本發(fā)明涉及化妝品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種含有活性酵母細(xì)胞衍生物的護(hù)膚品及其制備方法。

背景技術(shù)：

皮膚是人體最大的器官，總重量占體重的5％-15％，總面積為1.5-2平方米，厚度因人或因部位而異，為0.5-4毫米。皮膚覆蓋全身，與人體的其它器官密切相連，起著保護(hù)人體不受外部刺激或傷害的作用。皮膚具有兩個方面的屏障作用：一方面防止體內(nèi)水分，電解質(zhì)和其他物質(zhì)的丟失；另一方面阻止外界有害物質(zhì)的侵入。保持著人體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，在生理上起著重要的保護(hù)功能，同時皮膚也參與人體的代謝過程。如果想擁有健康漂亮的肌膚，除了要養(yǎng)成健康的生活習(xí)慣，還要做好防護(hù)保養(yǎng)工作，尤其對于平時裸露在外的皮膚，如臉部、頸部、手、臂部等，更要悉心呵護(hù)。

但是，目前市場上的各種美容護(hù)膚化妝品中大多數(shù)都含有對人體有害的化學(xué)物質(zhì)，如含鉛、汞等有毒有害物質(zhì)，這些護(hù)膚品容易引起人們皮膚過敏，對人體器官和功能造成損傷。因此，人們對美容護(hù)膚化妝品的要求也越來越高，越來越向“天然化、營養(yǎng)化、療效化”的方向發(fā)展。而從植物、微生物中提取的天然化合物作為護(hù)膚化妝品的主要添加劑已經(jīng)受到人們越來越多的關(guān)注。

活性酵母細(xì)胞衍生物(liveyeastcellderivative,lycd)是由釀酒酵母細(xì)胞(saccharomycescerevisiae,s.cerevisiae)受到外界不良刺激后快速合成的大量具有自我修復(fù)功能的物質(zhì)，主要由多肽、氨基酸、脂類、核酸、單糖、雙糖以及酵母特有的痕量維生素和礦物質(zhì)組成?，F(xiàn)有研究表明，活性酵母細(xì)胞衍生物具有加速膠原蛋白和彈性蛋白生成的能力，可以滋潤并更新皮膚細(xì)胞，增加皮膚細(xì)胞中新生蛋白質(zhì)對水分的吸收和促進(jìn)對氧的利用，使皮膚豐滿，是奇特的保濕劑。此外，活性酵母細(xì)胞衍生物還具有強(qiáng)紫外吸收和促進(jìn)細(xì)胞活性的能力，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于配制具有消炎作用、專門用于預(yù)防曬后失水和促進(jìn)防曬傷皮膚重新水合從而減少紫外傷害的新型化妝品。

傳統(tǒng)的活性酵母細(xì)胞衍生物是從紫外光照射過的酵母細(xì)胞中提取得到的。后來人們把亞致死劑量的過氧化氫加入到酵母細(xì)胞中，處理后的酵母細(xì)胞經(jīng)提取也獲得了活性酵母細(xì)胞衍生物。而上述傳統(tǒng)方法難以實現(xiàn)活性酵母細(xì)胞衍生物的大量生產(chǎn)，并且其制備方法繁瑣、費(fèi)時、費(fèi)力、對人體有毒害作用。大氣壓低溫等離子體活化水是由水溶液經(jīng)大氣壓低溫等離子體處理得到的一種富含活性氧自由基(如超氧陰離子、羥基、單線態(tài)氧、一氧化氮自由基等) 的溶液。由于大部分活性氧自由基壽命短，不會對環(huán)境、人體造成傷害，有效避免了傳統(tǒng)制備方法中藥殘問題，確?；钚越湍讣?xì)胞衍生物制品的安全。此外，本發(fā)明制備活性酵母細(xì)胞衍生物的工藝操作簡單、成本低、便攜、小型、可隨用隨制，并且制備過程不會對人體造成傷害，可以很好的解決傳統(tǒng)制備活性酵母衍生物方法的弊端。本發(fā)明采取微生物發(fā)酵生產(chǎn)，不受環(huán)境和自然資源影響，易實現(xiàn)工業(yè)化、自動化。并且現(xiàn)有大量研究表明天然活性酵母細(xì)胞提取物，具有抗氧化、抗紫外的特性，對細(xì)胞無毒害作用，具有極大的市場應(yīng)用前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了避免化學(xué)添加劑對皮膚的毒害作用，本發(fā)明提供了一種含有活性酵母細(xì)胞衍生物的天然護(hù)膚品，主要由活性酵母細(xì)胞衍生物、油脂、表面活性劑、保濕劑、防腐劑、去離子水。并且，為了克服傳統(tǒng)方法利用紫外和過氧化氫制備活性酵母細(xì)胞衍生物的繁瑣、費(fèi)時、費(fèi)力、對人體有毒害的不足，本發(fā)明提供了一種基于大氣壓低溫等離子體活化水制備活性酵母細(xì)胞衍生物的方法，通過大氣壓低溫等離子體活化水處理酵母細(xì)胞懸液，再經(jīng)破除細(xì)胞壁、破除細(xì)胞膜提取酵母胞內(nèi)的活性物質(zhì)。本發(fā)明制備的含有活性酵母細(xì)胞衍生物的護(hù)膚品具有保護(hù)細(xì)胞抵御紫外輻射、過氧化氫損傷的效果。本發(fā)明制備活性酵母細(xì)胞衍生物的方法簡單、易操作、成本低廉、安全、無毒性殘留，且釀酒酵母細(xì)胞來源廣泛、取材便利，具有極大的市場應(yīng)用前景。

為了實現(xiàn)以上技術(shù)效果，本發(fā)明采用以下的技術(shù)方案：

一種含有活性酵母細(xì)胞衍生物的護(hù)膚品，主要成分為活性酵母細(xì)胞衍生物、油脂、表面活性劑、保濕劑、防腐劑、去離子水。其中，活性酵母細(xì)胞衍生物是基于大氣壓低溫等離子體活化水制備產(chǎn)生的。

所述的一種含有活性酵母細(xì)胞衍生物的護(hù)膚品中的活性酵母細(xì)胞衍生物用量占護(hù)膚品總質(zhì)量的4-10％；所述油脂選自白礦油、硬脂酸、鯨蠟硬脂醇、橄欖油、辛酸/癸酸三甘油脂、乳木果油、霍霍巴油、硅油中的一種或多種，其用量占護(hù)膚品中質(zhì)量的2-12％；所述表面活性劑為吐溫20、月桂酸鈉、硬脂醇硫酸鈉、聚氧乙烯脂肪酸酯、鯨蠟硬脂醇醚-2、鯨蠟醇磷酸酯中的一種或幾種，其用量占護(hù)膚品中質(zhì)量的2-12％；所述保濕劑為吡咯烷酮羧酸鈉、硫酸軟骨素、丙三醇、丙二醇、1,3-丁二醇、透明質(zhì)酸鈉、三甲基甘氨酸、甲基甘氨酸脯氨酸中的一種或幾種，其用量占護(hù)膚品中質(zhì)量的5-15％；所述防腐劑為尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、二羥甲基二甲基乙內(nèi)酰脲中的一種或多種，其用量占護(hù)膚品中質(zhì)量的0.1-0.3％。

所述的一種含有活性酵母細(xì)胞衍生物的護(hù)膚品制備方法，包括以下步驟：

(1)將油脂和表面活性劑置于容器中，加熱到75-85℃并不斷攪拌，使各組分充分溶解 后，靜置冷卻至50℃；

(2)將保濕劑溶于少量去離子水中，加熱至65-75℃并不斷攪拌，使各組分充分溶解后，靜置冷卻至50℃；

(3)將步驟(1)的溶液與步驟(2)的溶液混合，加入去離子水后攪拌20-40min，使各組分充分混勻，靜置冷卻至40℃；

(4)將活性酵母細(xì)胞衍生物、防腐劑依次加入步驟(3)的混合溶液中，攪拌10-20min，使各組分充分混勻。

所述的基于大氣壓低溫等離子體活化水制備活性酵母細(xì)胞衍生物的方法，包括以下步驟：

(1)培養(yǎng)酵母細(xì)胞：取酵母細(xì)胞凍存液接種于酵母液體培養(yǎng)基中，放置在30℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；

(2)大氣壓低溫等離子體活化水的制備：將大氣壓低溫等離子體發(fā)生器放置于水溶液中，打開氣源向大氣壓低溫等離子體發(fā)生器中通入工作氣體，調(diào)節(jié)氣體流速，待氣流穩(wěn)定后開啟高壓電源，進(jìn)行放電處理即得到等離子體活化水；

(3)處理酵母細(xì)胞：將步驟(1)的酵母細(xì)胞懸液與步驟(2)的大氣壓低溫等離子體活化水充分混勻后，放置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育；

(4)提取活性酵母細(xì)胞衍生物：將步驟(3)經(jīng)處理后的酵母細(xì)胞懸液離心收集，然后破除細(xì)胞壁，破除細(xì)胞膜，離心取上清即為活性酵母細(xì)胞衍生物，置于-80℃超低溫冰箱中保存。

所述的基于大氣壓低溫等離子體活化水制備活性酵母細(xì)胞衍生物的方法中使用的酵母細(xì)胞為釀酒酵母細(xì)胞(saccharomycescerevisiae,s.cerevisiae)，所用酵母培養(yǎng)基為ypad培養(yǎng)基，酵母細(xì)胞凍存液與ypad液體培養(yǎng)基的比例為1:10-1:50，培養(yǎng)時間為16-24h。

所述的基于大氣壓低溫等離子體活化水制備活性酵母細(xì)胞衍生物的方法中使用的水溶液可以選自純凈水、自來水、超純水、去離子水、蒸餾水中的一種。

所述的基于大氣壓低溫等離子體活化水制備活性酵母細(xì)胞衍生物的方法中大氣壓低溫等離子體的工作氣體選自氬氣、氦氣、空氣中的一種或氦氣/氬氣與氧氣兩種氣體以任意比例的混合氣體，工作氣體流速為2-5l/min，處理功率為20-60w，處理時間為10-30min。

所述的基于大氣壓低溫等離子體活化水制備活性酵母細(xì)胞衍生物的方法中酵母細(xì)胞懸液與大氣壓低溫等離子體活化水的比例為1:5-1:10，酵母細(xì)胞的孵育時間為2-10h。

所述的基于大氣壓低溫等離子體活化水制備的活性酵母細(xì)胞衍生物的方法中酵母細(xì)胞的破除細(xì)胞壁的方法選自堿破壁法、外加葡聚糖酶法、表面活性劑處理法、酸堿處理法、外加蛋白酶破壁法、鹽法破壁、高壓均漿法、超聲波法氣、微波加熱法擠壓式破壁法、凍融法、 有機(jī)溶劑法中的一種。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明是一種含有活性酵母細(xì)胞衍生物的護(hù)膚品，將活性酵母細(xì)胞衍生物作為主要添加劑使用后，具有保護(hù)細(xì)胞抵御紫外輻射、過氧化氫損傷的效果。并且已有研究表明天然的活性酵母細(xì)胞衍生物對細(xì)胞無毒副作用、安全可靠；此外，本發(fā)明中采用大氣壓低溫等離子體活化水制備活性酵母衍生物的方法易操作，僅需將酵母細(xì)胞與等離子體活化水共同孵育；加工速度快，短時間處理即可獲得有活性的活性酵母提取物；有效成分活性氧自由基壽命短，對環(huán)境、人體造成傷害小；等離子體裝置處理功率小，比紫外輻射處理更加節(jié)能等優(yōu)點，可以很好的解決傳統(tǒng)制備活性酵母衍生物方法的弊端。本發(fā)明采取微生物發(fā)酵生產(chǎn)，不受環(huán)境和自然資源影響，易實現(xiàn)工業(yè)化、自動化，具有極大的市場應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1是小鼠成纖維細(xì)胞(nih-3t3)加入含有活性酵母細(xì)胞衍生物的護(hù)膚品前后經(jīng)過紫外輻射處理后的細(xì)胞存活率圖。

圖2是小鼠成纖維細(xì)胞(nih-3t3)加入含有活性酵母細(xì)胞衍生物的護(hù)膚品前后經(jīng)過過氧化氫處理后的細(xì)胞存活率圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步對本發(fā)明進(jìn)行闡述，應(yīng)理解，引用實施例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。

實施例1

1、一種含有活性酵母細(xì)胞衍生物的護(hù)膚品配方為：10％活性酵母細(xì)胞衍生物，2％辛酸/癸酸三甘油脂、2％硬脂酸、2％橄欖油、2％硅油，2％吐溫20、3％聚氧乙烯脂肪酸酯、2％月桂酸鈉、2％硬脂醇硫酸鈉，3％硫酸軟骨素、2％丙三醇、3％丙二醇、3％透明質(zhì)酸鈉、3％三甲基甘氨酸，0.1％尼泊金甲酯、0.1％尼泊金乙酯，余量為去離子水。

2、一種含有活性酵母細(xì)胞衍生物的護(hù)膚品的制備方法如下：

(1)按照計算量，將辛酸/癸酸三甘油脂、硬脂酸、橄欖油、硅油、吐溫20、聚氧乙烯脂肪酸酯、月桂酸鈉、硬脂醇硫酸鈉置于容器中，加熱到75-85℃并不斷攪拌，使各組分充分溶解后，靜置冷卻至50℃；

(2)將硫酸軟骨素、丙三醇、丙二醇、透明質(zhì)酸鈉、三甲基甘氨酸溶于少量去離子水中，加熱至65-75℃并不斷攪拌，使各組分充分溶解后，靜置冷卻至50℃；

(3)將步驟(1)的溶液與步驟(2)的溶液混合，加入去離子水后攪拌30min，使各組分充分混勻，靜置冷卻至40℃；

(4)將活性酵母細(xì)胞衍生物、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯依次加入步驟(3)的混合溶液中，攪拌15min，使各組分充分混勻即得到含有活性酵母細(xì)胞衍生物的護(hù)膚品。

3、本發(fā)明采用大氣壓低溫等離子體活化水制備活性酵母細(xì)胞衍生物的方法如下：

(1)取1ml酵母細(xì)胞凍存液，放置于20ml的ypad液體培養(yǎng)基中，在30℃、200rpm轉(zhuǎn)速下過夜培養(yǎng)至od600達(dá)到0.8左右；

(2)在超凈工作臺中，用無菌接種環(huán)蘸取上述活化后的酵母細(xì)胞懸液，在ypad固體平板上劃線，倒置平板放置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h；

(3)用無菌槍頭挑取ypad固體平板上的單菌落，并放置于20mlypad液體培養(yǎng)基中，在30℃、200rpm轉(zhuǎn)速下過夜培養(yǎng)至od600達(dá)到0.8左右；

(4)取上述1ml酵母細(xì)胞懸液放置于20mlypad液體培養(yǎng)基中，在30℃、210rpm轉(zhuǎn)速下活化1-2h后細(xì)胞達(dá)到對數(shù)生長期，od600在0.3-0.5之間；

(5)將大氣壓低溫等離子體發(fā)生器放置于超純水中，工作氣體為空氣，氣體流速為2l/min，處理功率為30w，處理時間為20min制備得到等離子體活化水；

(6)取5ml已活化后的酵母細(xì)胞懸液與40ml等離子體活化水混合，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育6h；

(7)孵育后的酵母細(xì)胞懸液，2000rpm離心5min，吸取上清；

(8)用1mlpbs重懸酵母細(xì)胞后，2000rpm離心5min，吸取上清；

(9)用1ml山梨醇buffer重懸細(xì)胞后，加入100ulyticase，充分混勻。在30℃下恒溫培養(yǎng)箱中孵育2h后，4000rpm離心10min，棄上清，收集沉淀；

(10)用200μlwestern及ip細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，用手指輕彈以充分混勻細(xì)胞后，靜置于冰上5min。酵母細(xì)胞充分裂解后，12000rpm離心5min，取上清液，此上清液即為活性酵母細(xì)胞衍生物。

實施例2.抗紫外、抗氧化能力測試

本實驗采用小鼠成纖維細(xì)胞(nih-3t3)評估含有活性酵母細(xì)胞衍生物的護(hù)膚品的抗紫外、抗氧化能力，并采用xtt法檢測紫外輻射與過氧化氫處理后小鼠成纖維細(xì)胞的存活率。

1、含有活性酵母細(xì)胞衍生物的護(hù)膚品抗紫外能力檢測：

(1)小鼠成纖維細(xì)胞nih-3t3細(xì)胞系用含有10％新生胎牛血清與100u/ml青霉素與鏈霉素的dmem培養(yǎng)基中，在37℃、5％co2恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞生長到覆蓋培養(yǎng)皿70-80％后，用0.25％edta胰蛋白酶消化培養(yǎng)皿中的細(xì)胞，獲得小鼠成纖維細(xì)胞懸液；

(2)取2ml上述小鼠成纖維細(xì)胞懸液放置于24孔板中；

(3)在2ml細(xì)胞懸液中，加入20μl含有活性酵母細(xì)胞衍生物的護(hù)膚品，在37℃、5％co2恒溫培養(yǎng)箱中孵育30min；

(4)30w的紫外線燈(紫外波長為254nm)距離24孔板30cm對小鼠成纖維細(xì)胞懸液進(jìn)行紫外輻射處理4min；

(5)xtt溶液配制：用deme稀釋xtt母液，稀釋比例為5:1；

(6)向96孔板中加入100μlxtt溶液；

(7)向100μlxtt溶液中，加入20μl上述經(jīng)過大氣壓低溫等離子體處理后的小鼠成纖維細(xì)胞懸液，每個不同處理組分別設(shè)置兩個復(fù)孔；

(8)把加完樣品的96孔板放置于37℃、5％co2恒溫培養(yǎng)箱中孵育24h后，讀取od450讀數(shù)；

(9)采集數(shù)據(jù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，計算細(xì)胞存活率。首先，所有處理組的od450減去空白對照的od450(即僅含100μlxtt溶液，沒有加入小鼠成纖維細(xì)胞的組別)。細(xì)胞存活率的計算則以未經(jīng)紫外輻射處理的細(xì)胞樣品為對照，將紫外輻射處理組細(xì)胞樣品的od450值數(shù)據(jù)歸一化，計算公式如下：

細(xì)胞存活率＝(od450(處理組)-od450(空白對照組))/(od450(未處理組)-od450(空白對照組))

2、含有活性酵母細(xì)胞衍生物的護(hù)膚品抗氧化能力檢測：

(1)小鼠成纖維細(xì)胞nih-3t3細(xì)胞系用含有10％新生胎牛血清與100u/ml青霉素與鏈霉素的dmem培養(yǎng)基中，在37℃、5％co2恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞生長到覆蓋培養(yǎng)皿70-80％后，用0.25％edta胰蛋白酶消化培養(yǎng)皿中的細(xì)胞，獲得小鼠成纖維細(xì)胞懸液；

(2)取2ml上述小鼠成纖維細(xì)胞懸液放置于24孔板中；

(3)在2ml細(xì)胞懸液中，加入20μl含有活性酵母細(xì)胞衍生物的護(hù)膚品，在37℃、5％co2恒溫培養(yǎng)箱中孵育30min；

(4)采用2mm過氧化氫溶液處理小鼠成纖維細(xì)胞懸液40min；

(5)xtt溶液配制：用deme稀釋xtt母液，稀釋比例為5:1；

(6)向96孔板中加入100μlxtt溶液；

(7)向100μlxtt溶液中，加入20μl上述經(jīng)過大氣壓低溫等離子體處理后的小鼠成纖維細(xì)胞懸液，每個不同處理組分別設(shè)置兩個復(fù)孔；

(8)把加完樣品的96孔板放置于37℃、5％co2恒溫培養(yǎng)箱中孵育24h后，讀取od450讀數(shù)；

(9)采集數(shù)據(jù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，計算細(xì)胞存活率。首先，所有處理組的od450減去空白對照的od450(即僅含100μlxtt溶液，沒有加入小鼠成纖維細(xì)胞的組別)。細(xì)胞存活率的計算則以未經(jīng)紫外輻射處理的細(xì)胞樣品為對照，將紫外輻射處理組細(xì)胞樣品的od450值數(shù)據(jù)歸一化，計算公式如下：

細(xì)胞存活率＝(od450(處理組)-od450(空白對照組))/(od450(未處理組)-od450(空白對照組))

實驗結(jié)果表明：見圖1-2，經(jīng)大氣壓低溫等離子體活化水處理酵母細(xì)胞3,4,5,6,7h得到的活性酵母細(xì)胞衍生物作為主要添加劑制備得到的護(hù)膚品分別記作護(hù)膚品-1、護(hù)膚品-2、護(hù)膚品-3、護(hù)膚品-4、護(hù)膚品-5。未加入含有活性酵母細(xì)胞衍生物的護(hù)膚品的小鼠成纖維細(xì)胞經(jīng)過致死劑量的紫外輻射與過氧化氫處理后，細(xì)胞存活率分別降至15％與10％左右。而加入含有活性酵母細(xì)胞衍生物的護(hù)膚品后，小鼠成纖維細(xì)胞存活率顯著提高，并且隨著活性酵母細(xì)胞衍生物經(jīng)大氣壓低溫等離子體活化水處理時間的延長而增加，表明含有活性酵母細(xì)胞衍生物的護(hù)膚品能夠有效的保護(hù)小鼠成纖維細(xì)胞抵御紫外輻射、過氧化氫的損傷。因此，含有活性酵母細(xì)胞衍生物的護(hù)膚品具有抗紫外、抗氧化的特性。