本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，尤其涉及一種多肽生長(zhǎng)因子修飾頭發(fā)基材料的制備方法。

背景技術(shù)：

多肽生長(zhǎng)因子可由體內(nèi)很多細(xì)胞產(chǎn)生，具有重要生理病理及治療作用。例如參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)；與細(xì)胞表面受體的結(jié)合最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)rna和蛋白合成方式的改變，從而影響細(xì)胞行為；在生物體胚胎發(fā)生、發(fā)育、分化以及人體各種組織損傷后再生修復(fù)過程中起重要作用。各種因子之間通過相互誘導(dǎo)、交互調(diào)節(jié)對(duì)細(xì)胞功能產(chǎn)生協(xié)同、相加或拮抗作用。多肽因子在體內(nèi)半衰期極短，故需要加載到生物材料上，延長(zhǎng)其在體內(nèi)的作用時(shí)間。

頭發(fā)作為自體材料，取材方便，且力學(xué)性能優(yōu)異，在生物工程領(lǐng)域的應(yīng)用得到廣泛關(guān)注。頭發(fā)由毛干、毛根和毛囊三部分組成。毛干指露于皮膚表面的部分，是皮膚的附屬器。由角朊細(xì)胞組成，其主要成分為角蛋白。其有毛髓質(zhì)、毛皮質(zhì)和毛小皮構(gòu)成。毛髓質(zhì)位于毛發(fā)中軸部位，由1-2排立方上皮細(xì)胞縱列而成，主要從頭皮中吸取營養(yǎng)物質(zhì)，供頭發(fā)生長(zhǎng)。毛皮質(zhì)占毛發(fā)的75％至90％，是決定毛發(fā)的顏色、彈性、強(qiáng)度、粗細(xì)與屈曲型的重要組成部分，其由柔軟的角蛋白構(gòu)成；毛小皮，又稱表皮層，是毛發(fā)的最外層，決定毛發(fā)的外觀和亮澤度。其可以抵御外來刺激，保護(hù)皮質(zhì)并抑制水分的蒸發(fā)。毛發(fā)在皮膚內(nèi)的部分稱為毛根，同樣也具有毛髓質(zhì)、毛皮質(zhì)和毛小皮三個(gè)部分。毛根末端膨大呈球狀，稱毛球。后者位于毛囊內(nèi)，中央內(nèi)凹，接毛囊真皮乳頭。

已有的研究大多關(guān)注頭發(fā)內(nèi)部的部分成分——角蛋白。從頭發(fā)中提取角蛋白，通過包封或表面接枝多肽生長(zhǎng)因子制得成的水凝膠可以促進(jìn)止血功能，改善心臟病患者的心臟功能，促進(jìn)軸突再生等。這些研究均無法直接利用頭發(fā)作為多肽生長(zhǎng)因子的載體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種多肽生長(zhǎng)因子修飾頭發(fā)基材料的制備方法，該方法將頭發(fā)作為多肽生長(zhǎng)因子的載體，保留了頭發(fā)的整體結(jié)構(gòu)，取材方便。

本發(fā)明提供的一種多肽生長(zhǎng)因子修飾頭發(fā)基材料的制備方法，包括如下步驟：

(1)將頭發(fā)置于酒精的水溶液中浸泡，取出頭發(fā)進(jìn)行清洗和干燥；將干燥后的頭發(fā)置于酸的水溶液中浸泡，取出頭發(fā)進(jìn)行清洗和干燥，得到頭發(fā)基材料；

(2)在引發(fā)劑的作用下，步驟(1)所述頭發(fā)基材料和多肽生長(zhǎng)因子在水中發(fā)生反應(yīng)，得到所述多肽生長(zhǎng)因子修飾頭發(fā)基材料。

上述的制備方法，步驟(1)的處理可在保證頭發(fā)結(jié)構(gòu)完整性的前提下，將頭發(fā)表面的羧基基團(tuán)暴露。

步驟(1)中，所述頭發(fā)的長(zhǎng)度可為0.5～1cm，具體可為1cm。

所述酒精的水溶液中，酒精的質(zhì)量濃度可為75％。所述酒精的水溶液的體積不受限制，能夠保證浸沒頭發(fā)即可。

在酒精的水溶液中浸泡的時(shí)間可為30～90min(如60min)，浸泡的溫度可為20～37℃(如37℃)。

從酒精的水溶液中取出后的清洗可為水洗，具體可采用蒸餾水。

所述干燥可為烘干，所述烘干的溫度可為20～37℃(如37℃)，時(shí)間可為10～20min(如15min)。

所述酸的水溶液中，酸的質(zhì)量濃度可為1％～15％，具體可為10％。所述頭發(fā)與所述酸的水溶液的質(zhì)量體積比可為(1～10)mg：10ml，具體可為8mg：10ml。

所述酸的水溶液中，酸可為鹽酸、硫酸、硝酸或醋酸。

在酸的水溶液中浸泡的時(shí)間可為5～15min，具體可為10min，浸泡的溫度可為20～37℃，具體可為37℃。

從酸的水溶液中取出后的清洗可為水洗，具體可采用蒸餾水。

所述干燥可為冷凍干燥；所述干燥的時(shí)間可為24～48h，具體可為36h。

上述的制備方法，步驟(2)中，所述反應(yīng)為步驟(1)中頭發(fā)基材料表面中暴露的羧基和多肽神經(jīng)生長(zhǎng)因子中的氨基發(fā)生的交聯(lián)反應(yīng)，多肽神經(jīng)生長(zhǎng)因子被接枝到頭發(fā)上。

所述引發(fā)劑、所述頭發(fā)基材料、所述多肽生長(zhǎng)因子和所述水的比例可為(1～100)mg：(10～200)ng：(1～10)ng：1ml，具體可為0.1mg：0.8mg：5ng：1ml。

所述多肽生長(zhǎng)因子包括但不限于：神經(jīng)生長(zhǎng)因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)營養(yǎng)素-3、神經(jīng)營養(yǎng)素-4、神經(jīng)營養(yǎng)素-5、神經(jīng)營養(yǎng)素-6、神經(jīng)營養(yǎng)素-7、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、紅細(xì)胞生成素、膠質(zhì)細(xì)胞株源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營養(yǎng)因子-1、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營養(yǎng)因子-2、骨形成蛋白、nogo的抗體或硫酸軟骨素抗體。

所述引發(fā)劑可為京尼平、戊二醛或質(zhì)量比為1：(1～10)的n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)，具體可為質(zhì)量比為1：1的n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)。

所述水具體可為蒸餾水。

所述反應(yīng)可在攪拌的條件下進(jìn)行，所述攪拌的轉(zhuǎn)速可為200～500rpm，如400rpm；所述反應(yīng)的溫度可為0～4℃，具體可為4℃，時(shí)間可為24～48h，具體可為48h。

本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)本發(fā)明多肽生長(zhǎng)因子修飾頭發(fā)基材料的制備方法，包括如下步驟：采用酸對(duì)頭發(fā)進(jìn)行處理使頭發(fā)表面裸露出羧基，得頭發(fā)基材料；在引發(fā)劑的作用下，所述頭發(fā)基材料與多肽生長(zhǎng)因子發(fā)生反應(yīng)，即可得到所述多肽生長(zhǎng)因子修飾頭發(fā)基材料。本發(fā)明方法利用稀酸溫和的腐蝕作用對(duì)頭發(fā)表面進(jìn)行表面處理，使頭發(fā)表面暴露出羧基基團(tuán)，這樣既保證了頭發(fā)的完整結(jié)構(gòu)，又使羧基基團(tuán)便于與多肽生長(zhǎng)因子的氨基在引發(fā)劑作用下發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，得到多肽生長(zhǎng)因子修飾的頭發(fā)基材料。

(2)良好的生物相容性和應(yīng)用廣泛性。頭發(fā)表面暴露出羧基基團(tuán)，便于接枝多種多肽因子。頭發(fā)材料作為自體附屬器官，取材方便。而且頭發(fā)基材料可以為多肽生長(zhǎng)因子提供支撐作用，將多肽生長(zhǎng)因子釋放出來，為缺損組織提供整個(gè)再生過程中所需的多肽生長(zhǎng)因子，具應(yīng)用廣泛性。

附圖說明

圖1為頭發(fā)材料原樣、頭發(fā)基材料、ngf修飾頭發(fā)基材料的表面形貌(掃描電子顯微鏡照片)。圖1a為頭發(fā)材料原樣的表面形貌；圖1b為頭發(fā)基材料的表面形貌；圖1c為ngf修飾頭發(fā)基材料的表面形貌。

圖2為頭發(fā)材料原樣、頭發(fā)基材料、ngf修飾頭發(fā)基材料的紅外譜圖。圖2a為頭發(fā)材料原樣的紅外譜圖；圖2b為頭發(fā)基材料的紅外譜圖；圖2c為ngf修飾頭發(fā)基材料的紅外譜圖。

圖3為雞胚背根神經(jīng)節(jié)(drg)在ngf修飾頭發(fā)基材料作用下生長(zhǎng)的神經(jīng)纖維(顯微鏡照片)。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nervegrowthfactor,ngf)是最早被發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營養(yǎng)因子，于20世紀(jì)50年代被首次發(fā)現(xiàn)證實(shí)。ngf是由3個(gè)亞基(α、β和γ)組成的五聚體蛋白質(zhì)復(fù)合物，分子質(zhì)量為130-140kda。β亞單元是ngf的功能活性單位，由雙鏈構(gòu)成的二聚體-β亞基(βngf)，分子量為26kda。下述實(shí)施例中的神經(jīng)生長(zhǎng)因子的通用名為注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子(mousenervegrowthfactforinjection)，商品名為恩經(jīng)復(fù)，生產(chǎn)廠家為廈門北大之路生物工程有限公司，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，規(guī)格為18ug(≥9000au)/支。

實(shí)施例1、制備多肽生長(zhǎng)因子修飾頭發(fā)基材料

一、制備方法

按照如下步驟制備多肽生長(zhǎng)因子修飾頭發(fā)基材料：

(1)經(jīng)鹽酸處理的頭發(fā)基材料的制備

取長(zhǎng)度為1cm的頭發(fā)(掃描電鏡照片如圖1a所示)若干根，置于75wt％酒精的水溶液中浸泡60min，浸泡溫度為37℃，蒸餾水洗凈烘干，烘干溫度為37℃，烘干時(shí)間為15min。然后將8mg頭發(fā)置于質(zhì)量濃度為10％的10ml鹽酸水溶液中，37℃下浸泡10min；反應(yīng)完畢后蒸餾水沖洗，冷凍干燥36h，得到頭發(fā)基材料(掃描電鏡照片如圖1b所示)。

(2)ngf修飾經(jīng)鹽酸處理的頭發(fā)基材料的制備

取上述步驟(1)中制備得到的頭發(fā)基材料8mg、神經(jīng)生長(zhǎng)因子5ng、n-羥基琥珀酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽均0.5mg依次加入到10ml蒸餾水中，4℃下攪拌48h(攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm)，得到ngf修飾的頭發(fā)基材料(掃描電鏡照片如圖1c所示)。

由圖1中的掃描電鏡照片可以看出，頭發(fā)表面的毛鱗片并無明顯差異。這表明由于鹽酸僅對(duì)頭發(fā)材料表面進(jìn)行改性，時(shí)間短且條件溫和，故不影響頭發(fā)的整體結(jié)構(gòu)。

二、紅外光譜測(cè)定

測(cè)定方法：分別取上述制備方法一中所用的頭發(fā)原樣、步驟(1)制備得到的頭發(fā)基材料、制備得到的ngf修飾頭發(fā)基材料三組材料各若干根。將試樣首尾兩端用膠帶粘緊，保證中間被測(cè)試部分的長(zhǎng)度為2cm，直徑為2mm。樣品間盡量不留縫隙，將捆綁好的樣品插入紅外光譜儀的試樣安放處。然后設(shè)置參數(shù)：分辨率為4cm^-1，掃描次數(shù)為30次，掃描范圍為4000-400cm^-1，并進(jìn)行波數(shù)掃描，得到吸收光譜數(shù)據(jù)。最后，將得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，得到紅外譜圖。如圖2所示。

在紅外譜圖(圖2)中，2924.39cm^-1與2853.25cm^-1處為-oh羥基伸縮振動(dòng)特征峰，1648.69cm^-1為-c＝o的伸縮振動(dòng)特征峰，1235.32cm^-1為-c-o的伸縮振動(dòng)特征峰，幾組特征峰共同表征羧基基團(tuán)。頭發(fā)原樣(圖2a)表面的脂肪酸、角蛋白等通過二硫鍵牢固連接，并且頭發(fā)表面形成特殊的復(fù)雜保護(hù)層，因此紅外光譜顯示其并無明顯特征峰。對(duì)頭發(fā)原樣進(jìn)行表面處理，使頭發(fā)表面暴露出羧基，以便進(jìn)行接枝，因此頭發(fā)基材料(圖2b)暴露出特征峰。ngf修飾經(jīng)鹽酸處理的頭發(fā)基材料(圖2c)中ngf的氨基與頭發(fā)基材料表面的脂肪酸、角蛋白的羧基結(jié)合成酰胺鍵，因此峰尖銳程度均弱于頭發(fā)基材料。atr-ftir結(jié)果表明ngf成功接枝到頭發(fā)基材料表面。

三、生物活性

為了驗(yàn)證上述制備方法一中制備的ngf修飾頭發(fā)基材料中ngf仍具有生物活性，現(xiàn)采用ngf修飾頭發(fā)基材料與雞胚背根神經(jīng)節(jié)共培養(yǎng)的方法，驗(yàn)證ngf的活性。具體方法如下：將神經(jīng)生長(zhǎng)因子修飾頭發(fā)基材料與從8日齡雞胚中提取的雞胚背根神經(jīng)節(jié)共培養(yǎng)。其中培養(yǎng)體系為雞血漿10μl，dmem200μl和100μl。共培養(yǎng)24h后，光 學(xué)顯微鏡下觀察背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)情況。

結(jié)果如圖3所示：雞胚背根神經(jīng)節(jié)在靠近神經(jīng)生長(zhǎng)因子修飾頭發(fā)基材料一側(cè)突起更長(zhǎng)，并且突起可以沿著材料方向生長(zhǎng)。證明包封神經(jīng)生長(zhǎng)因子修飾頭發(fā)基材料可以釋放出神經(jīng)生長(zhǎng)因子，且神經(jīng)生長(zhǎng)因子具有生物活性。