；瘜W(xué)合成包括固相和液相合成。盡管參考SYNTHETICVACCINESEd.Nicholson(BlackwellScientificPublications)的第9章以及CURRENTPROTOCOLSINPROTEINSCIENCEEds.Coliganetal.,(JohnWiley&Sons,Inc.NYUSA1995-2008)的第15章中提供的化學(xué)合成技術(shù)的實(shí)例，但此類方法為本領(lǐng)域熟知的。在這方面，還參考了國際公布WO99/02550和國際公布WO97/45444。重組蛋白可以使用標(biāo)準(zhǔn)方案通過本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員方便地制備，所述標(biāo)準(zhǔn)方案描述于例如Sambrooketal.,MOLECULARCLONING.ALaboratoryManual(ColdSpringHarborPress,1989)，特別是第16部分和第17部分；CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGYEds.Ausubeletal.,(JohnWiley&Sons,Inc.NYUSA1995-2008)，特別是第10章和第16章；以及CURRENTPROTOCOLSINPROTEINSCIENCEEds.Coliganetal.,(JohnWiley&Sons,Inc.NYUSA1995-2008)，特別是第1章、第5章和第6章。通常，重組蛋白制備包括在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼蛋白的核酸。如上文所述，本發(fā)明提供了免疫原性劑和/或它們用于預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物或其它動(dòng)物中病原體相關(guān)的疾病、病癥或病況的用途。如本文所用，“治療(treating/treat/treatment)”是指在開始形成之后至少部分地改善、消除或減少病原體相關(guān)的疾病、病癥或病況的癥狀或病理學(xué)跡象的治療性干預(yù)。治療不一定絕對有益于對象。有益效果可以使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何方法或標(biāo)準(zhǔn)來測定。如本文所用，防止(preventing/prevent/prevention)是指在感染或暴露于A群鏈球菌之前和/或A群鏈球菌相關(guān)的疾病、病癥或病況的癥狀或病理 學(xué)跡象發(fā)作之前開始的以便防止感染和/或減少癥狀或病理學(xué)跡象的作用過程。也應(yīng)理解此類防止不一定絕對有益于對象?！邦A(yù)防性”治療是為了降低患有疾病、病癥或病況的癥狀或病理學(xué)跡象的風(fēng)險(xiǎn)的目的，施用于未顯示出疾病、病癥或病況的跡象或者僅顯示出早期跡象的對象的治療。疾病、病癥或病況可以為A群鏈球菌相關(guān)的疾病、病癥或病況。在本發(fā)明的背景下，“A群鏈球菌相關(guān)的疾病、病癥或病況”意指由A群鏈球菌感染引起的任何臨床病理學(xué)并且包括蜂窩織炎、丹毒、膿皰病、猩紅熱、喉感染如急性咽炎(“鏈球菌性喉炎”)、菌血癥、中毒性休克綜合征、壞死性筋膜炎、急性風(fēng)濕熱和急性腎小球腎炎，盡管不局限于此。如上文所述，本文公開的用于治療和/或免疫的用途包括向哺乳動(dòng)物施用包括M蛋白片段、變體或衍生物、脂質(zhì)囊泡、載體蛋白和/或SpyCEP肽或促進(jìn)中性粒細(xì)胞活性恢復(fù)或增強(qiáng)的其它片段的免疫原性劑。如本文所公開的，治療和/或免疫可以另外包括如通過靶向SpyCEP在感染部位(例如皮膚)施用治療上治療GAS感染的抗體或抗體片段和/或結(jié)合M蛋白、其片段或變體的抗體或抗體片段?？贵w和抗體片段可以為多克隆的或單克隆的、天然的或重組的?？贵w片段包括Fc、Fab或F(ab)2片段和/或可以包括單鏈Fv抗體(scFv)。此類scFv可以例如根據(jù)分別描述于下述的方法來制備：美國專利第5,091,513號、歐洲專利第239,400號或Winter&Milstein,1991,Nature349:293的文章?？贵w還可以包括含有多個(gè)scFv的多價(jià)重組抗體片段，如雙鏈抗體、三鏈抗體和/或四鏈抗體，以及二聚作用活化的半鏈抗體(demibodies)(例如WO/2007/062466)。舉例來說，此類抗體可以根據(jù)描述于Holligeretal.,1993ProcNatlAcadSciUSA906444；或者Kipriyanov,2009MethodsMolBiol562177中的方法來制備?？蓱?yīng)用于抗體產(chǎn)生、純化和用途的熟知方案可以見于，例如Coliganetal.,CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY(JohnWiley&SonsNY,1991-1994)的第2章和Harlow,E.&Lane,D.Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,ColdSpringHarborLaboratory,1988。用于產(chǎn)生多克隆抗體的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是熟知的?？梢允褂玫氖纠苑桨该枋鲇诶鏑oliganetal.,CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY,見上文和Harlow&Lane,1988,見上文中。在特定實(shí)施方案中，抗-SpyCEP多克隆抗體可以獲得自或純化自來自暴露于或感染A群鏈球菌的個(gè)體的人血清?？蛇x地，對于純化的或重組的SpyCEP或其免疫原性片段，多克隆抗體在諸如馬的產(chǎn)生物種中可以升高，然后在施用之前隨后純化。單克隆抗體可以通過來源于已接種過本發(fā)明的一種或多種分離的蛋白、片段、變體或衍生物的產(chǎn)生物種的永生化脾或其它產(chǎn)生抗體的細(xì)胞使用標(biāo)準(zhǔn)方法來制備，例如最初描述于&Milstein,1975,Nature256,495中的文章或者通過例如描述于Coliganetal.,CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY(見上文)的近來修改的文章來產(chǎn)生。因此，針對根據(jù)本發(fā)明使用的M蛋白片段、變體或衍生物和/或促進(jìn)中性粒細(xì)胞活性恢復(fù)或增強(qiáng)的試劑(例如SpyCEP)，單克隆抗體可以升高。在某些實(shí)施方案中，單克隆抗體或其片段可以為重組形式。如果單克隆抗體最初由非人類哺乳動(dòng)物的脾細(xì)胞產(chǎn)生，則這可以特別有利于“人源化”單克隆抗體或片段。對于與治療性抗體相關(guān)的實(shí)施方案，優(yōu)選的M蛋白片段可以為p145肽。用于抗體產(chǎn)生的SpyCEP的優(yōu)選片段可以包括下述氨基酸序列或者由下述氨基酸序列組成：NSDNIKENQFEDFDEDWENF(SEQIDNO:2)。在某些方面和實(shí)施方案中，免疫原性劑可以以制劑形式施用。在優(yōu)選形式中，制劑包含可接受的載體、稀釋劑或賦形劑?！翱山邮艿妮d體、稀釋劑或賦形劑”意指可以安全用于全身施用的固體或液體填充劑、稀釋劑或封裝物質(zhì)。取決于特定的施用途徑，可以使用本領(lǐng)域熟知的多種載體、稀釋劑和賦形劑。這些可以選自糖、淀粉、纖維素及其衍生物、麥芽、明膠、滑石、硫酸鈣、植物油、合成油、多元醇、海藻酸、磷酸鹽緩沖液、乳化劑、等滲鹽水和鹽(如無機(jī)酸鹽，包括鹽酸鹽、溴酸鹽和硫酸鹽；有機(jī)酸鹽，如乙酸鹽、丙酸鹽和丙二酸鹽)、水和無熱原水。描述可接受的載體、稀釋劑和賦形劑的有空的參考資料為Remington’sPharmaceuticalSciences(MackPublishingCo.N.J.USA,1991)，其通過引用并入本文。優(yōu)選地，為了引發(fā)免疫應(yīng)答的目的，某些免疫學(xué)試劑可以與本文公開的免疫原性劑組合用于制劑中。術(shù)語“免疫學(xué)劑(試劑)”包括本領(lǐng)域熟知的其范圍內(nèi)的載體、遞送試劑、免疫刺激劑和/或佐劑。本領(lǐng)域?qū)?huì)理解，免疫刺激劑和佐劑指或者包含一種或多種增強(qiáng)制劑的免疫原性和/或效力的物質(zhì)。合適的免疫刺激劑和佐劑的非限制性實(shí)例包括：角鯊?fù)楹徒酋徬?或其它植物或動(dòng)物來源的油)；嵌段共聚物；洗滌劑如吐溫礦物油如Drakeol或Marcol、植物油如花生油；棒狀桿菌來源的佐劑如短小棒狀桿菌(Corynebacteriumparvum)；丙酸桿菌來源的佐劑如痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacne)；牛型分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)(卡介苗或BCG)；百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)抗原；破傷風(fēng)類毒素；白喉類毒素；表面活性物質(zhì)如十六胺、十八胺、十八基氨基酸酯、溶血卵磷脂、二甲基雙二十八烷基溴化銨、N,N-dicoctadecyl-N’,N’二(2-羥乙基-丙二酰胺)、甲氧基十六烷甘油和復(fù)合多元醇；聚胺如吡喃、硫酸葡聚糖、聚IC羧乙烯；肽如胞壁酰二肽和衍生物、二甲基甘氨酸、促吞噬素；油乳劑；以及礦物凝膠如磷酸鋁、氫氧化鋁或鋁；白介素如白介素2和白介素12；單核因子如白介素1；腫瘤壞死因子；干擾素如γ干擾素；免疫刺激性DNA如CpGDNA、組合物如皂苷氫氧化鋁或QuilA氫氧化鋁；脂質(zhì)體；和佐劑；分枝桿菌細(xì)胞壁提取物；合成的糖肽如胞壁酰二肽或其它衍生物；阿夫利定；脂質(zhì)A衍生物；硫酸葡聚糖；單獨(dú)的DEAE葡聚糖或與磷酸鋁一起的DEAE葡聚糖；羧聚乙烯如Carbopol’EMA；丙烯酸共聚物乳劑如NeocrylA640(例如美國專利號5,047,238)；油包水乳化劑如MontanideISA720；脊髓灰質(zhì)炎病毒、牛痘或動(dòng)物痘病毒蛋白；或者它們的混合物。免疫學(xué)試劑可以包含：載體蛋白如甲狀腺球蛋白；白蛋白如人血清白蛋白；毒素、類毒素或來自破傷風(fēng)、白喉、百日咳、假單胞菌、大腸桿菌、葡萄球菌以及鏈球菌的毒素的任何突變體交叉反應(yīng)性物質(zhì)(CRM)； 聚氨基酸如聚(賴氨酸：谷氨酸)；流感；輪狀病毒VP6、細(xì)小病毒VP1和VP2；乙型肝炎病毒核心蛋白；乙型肝炎病毒重組疫苗等。可選地，可以使用載體蛋白的片段或表位或者其它免疫原性蛋白。例如，可以使用細(xì)菌毒素、類毒素或CRM的T細(xì)胞表位。在該方面，可以參考美國專利號5,785,973，將其以引用的方式并入本文?？紤]任何合適的方案以用于產(chǎn)生疫苗制劑。示例性方案包括，例如NewGenerationVaccines(1997,Levineetal.,MarcelDekker,Inc.NewYork,Basel,HongKong)中所述的那些，將其以引用的方式并入本文。可以采用任何安全的給藥途徑，包括：鼻內(nèi)給藥、口服給藥、直腸給藥、腸胃外給藥、舌下給藥、頰部給藥、靜脈內(nèi)給藥、關(guān)節(jié)內(nèi)給藥、肌肉內(nèi)給藥、真皮內(nèi)給藥、皮下給藥、吸入給藥、眼內(nèi)給藥、腹膜內(nèi)給藥、腦室內(nèi)給藥、局部給藥、粘膜給藥以及經(jīng)皮給藥，盡管不限于此。劑型包括片劑、分散液、懸液、注射劑、溶液、糖漿劑、錠劑、膠囊、鼻腔噴霧、栓劑、氣霧劑、皮膚貼片等。這些劑型還可以包括為該目的專門設(shè)計(jì)的注射或植入控制的釋放裝置或者改進(jìn)的其它形式的埋植劑，從而以該種形式額外發(fā)揮作用?？蒯尶赡苁苁杷酆衔锇坏挠绊懀鍪杷酆衔锇ū┧針渲?、蠟、高級脂肪醇、聚乳酸和聚乙醇酸以及某些纖維素衍生物如羥丙基甲基纖維素。制劑可以呈分離的單元，如膠囊、囊劑、功能性食品/飼料或片劑，其各包含預(yù)先確定量的本發(fā)明的一種或多種治療劑；呈粉末或顆粒囊或者呈水性液體、非水性液體、水包油乳液或油包水液體乳液中的溶液或懸液。可以通過任何藥學(xué)方法來制備此類制劑，但是所有方法都包括下述步驟：將如上文所述的一種或多種試劑與組成一種或多種必需組分的載體聯(lián)合。一般而言，通過下述來制備所述制劑：將本發(fā)明的試劑與液體載體或充分磨碎的固體載體或這兩者均勻且密切地混合，然后，如果需要，將產(chǎn)物塑成期望的形式。上述制劑可以以與所述劑型相容的方式使用，且其所用劑量為有效的。在本發(fā)明的背景下，施用于患者的劑量應(yīng)足以在一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間后在患者中產(chǎn)生有益的應(yīng)答。待施用于患者的藥劑的量可取決于待治療的對象，包括其年齡、性別、體重和總體健康狀況，取決于醫(yī)生判斷的因 素。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述制劑適于經(jīng)鼻內(nèi)施用于對象。如本文通常所用，術(shù)語“患者”、“個(gè)體”和“對象”被使用于本文公開的治療或制劑的任何哺乳動(dòng)物接受者。因此，本文公開的方法和制劑可用于醫(yī)療和/或獸醫(yī)應(yīng)用。在優(yōu)選的形式中，所述哺乳動(dòng)物為人。為使本發(fā)明可被充分理解并產(chǎn)生實(shí)際效果，參照以下非限制性實(shí)施例。實(shí)施例實(shí)施例1前言A群鏈球菌(GAS)主要感染人的上呼吸道(URT)粘膜以及皮膚，導(dǎo)致眾多疾病。感染可導(dǎo)致中毒性休克綜合征、壞死性筋膜炎和肌肉炎。壞死性筋膜炎發(fā)病率為10萬分之一，而死亡率高達(dá)70％(1)。后鏈球菌病—風(fēng)濕熱(RF)和風(fēng)濕性心臟病(RHD)—同樣備受關(guān)注。約有1560萬RHD現(xiàn)患病例，并且每年幾乎40萬例死亡(2)。細(xì)菌定殖于URT后最常見的疾病是咽炎，而RF和RHD與未治療的咽部主要感染密切相關(guān)(3)。GAS感染及其相關(guān)疾病在熱帶地區(qū)、發(fā)展中國家和發(fā)達(dá)國家的本地人群中普遍存在，每年導(dǎo)致50萬例死亡(4)，突顯了疫苗的亟需。GAS疫苗候選物可分為基于M蛋白和非M蛋白的疫苗(5)。細(xì)胞表面的M蛋白(由3個(gè)主要結(jié)構(gòu)域組成的盤繞的卷曲蛋白)是主要的毒性決定因素(6)。該蛋白由高變的氨基末端和用于流行病學(xué)分子分型(emm或M分型)的A-重復(fù)結(jié)構(gòu)域；B-重復(fù)結(jié)構(gòu)域和保守的C-重復(fù)結(jié)構(gòu)域(6)組成。基于臨床研究的主要亞單位疫苗是氨基末端M蛋白-基多價(jià)疫苗和保守的C-重復(fù)M蛋白肽疫苗(5)?；谄湔T導(dǎo)全身免疫力的成功，這些GAS疫苗候選物已進(jìn)入臨床試驗(yàn)(7)。已證明全身免疫力有效阻止GAS向深層組織傳染病，并在全身位點(diǎn)通過血清免疫球蛋白(Ig)防止疾病，但沒有阻止其在粘膜位置的定殖，從而導(dǎo)致人與人之間的傳染(8)。因此，全身疫苗并非誘導(dǎo)針對GAS的免疫力的最佳方法。相反，經(jīng)鼻施用的針對各種生物體的粘膜疫苗在全身和粘膜隔室有效地誘導(dǎo)了抗原特異性免疫應(yīng)答 (9-11)。由于這樣的雙層保護(hù)性免疫力，粘膜疫苗是應(yīng)對全身和粘膜GAS感染的理想策略，其增加的益處為，對粘膜定殖的阻止也會(huì)通過來自UTR的液滴和氣溶膠抑制傳染(7)。考慮到疫苗的發(fā)展，粘膜疫苗在經(jīng)濟(jì)上也是有益的。由于易于經(jīng)鼻施用疫苗，可免于使用針具(7)。無痛遞送有助于得到患者的極大配合?；趤碜訫蛋白的保守C3-重復(fù)結(jié)構(gòu)域的最小B細(xì)胞表位，我們此前確定了一種疫苗候選物肽J8(12)。該J8肽(QAEDKVKQKQLEDKVQ；SEQIDNO:1)為嵌合肽，其含有來自C-區(qū)(顯示為黑體字)的12個(gè)氨基酸，側(cè)翼有GCN4DNA-結(jié)合蛋白序列，以維持正確的螺旋構(gòu)象結(jié)構(gòu)(13)。當(dāng)連接至載體蛋白白喉類毒素(DT)并與明礬一起施用時(shí)，J8誘導(dǎo)了IgG抗體，其保護(hù)小鼠抵御多種GAS菌株的全身和皮膚激發(fā)(4,13)。而且，當(dāng)與限于動(dòng)物的粘膜助劑CTB(14,15)一起施用，或當(dāng)作為蛋白酶體施用時(shí)(16)，基于GAS的M蛋白保守區(qū)的疫苗候選物有效地保護(hù)了抵御GAS鼻內(nèi)感染。當(dāng)誘導(dǎo)了粘膜免疫力和降低的URT定殖時(shí)，確定了與IgA產(chǎn)生的相關(guān)性。清楚這點(diǎn)以后，我們的目標(biāo)是開發(fā)基于J8的人相容性粘膜疫苗。然而，開發(fā)用于人的粘膜疫苗的限制之一是，缺少安全有效的粘膜助劑(17,18)。脂質(zhì)體是由生物相容性磷脂雙層組成的球狀囊泡，其可裝載和遞送親水和疏水分子(19)。脂質(zhì)體已通過鼻內(nèi)途徑安全地遞送至人體(20,21)。然而，呈遞肽抗原的脂質(zhì)體并非誘導(dǎo)肽特異性抗體應(yīng)答的理想平臺(tái)。肽僅包含有限的能夠激活B細(xì)胞抗體反應(yīng)所需的輔助T細(xì)胞的抗原表位。它們需要綴合至“載體”蛋白以使其在遠(yuǎn)交種群產(chǎn)生免疫性，因此其由脂質(zhì)體來呈遞并非非常合適。不過，由顆粒如脂質(zhì)體賦予的免疫原性增強(qiáng)并不奇怪，因?yàn)樘烊徊≡w也是顆粒，且被免疫系統(tǒng)很好地識(shí)別(22)。脂質(zhì)體與抗原呈遞細(xì)胞相互作用的天然傾向已作為用脂質(zhì)體來呈遞抗原至免疫系統(tǒng)的主要原理(23)。該研究的目的是開發(fā)基于J8的脂質(zhì)體制劑(在缺少助劑時(shí))，其中親脂性J8構(gòu)建體被并入脂質(zhì)雙層，且親水性載體蛋白(DT)被包封于內(nèi)部的含水核心中。材料和方法小鼠。采用的所有動(dòng)物方案均經(jīng)格里菲斯大學(xué)基于動(dòng)物工作的倫理審查委員會(huì)(GriffithUniversityResearchEthicsReviewBoardforAnimal-BasedWork,GURefNo:GLY/09/14/AEC)批準(zhǔn)。該研究實(shí)施嚴(yán)格執(zhí)行澳大利亞全國健康和醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)(NHMRC)的關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指南。所選的方法最大限度減少小鼠的痛苦和折磨，由受過訓(xùn)練的實(shí)驗(yàn)人員每天觀察動(dòng)物。采用CO2吸入室處死小鼠。人的血液。經(jīng)知情同意書，在格里菲斯大學(xué)健康中心由抽血技術(shù)人員從捐獻(xiàn)者獲得血液。該研究由格里菲斯大學(xué)人類研究倫理委員會(huì)(GUHREC,Protocol#GLY/03/14/HREC)批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)人員處理樣品前，將其去識(shí)別化。J8-脂質(zhì)-DT制劑。為促進(jìn)J8與脂質(zhì)雙層的非共價(jià)配位，將由兩個(gè)棕櫚酸(C16)組成的疏水錨添加至存在于J8氨基末端的三肽間隔子(由LysSerSer組成)的賴氨酸的ε和伯氨基(C16-C16-KSSJ8)。該構(gòu)建體由上海強(qiáng)耀生物科技有限公司(ChinapeptidesCo.,Ltd.,Shanghai,China)生產(chǎn)。該構(gòu)建體的預(yù)計(jì)分子量(MW4061.97g/mol)通過ESI-MS驗(yàn)證，獲得的產(chǎn)品純度大于95％(通過分析性RP-HPLC面積的曲線下分析)。采用薄膜水合作用法(42)制備脂質(zhì)體。采用來自AvantiPolarLipids公司(Alabaster,UnitedStates)的脂質(zhì)體，摩爾比為，7二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC):2膽固醇Cholesterol(CHOL):1L-α-磷脂酰甘油(PG)。采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將氯仿(CHCl3)溶液中的脂質(zhì)體與預(yù)定量的C16-C16-KSSJ8涂布至圓底燒瓶。所用的體積為：0.7ml的DPPC(10mg/ml)于CHCl3中，0.2ml的CHOL(5mg/ml)于CHCl3中，以及0.1ml的PG(10mg/ml)于CHCl3中。然后將脂薄膜水化，并在室溫通過劇烈攪拌分散于含有預(yù)定量DT的1mL磷酸鹽緩沖液。將得到的脂質(zhì)體懸浮液以16,162g離心10min，移除上清液，將脂質(zhì)體小球重懸于合適量的待施用于小鼠的PBS中。為確定DT的封裝效率，收集上清液，并采用NanoDrop2000紫外可見分光光度計(jì)測定上清液中未包封的DT的量(ThermoScientific,Massachusetts,United States)。從用于再水化脂質(zhì)以產(chǎn)生脂質(zhì)體的PBS起始DT濃度減去上清液的DT濃度，允許定量包封效率。于25℃用具有一次性毛細(xì)管比色皿的納米顆粒分析儀(ZetasizerNanoSeriesZS,MalvernInstruments,UnitedKingdom)測量脂質(zhì)體的平均粒徑(nm)。用非侵入性反向散射系統(tǒng)分析尺寸，并以173°散射角進(jìn)行測量。相關(guān)的時(shí)間基于每次運(yùn)行10秒，每個(gè)測量至少連續(xù)運(yùn)行5次。采用散射技術(shù)軟件(DispersionTechnologySoftware,MalvernInstruments,UnitedKingdom)分析獨(dú)立的三個(gè)重復(fù)測量的平均值得出結(jié)果。通過針對J8-Lipo-DT顯示的低多分散指數(shù)(PDI)0.238確定均質(zhì)大小分布。PDI是樣品大小分布多窄的指示，其值大于0.7指示樣品具有寬的大小分布。小鼠的鼻內(nèi)免疫。用甲苯噻嗪和氯胺酮(噻嗪:氯胺酮:H2O＝1:1:10的混合物)的混合物，麻醉待免疫的B10.BR和BALB/c小鼠(AnimalResourcesCentre,WesternAustralia,Australia)。對小鼠施用總體積20μLPBS(10μL/鼻孔)中的30μg單獨(dú)J8-Lipo-DT，而對照小鼠施用20μL的PBS(10μL/鼻孔)。陽性對照小鼠接受30μg的綴合至DT的J8，同時(shí)施用總體積20μLPBS中的10μgCTB(SigmaAldrich,St.Louis,UnitedStates)。以和初次免疫相同的方式，小鼠間隔21天接受兩次加強(qiáng)免疫。其他對照小鼠如上所述接受等量的單獨(dú)的J8、DT或脂質(zhì)體。血清、唾液和排泄物樣品收集。初次免疫后，在第20、40和60天收集血清，以測定J8-特異性全身抗體的水平。通過尾動(dòng)脈收集小鼠的血液，于37℃允許凝集至少30min。以1000g離心10min后收集血清，于56℃加熱滅活10min并在–20℃存儲(chǔ)。對小鼠施用50μL的0.1％毛果蕓香堿溶液以誘導(dǎo)分泌唾液。將唾液收集至含有2μL的50mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)蛋白酶抑制劑(SigmaAldrich)的微量離心管中。以13,000g離心10min分離微粒物質(zhì)，將樣品在-80℃儲(chǔ)存。從單只小鼠收集6-10份新鮮的排泄物糞球，冷凍并凍干。測定糞球固體的干重，然后通過渦旋將其重懸于5％脫脂奶粉，50mmol/LEDTA (SigmaAldrich)，0.1mg/mL大豆胰蛋白酶抑制劑(SigmaAldrich)和2mmol/LPMSF(20μL/mg干重)中。以15,000g離心10min分離固體物質(zhì)，將上清液在-80℃儲(chǔ)存。通過酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)鑒定抗體滴度如其他處所描述的(43)，使用ELISA來測量J8-特異性血清IgG和粘膜IgA，用碳酸鹽包被緩沖液(pH9.6)將J8肽稀釋至0.5mg/ml，并且以100μl/孔的體積將其包被在聚碳酸酯板上，于4℃孵育過夜，去除未結(jié)合肽，并且用150μl的5％脫脂乳PBS-吐溫20于37℃將所述孔封閉2小時(shí)，然后用PBS-吐溫20緩沖液將所述板洗滌3次，在0.5％脫脂乳PBS-吐溫20緩沖液中，在板中對樣品進(jìn)行系列稀釋，其開始于1:100的最初稀釋至1:12,800的最終稀釋(對于血清)，以及1:2至1:256(對于唾液/糞便樣品)，將各個(gè)樣品稀釋成100μl的總體積，并于37℃孵育1.5小時(shí)，將所述板洗滌5次，并且將過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG或IgA(Invivogen，SanDiego，UnitedStates)以1:3000或1:1000的稀釋度分別地加在0.5％脫脂乳PBS-吐溫中，于37℃孵育1.5小時(shí)，洗滌后，根據(jù)制造商的說明書添加100μlOPD底物(SigmaAldrich)，并且在室溫下暗孵育30分鐘，在Victor31420多標(biāo)記計(jì)數(shù)儀(PerkinElmerLifeandAnalyticalSciences，Shelton，UnitedStates)中，于450nm下測量吸光度，滴度被描述為得到超過陰性對照孔(含有用PBS免疫的正常小鼠血清)的平均吸光度的>3標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)的吸光度的最低稀釋度，利用單因素方差分析(ANOVA)與Tukey事后檢驗(yàn)，利用GraphPadPrism5軟件(GraphPad，California，UnitedStates)測定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p<0.05)。GAS激發(fā)的過程初次免疫后第63天，用預(yù)定劑量的GAS菌株M1經(jīng)鼻內(nèi)激發(fā)免疫小鼠和對照小鼠。GAS菌株M1已在小鼠脾臟中被連續(xù)地傳代以提高毒力，并得到鏈霉素抗性使得咽拭子中的GAS與正常的鼠細(xì)菌菌群不同(44)。為了測定GAS的定殖，激發(fā)后1-3天，從小鼠獲得咽拭子，將所述咽拭子劃線培養(yǎng)于含有2％去纖維蛋白馬血的Todd-Hewitt瓊脂板上，并于37℃過夜孵育。通過將各個(gè)小鼠的鼻孔壓在哥倫比亞血瓊 脂(CBA)板的表面十次(三個(gè)重復(fù)的CBA板/小鼠/天)測定鼻脫落物中的細(xì)菌負(fù)荷，并且將呼出的粒子劃線培養(yǎng)。第3天，對小鼠進(jìn)行揀選，在PBS中使器官樣品均質(zhì)化，并且使用澆注平板法，將樣品以三個(gè)重復(fù)的方式接種，對于鼻脫落物和咽拭子，結(jié)果被表示為平均克隆形成單位(CFU)+均數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)，用于第1、2和3天的10只小鼠/組。對于器官樣品，結(jié)果被表示為平均CFU+SEM，用于第3天的10只小鼠/組。用GraphPadPrism5，利用非參數(shù)、非成對的Mann-WhitneyU檢驗(yàn)分析差異性來比較測試組與PBS對照組(p<0.05被認(rèn)為是顯著的).DC的制備和成熟從健康志愿者收集外周血，并基于Ficoll-Paque(AmershamPharmacia，Uppsala，Sweden)，通過標(biāo)準(zhǔn)過程將其分級，基于FicollPaque，通過離心收獲PBMC，洗滌并以每0.35mLMACS緩沖液(MiltenyiBiotecS.L.，Germany)1x108個(gè)細(xì)胞的最終密度重懸。利用PanDC分離試劑盒(MiltenyiBiotec)，根據(jù)制造商的說明書分離DC，將得到的DC群體重懸于補(bǔ)充有10％FCS(Gibco)的RPMI1640(Gibco，Gaithersburg，UnitedStates)完全培養(yǎng)基(具有2mMl-谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，1％Pen-strep，10mMHEPES)。接種總體積0.2mL的DC(2X106)，并按所示添加下述刺激物：單獨(dú)的10μg/mL的pIC(Invivogen，SanDiego，UnitedStates)，單獨(dú)的J8-Lipo-DT(150μg/mL)或單獨(dú)的完全培養(yǎng)基，孵育24小時(shí)。24小時(shí)后收集上清液，并儲(chǔ)存于–20℃。通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行免疫表型分析為了分析各種標(biāo)志物的表面表達(dá)，用一種或多種下述熒光團(tuán)標(biāo)記的mAb對處理DC進(jìn)行染色，并利用LSRFortessa細(xì)胞計(jì)數(shù)器(BectonDickinson，California，UnitedStates)和FlowJo軟件(Treestar，Inc.，California，UnitedStates)，通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。利用下述抗體(BectonDickinson)，通過流式細(xì)胞術(shù)分析來評估得到的群體：抗HLA-DR-V450、-CD1c-APC、-CD80-PE-Cy7、-CD83-PE-TexasRed、-CD86-PE、-CD123-Percp-5.5、-CD141-APC-Cy7。用合適的抗體于4℃ 暗染色30分鐘之后，將細(xì)胞用PBS洗滌兩次，并用1％多聚甲醛固定。基于大的粒狀細(xì)胞進(jìn)行設(shè)門，并且從各個(gè)樣品收集2000–5000次設(shè)門事件，簡言之，將HLA-DR陽性細(xì)胞設(shè)門來限定人DC，并且根據(jù)之前確立的方法(45)將其進(jìn)一步細(xì)分為CD141+常規(guī)DC1型、CD1c+DC常規(guī)(髓樣)DC2型和CD123+類漿細(xì)胞DC?；谠O(shè)門群體，測定平均熒光強(qiáng)度(MFI)值。所述數(shù)據(jù)被記錄為平均值+SEM，并且利用Student’st檢驗(yàn)，用GraphPadPrism5軟件(GraphPad，California，UnitedStates)分析差異性。小于0.05的P值被認(rèn)為是顯著的。用抗原體外刺激脾細(xì)胞使用流式微球陣列(CBA)分析和流式細(xì)胞術(shù)分析來定量由于用J8肽刺激后的脾細(xì)胞產(chǎn)生的促炎性應(yīng)答。簡言之，在RPMI1640培養(yǎng)基中制備來自J8-Lipo-DT免疫小鼠的脾臟的不含紅細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液。接種總體積0.1mL的脾細(xì)胞(4x105)，并且按指示添加下述刺激物：單獨(dú)的2μg/mLLPS(SigmaAldrich)、J8(10μg/mL)或RPMI1640培養(yǎng)基，孵育72小時(shí)。72小時(shí)之后分離上清液，并儲(chǔ)存于-80℃，用于CBA流式細(xì)胞分析。通過CBA定量分泌的趨化因子根據(jù)制造商的說明書定量累積的炎癥性細(xì)胞因子的水平。對于小鼠炎癥試劑盒CBA，樣品和標(biāo)準(zhǔn)物的體積被縮減至10μl，并且使用2μl的每種捕獲珠。根據(jù)制造商的推薦，來自人DC孔的上清液使用人炎癥試劑盒CBA(BectonDickinson)。在LSRFortessa細(xì)胞計(jì)數(shù)儀上運(yùn)行樣品，并用FCAP陣列(v1.01forWindows)軟件(BectonDickinson)分析數(shù)據(jù)，所述數(shù)據(jù)被記錄為平均值+均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)，并且利用學(xué)生t檢驗(yàn)，用GraphPadPrism5軟件分析差異。小于0.05的P值被認(rèn)為是顯著的。結(jié)果如材料和方法中所描述的構(gòu)建具有表面相關(guān)的J8肽且含有白喉類毒素的脂質(zhì)體(圖1)。使用基于棕櫚酸的部分將含有每劑量30μgJ8的施用制劑連接至脂質(zhì)體表面。脂質(zhì)體在內(nèi)部含有每劑量30μgDT。通過動(dòng)態(tài) 光散射所測量的，脂質(zhì)體的平均直徑是1.8μm(標(biāo)準(zhǔn)偏差＝100.3nm)(參見材料和方法)。使用初次和2次加強(qiáng)方案，用J8-Lipo-DT和多種對照經(jīng)鼻免疫BALB/c小鼠(每組10只)：單獨(dú)的脂質(zhì)體(Lipo)；包封DT的脂質(zhì)體(Lipo-DT)；J8嵌在脂質(zhì)體表面但是無包封的DT(J8-Lipo)；J8-DT+CTB；PBS+CTB；和PBS。為了與其它構(gòu)建體相比較來評價(jià)J8-Lipo-DT的功效，然后將經(jīng)鼻免疫接種的小鼠用獲自猩紅熱患者的咽分離物M1GAS株鼻內(nèi)激發(fā)(16)。在激發(fā)之前，我們觀察到，相比J8-Lipo，J8-Lipo-DT誘導(dǎo)出較高的J8-特異性IgA(糞便和唾液)和血清IgG滴度。盡管對于任何一組，J8-Lipo-DT和J8-Lipo之間的差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上都不顯著，但是觀察到J8-Lipo-DT對于唾液IgA應(yīng)答、糞便IgA應(yīng)答和血清IgG應(yīng)答是較優(yōu)的(圖2A-C)。用GAS激發(fā)之后，與PBS組相比，在J8-Lipo-DT免疫的小鼠中，鼻涕中的細(xì)菌負(fù)擔(dān)顯著較低，并且與用J8-DT+CTB免疫的小鼠相當(dāng)(第3天，圖3A)。然而，出人意料的是，J8-DT+CTB免疫的小鼠并沒有防御喉嚨或NALT的定植，而J8-Lipo-DT免疫的小鼠則顯示出顯著的防御在兩個(gè)區(qū)域內(nèi)的定植(圖3B和C)。由于J8-Lipo-DT的保護(hù)顯著優(yōu)于J8-Lipo所誘導(dǎo)的保護(hù)。鼠NALT是持續(xù)GAS感染的侵入門戶(24)，并且是人扁桃體的功能同源物(25)。因此，這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了J8-Lipo-DT在降低粘膜GAS感染的優(yōu)選位點(diǎn)的生物負(fù)擔(dān)中的功效。然后，我們疑問J8-Lipo-DT是否能類似地保護(hù)不同品系的小鼠。J8-DT/CTB和PBS充當(dāng)對照免疫原。用J8-Lipo-DT免疫B10.BR小鼠(n＝5)誘導(dǎo)了顯著的J8-特異性抗體滴度(圖4)。唾液和糞便樣品中的粘膜抗體滴度與J8-DT+CTB免疫小鼠中的滴度相當(dāng)(圖4A-B)。為了測試J8-Lipo-DT是否將防御B10.BR小鼠中的GAS感染，另一小鼠群體(n＝5)用GASM1株免疫和激發(fā)。在3天的觀察期內(nèi)監(jiān)測鼻涕和咽拭子。到第2天，J8-Lipo-DT和J8-DT+CTB免疫的小鼠在鼻涕中具有不可檢測的生物負(fù)擔(dān)(圖5A)。與BALB/c小鼠類似，數(shù)據(jù)還證實(shí)，到激發(fā)后2天，J8-Lipo-DT免疫的小鼠的咽拭子沒有細(xì)菌，而在第3天，J8-DT+CTB免疫的小鼠的咽拭子中仍有可檢測水平的GAS(圖5B)。之前的研究證實(shí)了，盡管脂質(zhì)體內(nèi)包封的肽不誘導(dǎo)免疫球蛋白應(yīng)答，但是脂質(zhì)體加脂質(zhì)A(脂多糖的成分)在腹膜內(nèi)免疫之后能誘導(dǎo)抗體應(yīng)答(26)，因而提示脂質(zhì)A的脂尾可以作為佐劑起作用。為了解答將J8錨定于脂質(zhì)體表面的雙C16脂尾是否負(fù)責(zé)抗體應(yīng)答的誘導(dǎo)，另一小鼠群體用C16-C16-KSSJ8、J8-Lipo-DT、J8-DT+CTB或PBS免疫。我們觀察到，J8-Lipo-DT和J8-DT+CTB是免疫原性的，而C16-C16-KSSJ8不是(圖6A-B)。測量來自經(jīng)鼻免疫小鼠的脾細(xì)胞的細(xì)胞因子應(yīng)答，以確定經(jīng)鼻免疫是否誘導(dǎo)了全身的細(xì)胞免疫應(yīng)答，其可以解釋J8-Lipo-DT的自我佐劑性和抗體同種型向IgA的轉(zhuǎn)換。分析了促炎性細(xì)胞因子(γ干擾素[IFN-γ]，白細(xì)胞介素1[IL-1]、IL-6、IL-12p70、單核細(xì)胞趨化蛋白1[MCP-1]、和腫瘤壞死因子α[TNF-α])。將J8-Lipo-DT免疫的B10.BR小鼠處死，并用J8、LPS或介質(zhì)刺激脾細(xì)胞。我們觀察到顯著的應(yīng)答于J8和LPS的IFN-γ、MCP-1和IL-6產(chǎn)生(圖7)。沒有被檢測到所評估的其它細(xì)胞因子。該結(jié)果證實(shí)，用J8-Lipo-DT免疫接種誘導(dǎo)了促炎性應(yīng)答，提供了J8-Lipo-DT自我佐劑性的潛在機(jī)制。具體而言，已知IL-6負(fù)責(zé)抗體應(yīng)答向IgA的轉(zhuǎn)換(27)。此外，已知化學(xué)引誘劑MCP-1在GAS防御機(jī)制中起主要作用(28)。為了評價(jià)J8-Lipo-DT在人體內(nèi)誘導(dǎo)具有自我佐劑活性的有效免疫應(yīng)答的效力，從三名健康志愿者的血液分離樹突細(xì)胞子集，并用J8-Lipo-DT刺激。成熟DC是有效的抗原呈遞細(xì)胞，表達(dá)高水平的參與促進(jìn)抗原識(shí)別和細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的抗原呈遞以及共刺激的細(xì)胞表面分子。為了表征人DC成熟，通過流式細(xì)胞術(shù)檢查多種細(xì)胞表面分子應(yīng)答于J8-Lipo-DT的調(diào)整(圖8A-C)。合成的雙鏈RNA佐劑，多核糖肌苷酸-多核糖胞啶酸(pIC)用作對照(29)。與J8-Lipo-DT一起培養(yǎng)的CD123+類漿細(xì)胞DC(pDC)上的共刺激分子CD80、CD83和CD86的水平顯著較高(圖8A)。在兩個(gè)經(jīng)典DC子集(cDC)，CD141+經(jīng)典1型DC和CD1c+經(jīng)典2型DC中，CD80的表達(dá)也增加(圖8B-C)。此外，CD141+DC的CD86表達(dá)也是增加的(圖8B)。為了進(jìn)一步明確與人DC的相互作用，使用流式細(xì)胞小球微陣列術(shù)評估刺激后促炎性細(xì)胞因子的水平。我們觀察到了促炎性細(xì)胞因子 (TNF-α、IL-6和IL-1β(IL-1β))以及嗜中性粒細(xì)胞化學(xué)引誘劑IL-8的增加的表達(dá)(圖9)。已知嗜中性粒細(xì)胞對GAS感染的IgA控制至關(guān)重要(30)。還觀察到升高水平的抗炎性細(xì)胞因子IL-10(圖9)。這可能是由于IL-10在DC成熟步驟和平衡宿主促炎性應(yīng)答中的調(diào)節(jié)作用(31,32)。然而，具體而言，IL-6應(yīng)答提示，J8-lipo-DT將導(dǎo)致人體中的IgA轉(zhuǎn)換，以及嗜中性粒細(xì)胞應(yīng)答(經(jīng)由IL-8)，將很好地將宿主定位為控制GAS感染。如圖10所示，當(dāng)被單獨(dú)展示以及作為S2-J8嵌合物(SEQIDNO:3)展示時(shí)，由脂質(zhì)體以及囊內(nèi)DT所展示的SpyCEP肽(S2；SEQIDNO:2)引發(fā)了粘膜IgA應(yīng)答。結(jié)合圖11，J8+S2-Lipo-DT誘導(dǎo)了抗原特異性IgA，IgG應(yīng)答。觀察到應(yīng)答于J8-Lipo-DT和S2-Lipo-DT的相當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答。不同的配制策略采用(i)在脂質(zhì)體中的兩種表位(J8+S2-Lipo-DT)或(ii)J8/S2S2-Lipo-DT脂質(zhì)體的摻合物。A群鏈球菌感染能引起多種皮膚和軟組織感染，其中的一些是重度的，甚至是威脅生命的。因此，感興趣的是查看J8-Lipo-DT是否能防御88/30株激發(fā)后的皮膚感染。采用包含DT和J8的脂質(zhì)體的單獨(dú)的經(jīng)鼻施用的初始實(shí)驗(yàn)顯示，J8-Lipo-DT經(jīng)鼻免疫后顯著的IgG滴度，但是在皮膚激發(fā)測定中沒有保護(hù)(數(shù)據(jù)未顯示)。正在從事通過不同脂質(zhì)體制劑或通過用皮下給予J8-DT+Alum免疫的全身IgG應(yīng)答的增強(qiáng)。討論我們已經(jīng)開發(fā)出了A群鏈球菌(GAS)的粘膜活性亞單元脂質(zhì)體疫苗候選物。將脂質(zhì)體的粘膜刺激特性與蛋白載體DT的封裝和脂質(zhì)體表面上的GAS特異性B細(xì)胞表位的展示相結(jié)合。肽和載體蛋白都是最佳免疫力所需要的。復(fù)合脂質(zhì)體所誘導(dǎo)的粘膜免疫力優(yōu)于與CTB一起給予的肽-蛋白綴合物所誘導(dǎo)的粘膜免疫力。粘膜免疫作為激發(fā)針對感染性疾病的保護(hù)性免疫的手段，引起了強(qiáng)烈的關(guān)注。絕大部分感染發(fā)生在或起始于粘膜表面。因此，能誘導(dǎo)粘膜保護(hù)性免疫應(yīng)答的疫苗的應(yīng)用是理想的并且可行的。在實(shí)踐中，刺激出強(qiáng)的粘膜IgA免疫應(yīng)答常常被證明非常困難，并且利用亞單元 肽抗原進(jìn)行粘膜疫苗接種努力的過程并不理想。這在一定程度上是由于難以刺激出與常規(guī)的基于全生物體的方法相當(dāng)?shù)膹?qiáng)的免疫應(yīng)答。添加佐劑以及將亞單元抗原與蛋白載體綴合作為輔助T細(xì)胞的來源已被證實(shí)對于系統(tǒng)性免疫是有效的。但是，誘導(dǎo)粘膜免疫力仍需要新的策略。脂質(zhì)體相關(guān)聯(lián)的抗原的“地形”位置影響抗原加工和向B細(xì)胞和輔助T細(xì)胞的呈遞(33)。已表明，脂質(zhì)體表面上暴露的抗原被優(yōu)先加工，并由B細(xì)胞呈遞，而脂質(zhì)體封裝的抗原被更有效地加工，并由抗原呈遞細(xì)胞呈遞給T細(xì)胞(34)。由此，疫苗候選物J8-Lipo-DT代表了合理的亞單元脂質(zhì)體疫苗設(shè)計(jì)，這確保B細(xì)胞表位與脂質(zhì)體雙層相關(guān)聯(lián)，以被進(jìn)行暴露而結(jié)合B細(xì)胞的Ig受體，同時(shí)DT的封裝允許有效的遞送、加工和呈遞給T細(xì)胞。我們證實(shí)了包括NALT的URT組織中GAS被清除。疫苗候選物提供的有效的鼻咽免疫力顯示出降低RF和RHD的理想潛力，RF和RHD與主要咽部感染相關(guān)聯(lián)(7)。在人類URT中，扁桃腺是GAS的主要貯留部位，導(dǎo)致全球范圍內(nèi)持續(xù)性的地方性疾病(25)。人類扁桃腺的功能類似物NALT中GAS定殖的減少提示利用J8-Lipo-DT的鼻內(nèi)免疫會(huì)減少人類扁桃腺的定殖和感染，從而減少GAS的傳播(25)。雖然脂質(zhì)體已被報(bào)道用于遞送封裝的肽來誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，這樣的脂質(zhì)體不會(huì)誘導(dǎo)IgA或IgG應(yīng)答，除非存在強(qiáng)的佐劑，例如LipidA(26，35)?？赡艿那闆r是，J8上的脂質(zhì)尾部提供了佐劑活性，因此對J8-Lipo-DT的免疫原性作出貢獻(xiàn)；然而，在自身具有脂質(zhì)尾部的J8肽不具有免疫原性，這表明需要脂質(zhì)體制劑。脂質(zhì)體的自身佐劑的免疫刺激活性已有報(bào)道，并被證實(shí)是由于與抗原呈遞細(xì)胞的相互作用和促炎癥應(yīng)答的誘導(dǎo)(36)。我們的研究中的體外檢測揭示了免疫小鼠中抗原特異性炎癥趨化因子和細(xì)胞因子的誘導(dǎo)。特別值得注意的是抗原特異性MCP-1和IL-6的分泌。MCP-1是淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞的化學(xué)趨附劑(37)。之前被提示參與介導(dǎo)粘膜炎癥，其由于能顯著地增加粘膜IgA分泌而已被報(bào)道為強(qiáng)的粘膜佐劑(37)。雖然抗原可以由很多細(xì)胞類型呈遞給免疫系統(tǒng)，但是天然T細(xì)胞 的準(zhǔn)備需要抗原的成熟和呈遞，以及僅發(fā)現(xiàn)于專職抗原呈遞細(xì)胞(例如DC)的共刺激分子的接合(38)。DC是橋接對感染的先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵要素(39)。成熟DC產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子，上調(diào)共刺激和抗原呈遞分子，并遷移至淋巴結(jié)，在淋巴結(jié)中，它們的功能是作為天然T淋巴細(xì)胞的強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞，以啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。我們證實(shí)，通過體外暴露和誘導(dǎo)包括IL-6和IL-8的促炎癥細(xì)胞因子，J8-Lipo-DT介導(dǎo)人類DC上細(xì)胞表面活化和成熟標(biāo)志物的表達(dá)。人和鼠IL-6在B細(xì)胞終末分化中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并且在粘膜部位，其刺激粘膜部位中IgA的增殖和分泌(27)。針對GAS的IgA特異性免疫需要嗜中性粒細(xì)胞的存在(30)。IL-8在嗜中性粒細(xì)胞的動(dòng)員和活化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。對此，單獨(dú)給予由脂質(zhì)體顆粒遞送體系展示的SpyCEPS2肽(SEQIDNO:2)或聯(lián)合給予J8肽激發(fā)出肽特異性IgA。因此，在人類中賦予對GAS感染的免疫力的根本機(jī)制可以使用脂質(zhì)體平臺(tái)來介導(dǎo)，為基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用的關(guān)聯(lián)性提供了支撐。我們證實(shí)，當(dāng)用J8-Lipo-DT進(jìn)行刺激時(shí)，人類pDC增加成熟和共刺激標(biāo)志物。人類pDC容易地吞噬和加工封裝于顆粒遞送體系中的抗原(40)，表明顆粒遞送體系可用于促進(jìn)抗原向pDC的有效遞送。據(jù)我們認(rèn)為，我們的結(jié)果首次證實(shí)用基于脂質(zhì)體的顆粒遞送體系刺激人類pDC的能力。最初在血液中鑒定出的人類pDC后續(xù)在脾臟、淋巴結(jié)和包括扁桃腺的粘膜部位中已被檢測到(41)。因此，基于脂質(zhì)體的疫苗遞送有潛力被開發(fā)用于將該DC亞組靶向于所需要的人類粘膜免疫應(yīng)答。實(shí)施例2進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)來研究脂質(zhì)體尺寸對免疫原性的影響。脂質(zhì)體擠壓是用熱模塊完成的，利用1mL注射器迷你擠壓機(jī)(AvantiPolarLipids)。使再水化的溶液通過50nm、400nm、1000mm濾器11次(AvantiPolarLipids)，同時(shí)將熱模塊設(shè)定為～40℃。脂質(zhì)體尺寸測量通過Nanosizer進(jìn)行(動(dòng)態(tài)光散射或DLS)。如圖12所示，J8-Lipo-DT可以被擠壓而形成納米或微米尺寸的顆 粒。顆粒尺寸的大部分具有狹窄的分子量分布(低多分散性指數(shù)<0.3)。圖13的數(shù)據(jù)顯示，J8-Lipo-DT尺寸不影響系統(tǒng)性IgG應(yīng)答。但是，如圖14所示，較大尺寸的脂質(zhì)體誘導(dǎo)J8特異性粘膜應(yīng)答。實(shí)施例3進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)來研究脂質(zhì)體的冷凍干燥對免疫原性的影響。用含10％海藻糖的milliQ水使脂質(zhì)體薄膜再水化，然后凍干。凍干后1、4和7周，將J8-Lipo-DT粉末用PBS復(fù)原。圖15顯示了通過Nanosizer(動(dòng)態(tài)光散射或DLS)進(jìn)行的脂質(zhì)體尺寸測量的尺寸結(jié)果。顆粒尺寸的大部分具有狹窄的分子量分布(低多分散性指數(shù)<0.3)。圖16顯示，復(fù)原的凍干的J8-Lipo-DT脂質(zhì)體誘導(dǎo)J8特異性系統(tǒng)應(yīng)答，而不需要額外的佐劑。這是與新鮮制備的J8-Lipo-DT相當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答。海藻糖對于冷凍干燥的J8-Lipo-DT的免疫原性是重要的。圖17顯示，復(fù)原的凍干的J8-Lipo-DT脂質(zhì)體誘導(dǎo)J8特異性粘膜應(yīng)答。實(shí)施例4進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)會(huì)確定包含海藻糖6,6′-二山崳酸酯(TDB)的免疫原性脂質(zhì)體的功效。TDB與脂質(zhì)體配制是基于脂質(zhì)體中總磷脂的百分比。使用9mg的磷脂，TDB使用的比例是該量的20％(1.8mg)。通過利用GAS菌株的免疫后抗體滴度(IgA和IgG抗體)和皮膚激發(fā)實(shí)驗(yàn)測量功效。包含海藻糖6,6′-二山崳酸酯(TDB)的脂質(zhì)體的實(shí)例參見圖18的示意圖。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)會(huì)確定包含膽鹽(例如脫氧膽酸鈉)的免疫原性脂質(zhì)體的功效。包含膽鹽脫氧膽酸鈉的脂質(zhì)體的實(shí)例參見圖19的示意圖。當(dāng)磷脂水合時(shí)，膽鹽會(huì)配制于脂質(zhì)體中以產(chǎn)生脂質(zhì)體(含膽鹽的脂質(zhì)體被稱為“膽汁體(bilosomes)”)。膽汁體的制備如下。在圓底燒瓶中，將摩爾比為7:3:1的山梨聚糖三硬脂酸酯(150mmol)、膽固醇和聯(lián)十六烷基磷酸酯(DCP)以及150g的用棕櫚酸部分修飾的J8被溶解于10mL氯仿中。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除溶劑，以在圓 底燒瓶的玻璃表面上形成薄膜。然后，用含100mg脫氧膽酸鈉(膽汁鹽)以及150g白喉類毒素的3.5mLPBS(pH7.4)使膜水合。總之，本研究首次報(bào)道了基于脂質(zhì)體的粘膜活性GAS疫苗候選物。我們的發(fā)現(xiàn)朝向克服在開發(fā)用于預(yù)防粘膜部位的感染和社區(qū)傳播的GAS疫苗中目前遇到的難題邁出了重要的一步。本研究為脂質(zhì)體顆粒遞送體系如何能整體誘導(dǎo)理想的粘膜免疫應(yīng)答從而對抗GAS感染提供了重要的機(jī)制性啟示。在本說明書中，目的是為了描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，而并不是將本發(fā)明限制于任何一個(gè)實(shí)施方案或特征的特定集合。在不脫離本發(fā)明的寬泛實(shí)質(zhì)和范圍的情況下，可以對本文描述和展示的實(shí)施方案進(jìn)行各種改變和修改。將本文引用的所有的計(jì)算機(jī)程序、算法、專利和科學(xué)文獻(xiàn)通過引用的方式整體并入本文。參考文獻(xiàn)1.BakerA(2012)GroupAstreptococcalinfectionsinprimarycare:acasereport.TheBritishjournalofgeneralpractice:thejournaloftheRoyalCollegeofGeneralPractitioners62(600):388-389.2.ZuhlkeLJ&SteerAC(2013)Estimatesoftheglobalburdenofrheumaticheartdisease.Globalheart8(3):189-195.3.NkomoVT(2007)EpidemiologyandpreventionofvalvularheartdiseasesandinfectiveendocarditisinAfrica.Heart(BritishCardiacSociety)93(12):1510-1519.4.PandeyM,etal.(2015)AsyntheticMproteinpeptidesynergizeswithaCXCchemokineproteasetoinducevaccine-mediatedprotectionagainstvirulentstreptococcalpyodermaandbacteremia.Journalofimmunology(Baltimore,Md.:1950)194(12):5915-5925.5.SteerAC,DaleJB,&CarapetisJR(2013)Progresstowardaglobalgroupastreptococcalvaccine.ThePediatricinfectiousdiseasejournal32(2):180-182.6.MetzgarD&ZampolliA(2011)TheMproteinofgroupAStreptococcusisakeyvirulencefactorandaclinicallyrelevantstrainidentificationmarker.Virulence2(5):402-412.7.GeorgousakisMM,McMillanDJ,BatzloffMR,&SriprakashKS(2009)Movingforward:amucosalvaccineagainstgroupAstreptococcus.Expertreviewofvaccines8(6):747-760.8.GambaMA,etal.(1997)Familialtransmissionofaseriousdisease--producinggroupAstreptococcusclone:casereportsandreview.Clinicalinfectiousdiseases:anofficialpublicationoftheInfectiousDiseasesSocietyofAmerica24(6):1118-1121.9.LangermannS,PalaszynskiS,SadzieneA,StoverCK,&KoenigS(1994)SystemicandmucosalimmunityinducedbyBCGvectorexpressingouter-surfaceproteinAofBorreliaburgdorferi.Nature372(6506):552-555.10.WuHY&RussellMW(1998)InductionofmucosalandsystemicimmuneresponsesbyintranasalimmunizationusingrecombinantcholeratoxinBsubunitasanadjuvant.Vaccine16(2-3):286-292.11.BaldridgeJR,YorgensenY,WardJR,&UlrichJT(2000)MonophosphoryllipidAenhancesmucosalandsystemicimmunitytovaccineantigensfollowingintranasaladministration.Vaccine18(22):2416-2425.12.HaymanWA,etal.(1997)MappingtheminimalmurineTcellandBcellepitopeswithinapeptidevaccinecandidatefromtheconservedregionoftheMproteinofgroupAstreptococcus.Internationalimmunology9(11):1723-1733.13.BatzloffMR,etal.(2003)ProtectionagainstgroupAstreptococcusbyimmunizationwithJ8-diphtheriatoxoid:contributionofJ8-anddiphtheriatoxoid-specificantibodiestoprotection.TheJournalofinfectiousdiseases187(10):1598-1608.14.BessenD&FischettiVA(1990)SyntheticpeptidevaccineagainstmucosalcolonizationbygroupAstreptococci.I.ProtectionagainstaheterologousMserotypewithsharedCrepeatregionepitopes.Journalofimmunology(Baltimore,Md.:1950)145(4):1251-1256.15.BessenD&FischettiVA(1988)InfluenceofintranasalimmunizationwithsyntheticpeptidescorrespondingtoconservedepitopesofMproteinonmucosalcolonizationbygroupAstreptococci.Infectionandimmunity56(10):2666-2672.16.BatzloffMR,etal.(2005)Towardthedevelopmentofanantidisease,transmission-blockingintranasalvaccineforgroupastreptococcus.TheJournalofinfectiousdiseases192(8):1450-1455.17.ZengL,etal.(2015)Compound48/80actsasapotentmucosaladjuvantforvaccinationagainstStreptococcuspneumoniaeinfectioninyoungmice.Vaccine33(8):1008-1016.18.ZamanM,ChandruduS,&TothI(2013)Strategiesforintranasaldeliveryofvaccines.Drugdeliveryandtranslationalresearch3(1):100-109.19.GiddamAK,ZamanM,SkwarczynskiM,&TothI(2012)Liposome-baseddeliverysystemforvaccinecandidates:constructinganeffectiveformulation.Nanomedicine(London,England)7(12):1877-1893.20.ChildersNK,etal.(1999)AcontrolledclinicalstudyoftheeffectofnasalimmunizationwithaStreptococcusmutansantigenaloneorincorporatedinto 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