本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及甘油激酶作為糖代謝紊亂疾病的治療靶標的用途。

背景技術(shù)：

肝臟糖代謝(包括吸收血糖、糖原合成與分解、糖異生及輸出)在維持血糖穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。肝臟糖異生亢進是2型糖尿病肝糖輸出增加導致血糖升高的一個重要病理機制，糾正亢進的肝糖生成有利于控制糖尿病發(fā)病進程及續(xù)發(fā)性疾病。所以靶向肝糖產(chǎn)生的抑制劑研究對控制和治療糖代謝紊亂相關(guān)疾病，包括代謝綜合癥和2型糖尿病等，具有重要意義。

甘油激酶(glycerolkinase)能夠催化甘油磷酸化為3-磷酸甘油。在脂肪細胞中，因為甘油激酶表達很低，所以不能有效利用脂肪分解產(chǎn)生的甘油，只有通過血液循環(huán)運輸至肝、腎、腸等組織利用。甘油在甘油激酶作用下，轉(zhuǎn)變?yōu)?-磷酸甘油，然后脫氫生成磷酸二羥丙酮，再循糖代謝途徑進行氧化分解釋放能量，也可在肝臟沿糖異生途徑轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟腔蛱窃?/p>

現(xiàn)有技術(shù)中，目前沒有報導甘油激酶在2型糖尿病中的作用以及通過調(diào)控akt-foxo-pepck/g6pase通路調(diào)控肝臟糖異生和血糖穩(wěn)態(tài)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供甘油激酶作為糖代謝紊亂疾病的治療靶標的用途。

在本發(fā)明的第一方面，提供甘油激酶或其調(diào)節(jié)劑的用途，用于制備改善或治療糖代謝紊亂疾病的組合物。

在一個優(yōu)選例中，所述的糖代謝紊亂疾病包括：高血糖，高胰島素血癥，胰島素抵抗，糖耐量受損，糖尿病(包括1型糖尿病和2型糖尿病)；低血糖。

在另一優(yōu)選例中，所述的調(diào)節(jié)劑包括甘油激酶的表達下調(diào)劑和活性/功能抑制劑，甘油激酶的表達下調(diào)劑和活性/功能抑制劑用于制備改善或治療高血糖，胰島素抵抗，糖耐量受損(糖耐量降低)，糖尿病(包括1型糖尿病和2型糖尿病)的組合物。

在另一優(yōu)選例中，所述的甘油激酶的下調(diào)劑和活性/功能抑制劑還用于制備具有如下功能的制劑：

降低血糖和空腹血糖；

增強葡萄糖清除能力；

提高胰島素敏感性；

減少糖異生；或

降低葡萄糖-6-磷酸酶或磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的表達。

在另一優(yōu)選例中，所述的甘油激酶的下調(diào)劑包括下調(diào)甘油激酶的基因轉(zhuǎn)錄、多肽表達的下調(diào)劑；較佳地是特異性干擾甘油激酶的基因表達的干擾分子；更佳地，所述的干擾分子是以甘油激酶基因或其轉(zhuǎn)錄本為抑制或沉默靶標的shrna，反義核酸、小干擾rna、微小rna，或能表達或形成所述shrna，反義核酸、小干擾rna、微小rna的構(gòu)建物；或所述的甘油激酶的抑制劑包括特異性抑制甘油激酶活性或功能的抗體、化合物等。

在另一優(yōu)選例中，所述的干擾分子是shrna，其核苷酸序列包括seqidno:1所示的序列；或所述的干擾分子是包括seqidno:1所示的序列或以seqidno:1所示的序列為靶標的表達系統(tǒng)(包括但不限于：表達質(zhì)粒、宿主細胞或病毒；所述的病毒包括腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒等)。

在另一優(yōu)選例中，所述的調(diào)節(jié)劑是上調(diào)劑，所述的甘油激酶或其上調(diào)劑用于制備改善或治療低血糖的組合物。

在另一優(yōu)選例中，所述的甘油激酶或其上調(diào)劑還用于制備具有如下功能的制劑：

降低血液甘油濃度；

升高血糖；

增強糖異生；

升高葡萄糖-6-磷酸酶或磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的表達；

降低轉(zhuǎn)錄因子foxo1及其上游分子akt的磷酸化；或

升高foxo1下游的分子igfbp1的表達。

在另一優(yōu)選例中，所述的甘油激酶的上調(diào)劑包括：表達甘油激酶的多核苷酸的表達系統(tǒng)(包括但不限于：表達載體、宿主細胞或病毒；所述的病毒包括腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒等)；較佳地，所述的表達系統(tǒng)為表達載體；更佳地，所述的表達載體為病毒載體；或所述的甘油激酶的上調(diào)劑是促進甘油激酶表達或增強甘油激酶活性/功能的抗體、化合物。

在另一優(yōu)選例中，所述的病毒載體選自下組：慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄酶病毒，腺病毒，皰疹病毒，牛痘病毒或腺相關(guān)病毒。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于調(diào)節(jié)血糖的物質(zhì)，其是甘油激酶的下調(diào)劑，該下調(diào)劑具有seqidno:1所示核苷酸序列的shrna；或該下調(diào)劑是包括seqidno:1所示的序列或以seqidno:1所示的序列為靶標的表達系統(tǒng)(包括但不限于：表達載體、宿主細胞或病毒；所述的病毒包括腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒等)。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種篩選改善或治療糖代謝紊亂疾病的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包括：

(1)用候選物質(zhì)處理表達甘油激酶的體系或含有甘油激酶的體系；和

(2)檢測所述體系中甘油激酶的表達或活性/功能；

其中，若所述候選物質(zhì)可提高甘油激酶的表達或增強其活性，則表明該候選物質(zhì)是改善或治療低血糖的潛在物質(zhì)；若所述候選物質(zhì)可降低甘油激酶的表達或抑制其活性/功能，則表明該候選物質(zhì)是改善或治療高血糖，胰島素抵抗，糖耐量受損，糖尿病(包括1型糖尿病和2型糖尿病)的潛在物質(zhì)。

在一個優(yōu)選例中，所述的篩選方法中，步驟(1)包括：在測試組中，將候選物質(zhì)加入到表達甘油激酶的體系或含有甘油激酶的體系中；步驟(2)包括：檢測測試組的體系中甘油激酶的表達或活性/功能，并與對照組比較，其中所述的對照組是不添加所述候選物質(zhì)的表達甘油激酶的體系或含有甘油激酶的體系；

如果測試組中甘油激酶的表達或活性在統(tǒng)計學上高于(優(yōu)選顯著高于，如提高20％以上，較佳的提高50％以上；更佳的提高80％以上)對照組，就表明 該候選物是改善或治療低血糖的潛在物質(zhì)；如果測試組中甘油激酶的表達或活性在統(tǒng)計學上低于(優(yōu)選顯著低于，如降低20％以上，較佳的降低50％以上；更佳的降低80％以上)對照組，就表明該候選物是改善或治療高血糖，胰島素抵抗，糖耐量受損，糖尿病(包括1型糖尿病和2型糖尿病)的潛在物質(zhì)。

在另一優(yōu)選例中，所述的篩選方法中，所述的候選物質(zhì)可以是：基于影響甘油激酶的活性或功能、或調(diào)控其表達的基因或蛋白而設(shè)計的大分子(如肽、抗體、過表達載體或干擾分子)或小分子(如化合物)。

在另一優(yōu)選例中，所述的篩選方法中，所述的體系選自：細胞體系(或細胞培養(yǎng)物體系)、亞細胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動物體系。

在另一優(yōu)選例中，所述的篩選方還包括：對獲得的潛在物質(zhì)進行進一步的細胞實驗和/或動物試驗，以從候選物質(zhì)中進一步選擇和確定對于改善或治療糖代謝紊亂疾病有用的物質(zhì)。

本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。

附圖說明

圖1、在高脂飲食誘導的糖尿病小鼠模型抑制肝臟甘油激酶表達顯著改善高血糖和胰島素敏感性。

a：c57bl/6j小鼠喂飼常規(guī)飼料(chow)或60％高脂飼料(hfd)12周，檢測肝臟甘油激酶(gyk)mrna和蛋白水平。

b-i：利用腺病毒介導在高脂飲食誘導的糖尿病小鼠過表達甘油激酶shrna(sh-gyk)或非特異性shrna(sh-nc)，分別檢測肝臟gyk的mrna和蛋白水平(b)，血中葡萄糖(c)、胰島素(d)和甘油(g)水平，檢測糖耐量(e，gtt)、胰島素耐量(f，itt)和丙酮酸耐量(h，ptt)，檢測肝臟糖異生酶基因g6pase和pepck表達(i)。圖中數(shù)值為平均值±標準誤差，n＝6-10。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，與chow喂飼組小鼠相比(a)，與sh-nc組小鼠相比(b-i)。

圖2、甘油激酶對糖異生和血糖穩(wěn)態(tài)的調(diào)控作用。

利用腺病毒介導在c57bl/6j小鼠過表達甘油激酶(ad-gyk)或?qū)φ盏鞍? gfp(ad-gfp)，分別檢測肝臟gykmrna(a)和蛋白水平(g)，血甘油水平(b)，血糖水平(c)，檢測以甘油為前體(d，glytt)或以丙酮酸為前體(e，ptt)的糖異生，肝臟g6pase和pepckmrna表達(f)，以及肝臟akt、foxo1和creb磷酸化(g)。圖中數(shù)值為平均值±標準誤差，n＝6-9。*p<0.05；**p<0.01，與過表達gfp的對照小鼠相比。

圖3、甘油激酶對糖異生和血糖穩(wěn)態(tài)的調(diào)控作用。

利用腺病毒介導在c57bl/6j小鼠過表達甘油激酶shrna(sh-gyk)或非特異性shrna(sh-nc)，分別檢測肝臟gykmrna和蛋白水平(a)，自由進食時和空腹血糖水平(b)，血清胰島素水平(c)，檢測糖耐量(gtt，d)、胰島素耐量(itt，e)、丙酮酸耐量(ptt，f)，以及肝臟g6pase和pepckmrna表達(g)。圖中數(shù)值為平均值±標準誤差，n＝7-9。*p<0.05；**p<0.01，與sh-nc組小鼠相比。

圖4、甘油激酶通過akt-foxo1信號通路促進肝細胞表達糖異生酶及產(chǎn)糖。

利用腺病毒介導在原代培養(yǎng)小鼠肝細胞中過表達甘油激酶(ad-gyk)或?qū)φ盏鞍譯fp(ad-gfp)，分別檢測細胞通過糖異生產(chǎn)生的葡萄糖量(a，n＝5)、akt和foxo1磷酸化(b)，以及100nm胰高血糖素刺激后糖異生酶g6pase和pepck的表達(c，n＝3)。圖中數(shù)值為平均值±標準誤差，*p<0.05；**p<0.01，與過表達gfp的肝細胞相比。

具體實施方式

本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，發(fā)現(xiàn)甘油激酶(gyk)不僅能通過催化甘油生成3-磷酸甘油而參與糖異生，還通過akt-foxo1信號通路調(diào)控糖異生酶g6pase和pepck表達而調(diào)控糖異生，在維持血糖穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。因此，甘油激酶及其調(diào)節(jié)劑是調(diào)節(jié)血糖乃至治療糖尿病的新靶標。

甘油激酶及其治療用途

所述的甘油激酶的氨基酸序列可以如genbank登錄號caa55365.1，gi:516124所示；或其與該序列具有保守性或同源性(如序列相同性高于80％；較佳地高于85％；更佳地高于90％；更佳地高于95％；如98％，99％)的序列。所述的甘油激酶可以分離自細胞，或者可通過基因工程方法制備。在得知了甘油激酶的序列后，本領(lǐng)域人員可以方便地制備獲得甘油激酶。

基于本發(fā)明的闡述，甘油激酶是一個新的、與糖代謝紊亂疾病密切相關(guān)的藥物靶點。針對甘油激酶的各種治療手段可以作為防治動物(特別是人)的糖代謝紊亂疾病的新穎且有效的手段。

如本文所用，所述的“糖代謝紊亂疾病”包括但不限于：高血糖，高胰島素血癥，胰島素抵抗，糖耐量受損，糖尿病(包括1型糖尿病和2型糖尿病)；低血糖等。

并且，甘油激酶也可以用于作為藥物篩選的靶點，篩選通過降低或提高甘油激酶的表達或活性而緩解或治療糖代謝紊亂疾病的藥物。

甘油激酶調(diào)節(jié)劑的治療用途

基于本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，所述的甘油激酶的下調(diào)劑可用于制備改善或治療高血糖，胰島素抵抗，糖耐量受損(糖耐量降低)，糖尿病(包括1型糖尿病和2型糖尿病)的組合物。

如本文所用，所述的“甘油激酶(表達)下調(diào)劑”及“活性或功能抑制劑”包括了核酸抑制物、拮抗劑、抑制劑、阻滯劑、阻斷劑等，只要它們能夠下調(diào)甘油激酶的表達水平、抑制甘油激酶的活性或功能。它們可以是化合物、化學小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括dna、rna)的，也可以是蛋白水平的。

所述的甘油激酶(表達)下調(diào)劑是指任何可降低甘油激酶的活性、降低甘油激酶的穩(wěn)定性、下調(diào)甘油激酶的表達、減少甘油激酶有效作用時間的物質(zhì)，這些物質(zhì)均可用于本發(fā)明，作為對于下調(diào)甘油激酶有用的物質(zhì)，從而可用于緩解或治療高血糖或糖尿病。例如，所述的下調(diào)劑是：核酸抑制物、蛋白抑制劑、抗體、配體、化合物、核酸酶、核酸結(jié)合分子等，只要其能夠下調(diào)甘油激酶的表達、抑制其活性或功能。所述的核酸抑制物包括但不限于：以甘油激酶基因或其轉(zhuǎn)錄本為抑制或沉默靶標的shrna，反義核酸、小干擾rna、 微小rna，或能表達或形成所述shrna，反義核酸、小干擾rna、微小rna的構(gòu)建物。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的甘油激酶下調(diào)劑是shrna，其核苷酸序列包括seqidno:1所示的序列；或所述的干擾分子是包括seqidno:1所示的序列或以seqidno:1所示的序列為靶標的表達系統(tǒng)。所述的表達系統(tǒng)包括但不限于：表達質(zhì)粒、宿主細胞或病毒；所述的病毒包括腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒等。

基于本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，所述的甘油激酶的上調(diào)劑可用于制備改善或治療低血糖的組合物。

所述的甘油激酶的上調(diào)劑是指任何可提高甘油激酶的活性、提高甘油激酶的穩(wěn)定性、上調(diào)甘油激酶的表達、增加甘油激酶有效作用時間的物質(zhì)，這些物質(zhì)均可用于本發(fā)明，作為對于上調(diào)甘油激酶有用的物質(zhì)，從而可用于提高血糖。它們可以是化合物、化學小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括dna、rna)的，也可以是蛋白水平的。

作為本發(fā)明的優(yōu)選選擇方式，所述的甘油激酶上調(diào)劑是表達甘油激酶的表達系統(tǒng)。所述的表達系統(tǒng)沒有特別的限制，任何可表達出具有甘油激酶或其類似物、模擬物相似活性的表達系統(tǒng)均可應(yīng)用于本發(fā)明中。例如，所述的表達系統(tǒng)包括但不限于：表達載體、含有表達載體的宿主細胞或病毒；所述的病毒包括腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒等。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解如何表達出甘油激酶或其類似物、模擬物，并且已經(jīng)有一些商業(yè)化的表達系統(tǒng)，均可應(yīng)用于本發(fā)明中。

藥物組合物

本發(fā)明還提供了一種組合物，它含有有效量(如0.000001-50wt％；較佳的0.00001-20wt％；更佳的，0.0001-10wt％)的所述的甘油激酶或其表達載體、或甘油激酶調(diào)節(jié)劑(包括上調(diào)劑或下調(diào)劑)，以及藥學上可接受的載體。所述的組合物可用于改善或治療糖代謝紊亂疾病。

如本文所用，所述“有效量”是指可對人和/或動物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。所述“藥學上可接受的載體”指用于治療劑給 藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體：它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在組合物中藥學上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、緩沖液。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、潤滑劑、助流劑、潤濕劑或乳化劑、ph緩沖物質(zhì)等。所述的載體中還可以含有細胞轉(zhuǎn)染試劑。

在得知了所述甘油激酶或其調(diào)節(jié)劑的用途后，可以采用本領(lǐng)域熟知的多種方法來將所述的甘油激酶或其表達載體、甘油激酶調(diào)節(jié)劑或它們的藥物組合物給藥于哺乳動物。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、靜脈輸入、經(jīng)皮給予、局部給予、植入、緩釋給予等。

本發(fā)明所述的甘油激酶或其表達載體、甘油激酶調(diào)節(jié)劑的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴重程度等而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)各種因素來確定(例如通過臨床試驗)。所述的因素包括但不限于：所述的甘油激酶或其表達載體、甘油激酶調(diào)節(jié)劑的藥代動力學參數(shù)例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。通常，當本發(fā)明的甘油激酶或其調(diào)節(jié)劑每天以約0.00001mg-50mg/kg動物體重(較佳的0.0001mg-10mg/kg動物體重)的劑量給予，能得到令人滿意的效果。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或?qū)┝堪幢壤販p少。

藥物篩選

在得知了甘油激酶與糖代謝紊亂疾病的密切相關(guān)性后，可以基于該特征來篩選調(diào)節(jié)甘油激酶的表達(及甘油激酶的調(diào)節(jié)劑)的物質(zhì)。

因此，本發(fā)明提供一種篩選調(diào)節(jié)血糖的潛在物質(zhì)的方法，所述的方法包括：用候選物質(zhì)處理表達或含有甘油激酶的體系；和檢測所述體系中甘油激酶的表達或活性/功能；若所述候選物質(zhì)可降低甘油激酶的表達或活性/功能，則表明該候選物質(zhì)是降低血糖的潛在物質(zhì)，反之則表明該候選物質(zhì)是提高血糖的潛在物質(zhì)。所述的表達或含有甘油激酶的體系例如可以是細胞(或細胞培養(yǎng)物)體系，所述的細胞可以是內(nèi)源性表達甘油激酶的細胞；或可以是表達重組甘油激酶的細胞。所述的表達或含有甘油激酶的體系還可以是亞細胞體系、 溶液體系、組織體系、器官體系或動物體系(如動物模型，優(yōu)選非人哺乳動物的動物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。

在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，在進行篩選時，為了更易于觀察到甘油激酶的表達或活性/功能的改變，還可設(shè)置對照組，所述的對照組可以是不添加所述候選物質(zhì)的表達甘油激酶的體系或含有甘油激酶的體系。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的方法還包括：對獲得的潛在物質(zhì)進行進一步的細胞實驗和/或動物試驗，以進一步選擇和確定對于調(diào)節(jié)血糖真正有用的物質(zhì)。

本發(fā)明對于甘油激酶的表達、活性、存在量的檢測方法沒有特別的限制?？梢圆捎贸Ｒ?guī)的基因定量或半定量檢測技術(shù)、酶催化反應(yīng)等，例如(但不限于)：聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)(pcr)，northern印跡法等。

另一方面，本發(fā)明還提供了采用所述篩選方法獲得的可調(diào)節(jié)血糖的潛在物質(zhì)。這些初步篩選出的物質(zhì)可構(gòu)成一個篩選庫，以便于人們最終可以從中篩選出能夠?qū)τ谡{(diào)節(jié)甘油激酶的表達和活性，進而調(diào)節(jié)血糖有用的物質(zhì)。

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如j.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

材料與方法

1、實驗動物

c57bl/6j背景的雄性小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司。小鼠飼養(yǎng)于spf級動物房，12小時光照晝夜循環(huán)，除了實驗特殊要求外，小鼠自由進食常規(guī)飼料和水。通過給8周齡c57bl/6j小鼠喂食60％高脂飼料(researchdiets)至少12周建立高脂誘導的糖尿病小鼠模型。所有的小鼠實驗操作均遵循institutionalanimalcare以及usecommitteeoftheinstitutefornutritionalsciences有關(guān)細則。

2、腺病毒制備和純化

甘油激酶(gyk)及gfp腺病毒表達質(zhì)粒使用adeasy腺病毒表達系統(tǒng)(stratagene，lajolla，ca)構(gòu)建。

擴增小鼠gykmrnacds區(qū)的pcr引物序列為：

正向：5′-aaggaaaaaagcggccgcgaagctgactgacttcc-3′(seqidno:3)；

反向：5′-cccaagcttaatccgtgaggtggtatt-3′(seqidno:4)。

擴增gfpcdna的pcr引物序列為：

正向：5’-atggtgagcaagggcgagga-3’(seqidno:5)；

反向：5’-ttacttgtacagctcgtccat-3’(seqidno:6)。

gykshrna腺病毒表達質(zhì)粒(sh-gyk)使用block-it^tmadenoviralrnaiexpressionsystem(invitrogen)構(gòu)建。

gykshrna(sh-gyk)序列為：

5’-gctatagctggtgctgtaatcttcaagagagattacagcaccagctatagc-3’(seqidno:1)。

ncshrna(sh-nc)序列為：

5’-cctaaggttaagtcgccctcgccgaagcgagggcgacttaaccttagg-3’(seqidno:2)。

上述表達gyk、gfp、gyk-shrna或nc-shrna的腺病毒表達質(zhì)粒通過酶切線性化后，分別用lipofectamine2000(invitrogen)轉(zhuǎn)染hek293a腺病毒包裝細胞以產(chǎn)生相應(yīng)的腺病毒，收集上清和細胞，用0.5％np-40室溫裂解細胞20min，12000rpm4℃離心10min；每100ml上清加入50mlpeg8000(20％peg8000+2.5mnacl)，在冰上放置2h后，12000rpm4℃離心20min；棄上清，用1.1g/mlcscl(溶劑為20mmtri-hcl，ph8.0)重懸沉淀，7000rpm，離心5min；取上清依次進行不連續(xù)和連續(xù)cscl密度梯度離心，取病毒帶用200倍體積的透析緩沖液在4℃透析三次，每次3h，分裝病毒保存于-80℃，測定病毒滴度后按照需要量使用。

利用腺病毒系統(tǒng)在小鼠肝臟過表達gyk或其對照gfp、過表達sh-gyk或其對照nc-shrna：將上述表達gyk、gfp、sh-gyk或nc-shrna的腺病毒，通過尾靜脈注射1×10⁹pfu(plaque-formingunits，配制于200μlpbs)，5天后 進行葡萄糖耐受實驗(glucosetolerancetest，gtt)、丙酮酸耐受實驗(pyruvatetolerancetest，ptt)或甘油耐受實驗(glyceroltolerancetest，glytt)。實驗后注射6％水合氯醛(0.1ml/10g)麻醉處死小鼠，收集血清和肝臟等組織樣品，保存于-80℃冰箱，待之后分析。

3、葡萄糖、丙酮酸和甘油耐受實驗

小鼠禁食6h后，腹腔注射2g/kg體重的葡萄糖、2g/kg體重的丙酮酸或2g/kg體重的甘油進行g(shù)tt、ptt或glytt實驗。于注射前及注射后在15、30、60、90和120min用血糖儀從尾部取血測定血糖值。

4、血清生化分析

血清胰島素濃度用millipore的胰島素elisa測定試劑盒；血清甘油水平用普利萊的甘油(液體樣品)酶法測定試劑盒檢測。

5、rna抽提和熒光定量pcr

小鼠組織中的總rna使用invitrogen公司的trizol試劑抽提，步驟如下：每10mg～40mg組織在1.5mlep管中加0.4mltrizol進行研磨后補至1ml，加入0.2ml氯仿，劇烈震蕩15s后將其在室溫下放置5min，在4℃下以12000rpm離心10min。約取350μl水樣層轉(zhuǎn)移到一干凈的ep管中，加入等體積異丙醇沉淀rna，室溫條件下放置30min后，4℃下12000rpm離心10min。移去上層液體，用75％的乙醇溶液(depc水配制)洗滌rna沉淀一次后，用depc水溶解。

rna抽提后用takara公司的dnaseⅰ消化，以去除dna。取2μgrna用m-mlv逆轉(zhuǎn)錄酶通過逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)將mrna逆轉(zhuǎn)錄得到cdna，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物通過美國appliedbiosystems公司(fostercity，ca)的sybrgreenpcrsystem進行擴增，以36b4(mrna)為內(nèi)參進行mrna豐度分析。

熒光定量pcr使用的引物如表1。

表1

6、westernblot

用含cocktail蛋白酶抑制劑的ripa裂解液處理細胞或組織，離心去除細胞碎片，測蛋白質(zhì)濃度。取等量的蛋白(10～20μg)與4×蛋白上樣緩沖液混合上樣，在恒壓(80-120v)下進行sds-page電泳(凝膠厚度1.5mm，積層膠5％，分離膠10％)，再用濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到pvdf膜上。用含5％脫脂奶粉的tbst溶液封閉pvdf膜1h，然后加入一抗，4℃結(jié)合過夜。用tbst室溫洗膜3次，每次5min。加入相應(yīng)的二抗于室溫結(jié)合1～2h，再用tbst洗膜3次，用thermoscientific公司的supersignalwestpicochemiluminescentsubstrate檢測系統(tǒng)顯色。

7、統(tǒng)計學分析

實驗結(jié)果均以均值±標準誤的形式呈現(xiàn)，兩組之間的差別用雙尾非配對t檢驗進行統(tǒng)計分析，當p值小于0.05時認為有統(tǒng)計學差異(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。

實施例1、糖尿病模型小鼠肝臟甘油激酶表達升高，抑制甘油激酶表達能顯著改善小鼠的高血糖和胰島素敏感性

甘油激酶通過催化甘油生成3-磷酸甘油而參與糖異生(gluconeogenesis)。 甘油激酶主要在肝臟表達，其次是腎臟，在脂肪組織和骨骼肌有少量表達。本發(fā)明人在高脂飼料誘導的糖尿病小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，肝臟甘油激酶(glycerolkinase，gyk)的表達顯著高于對照飼料喂養(yǎng)的小鼠(圖1a)。

本發(fā)明人利用腺病毒介導的rna干擾抑制糖尿病模型小鼠肝臟gyk表達(圖1b)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rna干擾gyk表達后，能顯著降低小鼠在自由進食時的血糖和空腹血糖(圖1c)，改善高胰島素血癥(圖1d)。糖耐量實驗表明，小鼠的葡萄糖清除能力顯著增強(圖1e)。胰島素耐量實驗表明，小鼠的胰島素敏感性顯著升高(圖1f)。

這些結(jié)果提示，肝臟gyk升高在高脂飲食導致的胰島素抵抗、高血糖和糖耐量降低中發(fā)揮重要作用。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病模型小鼠抑制肝臟gyk表達能顯著升高血清甘油濃度(圖1g)，說明gyk表達被抑制后，其催化甘油生成3-磷酸甘油減少，從而使糖異生減少。

丙酮酸耐量實驗發(fā)現(xiàn)，在肝臟甘油激酶表達被抑制后，以丙酮酸為前體的糖異生被抑制(圖1h)，肝臟糖異生關(guān)鍵酶葡萄糖-6-磷酸酶(g6pase)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(pepck)的表達被抑制(圖1i)。

這些結(jié)果提示，gyk不但通過催化甘油生成3-磷酸甘油參與糖異生，而且還可能通過調(diào)控g6pase和pepck表達而調(diào)控其他前體物質(zhì)(如丙酮酸)的糖異生，從而使血糖升高。

實施例2、甘油激酶通過調(diào)控甘油代謝以及akt-foxo1介導的糖異生基因表達而調(diào)控糖異生和血糖穩(wěn)態(tài)

本實施例中，在正常小鼠中探討gyk在肝臟糖異生及血糖穩(wěn)態(tài)中的功能及機制。

1、過表達gyk的影響

本發(fā)明人利用腺病毒介導在正常小鼠肝臟過表達gyk(圖2a)，發(fā)現(xiàn)血液甘油濃度顯著降低(圖2b)、小鼠在自由進食時的血糖升高(圖2c)，以甘油作為前體的糖異生顯著增強(圖2d)。這些結(jié)果說明，gyk在整體水平通過調(diào)控甘油代謝而調(diào)控糖異生，證實了gyk在調(diào)控以甘油為前體的糖異生中的作用。

丙酮酸耐受實驗顯示，gyk過表達小鼠的糖異生能力也是增強的(圖2e)， 證實gyk也調(diào)控其它前體參與的糖異生。與上述結(jié)果一致，本發(fā)明人在分子水平檢測到gyk過表達使小鼠肝臟糖異生關(guān)鍵酶g6pase和pepck表達升高(圖2f)。

進一步的機制研究發(fā)現(xiàn)，小鼠肝臟過表達gyk使調(diào)控g6pase和pepck表達的轉(zhuǎn)錄因子foxo1及其上游分子akt的磷酸化都顯著降低(圖2g)，foxo1下游的分子igfbp1(insulin-likegrowthfactorbindingprotein1)也像g6pase和pepck一樣顯著升高(圖2f)；但另一些調(diào)控糖異生的分子，如pgc1α的表達和creb的磷酸化則沒有顯著變化(圖2f和2g)。已知akt的磷酸化能促進胞漿foxo1磷酸化繼而降解，使foxo1進入細胞核減少，其對g6pase和pepck表達的促進作用減弱，從而抑制糖異生。

因此，上述結(jié)果表明，gyk除了通過影響甘油代謝調(diào)控糖異生，還通過akt-foxo1信號通路影響糖異生關(guān)鍵酶g6pase和pepck的表達而調(diào)控糖異生，從而維持血糖平衡。

2、干擾gyk表達的影響

本發(fā)明人進一步通過腺病毒介導的rna干擾在正常小鼠肝臟抑制gyk表達，探討gyk在小鼠糖代謝及血糖穩(wěn)態(tài)調(diào)控中的作用。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與肝臟過表達gyk的結(jié)果相反，抑制肝臟gyk表達(圖3a)能顯著降低小鼠自由進食時的血糖及空腹血糖水平(圖3b)，降低血清胰島素水平(圖3c)，小鼠的糖耐量稍有升高(圖3d)，但胰島素敏感性顯著升高(圖3e)，以丙酮酸為前體的糖異生能力顯著降低(圖3f)，肝臟糖異生酶g6pase和pepck的表達顯著降低(圖3g)。

這些結(jié)果證實，肝臟gyk在生理情況下能通過調(diào)控糖異生酶基因表達而促進糖異生，在維持血糖穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。

3、原代培養(yǎng)的肝細胞中過表達gyk的影響

本發(fā)明人最后通過腺病毒介導在原代培養(yǎng)的肝細胞中過表達gyk，發(fā)現(xiàn)過表達gyk能顯著促進葡萄糖生成(圖4a)，抑制akt和foxo1磷酸化(圖4b)，促進胰高血糖素誘導的pepck和g6pase表達(圖4c)。

這些結(jié)果在細胞水平驗證了甘油激酶通過akt-foxo-pepck/g6pase通 路促進肝細胞糖異生。

實施例3、藥物篩選

1、以表達甘油激酶的細胞進行藥物篩選

取小鼠原代培養(yǎng)的肝細胞，該細胞可內(nèi)源性表達甘油激酶。將該種細胞作為用于篩選改善或治療糖代謝紊亂疾病的細胞模型。

測試組：用候選物質(zhì)處理上述細胞；

對照組：未用候選物質(zhì)處理上述細胞。

在處理后，測定所述細胞的甘油激酶的表達。如果與對照組相比，測試組中的甘油激酶的表達顯著上升1.5倍以上，則說明該候選物質(zhì)是潛在的改善或治療低血糖的物質(zhì)；如果與對照組相比，測試組中的甘油激酶的表達顯著下降1.5倍以上，則說明該候選物質(zhì)是潛在的改善或治療高血糖，胰島素抵抗，糖耐量受損，糖尿病的物質(zhì)。

以前述獲得的gykshrna病毒轉(zhuǎn)染小鼠原代培養(yǎng)的肝細胞，可以使得細胞內(nèi)甘油激酶表達下降，因此gykshrna病毒是一中對于改善或治療高血糖，胰島素抵抗，糖耐量受損，糖尿病有用的物質(zhì)。

2、基于甘油激酶活性進行藥物篩選

取重組表達的甘油激酶用于篩選甘油激酶調(diào)節(jié)劑。

測試組：用候選物質(zhì)處理含有甘油激酶的反應(yīng)溶液；

對照組：未用候選物質(zhì)處理的甘油激酶反應(yīng)溶液。

在處理后，根據(jù)甘油激酶催化甘油生成3-磷酸甘油，用甘油測定試劑盒(普利萊公司)測定反應(yīng)前后的甘油濃度，以甘油消耗量代表甘油激酶的活性。如果與對照組相比，測試組中的甘油激酶的活性顯著上升1.5倍以上，則說明該候選物質(zhì)是潛在的改善或治療低血糖的物質(zhì)；如果與對照組相比，測試組中的甘油激酶的活性顯著下降1.5倍以上，則說明該候選物質(zhì)是潛在的改善或治療高血糖，胰島素抵抗，糖耐量受損，糖尿病的物質(zhì)。

綜上所述，本發(fā)明人在高脂飲食誘導的糖尿病小鼠模型發(fā)現(xiàn)肝臟gyk表達升高，抑制肝臟gyk表達能顯著降低小鼠的高血糖，提高胰島素敏感性，增強小鼠的葡萄糖清除能力。通過在正常小鼠以及離體培養(yǎng)肝細胞的實驗， 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，gyk不僅能通過催化甘油生成3-磷酸甘油而參與糖異生，還通過akt-foxo1信號通路調(diào)控糖異生酶g6pase和pepck表達而調(diào)控糖異生，在維持血糖穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。因此，gyk是治療糖尿病的新靶標。

在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。