本發(fā)明涉及一類基于rgd多肽-化療藥物的小分子偶聯(lián)物及其納米前藥系統(tǒng)，屬于生物醫(yī)藥和納米醫(yī)藥技術領域。本發(fā)明提供一類rgd多肽-化療藥物的小分子偶聯(lián)物及其納米前藥系統(tǒng)的組成及制備方法。

背景技術：

惡性腫瘤是嚴重威脅人類生命健康的重大疾病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織(worldhealthorganization，who)統(tǒng)計，癌癥患者數(shù)量呈逐年遞增趨勢，每年全世界有近100萬人被診斷出癌癥，但目前癌癥治療還是一個世界性難題。在癌癥的治療中，化療是腫瘤特別是中晚期腫瘤的主要的治療手段，然而，臨床上最有效的抗腫瘤藥物－細胞毒藥物嚴重缺乏靶向性，在癌癥治療的同時也會損傷健康的器官和組織，易造成局部或全身的毒副作用，另外，許多化療藥物仍存在水溶性差、遞送重現(xiàn)性差、體內(nèi)外不相關、治療效果欠佳等關鍵問題。這些原因嚴重限制了抗腫瘤藥物的臨床使用。

抗體-藥物偶聯(lián)物(antibody-drugconjugates,adcs)源于德國病理學家paulehrlich構(gòu)想的“生物導彈”靶向治療腫瘤的理念，且隨連接技術的突破而迅速發(fā)展，到目前為止，全球已有30多種adcs處于臨床研究階段。有專利(美國專利公開號us2013/0108620a1)報道利用抗erbb受體的抗體偶聯(lián)美登素dm1，增加腫瘤靶向性、提高療效同時，也降低了dm1毒副作用。另有報道(中國專利公開號cn1993146a)，抗體-藥物偶聯(lián)物特別是曲妥珠單抗-美登素藥物dm1偶聯(lián)物對her2陽性乳腺癌有很好的治療效果。然而，抗體的免疫原性、高分子量、高成本等也是急需解決的問題。

近年來抗腫瘤多肽藥物的研發(fā)備受關注，有專利(中國專利公開號cn104940949a)報道了一種酸響應的抗腫瘤多肽納米藥物，生物相容性好，毒副作用低。肽是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的基礎，組成肽鏈的氨基酸可隨意結(jié)合，易于設計針對不同靶點的肽，還可以進行拼接和組裝作為藥物靶向載體，具有免疫原性低、分子量小、細胞通透性好、易于改造等優(yōu)點。某些肽類對整合素受體具有較好的親和性或特異性，如含“精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸”(rgd)的寡肽序列能被整合素αvβ3受體特異性識別和結(jié)合。整合素αvβ3受體是一類非常重要的細胞膜受體，在多種腫瘤細胞表面和新生血管內(nèi)皮細胞上有高表達，對腫瘤細胞信號傳導、基因表達、腫瘤形成、生長、分化和轉(zhuǎn)移以及血管生長都起著重要作用。近年來，多肽-藥物偶聯(lián)物(peptide-drugconjugates,pdcs)的研究開始不斷出現(xiàn)，但尚處于臨床前研究階段。

美登素(maytansine)衍生物dm1、dm3和dm4，是kupchan等美國植物化學家于1972年首次從熱帶非洲的寬齒葉美登木中發(fā)現(xiàn)的、具有抗腫瘤活性的大環(huán)內(nèi)酯類天然化合物，是一種微管蛋白抑制劑(破壞微管蛋白)，可與微管蛋白結(jié)合破壞細胞內(nèi)微管網(wǎng)絡，通過抑制微管蛋白聚合同時促進其解聚，進而抑制微管的形成，從而阻止細胞周期、抑制細胞分裂而引起細胞凋亡性死亡。研究表明，與傳統(tǒng)的化療藥物相比，dm1對癌細胞的殺傷效力是臨床常規(guī)抗癌藥物的100～1000倍，通常平均四到六個分子就可實現(xiàn)對靶細胞的殺傷，由于它的毒副作用大以及對腫瘤細胞特異性不強，已被臨床上禁止使用。所以人們一直在探索美登素衍生物更好的臨床用藥形式。顯然，提高靶向遞送，降低其毒副作用是非常必要的。有專利報道(美國專利公開號us2013/0029900a1)細胞黏合性肽鍵偶聯(lián)美登素dm1后，能顯著抑制腫瘤生長，降低毒副作用，提高存活率。

阿霉素(adriamycin)是上世紀60年代初由米蘭farmitaliaresearchlaboratories從一種鏈霉菌中分離出來的蒽環(huán)霉素類抗生素，周期非特異性藥物，對各種生長周期的腫瘤細胞都有殺滅作用。阿霉素具有廣泛的抗腫瘤作用，作為治療癌癥的一線藥物常用于肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌和多種血癌等的臨床治療中，療效好，但靜脈注射阿霉素，毒副作用大、骨髓抑制和心臟毒性等不良反應而嚴重限制了其臨床應用。另外長期使用容易產(chǎn)生劑量依賴性，易發(fā)生多藥耐藥。阿霉素本身溶解度很低，形成鹽酸鹽以后，阿霉素藥效學功能大幅度下降，從而給臨床應用帶來很大困難。通過制備在腫瘤部位轉(zhuǎn)化成原型藥的前藥系統(tǒng)可較好解決阿霉素藥物治療過程中毒副作用問題。在此領域已有一些研究和報導，有專利(中國專利公開號cn104147613a)報道將peg衍生物通過腫瘤內(nèi)蛋白酶敏感多肽連接dox，延長藥物半衰期和降低藥物毒性的同時，保證藥物在病灶部位快速釋藥。

納米遞送系統(tǒng)被認為是最有前景的藥物傳遞系統(tǒng)之一。優(yōu)良的納米遞送系統(tǒng)能夠解決難溶性藥物的注射給藥問題、提高藥物的利用度、避免被巨噬細胞識別和吞噬、靶向遞送到腫瘤組織甚至細胞，從而更好地發(fā)揮療效，降低毒副作用。關于細胞毒藥物dox的納米前藥系統(tǒng)的制備已有一些研究和報導，而關于美登素dm1、dm3和dm4的納米前藥報道較少。有專利(中國專利公開號cn104984361a)報道了一種含羧酸基聚合物的dox大分子納米前藥，具有長循環(huán)功能，在提高抗腫瘤活性，降低毒副作用的同時，也降低腫瘤細胞耐藥性。另有報道(中國專利授權(quán)公開號cn101879313b)合成rgd環(huán)肽作為靶頭、聚乙二醇為親水鏈段、經(jīng)酸敏感化學鍵和樹枝狀聚合物連接dox的高分子納米前藥系統(tǒng)，與dox相比，該高分子納米前藥系統(tǒng)具有明顯的靶向效果，在提高療效的同時，也降低了藥物毒性。但這些前藥系統(tǒng)都采用了高分子聚合物為載體，需考慮細胞毒藥物的載藥量、載體大小、載體生物相容性等問題。

因此，為了進一步提高抗腫瘤藥物的療效、安全性、靶向遞送的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性以及體內(nèi)外相關性，本發(fā)明提供了一種具有主動靶向性、載藥量高、滲透性好、腫瘤部位環(huán)境敏感(如氧化還原、酶敏感等)釋藥的“小型化”的抗腫瘤納米前藥系統(tǒng)。具體地，本發(fā)明提供一種rgd多肽-化療藥物的小分子偶聯(lián)物及其納米前藥系統(tǒng)的組成及制備方法。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一類基于rgd多肽-化療藥物的小分子偶聯(lián)物及其納米前藥系統(tǒng)(peptide-drugconjugatenanoparticles，pdcnps)，尤其是該抗腫瘤納米前藥系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)組成及其制備方法，以克服現(xiàn)有技術中諸如大分子靶頭和載體的生物相容性差、載藥量低、滲透性低等問題。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案：

本發(fā)明提供一類基于rgd多肽-化療藥物的小分子偶聯(lián)物的納米前藥系統(tǒng)，由下述三個功能部分組成：(1)具有靶向作用的rgd多肽位于最外層；(2)抗腫瘤藥物選擇美登素(dm1、dm3和dm4)和阿霉素(dox)為疏水內(nèi)核；(3)選擇還原敏感、酶敏感化學鍵作為小分子連接橋臂偶聯(lián)靶頭和抗腫瘤模型藥物。rgd多肽-化療藥物小分子偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)可簡單表示為：

rgd-linker-drug

其中，rgd多肽為環(huán)(精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸-d-苯丙氨酸-賴氨酸)[c(rgdfk)]、環(huán)(精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸-d-酪氨酸-賴氨酸)[c(rgdyk)]、環(huán)(精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸-d-苯丙氨酸-半胱氨酸)[c(rgdfc)]、環(huán)(精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸-d-酪氨酸-半胱氨酸)[c(rgdyc)]、環(huán)(精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸-d-苯丙氨酸-賴氨酸-coch2sh)[c(rgdfk-coch2sh)]、環(huán)(精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸-d-苯丙氨酸-賴氨酸-coch2ch2sh)[c(rgdfk-coch2ch2sh)]等含有rgd序列的親水性多肽，選自結(jié)構(gòu)中含有游離氨基或游離巰基的多肽中的一種或幾種；linker為小分子連接橋臂，其分子量為200～800道爾頓，選自兩末端分別以馬來酰亞胺基和琥珀酰亞胺活化酯封端的連接臂、二硫吡啶基和羧酸封端的連接臂、二硫吡啶基和琥珀酰亞胺活化酯封端的連接臂、馬來酰亞胺基和對硝基氯甲酸苯酯封端的纈氨酸-瓜氨酸類的連接臂中的一種或幾種，如4-(n-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯(smcc)、6-(馬來酰亞胺基)己酸琥珀酰亞胺酯(mcosu)、3-二硫吡啶基丙酸(py-ss-cooh)、馬來酰亞胺基-纈氨酸-瓜氨酸對氨基芐醇基對硝基苯基碳酸酯(mc-val-cit-pabc-pnp)等；drug為大環(huán)內(nèi)酯類、蒽環(huán)類藥物抗腫瘤藥物，選自美登素衍生物(dm1、dm3和dm4)和阿霉素(dox)。

本發(fā)明提供的基于rgd多肽-化療藥物的小分子偶聯(lián)物的納米前藥系統(tǒng)中，rgd多肽-化療藥物的小分子偶聯(lián)物具有式ⅰ、式ⅱ、式ⅲ、式ⅳ、式ⅴ、式ⅵ、式ⅶ、式ⅷ或式ⅸ所示結(jié)構(gòu)：

rgd多肽-美登素類藥物的小分子偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)式如式ⅰ、式ⅱ、式ⅲ、式ⅳ、式ⅴ和式ⅵ所示，其中，cm：c代表碳原子；m代表兩末端分別為馬來酰亞胺基和琥珀酰亞胺活化酯封端的小分子連接橋臂。c(rnk)：c代表括弧中為環(huán)肽；r代表精氨酰肽段；n代表甘氨酰-天冬氨酸-d-苯丙氨酸(-gd-d-f-)、甘氨酰-天冬氨酸-d-酪氨酸(-gd-d-y-)等連接肽，連接肽的個數(shù)為1。而k代表賴氨酸肽段。

rgd多肽-阿霉素類藥物的小分子偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)式如式ⅶ、式ⅷ和式ⅸ所示，其中，cx：c代表碳原子；x代表兩末端分別為馬來酰亞胺基和琥珀酰亞胺活化酯封端、二硫吡啶基和琥珀酰亞胺活化酯封端、二硫吡啶基和羧酸封端、馬來酰亞胺基和對硝基氯甲酸苯酯封端的纈氨酸-瓜氨酸類的小分子連接橋臂。c(ryc)：c代表括弧中為環(huán)肽；r代表精氨酰肽段；y代表甘氨酰-天冬氨酸-d-苯丙氨酸(-gd-d-f-)、甘氨酰-天冬氨酸-d-酪氨酸(-gd-d-y-)、甘氨酰-天冬氨酸-d-苯丙氨酸-coch2sh(-gd-d-f-coch2sh)、甘氨酰-天冬氨酸-d-苯丙氨酸-coch2ch2sh(-gd-d-f-coch2ch2sh)等連接肽，連接肽的個數(shù)為1；c代表半胱氨酸肽段。

本發(fā)明提供的基于rgd多肽-化療藥物的小分子偶聯(lián)物的納米前藥系統(tǒng)的制備方法，其包括下述內(nèi)容：

1)rgd多肽-美登素系列的小分子偶聯(lián)物的制備

(1)美登素衍生物(dm1、dm3或dm4)與含游離氨基的rgd多肽通過穩(wěn)定硫醚鍵連接

將含有游離氨基的rgd多肽充分溶于干燥的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，加入三口反應瓶，調(diào)節(jié)ph至8～10；將美登素衍生物與馬來酰亞胺基琥珀酰亞胺活化酯類化合物經(jīng)邁克爾(michael)加成反應制得的化合物充分溶于干燥dmf中，然后加入到上述反應瓶中，室溫攪拌過夜，tlc跟蹤檢測，反應結(jié)束，粗產(chǎn)物經(jīng)柱分離純化得到目標小分子偶聯(lián)物。

(2)美登素衍生物(dm1、dm3或dm4)與含游離氨基的rgd多肽通過還原敏感二硫鍵連接

將二硫吡啶基羧酸類化合物充分溶于干燥的dmf中，加入三口反應瓶，將活化劑o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu)加入反應體系，活化羧基20～60min，tlc跟蹤檢測反應；充分活化后，將含有游離氨基的rgd多肽的dmf溶液加入上述反應瓶，調(diào)節(jié)ph至8～11，室溫攪拌過夜，tlc跟蹤檢測，反應結(jié)束，粗產(chǎn)物經(jīng)乙醚結(jié)晶純化，得到二硫吡啶基-rgd多肽化合物。

將上述制備的二硫吡啶基-rgd多肽化合物充分溶于干燥dmf，加入三口反應瓶；然后將美登素衍生物的dmf溶液加入上述反應瓶，室溫下攪拌過夜，tlc跟蹤檢測反應，反應結(jié)束，粗產(chǎn)物經(jīng)乙醚結(jié)晶純化得到目標小分子偶聯(lián)物。

2)rgd多肽-阿霉素系列小分子偶聯(lián)物的制備

(1)阿霉素與含游離巰基的rgd多肽通過穩(wěn)定硫醚鍵連接

將dox·hcl溶于干燥dmf且充分脫鹽酸后，加入三口反應瓶，加入調(diào)節(jié)ph至8.5～11；然后將馬來酰亞胺基琥珀酰亞胺酯類化合物的dmf溶液加入上述反應瓶，室溫避光攪拌過夜，tlc跟蹤檢測，反應結(jié)束，粗產(chǎn)物經(jīng)柱分離純化，得到馬來酰亞胺基-dox化合物。

將上述制備的馬來酰亞胺基-dox化合物充分溶于干燥dmf，加入三口反應瓶；將含游離巰基的rgd多肽充分溶于醋酸鈉緩沖液，然后加入上述反應瓶中，室溫避光攪拌過夜，tlc跟蹤檢測反應，反應結(jié)束，粗產(chǎn)物經(jīng)柱分離純化得到目標小分子偶聯(lián)物。

(2)阿霉素與含游離巰基的rgd多肽通過還原敏感二硫鍵連接

將二硫吡啶基羧酸類化合物充分溶于干燥dmf，加入三口反應瓶，將活化劑hbtu加入反應瓶，活化羧基20～60min，tlc跟蹤檢測反應；將dox·hcl溶于干燥dmf且充分脫鹽酸后，加入上述反應瓶，調(diào)節(jié)體系ph至8～11，室溫避光攪拌過夜，tlc跟蹤檢測，反應結(jié)束，經(jīng)柱分離純化得到二硫吡啶基-dox化合物。

將上述制備的二硫吡啶基-dox化合物充分溶于干燥dmf，加入三口反應瓶；然后將含游離巰基的rgd多肽的dmf溶液加入上述反應瓶，室溫避光攪拌過夜，tlc跟蹤檢測，反應結(jié)束，粗產(chǎn)物經(jīng)乙醚結(jié)晶純化，得到目標小分子偶聯(lián)物。

(3)阿霉素與含游離巰基的rgd多肽通過組織蛋白酶b敏感鍵連接

將dox·hcl溶于干燥dmf且充分脫鹽酸后，加入三口反應瓶，調(diào)節(jié)ph至8～11；然后將纈氨酸-瓜氨酸類化合物的dmf溶液加入上述反應瓶，室溫避光攪拌過夜，tlc跟蹤檢測，反應結(jié)束，粗產(chǎn)物經(jīng)乙醚結(jié)晶純化，得到纈氨酸-瓜氨酸基-dox化合物。

將上述制備的纈氨酸-瓜氨酸基-dox化合物充分溶于干燥dmf，加入三口反應瓶；將含游離巰基的rgd多肽充分溶于醋酸鈉緩沖液，然后加入上述反應瓶中，室溫避光攪拌過夜，tlc跟蹤檢測反應，反應結(jié)束，粗產(chǎn)物經(jīng)柱分離純化，得到目標小分子偶聯(lián)物。

3)基于rgd多肽-美登素、rgd多肽-阿霉素的小分子偶聯(lián)物的納米前藥系統(tǒng)(pdcnps)的制備

采用反溶劑沉淀法制備納米前藥系統(tǒng)，首先將rgd多肽-美登素、rgd多肽-阿霉素的小分子偶聯(lián)物充分溶解于良溶劑，如溶于dmso中制備母液；然后在超聲過程中將母液緩慢滴加到雙蒸水中，超聲5～30min即可自組裝成以難溶性藥物為疏水內(nèi)核，rgd多肽為親水外殼的核-殼型納米系統(tǒng)，粒徑大小為80nm～380nm。

本發(fā)明提供的一類基于rgd多肽-化療藥物的小分子偶聯(lián)物的納米前藥系統(tǒng)的制備過程中，所用dmso溶劑在整個體系中的含量小于0.5％，并且可通過冷凍干燥得到納米前藥系統(tǒng)的固體凍干粉制劑。

本發(fā)明提供的基于rgd多肽-化療藥物的小分子偶聯(lián)物的納米前藥系統(tǒng)，不需要高分子材料作為載體，載藥量高；其固體凍干粉制劑中，含30wt％～60wt％偶聯(lián)物質(zhì)量比的藥物。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明提供的基于rgd多肽-化療藥物的小分子偶聯(lián)物的納米前藥系統(tǒng)的顯著優(yōu)點在于：

1)基于rgd多肽與化療藥物經(jīng)連接臂直接共價連接而成的小分子偶聯(lián)物，提高了體系的載藥量；

2)利用親水性rgd多肽修飾疏水性化療藥物，進一步提高了藥物的溶解度，且偶聯(lián)物能自組裝成以藥物為疏水內(nèi)核、rgd多肽為親水外殼的納米前藥系統(tǒng)；

3)利rgd多肽靶頭的靶向作用，可將納米前藥系統(tǒng)特異性地運送到腫瘤組織，減少正常組織的蓄積，降低其生物毒性，通過配體-受體的相互作用增加腫瘤細胞和腫瘤新生血管對納米前藥系統(tǒng)的攝??；

4)rgd多肽與化療藥物之間的硫醚化學鍵、還原敏感二硫化學鍵或組織蛋白酶b敏感化學鍵在血液循環(huán)條件下穩(wěn)定不釋放藥物，一旦納米前藥系統(tǒng)經(jīng)內(nèi)吞作用進入細胞內(nèi)，在溶酶體、還原型谷胱甘肽或組織蛋白酶b作用下，化療藥物與rgd多肽之間的化學鍵被切斷而釋放出游離藥物，進而發(fā)揮其細胞毒性作用，有效提高抗腫瘤藥物的生物利用度；

5)基于rgd多肽與化療藥物的小分子偶聯(lián)物，不需要高分子材料作為載體，也不需要大分子抗體為靶頭，生物相容性更好，而且有利于納米前藥系統(tǒng)更均勻、更有效地滲透腫瘤組織和細胞，發(fā)揮更好的抗腫瘤作用；

6)本發(fā)明所制備的納米前藥系統(tǒng)，可明顯提高美登素衍生物或阿霉素藥物的體內(nèi)抗腫瘤療效，具有良好的臨床應用價值。

附圖說明

圖1為實施例1、2、3和4中rgd多肽-化療藥物的小分子偶聯(lián)物的化學結(jié)構(gòu)圖。a：crgd-smcc-dm1；b：crpq-smcc-dm1；c：crgd-ss-dm1；d：crpq-ss-dm1

圖2為實施例5、6和7中rgd多肽-化療藥物的小分子偶聯(lián)物的化學結(jié)構(gòu)圖。a：crgd-dox；b：crgd-ss-dox；c：crgd-vc-dox

圖3為實施例8中rgd多肽-化療藥物的小分子偶聯(lián)物的粒徑分布圖和透射電鏡圖。a：crgd-smcc-dm1粒徑分布；b：crgd-smcc-dm1透射電鏡圖；c：crpq-smcc-dm1粒徑分布圖；d：crpq-smcc-dm1透射電鏡圖；e：crgd-ss-dm1粒徑分布圖；f：crgd-ss-dm1透射電鏡圖；g：crpq-ss-dm1粒徑分布圖；h：crpq-ss-dm1透射電鏡圖

圖4為實施例9中dm1系列納米前藥系統(tǒng)與游離dm1的抗腫瘤藥效學比較研究。a：腫瘤生長曲線；b：體重變化曲線

圖5為實施例8中rgd多肽-化療藥物的小分子偶聯(lián)物的粒徑分布圖和透射電鏡圖。a：crgd-dox粒徑分布；b：crgd-dox透射電鏡圖；c：crgd-ss-dox粒徑分布圖；d：crgd-ss-dox透射電鏡圖；e：crgd-vc-dox粒徑分布圖；f：crgd-vc-dox透射電鏡圖

圖6為實施例10中dox系列納米前藥系統(tǒng)與dox·hcl的抗腫瘤藥效學比較研究。a：腫瘤生長曲線；b：體重變化曲線

具體實施方式

以下結(jié)合附圖和具體實施例進一步說明本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明進行的具體限制。

實施例1、crgd-smcc-dm1小分子偶聯(lián)物的制備

將含有游離氨基的c(rgdfk)(0.0105mmol，1.05eq)溶于干燥dmf(0.2ml)，加入反應瓶充分攪拌，接著加入n-甲基嗎啉(0.20mmol，20eq)調(diào)節(jié)ph至8～10。將dm1-smcc(0.01mmol，1eq)充分溶于干燥dmf(0.2ml)，然后低溫加入到反應瓶中，室溫n2氛圍反應過夜，tlc跟蹤檢測，反應結(jié)束，經(jīng)硅膠柱(ch2cl2：ch3oh＝20:1～5:1)分離純化得目標產(chǎn)物crgd-smcc-dm1為白色固體，產(chǎn)率為61％。esi-ms質(zhì)譜檢測結(jié)果為1559.80g/mol，表明dm1經(jīng)smcc化學鍵已連接到crgd多肽上。

實施例2、crpq-smcc-dm1小分子偶聯(lián)物的制備

將含有游離氨基的c(rpqfk)(0.0105mmol，1.05eq)溶于干燥dmf(0.2ml)，加入反應瓶充分攪拌，接著加入n-甲基嗎啉(0.20mmol，20eq)調(diào)節(jié)ph至8～10。將dm1-smcc(0.01mmol，1eq)充分溶于干燥dmf(0.2ml)，然后低溫加入到反應瓶中，室溫n2氛圍反應過夜，tlc跟蹤檢測，反應結(jié)束，經(jīng)硅膠柱(ch2cl2：ch3oh＝15:1～4:1)分離純化得目標產(chǎn)物crpq-smcc-dm1為白色固體，產(chǎn)率為61％。esi-ms質(zhì)譜檢測結(jié)果為1613.71g/mol，表明dm1經(jīng)smcc化學鍵已連接到crpq多肽上。

實施例3、crgd-ss-dm1小分子偶聯(lián)物的制備

將制備的3-二硫吡啶基丙酸(py-ss-cooh)(0.10mmol，1eq)溶于干燥dmf(0.4ml)，加入反應瓶，充分攪拌溶解，將羧基活化劑hbtu(0.20mmol，2eq)溶于0.4ml干燥dmf，加入反應瓶，活化羧基20～60min，tlc跟蹤檢測反應。充分活化后，將c(rgdfk)(0.12mmol，1.2eq)的0.7ml干燥dmf溶液加入反應瓶，加入n,n-二異丙基乙胺(diea)(0.60mmol，6eq)調(diào)節(jié)反應體系的ph至8～11，室溫n2氛圍反應過夜，tlc跟蹤檢測，反應結(jié)束，冷乙醚重結(jié)晶，甲醇洗滌，充分干燥得py-ss-crgd為淺黃色固體，產(chǎn)率為53％。

將上述制備的py-ss-crgd(0.01mmol，1eq)溶于0.7ml干燥dmf中，加入反應瓶，充分攪拌。然后將dm1(0.02mmol，2eq)充分溶于0.2ml干燥dmf，加入反應瓶，室溫n2氛圍反應過夜，tlc跟蹤檢測，反應結(jié)束，冷乙醚重結(jié)晶，二氯甲烷洗滌，充分干燥得目標產(chǎn)物crgd-ss-dm1為白色固體，產(chǎn)率為59％。esi-ms質(zhì)譜檢測結(jié)果為1426.58g/mol，表明dm1經(jīng)ss化學鍵已連接到crgd多肽上。

實施例4、crpq-ss-dm1小分子偶聯(lián)物的制備

將制備的3-二硫吡啶基丙酸(py-ss-cooh)(0.10mmol，1eq)溶于干燥dmf(0.3ml)，加入反應瓶，充分攪拌溶解，將羧基活化劑hbtu(0.20mmol，2eq)溶于0.4ml干燥dmf，加入反應瓶，活化羧基20～60min，tlc跟蹤檢測反應。充分活化后，將c(rpqfk)(0.12mmol，1.2eq)的0.9ml干燥dmf溶液加入反應瓶，加入n,n-二異丙基乙胺(diea)(0.60mmol，6eq)調(diào)節(jié)反應體系的ph至8～11，室溫n2氛圍反應過夜，tlc跟蹤檢測，反應結(jié)束，冷乙醚重結(jié)晶，甲醇洗滌，充分干燥得py-ss-crpq為淺黃色固體，產(chǎn)率為74％。

將上述制備的py-ss-crpq(0.01mmol，1eq)溶于0.4ml干燥dmf中，加入反應瓶，充分攪拌。然后將dm1(0.02mmol，2eq)充分溶于0.3ml干燥dmf，加入反應瓶，室溫n2氛圍反應過夜，tlc跟蹤檢測，反應結(jié)束，冷乙醚重結(jié)晶，二氯甲烷洗滌，充分干燥得目標產(chǎn)物crpq-ss-dm1為白色固體，產(chǎn)率為51％。esi-ms質(zhì)譜檢測結(jié)果為1481.13g/mol，表明dm1經(jīng)ss化學鍵已連接到crpq多肽上。

實施例5、crgd-dox小分子偶聯(lián)物的制備

將dox·hcl(0.01mmol，1eq)加入干燥dmf(0.2ml)，加入diea(0.01mmol，1eq)充分脫鹽酸，加入反應瓶，調(diào)節(jié)ph至8.5～11。將mcosu(0.02mmol，2eq)充分溶于0.2ml干燥dmf，然后將其低溫條件下加入到反應瓶中，室溫n2氛圍避光過夜反應，tlc跟蹤檢測，反應結(jié)束，經(jīng)硅膠柱(ch2cl2：ch3oh＝20:1～5:1)分離純化得mc-dox為紅色固體，產(chǎn)率為61％。

將上述制備的mc-dox(0.01mmol，1eq)溶于0.5ml干燥dmf中，加入反應瓶，充分攪拌。將c(rgdfc)(0.02mmol，2eq)充分溶于ph＝6.0的醋酸鈉緩沖液中，然后將其加入反應瓶，n2氛圍避光過夜反應，tlc跟蹤檢測，反應結(jié)束，經(jīng)硅膠柱(ch2cl2：ch3oh＝15:1～4:1)分離純化得目標產(chǎn)物crgd-dox為深紅色固體粉末，產(chǎn)率為63％。esi-ms質(zhì)譜檢測結(jié)果為1314.48g/mol，表明dox已連接到crgd多肽上。

實施例6、crgd-ss-dox小分子偶聯(lián)物的制備

將制備的3-二硫吡啶基丙酸(py-ss-cooh)(0.10mmol，1eq)溶于0.4ml干燥dmf中，加入反應瓶，充分攪拌溶解，將hbtu(0.20mmol，2eq)溶于0.4ml干燥dmf，加入反應瓶，活化羧基20～60min，tlc跟蹤檢測反應。充分活化后，將dox·hcl(0.12mmol，1.2eq)加入0.5ml干燥dmf中，加入diea(0.30mmol，1eq)充分脫鹽酸，加入反應瓶，并調(diào)節(jié)體系ph至8.5～11，室溫n2氛圍反應過夜，tlc跟蹤檢測，反應結(jié)束，經(jīng)硅膠柱(ch2cl2：ch3oh＝20:1～5:1)分離純化得py-ss-dox為深紅色固體，產(chǎn)率為98％。

將上述制備的py-ss-dox(0.20mmol，2eq)溶于1.0ml干燥dmf中，加入反應瓶，充分攪拌。將c(rgdfc)(0.10mmol，1eq)充分溶于ph＝6.0的醋酸鈉緩沖液中，然后將其加入反應瓶，n2氛圍避光過夜反應，tlc跟蹤檢測，反應結(jié)束，經(jīng)硅膠柱(ch2cl2：ch3oh＝15:1～4:1)分離純化得目標產(chǎn)物crgd-ss-dox為深紅色固體粉末，產(chǎn)率為90％。esi-ms質(zhì)譜檢測結(jié)果為1719.67g/mol，表明dox經(jīng)ss化學鍵已連接到crgd多肽上。

實施例7、crgd-vc-dox小分子偶聯(lián)物的制備

將dox·hcl(0.011mmol，1.1eq)加入0.3ml干燥dmf，加入diea(0.01mmol，1eq)充分脫鹽酸，加入反應瓶，調(diào)節(jié)ph至8.5～11。將mc-val-cit-pabc-pnp(0.01mmol，1eq)充分溶于0.3ml干燥dmf，然后將其加入反應瓶中，室溫n2氛圍避光過夜反應，tlc跟蹤檢測，反應結(jié)束，經(jīng)硅膠柱(ch2cl2：ch3oh＝20:1～5:1)分離純化得目標產(chǎn)物mc-val-cit-pabc-dox為紅色固體粉末，產(chǎn)率為81％。

將上述制備的mc-val-cit-pabc-dox(0.01mmol，1eq)充分溶于0.4ml干燥dmf中，加入反應瓶，勻速攪拌。將c(rgdfc)(0.02mmol，2eq)充分溶于ph＝6.0的醋酸鈉緩沖液中，然后將其加入反應瓶，n2氛圍避光過夜反應，tlc跟蹤檢測，反應結(jié)束，經(jīng)硅膠柱(ch2cl2：ch3oh＝15:1～4:1)分離純化得目標產(chǎn)物crgd-val-cit-pabc-dox(crgd-vc-dox)為紅色固體粉末，產(chǎn)率為82％。esi-ms質(zhì)譜檢測結(jié)果為1207.39g/mol，表明dox經(jīng)vc-pabc化學鍵已連接到crgd多肽上。

實施例8、基于美登素類、阿霉素類的rgd多肽-化療藥物的小分子偶聯(lián)物的納米前藥系統(tǒng)(pdcnps)制備及表征

采用反溶劑沉淀法制備pdcnps。稱取實施例1、2、3、4、5、6、7中合成的crgd-smcc-dm1、crpq-smcc-dm1、crgd-ss-dm1、crpq-ss-dm1、crgd-dox、crgd-ss-dox、crgd-vc-dox小分子偶聯(lián)物，加入dmso良溶劑充分溶解配制成40mg/ml的母液，然后于室溫超聲過程中，將12.5μl母液緩慢滴加到3987.5μl的雙蒸水中，滴加完記時探超10min，溶劑在水相迅速擴散得到均一澄清的納米藥物體系(體系中藥物濃度：0.125mg/ml；dmso體積含量：0.3％)。利用動態(tài)光散射(dynamiclightscattering，dls)測定其粒度及分布，利用透射式電子顯微鏡觀察pdcnps的形態(tài)。其pdcnps粒徑及分布、形態(tài)見表1，圖3和圖5。

表1基于rgd多肽-化療藥物的小分子偶聯(lián)物的納米前藥系統(tǒng)的粒徑及分布

實施例9美登素dm1系列的納米前藥系統(tǒng)的體內(nèi)抗腫瘤活性試驗

近交系雌性c57bl/6小鼠(18-20g，北京維通利華實驗動物中心提供)，于小鼠右側(cè)腋皮下接種8×10⁵個/只b16-f10細胞，分別與接種后第10天、12天、14天、16天和18天經(jīng)尾靜脈注射給生理鹽水、游離dm1、crgd-smcc-dm1納米前藥系統(tǒng)、crpq-smcc-dm1納米前藥系統(tǒng)、crgd-ss-dm1納米前藥系統(tǒng)、crpq-ss-dm1納米前藥系統(tǒng)，給藥劑量均為400μg/kg。自接種腫瘤細胞第7天起隔天使用游標卡尺測量小鼠腫瘤的長短徑，計算腫瘤體積v(v＝[length×(width)²]/2)，繪制腫瘤體積-時間變化圖，并記錄小鼠體重，繪制體重增長曲線以評價制劑的全身毒性。

實施例10阿霉素dox類的納米前藥系統(tǒng)的體內(nèi)抗腫瘤活性試驗

近交系雌性c57bl/6小鼠(18-20g，北京維通利華實驗動物中心提供)，于小鼠右側(cè)腋皮下接種8×10⁵個/只b16-f10細胞，分別與接種后第10天、12天、14天、16天和18天經(jīng)尾靜脈注射給生理鹽水、游離dox·hcl、crgd-dox納米前藥系統(tǒng)、crgd-ss-dox納米前藥系統(tǒng)、crgd-vc-dox納米前藥系統(tǒng)，給藥劑量均為2000μg/kg。自接種腫瘤細胞第7天起隔天使用游標卡尺測量小鼠腫瘤的長短徑，計算腫瘤體積v(v＝[length×(width)²]/2)，繪制腫瘤體積-時間變化圖，并記錄小鼠體重，繪制體重增長曲線以評價制劑的全身毒性。