本發(fā)明涉及藥物組合物，具體涉及一種用于治療肺結(jié)核的藥物組合物。
背景技術(shù)：
：結(jié)核病至今仍是危害我們?nèi)祟惤】档闹饕詡魅拘约膊≈?。?jù)世界衛(wèi)生組織(who)2012年統(tǒng)計(jì)，結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium，簡(jiǎn)稱結(jié)核桿菌)每年可以引起全球約140萬(wàn)人死亡，全球疫情呈上升趨勢(shì)；而且由于耐藥性和多重耐藥性菌株的不斷出現(xiàn)，對(duì)人類構(gòu)成嚴(yán)重的健康威脅?；瘜W(xué)治療雖是結(jié)核病的基本治療手段，但仍存在結(jié)核桿菌清除率低、治療持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、結(jié)核病復(fù)發(fā)率與耐藥結(jié)核發(fā)生率居高不下、化療愈后肺功能狀況下降等問(wèn)題，而且化學(xué)藥物毒副作用大，對(duì)胃、肝、腎等器官有不同程度的損傷。因此，開(kāi)發(fā)出一種新的無(wú)毒的天然藥物組合物，用于治療結(jié)核桿菌，很有現(xiàn)實(shí)意義。目前，基于對(duì)殼聚糖的研究，已報(bào)道了其具有抑菌、抗腫瘤、調(diào)血脂、調(diào)節(jié)免疫和促進(jìn)傷口修復(fù)等多種功能，但因其水溶性差，大大限制了在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。本發(fā)明人通過(guò)酶降解法，將殼聚糖降解成聚合度小、水溶性大的低聚殼聚糖。并且經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，低聚殼聚糖具有游離氨基，可迅速與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜結(jié)合，使細(xì)菌細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)容物外流；并進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，與細(xì)菌dna及其內(nèi)酶 系統(tǒng)發(fā)生絮凝反應(yīng)，從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。然而，本發(fā)明人進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，如單獨(dú)將低聚殼聚糖用于治療肺結(jié)核時(shí)，效果并不顯著，而添加其他成分制成藥物組合物時(shí)，其對(duì)結(jié)核桿菌有強(qiáng)抑制作用，可用于治療肺結(jié)核。因而，宜積極研究低聚殼聚糖組合物及其新適應(yīng)癥。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于克服上述不足之處，研究設(shè)計(jì)含低聚殼聚糖的藥物組合物及其臨床應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種用于治療肺結(jié)核的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物由下列重量份配比的成份組成：低聚殼聚糖2份-8份，川貝提取物0.5份-2份，夏枯草提取物0.5份-1份，白芨提取物0.5份-1份，杜衡提取物0.25份-0.75份，風(fēng)寒草提取物0.25份-0.75份，千日紅提取物0.25份-0.75份。優(yōu)選的，本發(fā)明的藥物組合物由下列重量配比的成份組成：低聚殼聚糖5份，川貝提取物1份，夏枯草提取物0.8份，白芨提取物0.8份，杜衡提取物0.5份，風(fēng)寒草提取物0.5份，千日紅提取物0.5份。本發(fā)明的另一目的是提供了所述藥物組合物的制備方法，該方法為：低聚殼聚糖、川貝提取物、夏枯草提取物、白芨提取物、杜衡提取物，風(fēng)寒草提取物、千日紅提取物與水一起混合，所述水的用量為 原料總重量的8-15倍量，優(yōu)選11倍量；充分?jǐn)嚢枋蛊渚鶆?，煮?min，冷卻至室溫(25℃±2℃)，過(guò)濾除去不溶物，即得。本發(fā)明所述藥物組合物中，所述低聚殼聚糖的平均分子量為600-4000，通過(guò)以下方法制備：將殼聚糖10g用乙酸333ml溶解，殼聚糖濃度為0.03g/ml，加入木瓜蛋白酶5ml(含酶量45u)水解，水解20mim后調(diào)節(jié)ph值至6.1，50℃繼續(xù)降解6h，100℃滅酶15min，離心取上清液，冷凍干燥，得低聚殼聚糖9.57g。經(jīng)hplc測(cè)試，確認(rèn)其為低聚殼聚糖，平均分子量為1200。所述川貝提取物、夏枯草提取物、白芨提取物、杜衡提取物、風(fēng)寒草提取物、千日紅提取物等原料均通過(guò)市售得到。本發(fā)明的又一目的是提供了所述藥物組合物在制備治療肺結(jié)核藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明人對(duì)所述藥物組合物進(jìn)行了急性毒性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示本發(fā)明的藥物組合物可視為無(wú)毒。對(duì)所述藥物組合物進(jìn)行的抑菌實(shí)驗(yàn)，證實(shí)其對(duì)金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，結(jié)核桿菌均有極強(qiáng)的抑菌能力。體外抑菌實(shí)驗(yàn)顯示本發(fā)明的藥物組合物對(duì)結(jié)核桿菌有強(qiáng)抑菌能力。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同濃度的實(shí)驗(yàn)藥物對(duì)結(jié)核桿菌均有抑制作用，75％濃度組即能全部存活。因而，本發(fā)明的藥物組合物可用于制備治療肺結(jié)核藥物。本發(fā)明的藥物組合物解決了臨床藥物毒性大且對(duì)結(jié)核桿菌抑制率差的問(wèn)題，本發(fā)明藥物組合物無(wú)毒性，效果顯著，用于治療肺結(jié)核 有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值和社會(huì)效益。本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單，宜于工業(yè)化生產(chǎn)。附圖說(shuō)明圖1本發(fā)明藥物組合物體外抑菌實(shí)驗(yàn)(實(shí)施例5)具體實(shí)施方式實(shí)施例1低聚殼聚糖的制備(酶法)將殼聚糖10g(脫乙?；?5％，水分4.85％，灰分0.5％，粘均分子量10萬(wàn)，購(gòu)自濟(jì)南海得貝海洋工程有限公司)用乙酸333ml溶解，殼聚糖濃度為0.03g/ml，加入木瓜蛋白酶5ml(含酶量45u)水解，水解20mim后調(diào)節(jié)ph值至6.1，50℃繼續(xù)降解6h，100℃滅酶15min，離心取上清液，冷凍干燥，得低聚殼聚糖9.57g。經(jīng)hplc測(cè)試，確認(rèn)其為低聚殼聚糖，平均分子量為1200。實(shí)施例2藥物組合物的制備低聚殼聚糖純度≥98％，分子量600-4000，實(shí)施例1制得以下各成份原料均可購(gòu)買得到：取200ml燒杯，加入100ml除熱源蒸餾水，然后加入5g低聚殼聚糖、1g川貝提取物、0.8g夏枯草提取物、0.8g白芨提取物、0.5g杜衡提取物、0.5g風(fēng)寒草提取物、0.5g千日紅提取物，充分?jǐn)嚢枋蛊浠旌暇鶆?，煮?min，冷卻至室溫25℃，過(guò)濾除去不溶物，即得藥物組合物溶液109.1g。實(shí)施例2制得的藥物組合物用于下列實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例3急性毒性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：昆明小鼠70只，體重17～22g，雌雄各半，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。動(dòng)物分組：采用雌雄分別隨機(jī)均衡分組法，共分為7組，每組10只，其中一組為空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)樣品：實(shí)施例2中制得。劑量確定：劑量設(shè)計(jì)為3ml/kg，10ml/kg，50ml/kg，100ml/kg。給藥：一次性灌胃給藥：給藥前禁食3～5h，給藥后禁食1～2h，禁食不禁水。采用分批給藥，對(duì)照組、3ml/kg組、10ml/kg組第一批給藥，給藥后確定所設(shè)劑量合適，再給予50ml/kg組和100ml/kg組。給藥后連續(xù)觀察7天以上，隨后每天上下午各觀察一次，連續(xù)觀察14天。詳細(xì)記錄各項(xiàng)觀察指標(biāo)。組別劑量(ml/kg)數(shù)量(只)存活率(％)101010023101003101010045010100510010100結(jié)論：受試物在本實(shí)驗(yàn)中灌胃給藥劑量達(dá)到100ml/kg時(shí)(相當(dāng)于5.8mg/kg的固體藥物)，未出現(xiàn)死亡。按照急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判定，本受試藥物可視為無(wú)毒。實(shí)施例4體外抑菌實(shí)驗(yàn)(一)菌株：金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，結(jié)核桿菌。緩沖液：ph7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液。培養(yǎng)基：普通瓊脂培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)樣品：實(shí)施例2制得。實(shí)驗(yàn)溫度：20℃±1℃。實(shí)驗(yàn)方法：在20℃±1℃下，將實(shí)驗(yàn)樣品作用于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、結(jié)核桿菌，作用時(shí)間為2min、5min、10min、20min，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：結(jié)論：在20℃±1℃下，受試物對(duì)金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，結(jié)核桿菌均有極強(qiáng)的抑菌能力。實(shí)施例5體外抑菌實(shí)驗(yàn)(二)1.材料菌株：結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)株h37rv。液體培養(yǎng)基：middlebrook7h9培養(yǎng)基干粉、營(yíng)養(yǎng)添加劑(oadc)。受試物：實(shí)施例2所得。2.實(shí)驗(yàn)方法1)受試菌株的制備將受試菌株轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基，經(jīng)活化后，于37℃培養(yǎng)2周，吸取培養(yǎng)菌液少許，置于4ml液體培養(yǎng)基中，加入直徑2～3mm無(wú)菌玻璃珠10～20粒，振蕩2o～30秒，靜止沉淀l0～20min，吸取菌懸液上清，用液體培養(yǎng)基調(diào)整比濁至1個(gè)麥?zhǔn)蠁挝唬喈?dāng)于1×107cfu(菌落形成單位)/ml備用。2)受試藥物的準(zhǔn)備受試藥物用0.22μm濾器過(guò)濾后，用液體培養(yǎng)基稀釋，獲得40％ 濃度的初始藥物溶液，再用液體培養(yǎng)基對(duì)倍稀釋，獲得20％、10％、5％、2.5％、1.25％、0.625％、0.3125％、0.156％、0.078％、0.039％、0.0195％十個(gè)濃度梯度。3)操作步驟檢測(cè)時(shí)，各取上述藥物溶液100μl，加到96孔微孔板中，再加入104cfu/ml(由107cfu/ml稀釋獲得)濃度的菌液100μl。同時(shí)設(shè)置不含藥的100％、10％接菌量為對(duì)照。37℃培養(yǎng)。同一藥物稀釋度設(shè)兩組平行對(duì)照。觀察藥物對(duì)分枝桿菌的最低抑菌濃度(mic)。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果受試物檢測(cè)結(jié)果，見(jiàn)下表。菌株mic(稀釋濃度)結(jié)核桿菌≤0.0195％4.實(shí)驗(yàn)結(jié)論受試物在稀釋濃度為0.0195％時(shí)，對(duì)結(jié)核桿菌仍然具有強(qiáng)抑菌能力。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如圖1所示。實(shí)施例6動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1.材料實(shí)驗(yàn)菌株：結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)株h37rv(中國(guó)生物制品檢定所)。受試藥物：分為3組，①為實(shí)施例2所得溶液；②為①用水稀釋到75％濃度所得；③為①用水稀釋到50％濃度所得。培養(yǎng)基：羅琴氏培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選用體質(zhì)量(18±2g)的nih(美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院)小鼠(購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，每組10只，雌雄各半。細(xì)菌培養(yǎng)方法：將結(jié)核桿菌接種于羅琴氏培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)4周。2.實(shí)驗(yàn)部分實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組、感染對(duì)照組和空白對(duì)照組。參照臨床用藥常規(guī)方案，實(shí)驗(yàn)組每只小鼠尾靜脈注射結(jié)核桿菌菌液0.2ml，感染后即刻分別將①②③灌胃，每只0.5ml，以后每周灌胃同劑量藥物2次，共1周。感染對(duì)照組和空白對(duì)照組小鼠分別尾靜脈注射結(jié)核桿菌菌液和滅菌生理鹽水各0.2ml，注射后即刻用0.5ml生理鹽水灌胃，以后每周灌胃同劑量的生理鹽水2次，共1周。各組小鼠常規(guī)飼養(yǎng)，觀察各組小鼠的存活情況，4周后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表格。4.結(jié)論實(shí)驗(yàn)證明，不同濃度的實(shí)驗(yàn)藥物對(duì)結(jié)核桿菌均有抑制作用，75％濃度組即能全部存活。當(dāng)前第1頁(yè)12